JPS63145297A - タンパク質の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は、タンパク質の精製方法に関し、特には１例
えば遺伝子工学的手法により微生物等の宿主により生産
される、その宿主本来のタンパク質てはない異種タンパ
ク質の精製方法に関する。

［従来の技術］ 最近、例えばヒトプラスミノーゲンアクチベーターのよ
うな有用タンパク質を遺伝子工学的手法により例えば大
腸菌のような微生物に生産させることか行なわれている
。一般に、生理活性を有するタンパク質は分子内の−３
−５−結合により所定の立体構造を有しているか、この
ようなタンパク質が微生物により生産された場合には、
細胞壁やその他の器官由来のシスティン残基と有用タン
パク質とか−８−８−結合を形成して結合し、その生理
活性を失って不溶化する場合か多い。例えば、ヒトプラ
スミノーゲンアクチベーターは４人尿又は培養細胞の培
養上清から回収した場合には可溶性であるか、遺伝子工
学的手法により大腸菌に生産させた場合には変性して不
溶性になる。一般に、このように変性して不溶化してい
る異種タンパク質を再生するためには例えば尿素や塩酸
グアニシンンのような高濃度の可溶化剤を含む溶液中て
異種タンパク質を可溶化し、透析あるいは希釈により可
溶化剤を除去するか又は濃度を下げることか行なわれる
。また、可溶化液中からの宿主細胞由来のタンパク質等
の不純物の除去はゲルろ過クロマトグラフィー又はイオ
ン交換クロマトグラフィーにより行なわれ、ている（特
開昭５９−１５１３２１号）。

［従来技術の欠点］ しかしなから、透析又は希釈によって精製する場合には
、処理量が膨大（１０倍から１００倍）になり、工業的
規模ての実施か困難である。特に、透析による方法は処
理に時間かかかる上、宿主菌に由来するプロテアーゼの
作用により有用タンパク質か分解される場合かある。特
に、有用タンパク質かプラスミノーゲンアクチベーター
である場合には、プロテアーゼによって生成した活性型
ブラスミノーゲンアクチベーターか自己消化を促進し、
ブラスミノーゲンアクチベーターの回収量が低下する。

［発明か解決しようとする問題点］ この発明の目的は、工業的規模ての実施か容易てあり、
時間かかからず、宿主由来のプロテアーゼにより異種タ
ンパク質か分解されることを最少限に抑えることかでき
る、異種タンパク質の精製方法を提供することである。

［問題点を解決するための手段］ すなわち、この発明は、可溶性の異種タンパク質を疎水
性クロマトグラフィー及び金属キレートクロマトグラフ
ィーにそれぞれ架ける工程を含む異種タンパク質の精製
方法を提供する。不溶性の異種タンパク質をこの発明の
方法により精製する場合には、まず異種タンパク質を可
溶化した後にこの発明の方法を行なう。

［発明の効果］ この発明の精製方法ては、透析や大幅な゛希釈ｔか不要
であるのて工業的規模ての実施か容易である。また、透
析に比べて精製に要する時間もはるかに短縮される。従
って、宿主由来のプロテアーゼによる信用異種タンパク
質の分解も最少限度に抑えることかできる。

［発明の具体的説ＩＩコ この明細書において、「異種タンパク質」とは、自然の
状ｒＥにおいて、宿主細胞によって全く生産されないか
あるいは極めて重量にしか生産されないタンパク質を言
う。例えば、遺伝子工学的手法により１プロウロキナー
ゼを大１揚菌を宿主として生産した場合には、大１揚菌
は自然の状態てはプロウロキナーゼを産生じないので、
プロウロキナーゼは異種タンパク質である。

種々の異種タンパク質をこの発明の方法によって精製す
ることかてき１例えば旧ＩＧ　、インシュリン、ソマト
メジンＣ、プロウロキナーゼ、組織ブラスミノーゲンア
クチベーター、ハイフリットブラスミノーゲンアクチベ
ーター、インターフ；ロン、カルシトニン、Ｂ型肝炎ウ
ィルスやポリオウィルス由来のタンパク質、あるいはリ
ンホトキシン、γ−−ｒンターフェロン１インターロイ
キン２や顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子等の
ようなリンホカインを挙げることかてきる。

この発明の方法により不溶性の異種タンパク質を精製す
る場合には、先ず、宿主細胞によって生産された不溶性
の異種タンパク質を可溶化する。不溶性の異種タンパク
質の可溶化方法自体は種々公知である（Ｍ、Ｅ、　Ｗｉ
ｎｋｌｅｒ　ｅｔ、　ａｔ。

Ｂ１０／ＴＥＣＩＩＮＯＬＯＧＹ、　］、　９９０．１
９８５）。例えば、宿主細胞を破砕、遠心して得られる
不溶性画分を、例えば５ＭないしｌＯＭの尿素、４Ｍな
いし８Ｍの塩酸クアニシン、ＩＭないし５Ｍの千オシア
ン酩カリクム等慣用の方法て抽出することによって行な
うことかてきる。なお、＋１！酸クアニシンにより可溶
化を行なう場合には、次の工程に移行する［１１ｊに、
可溶化液を希釈して１１２酩クアニシンの濃度か０２な
いし２Ｍとなるようにすることか好ましい。

このようにして可溶化した異種タンパク質は、未だ本来
の正常な立体構造をとっておらず。

生理活性を有していない場合がほとんどである。

従って、生理活性を有するタンパク質を得るためには、
その立体構造を正常に戻す、いわゆるフォールディング
を行なう必要かある。フォールディンク工程は、上記可
溶化工程の後てあればいずれの段階においても行なうこ
とかてきる。後述の実施例ては、可溶化の後、クロマト
グラフィーに架ける前にフォールディング工程を行なっ
ている。フオールデインク方法自体は公知である（特開
昭５１１１−１６１３２１）。例えば、所望のタンパク
質を０．２　ｍＭないし２ｍＭの酸化型グルタチオンと
、０．０２１闇ないし０．２　ｍＭの還元型グルタチオ
ンと、１ｍＭないし１０ｍＭのＥ　ＤＴＡとを含む緩衝
液（ｐｌ＋７〜９）に溶かし、約Ｏないし３７℃、好ま
しくは１５ないし３０°Ｃて約４ないし２４時間、好ま
しくは一夜放置することによって行なうことができる。

次に、可溶化した異種タンパク質含有溶液な疎水性クロ
マトグラフィー及び金属キレートクロマトグラフィーに
架ける。疎水性クロマトグラフィーと金属キレートクロ
マトグラフィーはどちらを先に行なってもよく、また、
これらのクロマトグラフィーの間に、タンパク質の精製
において一般に行なわれる各種アフィニティクロマトグ
ラフィー、ゲルろ過クロマ・トゲラフイーやイオン交換
クロマトグラフィーのような他のクロマトグラフィーを
行なってもよい。後述の実施例では、疎水性クロマトグ
ラフィーを行なった後に金属キレートクロマトグラフィ
ーを行なっている。

疎水性クロマトグラフィーは、上記可溶化液と疎水性リ
ガントを有するクロマトグラフィー担体とを接触させる
ことによって行なう。クロマト。

クラフィーはバッチ法てもカラム法ても行なうことかて
きるが、操作上カラム法の方か好ましい。

この発明の方法において使用される疎水性クロマトグラ
フィーは、例えばアガロースゲルのような担体に、脂肪
族系若１ノ〈は芳香族系の炭化水素又はアミノ基を有す
るこれらの炭化水素類をリガントとして結合したもので
あり、具体例としてフェニルセファロースＣＬ−４Ｂ　
　（ファルマシア社製）及びフチルトヨバール（東洋曹
達工業株式会社製）を挙げることかてきる。

疎水性クロマトグラフィーは試料液のｐＨを６ないし１
０にし、４℃ないし２５℃、好ましくは４°Ｃないしｌ
ＯｏＣの温度下て行なうことか好ましい。試料溶液（可
溶化液）中には、宿主由来のタンパク質を沈殿させるた
めにＳｗ／ｖ＄ないし３０ｗ／ｖ％、特に約７ｗ／ｖ％
の固体硫酸アンモニウムを添加することか好ましい。さ
らに、異種タンパク質の不溶化を沈殿を防止するために
、０．２Ｍないし２Ｍ、１．？にＬＭの塩酸グアニジン
を添加することか好ましい。可溶化液にこれらの物質を
添加しだらのをそのまま疎水性クロマトグラフィーに架
けることもてきるか、疎水性クロマトグラフィーに架け
る試料溶液の量を減少させて工業的規模ての実施を容易
にするために、まず上記可溶化液を３０Ｗ／Ｖ＄以Ｌ、
好ましくは６０ｗ／ｉの硫酸アンモニウムて塩析し、得
られた沈殿を緩衝液に再溶解し、Ｌ記濃度の塩酸グアニ
ジン及び硫酸アンモニウムを加えてから疎水性クロマト
グラフィーに架けることもてきる。なお、可溶化剤とし
て尿素を用いた場合には、このような塩析を行なって尿
素を除去することか必要になる。

可溶化液を吸着させた後、カラムを緩衝液て洗浄するこ
とか好ましい。この場合、試料溶液の媒体に用いられて
いる緩衝液と同一組成の緩衝液（試料溶液が硫酸アンモ
ニウムやｔｆｌＷクアニシンを含む場合にはこれらを含
む）を用いることか好ましい。

疎水性クロマトグラフィーカラムからの溶出は、硫酸ア
ンモニウムを含まない緩衝液、５０ｗ／ν２以下のエチ
レングリコールを含む緩衝液、又は３Ｍ以下のショ糖を
含む緩衝液を用いて行なうことかてきる。いずれを用い
る場合ても、緩衝液中には０．２ないし２Ｍ、特には約
１Ｍの塩酸グアニジンが含まれていることか好ましい。

金属キレートクロマトグラフィーは、異種タンパク質含
有溶液と金属キレートクロマトグラフィー担体とを接触
させることによって行なう。

クロマトグラフィーはハツチ法てもカラム法ても行なう
ことかてきるか、操作Ｌカラム法の方か好ましい。この
発明において使用される金属キレートクロマトグラフィ
ーは、オキシランアクチベーティトアガロースゲルのよ
うな担体に、キレート化剤をリガントとして結合したも
のに、通常用いられる方法により金属イオンをキレート
結合したものである。ここて採用されるキレート化剤の
好ましい例としてビスカルボキシメチルアミノ基を挙げ
ることかてきる。このような金属キレートクロマトグラ
フィーの好ましい具体例としてキレ−ティングセファロ
ース６Ｂ（ファルマシア社製）を挙げることかできる。

また、このキレート化剤に結合される金属イオンは、ｌ
　ｎ２＊、　Ｃｕ２＋、　Ｇｏ２＋及びＮ１２１のよう
な、ＩＢ族、■Ｂ族又は■族元素に属する２価のイオン
か好ましく、特にＺｎ”″及びＣｕ”″か好ましい。

試料溶液を金属キレートクロマトグラフィー担体に吸若
させた後、これを洗浄することか好ましい。洗ｎ１液と
しては０．１Ｍないし２ＭのＮａ（：ｌを含む、ｐ１１
６ないしｐＨ９の緩衝液か好ましい。塩へグアニジンは
洗浄液中に含まれる必要はないか、塩酸クアニシン存在
下て行なうこともてきる。

溶出は、ＩｈＭないし２００ｍＭのイミダソール若しく
はｌｏｍＭないし５０ｍＭのアルギニンを含む緩衝液又
はｐＨ５，５以下の緩衝液によって行なうことかてきる
。溶出液中に塩酸グアニジンか含まれる必要はない。

上述のように疎水性クロマトグラフィーを行なった後に
上記金属キレートクロマトグラフィーを行なうと、純度
３０％ないし９５％の所望の異種タンパク質溶液か得ら
れる。さらに高い純度を必要とする場合は、この溶出液
を各種アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換ク
ロマトグラフィー、ゲルろ過等に架けることかてきる。

このように、この発明の方法によると、透析や大幅な希
釈か不要であるのて工業的規模ての実施か容易である。

また、透析に比べて精製に要する時間もはるかに短縮さ
れる。従って、宿主由来のプロテアーゼによる有用異種
タンパク質の分解も般少限度に抑えることかてきる。特
に、所望の異種タンパク質かプラスミノーゲンアクチベ
ーターである場合には、活性型のプラスミノーゲンアク
チベーターの生成を最少限度に抑えることかできるのて
、自己消化による収量の低下も最少限度に抑えることか
てきる。

［発明の実施例］ 実施例１　　プロウロキナーゼの精製 （１）大腸菌体中に蓄積したプロウロキナーゼ様ポリペ
プチドの可溶化 ヒトプロウロキナーゼをコートする遺伝子が組込まれた
プラスミドｐＨＵＴ４Ｌｐｍ２を含有するニジエリシャ
・コリＸ　１７７５／ｐＭＵＴ４１．ｐ＋ｓ２（ＤＳＭ
９７０）をχ１７７６培地（トム・マニアティスら、Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　１９８２　ｐ６
９）から成る培地中て３７°Ｃて２４時間培養した後集
菌した。得られた１℃体から常法に従ってプラスミドを
抽出精製し、このプラスミドて大腸菌ＪＭＩ０３株（フ
ァルマシア社製）を形質転換した。プロウロキナーゼ産
生走のあるものを選択し、これを３７°Ｃて６時間培養
し、培養液６リツトルから遠心分離により菌体を回収し
、　０．１Ｍ食塩及びｌｌＩＩＭ　ＥＤＴＡを含む１０
１１１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）　５００　ｍｌに
！、濁して超音波破砕した。次いて遠心分離により不溶
物を回収し、これを４Ｍ尿素を含むＯ，１Ｍ）−ソス塩
酸緩衝液（ｐＨ８）　２５０ｍ１にて抽出し、さらに４
心分離を行なって沈殿を除いた。

（２）可溶化したプロウロキナーゼ様ポリペプチドのフ
ォールディング 前項て得られた抽出液２５０１に、８Ｍ１！！酸クアニ
ジン２５０ＩＩｌｌを加えた後、０．２７ｍＭ還元型ク
ルタチオン、０．０２７　ｔｘ閘酸化型クりタチオン及
び１．３：１ｍＭＥＤＴＡを含む５０ｉ１１　トソス塩
酸緩衝液１．５リットルと混合して２０℃、６時間放置
した。

（３）フォールディングしたプロウロキナーゼ様ポリペ
プチドの硫酸アンモニウム塩析と再溶解以下の操作は全
て０℃ないしｌＯｏＣにて行なった。

Ｊγ１項の混合前２リットルに０．８ｋｇの硫酸アンモ
ニウムを徐々に溶解させて５Ｑｗ／Ｖχ飽和硫酎アンモ
ニウム溶液とし、４°Ｃて一夜放置後遠心分離により沈
殿を回収した。次いて沈殿を水冷した０、４■食塩を含
む５０ｎＭトソス塩酸緩衝液（ｐＨ８，８）　］００１
に再溶解させ、遠心分離により不溶物を除いた後、直ち
に上清に８ＭＪｆ！酸クアニシりを１／７体積（１４３
ｍｌ）加えて混合した。この混合溶液中に含まれるウロ
キナーゼ活性及び比活性はそれぞれ１．０３ｘ　Ｉ　Ｏ
’　Ｉ　１１及び１．４６　ｘ　ｌｏ’ｌＵ／＋ｇてあ
った。

（１１）フェニルセファロースＣＬ−４１１カラムクロ
マトクラフイー 次いて、前項の溶液１１４ｍ１に８ｇの硫酸アンモニウ
ムを溶解させ、これを７ｗ／ｖ％　’ｌｉｔ酸アンモニ
ウムと１Ｍ１１２酸クアニシンとを含む５０１１１１ト
リス塩酸！街液＜ｐｏａ）で平衡化されたフェニルセフ
ァロースＣＬ　−４Ｂカラム（ファルマシア社製、２．
５゜１（直径）　ｘ　３．８ｃ１１）に添加した後、カ
ラムを平衡化緩衝液て十分洗浄し、ＩＭ塩酎耐アニジン
を含む５０ｍＭ　）リス塩酸緩衝液（ｐｌ＋８．０）に
て溶出を行なった。溶出液５４ｍ１中のウロキナーゼ活
性及び比活性はそれぞれＬ１１３　ｘ　１０’ｌＬｌ及
びＳ、２３　ｘ１０’　ＩＩＪ／Ｂてあった。

（５）亜鉛キレートセファロース６Ｂカラムクロマトク
ラフイー 次いで前項の溶出液５４ｍ１を、亜鉛キレ−１〜セフア
ロース６Ｂカラム（ファルマシアン上製０．７ｃｍ（直
径）　ｘ　７ｃｍ）に添加した。カラムは？？Ｉ）ｌＯ
ｎｌの１０ｍｇ／ｌ１１ｍ化亜鉛水溶液を流した後に、
１Ｍ食１１２を含む２０ｍＭ　）リス塩酸ＰＩＩｔ衝液
て平衡化したものを用いた。次いて平衡化緩衝液てカラ
ムを１・分洗浄し、５０ａ＋Ｍイミダゾール及び１Ｍ食
塩を含む２０［１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐｌ＋８．Ｉｉ
）にて溶出を行なった。溶出液２８ｍ１中のウロキナー
ゼ活性及び比活性はそれぞれ０．６２８　ｘ　ｌ０ＪＩ
Ｉ及びＩｌｌ　ｘ　ＩＯ’ｌＵ／ｍｇてあった。

実施例２ ヒトハイフリットブラスミノーゲンア クチベータ−（ＨＰ　Ａ　）産生能を有する大腸菌ＪＭ
１０：ｌ（ｐ＋１Ａ２０）（ＤＳＭ］５２５）の菌体よ
り実施例１と同様にして得られた！１２　ｘ　［１’　
ｌｌｊのＩＩＰ八（比活性７２１Ｕ１０Ｄ２８ｏ）を含
むリフォールディング溶液２又を】５ｗ／ｖ！ないし６
０Ｗ／シ２飽和硫酸アンモニウムて分画した後、Ｏ，Ｓ
Ｍ　ＮａＣ１、Ｉ　Ｍｋｍ酸グアニジン、０．０１＄Ｔ
ｗｅｅｎ８Ｔ］を含む５０ｍＭトリスＩ′ｉ２ｍ　緩衝
液（ｐＨ８）　５０ｍ１に懸高し、遠心（ｌｏＩ］ｏｒ
ｐ黴、２０分）した。遠心上清に５５　ｘ　ＩＯ’ｌｌ
ｌの活性か抽出され、これに７ｗ／ｖ？ｃ’Ａｔｆ＆ア
ンモニウムを加えた後、フェニルセファロースＣＬ−４
８カラム（ファルマシア社製、２．２ｃ１１（直径）　
ｘ　１６ｃ！Ｉ１）に吸着させた。０．５Ｍ　ＮａＣｌ
　、　　Ｉ　Ｍ！′！！Ｍクアニシン、０．０１＄　Ｔ
ｗｃｅｎ８０　、７ｗ／ｖ％　硫酸アンモニウムを含む
５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐ　Ｉｉ　８　）て洗浄し
た後、　０．５ＭＮａＣｌ、ＩＭｔｌ酸グアニジン。

０旧％　Ｔｗｃｅｎ８０　、０．３Ｍショ糖を含む５０
ｍＦｈリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）て溶出を行なったとこ
ろ、２．３ｘ　Ｉｎ４ｉｌｌの活性か回収され、比活性
は１．１　ｘ　１０’ＩＵ１０ｔ１２ｏ、てあった。

続いて、この活性画分を銅キレーティンクセファロース
６Ｂカラム（ファルマシア社製、１ｃｍ（直径）　ｘ　
１３ｃｍ）に吸着させた。ＩＭＮａＣｉ。

Ｄ、ＯＩｔ　Ｔｗｃｃｎ８０を含む２０ｆｆｌ■トリス
１１２ｇ　（ｐＨ８）て洗浄した後、１５０ｍＭイミタ
ゾールをさらに含む上記洗浄用緩衝液て溶出したところ
１９　ｘ　１０４ＡｐｌＪの活性か回収された。

ＨＰＡタンパク賀はＮａＣｌの濃度を５０ｍ１ｌｌ以下
にすると沈殿することかわかっているのて、この両分を
Ｑ、ＯＩｔ　Ｔｗｃｅｎ８０を含む４０倍量の１０ｍＦ
トリス塩酸緩衝液（ｐ　ｕ　ａ　）て希釈し、遠心（１
０００ｒｐｌｍ。

２０分）することにより沈殿として回収した。これを、
　０．５Ｍアルギニンと０．ＯＩｔ　Ｔｗｅｃｎ８０を
含ＩＪ５０ｍＭｔ−リス塩酸緩衝液８１に溶解し、活性
等を調へた。１０　ｘ　ｌＯ’ｌＵの活性が回収され、
比活性は３．４　ｘ　ｌｏ’ｌＬＩ／ｍｇてあった。Ｓ
ＤＳポリアクリルアミドゲル゛屯気泳動て純度を調べた
ところ　ＩＩＰＡタンパク質以外のハントはほとんど、
認められず、精製度の高い標品か得られた。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）可溶性の異種タンパク質を疎水性クロマトグラフ
   ィー及び金属キレートクロマトグラフィーにそれぞれ架
   ける工程を含む異種タンパク質の精製方法。
2. （２）前記可溶性の異種タンパク質は、不溶性の異種タ
   ンパク質を可溶化したものである特許請求の範囲第１項
   記載の方法。
3. （３）前記異種タンパク質はヒトプラスミノーゲンアク
   チベーターである特許請求の範囲第１項又は第２項記載
   の方法。
4. （４）疎水性クロマトグラフィーの後に金属キレートク
   ロマトグラフィーを行なう特許請求の範囲第１項ないし
   第３項記載のいずれか１項に記載の方法。
5. （５）可溶化後、疎水性クロマトグラフィーの前に異種
   タンパク質のフォールディングを行なう特許請求の範囲
   第４項記載の方法。