JPH0679172A - クロマトグラフィー剤およびタンパク質、ポリペプチドまたは金属の分離のためのその使用法 - Google Patents

クロマトグラフィー剤およびタンパク質、ポリペプチドまたは金属の分離のためのその使用法

Info

Publication number
JPH0679172A
JPH0679172A JP3281243A JP28124391A JPH0679172A JP H0679172 A JPH0679172 A JP H0679172A JP 3281243 A JP3281243 A JP 3281243A JP 28124391 A JP28124391 A JP 28124391A JP H0679172 A JPH0679172 A JP H0679172A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
phosvitin
protein
modified
matrix
polypeptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP3281243A
Other languages
English (en)
Inventor
Sesuhadori Ramados Kandadai
セスハドリ ラマドス カンダダイ
Basanto Rakkuhei Hiten
バサント ラックヘイ ヒテン
Rajagopariengal Krishnaswamy Patnam
ラジャゴパリエンガル クリシナスワミイ パトナム
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BITSUTARU MARURIYA SCIENT RISA
BITSUTARU MARURIYA SCIENT RISAACHIFUAUNDEISHIYON
Vittal Mallya Scientific Research Foundation
Original Assignee
BITSUTARU MARURIYA SCIENT RISA
BITSUTARU MARURIYA SCIENT RISAACHIFUAUNDEISHIYON
Vittal Mallya Scientific Research Foundation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from IN480MA1990 external-priority patent/IN177752B/en
Priority to CA002044717A priority Critical patent/CA2044717A1/en
Priority to NZ238588A priority patent/NZ238588A/en
Priority to AU79115/91A priority patent/AU653941B2/en
Priority to GB9113096A priority patent/GB2248839B/en
Priority to IE209391A priority patent/IE67188B1/en
Application filed by BITSUTARU MARURIYA SCIENT RISA, BITSUTARU MARURIYA SCIENT RISAACHIFUAUNDEISHIYON, Vittal Mallya Scientific Research Foundation filed Critical BITSUTARU MARURIYA SCIENT RISA
Priority to JP3281243A priority patent/JPH0679172A/ja
Publication of JPH0679172A publication Critical patent/JPH0679172A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2462—Lysozyme (3.2.1.17)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g.hCG [human chorionic gonadotropin]; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/635—Parathyroid hormone, i.e. parathormone; Parathyroid hormone-related peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/665—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
    • C07K14/695—Corticotropin [ACTH]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • C07K14/80—Cytochromes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P3/00—Preparation of elements or inorganic compounds except carbon dioxide

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【目的】 タンパク質またはポリペプチドを分離、精製
し、あるいは生物学的材料から金属イオンを除去する方
法ならびにこれらの方法に使用するクロマトグラフィー
剤を提供する。 【構成】 臭化シアンで活性化したセファロースマトリ
ックスにホスビチンまたは変性ホスビチンを結合させる
ことにより特異的親和性を有するクロマトグラフィー剤
をつくり、これを用いてタンパク質またはポリペプチド
を分離、精製し、あるいは生物学的材料から金属イオン
を除去する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明はポリペプチドまたはタンパク質の
分離あるいは金属イオンの除去、ならびにこれに適した
クロマトグラフィー剤に関する。
【０００２】各種分離法に使用するためのクロマトグラ
フィー剤はこの分野で公知である。しかし、タンパク質
に対して特別な親和性をもつクロマトグラフィー剤に対
し大きな要望がある。レクチンおよびタンパク質Ａのよ
うな少数のタンパク質はアフィニティー分離に対しリガ
ンドとして使用される。しかしそれらの使用は限られて
いる。即ちレクチンは糖タンパク質の単離および精製に
対してのみ使用でき、またタンパク質Ａは免疫グロブリ
ンの単離および精製に対してのみ使用される。
【０００３】本発明者等は固定化されたホスビチンおよ
び変性ホスビチンがポリペプチドおよびタンパク質、と
りわけホスホ−セリンクラスターに対して高い親和力を
持つものの分離に対して勝れたクロマトグラフィー剤と
して作用することを発見した。
【０００４】ホスビチンが金属イオンに対し高い親和性
をもつことは公知である。本出願者等はこの性質が固定
化されたホスビチンによっても発揮され、これを金属キ
レートクロマトグラフィーの原理に基づいて働く系で利
用できることも発見した。金属イオン、例えば、Ｆ
ｅ3+、Ｆｅ2+、Ｃａ2+、Ｍｇ2+、Ｍｎ2+、Ｃｕ2+、Ｃｏ
2+およびＺｎ2+はすべて種々な触媒過程に関与するので
生物学的に非常に重要である。
【０００５】従って、本発明はポリペプチドおよびタン
パク質の分離および（または）精製のための、あるいは
生物学的材料から金属イオンを除去するためのクロマト
グラフィー剤の調整にホスビチンまたは変性ホスビチン
を使用する方法を提供するものである。
【０００６】本発明はまたポリペプチドおよびタンパク
質の分離および（または）精製に使用するために適当な
マトリックスへ固定化し結合させたホスビチンまたは変
性ホスビチンを提供するものである。
【０００７】ホスビチンまたは変性ホスビチンは組換え
ＤＮＡ技術によりつくられたことがあり、本明細書中で
用いた「ホスビチン」という用語は天然起源をもつ分子
および相当する組換え分子両方を包含する。変性ホスビ
チンの場合には、変性分子そのものを組換えＤＮＡ技術
によってつくることができ、あるいは組換えホスビチン
をつくってから変性することもできる。
【０００８】変性ホスビチンは、例えば次の修飾の一つ
以上を有しながら尚結合能力を保有するものである：炭
水化物の若干またはすべての除去；１種以上のアミノ酸
の除去；１種以上のアミノ酸の追加；１種以上の個々の
アミノ酸残基のところでの修飾；１種以上の個々のアミ
ノ酸残基の置換、例えばグルタミン酸によるアスパラギ
ン酸の、またはアルギニンによるリジンの置換；分子に
対する適当な物理的変化。
【０００９】必要に応じ、ホスビチンまたは変性ホスビ
チンを金属キレート錯体の形にしてもよい。ホスビチン
または変性ホスビチンは、ポリペプチドおよびタンパク
質の単離において、種々な個々のポリペプチドおよびタ
ンパク質をそれらの不純物から分離するために、そして
ポリペプチドおよびタンパク質を精製するために使用で
きる。
【００１０】従って、例えばクロマトグラフィー剤はタ
ンパク質またはポリペプチドの混合物をブイヨンや抽出
物から分割するために使用でき、そして（または）タン
パク質またはポリペプチドを実質的に純粋な（均一な）
形で得るために使用することもできる。
【００１１】非キレート化ホスビチンまたは変性ホスビ
チンも、生物学的材料から、とりわけ生物学的液体か
ら、例えば血液、血清または血漿からの金属イオンの除
去に使用することができる。
【００１２】本発明はポリペプチドまたはタンパク質の
分離および（または）精製、あるいは生物学的材料から
の金属イオンの除去の方法を更に提供するものであり、
この場合、クロマトグラフィー剤として適当なマトリッ
クスへ固定化し結合させたホスビチンまたは変性ホスビ
チンが使われる。
【００１３】ホスビチンはホスホリル化セリン残基に富
み、そしてこれらは該タンパク質にクラスターとして普
通存在する。セリンクランスターをもつタンパク質に関
するＸ−線結晶学データを調べると、これらクラスター
の形状はタンパク質ごとに著しく変化することがわか
る。このことから本出願者等はクラスター近傍のアミノ
酸がセリンクランスターのとりうる配置を要求している
ものと考える。
【００１４】本出願者等はまた、例えばシトクロム−
Ｃ、リゾチーム、ＥｃＯＲ1 およびヒト濾胞刺激ホルモ
ン（ＦＳＨ）のようなタンパク質が、固定化された形の
ホスビチンのホスホ−セリン残基に対して極めて高い親
和性を有することを発見した。これらタンパク質、例え
ばシトクロム−ＣおよびリゾチームはそれらのＣ−末端
領域近くに電荷集塊をもち、本出願者等はホスビチン上
のあるホスホ−セリンクラスター領域と相補性をもつ電
荷集塊領域がこれらタンパク質に見られる親和力現象に
関与していると考えている。
【００１５】観察された結合効果はタンパク質に多陰イ
オン性のホスビチン分子と多陽イオン性のタンパク質ま
たはポリペプチドとの間の一般化された静電気的相互作
用の結果ではないと考えられている。電荷集塊領域のと
ころに、あるいは領域内に相補的構造および形状を有す
るある種の特定のタンパク質およびポリペプチドと特異
的な相互作用に導くのは、ホスホセリンクラスター領域
のところの、あるいは領域内のホスビチン分子の特定の
構造および形状であると思われる。
【００１６】従って、本発明者等は適当な変性ホスビチ
ンは、特に、重要なホスホリル化セリン残基を保持して
いるもの、とりわけホスホリル化セリン残基のクラスタ
ーの若干あるいは全部、なるべくはクラスターの大部分
が保有されているものであるとの考えをもっている。こ
のようなクラスターの実質的に全部が保持されていると
有利である。
【００１７】相互作用に関与する仮定された領域に対す
るこれ以上の証拠は、リゾチームのアルギニン残基をジ
アセチルで修飾し、またシトクロム−Ｃのリジン残基を
無水酢酸で修飾する処理を行なった実験から得られる。
本出願者等はこれらの修飾によってホスビチン−セファ
ロースマトリックスに対するこれらタンパク質の結合性
が完全に失なわれることを見出した。
【００１８】従って、本発明に係る非キレート化クロマ
トグラフィー剤によって分離および（または）精製する
ことのできるポリペプチドおよびタンパク質は、とりわ
け、例えば種々な成長因子、ＤＮＡ結合性タンパク質
（初期遺伝子複製および転写過程に関与するもの）、お
よびＤＮＡ−およびＲＮＡ−変性酵素を含めて電荷集塊
を有するものである。例として次の表１に示すものがあ
げられる：
【表１】表 １ A. 成長ホルモン／因子 （イ) 副腎皮質刺激ホルモン （ロ）副甲状腺ホルモン （ハ）繊維芽細胞成長因子（酸性、塩基性両方） （ニ）アストログリア成長因子１および２ （ホ）網膜由来成長因子 （ヘ）眼由来成長因子 （ト）軟骨由来成長因子 （チ）内皮細胞成長因子
【００１９】 B. ＤＮＡ結合タンパク質： （イ) ＰＯＵ領域をもつタンパク質 （ロ）Ｈｏｍｅｏ領域をもつタンパク質 （ハ）亜鉛−フィンガータンパク質 （ニ）ロイシン ジッパータンパク質 （ホ）両親媒性ヘリックス−ループ−ヘリックスの中心
図形を含有するタンパク質 C. ＤＮＡ修飾酵素 D. ＲＮＡ修飾酵素 E. ＤＮＡ組換え融合タンパク生成物：
【００２０】シトクロム−Ｃやリゾチームのようなタン
パク質におけるある種の領域はホスビチンに対し強い親
和性を有するので、興味あるタンパク質に対し生物体に
コード化してこれら領域を含む融合タンパク質をつくる
遺伝子コード化と共に前記領域に相当する遺伝子の操作
技術は、本発明に係るホスビチン／変性ホスビチンクロ
マトグラフィー剤を使用する迅速かつ特異的な精製を容
易にするであろう。
【００２１】酵素ホスビチンが基質として作用するタン
パク質キナーゼを精製するため、以前に固定化ホスビチ
ンを使用する方法が提案された。しかし、このような使
用はこの特定の酵素群に限られていて、本発明に包含さ
れない。
【００２２】未変性形あるいは変性形にあるホスビチン
をクロマトグラフィーリガンドとしての使用に著しく適
合せしめるその化学的かつ構造的な特徴は、電荷集塊相
互作用の原理に基づくと考えられるが、これはまた金属
キレートの形成にも役立つ。
【００２３】金属キレートを形成するこの能力は生物学
的および非生物学的材料からの金属の除去に利用される
だけでなく、金属−キレートクロマトグラフィー媒質の
形成にも使用され、そしてこれを生物学的および非生物
学的両方の材料の分離および（または）精製に使用でき
る。従って、本発明者等は金属を含むタンパク質および
金属イオンに対し大きい親和性をもつタンパク質を金属
キレートクロマトグラフィーにより精製できると考えて
いる。
【００２４】従って、例えば本出願者等は亜鉛と適当に
キレート化したホスビチン−セファロースマトリックス
がタンパク質に対して親和性を発揮する複合体を生ずる
ことをここに発見した。例えば、このものは卵白から少
なくとも２種類のタンパク質（１１０Ｋｄおよび１２０
Ｋｄ）に強い結合を示した。同様に、Ｆｅ3+、Ｆｅ2+、
Ｃｏ2+およびＣａ2+をホスビチンに結合させたキレート
錯体をつくり、そしてこれを金属依存型酵素および他の
タンパク質の精製に使用することができ、またホスビチ
ン親和性材料の鉄キレート錯体は溶媒から過酸化物を除
去するために使用できる。本出願者等はトリプシン処理
ホスビチンの金属イオンに対する高い親和性も実証し
た。このようにして、例えば本出願者等はＦｅ−ＥＤＴ
Ａにより触媒される脂質酸化を抑制することを発見し
た。Ｆｅ−ＥＤＴＡはpH４．５の５０mM酢酸ナトリウム
緩衝液、Ｔｗｅｅｎ２０中に分散させた１００マイクロ
モルのリノール酸およびＦｅＳＯ4 またはＦｅ（II）−
ＥＤＴＡ錯体としての鉄２〜１０μＭを全体積が１mlと
なるように合わせたものである。この反応で２６℃にお
いて生成する共役ジェンヒドロペルオキシドを２３４nm
で追跡した。この検定系に１〜５μｇのトリプシン処理
ホスビチンを添加すると、検定条件下で脂質酸化の８５
％より多くが抑制され、もし鉄をホスビチンと前以てイ
ンキュベーションすると脂質酸化が完全に抑制された。
このことは変性ホスビチンによって金属が能率よく除去
されることを示している。同様に、血清に加えられた塩
化鉄(III) もホスビチンの添加により除去され、このホ
スビチンはＣａＣｌ2 （１０〜２０mM）の使用により血
清から沈殿させることができる。
【００２５】未変性形あるいは変性形のホスビチンが金
属イオンに対して発揮する大きい親和性は、ホスビチン
マトリックスも重金属イオンを含めて過剰の金属イオン
を生理学的液体、特に血液から、例えば血液透析により
取り除くために使用できることを示している。たとえ
ば、鉄過剰負荷状態の場合に、Ｃｏｏｌｅｙ貧血の血清
から鉄の除去のためにホスビチンマトリックスを使用で
きる。
【００２６】ホスビチンは鳥や魚の卵に見出される天然
産タンパク質である。ホスビチンは例えばＪ．Ａｍ．Ｃ
ｈｅｍ．Ｓｏｃ．〔１９４９〕７１、３６７０に記載の
ように幾つかの公知の技術により精製された形（電気泳
動的に均一）で得ることができる。このように本発明に
用いるクロマトグラフィー剤は、天然に豊富に存在しか
つ比較的容易に精製できるタンパク質を利用するという
利点をもつ。
【００２７】ホスビチンのβ−形を使用すると有利であ
る。このものはα−形よりリン酸含量が高い。
【００２８】本発明はホスビチンそのものから調整しよ
うがしなかろうが、ホスビチンの変性形の使用ならびに
最初から変性ホスビチンを用いる可能性をも包含するも
のである。クロマトグラフィー剤調製時のどこか適当な
段階で一つ以上の変性を行なう可能性をあげることがで
きる。本発明はホスホセリンクラスターをもつ変性ホス
ビチンを更に提供するものである。ホスホセリンクラス
ターの領域のところのそして領域中の変性ホスビチン分
子の構造および形状は、未変性ホスビチンが特異的相互
作用をなしうるタンパク質およびポリペプチドと特異的
に相互作用することが可能なものである。
【００２９】金属イオンに対する親和性、例えばホスビ
チンがもつのと、実質的に同じ親和性をもつ変性ホスビ
チンを特に説明しなければならない。
【００３０】鎖長に対する修飾は、例えば化学的および
（または）酵素的手段、例えばプロテアーゼのトリプシ
ンを用いたタンパク質分解により実施できる。ホスビチ
ンはタンパク質分解に対し抵抗性があると一般に考えら
れているので、このタンパク質分解が可能であることが
分かったのは意外なことである。この方法で修飾され適
当なマトリックス上に固定化されたホスビチンは特に高
い結合能力を有しうる。
【００３１】特定のアミノ酸残基に向けられた他の化学
的および（または）酵素的変性も可能である。更にま
た、もしホスビチンに対する遺伝子を他の生物にクロー
ン化して組換えホスビチンをつくれば、特定のアミノ酸
を変えるためには、例えばアスパラギン酸をグルタミン
酸にあるいはリジンをアルギニンに変えるために、部位
特異的変位誘発を用いることができる。このような修飾
は分子生物学において公知である。もし得られた組換え
ホスビチンまたは変性ホスビチン分子が未だホスホリル
化されていないならば、一般にホスホリル化反応を実施
すべきである。
【００３２】ホスビチン、あるいは例えば上記のように
修飾されたホスビチンは自然のままのグリコシル化形に
あることもあれば、それを部分的にまたは完全に脱グリ
コシル化することもある。脱グリコシル化法は文献に記
載されている。アスパラギンに結合した（Ｎ−結合し
た）グリコシル化部分の除去についてはＴａｒｅｎｔｉ
ｎｏ Ａ．Ｌ．、Ｇｏｍｅｚ Ｇ．Ｍ．およびＰｌｕｍ
ｍｅｒ Ｔ．Ｈ．、（１９８５）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ、２４，４６６５〜４６７１を、またセリンおよ
びトレオニンに結合した（Ｏ−結合した）グリコシル化
部分の除去については、Ａ．Ｓ．Ｂ．Ｅｄｇｅ等（１９
８１）、Ａｎｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ、１１８、１３１
〜１３７を参照のこと。
【００３３】ホスビチンの適当な物理的修飾も述べてお
かねばならない。二つあるいはそれ以上の修飾はいずれ
か適当な順序で行なうことができる：例えばアミノ酸順
序の変化および（または）鎖長変化を脱グリコシル化の
前後いずれかで実施できる。特に断らない限り、本明細
書中で「ホスビチン」という語を引用したときは変性ホ
スビチンを包含するものとする。また本発明はポリペプ
チドあるいはタンパク質の分離および（または）精製に
使用できる適合性を留めている変性ホスビチンを提供す
る。
【００３４】本発明に従って使用されるクロマトグラフ
ィー剤は公知の方法により調製できる。例えば「セファ
ロース結合レクチンを使用する血清糖タンパク質の新分
析法」、Ｓ．ＴｈｏｍｐｓｏｎおよびＧ．Ａ．Ｔｕｒｎ
ｅｒ、Ｌｅｃｔｉｎｓ、Ｇ．Ｃ．Ｂｏｇ−Ｈａｎｓｅｎ
およびＤ．Ｌ．Ｊ。Ｆｒａｅｄ、４５３〜４５８頁、Ｓ
ｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ発行、１
９８８参照。ホスビチンはマトリックスに直接付けるこ
ともあれば、スペーサーアームを用いて間接的に付けら
れることもある。
【００３５】このようにして適当なマトリックスに固定
化し結合させたホスビチンまたは変性ホスビチンからな
るクロマトグラフィー剤は、混合物のpHをなるべくは
８．０から８．３の範囲にするように緩衝剤の存在下
で、ホスビチンをマトリックスと混合し、過剰のホスビ
チンのリガンドを洗浄し去り、次に混合物をアミンで処
理することによりマトリックスの残りの活性基を封鎖し
てホスビチン−マトリックス結合体をつくり、得られた
生成物を洗浄し、ホスビチン−マトリックス結合体を回
収することからなる方法により製造できる。
【００３６】マトリックスは例えばセファロースゲルで
よい。本発明者等はＣＮＢｒ活性化セファロースを使用
し、これがホスビチンおよび変性ホスビチンと効果的に
結合し、固定化することを発見した。臭化シアンによる
セファロースの活性化およびこのような活性化されたマ
トリックスへのレクチンのようなタンパク質の結合はこ
の分野で公知である。臭化シアンで活性化したセファロ
ースに加えて他の支持体媒体／マトリックス、例えばア
ガロース、アクリルアミド、シリカおよび適当
【００３７】な繊維（合成および天然両方）（これらは
タンパク質との結合ができるように適当に修飾される）
も使用できる。親和性物質の結合能力を増加させるため
にカップリングに常用される６から１２炭素原子含有の
スペーサーアーム、例えば６−アミノヘキサン酸または
１，４−ビス（２，３−エポキシプロポキシ）ブタンを
使用すると更に、利点が得られる。
【００３８】使用されるホスビチン対マトリックスの重
量比は例えば実質的に０．００５：１でよい。膨潤した
活性化セファロースまたは他のマトリックス１ml当りホ
スビチン６から１０mgの使用が推奨される。本発明者等
が観察したカップリングの最大量は約６mg／mlである。
このタンパク質範囲は、例えばタンパク質精製に十分な
能力を有するアフィニティー製品を与える。
【００３９】ホスビチンとマトリックスとの混合は、例
えば４から２５℃の範囲の温度で、更に詳しく言えば大
体４℃で実施できる。
【００４０】マトリックスへのホスビチンの結合は適当
な緩衝剤の存在下で行なう。アミン官能基に対して反応
性のある活性化マトリックスに対しては、この緩衝剤が
第１級アミンを含有しないことが好ましい。それはもし
カップリング用緩衝剤が結合させるべきタンパク質リガ
ンドと共に反応性アミノ基を含むなら、マトリックスへ
付着するタンパク質リガンドの量が減少し、その結果ア
フィニティー容量が低下するからである。アミノ基を欠
くどの緩衝剤も使用できるが、重炭酸ナトリウムおよび
ホウ酸塩緩衝剤が最も好ましい。一般に緩衝剤は８．０
から８．３の範
【００４１】囲のpHを与えねばならない。約０．５Ｍの
ＮａＣｌを含有する重炭酸ナトリウム緩衝剤を用いると
非常に好結果が得られる。実質的に８．３のpHを有しか
つ０．５Ｍ ＮａＣｌを含有する０．１Ｍ ＮａＨＣＯ
3 緩衝剤の使用を特に述べておかねばならない。
【００４２】マトリックスとのカップリング後過剰のリ
ガンドを、例えばカップリングに対して使用した緩衝剤
で洗浄し去り、その後できるだけ早く残存活性基を一般
にアミンまたはアミノ酸で封鎖する。第１級アミンが特
によい。エタノールアミンを使用すると特に好結果が得
られる。過剰の反応性部位の封鎖にアミノ酸も使用でき
るが、これらは望まない電荷を持ち込むので余り好まし
くない。アミンは例えば０．１〜１．０Ｍの濃度で使用
でき、１Ｍエタノールアミンが特に適している。
【００４３】封鎖反応は、例えば７．５から９．５のp
H、更に詳しく言えば実質的に９のpHで行なうことがで
きる。この反応は例えば２から１８時間、例えば大体１
６時間行なう。４から２５℃の範囲内の温度、例えば大
体４℃の温度を用いるのが適している。とりわけ４℃の
温度においてpH９で１６時間１Ｍエタノールアミンによ
る封鎖を特に述べておかねばならない。
【００４４】得られたホスビチン−マトリックス結合体
を一般的には次に洗浄して、もしあるとすれば非特異的
に結合したタンパク質をマトリックスから除去する。通
常は二つの異なるpH、更に詳しく言えば交番するpHの２
回以上のサイクルが使用される。サイクル数は一般に３
であるが、このようなサイクル数に特に制限はない。例
えば３回の洗浄サイクルを行なう場合、各サイクルは例
えば０．５Ｍ ＮａＣｌを含む０．１酢酸塩緩衝液（pH
４）、続いて０．５Ｍ ＮａＣｌを含む０．１Ｍ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（pH８．０）による洗浄からなる。本出願
者等は一般に３回のこのような洗浄で非特異的に結合し
たタンパク質（もしあれば）をマトリックスから除去で
きる（２８０nmにおける吸光度により決定）ことを見出
した。このクロマトグラフィー剤を次に濾過により採取
する。活性化マトリックスへタンパク質を結合させる際
に用いられる洗浄および回収の手順は公知である。
【００４５】次にクロマトグラフィーカラムの調製を公
知の方法により行なう。例えば、適当なカラムにホスビ
チンマトリックスを詰めた後、例えばＴｒｉｓ ＨＣｌ
緩衝液で、適当には１０から５０mM Ｔｒｉｓ ＨＣ
ｌ、pH７．５から８．５で平衡化を行なう。適当な流速
は０．２５ml／分である。
【００４６】金属キレートをつくるには、平衡化後のカ
ラムを金属イオン含有の適当な緩衝液で処理するが、通
常は平衡化に用いたものと同じ緩衝液、例えば０．１Ｍ
酢酸亜鉛、０．１Ｍ塩化第二鉄、または０．１Ｍ塩化カ
ルシウムを含む１０mM Ｔｒｉｓ緩衝液（pH７．５）を
この段階で使用する。このような金属含有緩衝液２から
３カラム容をカラムに通過させるのが適当で、次にこの
カラムを緩衝液単独で平衡化する。
【００４７】例えば溶媒から過酸化物を除去するため、
金属キレート、例えば鉄キレートを有するビーズの調製
も述べておかねばならない。このようなビーズの製造法
は文献に記載されている。
【００４８】本発明はまた適当なマトリックスに固定化
し結合させた金属キレート錯体の形でホスビチンを含有
するクロマトグラフィー剤および望むならば適当なマト
リックスに固定化し結合させた金属キレート錯体の形
で、変性ホスビチンを含有するクロマトグラフィー剤、
ならびに前記製造法を提供するものである。
【００４９】タンパク質／ポリペプチドの分離または精
製あるいは金属イオンの除去のための実際の方法は公知
の方法に従い、例えば下記の用意された計画案を用いて
実施できる。
【００５０】前記のようにカラムを調製し、平衡させ
る。次にカラムに粗製物質（例えば１．０から５．０mg
／mlのタンパク質あるいは金属含有物質を含む）を充填
する。例えば１０，０００回転／分で、例えば１０から
３０分、適宜４℃で遠心する。次にカラムをすべての非
結合性タンパク質が洗浄されるまで平衡化緩衝液で洗浄
し、カラムを、例えばＴｒｉｓ ＨＣｌ緩衝液（１０か
ら５０mM Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、pH７．５から８．５が適
当）を用い０．１Ｍから２Ｍ ＮａＣｌの直線性傾斜で
溶離する。適当な体積のフラクションを集め、洗液およ
び溶離液を２８０nmにおける吸光度でモニターする。金
属キレート錯体に対しては、溶離を行なうために緩衝液
のpHを一般に下げる。金属を除去するには、一般に塩に
よる溶離は行なわないが、もしタンパク質が結合してい
るならば塩溶離を必要とするかもしれない。
【００５１】従って、本発明はポリペプチドまたはタン
パク質、とりわけホスホ−セリンに対して親和性をもつ
ものの分離および（または）精製法を提供するものであ
り、本法は適当なマトリックスに固定化し結合させたホ
スビチンまたは変性ホスビチンからなるクロマトグラフ
ィー剤を含み前以て平衡化剤で平衡化したクロマトグラ
フィーへポリペプチドまたはタンパク質を充填し、そし
てカラムを塩溶液で溶離することによってポリペプチド
またはタンパク質を得ることからなる。
【００５２】例えば、卵白に由来するリゾチームを精製
するには、平衡化剤はpH６．２４の６６Ｍ ＫＨ2 ＰＯ
4 でよく、溶離に用いる緩衝剤は２００mM ＮａＣｌを
含むpH６．２４の１００mM ＫＨ2 ＰＯ4 でよい。
【００５３】制限酵素の精製に対しては、平衡化剤は、
例えばpH７．５を有しかつ５０mMＮａＣｌ、５mM Ｍｇ
ＳＯ4 および１mM ＤＴＴを含む１０mM Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌでよく、そして塩溶液は例えばpH７．５を有し、か
つ１．５Ｍ ＮａＣｌ、１０mM ＫＣｌ、１００μｇ／
mlのＢＳＡおよび１mM ＤＴＴを含む１０mM Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌでよい。
【００５４】カラム操作は４℃で適当に行なう。酵素の
場合には活性を測定し、ホルモンに対しては推奨される
免疫検証を実施する。
【００５５】下記の例により本発明を説明する。
【００５６】例１ホスビチンの精製 鶏卵黄を分離し、卵黄膜を破り、内容物を流し出すこと
により卵黄物質を得た。卵黄内容物（１００グラム）を
卵黄物質の体積の５．５倍の０．１１Ｍ ＭｇＳＯ4 に
懸濁し、激しく混合した。混合物を４℃に１８時間保ち
沈殿させた。この沈殿を７０mlの０．４Ｍ（ＮＨ4 ）2
ＳＯ4 に分散させ、pHを４．０に調節した。分散液を十
分よく混合し、遠心した。上澄をエーテル３０mlで抽出
し、これを３回繰り返した。抽出の終わる毎に水層を分
離した。全部の水性フラクションを一緒にためておき、
９５％飽和となるまで（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 で処理した。
飽和混合物を４℃で一晩放置した。
【００５７】沈殿したタンパク質を遠心し、水に溶か
し、蒸留水に対して４℃で４８時間透析した。８時間毎
に水を取り替えた。透析したタンパク質溶液を凍結乾燥
した。 収量：１００ｇの卵黄から２９０mgの乾燥タンパク質を
得た。
【００５８】精製されたホスビチンを次にゲル濾過によ
り濾過したα形とβ形に分けた。これを行なうには、Ｓ
ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２００カラム（１０４×２．５cm）
を１００mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH５．０）で平衡化
し、このカラムに透析したタンパク質５０mgを充填し
た。溶離液中の蛋白質をＯＤ280 によりモニターした。
タンパク質のリン酸含量の分析から二番目のピークがβ
形に相当することが分かった。このピークフラクション
を集め、蒸留水に対して透析した。透析したタンパク質
溶液を凍結乾燥した。充填したタンパク質５０mgのうち
３４mgがピークフラクション中に回収された。
【００５９】ホスビチンの分析： 1. リン酸塩（無機）：タンパク質に対するリン酸の算
定はモリブデン酸アンモニウム法〔Ａｎａｌ．Ｃｈｅ
ｍ．（１９５５）２８、１７５６〕を用いて行なった。
消化したタンパク質（Ｈ2 ＳＯ2 ＋ＨＮＯ3 消化）を分
析に付した。β形は１０．７〜１１．８％のリンを含ん
でいた。 2. タンパク質の算定：タンパク質の算定に対してはＬ
ｏｗｘｙ法〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９５１）、
１９３、２６５〕を用いた。
【００６０】電気泳動分析：電気泳動は１０％均質ポリ
アミドゲル上でＴｒｉｓ−グリシン緩衝液（pH８．３）
を用いて行なった。精製されたタンパク質は単一の主要
帯を示した。その後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での分析は精
製タンパク質の分子量が３０，０００から３５，０００
の範囲にあることを示した。このタンパク質に付随する
主な不純物は無かった。
【００６１】例２クロマトグラフィー剤の調製：ホスビチンの固定化とカ
ップリング
【００６２】凍結乾燥した粉末状の臭化シアン活性化セ
ファロース３ｇを１mM ＨＣｌ中で膨潤させ、焼結ガラ
ス中１mM ＨＣｌで１５分洗浄した。次にゲルを蒸留水
で洗浄した。例１で調製した自然のままのグリコシル化
形にあるホスビチン（１５mg）を、０．５Ｍ ＮａＣｌ
含有０．１Ｍ ＮａＨＣＯ3 （pH８．３）２５mlに溶か
した。これをゲル（１０ml）と混合し、４℃でおだやか
に一晩回転させた。０．５Ｍ ＮａＣｌを含む０．１Ｍ
ＮａＨＣＯ3 （pH８．３）で過剰のリガンドを洗い去
り、残存する活性基を１Ｍエタノールアミン（pH９．
０）で４℃において１６時間処理することにより封鎖し
た。次にゲルを交番するpHの３回サイクルで洗浄した。
各サイクルは０．５Ｍ ＮａＣｌを含む０．１Ｍ酢酸塩
緩衝液（pH４．０）およびそれに続く０．５Ｍ ＮａＣ
ｌ含有０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．０）での洗
浄からなる。結合したホスビチン−セファロースを、
０．５Ｍ ＮａＣｌおよび０．０２％アジ化ナトリウム
を含有する１００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．０）中
に４から８℃で貯蔵し、後述する例で使用した。
【００６３】例３ホスビチン−セファロースクロマトグラフィー剤の結合
容量の例示 ホスビチン−セファロース クロマトグラフィー剤の１
ml床体積カラムを使用した。このカラムはpH７．５の５
０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌであらかじめ平衡化させた。
【００６４】一つのこのようなカラムに０．２５mgのシ
トクロム−Ｃ（ウマの心臓から得たもの）を平衡化緩衝
液に溶かして充填した。緩衝液による洗浄は４１０nm
（シトクロム−Ｃのソーレー吸収帯）に吸収をもつ物質
が無視しうる量であることを示した。このカラムからタ
ンパク質を、２０mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH６．
５）で溶離した。溶離された試料の回収率は９０％より
多かった。
【００６５】特異性を調べるため、シトクロム−Ｃを可
溶性ホスビチンと反応させ、次にホスビチン−セファロ
ースに充填した。充填した混合物はカラムに結合せず、
従ってシトクロム−Ｃの結合領域が既にホスビチンでマ
スクされたことがはっきり示される。
【００６６】これによりカラム材料、即ちホスビチンの
効力が確立された。
【００６７】例４卵白からのリゾチームの精製 ホスビチン−セファロース４Ｂカラム（床体積５ml）を
この目的に用いた。卵白を６６mM ＫＨ2 ＰＯ4 （pH
６．２４）で希釈してＯＤ280 を約１０／mlに調節し
た。この希釈卵白形１０mlを、前以て６６mM ＫＨ2 Ｐ
Ｏ4 （pH６．２４）で平衡化したホスビチン−セファロ
ース上に充填した。蠕動ポンプを用いて流速を１ml／３
分に維持した。充填終了後、カラムを６６mM ＫＨ2 Ｐ
Ｏ4 （pH６．２４）で洗浄した。Ａ280 の読みがＯＤ
０．０５より下になったならば、２００mM ＮａＣｌを
含む１００mM ＫＨ2 ＰＯ4 （pH６．２４）でカラムを
溶離した。各フラクション（１ml体積）をＡ280 吸光度
ならびに酵素活性についてモニターした。
【００６８】酵素活性は必要量のＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｌｕｔｅｕｓ細胞浮遊液を含む６６mM ＫＨ2 ＰＯ
4 （pH６．２４）中２５℃で測定した。本明細書中で１
単位とは、検定条件下で４５０nmにおける光学密度低下
０．１／分と定義する。酵素単位で表わした全充填量
は、タンパク質１mg当り比活性３９．６単位を用いて４
３００となった。塩による溶離は４２０以上の範囲の比
活性で７０％以上の回収率を示した。同一条件でＳｉｇ
ｍａから得た３回再結晶した製剤は４３７の比活性を示
した。
【００６９】この酵素製剤をドデシル硫酸ナトリウム
ポリアクリルアミド電気泳動により分析したところリゾ
チームのほかに少量のオボアルブミン（４５，０００の
分子量をもつ）を含むことが分かった。
【００７０】例５ホスビチン−セファロースへのＥＣｏＲＩおよびＢａｍ
ＨＩの結合 Ｂｎａｇａｌｏｒｅ Ｇｅｎｅｉ Ｃｏｍｐａｎｙから
得たこれら制限酵素の各々２００単位を、５０mM Ｎａ
Ｃｌ、５mM ＭｇＳＯ4 および１mM ＤＴＴを含む１０
mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）で前以て平衡化した
ホスビチン−セファロース４Ｂの別々のカラム上に充填
した。１．５Ｍ ＮａＣｌ、１０mM ＫＣｌ、１００μ
ｇ／mlのＢＳＡおよび１mM ＤＴＴを含む１０mM Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）でこれら酵素を溶離した。塩
濃度が１．０Ｍであるとき酵素の溶離はなかった。この
検定は精製ＰＵＣ８プラスミドの線形化とその後のＴｒ
ｉｓ−ホウ酸塩ＥＤＴＡ緩衝系中１％アガロースゲル上
でのＤＮＡの電気泳動に基づいた。
【００７１】例６ＦＳＨ結合と溶離 ホスビチン−セファロース４Ｂカラム（床体積０．２５
ml）を使用した。カラムを１０mM Ｔｒｉｓ ＨＣｌ
（pH７．７５）で平衡化した。このカラムにヒト濾胞刺
激ホルモン（７単位／リットルに相当）を充填した。カ
ラムを平衡化に用いた緩衝液で洗浄し、０．２５mlずつ
８フラクションを集めた。次に１Ｍ ＮａＣｌを含む１
０mM Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（pH７．７５）でカラムを溶離
し、０．２５mlずつ８フラクションを集めた。これらフ
ラクションをＤｅｌｆｉａR 検定にかけた。ＦＳＨは溶
離緩衝液の３番目のフラクションに定量的に回収され
た。
【００７２】例７副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）に対するホスビチン
−セファロースの親和性 ホスビチン−セファロース（床体積０．２５ml）を１０
mM Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（pH７．７）で平衡化させた。２
００μｌのＡＣＴＨ（ヒト）（１mg／ml）をカラムに充
填し、カラムを同じ緩衝液で洗浄した。カラムを初めに
１Ｍ ＮａＣｌを含む１０mM Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（pH
７．７）で溶離した。洗液および塩溶出液を放射線免疫
検定により分析した。ＡＣＴＨはカラムに結合し、１．
０ ＮａＣｌにより溶離されることが観察された。
【００７３】例８副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ４４−６８）に対するホスビ
チン−セファロースの親和性 ホスビチン−セファロース（床体積０．２５ml）を１０
mM Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（pH７．７）で平衡化させた。２
００μｌの副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）（４４〜６８）
８７２pmol／リットルを充填した。カラムを先ず１Ｍ
ＮａＣｌを含む１０mM Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（pH７．７）
で溶離し、二番目の溶離は１．５Ｍ ＮａＣｌを含む１
０mM Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（pH７．７）を用いて行なっ
た。洗液および塩溶出液に対する分析は放射線免疫検定
により行なった。１Ｍ ＮａＣｌでは溶離が行なわれ
ず、ホスビチン−セファロースカラムからＰＴＨを溶離
するためには１．５Ｍ ＮａＣｌが必要であり、このこ
とでは強い結合形成を示している。
【００７４】ホスビチン−セファロースはまた血清試料
からｈＡＣＴＨおよびｈＰＴＨに結合することが例７お
よび例８から明らかとなる。
【００７５】変性ホスビチンを用いた例 例９ホスビチンの修飾 自然のままのホスビチンを下記のようにトリプシンでタ
ンパク質分解を行なうことにより修飾した。
【００７６】トリプシン処理 ホスビチン（ＦＰＬＣ系でＭｏｎｏ Ｑカラム上で精
製）を２０mM ＴｒｉｓＨＣｌ（pH７．５）に２０mg／
mlの濃度でとり、トリプシンで処理した（ホスビチン：
トリプシン比（ｗ／ｗ）１００：１）。混合物を３７℃
で１時間インキュベーションした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上
で天然タンパク質は２８〜３２ｋＤａ付近に３つの主要
帯を示した。トリプシンで処理したホスビチンは１つの
主要帯を２６ｋＤａに示し、他の二つは８０００〜１４
０００付近の分子量に相当することが分かった。
【００７７】トリプシン処理ホスビチンの精製 トリプシン処理ホスビチンをＣｕ (II) イミノ−酢酸、
金属キレートクロマトグラフィーに付した。この目的に
対して、キレート化セファロース速流カラム（１ml、Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ）を、カラム全体が着色するまで５０
mM硫酸銅溶液が平衡化した。次にカラムを０．５Ｍ Ｎ
ａＣｌを含む２０mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH７．
５）で平衡化し、これに２００μｌ（２mg）のタンパク
質溶液を充填した。このカラムを、０．５Ｍ ＮａＣｌ
を含む２０mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH７．５）（緩
衝液Ａ）および０．５Ｍ ＮａＣｌを含む２００mMリン
酸ナ
【００７８】トリウム緩衝液（pH３．５）（緩衝液Ｂ）
を用いてつくり出したpH傾斜を用いて展開した。すべて
の操作はＦＰＬＣ系（ｐｈａｒｍａｃｉａ）で２１℃に
おいて実施した。若干のＡ280 吸収物質（即ち、２８０
nmに吸収をもつもの）（ピークＰ１）が緩衝剤Ａ洗浄で
溶離され、その後、傾斜の終りでpHを３．５に維持し続
けるともう一つのタンパク質（ピークＰ２）が得られ
た。これらのピークをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、ピー
クＰ２が２６０００の分子量に相当するホスビチンの端
を切り取った異形であることが確認された。
【００７９】分析結果 端が切り取られたホスビチンの分子量は天然タンパク質
と比較して約４０００から５０００少なかったけれど
も、そのリン酸および炭水化物含量は本質的に同様なま
ま保たれた。
【００８０】例１０端を切り取ったホスビチンの固定化 Ｐ２フラクションを５ｍＡ ＥＤＴＡに対して、次にＭ
ｉｌｌｉ Ｑ水に対して透析した。透析したタンパク質
を凍結乾燥し、ＣＮＢｒ活性化セファロースに共有結合
により付けた（カップリングの実験計画はホスビチン−
セファロースに対して述べたものと同じである）。結合
されたマトリックス１mlは典型的にはタンパク質６mgを
含む。
【００８１】この結合後のマトリックスをＰ２−セファ
ロースと称することとし、下記のようにその結合特性に
ついて試験した。
【００８２】例１１Ｐ２−セファロースに対するシトクロム−Ｃの親和性 このマトリックス（床体積０．５ml）を２０mM Ｔｒｉ
ｓ ＨＣｌ（pH７．５）で平衡化させた。カラムにウマ
心臓シトクロム−Ｃ（Ｓｉｇｍａ）２００μｌ（１mg／
ml）を充填した。カラムをＡ２８０が殆どゼロになるま
で平衡化緩衝液で洗浄し、次に１Ｍ ＮａＣｌを含む２
０mM Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（pH７．５）で溶離した。塩で
溶離したフラクションは４１０nmにソーレー吸収帯を示
した。ナトリウム ジチオナイト還元はα，βおよびγ
帯を出現させ、シトクロム−Ｃの存在に確証を与えた。
【００８３】Ｐ４−セファロースに対するシトクロム−
Ｃの結合性はホスビチン−セファロースマトリックスに
対するそれと非常によく類似した。
【００８４】例１２Ｐ２−セファロースに対するリゾチームの親和性 床体積０．５mlのＰ２−セファロースカラムを２０mM
Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（pH７．５）で平衡化した。このカラ
ムに１４mg／mlリゾチーム（Ｓｉｇｍａ）５００μｌを
充填した。マトリックスをＡ280 がゼロになるまで平衡
化緩衝液で洗浄し、次に１Ｍ ＮａＣｌを含む２０mM
Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（pH７．５）で溶離し
【００８５】た。漏出分にもあるいは洗液フラクション
にも実質的にＡ280 吸収物質は現れなかった。塩で溶離
されたフラクション中にリゾチームの本質的に全量（＞
８５％）が回収された。溶離液中のリゾチームの存在は
それらフラクションを酵素検定法にかけることにより確
認された。Ｐ２−セファロースはゲル床体積１ml当り１
３〜１４mgのリゾチームに結合する能力をもつのに対
し、ホスビチン−セファロースに対する等価の能力は５
〜６mg／mlである。
【００８６】このカラムを卵白からのリゾチームの精製
に使用した。粗製卵白調製物を２０mM Ｔｒｉｓ ＨＣ
ｌ（pH７．５）で１０ ＯＤ（Ａ280 ）／mlに希釈し
た。Ｐ２−セファロースカラム（１ml）に５０ ＯＤの
粗製タンパク質を充填した。漏出タンパク質は認めうる
程のリゾチーム活性を示さなかったのに対して、１．０
Ｍ ＮａＣｌを含む２０mM Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（pH７．
５）の溶出物は非常に高い比活性を示した。
【００８７】実験で７．５mgのリゾチームを４２５ タ
ンパク質１mgの比活性を有するまで精製できた（単位の
定義：リゾチーム１単位は２５℃、pH６．２４において
０．１／分のＡ450 変化を起こす）。
【００８８】例１３Ｐ２−セファロース上でのＥｃｏＲＩの精製 ＥｃｏＲＩをＥ．ｃｏｌｉの株ＲＹ１３の抽出物から精
製した。Ｅ．ｃｏｌｉ（ＲＹ１３）Ｋ抽出物は次の実験
計画に従って調製した：
【００８９】この株をＬ−ブイヨン、pH７．０（トリプ
トン１０ｇ／リットル；ＮａＣｌ１０ｇ／リットル：グ
ルコース５ｇ／リットルおよび酵母エキス５ｇ／リット
ル）でＯＤ660 が１．０から１．１となるまで培養し
た。細胞を毎分１００００回転で１０分間遠心すること
により採取し、ＴＥＭ（２mM ＥＤＴＡおよび１mM β
−メルカプトエタノールを含む２０mM Ｔｒｉｓ ＨＣ
ｌ、pH７．５）で洗浄した。細胞をＴＥＭにとり、Ｓｏ
ｎｉｃｓ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａｌ；Ｖｉｂ
【００９０】ｒａ Ｃｅｌｌ Ｍｉｃｒｏｔｉｐを使用
して１０分間超音波処理することにより破壊した。溶解
したエキスを遠心し、上澄を５％（最終濃度）のストレ
プトマイシン硫酸塩で４℃において４５分処理した。溶
液を毎分１５０００回転で１５分遠心した。上澄液をＴ
ＥＭに対し２４時間透析した。透析した抽出物は典型的
には８．０mg／mlのタンパク質を含有した。
【００９１】Ｐ２−セファロース１mlをＴＥＭ緩衝液で
平衡化し、抽出物２mlをカラムに充填した。カラムをＡ
280 がゼロになるまで、ＴＥＭで洗浄し、次に１．５Ｍ
ＮａＣｌを含むＴＥＭで溶離した。ピークフラクショ
ンにＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を１００μｇ／mlの
最終濃度まで加え、ピークフラクションをＴＥＭに対し
て一晩透析し、ＥｃｏＲＩ活性を検定した。
【００９２】本発明者等はラムダＤＮＡ消化検定法を用
いてＥｃｏＲＩ活性を検出し定量した。本発明者等は床
体積１mlのＰ２−セファロースを用いて典型的には５５
００単位のＥｃｏＲＩを精製できる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヒテン バサント ラックヘイ インド国バンガローレ，ケイ．アール．ロ ード（番地なし） ビッタル マルリヤ サイエンティフィック リサーチ ファウ ンデイション 気付 (72)発明者 パトナム ラジャゴパリエンガル クリシ ナスワミイ インド国バンガローレ，ケイ．アール．ロ ード（番地なし） ビッタル マルリヤ サイエンティフィック リサーチ ファウ ンデイション 気付

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ポリペプチドまたはタンパク質の分離お
    よび（または）精製あるいは生物学的材料からの金属イ
    オンの除去のための方法に於いて、適当なマトリックス
    へ固定化し結合させたホスビチンまたは変性ホスビチン
    からなるクロマトグラフィー剤を使用する上記方法。
  2. 【請求項２】 ホスホセリンに対し親和性をもつポリペ
    プチドまたはタンパク質の分離および（または）精製法
    あるいは生物学的材料からの金属イオンの除去法におい
    て、適当なマトリックスへ固定化し結合させたホスビチ
    ンまたは変性ホスビチンからなるホスビチンクロマトグ
    ラフィー剤を含む前以て平衡化剤を用いて平衡させたク
    ロマトグラフィーカラムにポリペプチドまたはタンパク
    質あるいは生物学的材料を充填し、必要に応じ、前記カ
    ラムを塩溶液で溶離してポリペプチドまたはタンパク質
    あるいは無金属生物学的材料を得ることからなる上記方
    法。
  3. 【請求項３】 ホスビチンをトリプシンでタンパク質分
    解することにより修飾する、請求項１または請求項２の
    いずれか１項に記載の方法。
  4. 【請求項４】 ホスビチンまたは変性ホスビチンは金属
    キレート錯体の形にある、請求項１から請求項３までの
    いずれか１項に記載の方法。
  5. 【請求項５】 金属はＦｅ2+、Ｆｅ3+、Ｚｎ2+、Ｃ
    ｕ2+、Ｍｎ2+またはＣａ 2+である、請求項４記載の方
    法。
  6. 【請求項６】 タンパク質またはポリペプチドはリゾチ
    ーム、シトクロム−Ｃまたは制限酵素または成長ホルモ
    ンである、請求項１から請求項５までのいずれか１項に
    記載の方法。
  7. 【請求項７】 タンパク質またはポリペプチドは成長ホ
    ルモン、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ−またはＲＮＡ
    −修飾酵素あるいはＤＮＡ−組み換え融合タンパク質生
    成物である、請求項１から請求項５のいずれか１項に記
    載の方法。
  8. 【請求項８】 クロマトグラフィー剤を金属依存性酵素
    または他のタンパク質の分離および（または）精製に使
    用する、請求項４または請求項５記載の方法。
  9. 【請求項９】 生理学的液体から過剰の鉄を除去するこ
    とからなる、請求項１から請求項５のいずれか１項に記
    載の方法。
  10. 【請求項１０】 請求項１から請求項９のいずれか１項
    に記載された方法により得られる、分離および（また
    は）精製されたポリペプチドまたはタンパク質、あるい
    は金属イオンを除去した生物学的材料。
  11. 【請求項１１】 ポリペプチドまたはタンパク質の分離
    および（または）精製あるいは生物学的材料からの金属
    イオンの除去に供されるクロマトグラフィー剤調整のた
    めのホスビチンまたは変性ホスビチンの使用。
  12. 【請求項１２】 ポリペプチドまたはタンパク質の分離
    および（または）精製に使用するための、適当なマトリ
    ックスに固定化され結合されたホスビチンまたは変性ホ
    スビチン。
  13. 【請求項１３】 ポリペプチドまたはタンパク質の分離
    および（または）精製に、あるいは生物学的材料または
    他の材料からの金属イオンの除去に使用するための変性
    ホスビチン。
  14. 【請求項１４】 ポリペプチドまたはタンパク質の精製
    に使用するための金属キレート錯体の形にあるホスビチ
    ンまたは変性ホスビチン。
  15. 【請求項１５】 変性はトリプシンを用いたタンパク質
    分解による、請求項１３または請求項１４記載の変性ホ
    スビチン。
  16. 【請求項１６】 適当なマトリックスに固定化され結合
    された変性ホスビチンからなる、クロマトグラフィー
    剤。
  17. 【請求項１７】 変性はトリプシンを用いてのタンパク
    質分解による、請求項１６記載のクロマトグラフィー
    剤。
  18. 【請求項１８】 適当なマトリックスに固定化され結合
    された金属キレート錯体の形にあるホスビチンからなる
    クロマトグラフィー剤。
  19. 【請求項１９】 請求項１６または請求項１８記載のク
    ロマトグラフィー剤の製造法において、ホスビチンまた
    は変性ホスビチンを緩衝剤存在下にマトリックスと混合
    し、過剰のホスビチンリガンドを洗浄し去り、そして混
    合物をアミンで処理することによりマトリックスの残余
    活性基を封鎖してホスビチン−マトリックス結合物をつ
    くり、得られた生成物を洗浄することからなる上記方
    法。
  20. 【請求項２０】 膨潤マトリックス１ml当りホスビチン
    ６から１０mgの量でホスビチンをマトリックスと混合す
    る、請求項１９に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 ホスホセリンに対して親和性をもつポ
    リペプチドおよびタンパク質の分離および（または）精
    製に適した変性ホスビチン。
  22. 【請求項２２】 ホスホセリンクラスターを有する変性
    ホスビチンにおいて、ホスホセリンクラスターの領域の
    ところの、あるいは領域中の変性ホスビチン分子の構造
    および形状は、未変性ホスビチンが特異的相互作用の可
    能なタンパク質およびポリペプチドと変性ホスビチンが
    特異的に相互作用をなしうるような構造および形状であ
    る上記変性ホスビチン。
  23. 【請求項２３】 トリプシンを用いたタンパク質分解に
    より修飾されたホスビチン。
JP3281243A 1990-06-18 1991-10-28 クロマトグラフィー剤およびタンパク質、ポリペプチドまたは金属の分離のためのその使用法 Pending JPH0679172A (ja)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CA002044717A CA2044717A1 (en) 1990-06-18 1991-06-17 Process for the separation of proteins, polypeptides or metals
NZ238588A NZ238588A (en) 1990-06-18 1991-06-18 Process for the purification of a polypeptide or protein using immobilised phosvitin, removal of metal ions from biological material
AU79115/91A AU653941B2 (en) 1990-06-18 1991-06-18 Process for the separation of proteins, polypeptides or metals
GB9113096A GB2248839B (en) 1990-06-18 1991-06-18 Process for the separation of proteins or polypeptides
IE209391A IE67188B1 (en) 1990-06-18 1991-06-18 Process for the separation of proteins or polypeptides
JP3281243A JPH0679172A (ja) 1990-06-18 1991-10-28 クロマトグラフィー剤およびタンパク質、ポリペプチドまたは金属の分離のためのその使用法

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IN480MA1990 IN177752B (ja) 1990-06-18 1990-06-18
GB909020098A GB9020098D0 (en) 1990-06-18 1990-09-14 Chromatographic agent
JP3281243A JPH0679172A (ja) 1990-06-18 1991-10-28 クロマトグラフィー剤およびタンパク質、ポリペプチドまたは金属の分離のためのその使用法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH0679172A true JPH0679172A (ja) 1994-03-22

Family

ID=27265268

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP3281243A Pending JPH0679172A (ja) 1990-06-18 1991-10-28 クロマトグラフィー剤およびタンパク質、ポリペプチドまたは金属の分離のためのその使用法

Country Status (6)

Country Link
JP (1) JPH0679172A (ja)
AU (1) AU653941B2 (ja)
CA (1) CA2044717A1 (ja)
GB (1) GB2248839B (ja)
IE (1) IE67188B1 (ja)
NZ (1) NZ238588A (ja)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008500273A (ja) * 2003-12-22 2008-01-10 アレス トレーディング ソシエテ アノニム Ｆｓｈを精製するための方法
US7880192B2 (en) 2006-01-11 2011-02-01 Panasonic Corporation Nitride semiconductor light emitting element and nitride semiconductor light emitting device
US8059691B2 (en) 2006-03-14 2011-11-15 Sharp Kabushiki Kaisha Nitride semiconductor laser device and method of producing the same
US8879596B2 (en) 2009-12-15 2014-11-04 Osram Opto Semiconductors Gmbh Semiconductor laser

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113617060B (zh) * 2021-08-09 2023-02-10 福建省水产研究所（福建水产病害防治中心） 固定化酶凝胶亲和吸附柱制备方法及从河鲀中提取活性肽的方法

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008500273A (ja) * 2003-12-22 2008-01-10 アレス トレーディング ソシエテ アノニム Ｆｓｈを精製するための方法
JP4763616B2 (ja) * 2003-12-22 2011-08-31 アレス トレーディング ソシエテ アノニム Ｆｓｈを精製するための方法
US7880192B2 (en) 2006-01-11 2011-02-01 Panasonic Corporation Nitride semiconductor light emitting element and nitride semiconductor light emitting device
US8059691B2 (en) 2006-03-14 2011-11-15 Sharp Kabushiki Kaisha Nitride semiconductor laser device and method of producing the same
US8124431B2 (en) 2006-03-14 2012-02-28 Sharp Kabushiki Kaisha Nitride semiconductor laser device and method of producing the same
US8879596B2 (en) 2009-12-15 2014-11-04 Osram Opto Semiconductors Gmbh Semiconductor laser

Also Published As

Publication number Publication date
AU653941B2 (en) 1994-10-20
AU7911591A (en) 1991-12-19
IE67188B1 (en) 1996-03-06
CA2044717A1 (en) 1991-12-19
NZ238588A (en) 1994-05-26
IE912093A1 (en) 1991-12-18
GB2248839A (en) 1992-04-22
GB9113096D0 (en) 1991-08-07
GB2248839B (en) 1995-03-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5169936A (en) Protein purification on immobilized metal affinity resins effected by elution using a weak ligand
US4948874A (en) Purified protein G from streptococcal bacteria
US4629567A (en) Alpha-1-antiprotease purification
US5665868A (en) Chromatographic agent and its use for the separation or proteins, polypeptides of metals
SU1523046A3 (ru) Способ очистки человеческого @ -интерферона
KR100436857B1 (ko) 생물학적 공급원으로부터 인자나인을 제조하는 방법
KR960009051B1 (ko) 사람의 뇨로부터의 유용 단백질의 동시 제조방법
JPH0679172A (ja) クロマトグラフィー剤およびタンパク質、ポリペプチドまたは金属の分離のためのその使用法
JPH07126183A (ja) ビタミンｋ依存性タンパク質を含有する治療用途に適した薬剤的組成物
Hochuli Genetically designed affinity chromatography using a novel metal chelate absorbent
JPS62259596A (ja) ハイブリツドタンパク質の精製方法
US6555661B1 (en) Simple, environmentally benign, method for purifying protein A
CA2569821A1 (en) Process for protein isolation
Pogell et al. [32] Specific elution with substrate
Eastlake et al. Binding of univalent antibody fragments to a distinct antigenic determinant of staphylococcal nuclease
JP3508149B2 (ja) ヒト血清アルブミンおよびその製造方法
CN113402592B (zh) 一种使用imac层析纯化非标签化crm197蛋白的方法
CA1065305A (en) PROCESS FOR THE ENRICHMENT OF THE PREGNANCY-SPECIFIC .beta.1-GLYCOPROTEIN
WO2023012828A1 (en) Method to purify an antibody composition using cation exchange chromatography
JPH0795894A (ja) リポコルチンの精製方法
JPH05339297A (ja) オボトランスフェリンの分離方法
JP2714817B2 (ja) ウロキナーゼ前駆体の製造方法
JPS6317898A (ja) リンホトキシン類の精製法
JPS5810522A (ja) 不活化トロンビンゲルによるアンチトロンビン３の精製法
JPS61129199A (ja) ヒト・インタ−フエロンβの精製法