KR960009051B1 - 사람의 뇨로부터의 유용 단백질의 동시 제조방법 - Google Patents
사람의 뇨로부터의 유용 단백질의 동시 제조방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR960009051B1 KR960009051B1 KR1019920008884A KR920008884A KR960009051B1 KR 960009051 B1 KR960009051 B1 KR 960009051B1 KR 1019920008884 A KR1019920008884 A KR 1019920008884A KR 920008884 A KR920008884 A KR 920008884A KR 960009051 B1 KR960009051 B1 KR 960009051B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- chromatography
- urine
- albumin
- urokinase
- growth factor
- Prior art date
Links
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 title claims abstract description 54
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title abstract description 32
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title abstract description 32
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title 1
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 43
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims abstract description 28
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 claims abstract description 28
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 claims abstract description 28
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 claims abstract description 22
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 claims abstract description 21
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims abstract description 21
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 11
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 claims abstract 3
- 229940050528 albumin Drugs 0.000 claims description 25
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 19
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 14
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 11
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 9
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 9
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 claims description 8
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 claims description 5
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 claims description 5
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 claims description 5
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims description 5
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 claims description 4
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical compound [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 claims description 2
- -1 sulfopropyl Chemical group 0.000 claims description 2
- 150000001450 anions Chemical group 0.000 claims 1
- PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N benzamidine Chemical compound NC(=N)C1=CC=CC=C1 PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 abstract description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 abstract 2
- 238000007670 refining Methods 0.000 abstract 2
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 16
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 8
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 8
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 7
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 7
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 7
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 7
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 101500025419 Homo sapiens Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 4
- 229940116978 human epidermal growth factor Drugs 0.000 description 4
- GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N nepidermin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(C)C)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N methyl 1-acetylthieno[3,2-c]pyrazole-5-carboxylate Chemical compound CC(=O)N1N=CC2=C1C=C(C(=O)OC)S2 XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000022 2-aminoethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 1
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000018386 EGF Family of Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010066486 EGF Family of Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 1
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091006629 SLC13A2 Proteins 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 239000003610 charcoal Substances 0.000 description 1
- 150000001860 citric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- OMZSGWSJDCOLKM-UHFFFAOYSA-N copper(II) sulfide Chemical compound [S-2].[Cu+2] OMZSGWSJDCOLKM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002332 glycine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000001592 luteinising effect Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 238000001470 plasma protein fractionation Methods 0.000 description 1
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 238000007738 vacuum evaporation Methods 0.000 description 1
- 238000009777 vacuum freeze-drying Methods 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/485—Epidermal growth factor [EGF], i.e. urogastrone
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/18—Ion-exchange chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/20—Partition-, reverse-phase or hydrophobic interaction chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/30—Extraction; Separation; Purification by precipitation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/76—Albumins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
내용없음.
Description
제 1 도에서 제 8 도까지는 뇨로부터 유용 단백질을 분리, 정제하는 과정을 도시한 공정도이다.
제 9, 10, 14, 15, 16, 18, 20, 21, 23 및 24 도는 뇨로부터 유용 단백질을 컬럼 크로마토그래피함에 따른 용출곡선이다.
제 11, 12 및 13 도는 각각 산도, 염화아연 및 황산구리 농도에 따른 침전물중의 총단백질, 알부민, 유로키나제 및 표피성장인자 사이의 상관관계를 나타내는 그래프이다.
제 17, 19 및 22 도는 표피성장인자, 유로키나제 및 알부민에 대한 정제단계에서의 각각의 도데실황산나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 결과를 나타내는 사진이다.
본 발명은 사람의 뇨(urine)로부터 유용 단백질을 동시에 분리하는 방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 사람의 뇨를 한외여과(ultrafiltration)장치로 농축시키고 산이나 금속이온을 처리한 후, 일련의 컬럼 크로마토그래피 법을 이용하여 표피성장인자(epidermal growth factor), 유로키나제(urokinase) 및 알부민(albumin) 등을 경제적으로 일시에 분리, 정제하는 방법에 관한 것이다.
사람은 하루에 약 1.5리터 가량의 뇨를 방출하는데, 그 속에는 염산염, 황산염, 인산염, 칼륨, 나트륨 및 칼슘 등의 이온과 다량의 요소(urea) 및 미량의 단백질이 포함되어 있다.
이러한 사람의 뇨로부터 분리정제된 단백질은 지금까지 유로키나제(Williams, J.R.B.(1951) Br. J. Exp. Pathol. 32, 530), 표피성장인자(Jaspar, J. M. Franchimant. P.(1987) Eur. J. Biochem.166, 295), 군체촉진인자(colony stimulating factor)(Xu Tao, et al.(1987) Bio1. Chem. Hoppe-Seyler, 368, 187) 등이 알려져 왔으나, 그중 유로키나제만이 산업화되어 의약적으로 활용되고 있을 뿐, 나머지 뇨단백질은 다만 연구의 가치만을 가지고 있을 뿐이다.
종래의 사람의 뇨로부터 단백질을 회수하는 방법으로는 알루미나(alumina), 숯(charcoal) 및 규조토(diatomite)를 이용하는 방법(US Patent 3711377; JP Patent 82037316)과 금속이온같은 첨가제를 이용하는 침전방법, 그리고 황체화 호르몬(luteinising hormone)(US Patent 4123510)이나 성선자국호로몬(humanchorionic gonadotropin)(US Patent 4123509)을 정량하기 위하여 한외여과장치를 이용하는 방법 및 양이온 교환수지를 이용하는 방법(JP Patent 5206l289; JP Patent 50069285)이 제시되어 왔다.
그러나, 이들 방법은 복잡합 정제 단계를 체용함으로써 수율이 낮고, 각각의 단백질을 정제하는 방법에 적용되지 않는 나머지 뇨 단백질은 결국 회수할 수 없어 각 단백질마다 다른 정제방법을 도입시킬 수 밖에 없다는 단점이 있였다.
이러한 단점을 극복하기 위하여 한외여과장치를 이용하여 단백질을 농축, 회수하고 산이나 금속이온을 처리하여 대략적인 정제를 달성한 후, 효과적인 분획화를 하기위해 일련의 크로마토그래피 방법을 이용하여 정제단계를 단순화시킴으로해서, 수율이 높은 표피성장인자와 유로키나제 그리고 알부민 등 뇨단백질을 서로의 손실을 줄이면서 체계적으로 동시에 생산할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 무용물인 뇨로부터 의학적으로 활용이 가능한 유용 단백질을 분리정제하며 혈장(plasma) 단백질의 분획화(Curling, J.M.(1983) Separation of plasma proteins, Pharmacia Fine Chemical AB)와 같이 체계적인 단백질의 분획화를 목적으로 하는 것이다.
이하, 본 발명을 분리, 정제 단계별로 보다 구체적으로 설명하면 다음 같다.
[뇨의 농축]
건강한 성인 남자의 뇨를 모아 4 내지 30℃에서 실험을 실시하였으며, 뇨의 농축은 먼저 0.2 내지 0.8μm의 크기를 갖는 막(membrane)을 이용하여 여과한 후 1, 000 내지 5,000달톤(dalton)의 분자체를 갖는 한외여과장치를 사용하여 10 내지 100배 농축을 한다. 이때 1 내지 50mM, pH 6 내지 9의 성질을 갖는 완충용액, 즉 초산염, 구연산염, 인산염 및 트리스염(tris) 등의 완충용액으로 희석을 하고 다시 농축하여 단백질을 포함하는 농축액을 얻는다. 이 농축액의 분말화는 진공증발(vacuum evaporation) 및 냉동건조(freeze drying)로 실시하며 용해시킬 때의 용액은 위에서 언급한 완충용액으로 한다.
[산 또는 금속의 첨가]
본 발명의 방법에 의해 농축된 뇨를 직접 컬럼 크로마토그래피 방법에 적용하는 것은 수율이나 정제도면에서 볼때 효과적인 방법이 아니다. 따라서, 본 발명자들은 뇨의 농축액에 산이나 금속이온을 처리하여 상층액과 침전물로 분리하고 각각을 분리하여 컬럼에 적용하여 수율과 정제도면에서 만족할만한 결과를 얻었다.
뇨의 농축액을 먼저 염산이나 황산 등의 산용액으로 pH를 2 내지 6으로 조정하는 방법과 염화아연이나 황화 구리를 첨가하여 최종농도가 1 내지 50mM로 조정하는 방법으로 분획화를 실시하고, 처리된 농축액은 5분 내지 24시간동안 교반한 후 원심분리기를 사용하여 상층액과 침전물로 분리하며, 침전물의 용해는 위에서 언급한 완충용액으로 한다.
뇨의 농축액에 산을 처리하면 단백질간의 전하(charge)를 읽어버리는 정도에 따라 단백질은 침전되는데, 이러한 원리에 따라 상층액과 침전물을 분리한다. 즉, 상층액에는 총 단백질양의 15%가 존재하게 되고 그중에서 표피성장인자를 분리하는 방법을 도입하면, 기존의 정제방법(Jaspar, J.M. Franchimant, P.(1987) Eur. J. Biochem. 166, 295)보다 2배 정도의 수율향상과 공정의 단순화를 가져왔다. 한편, 침전물에 대부분에 존재하게 되는 유로키나제와 알부민은 음이온 교환수지 상에서 산도를 조절함으로써 각각 분리하였으며, 계속해서 친화성 컬럼을 이용하여 유로키나제(Holmberg, L. et al.(1976) Biochem Biophys. Acta 445, 215)와 알부민(Travis, J. et al.(1976) Biochem. J.157, 301)을 정제하였다.
또한, 금속이온의 첨가의 경우 아연이나 구리성분이 히스티딘(histidine) 잔기가 도출된 단백질과 결합하고 서로 복합체를 형성하며 단백질을 침전시키는 것으로, 이 방법은 위에서 제시한 산처리방법 보다는 수율은 약간 떨어지나 특정한 단백질의 선택적 분별침전에 유용한 것으로 밝혀졌다. 컬럼 크로마토그래피에 적용되는 시료는 불용성 불순물을 제거하기 위해 여과나 원심분리를 실시하였다.
[크로마토그래피]
본 발명에서 컬럼 크로마토그래피 방법은 농축이나 용액교환단계를 최대한 줄인 것으로 경제적이고 효과적인 방법으로 선택되었으며, 컬럼 크로마토그래피법에 사용한 수지는 다음과 같다 : 이온교환(ion-exchange) 방법은 소수성 다당류(hydroPhobic Polysaccharide)에 디에틸아미노에틸(DEAE : diethylamimorthyl), 퀀터널라이즈드 아미도에틸(QAE : quanternalized aminoethyl), 카복시메틸(CM : carboxymethu1), 술포프로필(SP : sulfopropyl) 등이 결합하고 있는 수지를 사용하였고, 흡착(adsorption)방법은 실리카 겔(silica gel)이나 알루미나(alumina) 등을 사용하였다. 겔 여과(gel filtration) 방법은 세파덱스(Sephadex), 세파크릴(Sephacryl) 등으로 수행하였고, 친화성(affinity) 크로마토그래피 방법은 벤즈아미딘 세파로스(benzamidine-Sepharose) 6B, 블루-세파로스(Blue-Sepharose) CL-6B로 수행하였다.
컬럼 크로마토그래피 방법에 사용한 완충용액은 음이온 교환의 경우 1 내지 50mM, pH 6 내지 9인 인신염 및 트리스염 등을 사용하였고, 양이온 교환인 경우 1 내지 50mM. pH 3 내지 3 내지 6인 초신염 및 구연산염 등을 사용하였으며, 용출은 염화칼륨 또는 염화나트륨 같은 염이나 산도(pH)를 조성함으로써 수행하였다.
겔 여과의 경우 10 내지 200mM 염화나트륨을 포함하는 1 내지 50mM, pH 6 내지 9인 완충액을 사용하였고, 흡착의 경우 5 내지 100mM, pH 3 내지 6인 완충액을 사용하였으며 이때의 용출은 알콜류의 용매나 산도를 조정함으로써 수행하였다.
친화성 컬럼의 경우 사용한 완충액은 1 내지 50mM, pH 6 내지 9인 인산염 및 트리스염과 5 내지 500mM, pH 2 내지 4인 글리신염이었으며, 역상 컬럼의 경우는 실리카 겔의 18개의 탄소가 결합된 수지를 사용하였으며, 삼불화초산(trifluoroacetic acid)과 아세토나이트릴(acetonitrile) 이 포함한 용액으로 실시하였다.
[뇨 단백질의 분석]
유로키나제는 411개의 아미노산으로 이루어진 세린 프로테아제(serine protease)로서 분자량이 54,000달톤인 플라스미노겐 활성화제(plasminogen activator)이며, 54,000달톤의 유로키나제 뿐만아니라 N-말단쪽의 135개의 아미노산이 잘린 34,000달톤의 유로키나제도 혈전을 용해시킨다(White, W.F. et a1.(1966)Biochemistry 5, 2160). 이러한 유로키나제의 분석방법은 피브린의 용해성(fibrinolysis)을 측정하는 방법(Astrup, T. Mullertz, S.(l952) Arch. Biochem. Biophys, 40, 346)과 색소체인 S-2444(pyro-Glu-GIy-Arg paraNitroanalide)의 분해성을 측정하는 방법(Pannell, R Gurewich, V.(1987) Blood 69, 22)을 병행하며 사용하였다.
표피성장인자는 분자량이 5,000달톤정도이고 53개의 아미노산으로 이루어진 유사분별인자(mitogenic factor)로서, 분석방법은 방사능 면역측정(radioimmunoassay) 방법(Jaspar, J.M. Franchimant, P.(l985) Eur. J. Cancer Clin. Onco1. 20, 1343)으로 수행하였다.
알부민은 혈액의 삼투압(osmotic pressure)을 유지시키고 지방산, 아미노산 등의 세포내로의 이동에 관여하는 분자량이 약 66,000달톤인 단백질(Theodore, P.Jr.(1975) The Plasma Proteins I, 133)로서, 분석방법은 HPLC상에서 표준 알부민과의 피크를 비교측정함으로써 수행하였다.
이하 실시예로서 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 본 발명이 이들 실시예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 요지를 벗어나지 않을 범위내에서의 변형이 본 발명의 범위에 속한다 함은 당해 분야에서 통상의 지식을 가진자에게 있어서 자명한 것이다.
[실시예 1]
성인 남자의 뇨 100리터를 회수한 뒤 0.45μm의 여과지로 여과하고 2,000달톤의 분자체체 갖는 여과지를이용하여 2리터로 농축하였다. 이때 20mM Tris-HCl, pH 7.6인 완충액 20리터를 첨가한 후, 다시 농축하여 2리터의 농축뇨를 얻었다. 이 농축뇨 중 0.5리터를 동결건조시켜 4.3그램의 뇨분말을 얻었다(제 1 도 참조). 이 뇨분말 2그램을 40mM Tds-HCl, pH 7.6인 완충액 5ml에 녹인 후, 50mM 염화나트륨의 첨가된 완충액으로 미리 평형화시킨 세파크릴 S-300(16×900mm)에 통과시켰다(제 4 도 참조). 용출된 분획을 5ml씩 모아 280nm에서 흡광도를 측정하고 유로키나제, 표피성장인자 및 알부민의 활성도를 측정하였다. 그 결과는 제 9 도와 표 1에 나타내었으며 각각의 활성도를 나타내는 분획들을 모아 4℃에 보관하였다.
[표 1]
[실시예 2]
뇨 5리터를 실시예 1과 같은 방법으로 실시하여 농축뇨 0.2리터를 얻거나 또는 이 농축뇨를 동결건조하여 분말화한 후 완충용액으로 다시 용해시킨 농축뇨를 얻었다. 이 농축뇨를 20mM Tris-HCl, pH 7.6인 완충액으로 미리 평형화시킨 DEAE-세파로스 컬럼(50×200mm)에 통과시킨 후 용출은 40mM 아세트산 나트륨 pH 4.6인 완충액과 0 내지 1M NaCl의 직선구배로 연속해서 실시하였다(제 4 도 참조). 컬럼을 통과한 분획들을 40mL씩 모아 실시예 1과 같은 방법으로 흡광도와 활성도를 측정하였다. 각각의 활성분획들을 모아 4℃에 보관하였으며 그 결과는 제 10 도와 표 2에 나타내었다.
[표 2]
[실시예 3]
뇨 3리터를 실시예 1과 같은 방법으로 실시하여 농축뇨 0.2리터를 얻었다. 이 농축뇨를 10mL씩 분취하고 각 분취된 용액에 5N HCl을 가하여 pH를 각각 3.0에서 5.6까지 0.2씩의 차이를 두고 조정하였다. 1시간가량 교반한 후 12,000g로 10분간 원심분리하였다(제 2 도 참조). 그 결과 얻은 침전물에 40mM 아세트산나트륨, pH 7.2인 완충액을 첨가하며 용해시킨 단백질의 함량과 유로키나제, 알부민 및 표피성장인자의 활성도를 측정하였다. 그 결과는 제 11 도에 나타내었으며, pH 3.4 내지 4.4에서 농축뇨의 침전물의 상층액의 분리를 시행하는 것이 효과적인 정제방법으로 확인되었다.
[실시예 4]
실서예 3과 같은 방법으로 분취한 10mL씩의 농축뇨에 염화아연의 최종농도가 1,2,4,6,8,10,20mM이 되도록 염화아연을 가하고 실시예 3과 같은 방법으로 원심분리하였다(제 3 도 참조). 각각의 침전물을 5mM EDTA가 첨가된 20mM 아세트산 나트륨, pH 7.2인 완충액 10mL로 용해시켰다. 각각의 용액에 대한 단백질 함량과 활성도의 측정결과는 제 12 도에 나타내었다.
[실시예 5]
염화아연 대신 황산구리를 사용한 것을 제외하고는 실시예 4와 동일한 방법으로 실험을 수행하였다(제 3 도참조). 그 결과는 제 13 도에 나타내였다.
[실시예 6]
뇨 20리터를 실시예 1과 같은 방법으로 실시하여 농축뇨 0.5리터를 얻었다. 이 농축뇨를 실시예 3의 방법에서와 같이 pH 4.0에서 침전물과 상층액으로 분리하였다. 이들 중 상층액은 표피성장인자의 정제를 위해 다음과 같이 실시하였다(제 6 도 참조). 상층액 485mL을 40mM 아세트산 나트륨, pH 4.2인 완충액으로 미리 평형화시킨 실리카겔 컬럼(50×200mm)에 통과시킨 후, 20% 에탄올을 포함하는 40mM 아세트산 나트륨, pH 8.0으로 용출시켰다. 컬럼을 통과한 분획중 표피성장인자의 활성을 갖는 분획을 모아 아미콘(Amicon) 멤브레인 YM02을 이용하며 20mL로 농축시켰다.
이 용액을 50mM NaCl을 포함하는 20mM 아세트산 나트륨, pH 8.0인 완충액으로 미리 평형화시킨 세파덱스 G-50 컬럼(26×1500mm)에 통과시켰다. 용출된 분획중 표피성장인자의 활성을 갖는 분획을 모아 0.1% 삼불화초산(trifluroacetic acid)로 미리 평형화 시킨 PepRPC(상품명) 역상 크로마토그래피 컬럼에 적용한 후, 용출은 50% 아세토니트릴로 시행하였다. 용출된 분획 중 표피성장인자의 활성을 갖는 분획을 모아 증발기와 냉동건조기를 이용하여 46ug의 표피성장인자를 얻었다.
정제단계의 결과는 표 3과 제 14, 15, 16 및 17 도에 나타내었으며, 각각 뇨로부터의 사람 표피성장인자를 실리카 겔 크로마토그래피(제 14 도), 세파텍스 G-50 겔 크로마토그래피(제 15 도) 및 Pep RPC 역상 크로마토그래피(제 16 도)한 결과를 나타낸다.
제 17 도는 각 정제단계에서 수득한 사람 표피성장인자를 20% 도데실황산나트륨-폴리아크릴 아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)한 결과를 나타내는데, 제1레벨은 고분자량 마커(maker)이며; 제2레인은 농축뇨; 제3레인은 pH 4.0에서의 상등액; 제4레인은 실리카 겔에서의 사람의 표피성장인자 분획; 제5레인은 세파덱스 C-50에서의 사람의 표피성장인자 분획; 제6레인은 PepRPC에서의 사람의 표피성장인자 분획: 제7레인은 마우스의 표피성장인자; 제8레인은 저분자량 마커를 각각 나타낸다.
[표 3]
한편, pH 4.0에서 농축뇨로부터 원심분리하여 얻은 침전물은 유로키나제와 알부민의 정제를 위해 다음과같이 실시하였다(제 5 도 참조). 먼저 20mM Tris-HCl, pH 7.8인 완충액 200mL을 침전물에 넣고 2시간교반하여 완전히 용해시킨 다음 같은 완충액으로 평형화시킨 DEAE-세파로스 컬럼(50×200mm)에 통과시켰다. 용출은 초기 완충액과 40mM 아세트산 나트륨, pH 4.6인 완충액으로 실시하였으며 이때 용출된 분획중 유로키나제와 알부민 분획을 따로 모았다(제 24 도 참조).
용출된 유로키나제 분획을 농축하여 얻은 200ml을 20mM Tris-HC1, pH 7.6으로 평형화시킨 벤즈아미단-세파로스 6B컬럼(26×150mm)에 통과시키고, 50mM Glycine-HC1, pH 3.6인 완충액으로 용출을 실시하였다. 용출된 분획중 유로키나제의 분획을 모아 동결건조하여 29,800단위의 유로키나제를 얻었다.
그 결과는 표 4와 제 18 및 19 도에 나타내었다. 제 18 도는 뇨로부터의 유로키나제를 볜즈아미딘-세파로스 6B 컬럼 크로마토그래피로 분리한 결과를 나타내고, 제 19 도는 각 정제단계에서 수득한 유로키나제를 12.5%도데실황산나트륨-폴리아크릴 아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)한 결과를 나타내는데, 제1레인은 중간분자량의 마커이며; 제2레인은 농축뇨; 제3레인은 pH 4.0에서의 침전된 뇨; 제4레인은 DEAE-세파로스에서의 유로키나제 분획 앞부분; 제5레인은 DEAE-세파로스에서외 유로키나제 분획 뒷부분; 제6레인은 벤즈아미딘-세파로스 6B에서의 유로키나제 분획; 제7레인은 표준 유로키나제; 제8레인은 저분자량마커를 각각 나타낸다.
[표 4]
또한, DEAE-세파로스 컬럼을 통해 얻은 알부민 분획은 블루-세파로스 CL-6B 컴럼(20×100mm)과 세파크릴 S-300 컬럼(16×900mm)을 이용하며 정제하였다. 용출은 블루-세파로스 CL-6B 컬럼의 경우 2M NaC1을 포함하는 20mM Tris-HC1, pH 7.6인 완충액을 이용하여 실시하였다.
위와 같이하며 얻은 분획을 동결건조하여 188mg의 알부민을 얻었고, 그 결과는 표 5와 제20, 21 및 22도에 나타내었다. 각각 뇨로부터의 알부민을 블루-세파로스 CL-6B 크로마토그래피(제 20 도) 및 세파크릴 S-300 겔 여과 크로마토그래피(제 21 도)한 결과를 나타낸다. 제 22 도는 각 정제단계에서 수득한 알부민 분획을12.5% 도데실황산나트륨-폴리아크릴 아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)한 결과를 나타내는데, 제1레인은 제2레인은 농축뇨; 제3레인은 pH 4.0에서의 농축뇨; 제4레인은 DEAE-세파로스에서의 알부민 분획; 제5레인은 블루-세파로스 CL-6B에서의 알부민 분획: 제6레인은 세파크릴 S-300에서의 알부민 분획; 제7레인은 표준 소혈청 알부민; 제8레인은 고분자량 마커를 각각 나타낸다.
[표 5]
[실시예 7]
실시예 4에서와 같이 20배 농축시킨 뇨 250ml에 최종농도가 8mM되게 염화아연을 가하고 1시간가량 교반한 후 원심분리(12,000g, 20분)하여 침전물을 얻었다. 이 침전물에 500mM EDRA 4ml와 20mM Tris-HCl, pH 7, 6의 완충용액을 첨가하여 완전히 침전물을 용해시킨 후 이 용액을 20mM Tris-HCl, pH 7.6으로 미리 평형화시킨 세파덱스 LH-20컬럼(26×900mm)에 통과시켰다(제 23 도 참조). 용출된 분획중 단백질 분획만 모아 실시예 2에서와 같이 DEAE-세파로스 컬럼(26×200mm)에 적용시켰다(제 7 도 참조). 그 결과는 표 2와 제 10 도에서 나타난 결과와 비슷한 결과를 얻었다.
[실시예 8]
염화아연 대신 황산구리를 사용하는 것을 제외하고는 실시에 7과 동일한 방법으로 실시하였다. 결과는 표 2와 제 10 도의 결과와 비슷하였다.
[실시예 9]
실시에 7에서 세파덱스 LH-20컬럼에 통과시켜 얻은 단백질 분획을 실시예 1파 같이 세파크릴 S-300컬럼에 통과시켜 알부민, 유로키나제 및 표피성장인자의 활성분획을 얻었다. 그 결과는 표 1과 제 9 도에서 나타난 결과와 비슷하였다.
[실시예 10]
염화아연 대신 황산구리를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 9와 동일한 방법으로 실시하였다. 그 결과는 실시예 9의 결과와 비슷하였다.
[실시예 11]
실시에 7, 8, 9 및 10에서 얻은 알부민, 유로키나제 및 표피성장인자의 분획을 더욱 정제하기 위해 실시예 6에서 언급한 방법으로 실험을 실시하였다. 유로키나제는 벤즈아미딘-세파로스 6B 컬럼으로, 알부인은 블루-세파로스 CL-6B와 세파크릴 S-300컬럼으로, 그리고 표피성장인자는 세파덱스 G-50과 PepRPC 컬럼으로 정제를 실시하였다(제 8 도 참조). 그 결과는 표 3, 4, 5의 결과와 비슷하였다.
전술한 실시예에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 방법은 사람의 뇨로부터 유용 단백질을 분리 정제하는데있어서 언급된 유로키나제, 알부민 및 표피성장인자외에 또 다른 단백질을 적용하며 분리할 수도 있으며, 특히 본 발명 특유의 분획 및 전처리 공정의 도입으로 분리공정을 단순화시킴으로 해서 뇨 단백질의 대량생산이 가능하며 신속하고 경제적인 방법을 제공한다.
Claims (6)
- (i) 사람의 뇨를 농축하는 공정; (ii) 전기 농축뇨에 pH 2 내지 6이 되도록 산을 첨가하고, 원심분리하며 상층액과 침전물을 수득하는 공정; 및, (iii) 전기에서 수득한 상층액을 흡착 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 및 역상 크로마토그래피를 일련의 과정으로 수행하여 표피성장인자(EGF)를 정제하고, 전기에서 수득한 침전물의 일부를 음이온 교환수지 크로마토그래피 및 친화성 크로마토그래피를 일련의 과정으로 수행하여 유로키나제를 정제하며, 전기에서 수득한 침전물의 일부를 음이온 교환수지 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피를 일련의 과정으로 수행하여 알부민을 정제하는 공정을 포함하는 사람의 뇨로부터의 표피성장인자, 유로키나제 및 알부민의 동시 정제방법.
- 제 1 항에 있어서, 흡착 크로마토그래피는 실리카겔 및 알루미나로 구성된 그룹으로부터 선택되는 수지를 사용하는 것을 특징으로 하는 정제방법.
- 제 1 항에 있어서, 겔 여과 크로마토그래피는 세파덱스 및 세파크릴로 구성된 그룹으로부터 선택되는 수지를 사용하는 것을 특징으로 하는 정제방법.
- 제 1 항에 있어서, 역상 크로마토그래피는 PepRPC 컬럼을 사용하는 것을 특징으로 하는 정제방법.
- 제 1 항에 있어서, 음이온 교환수지 크로마토그래피는 DEAE(diethylaminoethyl), QAE(quanternalizedaminoethyl), CM(carboxymethyl) 및 SP(sulfopropyl) 로 구성된 그룹으로부터 선택되는 수지를 사용하는 것을 특징으로 하는 정제방법.
- 제 1 항에 있어서, 친화성 크로마토그래피는 유로키나제 정제에서 벤즈아미딘 세파로스 6B 수지를 사용하고, 알부민 정제에서 블루-세파로스 CL-6B 수지를 사용하는 것을 특징으로 하는 정제방법.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1019920008884A KR960009051B1 (ko) | 1992-05-26 | 1992-05-26 | 사람의 뇨로부터의 유용 단백질의 동시 제조방법 |
| CN92108938A CN1037103C (zh) | 1992-05-26 | 1992-08-28 | 从人尿中制备生物活性蛋白的新方法 |
| KR96008146A KR960009052B1 (en) | 1992-05-26 | 1996-03-25 | Simultaneous preparation process of useful proteins from human urine |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1019920008884A KR960009051B1 (ko) | 1992-05-26 | 1992-05-26 | 사람의 뇨로부터의 유용 단백질의 동시 제조방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR930023371A KR930023371A (ko) | 1993-12-18 |
| KR960009051B1 true KR960009051B1 (ko) | 1996-07-10 |
Family
ID=19333576
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1019920008884A KR960009051B1 (ko) | 1992-05-26 | 1992-05-26 | 사람의 뇨로부터의 유용 단백질의 동시 제조방법 |
| KR96008146A KR960009052B1 (en) | 1992-05-26 | 1996-03-25 | Simultaneous preparation process of useful proteins from human urine |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR96008146A KR960009052B1 (en) | 1992-05-26 | 1996-03-25 | Simultaneous preparation process of useful proteins from human urine |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (2) | KR960009051B1 (ko) |
| CN (1) | CN1037103C (ko) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103740687A (zh) * | 2013-11-30 | 2014-04-23 | 青岛康原药业有限公司 | 一种制备尿激酶粗品的方法 |
| CN104531648A (zh) * | 2014-12-23 | 2015-04-22 | 青岛康原药业有限公司 | 一种制备尿激酶粗品的方法 |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1064049C (zh) * | 1995-10-05 | 2001-04-04 | 南京大学 | 血小板生成素制备工艺 |
| CN1113896C (zh) * | 1998-01-04 | 2003-07-09 | 刘荣秀 | 用虾及其废弃物制备表皮生长因子的方法 |
| CN1090970C (zh) * | 1999-10-26 | 2002-09-18 | 合肥永生制药有限公司 | 尿多酸肽组合物的制备方法 |
| CN1088597C (zh) * | 1999-10-26 | 2002-08-07 | 合肥永生制药有限公司 | 尿多酸肽组合物及其用途 |
| CN1090971C (zh) * | 1999-10-26 | 2002-09-18 | 合肥永生制药有限公司 | 尿多酸肽组合物 |
| CN103509104A (zh) * | 2013-08-23 | 2014-01-15 | 扬州艾迪生物科技有限公司 | 一种规模化收集人尿蛋白的方法 |
| CN103694334B (zh) * | 2013-12-23 | 2015-10-21 | 扬州艾迪生物科技有限公司 | 一种制备hEGF粗制品的方法 |
| CN108333263A (zh) * | 2017-01-20 | 2018-07-27 | 北京蛋白质组研究中心 | 一种尿蛋白制备方法及尿蛋白质组的检测方法 |
| CN112250753B (zh) * | 2020-10-28 | 2023-06-13 | 宁波博睿瀚达生物科技有限公司 | 一种游离吸附浓缩重组表皮生长因子的方法 |
-
1992
- 1992-05-26 KR KR1019920008884A patent/KR960009051B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1992-08-28 CN CN92108938A patent/CN1037103C/zh not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-03-25 KR KR96008146A patent/KR960009052B1/ko not_active IP Right Cessation
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103740687A (zh) * | 2013-11-30 | 2014-04-23 | 青岛康原药业有限公司 | 一种制备尿激酶粗品的方法 |
| CN103740687B (zh) * | 2013-11-30 | 2016-05-11 | 青岛康原药业有限公司 | 一种制备尿激酶粗品的方法 |
| CN104531648A (zh) * | 2014-12-23 | 2015-04-22 | 青岛康原药业有限公司 | 一种制备尿激酶粗品的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1079226A (zh) | 1993-12-08 |
| CN1037103C (zh) | 1998-01-21 |
| KR960009052B1 (en) | 1996-07-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5919913A (en) | Isolation of lactoferrin from milk | |
| Kitamura et al. | Purification and partial characterization of two glycoproteins in bovine peripheral nerve myelin membrane | |
| JPH04505014A (ja) | 新規の蛋白質及びその製法 | |
| Joubert | Hemachatus haemachatus (Ringhals) Venom. Purification, Some Properties and Amino‐Acid Sequence of Phospholipase A (Fraction DE‐I) | |
| JPH04504720A (ja) | タンパク質精製のための方法 | |
| KR960009051B1 (ko) | 사람의 뇨로부터의 유용 단백질의 동시 제조방법 | |
| JPH11506603A (ja) | 新規因子ｉｘ精製法 | |
| Moon et al. | Partial purification of neurofilament subunits from bovine brains and studies on neurofilament assembly. | |
| CN113355309B (zh) | 重组截短型人纤维蛋白溶酶制备工艺 | |
| EP0811058B1 (en) | A process for the preparation of factor ix from biological sources | |
| JP2568151B2 (ja) | アンジオジェニンの単離方法 | |
| KR101687686B1 (ko) | Pth를 정제하는 방법 | |
| JPH08510762A (ja) | 塩基性線維芽細胞成長因子の精製プロセス | |
| KR101089704B1 (ko) | 초유로부터 펩티드의 정제 | |
| US6869934B2 (en) | Method of purifying calcium ion-binding protein | |
| Béress et al. | Purification of two crab-paralysing polypeptides from the sea anemone Bolocera tuediae | |
| WO1995004077A1 (fr) | Procede de purification du plasminogene | |
| EP0042560B1 (en) | A process for producing and obtaining anaphylatoxin- and cocytotaxin-containing leucotaxine preparations and of anaphylatoxin and cocytotaxin proteins in molecularly homogeneous, biologically active form | |
| US4430264A (en) | Process for the preparation of a selective anorexogenic substance regulating food intake | |
| KR840001516B1 (ko) | 인체 섬유아세포 인터페론의 제조방법 | |
| JPH0679172A (ja) | クロマトグラフィー剤およびタンパク質、ポリペプチドまたは金属の分離のためのその使用法 | |
| KR100229420B1 (ko) | 대장균에서 발현된 닭 성장 호르몬의 정제 방법 | |
| Mizokami et al. | A convenient method for preparation of the calcium ion-binding protein annexin V | |
| JPS6226226A (ja) | 抗腫瘍性ポリペプチド | |
| Štrop et al. | Isolation and characterization of p15gag protease of myeloblastosis associated virus expressed in E. coli |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| G160 | Decision to publish patent application | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20020708 Year of fee payment: 9 |
|
| LAPS | Lapse due to unpaid annual fee |