JPH11506603A - 新規因子ｉｘ精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 アニオン交換クロマトグラフィー、ヘパリン様樹脂、ヒドロキシアパタイトおよび固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを利用する、因子ＩＸ蛋白の新規回収および精製方法が本発明により提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 新規因子ＩＸ精製法 発明の分野 一般的には、本発明は、新規蛋白回収および精製方法に関し、より詳細には、 因子ＩＸの回収および精製のための新規方法に関する。 発明の背景 現在、組み換え法の出現は、適当に形質転換された宿主細胞内での高レベルの 蛋白の生産を可能にする。分泌蛋白については、目的蛋白の精製は、宿主細胞培 地からの単離および精製を必要とする。典型的には、培地は選択栄養素（例えば 、ビタミン類、アミノ酸、コファクター、無機質）およびさらなる増殖因子／補 足物（インスリンおよび可能なさらなる外来性蛋白を包含）を含有する。ならし 培地は目的分泌生成物のみならず、さらに分泌された有意な量の宿主細胞蛋白お よび他の物質（例えば、核酸、膜小胞）を含有する。高レベルで発現されても、 目的生成物はならし培地中に存在するすべての蛋白のうちの少量のものであるか もしれない。形質転換宿主細胞により分泌される蛋白が目的生成物の性質とはま ったく異なった性質（例えば、電荷、分子サイズ、アミノ酸組成）を有すること は意外なことではない。同様に、選択された分泌宿主細胞蛋白は目的生成物の特 性と非常に類似した特性を示すかもしれず、そのことにより重要な課題が精製に 用いるプロセスに課せられる。ならし培地からの組み換え蛋白の精製のためのプ ロセスの開発が行われているが、使用条件（分離のための大きな利益を得るため に、分泌蛋白間のわずかな相違を利用するするための使用できる条件）が目的生 成物の変性により限定されるということは重要であり、そのことにより、存在す る他のすべての宿主細胞蛋白からの目的生成物の分離が困難となっている。 上記分泌宿主蛋白のほかに、ならし培地は、目的生成物をコードしているが種 々雑多に発現された遺伝子に由来する生成物を含んでいるかもしれない。これら は最終薬剤物質として望ましいものではなく、例えば、糖鎖付加、硫酸化、ガン マカルボキシレーション、または生物学的活性に潜在的に必要な他の修飾のごと きある種の翻訳後修飾を欠く生成物形態を包含する。さらに、目的生成物の蛋白 分解的に分解された形態もならし培地に存在するかもしれず、それらを精製途中 で除去する必要があるが、それらは目的生成物に非常に近似している。不幸なこ とに、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、お よびサイズ排除クロマトグラフィーのごときたいていのアプローチは、これらの 望ましくない形態から、ヒトの治療という状況に使用されるに必要な目的生成物 の分離の程度を提供しないかもしれない。所望生成物と汚染混入物質との間のわ ずかな相違（例えば、わずかな電荷の相違、分子サイズのわずかな相違）をフル に利用するためには、強力な変性剤の使用がしばしば必要である。しかしながら 、かかる変性剤は、生物学的活性の損失、新たな抗原部位の発現、および選択さ れた翻訳後修飾物の化学的分解の潜在的促進をもたらす可能性がある。 類似の特性を有する分子（例えば、発現遺伝子の修飾形態）からの目的生成物 の分離のほかに、所望生成物と特異的に反応するならし培地中に存在する成分か ら所望生成物を分離する必要があることを認識することは重要である。目的蛋白 が正に帯電している場合、それは負に帯電している分子に結合する傾向があり、 そのことは伝統的方法による生成物の精製を困難にする。 本発明に関する一般的背景は以下のごとし。Yan,USPN4981952（１９９１年１ 月１日）およびYan,et al.Bio/Technology 8:655（１９９０年６月）には、ビタ ミンＫ依存性蛋白の精製のための偽アフィニティーアイオン交換クロマトグラフ ィーの使用が開示されている。Josic,et al.J.Chrom.632:1(1993)には、他のビ タミンＫ依存性蛋白からの因子ＩＸの分離のためのヘパリンアフィニティークロ マトグラフィーの使用が開示されている。Suomela,Thromb.Res.7:101(1975);Suo mela,Eur.J.Bio.Chem.71:145(1976);およびSuomela,Thrombos.Haemostasis.35:2 11(1976)には、種々のクロッティング因子および因子ＩＸ血漿変種の分離におけ るヒドロキシアパタイトの使用が記載されている（炭水化物部分、例えばシアル 酸およびガラクトースの含量の相違による電荷の相違に基づく）。しかしな がら、Reekers,et al.Haemostasis 1:2(1972)には、ヒドロキシアパタイトが因 子ＩＩ、ＶＩＩおよびＩＸを互いに分離できず、またこれらを他の血漿蛋白から も分離できないことが示されている。Schwinn,et al.USPN 4411794には、濃度５ ０〜２００ｍＭのカルシウム存在下においてヒドロキシアパタイトを用いる血液 クロッティング因子の部分精製が開示されている。Feldman,et al.Biotech.Bloo d Proteins 227:63(1993)およびRoberts,et al.Vox Sang 67(suppl.1):69(1994) には、酸性化および銅荷電キレートセファロース（因子ＩＸがヒト・血漿から低 収率で得られた）を用いるウイルス感染性の低減が開示されている。 典型的には、研究者は伝統的クロマトグラフィー法を用いて所望生成物を精製 してきた。しばしば、かかる方法はヒトの治療用製品に望まれる純度および均一 性のレベルまでの生成物の精製が不十分である。研究者は、目的蛋白が特異的相 互作用する固定化リガンドに結合するアフィニティークロマトグラフィーの使用 によりこの困難を克服しようとした。適当な洗浄後、リガンドー蛋白相互作用を 破壊することにより所望生成物を溶離することができ、しばしば、有意に純粋な 溶離物が得られる。しかしながら、ならし培地中に存在する修飾形態からの所望 生成物の分離の場合に、１工程のアフィニティークロマトグラフィー法は不十分 であるかもしれず、他のアフィニティー樹脂および／または伝統的分離法と組み 合わせて使用しなければならない。高分解能アフィニティークロマトグラフィー 工程（例えば、固定化モノクローアル抗体を用いる免疫アフィニティー精製）で さえも、相互作用部位が共通しているために他の成分から所望生成物の十分に分 離できないかもしれない（例えば、目的生成物に存在するエピトープが蛋白分解 された形態の生成物にも存在する場合）。 したがって、かかる困難を効果的に克服する蛋白精製法に対する必要性が当該 分野において存在し続けている。 発明の簡単な概要 因子ＩＸを含有する溶液をアイオン交換樹脂に適用し、樹脂から因子ＩＸを溶 離するのに必要な導電率よりも低い導電率を有する溶液で該アニオン交換樹脂を 洗浄し、該アニオン交換樹脂を第１の溶離液で溶離して第１の溶離物を得て、該 溶離物をヘパリンまたはヘパリン様（例えば、負に帯電したマトリックス）樹脂 に適用し、該ヘパリンまたはヘパリン様樹脂を第２の溶離液で溶離して第２の溶 離物を得て、該第２の溶離物をヒドロキシアパタイト樹脂に適用し、次いで、該 ヒドロキシアパタイト樹脂を第３の溶離液で溶離して精製因子ＩＸを含有する第 ３の溶離物を得ることを特徴とする、溶液中の因子ＩＸの精製方法が本発明によ り提供される。第１の溶離物をヒドロキシアパタイト樹脂に適用してもよい。ま た、該方法は、第３の溶離物を固定化金属アフィニティー樹脂に適用し、次いで 、固定化金属アフィニティー樹脂を第４の溶離液で溶離して精製因子ＩＸを含有 する第４の溶離物を得ることをさらに特徴としてもよい。本発明方法によれば、 因子ＩＸは血漿由来のもの、培養細胞により発現されたもの、あるいは当業者に 知られたように組み換え的に製造されたものであってよい。好ましくは、第１の 洗浄液は、因子ＩＸをカラムから溶離するのに必要な導電率よりも低く、一般的 には、負荷溶液および第１の溶離液バッファーの導電率よりも高いかまたは同等 の導電率を有する溶液を含む。この導電率は、第１の溶離物中に存在することに なる混入蛋白の大部分を除去するのに十分なものである。適当な第１の洗浄液は 、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウムまたはリ ン酸カリウムのごとき塩溶液を含み、適当なバッファー剤を含有していもよい。 適当な濃度範囲は、因子ＩＸを溶離することなく汚染混入物質を除去するのに有 効なものであり、２５ｍＭないし２００ｍＭの塩、好ましくは２００ｍＭの塩化 ナトリウムを包含する。第１の溶離液は、カルシウム、マグネシウム、マンガン 、ストロンチウム、亜鉛、コバルトおよびニッケルのごとき２価カチオンを含む 。適当な濃度範囲は、因子ＩＸの溶離に効果的なものであり、例えば、５ないし １００ｍＭの範囲、好ましくは５０ｍＭのｐＨ約８.０のＴｒｉｓのごときバッ ファー剤、５０ないし２５０ｍＭの範囲、好ましくは１００ｍＭのＮａＣｌ、お よび５ないし２０ｍＭの範囲、好ましくは約１０ｍＭの塩化カルシウムを含有す る溶液を包含する。 適当なアニオン交換樹脂は、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、ポリエチレ ンイミン（ＰＥＩ）、および４級アミノエタン（ＱＡＥ）のごとき正に帯電した 基を有する樹脂を包含し、Q-Sepharose Fast Flow、DEAE-Sepharose Fast Flow 、Poros-Q、Fractogel-TMAE、Fractogel-DMAE、およびQAE-Toyopearlを包含する が、好ましい樹脂はQ-Sepharose Fast Flow（Pharmacia）である。 第２の溶離液は、塩化ナトリウムおよび塩化カリウムを伴ったＴｒｉｓのごと きバッファー中の適当な塩であってよく、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ,０.５０Ｍ ＮａＣ ｌ,ｐＨ８.０が好ましい。適当なヘパリンまたはヘパリン様樹脂は、ヘパリン、 セルロースの硫酸エステル、スルフィルプロピル（ＳＰ）、カルボキシル、およ びカルボキシメチルのごとき負に帯電した基を有する樹脂を包含し、Matrex Cel lufine Sulfate、Heparin Sepharose、Heparin Toyopearl、Carboxy Sulfon、Fr actogel EMD-SO₃、およびFractogel-EMD COOを包含するが、好ましいのはMatrex Cellufine Sulfateである。 第３の溶離液はリン酸塩および硫酸塩のごとき塩であってよく、０.５Ｍリン 酸カリウム、０.２Ｍ ＮａＣｌ,ｐＨ７.２が好ましい。適当なヒドロキシアパタ イト樹脂は、セラミック−ヒドロキシアパタイト、Biogel HT等のごときリン酸 カルシウムを含有するものを包含するが、セッラミック−ＨＡが好ましい。固定 化金属アフィニティー樹脂は、Fractogel-EMD-Chelate、Chelating-Sepharose、 Matrex Cellufine Chelate、およびPOROS 20MCを包含するが、本発明にはFracto gel-EMD-Chelateが好ましい。第４の溶離液は、イミダゾール、ＥＤＴＡ、ＥＧ ＴＡ、グリシン、ヒスチジンおよびＴｒｉｓのごときキレーターを含有するバッ ファー溶液であるが、好ましいのは２０ｍＭリン酸カリウム,１５ｍＭイミダゾ ール、０.１Ｍ ＮａＣｌ,ｐＨ７.１である。 本発明方法により製造される因子ＩＸ組成物も本発明により提供される。その ようにして製造された因子ＩＸは２４０〜４００Ｕ／ｍｇの範囲の比活性を有し 、約２４０Ｕ／ｍｇであってもよい。 発明の詳細な説明 本明細書の用語「因子ＩＸ」は、血漿、形質転換細胞系から単離された因子 ＩＸ、ならびに宿主細胞培養培地から単離された組み換え的に生産された因子Ｉ Ｘを包含するがこれらに限らない。 本明細書の用語「アニオン交換樹脂」は、ジエチルアミノエタン（ＤＥＡＥ） 、イエチレンイミン（ＰＥＩ）、および４級アミノエタン（ＱＡＥ）のごとき正 に帯電した部分（中性ｐＨにおいて）を有する樹脂を包含し、例えば、Q-Sephar ose Fast Flow（Pharmacia）、DEAE-Sepharose Fast Flow、DEAE-Toyopearl、QA E-Toyopearl,POROS-Q、Fractogel-DMAE、Fractogel-TMAE、Matrex Cellufine DE AE等を包含するがこれらに限らない。 本明細書の用語「第１の洗浄液」は、アニオン交換カラムから因子ＩＸを溶離 させるのに必要な導電率よりも低い導電率を有する溶液を包含するがこれに限る ものではなく、一般的には、その導電率は、負荷溶液の導電率および第１の溶離 液の導電率よりも高いかまたはそれらと同等である。この導電率は、第１の溶離 物中に存在することになる混入蛋白の大部分を除去するのに十分なものである。 適当な第１の洗浄液は塩溶液であってよく、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリ ウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウムまたはリン酸カリウムを包含し、適当 にバッファー化することができる。典型的には、低濃度（２５ｍＭ 塩）から高 濃度（２００ｍＭ 塩）にいたる濃度範囲であり、２００ｍＭ塩化ナトリウムが 好ましい。 本明細書の用語「第１の溶離液」は、約０.０５Ｍの濃度のバッファー剤（例 えば、Ｔｒｉｓ）、２価カチオン不存在下では樹脂から溶離するには十分でない 濃度（例えば、約０.１０Ｍ〜０.２０Ｍ）の塩（例えば、ＮａＣｌ）、および低 濃度（約０.０１Ｍ）の２価カチオン（例えば、ＣａＣｌ₂）を含むｐＨ８の溶液 を包含するが、これに限らない。好ましくは、「第１の溶離液」は「第１の洗浄 液」よりも低い導電率を有する。 本明細書の用語「ヘパリン」樹脂および「ヘパリン様」樹脂を互いに交えて使 用し、それらはヘパリン、セルロースの硫酸エステル、スルフィルプロピル（Ｓ Ｐ）、カルボキシル、およびカルボキシメチルのごとき負に帯電した基を有する 樹脂を包含し、Fractogel EMD-SO₃、Carboxy Sulfon、Fractogel-EMD COO、 Heparin Sepharose、Matrex Cellufine Sulfate、およびを包含するがこれらに 限らない。 本明細書の用語「第２の溶離液」は、約０.０５Ｍの濃度のバッファー剤（例 えばＴｒｉｓ）、因子ＩＸと負に帯電した樹脂支持体との相互作用を破壊するに 十分な濃度（例えば０.０５Ｍ）の塩（例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、Ｎａ₂ＳＯ₄ ）を含むｐＨ８.０の溶液を包含するが、これに限らない。本発明プロセスに用 いる場合には、第２の溶離液はその後のプロセス工程、すなわちヒドロキシアパ タイトに適合すべきである。 本明細書の用語「ヒドロキシアパタイトカラム」は、例えばBioGel-HTおよび セラミック−ヒドロキシアパタイトのごときリン酸カルシウムゲル支持体を包含 するが、これらに限らない。 本明細書の用語「第３の溶離液」（および「第２のリン酸塩バッファー」）は 、因子ＩＸと樹脂との相互作用を破壊するに十分な濃度（例えば、約０.２０Ｍ なたはそれ以上）のバッファー剤（例えば、リン酸塩または硫酸塩）および因子 ＩＸとヒドロキシアパタイト樹脂との電荷相互作用を最小化するに十分な濃度で 存在する塩（例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ）を含む中性ｐＨ（ｐＨ７.２）の溶液 を包含するが、これに限らない。用語「第１のリン酸塩バッファー」は、不活性 形態の因子ＩＸをヒドロキシアパタイト樹脂から除去するに十分な濃度のバッフ ァー剤（例えば、リン酸塩または硫酸塩）を含む溶液を包含するが、これに限ら ない。 本明細書の用語「固定化金属アフィニティー樹脂」（ＩＭＡＣ）は、多価カチ オンに結合し、調和して機能しうる固定化官能基（例えば、イミノジ酢酸）を含 む樹脂を包含し、Chelating-Sepharose、Fractogel-EMD-Chelate、POROS 20MC、 およびMatrex Cellufine Chelateがあるが、これらに限らない。結合金属イオン をいくつかの可能な選択物から選択することができ、銅、ニッケル、カドミウム 、コバルト、鉄、亜鉛またはストロンチウムがあるが、これらに限らない。 用語「第４の溶離液」（「置換物質」ともいう）は、ＩＭＡＣ樹脂支持体に結 合因している子ＩＸと置換するが、樹脂支持体の固定化されている金属イオンと の置換が最小である化合物を包含し（これに限らない）、グリシン、ヒスチジン 、ｔｒｉｓ、イミダゾール、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ等があるがこれらに限らない。 置換物質の適当濃度は結合アフィニティーにより変化し、実験的に条件を評価す ることにより確認できることを、当業者は容易に理解する。典型的には、低濃度 （例えば、５〜１５ｍＭの置換物質）ないし高濃度（例えば、１００〜２００ｍ Ｍの置換物質）の範囲の濃度である。 因子ＩＸについていう比活性「Ｕ／ｍｇ」は、プールされた血漿または単離血 漿を用い、精製ＩＸを標準物質として用いるインビトロ（ＡＰＴＴ）クロッティ ングアッセイにおいて決定される生物学的活性を包含するが、これに限らない。 ＳＥＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、色素によるアッセイ（例えば、Bradford法、Lowry法 ）または２８０ｎｍにおける吸光度を包含するいくつかの適当に確認された方法 により蛋白濃度を決定することができる。因子ＩＸ欠損血漿を用いるPittman,D. ,et al.,Blood 79:389-397(1992)の方法により因子ＩＸの活性を決定する。 図１はプロセスの概要を示す。示された工程の順序は目下好ましい順序である が、所望ならば順序を入れ替えることができ、工程を省力することができること が当業者により理解されるであろう。 本発明によれば、まず、約０.６μｍの孔サイズの十字フロー濾過膜用いる精 密濾過（ＭＦ）により細胞をならし培地から除去する。深さ０.４５μｍのフィ ルターで濾過することにより、精製用の無細胞ならし培地を調製してもよい。次 いで、無細胞ならし培地を限外濾過により濃縮することができ、次いで、所望な らば、第１のクロマトグラフィー工程に負荷するための適当なバッファー中に透 析濾過する。別法として、適当なバッファーで平衡化した第１のクロマトグラフ ィーカラムに無細胞ならし培地を直接負荷してもよい。 最初のプロセス工程であるＵＦ／ＤＦ＃１には、無細胞因子ＩＸ含有ならし培 地の限外濾過による濃縮、次いで、透析濾過が必要である。因子ＩＸが第１のク ロマトグラフィーカラムに結合することは必要ないとしても、この工程は低分子 量細胞培養培地成分の除去に効果的である。かかる成分は最初のクロマトグラフ ィーカラムに結合するかもしれず、それにより因子ＩＸに対するカラム容量が低 下する。その後の処理のために、ＵＦ／ＤＦ＃１を用いて因子ＩＸを適当なバッ ファー溶液中に置換する。 第１のクロマトグラフィー工程、すなわちQ-Sepharose Fast Flow(FF)（Pharm acia）によるアニオン交換において、因子ＩＸが捕捉され、ＵＦ／ＤＦ＃１濃縮 物プール中に存在する宿主細胞成分から精製される。Q-SepharoseFFカラムは因 子ＩＸを吸着し、操作ｐＨよりも高い等電点を有する混入している宿主細胞蛋白 は、カラムを素通りすることによりプロセスの流れから除去される。次いで、緩 やかに結合している汚染混入物質を除去する前に、因子ＩＸが吸着しているカラ ムを洗浄し、溶離用に調製するバッファーの導電率を調節する。 典型的には、バッファーのイオン強度を増加させることにより結合蛋白をQ-Se pharose FFから溶離させる。しかしながら、因子ＩＸの精製プロセスは、例えば 塩化カルシウムをバッファーに添加することにより活性因子ＩＸを溶離する偽ア フィニティーアニオン交換モードにおいてこの樹脂を使用する。この２価カチオ ンは、活性形態の因子ＩＸを樹脂から溶離させる。この溶離バッファーとともに いくつかのあまり活性でない因子ＩＸもQ-Sepharose FFカラムから溶離されるか もしれない。選択された不活性形態の因子ＩＸおよび他の混入宿主細胞蛋白はカ ラムに結合したままである。Q-Sepharose FF工程により因子ＩＸの純度が有意に 向上する。 第２のクロマトグラフィー工程において、Q-Sepharose FF溶離物プールを希釈 せずに直接Matrex Cellulose Sulfateカラム上に負荷する。因子ＩＸはカラムに 吸着するが、他の混入蛋白（例えば、Q-Sepharose FF溶離物中に存在する可溶性 ＰＡＣＥおよび他の宿主細胞蛋白）はカラムを素通りすることによりプロセスの 流れから除去される。低イオン強度バッファーでカラムを洗浄してすべての未結 合蛋白を除去する。塩（例えば、塩化ナトリウム）を用いてバッファーのイオン 強度を増加させることにより因子ＩＸを溶離する。 第３のクロマトグラフィー工程、すなわちCeramic-HAカラムクロマトグラフィ ーを行っている間に不活性な因子ＩＸ形態のさらなる除去を行う。Matrex Cellu fine Sulfate溶離物プールのｐＨを約７.５に合わせ、次いで、溶離物プールをC eramic-HAカラム上に直接負荷する。因子ＩＸはカラムに吸着する。Ceramic-HA カラムをバッファーで洗浄して緩やかに結合している汚染混入物質を除去し、次 いで、５０ｍＭリン酸カリウム,０.１８５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７.２）で洗浄して 固く結合している汚染混入物質（不活性形態の因子ＩＸを包含する）を除去する 。高濃度のリン酸カリウム（例えば、２００ｍＭまたはそれ以上，ｐＨ７.２） を溶離液として用いるステップ−ワイズ様式で、結合している活性因子ＩＸを溶 離させる。 第４のクロマトグラフィー工程、すなわちFractogel EMD-Chelate-Cu(II)クロ マトグラフィーにより、まだ生成物の流れに存在している低レベルの混入宿主細 胞蛋白を除去する。Ceramic-HA溶離物プールをFractogel EMD-Chelate-Cu(II)カ ラムに直接負荷する。因子ＩＸおよび多くの汚染混入蛋白がカラムに吸着する。 バッファー中の低濃度のイミダゾール（例えば、約１５ｍＭ）により精製活性因 子ＩＸがカラムから溶離され、残存する混入宿主細胞蛋白はカラムに結合したま まとなることにより生成物の流れから除去される。 最後に、限外濾過、次いで、ポリソルベート８０不含であること以外は）処方 バッファーと同じバッファー中への透析濾過（ＵＦ／ＤＦ＃２）によりFractoge l EMD-Chelate-Cu(II)溶離物プールを濃縮する。適当な処方バッファーは、ヒス チジン、グリシン、蔗糖、およびポリソルベート８０（それぞれ１０ｍＭ、２６ ０ｍＭ、１％、および０.００５％であってもよい）を含む。透析濾過が完了し たら、因子ＩＸを目的濃度にまで濃縮する。生成物プールをＵＦ／ＤＦ＃２装置 から取り、ポリソルベート８０を目的濃度０.００５％となるまで添加すること により処方する。次いで、因子ＩＸ薬剤物質をサンプリングし、ラベルを貼り、 次いで、約−８０℃で保存する。最終プロセス工程であるＵＦ／ ＤＦ＃２は、有意な蛋白変性または損失なしに精製因子ＩＸ薬剤物質を濃縮し透 析濾過することにおいて有効である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（還元および非還元 ）は、プロセス全体の質を評価するための１の方法である。各工程は８０％ない し１００％の回収率であり、因子ＩＸの平均の正味の収率は約５１％である。精 製プロセスに供する前のクロッティング活性と因子ＩＸ薬剤物質（プロセス途中 の試料および保持液として取ったものを除く）の全クロッティング活性からプロ セス全体の収率を決定する。 下記実施例は本発明の実施を説明する。これらの実施例は説明のみを目的とし 、特許請求されている本発明の範囲を何ら限定するものではない。 実施例１は限外濾過／透析濾過による蛋白の濃縮を説明する。実施例２はQ-Se pharose Fast Flow偽アフィニティーイオン交換クロマトグラフィーによる因子 ＩＸの精製に関する。実施例３はMatrex Cellulose Sulfateクロマトグラフィー による因子ＩＸの精製を説明する。実施例４はヒドロキシアパタイトを用いる蛋 白精製に関する。実施例５は固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによ る蛋白精製を説明する。実施例６は限外濾過／透析濾過による蛋白の濃縮および 処方に関する。 実施例１−限外濾過／透析濾過による蛋白濃縮 十字フロー膜濾過を用いる限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ＃１）を行って無 細胞ならし培地を濃縮しバッファー交換することができる。十字フロー装置に使 用する膜は、分子量に基づいて物質を分離する選択的透過性フィルターとして役 立つ。因子ＩＸのごとき高分子の溶液成分は膜により保持され、無機塩類および バッファー成分のごとき低分子成分は多孔性膜構造中を自由に通過し、透過液中 に除去される。 置換バッファーを保持液に添加するよりも早い速度で十字フロー装置からバッ ファーを取る場合、蛋白溶液は濃縮される。バッファーが膜を通って出て行くの とほぼ同じ速度で置換バッファーを十字フロー保持液に添加する場合、最初のバ ッファーは連続的に希釈される（蛋白の透析濾過）。これらの条件下で、低分子 量 の成分は容易に交換され、蛋白濃度は一定のままである。保持液の５倍の体積の バッファーの添加により、理論上最初のバッファーの９９％またはそれ以上が置 換される。 使用前に、ＵＦ／ＤＦ＃１システムを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ,１５０ｍＭ ＮａＣ ｌ,ｐＨ７.５で平衡化する。無細胞ならし培地を、最初の無細胞ならし培地の体 積を基準として約２０倍に濃縮する。次いで、濃縮無細胞ならし培地をバッファ ー中に透析濾過する。保持液の少なくとも５倍の体積のバッファーが膜を通過し て時点で透析濾過を完了し、理論上、無細胞ならし培地に存在する塩類および他 の低分子量成分の９９％またはそれ以上が除去される。 透析濾過が完了したならば、必要な場合、保持液を濃縮する。次いで、残留し ている因子ＩＸ生成物をリザーバーおよび配管から回収するのに十分なバッファ ーで装置を洗う。次いで、プールをＵＦ／ＤＦ容器からポンプで出し、オートク レーブ済み０.２μｍフィルターで濾過してきれいな容器中に入れる。さらに処 理するまでＵＦ／ＤＦ＃１プールを２ないし８℃で保存する。 実施例２−Q-Sepharose Fast Flow偽アフィニティーアニオン交換クロマトグラ フィーによる因子ＩＸの精製 Q-Sepharose Fast Flow(FF)（Pharmacia）は、短いリンカーを介して４級アミ ン基を共有結合して誘導体化された架橋アガロースマトリックスからなる強アニ オン交換樹脂である。操作ｐＨにおいて正味の負電荷を有する酸性蛋白（因子Ｉ Ｘのごとき）および他の多イオン性物質は電荷相互作用によりQ-Sepharose FFに 結合する。典型的には、導電率の大きい溶液によりこれらの電荷の相互作用を破 壊することにより結合成分はQ-Sepharose FFから個々に溶離される。しかしなが ら、因子ＩＸ精製プロセスには偽アフィニティーモードのQ-Sepharose FF樹脂を 用いる。低濃度（１０ｍＭ）の塩化カルシウムを含有する溶液を用いて因子ＩＸ をカラムから溶離する。溶離バッファー中のカルシウムイオンを含めることは因 子ＩＸのコンホーメーション変化を引き起こし、樹脂からの溶離を引き起こす。 Q-Sepharose FFを用いてＵＦ／ＤＦ＃１保持液から因子ＩＸを捕捉し、非荷電 汚染混入物質および塩基性汚染混入物質を除去し（カラムへの負荷中に未結合フ ラクション中に出る）、因子ＩＸ（不活性形態の因子ＩＸを包含）を酸性蛋白か ら分離し（それらは樹脂に結合するが、バッファーへの塩化カルシウム添加によ っては溶離されない）、濃縮された因子ＩＸのプロセスの流れを次の精製プロセ スであるクロマトグラフィー工程、すなわちMatrex Cellufine Sulfateへと送る 。 この工程に関するすべてのクロマトグラフィー操作を２ないし８℃で行っても よい。まず、Q-Sepharose FFカラムに５０ｍＭ Ｔｒｉｓ,２Ｍ ＮａＣｌ,ｐＨ８ .０をチャージし、次いで、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ,１５０ｍＭ ＮａＣｌ,ｐＨ８.０ で平衡化する。ＵＦ／ＤＦ＃１保持液をQ-Sepharose FFカラムに負荷し、次いで 、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ,２００ｍＭ ＮａＣｌ,ｐＨ８.０でカラムを洗浄する。こ の最初の洗浄により、全負荷物がカラムを通り、緩やかに樹脂に結合している負 荷物中の非吸着性不純物ならびに汚染混入物質が系から洗い出されることが確実 となる。次いで、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ,１００ｍＭ ＮａＣｌ,ｐＨ８.０でカラム を洗浄して導電率を下げて溶離に備える。 ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ,１００ｍＭ ＮａＣｌ,１０ｍＭ ＣａＣｌ₂,ｐＨ８.０でカ ラムから因子ＩＸを溶離し、溶離生成物をを１本のピークとして集める。Q-Seph arose FF溶離物をサンプリングし、さらなる処理を行うまで２ないし８℃で保存 する。カラムを再生して再使用してもよい。 実施例３−Matrex Cellufine Sulfateクロマトグラフィーによる因子ＩＸの精製 Matrex Cellufine Sulfateは、硫酸エステルで誘導体化された球形セルロース ビーズからなる。ヘパリン結合ドメインを含む蛋白のアフィニティー精製のため の固定化ヘパリンアナログとしてそれを用いることができる。それは負に帯電し た硫酸官能基を有するので、それをカチオン交換クロマトグラフィーに用いても よい。操作ｐＨにおいて正味の正電荷を有する塩基性蛋白、他の多イオン性物質 、ならびにヘパリン結合蛋白は樹脂に結合し、溶液のイオン強度を増加させると 溶離する。Q-Sepharose FF溶離物プール中の因子ＩＸ以外の宿主細胞蛋白を除去 す るための因子ＩＸ精製プロセスにおいてMatrex Cellufine Sulfate樹脂を用い、 さらにヒドロキシアパタイトカラム負荷に適するバッファー条件を提供してもよ い。 この工程のすべてのクロマトグラフィー操作を２ないし８℃で行ってもよい。 負荷工程の準備のために、Matrex Cellufine Sulfateカラムを５０ｍＭ Ｔｒｉ ｓ,ｐＨ８.０で平衡化する。Q-Sepharose FF溶離物プールを平衡化されたMatrex Cellufine Sulfateカラムに直接負荷し、カラムを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ,１５０ｍ Ｍ ＮａＣｌ,１０ｍＭ ＣａＣｌ₂,ｐＨ８.０で洗浄して、すべての負荷物がカラ ムを通り、弱く結合した不純物が系から除去されることを確実にする。次に、溶 離の前にカラムを洗浄してカルシウムイオンを除去する。 洗浄工程完了後、Matrex Cellufine Sulfateカラムを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ,５００ ｍＭ ＮａＣｌ,ｐＨ８.０で溶離し、溶離物を１つのＵＶ吸収溶離物プールとし て集める。Matrex Cellufine Sulfate溶離物プールをサンプリングし、さらに処 理するまで２ないし８℃で保存する。カラムを再生し、再使用してもよい。 実施例４−ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いる蛋白精製 セラミック−ヒドロキシアパタイト（Ceramic-HA）は、大きな機械的強度を有 する球形多孔質粒子からなる合成形態のリン酸カルシウムである。Ceramic-HAは 、主に電荷相互作用に基づいて、広範囲の電荷および等電点の蛋白を分離する。 因子ＩＸは、ほぼ中性ｐＨにおいてCeramic-HAに結合する酸性蛋白である。典型 的には、バッファー溶液にリン酸塩を添加することにより、酸性蛋白はCeramic- HAから溶離される。目的分子の特性により溶離に必要なリン酸塩濃度は変動し、 そのことにより結合蛋白が個々に溶離される。Ceramic-HAを因子ＩＸ精製プロセ スに用いて、Matrex Cellufine Sulfate溶離物プール中の不活性因子ＩＸおよび 他の汚染混入物質を除去し、溶離物バッファーを最終クロマトグラフィー工程に 適合したものにする。最終クロマトグラフィー工程が固定化金属アフィニティー クロマトグラフィーであるので、Ceramic-HAの溶離に使用するバッファーをＩＭ ＡＣに適合するように選択する。このことによりプロセスに差し挟む透析濾 過または他のバッファー交換法を省略する。金属イオンと固定化リガンドとの相 互作用を破壊するので、Ｔｒｉｓ、グリシン、ヒスチジンのごときバッファーは ＩＭＡＣに適合しない。 負荷のための準備において、Ceramic-HAカラムを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ,５００ｍ Ｍ ＮａＣｌ,ｐＨ７.５で平衡化する。Matrex Cellufine Sulfate溶離物プール を希ＨＣｌで滴定してｐＨ７.５とし、Ceramic-HAカラムに直接負荷する。負荷 完了後、カラムをバッファー（すべての負荷物がカラムを通り、）で洗浄して緩 く結合した汚染混入物質がカラムから除去されることを確実にする。次に、カラ ムを５０ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄,１８５ｍＭ ＮａＣｌ,ｐＨ７.２で洗浄して不活性形 態の因子ＩＸをプロセスの流れから除去する。 洗浄工程完了後、結合した因子ＩＸを５００ｍＭ Ｋ₂ＨＰＯ₄,２００ｍＭ Ｎ ａＣｌ,ｐＨ７.２で溶離し、因子ＩＸ溶離物を１つのＵＶ吸収溶離物プールとし て集める。溶離物プールをサンプリングし、さらなる処理を行うまで２ないし８ ℃に保存する。カラムを再生し、再使用してもよい。 実施例５−固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによる蛋白精製 Fractogel-EMD-Chelateは、遷移状態の金属イオンが結合しうるイミノジ酢酸 官能基で誘導体化されたメタクリレートポリマーからなる。精製プロセスでの使 用準備において、硫酸銅溶液を用いて樹脂に銅をチャージする。固定化銅イオン と相互作用しうる蛋白はカラムに保持され、相互作用しない汚染混入物質は未結 合フラクション中に素通りする。イミダゾール含有溶液を用いて結合蛋白を溶離 させる。Fractogel-EMD-Chelate-Cu(II)工程を蛋白精製プロセスに用いて、固定 化金属イオンに結合しないかまたは因子ＩＸの溶離に必要なイミダゾールよりも 高濃度のイミダゾールを必要とする汚染混入物質をプロセスの流れから除去する 。このクロマトグラフィー工程を表すために、用語ＩＭＡＣ（固定化金属アフィ ニティークロマトグラフィー）を使用する。 負荷のための準備において、未チャージの（固定化金属イオンのない）Fracto gel-EMD-Chelateカラムを、１００ｍＭ酢酸、５００ｍＭ ＮａＣｌ,ｐＨ ４.０で洗浄し、次いで、２００ｍＭ ＣｕＳＯ₄,５００ｍＭ ＮａＣｌをチャー ジする。１００ｍＭ酢酸、５００ｍＭ ＮａＣｌ,ｐＨ４.０、次いで、２００ｍ Ｍイミダゾール,５００ｍＭ ＮａＣｌ,ｐＨ７.１で洗浄することにより緩く結合 した銅イオンを除去する。次いで、Fractogel-EMD-Chelate-Cu(II)樹脂を２００ ｍＭ Ｋ₂ＨＰＯ₄,２００ｍＭ ＮａＣｌ,ｐＨ７.１で平衡化する（平衡化Ｖ）。C eramic-HA溶離物プールを、平衡化したFractogel-EMD-Chelate-Cu(II)カラムに 直接負荷する。 負荷完了後、平衡化バッファーでカラムを洗浄して、すべての負荷物がカラム を通ることを確実にする。２０ｍＭ Ｋ₂ＨＰＯ₄,１５ｍＭイミダゾール,１００ ｍＭ ＮａＣｌ,ｐＨ７.１を用いて樹脂に結合した因子ＩＸを溶離する。Fractog el-EMD-Chelate-Cu(II)溶離物を１つのＵＶ吸収プールとして集める。集めた後 、溶離物プールを、カラム溶離物１リットルあたり２０ｍＬの５００ｍＭＥＤＴ Ａ,ｐＨ８.０で希釈する。さらに処理するまで溶離物プールを室温に保存する。 実施例６−限外濾過／透析濾過＃２による蛋白の濃縮および処方 因子ＩＸを選択バッファーに移すために、限外濾過／透析濾過工程を用いる。 十字フローＵＦ／ＤＦは非クロマトグラフィー分離法であり、これを用いて溶液 中の物質の濃縮およびバッファー交換を行うことができる。供給液を選択的透過 性膜表面に平行に流し、膜の保持液側に圧をかけて、膜表面における水および溶 質の相対的透過性に基づく輸送を行わせる。これらの環境において、低分子量の 供給液中の成分は自由に膜の孔を通過して透過フラクション中に至り、高分子量 物質（例えば、因子ＩＸ）は膜により保持され、保持フラクションを形成する。 この方法において、水およびバッファー塩をFractogel-EMD-Chelate-Cu(II)溶離 物プールから除去することができ、因子ＩＸを目的濃度にまで濃縮することがで きる。 十字フローシステムの螺旋溝カートリッジコンポーネントを、まず１０ｍＭヒ スチジン,２６０ｍＭグリシン,１％蔗糖,ｐＨ６.８で平衡化する。次いで、 Fractogel-EMD-Chelate-Cu(II)溶離物プール（前以て５００ｍＭ ＥＤＴＡで希 釈）を、蛋白濃縮に備えて十字フロー装置のステンレス製保持液加圧容器に移す 。 移すことが完了したら、正味の正の経膜圧力をかけながら保持溶液をポンプで 連続的に加圧容器から螺旋溝カートリッジを通して加圧容器に戻す。この操作を 行っている間、目盛り付き収集容器を用いて透過フラクション体積を測定するこ とにより保持液体積を連続的にモニターする。 目的保持液体積に達したならば、保持液プールを選択バッファー中に透析濾過 する。この操作の間、透過液がシステムから流出するのと同じ速度で透析濾過バ ッファーを加圧容器中にポンプで送り、そのことにより保持液体積を一定に維持 する。 透析濾過工程完了後、限外濾過を用いて保持液フラクションを目的体積にまで 濃縮する。保持液加圧容器からの流出フラクションを止め、目的体積の選択バッ ファーで螺旋溝カートリッジ中の保持液フラクションを保持液加圧容器中に洗い 込む。濃縮され、透析濾過された因子ＩＸ生成物をポンプで加圧容器から風袋を 計っておいたプール用ビンに取る。 因子ＩＸ生成物プールを１０ｍＭヒスチジン,２６０ｍＭグリシン,１％蔗糖, １％ポリソルベート８０,ｐＨ６.８で希釈してポリソルベート最終濃度０.００ ５％とする。次いで、生成物を完全に混合し、０.２μｍフィルター（前以て１ ０ｍＭヒスチジン,２６０ｍＭグリシン,１％蔗糖,０.００５％ポリソルベート８ ０,ｐＨ６.８にて平衡化）で濾過して脱パイロジェン化したテフロン製ビンに入 れる。次いで、蛋白をサンプリングし、ラベルを貼り、液体窒素で素早く凍結し て−８０℃で保存する。 組み換え的に製造された因子ＩＸの形質転換宿主細胞からの精製によって本発 明方法を説明したが、該方法は、天然の細胞中に存在する因子ＩＸの精製にも使 用でき、溶液または血漿、細胞ホモジネート物、細胞培養上清、あるいは単離細 胞サブフラクションからの蛋白の精製に使用できる。本発明を特定の方法および 組成物について説明したが、本発明を考慮して当業者が変更および修飾を行うこ とが理解される。 上記の説明的実施例に記載された本発明における多くの修飾および変更は当業 者により行われると予想され、したがって、添付した請求の範囲にあるような限 定のみが本発明に課されるはずである。したがって、特許請求されている本発明 の範囲内にあるすべてのかかる均等な変更を添付した請求の範囲がカバーすると 考えられる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 コスティガン，ロバート・ジェイ アメリカ合衆国01921マサチューセッツ州 ボックスフォード、キャメロット・ドラ イブ ７番 (72)発明者 ボナム，デュアン アメリカ合衆国01913マサチューセッツ州 エイムズベリ、モースクロフト・レイン ４番 (72)発明者 スウィッザー，メアリー・ビー アメリカ合衆国01810マサチューセッツ州 アンドーバー、ホール・アベニュー ７ 番 (72)発明者 ウォルシュ，ロチェール アメリカ合衆国01864マサチューセッツ州 ノース・リーディング、ローレルトン・ ロード 17番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．溶液中の因子ＩＸの精製方法であって、下記工程： 該溶液をアニオン交換樹脂に適用すること、 該アニオン交換樹脂を第１の溶離液で溶離して第１の溶離物を得ること、 該溶離物をヘパリン様樹脂に適用すること、 該ヘパリン様樹脂を第２の溶離液で溶離して第２の溶離物を得ること、 該第２の溶離物をヒドロキシアパタイト樹脂に適用すること、次いで、 該ヒドロキシアパタイト樹脂を第３の溶離液で溶離して第３の溶離物を得るこ と を特徴とする方法。 ２．下記工程： 該第１の溶離液で溶離する前に該アニオン交換樹脂を第１の洗浄液で洗浄する こと をさらに特徴とする請求項１の方法。 ３．該第１の洗浄液が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、リ ン酸ナトリウムまたはリン酸カリウムからなる群より選択される溶液を含むもの である請求項２の方法。 ４．該第１の洗浄液が２００ｍＭ塩化ナトリウムである請求項３の方法。 ５．下記工程： 該第３の溶離物を固定化金属アフィニティー樹脂に適用し、次いで、 該固定化金属アフィニティー樹脂を第４の溶離液で溶離して第４の溶離物を得 ること をさらに特徴とする請求項１の方法。 ６．該第１の溶離液が、カルシウム、マグネシウム、マンガン、ストロンチウ ム、亜鉛、コバルトおよびニッケルからなる群より選択される２価カチオンを含 むものである請求項１の方法。 ７．該第１の溶離液が１０ｍＭカルシウムである請求項６の方法。 ８．該アニオン交換樹脂が、ジエチルアミノエタン（ＤＥＡＥ）、ポリエチレ ンイミン（ＰＥＩ）および４級アミノエタン（ＱＡＥ）からなる群より選択され るメンバーである正に帯電した基を有するものである請求項１の方法。 ９．該アニオン交換樹脂がQ-Sepharose Fast Flowである請求項８の方法。 １０．該ヘパリン様樹脂が、ヘパリン、セルロースの硫酸エステル、スルフィ ルプロピル（ＳＰ）、カルボキシルおよびカルボキシメチルからなる群より選択 されるメンバーである負に帯電した基を有するものである請求項１の方法。 １１．該ヘパリン様樹脂がMatrex Cellufine Sulfateである請求項１０の方法 。 １２．該第２の溶離液が、塩化ナトリウムおよび塩化カリウムからなる群より 選択されるメンバーである請求項１の方法。 １３．該第２の溶離液が５０ｍＭ Ｔｒｉｓ,０.５０Ｍ ＮａＣｌ,ｐＨ８.０で ある請求項１２の方法。 １４．該第３の溶離液が、リン酸塩および硫酸塩からなる群から選択されるメ ンバーである請求項１の方法。 １５．該第３の溶離液が０.５Ｍリン酸カリウム,０.２Ｍ ＮａＣｌ,ｐＨ７.２ である請求項１４記載の方法。 １６．該ヒドロキシアパタイト樹脂が、セラミック−ヒドロキシアパタイトお よびBioGel-HTからなる群より選択されるメンバーである請求項１の方法。 １７．該ヒドロキシアパタイト樹脂がセラミック−ヒドロキシアパタイトであ る請求項１６の方法。 １８．該固定化金属アフィニティー樹脂が、Fractogel-EMD-Chelate、Chelati ng-Sepharose、Matrex Cellufine ChelateおよびPOROS 20MCからなる群より選択 されるメンバーである請求項５の方法。 １９．該固定化金属アフィニティー樹脂がFractogel-EMD-Chelateである請求 項５の方法。 ２０．該第４の溶離液が置換物質である請求項５の方法。 ２１．該置換物質が、イミダゾール、ＥＤＴＡ、グリシン、ヒスチジンおよび Ｔｒｉｓからなる群より選択されるメンバーである請求項２０の方法。 ２２．溶液中の因子ＩＸの精製方法であって、下記工程： 該溶液をアニオン交換樹脂に適用すること、 該アニオン交換樹脂を第１の溶離液で溶離して第１の溶離物を得ること、 該第１の溶離物をヒドロキシアパタイト樹脂に適用すること、次いで、 該ヒドロキシアパタイト樹脂を第３の溶離液で溶離して第３の溶離物を得るこ と を特徴とする方法。 ２３．下記工程： 該第１の溶離液で溶離する前に該アニオン交換樹脂を第１の洗浄液で洗浄する こと をさらに特徴とする請求項２２の方法。 ２４．下記工程： 該第３の溶離物を固定化金属アフィニティー樹脂に結合させること、次いで、 該固定化金属アフィニティー樹脂を第４の溶離液で溶離して第４の溶離物を得 ること をさらに特徴とする請求項２２の方法。 ２５．溶液中の因子ＩＸの精製方法であって、下記工程： 該溶液をアニオン交換樹脂に適用すること、 該アニオン交換樹脂を第１の洗浄液で洗浄すること、次いで、 該アニオン交換樹脂を第１の溶離液で溶離して第１の溶離物を得ること を特徴とし、該第１の溶離液が該第１の洗浄液の導電率および該溶液の導電率の うち高い方よりも低い導電率を有するのもである方法。 ２６．該第１の洗浄液が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、 リン酸ナトリウムまたはリン酸カリウムからなる群より選択される溶液を含むも のである請求項２５の方法。 ２７．該第１の洗浄液が２００ｍＭ塩化ナトリウムである請求項２６の方法。 ２８．溶液中の因子ＩＸの精製方法であって、下記工程： 該溶液をヒドロキシアパタイト樹脂に適用すること、 該ヒドロキシアパタイト樹脂を第１のリン酸塩バッファーで洗浄して不活性形 態の因子ＩＸを除去すること、 該ヒドロキシアパタイト樹脂を第２のリン酸塩バッファーで溶離すること を特徴とし、該第２のリン酸塩バッファーが該第１のリン酸塩バッファーよりも 高い濃度のリン酸塩濃度を有するものである方法。 ２９．該第１のリン酸塩バッファーが硫酸塩バッファーである請求項２８の方 法。 ３０．該第１のリン酸塩バッファーが５０ｍＭリン酸カリウム，０.１８５Ｍ ＮａＣｌ,ｐＨ７.２であり、該第２のリン酸塩バッファーが０.５Ｍリン酸カリ ウム,０.２Ｍ ＮａＣｌ,ｐＨ７.２である請求項２８の方法。 ３１．請求項１の方法により製造される因子ＩＸ。 ３２．請求項５の方法により製造される因子ＩＸ。 ３３．請求項２２の方法により製造される因子ＩＸ。 ３４．請求項２４の方法により製造される因子ＩＸ。 ３５．請求項２５の方法により製造される因子ＩＸ。 ３６．請求項２８の方法により製造される因子ＩＸ。 ３７．２４０〜４００Ｕ／ｍｇの比活性を有する因子ＩＸ。 ３８．該比活性が約２４０Ｕ／ｍｇである請求項３７の因子ＩＸ。