KR100451308B1

KR100451308B1 - 단백질 의약품 정제 방법에서의 바이러스 제거 방법

Info

Publication number: KR100451308B1
Application number: KR10-2001-0087154A
Authority: KR
Inventors: 노광; 박민구; 이지원; 이준희; 유형덕; 김승덕
Original assignee: 선바이오(주)
Priority date: 2001-12-28
Filing date: 2001-12-28
Publication date: 2004-10-06
Also published as: KR20030056852A

Abstract

본 발명은 단백질 의약품 정제 방법으로서 생리활성 단백질 의약품의 생산 공정 중 원료 물질에 존재하거나 공정 중에 오염될 가능성이 있는 바이러스들을 제거하는 방법에 관한 것으로, 실리카-폴리에틸렌이민(polyethyleneimine; PEI) 음이온 교환 레진과 셀룰로우즈-4급아민트리메틸아미노에틸 그룹[quaternary amine(trimethyl-aminoethyl); QAE] 음이온 교환 레진에 의한 2 단계의 음이온 교환 크로마토그래피(anion exchange chromatography) 공정; 및 기공 크기가 15∼20 ㎚인 멤브레인 필터에 의한 나노여과(nanofiltration) 공정을 통해 바이러스를 제거하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 의약품의 정제 방법에 의하면, 전체 단백질 의약품 정제 공정 중 log₁₀15∼20 이상의 바이러스 감소 계수를 얻을 수 있어 효율적이고 재현성이 있으며, 단백질의 활성에 영향을 주지 않으면서 단백질 의약품을 정제할 수 있어 바람직하다.

Description

단백질 의약품 정제 방법에서의 바이러스 제거 방법{A VIRUS REMOVAL PROCESS IN THE PURIFICATION OF BIOLOGICALLY ACTIVE MOLECULES}

본 발명은 단백질 의약품 정제 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 생리활성 단백질 의약품의 생산 공정 중 원료 물질에 존재하거나 공정 중에 오염될 가능성이 있는 바이러스들을 제거하는 방법에 관련된다.

미국 FDA나 유럽 연합 EMEA(CPMP/BWP/268/95) 등에서는 생물학적제제 생산 공정 내에 바이러스 불활성화/제거에 효과적이고 검증(validation)된 단계들을 첨가할 것을 권고하고 있다. 또한 미국 FDA 관보에 의하면, 최종 제품에 감염 바이러스들이 존재하지 않는다는 증명은, 단순히 바이러스들의 존재 유무를 검사하는 것 뿐만 아니라 정제 공정이 바이러스들을 제거 및/또는 불활성화할 수 있는 능력을 증명하는 것으로부터 유래해야 한다고 밝히고 있다(Federal Register, 1998, 63(185), 51074-51084). 즉, 단백질 의약품 생산 공정에 있어서는 효과적인 바이러스 제거 및/또는 불활성화 단계를 첨가하고 이를 검증(validation)하는 것이 무엇보다 중요한 것이라 할 수 있다.

EMEA(European agency for the evaluation of medicinal products)의CPMP(committee for proprietary medicinal products)가 발행한 CPMP/BWP/269/rev. 3에 의하면, 다음 5 개 단계가 혈장-유래 인간 의약품 생산 공정에서 바이러스 불활성화/제거 능력이 있는 단계로 규정되어 있다.

(1) 수용액 상에서 가열

최종 제품 상태로 수용액 상에서 60 ℃로 10 시간 가열하는 것이, 알부민 제조시 바이러스를 불활성화시키는 약전(European pharmacopeia)에 기술된 방법이다. 이 방법은 기타 혈장-유래 의약품의 대량 생산 공정에서도 사용된다.

그러나, 이 방법의 유효성은 수용액의 조성에 따라 다르다. 또한, 단백질들을 보호하고 새로운 항원(neoantigen) 형성을 최소화하기 위해서는 안정화 (stabilization) 단계가 필요한데, 여기에 사용되는 당이나 아미노산 같은 안정화제제(stabilizer)는 바이러스의 불활성화를 저해할 수 있다. 따라서, 이 방법에는 신중한 검증(validation)이 요구된다고 밝히고 있다.

이 방법은 또한 일부 비-외피 보유(nonenveloped) 바이러스들(예를 들어, 개 파보바이러스(canine parvovirus))의 감염성(infectivity)은 제거하지 못하는 것으로 알려져 있다.

(2) 동결건조 의약품의 가열

이 방법의 유효성은 동결건조 조건에 따라 차이가 있다. 파마시아 (Pharmacia)에서 발표한 자료에 의하면, 80 ℃로 72 시간, 90 ℃로 20 시간, 또는 100 ℃로 10 시간 등의 조건대로 동결건조 의약품을 가열하였을 때, 개 파보바이러스는 log₁₀4의 감염성 감소가 일어났지만, 단백질 의약품의 경우 응괴 (aggregation)가 일어나고 응고인자는 활성이 30 % 가량 감소되었다고 밝히고 있다.

(3) 용매/세제 처리(solvent/detergent treatment)

트리-n-부틸-포스페이트(tri-n-butyl-phosphate, TNBP) 같은 용매와, 트리톤 (Triton) X-100이나 트윈(Tween) 80 같은 비-이온성 세제를 함께 처리하면 외피보유(enveloped) 바이러스들을 불활성화시킬 수 있다.

이러한 용매/세제 처리는 다음과 같은 조건이 충족되어야 효과적이다: 우선 처리를 받을 공정산물은 처리 전에 응괴(aggregates)가 없어야 하는데, 응괴는 바이러스를 포함할 수도 있고 처리를 저해하기 때문이다. 응괴는 여과(filtration)로 제거할 수 있는데, 이 경우 사용되는 필터들이 공정산물내 다른 첨가물(additives)들의 함량을 변화시키지 않는다는 것을 증명할 필요가 있다. 또한, 용매/세제 처리 시에는 혼합(mixing)이 균일해야 하며 목표로 하는 공정 온도에 적합하도록 온도를 조절해야만 한다. 또 리피드(lipid) 함량은 불활성화의 유효성에 영향을 미칠 수 있으므로, 불활성화는 리피드 함량이 최악조건일 때를 가정해서 확인이 되어야 한다. 그리고, 잔존하는 용매와 세제의 양을 최소화하기 위해 전 공정을 모니터링(monitoring)해야 한다.

한편, 비-외피보유(nonenveloped) 바이러스들은 용매/세제 처리에 불활성화되지 않는다.

(4) 여과(filtration)에 의한 바이러스 제거

여과는 크기가 작은 바이러스들을 제거하는 데에는 어려움이 있을 수 있지만, 제 Ⅷ 인자 같은 고분자량의 산물들에 대해서는 만족할 만한 수율을 제공한다. 몇몇 형태의 필터들은 응고인자들의 활성화를 유발할 수 있으므로 적절한 선택을 통해 이를 최소화해야 하며, 여과 전후로 활성화 여부를 모니터링 해야 한다. 선택한 특정 필터들의 작용기전을 확인해야 하고, 바이러스 제거에 필수적인 지표들(예를 들어 부피, 이온 강도, 유속, 압력 및 부하)도 확인해야 한다. 또한, 필터 인티그리티(integrity)를 확인하는 시험이 공정 제어에 필수적이다. 바이러스 응괴는 여과에 의한 바이러스 제거 수준에 영향을 줄 수 있는데, 이러한 점은 바이러스 검증(validaion) 실험 수행시에도 고려해야 한다.

(5) 낮은 pH

대략 4 정도의 낮은 pH에서는 특정 바이러스들이 불활성화될 수 있다. 감소 계수(reduction factor)는 공정에 사용되는 조건들(pH, 시간, 처리 온도 및 수용액의 조성 등)에 따라 다르며, 따라서 신중하게 검증(validaion)해야 한다.

의약품 단백질 제조 공정에서는 실제 오염원 바이러스들(혈장-유래 의약품의 경우 혈액-유래 바이러스들) 뿐 아니라 검출이 안되거나 오염 가능성이 있는 바이러스들도 제거하거나 불활성화시켜야 한다.

바이러스 클리어런스(clearance) 방법 중에서는, 생산 공정에 포함된 침전, 친화력(affinity), 이온 교환, 젤-여과, 소수성 결합 및 혼합 이온 교환 크로마토그래피가 바이러스 입자(particle)들을 크기, 전하, 밀도, 결합 친화력 및 바이러스와 공정산물간 기타 다른 차이들에 의해 물리적으로 분리(즉, 바이러스를 제거)할 수 있다고 알려져 있다. 바이러스의 불활성화는 공정 중 pH 변화에 의하거나 (Vox. Sang. 63: 6-11, 1992), 크로마토그래피 칼럼으로부터 단백질 용출(elution)시 낮은 pH 완충용액을 사용하거나(BioPharm, 5(9): 22-30, 1992), 또는 정제 공정에 사용되는 시약들에 의해서도(Human leukocyte alpha-interferon preparations: laboratory characterization and regulatory considerations, 41-53, 1984) 달성될 수 있다.

바이러스 클리어런스는 사용하는 방법에 따라 바이러스 제거(바이러스 수의 역학적 감소) 또는 불활성화(바이러스 감염성의 비가역적 소실)로 나눌 수 있다. 바이러스 제거는 크기 배제 여과(size-exclusion filtration)로 가능하며(Vox. Sang. 75: 185-188, 1998), 이온교환, 친화, 젤-여과 크로마토그래피의 특정 매트릭스들(matrices)에 대한 흡착(adsorption)에 의해(Dev. Biol. Stand. 81: 199-209, 1993), 그리고 다른 분획으로의 분배(partitioning)에 의해(Dev. Biol. Stand. 81: 185-190, 1993) 영향을 받을 수 있다. 한편, 바이러스 불활성화는 물리적 방법(가열, 방사선, 초음파) 또는 화학적 방법[세제, 용매, 산, 염기, 글루타르알데히드(glutaraldehyde), 베타-프로피오락톤(β-propiolactone)]에 의해 달성될 수 있다.

이와 같은 불활성화 방법들은 바이러스 버든(burden)의 감소에 상당히 효과적이기는 하지만, 여러 가지 악영향의 가능성에 대해서도 고려해야 한다. 즉, 바이러스 불활성화 처리에 따르는 영향으로서, 단백질 변성(Ann. Clin. Biochem. 27:592-594, 1990), 이에 따르는 생물학적 활성의 소실, 주요 성분이나 제품 내 다른 단백질들의 항원성 변화(J. Infect. Disease, 155: 909-913, 1987), 새로운 항원 (neoantigen)의 형성과 항체 유도(Tromb. Haemost. 69: 115-118, 1993), 그리고 바이러스 불활성화에 의한 혈전 생성(thrombogenicity)[Tromb. Haemost. 44: 81-86, 1980]등을 들 수 있다. 또한, 불활성화 단계 중에 제품 내 주요 성분의 생물학적 활성을 유지시키기 위해 안정화 제제를 사용할 수 있는데, 이러한 안정화 제제가 제품 산물의 회수(recovery)에 영향을 줄 수 있으므로 최종 제형화(formulation) 이전에 제거해야 한다는 어려움이 존재한다.

이상에서 살펴 본 바와 같이, 종래의 바이러스 제거 및/또는 불활성화 방법들에는 유효성이 확보되지 않아 신중한 검증을 요하는 것들이 많고, 제거 및/또는 불활성화되지 않는 바이러스 종류도 있다. 더우기, 바이러스 클리어런스에 효과적인 방법들 중에는 단백질 의약품에 변화를 일으키거나 제품 회수율에 영향을 주는 것도 있으므로, 단백질 의약품의 정제 공정에서 바이러스를 제거하기 위한 방법을 선택할 때는 주의를 기울여야 한다.

본 발명에서는 이와 같은 종래의 바이러스 클리어런스 방법들의 문제점을 고려하여, 의약품 단백질 생산 공정 중 원료 물질에 존재하거나 또는 공정 중에 오염될 가능성이 있는 바이러스들을 제거하는 방법으로서, 효율적이고 재현성이 있으면서도 단백질의 활성에 영향을 주지 않는 단백질 의약품의 정제 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 단백질 의약품의 정제 방법은,

서로 다른 작용기를 갖는 2 단계의 음이온 교환 크로마토그래피(anion exchange chromatography) 공정 및 나노여과(nanofiltration) 공정을 통해 바이러스를 제거하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

여기에서, 2 단계의 음이온 교환 크로마토그래피 공정은 실리카-폴리에틸렌이민(polyethyleneimine; PEI) 음이온 교환 레진과 셀룰로우즈-4급아민트리메틸아미노에틸 그룹[quaternary amine(trimethyl-aminoethyl); QAE] 음이온 교환 레진을 사용하고, 나노여과 공정은 기공 크기가 15∼20 ㎚인 멤브레인 필터를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 바이러스 제거 방법이 적용될 수 있는 단백질 의약품으로는, 예를 들어 사이토카인 단백질 등의 재조합 생리활성 단백질 의약품과 헤모글로빈 등의 천연 단백질 의약품이 포함된다.

본 발명에서는 단백질 의약품의 정제 방법으로서 생산 공정 중 원료 물질에 존재하거나 공정 중에 오염될 가능성이 있는 바이러스들을 제거하는 방법을 제공하고 있다. 즉, 서로 다른 작용기(functional group)를 갖는 2 단계의 음이온 교환 크로마토그래피를 사용함으로써 전하(charge)의 차이에 의해 공정 산물로부터 바이러스를 제거하고, 나노여과 단계를 통해 입자 크기의 차이를 이용함으로써 크기가 20 ㎚ 부근에 있는 미세 크기의 바이러스를 제거할 수 있다. 음이온 교환 크로마토그래피 단계에서는 외피보유 바이러스들을 제거할 수 있고, 나노여과 단계는 비-외피보유 바이러스들의 제거에 특이적으로 작용할 수 있다.

이와 같은 본 발명의 방법에 의하면, 음이온 교환 크로마토그래피 단계 당, 그리고 나노여과 단계에 의해 각 log₁₀5 이상의 바이러스 감소 계수(reduction factor)를 얻음으로써, 단백질 의약품 정제 공정 중 log₁₀15∼20 이상의 바이러스 감소 계수를 얻을 수 있다.

본 발명에 따른 바이러스 제거 방법에서는 2 종류의 음이온 교환 크로마토그래피 레진(resin)을 사용하는데, 첫째는 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine; PEI)이 교차결합된 실리카(silica) 재질의 레진 비드(bead)로서, 평균 입자 크기가 50 ㎛이고 입자의 기공(pore) 크기는 500∼1000 Å인 것이다. 기공 크기가 500 Å인 비드는 분자량 50 kDa 이하인 물질들(크기가 작은 효소, 성장인자, 임파구, 펩티드, 올리고뉴클레오티드 등)의 정제에 효과적이고, 기공 크기가 1000 Å인 비드는 분자량 50 kDa 이상의 물질들(항체, 다 소단위 효소, 핵산 등)의 정제에 효과적이다. 두 번째 레진은 교차결합된 셀룰로즈(cellulose) 레진 비드로서, 강 음이온 교환 작용기인 4급 아민 트리메틸아미노에틸 그룹[quaternary amine(trimethyl-aminoethyl); QAE]이 결합된 것으로, 입자 크기가 50∼120 ㎛인 것이다. 이 레진은 산성 단백질, 펩티드 등의 정제에 효과적으로, 배제 한계(exclusion limit)는 500 kDa 이하이다.

본 발명의 나노여과 공정에 사용되는 나노여과 필터는 기공 크기가 15∼20 ㎚인 멤브레인 필터이다. 크기가 작고 물리화학적 처리에 상당한 저항성을 갖는비-외피보유 바이러스들[예를 들어, 간염 A 바이러스(크기: 25∼30 ㎚), 파보바이러스 B19(크기: 18∼24 ㎚)]을 효과적으로 제거하기 위해서는 기공 크기(pore size)가 15∼20 ㎚인 필터들을 사용하는 것이 최선책이다. 이들 필터는 공정 산물 내 인터-알파-트립신 저해제, 면역글로불린 M, 및 피브로넥틴 같은 고분자량의 단백질들에 의해 클로깅(clogging)이나 누출(leakage)이 일어날 수 있으므로 프리-필터(pre-filter)를 사용하거나 여과 단계 전에 분자량 차단치(cut-off)가 200 kDa인 멤브레인(membrane) 필터를 사용하여 이들 단백질들을 제거해야 한다.

이하에서는 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 일부 시험 방법과 조성의 예시일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 바이러스 제거 실험에 사용될 모델 바이러스 선정 및 스톡(stock) 준비

(1) 모델 바이러스 선정

본 발명의 실시예에 사용된 바이러스들은 다음의 자격요건들을 충족시키도록 선정하였다:

① 공정 시작 물질 내에 존재할 수 있는 바이러스의 제거와 감소를 증명할 수 있어야 한다.

② 시작 물질 내에 미지 또는 미확인 오염원들의 존재를 대신할 수 있는 일련의 생물리적 및 구조적 특징들을 갖는 바이러스들의 제거와 감소를 증명할 수 있어야 한다. 물리적 또는 화학적 제제들에 상당한 저항성을 나타내는 바이러스들이 선호된다.

③ 바이러스들은 용이하게 분석이 되어야 하며 높은 역가(titer)를 보유하도록 분리가 가능해야 한다.

④ 바이러스들은 실험자들에게 부당한 위험을 주어서는 안된다.

본 실시예에 사용된 다음 바이러스들은 상기의 요건들을 충족하는 것으로, 정제 과정에서 바이러스의 제거와 감소 용량(capacity)에 관한 정보를 제공할 수 있다.

BVD(Bovine Viral Diarrhea) 바이러스

외피보유(enveloped), 중간 크기(약 40∼60 ㎚), 외가닥 RNA 바이러스로 물리-화학적 불활성화에 평균 정도의 저항성을 나타낸다. BVD는 C형 간염 바이러스와 G형 간염 바이러스들이 속하는 플라비비리다에 과(Flaviviridae family)에 속하므로, C형 간염 바이러스와 G형 간염 바이러스들이 쟁점이 되는 품목에 적절한 모델 바이러스가 된다. 또한, BVD는 플라비바이러스(Flavivirus)와 토가바이러스 (Togavirus) 오염원들이 쟁점이 되는, 예를 들어 소-유래 의약품들의 모델 바이러스로 적절하다(Andrews' Viruses of Verterbrates, pp 230∼245, 1989).

PPV(Porcine Parvovirus)

비-외피보유(non-enveloped), 작은 크기(약 18∼25 ㎚), 외가닥 DNA 바이러스로 물리-화학적 불활성화에 상당한 저항성을 나타낸다. 따라서, 하향 (downstream) 공정의 바이러스 제거와 감소 용량에 대한 엄격한 모델 바이러스로 적합하다. 인간 파르보바이러스 B19(Parvovirus B19)는 인간 혈장에 높은 역가 (titer)로 존재할 수 있으며, 따라서 PPV는 인간 혈장 유래 의약품 검증(validation)에서 B19에 대한 모델 바이러스로 사용될 수 있다. 재조합 및 동물 유래 의약품의 파르보바이러스(예를 들어, Murine minute virus) 오염 발생이 보고되고 있는데, PPV가 이 계열의 바이러스에 대한 모델 바이러스로 사용될 수 있다(Andrews' Viruses of Verterbrates, pp 371∼394, 1989).

(2) 바이러스 스톡(stock) 준비

① BVD

BT(Bovine turbinate) 세포(ATCC CRL-1390)를 FBS(fetal bovine serum)를 포함하는 고농도 포도당 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지에서 생육하였다. 세포 단일층(monolayer)에 BVD의 NADL strain(ATCC VR-534)을 감염시키고 정기적으로 세포 변성 효과를 검사하였다. 세포 변성 효과가 명백하게 관찰되면, 배양 상층액과 세포 잔사(debris)를 회수하여 냉동시키고 해동하였다. 세포 잔사를 원심분리로 제거하고 상층액은 0.45 ㎛ 필터를 통과시킨 후 분주하여 냉동시키거나 -70 ℃ 이하에서 검증(validation) 실험 사용시까지 보관하였다.

② PPV

MPK(Minipig kidney) 세포(ATCC CCL-166)를 FBS(fetal bovine serum)를 포함하는 고농도 포도당 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지에서 생육하였다. 준융합(subconfluent) 세포 단일층(monolayer)에 PPV의 NADL-2 strain(ATCC VR-742)를 감염시키고 정기적으로 세포 변성 효과를 검사하였다. 세포 변성 효과가 명백하게 관찰되면, 배양 상층액과 세포 잔사(debris)를 회수하여 냉동시키고 해동하였다. 세포 잔사를 원심분리로 제거하고 상층액은 0.45 ㎛ 필터를 통과시킨 후분주하여 냉동시키거나 -70 ℃ 이하에서 검증(validation) 실험 사용시까지 보관하였다.

[실시예 2] 바이러스 제거 예비 실험 및 결과

(1) 세포독성 시험

정제 공정 중 산물이 바이러스 역가(titer) 측정시 세포독성(cytotoxicity)을 나타내면 정확한 바이러스 역가 측정이 어려워지므로, 바이러스 역가 측정을 위해 회수되는 정제 공정 중 산물들을 가지고 세포독성 시험을 수행하여, 세포독성 시험에 사용되는 세포주(cell line)에 대한 세포독성 효과를 조절하였다. 샘플들은 바이러스 스파이킹 없는 상태에서 공정을 축소 규모 또는 원래 공정 규모 그대로 수행하는 대조군(control) 정제 과정 중에서 회수하였다. 모든 샘플들은 필요에 따라 pH 6.5∼7.5 범위로 적정하였고 0.45 ㎛ 필터를 통과시켰다. 각 샘플들을 순차 희석(serial diultion)하여 세포독성을 검사하였다. 정제 과정에 대한 바이러스 스파이킹 검증(validation)은 예비 실험에서 결정된 비-세포독성 희석 농도로 바이러스의 역가를 계산하였다.

(2) 간섭 시험

간섭(interference) 시험은 정제 공정 중 샘플 분획이 모델 바이러스를 검출하는 세포주의 능력을 억제하는지 여부를 판단하기 위해 수행되었다. 바이러스는 순차 희석된 샘플들에 최종 농도 10⁰∼10³감염 단위(infection unit) 범위로 스파이킹(spiking)되었다. 각 샘플들은 2 반복(two replicate)으로 분석되었으며, 조직배양 배지에 스파이킹된 바이러스 샘플을 양성 대조군(positive control)으로 하였다.

간섭 시험에서 결정된 비-간섭 희석 농도로부터 바이러스 스파이킹을 통하여 수행되는 바이러스 제거 실험의 샘플들의 역가를 측정하였다.

비-간섭 희석을 바이러스의 세포변성 효과(cytopathic effect, CPE) 측정시에 간섭을 주지 않는 샘플의 첫 번째 희석으로 결정하였다.

다음 표 1은 BVD 모델 바이러스를 이용한 BT 세포주에 대한 세포독성 및 간섭 시험 결과를 나타낸 것이고, 표 2는 PPV 모델 바이러스를 이용한 MPK 세포주에 대한 세포독성 및 간섭 시험 결과를 나타낸 것이다.

샘플	비-세포독성희석배수	비-간섭희석배수	샘플 역가측정의시작 희석 배수
1A	Neat	NT	10^-2.1*
1LH	NT	NT	10^-1.4*
1FT1	Neat	NT	10^-0.3**
1W1	1:7	NT	10^-0.9
1FT2	Neat	Neat	10^-0.3**
1W2	1:15	NT	10^-1.2
2A	Neat	NT	10^-2.1*
2LH	NT	NT	10^-1.4*
2F1	NT	NT	Neat¹
2F2	Neat	Neat	10^-0.3**

NT: Not tested

^*: 높은 수준의 바이러스가 예상되어 비-세포독성 희석 배수보다 높은 시작 희석 배수

¹: 295.3F2의 비-세포독성/비-간섭 희석 배수

^**: neat 희석 배수에서 판독이 어려운 샘플들

샘플	비-세포독성희석배수	비-간섭희석배수	샘플 역가측정의시작 희석 배수
1A	Neat	NT	10^-1.4*
1LH	NT	NT	10^-0.7*
1FT1	1:7	NT	10^-0.9
1W1	1:3	NT	10^-0.6
1FT2	1:7	1:15	10^-1.2
1W2	1:3	NT	10^-0.6
2A	Neat	NT	10^-1.4*
2LH	NT	NT	10^-0.7*
2F1	NT	NT	10^-0.9
2F2	1:3	1:7	10^-0.9

샘플 지정(designation)에 대한 설명

1A: 음이온 교환 크로마토그래피의 첫 단계인 실리카-PEI 단계의 출발 물질을 BVD나 PPV 바이러스로 스파이킹(spiking)한 샘플.

1LH: 출발 물질을 분주(aliquot)해서 조직 배양 배지로 1:9 희석한 로드 홀드(load hold) 샘플.

1FT1: 첫 번째 음이온 교환 크로마토그래피 단계인 실리카-PEI의 플로우-쓰루(flow-through, 통과) 분획.

1W1: 실리카-PEI 단계의 고염 세척(high salt wash) 분획.

1FT2: 두 번째 음이온 교환 크로마토그래피 단계인 셀룰로우즈-QAE의 플로우-쓰로우(flow-through, 통과) 분획.

1W2: 셀룰로우즈-QAE 단계의 고염 세척(high salt wash) 분획.

2A: 20 ㎚ 나노여과 단계의 출발 물질을 조직 배양 배지로 1:9 희석한 샘플.

2LH: 20 ㎚ 나노여과 단계의 출발 물질에 BVD나 PPV 바이러스를 스파이킹한 샘플.

2F1: 바이러스 응괴를 검사하기 위한 대조 필트레이트(control filtrate) 샘플로, BVD의 경우 0.1 ㎛ 필터를 사용하고, PPV의 경우 50 ㎚ 필터를 사용하였다.

2F1: 20 ㎚ 나노필터를 통과한 필트레이트 샘플.

음이온 교환 크로마토그래피 출발물질: PEG-헤모글로빈, SB1 생산 공정 중, 정제 과정을 거치기 전까지 처리된 샘플을 의미함.

DV20 나노여과 출발 물질: 생산 공정 중, 음이온 교환 크로마토그래피 공정까지 거친 샘플을 의미함.

[실시예 3] 바이러스 제거 실험 및 결과

(1) 첫 번째 음이온 교환 크로마토그래피 단계인 실리카-PEI 레진의 칼럼 내 충전과 세척

칼럼에 충전할 실리카-PEI 레진(PEI-1000, Millipore, USA)은 초 순수를 이용하여 팽윤(swelling)과정을 시행하였다. 초 순수 30 ㎖를 포함하는 비이커에 건조되어 있는 레진 14 g을 가하고 유리나 스테인레스 재질의 막대로 부드럽게 저어주어 현탁액을 만든 후 방치하여 레진이 침전되도록 하였다. 레진이 모두 침전되었으면 상층부에 떠있는 불순물을 따라내어 제거하고, 위와 같은 과정을 3 회 반복 시행하였다.

팽윤 과정이 모두 끝난 레진은 기포의 생성을 최소화하기 위해 진공펌프를 이용하여 탈기(degasing) 작업을 진행하였다. 이와 같이 기공 내 기포가 제거되고 팽윤이 끝난 레진은 칼럼에 충전하게 되는데, 이 때 수지의 충전량은 30 ㎖이었다. 칼럼 내에 충전된 레진은 안정화를 위해 펌프를 이용하여 2 ㎖/분의 속도로 초 순수를 수 분간 흘려주었다.

레진이 안정화되어 칼럼 내에 모두 침전하게 되면 레진 세척 과정을 시행하는데, 세척에는 1.5 M NaCl 용액 90 ㎖를 이용하였다. 펌프를 사용하여 1.5 ㎖/분의 속도로 NaCl 용액을 흘려주고 압력은 1 기압(bar)이 넘지 않도록 하였다. 세척 과정은 레진에 결합되어 있을지도 모르는 불순물을 고농도의 NaCl 용액을 이용하여 제거하는 작업이다.

(2) 레진의 디파이로젠(depyrogen)과 평형

세척이 모두 끝난 레진은 정제하고자 하는 단백질의 오염을 미연에 방지하기 위해 디파이로젠(depyrogen) 과정을 실시하였다. 여기에는 0.1 M NaOH 용액 90 ㎖를 이용하며, 펌프를 사용하여 1.5 ㎖/분의 속도로 NaOH 용액을 흘려주고 압력은 1 기압(bar)이 넘지 않도록 하였다.

레진의 평형(equilibration)을 위해 평형 완충액(equilibration buffer, 65 mM NaCl·5 mM 인산염, pH 7.6) 1.5 ℓ를 흘려주어 칼럼의 평형을 유도하였다. 이 때 완충액의 유속은 0.5 ㎖/분을 유지하고, 압력은 1 기압(bar) 이하로 유지하였다. 칼럼의 평형 상태가 이루어진 것은 용출액(eluant)의 pH를 측정하여 알 수 있는데, 레진의 평형 상태 pH는 7.6이다. 이 평형 작업은 레진이 이온 교환에 따른물질의 정제능력을 가질 수 있도록 레진을 활성화시키는 작업이다.

(3) 정제

레진이 평형을 이루었음을 확인한 이후 칼럼의 용출액을 받아 칼럼 내 오염원의 존재 여부를 확인하였다. 이는 LAL(Limulus Amebocyte Lysate) 시험법에 따라 측정된 엔도톡신(endotoxin)의 수준으로 판단하며, 엔도톡신이 0.03 EU/㎖ 이하의 상태이면 디파이로젠된 상태로 간주하였다.

칼럼 내의 오염원이 존재하지 않을 경우 바이러스를 제거하려는 시료 즉, 단백질 의약품 용액을 칼럼의 주입구를 통해 펌프를 사용해서 주입하여 정제 작업을 진행하였다. 이 때의 속도는 0.5 ㎖/분을 넘지 않도록 펌프의 유속을 유지하고, 압력은 1.5 기압(bar)이 넘지 않도록 하였으며, 시료의 총량은 90 ㎖이었다. 이는 제조사가 권장하는 실리카-PEI 레진의 정제 능력을 초과하지 않는 범위에서 정제작업을 진행하기 위한 것이다.

(4) 두 번째 음이온 교환 크로마토그래피 단계인 셀룰로우즈-QAE 레진의 칼럼 내 충전과 세척

셀룰로우즈-QAE 레진(Cellufine Q-500, Millipore, USA)은 20 % 알콜 용액으로 이미 팽윤 처리가 되어있는 제품을 이용하였으며, 30 ㎖을 사용하였다. 분주한 셀룰로우즈-QAE 수지는 위 (1)에 기술된 팽윤 과정 이후의 작업을 동일하게 진행하여 충전과 세척을 진행하였다.

(5) 레진의 디파이로젠과 평형

셀룰로우즈-QAE 레진의 디파이로젠과 평형 작업 역시 위 (2)에 기술된 것과동일한 공정으로 진행하였다. 이 때 사용되는 평형 완충액은 0.9 ℓ를 흘려주어 칼럼의 평형을 유도하였다.

(6) 정제

위 (3)에 기술된 실리카-PEI 칼럼을 통해 정제된 시료를, 위 (4)와 (5)의 단계를 거쳐 준비된 셀룰로우즈-QAE 칼럼의 주입구를 통해 펌프를 사용하여 주입하였다. 이 때의 속도는 0.5 ㎖/분을 넘지 않도록 펌프의 유속을 유지하고, 압력은 1.5 기압(bar)이 넘지 않도록 하였다. 시료의 총량은 90 ㎖로, 이는 제조사가 권장하는 셀룰로우즈-QAE 레진의 정제 능력을 초과하지 않는 범위에서 장제 작업을 진행하기 위한 것이다.

(7) 나노필터의 습윤(wetting)과 홀더(holder)의 준비

20 ㎚ 나노필터(DV-20, Pall, USA)는 초 순수를 이용하여 습윤 상태를 유지시키는데, 이는 건조되어 있는 필터에 적당한 습윤 상태를 확보하도록 하여, 시료의 통과시 필터의 장력을 유지시켜 주고, 또한 필터 기공 내 기포를 제거하여 필터의 능력을 극대화하기 위한 것이다.

페트리디쉬에 초 순수를 10 ㎖ 준비하고, 직경 47 ㎜ 디스크 타입의 필터를 핀셋으로 잡아 초 순수에 넣어 흔들어주었다. 이 과정은 육안으로 관찰하여 필터에서 기포가 모두 제거될 때까지 계속하였다.

필터 홀더는 초 순수로 깨끗이 세척하고 210 ℃에서 2 시간 동안 가열 멸균하여 준비하였다.

(8) 나노여과(nanofiltration)

필터 홀더를 장치하고 습윤 과정이 완료된 나노필터를 홀더에 부착시켰다. 홀더에 연결되어 있는 저장기(reservoir)에, 위 (6)에 기술된 두 번째 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 거쳐 얻어진 시료를 넣고, 질소 가스를 이용하여 압력을 가하였다. 이 때의 압력은 제조사가 권장하는 1.4∼1.8 기압(bar)을 유지하도록 하였다.

(9) 바이러스 제거 실험 결과

다음 표 3은 모델 바이러스 BVD를 이용한 2 단계의 음이온 교환 크로마토그래피 결과를 나타낸 것이다. 여기에서 샘플에 대한 설명은 위 실시예 2에 기술된 내용과 동일하다.

샘플	총 바이러스(TCID₅₀units)	클리어런스(TCID₅₀units)	클리어런스(log₁₀)	감소(TCID₅₀units)	감소(log₁₀)
스파이크	2.2E+09	-	-	-	-
1A	5.2E+09	-	-	-	-
1LH	1.9E+09	-	-	2.7E+00	0.4
1FT1	2.4E+02	9.2E+06	7.0	2.2E+07	7.3
1W1	2.6E+08	8.5E+00	0.9	2.0E+01	1.3
1W2	4.9E+03	4.5E+05	5.7	1.1E+06	6.0
1FT2	9.4E+01	2.3E+07	7.4	5.5E+07	7.7

위 표에서 보듯이 음이온 교환 크로마토그래피에서는 BVD 바이러스의 감소치가 실리카-PEI(1F1) 단계에서 log₁₀7.3이고 셀룰로우즈-QAE (1FT2) 단계에서 log₁₀7.7임을 알 수 있다.

다음 표 4는 모델 바이러스 BVD를 이용한 20 ㎚ 나노여과 단계의 결과를 나타낸 것이다. 여기에서 샘플에 대한 설명은 위 실시예 2에 기술된 내용과 동일하다.

샘플	총 바이러스(TCID₅₀units)	클리어런스(TCID₅₀units)	클리어런스(log₁₀)	감소(TCID₅₀units)	감소(log₁₀)
스파이크	1.4E+09	-	-	-	-
2A	5.2E+08	-	-	-	-
2LH	3.0E+08	-	-	1.7E+00	0.2
2F1	5.0E+02	2.8E+06	6.4	1.0E+06	6.0
2F2	2.7E+01	5.2E+07	7.7	1.9E+07	7.3

위 표에서 보듯이 20 ㎚ 나노여과(3F2) 단계에서 BVD 바이러스의 감소치는 log₁₀7.3임을 알 수 있다.

다음 표 5는 모델 바이러스 PPV를 이용한 2 단계의 음이온 교환 크로마토그래피 결과를 나타낸 것이다. 여기에서 샘플에 대한 설명은 위 실시예 2에 기술된 내용과 동일하다.

샘플	총 바이러스(TCID₅₀units)	클리어런스(TCID₅₀units)	클리어런스(log₁₀)	감소(TCID₅₀units)	감소(log₁₀)
스파이크	4.8E+07	-	-	-	-
1A	3.4E+07	-	-	-	-
1LH	1.5E+07	-	-	2.3E+00	0.4
1FT1	2.0E+03	2.4E+04	4.4	1.7E+04	4.2
1W1	1.4E+07	3.4E+00	0.5	2.4E+00	0.4
1W2	3.4E+02	1.4E+05	5.1	1.0E+05	5.0
1FT2	1.6E+02	3.0E+05	5.5	2.1E+05	5.3

위 표에서 보듯이, 음이온 교환 크로마토그래피에서는 PPV 바이러스의 감소치가 실리카-PEI(1F1) 단계에서 log₁₀4.2이고 셀룰로우즈-QAE (1FT2) 단계에서 log₁₀5.3임을 알 수 있다.

다음 표 6은 모델 바이러스 PPV를 이용한 20 ㎚ 나노여과 단계의 결과를 나타낸 것이다. 여기에서 샘플에 대한 설명은 위 실시예 2에 기술된 내용과 동일하다.

샘플	총 바이러스(TCID₅₀units)	클리어런스(TCID₅₀units)	클리어런스(log₁₀)	감소(TCID₅₀units)	감소(log₁₀)
스파이크	3.3E+06	-	-	-	-
2A	6.3E+06	-	-	-	-
2LH	1.2E+07	-	-	5.3E-01	-0.3
2F1	6.1E+06	5.4E-01	-0.3	1.0E+00	0.0
2F2	7.2E+03	4.6E+02	2.7	8.8E+02	2.9

위 표에서 보듯이 20 ㎚ 나노여과(3F2) 단계에서 PPV 바이러스의 감소치는 log₁₀2.9임을 알 수 있다.

위 결과에서 보듯이, 본 발명에 따라 2 단계의 음이온 교환 크로마토그래피 공정 및 나노여과 공정을 통한 바이러스 제거 방법에 의하면, 음이온 교환 크로마토그래피 각 단계에서, 그리고 나노여과 단계에서 각각 log₁₀5 이상씩의 바이러스 감소 계수(reduction factor)를 얻게 되고, 따라서 단백질 의약품 정제 공정의 전체 단계에서 총 log₁₀15∼20 이상의 바이러스 감소 계수를 얻을 수 있다.

이상에서 살펴 본 바와 같이, 본 발명의 2 단계의 음이온 교환 크로마토그래피 공정 및 나노여과 공정에 의한 바이러스 제거 방법에 의하면, 전체 단백질 의약품 정제 공정 중 log₁₀15∼20 이상의 바이러스 감소 계수를 얻을 수 있어 효율적이고 재현성이 있으며, 단백질의 활성에 영향을 주지 않으면서 단백질 의약품을 정제할 수 있어 바람직하다.

Claims

실리카-폴리에틸렌이민(polyethyleneimine; PEI) 음이온 교환 레진과 셀룰로우즈-4급아민트리메틸아미노에틸 그룹[quaternary amine(trimethyl-aminoethyl); QAE] 음이온 교환 레진에 의한 2 단계의 음이온 교환 크로마토그래피(anion exchange chromatography) 공정; 및

기공 크기가 15∼20 ㎚인 멤브레인 필터에 의한 나노여과(nanofiltration) 공정을 통해 바이러스를 제거하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 단백질 의약품 정제 방법.
제 1 항에 있어서, 실리카-PEI 음이온 교환 레진은 PEI이 교차결합된 실리카 재질의 레진 비드(bead)로서, 평균 입자 크기가 50 ㎛이고 입자의 기공(pore) 크기는 500∼1000 Å인 것이고, 셀룰로우즈-QAE 음이온 교환 레진은 교차결합된 셀룰로즈 레진 비드로서 QAE이 결합된 것으로, 입자 크기가 50∼120 ㎛인 것을 특징으로 하는 단백질 의약품 정제 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단백질 의약품은 재조합 생리활성 단백질 의약품과 천연 단백질 의약품을 특징으로 하는 단백질 의약품 정제 방법.