SK287633B6 - Spôsob výroby humánneho gamaglobulínu G a humánny gamaglobulín G s inaktivovanými vírusmi - Google Patents

Abstract

gama-Globulín sa extrahuje z frakcie izolovanej frakčným delením etanolom v prítomnosti uhľovodíka. Po znížení znečisťujúcich sprievodných látok prostredníctvom PEG sa použije kolóna s aniónovou ionexovou živicou a v odtoku z kolóny sa obsah PEG aj objem roztoku zníži ultrafiltráciou na vhodne volené nasledujúce spracovanie. Roztok sa prevedie do kyslého pH a nasleduje aspoň jeden z nasledujúcich postupov na inaktiváciu vírusov, a to pasterizácia a spracovanie rozpúšťadlom/detergentom. Následne sa výrobok vyzráža a premyje s PEG na odstránenie chemických látok po vírusovej inaktivácii, potom sa po rozpustení a zmenenom pH odstránia znečisťujúce proteíny a konečné čistenie sa urobí ultrafiltráciou vedúcou k zmenšeniu objemu roztoku a k zníženiu obsahu PEG. Konečne nasleduje vhodná filtrácia vírusov a následne koncentrácia proteínu na jeho obsah v roztoku na potrebných 5 % alebo 10 %.

Description

Predložený vynález sa vzťahuje na spôsob výroby humánneho γ-globulínu G s inaktivovanými vírusmi. Východiskový materiál na prípravu γ-globulínu (humánneho imunoglobulínu G alebo IgG) podľa predloženého vynálezu pochádza od skupiny darcov (väčšej ako 1 000) ľudskej plazmy, ktorá tvorí polyvalentnú zmes aktívnych protilátok, ktorých individuálne jednotky boli preskúšané na neprítomnosť typických infekčných znakov (HIV, vírus hepatitídy B, C).

Doterajší stav techniky

Podávanie γ-globulínu môže byť uskutočňované intramuskuláme alebo účinnejšie intravenózne. Tento druhý spôsob podávania má veľké terapeutické výhody v porovnaní s prvým postupom, predovšetkým vo väčšej účinnosti, ale môže zároveň vyvolať vážne vedľajšie účinky. Na intravenózne podávanie sú potom vhodné iba výrobky získané v podmienkach nepripúšťajúcich denaturáciu a so zodpovedajúcim stupňom čistoty.

Uprednostňované a najúčinnejšie klinické použitie výrobkov podľa toho vynálezu je intravenózne podávanie výrobku, ktorého terapeutické indikácie sú určené pre taký druh výrobku (IgG), ktorý má potrebné charakteristické zloženie a molekulárnu štruktúru. Najbežnejšie terapeutické indikácie IgG podľa vynálezu je možné rozdeliť do troch základných patologických skupín: prvá skupina sa vyznačuje nedostačujúcou imunitou (nedostatočná humánna reakcia); druhá skupina získanou imunitnou nedostatočnosťou (napr. následkom vírusovej infekcie) a konečne tretia skupina nedostatkom imunity vlastného pôvodu (nedostatočné vytváranie vlastných telových protilátok).

Pokiaľ sa týka prvej uvedenej skupiny, IgG podľa toho vynálezu je potenciálne vhodný na použitie v boji proti bežným a premenným nedostatkom v imunite, proti nedostatku podtried IgG, proti neprítomnosti IgG a iných. Najbežnejšie druhy chorôb patriace do druhej skupiny sú vyvolané infekciou vírusov a baktériami (HIV alebo humánny imunodeficientný vírus, cytomegalovírus, vírus pásového oparu, vírus hepatitídy B a pod.) novorodenecká sepsa a pod. Identifikovateľné indikácie choroby zahŕňajúce nedostatočnú autoimunnú zložku IgG sa neustále rozširujú, významná medzi nimi je idiopatická trombocytopenická purpura (ITP), prispievajúca k deštrukcii krvných doštičiek, Kawasakiho syndróm a pod.

Prvé poznatky týkajúce sa prípravy a infúzií γ-globulínu sa objavujú ku koncu štyridsiatych rokov a opisujú známe spôsoby frakčného delenia plazmy Cohnovho postupu (Cohn E. J., Strong L. E. a kol.: Separation into Fractions of the Protein and Lipoprotein Components, J. Am. Chem. Soc. 68, 68, 459 - 475, 1946) alebo neskoršia modifikácia zavedená Kistlerom-Nitschmannom (Kistler P. a Nitschmann Hs., Large Scale Production of Human Plasma Fractions, Vox Sang. 7, 414 - 424, 1962). Dodatočné čistenie zavedené Oncleyom (Oncley J. L. a kol., J. Am. Chem. Soc. 71, 541 - 550, 1949) vychádza z materiálu medziproduktu získaného fiakčným delením plazmy podľa Cohna a dalo vznik známemu spôsobu Cohn-Oncleya, ktorý stále používa na všeobecné čistenie γ-globulínu etanol za chladu ako koncentračné médium, rovnako ako predchádzajúce spôsoby. γ-Globulín vyrobený podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúceho spôsobu vykazuje molekulárne rozdelenie s významným obsahom polymerizovanej alebo agregovanej formy, ktorá má vysokú molekulárnu hmotnosť, ako je určovaná pri analýze postupom vysoko rozlišujúceho gélu použitím kolóny (HPLC). Pôvodné kvapalné výrobky získané týmto spôsobom majú malú stabilitu, je pozorovaná opaliscencia alebo zákal počas skladovania, rozkladania alebo polymerizácie γ-globulínových molekúl a snaha po znížení aktivity niektorých viacej nestálych protilátok, spontánny vznik antikomplementámej aktivity a pod.

Problém týkajúci sa terapeutického použitia γ-globulínu intravenóznou infúziou ustupuje do pozadia v prvých preparátoch získaných podľa Cohn-Oncleyovho spôsobu, vrátane mnohých variantov, ktoré boli príčinou mnohých odmietavých reakcií (precitlivenosti k niektorým bielkovinám) s veľmi vysokým stupňom výskytu obzvlášť u pacientov s nedostatočnou prítomnosťou γ-globulínu v krvi a ktorý γ-globulín získali (až do 90 % prípadov). Opísané reakcie sú spojené so zníženou vybavenosťou pacientov komplementom pri liečení týmto spôsobom (Barandun S., a kol., Vox Sang., 7, 157 - 174, 1962).

Bolo pozorované, že γ-globulín pripravený alkoholickým fiakčným delením, má význačnú schopnosť spontánne viazať komplement, ako výsledok denaturácie proteínu počas spôsobu výroby a obzvlášť pri vzniku γ-globulínových agregátov, ktoré sú príčinou vzniku foriem s vysokou molekulárnou hmotnosťou. Tieto môžu pôsobiť ako komplexné protilátky-antigény so schopnosťou voľne zachytiť komplement.

Oddelenie γ-globulínových agregátov obvyklými technikami, buď ultracentrifúgou, alebo vylučovacou chromatografiou (permeáciou gélu), umožní získať výrobok s malou antikomplementámou aktivitou, tolerovateľnou pri intravenóznom podávaní (Barandun a kol., pozri skôr). V každom prípade však nie je možné techniku ultracentrifúgou alebo permeáciou v géli využiť vo veľkom meradle a priemyselne na spracovanie γ-globulínu v množstve niekoľkých kilogramov (a ani v meradle hmotnosti v gramoch v prípade použitia ultracentrifúgy).

Na druhej strane pri príprave γ-globulínu s použitím alkoholického trakčného delenia, keď boli odstránené agregované zložky s vysokou molekulárnou hmotnosťou, sa môže ľahko obnoviť antikomplementáma aktivita pri konečnom postupe spracovania (pri sterilizácii, lyofilizácii) alebo počas skladovania (v kvapalnej forme).

Na zamedzenie tieňových stránok klasického spôsobu výroby Cohn-Oncleyovou metódou precipitácie s etanolom (alebo variant týchto spôsobov), je v doterajšom stave využívaná substitúcia, alebo sa doplňujú ďalšie prídavné kroky, aby sa zväčšila stabilita a tolerancia na jeho intravenózne použitie.

Polson a kol., (Polson A. a kol., Biochim. Biophys. Acta 82, 463 - 475, 1964) opisuje spôsob frakčného delenia humánnej plazmy prostredníctvom etylénglykolových polymérov a týmto spôsobom je možné oddeliť čistú frakciu γ-globulínu. Coval L. (patenty US 4 093 606 a 4 165 370, s prioritou 1976 a 1978) navrhujú polyetylénglykol (PEG) ako čistiace činidlo pri výrobe intravenózneho γ-globulínu a vychádzajú z materiálu oddeleného Cohnovým trakčným delením (frakcie II alebo II + III). Následne boli zverejnené spôsoby čistenia využívajúce polyetylénglykol, ako ich opisuje Uemura a Y. a kol., (španielsky patent č. 506 679, využiteľný od 1981) alebo podobný, iba s tým rozdielom, že je výhodná pasterizácia materiálu obsahujúceho γ-globulín pred alebo po čistení polyetylénglykolom, uvádzaný taktiež Uemurom Y a kol. (patent EP 0 246 579, 1986). Uvádzané sú taktiež chemické spôsoby inaktivácie vírusov organickými rozpúšťadlami alebo detergentmi, ktoré sú veľmi účinné proti vírusom s lipidickým povlakom a ktoré boli využité pre proteíny odvodené z humánnej plazmy podľa Neuratha a kol. (patent US 514 375).

Opisujú sa aj ďalšie spôsoby výroby γ-globulínu prijateľného na intravenózne podávanie, ktoré využívajú úpravu s enzýmami, pepsínom (španielsky patent č. 86 115 016 a francúzsky patent 2 382 M), plazmínom (nemecký patent DE 2 752 694), imobilizujúcim trypsínom (španielsky patent P 0 530 592) alebo ošetrenie v moderujúcom kyslom pH (Acta Chemica Scandinavica 22, 490 - 496, Barandum S. a kol. pozri skôr).

Iné spôsoby výroby γ-globulínu, ktoré je možné tolerovať pri intravenóznom podávaní, sú založené na chemickej a čiastočne modifikujúcej úprave molekúl IgG počas ich úpravy redukujúcimi činidlami (Wiedeman a kol., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 113, 609 - 613, 1963), spracovaní alkoholizáciou (španielsky patent č. 412 552), alkyláciou (španielsky patent č. 0 533 908) a sulfonáciou (Yamaka T. a kol., Vox Sang. 37, 14 - 20, 1979).

Ďalej sa opisujú spôsoby výroby využívajúce výmennú chromatografiu, eliminujúcu nežiaduce znečisteniny z východiskového materiálu použiteľného na získavanie γ-globulínu (patent US 3 869 436, španielsky patent č. 518 181, EP 91 300 790 a WO 94/29 334). Samo M. E. a kol. (patent EP 0 440 483) opisuje kombináciu techník vhodných na uľahčenie výroby intravenózne prijateľného výrobku, založených na iónovej výmennej chromatografii a diafiltrácii v slabo kyslom pH.

Konečná formulácia výroby je obzvlášť dôležitá pre zodpovedajúcu stabilizáciu výrobku. Bol zverejnený lyofilný spôsob výroby, zo začiatku v odbore prijateľný, pokiaľ vykazoval minimálne zmeny počas skladovania. Zloženie lyofilného výrobku prijateľného na intravenózne podávanie a opisovaného v literatúre, vykazuje odolnosť proti denaturácii γ-globulínu, predovšetkým pri lyofilnom spracovaní (španielsky patent č. 525 246) a využíva na tento účel uhľovodíky, polyol, glykol alebo ich deriváty, aminokyseliny a taktiež prítomnosť sérového albumínu.

Nedávno boli opísané stabilné kvapalné formulácie využívajúce uhľovodíky vo vodnom prostredí, pri veľmi malej iónovej sile a pri pH 4,25 (patent US 4 396 608) alebo v slabo kyslom pH 5 až 6 (patent EP 0 278 422).

Z toho dôvodu podľa opisovanej situácie v odbore, γ-globulín, ktorý je t. č. na trhu, patrí do jednej z troch nasledujúcich skupín, ktoré sa v zásade líšia svojím spôsobom výroby:

- prvá generácia, vyrobená enzymatickými spôsobmi (pepsín, trypsín, plazmín a pod.),

- druhá generácia, chemicky modifikovaná (redukcia, sulfonácia, alkylácia, úprava s p-propiolaktónom a pod.),

- tretia generácia, zodpovedajúca nedotknutej molekule IgG (diafiltrácia pri nízkom pH, chromatografia, precipitácia s polyetylénglykolom, príprava pri kyslom pH a pri nízkej iónovej sile).

Intravenózne podávanie bežných vyrábaných preparátov nevyvoláva vážne intolerantné reakcie, hoci každý z nich má určité terapeutické slabé stránky, charakterizované ťažkosťami alebo kontraindikáciami. Tak enzymaticky spracovaný výrobok má kratší stredný polčas životnosti in vitro (asi 8 dní), zatiaľ čo normálny γ-globulín G (20 až 25 dní) má nulovú opsonizačnú schopnosť (neprítomnosť Fc fragmentov) a môže mať fragmentáciu a veľmi obmedzené množstvo podtried IgG 3 a IgG 4.

γ-Globulíny vyrobené chemickými modifikáciami majú stredný polovičný čas životnosti in vitro (10 až 15 dní), kratší ako fyziologický, zachovávajú opsonizačnú kapacitu a molekulárnu integritu, ale v závislosti od úpravy trpia zníženou bakteriolytickou kapacitou a vytvárajú nové antigénové determinanty (pri spracovaní s β-propiolaktónom).

Celkom nedávno bol pripravený neporušený γ-globulín spôsobom zamedzujúcim denaturáciu molekúl IgG. V niektorých prípadoch novovyvinuté výrobné spôsoby môžu byť prípadne prepojené s frakčným dele3 ním etanolom, takže je napr. možné ako východiskový materiál použiť jednu z frakcií bohatých na γ-globulín, získanú podľa Cohna, Cohn-Oncleya alebo Kistler-Nischmanna.

Na základe dnes opisovaných spôsobov je pre výrobu neporušeného IgG ľahostajné, či je vyrobený moderovanou úpravou v kyslom pH, diafiltráciou v kyslom pH, stabilizáciou molekúl IgG pri nízkej iónovej sile a pH 4,25. Týmito spôsobmi je možné voliteľne redukovať množstvo agregovaných foriem IgG (s vysokou molekulárnou hmotnosťou polymérov a intermediámych oligomérov, až do vrátane dimérov) a zväčšiť podiel monomémeho IgG. Konečná kvapalná formulácia pri pH 4,25 zamedzuje reagregáciu molekúl IgG počas skladovania, ktorý zostáva v roztoku stabilný (ale pri skladovacej teplote 2 °C až 8 °C) s dostatočne nízkou hladinou antikomplementámej aktivity.

Hlavným problémom pri kvapalinovom spôsobe výroby výhradne v kyslom prostredí je reverzibilný inhibičný účinok na antikomplementámu aktivitu, ktorý je vyvolaný redukciou v prostredí s kyslým pH, t. j. uvedená aktivita sa obnoví a znova ustáli pri podmienkach pH v danom médiu pri alebo v blízkosti fyziologických hodnôt. Na druhej strane neškodnosť intravenóznej infúzie veľkých objemov γ-globulínových preparátov vyrobených v takomto kyslom pH (pH 4,25) je skutočne sporná (u novorodencov a pacientov s ľadvinovými ťažkosťami).

Pri inom spôsobe čistenia sa používa katiónová a/alebo aniónová iónovýmenná živica, ktorá sa využíva pri úprave stredných frakcií získaných Cohnovým alebo Cohn-Oncleyovým etanolovým trakčným delením (frakcia II + III alebo výhodnejšie frakcia II). Takto čistený γ-globulín môže byť kombinovaný s jedným zo skôr uvedených kyslých postupov (stredný alebo podľa vhodného predpisu) alebo iným ekvivalentným spôsobom vhodným pre kvapalné spracovanie, inak sa udrží stabilita v lyofilnej forme.

Podľa skoršieho spôsobu používané iónovýmenné živice predstavujú ligand silne aniónového typu (kvartemámy etylamónium; QAE) a slabo aniónového typu (dietylaminoetyl; DEAE) alebo silne katiónového typu (sulfopropyl; SP) a slabo katiónového typu (karboxymety); CM). Ligandy sú kovalentne imobilizované na nerozpustnom nosiči alebo matriciach, ktoré zložením môžu byť: kremičitan (keramika), akrylát (polyakrylamidy, polystyrén), uhľovodík (celulóza, dextrán, agaróza). V podstate meniče na báze dextránu (Sephadex od Amersham-Pharmacia) alebo na báze agarózy (Sepharose, Amersham-Pharmacia) sú najvýkonnejšie a taktiež najpoužívanejšie. Majú však aj svoje nedostatky neodstránené predchádzajúcimi spôsobmi, predovšetkým z toho dôvodu, že je potrebné veľké množstvo živice na účinné oddelenie kontaminujúcich proteínov a ich zachytenie s ohľadom na zachovanie γ-globulínu a správneho delenia podtried, predovšetkým IgG 4. Kompromisná situácia vytvorená medzi čistením (elimináciou kontaminujúcich proteínov: IgA, IgM a iných) a zachovania IgG (IgG 4) závisí v tomto prípade od priaznivých vlastností jednej alebo druhej strany a preto sa taktiež značne vzájomne líšia rôzne druhy podávaného γ-globulínu v účinnosti a v terapeutickej kvalite.

Frakčným delením plazmy prostredníctvom PEG alebo precipitáciou s PEG pri použití strednej frakcie po frakčnom delení podľa Cohna alebo jej ekvivalentu, ako sú frakcie II + III, je možné získať lyofilizovaný γ-globulín, ktorý je možné podávať intravenózne, ktorý však nie je dostatočne stabilný v kvapalnom stave. Pokiaľ sa do prípravy zahrnie pasterizačný postup (pred precipitáciou s PEG), dôjde k významnému molekulárnemu zhlukovaniu a to aj v prítomnosti stabilizátorov (akým je napríklad sorbitol), zrejme ako dôsledok prítomnosti nestabilných proteínov. Pretože však väčšie zhluky musia byť celkom eliminované počas nasledujúceho postupového kroku, predstavuje to významné zníženie výťažnosti požadovaného výrobku. Pokiaľ sa však ako východiskový materiál použije významnejšie prečistená frakcia (frakcia II alebo ekvivalentná), obsahujúca agregáty s vysokou molekulárnou hmotnosťou, alebo agregáty vzniknuté počas pasterizácie, nie je v podstate možné ich oddeliť prostredníctvom PEG za stanovených bežných a opisovaných technických podmienok. To značí koncentráciu PEG v množstve 4 až 5 % pri pH 4 až 6 (Coval L. a kol. pozri skôr) a 4 až 10 % PEG pri pH 4,8 až 6,5 (Uemura Y. a kol., pozri skôr), čo je platné výhradne vtedy, pokiaľ γ-globulín je v prítomnosti iných sprevádzajúcich proteínov (prítomných napr. vo frakcii II + III), vhodných na koprecipitáciu spoločne s agregátmi s vysokou molekulárnou hmotnosťou.

Spôsob podľa predloženého vynálezu podstatne zlepšuje bežný spôsob v danom odbore, pretože prostredníctvom kombinácie výrobných krokov, uskutočňovaných za presne stanovených podmienok opisovaných v predloženom vynáleze, je výsledný výrobok γ-globulínu skutočne zbavený stanoviteľných znečisťujúcich proteínov, aj s použitím najcitlivejšej analytickej techniky, bez kompromisov v ohľade na molekulárnu celistvosť alebo vznik a rozdelenie podtried IgG a tým je taktiež rovnako zachovaná malá schopnosť spontánneho zachytenia komplementu.

Podstata vynálezu

Maximálna požiadavka pracovného spôsobu v opisovanom predloženom vynáleze je zaistenie bezpečnosti výrobku s ohľadom na potenciálne riziko prenosu vírusov. Preto do výroby boli zavedené spôsoby pasterizácie v prítomnosti cukrového alkoholu (napr. sorbitolu) a/alebo rozpúšťadla-detergentu s tri-n-butylfosfátom (TnBP) a polysorbátom-80 (Tween-80) alebo ekvivalentných látok, ktoré vytvárajú základný výrobný krok na kontrolu vírusovej inaktivity, a ktoré sú preto vysoko účinné a vzájomne sa doplňujúce. K týmto výrobným krokom bol pridaný viricidný spôsob vhodného predchádzajúceho spracovania v kyslom prostredí, ktorý eliminuje alebo zmenšuje množstvo prítomných vírusov, než sa pristúpi ku konečnému základnému inaktivačnému postupu. Je taktiež možné pre roztok využiť nanofiltráciu na zadržanie vírusov počas kyslého pracovného postupu alebo vhodne diafiltráciu základu pred konečnou koncentráciou a formuláciou.

Kombinácia predchádzajúcich spôsobov eliminácie vírusov zaisťuje výrobok s maximálnou vírusovou bezpečnosťou a presahuje predchádzajúce spôsoby výroby s jednoduchou individuálnou inaktiváciou vírusov. Opisovaný spôsob výroby je oproti doterajšiemu priemyselnému stavu dokonalejší a výrobné kroky (výhodné do štyroch) podľa predloženého vynálezu môžu byť uskutočňované súsledne a v jednoduchom inaktivovanom priestore alebo s rovnakým stupňom bezpečnosti.

Teraz bolo s prekvapením zistené, že pri použití stredného trakčného materiálu po Cohnovom alkoholickom frakčnom delení (vhodne frakcie II + III), je výhodné extrahovať v podstate celý γ-globulín v prítomnosti uhľovodíka (výhodne cukrového alkoholu), pri nastavení vhodných extrakčných podmienok pre IgG, ako je objem riedenia, pH a iónovú silu a oddeliť väčší podiel doprevádzajúcich proteínov precipitáciou PEG. Výsledný prechádzajúci roztok (filtrát) je kvapalina zbavená častíc a koloidov, má výhodný vysoký následný adsorpčný koeficient na iónomeničovej kolóne a vychádzajúci roztok je v podstate zbavený všetkých nežiaducich kontaminujúcich látok (IgA, AgM, proteolytických enzýmov a pod.) bez toho, aby sa vytváral akýmkoľvek kompromis medzi IgG alebo rozdelením podtried.

Ešte prekvapivejšie je zistenie, že vo vysoko čistom odtoku z kolóny a za špecifických podmienok podľa vynálezu bolo možné veľmi výhodne znížiť obsah zostatkového PEG a prítomného etanolu pri ultrafíltrácii a koncentrovať protein podľa potreby. Následne sú povolené všetky postupy pre vírusovú inaktiváciu (výhodné ošetrenie za kyslého pH, pasterizácia, rozpúšťadlo/detergent) v spoločnom slede a bez vzniku význačného znečistenia (dokazujúc neprítomnosť vzniku častíc alebo koloidov), ani vznik agregátov (jedine 1 % až 2 % rozpustných polymérov s vysokou molekulárnou hmotnosťou). Znížený obsah polymérov je prijateľný v prítomnosti uhľovodíka (medzi iným zložkami), ktorý stabilizuje roztok počas všetkých výrobných krokov predchádzajúcich pasterizácií.

Ďalej bolo s prekvapením zistené, že odlišný spôsob od skôr opisovaných postupov pre elimináciu alebo zníženie obsahu reagencií pre vírusovú inaktiváciu pridaním pracovného kroku využívajúceho rozpúšťadlo/detergent, doplnený k predchádzajúcemu výrobnému kroku a založenom na vyzrážaní γ-globulínu s použitím PEG a zachovaní zriedenia chemických činidiel v roztoku pri nízkej teplote, napomáha k zníženiu obsahu myciel. Potom, pri zachytení precipitátu pri mikrofiltrácii s tangenciálnym tokom a okamžitým následným premytím zachyteného materiálu je možné uvedené činidlá celkom odstrániť. Precipitát bol rozpustený priamo v rovnakom zariadení pre mikrofíltráciu privedením do styku s vhodným roztokom a bez potreby ďalšej fyzikálnej manipulácie.

Roztok získaný uvedeným spôsobom v dôsledku obsahu iba 1 až 2 % polymérov nebol považovaný za prijateľný na intravenózne podávanie. Bolo však taktiež s prekvapením zistené, že vhodným spôsobom zriedenia predchádzajúceho rozpusteného precipitátu je možné dosiahnuť špecifickú koncentráciu PEG a uhľovodíkov (skôr pridaných) a že v roztoku obsiahnuté agregáty s vyššou molekulárnou hmotnosťou sú nerozpustné v špecifickom rozsahu pH a sú celkom odstránené od veľkej väčšiny monomérov a dimérov v roztoku. Bolo zistené, že koncentrácia uhľovodíkov (prednostne cukrového alkoholu) a taktiež koncentrácia PEG sú rozhodujúce na zamedzenie koprecipitácie monomérov/dimérov IgG a na udržanie maxima IgG v roztoku. Vytvorený precipitát je možné ľahko oddeliť tangenciálnou mikrofiltráciou alebo obvyklou filtráciou. Konečne výsledný filtrát, zbavený agregátov, diafiltrovaný alebo ultrafiltrovaný za aktuálnych podmienok, ktoré tvoria súčasť predloženého vynálezu, predstavuje výrobok, ktorý je možné úspešne filtrovať membránami zadržujúcimi vírusy a konečne koncentrovať (na roztok s 5 % až 10 % γ-globulínu) za neprítomnosti alebo iba s veľmi malým obsahom chemických činidiel, ktoré boli použité počas výrobného procesu.

Spôsob podľa predloženého vynálezu prevyšuje súčasný stav v odbore odstránením obvyklých nedostatkov γ-globulínu, ktorý sa v súčasnosti nachádza v obchode. Takto vytvorený γ-globulín (s 10 % koncentráciou IgG) v podstate neobsahuje (alebo nemôže byť dokázané): agregované polyméry s vysokou molekulárnou hmotnosťou (monoméry + diméry > 99 % a výhodne > 99,9 %); rôzne znečisťujúce proteíny v γ-globulíne; IgA (< 0,003 mg/ml); IgM (< 0,002 mg/ml); PKA (< 2,77 IU/ml) a kalikreín; plazmín a plazminogén; albumín; tri-n-butylfosfát (<3,6 pp); polysorbát 80 (< 50 ppm); PEG-4 000 (< 500 ppm). Má vysoký obsah viacerých labilných podtried IgG 3 a IgG 4 a dostatočnú molekulárnu čistotu (fragment Fc > 100 %) s nízkou kapacitou pre spontánnu aktiváciu (ACA < 1 CH 50/mg proteínu). Kvapalná formulácia so sorbitolom je stabilná najmenej 2 roky, tak pri 2 °C až 8 °C, ako do 25 °C. Spoločne s výbornou charakteristikou výrobku je zaistená maximálna bezpečnosť v ohľade na riziko prenosu vírusov plazmovými derivátmi, spočívajúca v potenciálnej inaktivačnej kapacite uskutočnenej s použitím rozpúšťadla, detergentu, pasterizácie, výhodnej inkubácie v kyslom prostredí a výhodným odfiltrovaním vírusov (nanofiltrácia) a ďalej taktiež výrobnými krokmi, ktoré prispievajú k zníženiu vírusovej záťaže (precipitácia s etanolom, precipitácia s PEG, adsorpcia nabitými iónmi a pod.). Na druhej strane je treba taktiež poukázať na to, že celý výrobný postup môže byť uskutočnený v čase kratšom ako 5 dní pri využití vhodnej inštalácie a konečný výťažok IgG presahuje 4,5 g z jedného litra východiskovej plazmy.

Spôsob podľa predloženého vynálezu je detailne vyložený v nasledujúcom texte.

Pri uskutočňovaní opisovaného spôsobu sa vychádza z precipitátu bohatého na IgG, ktorý sa získa etanolovým trakčným delením humánnej plazmy, prednostne z frakcie II + III podľa Cohnovho postupu. Každý kilogram uvedeného precipitátu sa suspenduje vo vodnom roztoku, výhodne v množstve 5 kg až 25 kg roztoku, ktorý obsahuje uhľovodíky, prednostne cukrový alkohol, najvýhodnejšie sorbitol v množstve od 2 % až 10 hmotn./obj. %. Ako pufor sa výhodne použijú fosfátové alebo acetátové ióny takej koncentrácie, aby pH vodnej suspenzie frakcií II + III bolo medzi 4,8 a 5,8 a vodivosť nepresiahla 2 mS/cm. Po minimálnom čase miešania, ktorý je vhodne dlhší ako 1 h, sa väčšina extrahovaných globulínov sprevádzajúcich IgG vyzráža s PEG s nominálnou molekulovou hmotnosťou 4 000, v koncentračnom rozsahu od 2,5 % do 5,5 hmotn. % pri vhodnej teplote od 2 °C do 8 °C. Následne sa okamžite a pred pokračovaním postupu precipitácie, vhodne pridá adsorbent lipidov a lipoproteínov, ako sú napr. bentonity a súčasne vhodná prísada uľahčujúca filtráciu, ako napr. Hyflo-supercel alebo celit (obidve predávané J. Manvillom) alebo ekvivalentná látka, aby sa uľahčila filtrovateľnosť suspenzie. Vytvorený precipitát sa vhodne zadrží tlakovou filtráciou s použitím jemného celulózového filtračného listu alebo filtračnej patróny (stupeň 50 SA, Cuna Brand alebo KS-80, alebo K-200, výrobok Seitz alebo ekvivalentmi), aby mal získaný filtrát menšie zakalenie ako 5 NTU (nefelometrických turbidimetrických jednotiek). Výhodne je precipitát oddeliť kombinovane odstredením a filtráciou. Pokiaľ sa precipitát získa filtráciou, premyje sa vhodným roztokom upraveným na takúto koncentráciu PEG, fosfátových a acetátových iónov a pH ekvivalentné podmienkam nastaveným pri precipitácii, čím sa uľahčí vyššia výťažnosť IgG.

pH získaného filtrátu sa upraví na hodnotu medzi 5,7 a 6,3, vhodne prísadou zriedeného roztoku hydroxidu sodného a umiestni sa na vyčírenie do iónomeničovej kolóny.

Iónomeničová kolóna obsahuje živicu s aniónovým ligandom, výhodne dietylaminoetylového typu (DEAE), ktorým je napojená nerozpustná matrica z agarózy alebo vhodnej DEAE-agarózy, ktorá je obchodne známa ako Sepharose, predovšetkým takého druhu, ktorý má vysokú dynamickú kapacitu (FF alebo rýchly tok). Výhodná je kolóna s radiálnym distribučným tokom, vhodne s dĺžkou (alebo výškou lôžka) medzi 8 až 15 cm. Prietoková rýchlosť filtrátu v kolóne s vhodnou živicou sa vhodne nastaví na takú hodnotu, aby kolónou prešiel za hodinu asi štvornásobný objem kolóny so živicou a dávkuje sa do vyčerpania roztoku, t. j. až vnesené množstvo úmerné počiatočnému východiskovému materiálu (vhodne frakcie II + III), je vhodné medzi 1 g až 2,5 g na 1 ml živice. Keď je dávkovanie roztoku skončené, kolóna sa výhodne premyje 2,5 až 4,5-násobným množstvom objemu kolóny roztokom s rovnakou iónovou silou a rovnakým pH, akú má dávkovaný roztok.

Kvapalný odtok z kolóny počas dávkovania do kolóny a premývanie alebo vychádzajúce z kolóny (neadsorbovaná frakcia) sa ultrafiltruje s cieľom znížiť koncentráciu PEG a získať vhodnú koncentráciu proteínu na vykonanie následných výrobných krokov vírusovej inaktivácie. Výhodná ultrafiltračná membrána má 100 kDa nominálnu molekulárnu hranu a je výhodne tvorená polysulfónom (alebo jeho derivátmi), obchodnej značky Millipore alebo Pall-Filtron. pH roztoku sa vopred nastaví na hodnotu medzi 5,0 a 5,5 prísadou slabej kyseliny (napr. zriedenou kyselinou octovou) a spracuje sa pri teplote 2 °C až 8 °C filtráciou pri membránovom pretlaku vhodne medzi 0,15 MPa až 0,2 MPa. Po zmenšení objemu, výhodne na polovinu pôvodného objemu, sa vhodne urobí diafiltrácia do konštantného objemu, výhodne s použitím 1 až 3 objemov vody pre injekcie. Potom sa pH roztoku prídavkom minerálnej kyseliny nastaví na 4,0 až 4,8 výhodne na hodnotu 4,2 až 4,6. Membránový pretlak sa upraví na hodnotu pod 1,2 bar a vhodne medzi 0,05 MPa a 0,1 MPa a vhodná koncentrácia sa dosiahne prostredníctvom zníženia bežného objemu na jednu polovinu. Urobí sa diafiltrácia, vhodne za prísady nie menej ako 3 objemov roztoku, ktorý obsahuje cukrový alkohol, výhodne sorbitol, v koncentrácii medzi 2 % a 10 hmotn./obj. % za pH nastaveného kyselinou octovou na hodnotu 4 až 5. Konečne sa koncentrácia proteínu prevedie na požadovaný objem, vhodne na optickú hustotu (pri 28 nm) vyššiu ako 45 AU (absorpčnej jednotky). Následne sa roztok sterilizuje filtráciou, vhodne s použitím absolútnej membrány s veľkosťou pórov 0,22 μ. Výhodne sa potom roztok sterilizuje a stabilizuje (cukrovým alkoholom pochádzajúcim z diafiltračného roztoku) a roztok môže byť udržiavaný dlhší čas pri teplote 2 °C až 8 °C.

Počas spracovania sa roztok ochladí na 2 °C až 8 °C a pH sa upraví na hodnotu medzí 3,75 a 4,25 pomalým pridávaním minerálnej kyseliny pri teplote 2 °C až 8 °C. Vhodne sa roztok s upraveným pH inkubuje pri 2 °C až 40 °C počas 0,5 h až 48 h, výhodnejšie pri pH medzi 3,95 a 4,05 medzi 35 °C až 38 °C počas 1 hodiny až 4 h, za prítomnosti cukrového alkoholu, výhodne sorbitolu, s koncentráciou 2 % až 10 hmotn./ obj. %, pridanom skôr počas diafiltrácie. Počas úpravy na kyslé pH je taktiež vhodné napr. filtrovať vírusy z roztoku cez nanometrickú poréznu membránu, výhodne s veľkosťou pórov medzi 15 nm a 50 nm, ako sú napr. 50 nm filter (DV50, výrobca Pall), 35 nm (BMM-Planova 35N, výrobca Asahi), 20 nm (DV20, výrobca Pall), 15 nm (BMM-Planova 15N, výrobca Asahi) alebo inou membránou so zodpovedajúcou veľkosťou pórov.

Keď je vhodný výrobný postup s úpravou pH dokončený, teplota sa upraví na 2 °C až 8 °C a roztok sa zalkalizuje prísadou silnej zásady, až pH dosiahne hodnotu medzi 4,7 a 5,2. Okamžite sa následne pridá uhľovodík ako stabilizátor, výhodne cukrový alkohol, najvýhodnejšie sorbitol, na konečnú koncentráciu medzi 25 % až 35 hmotn. %. Pasterizácia sa uskutoční pri teplote 60 °C až 62 °C počas 10 až 12 h, výhodne v obidvoch prípadoch.

Potom sa roztok zriedi vodou na injekcie do koncentrácie uhľovodíka alebo vhodnej koncentrácie cukrového alkoholu pod 25 hmotn. %, aby koncentrácia proteínu bola medzi 1 % a 3 hmotn./obj. %. Keď sa roztok ochladí na teplotu miestnosti, pridá sa koncentrovaný roztok zmesi rozpúšťadla/detergentu, pozostávajúci prednostne z alkylfosfátových reagencií a neiónového detergentu, výhodnejšie z tri-n-butylfosfátu a polysorbátu-80 tak, aby konečná koncentrácia dosiahla 0,3 % a 1 hmotn./obj. % obidvoch reagencií. Urobí sa inkubácia pri teplote 24 °C až 28 °C počas 4 h a 8 h, vhodne v obidvoch prípadoch, (vírusovo inaktivovaný roztok predstavuje teraz exkluzívne bezpečné vírusové prostredie pre inaktivované výrobky, s ktorými sa robia zostávajúce postupy).

Roztok sa následne zriedi studenou vodou pre injekcie, výhodne pridaním 1 kg a 2 kg vody na každý 1 kg roztoku a potom sa vyzráža všetok prítomný proteín prísadou dostatočného množstva PEG (výhodne s molekulárnou hmotnosťou 4 000), roztok sa upraví na konečnú koncentráciu medzi 12 % a 17 hmotn. % PEG a pH sa nastaví na hodnotu medzi 7,0 a 9,0, výhodne na hodnotu medzi 7,8 a 8,4, pri vhodnej teplote 2 °C až 8 °C. Po dôkladnej homogenizácii, výhodne počas času viac ako 1 h (miešanie) a po vhodnom státí sa urobí zber precipitátu výhodne s použitím zariadenia, ktoré obsahuje membránu pre prietokovú tangenciálnu filtráciu (TFF). Filtrovaná kvapalina obsahuje okrem iných zložiek inaktivačnú reagenciu použitú pre predchádzajúci krok výrobného postupu, využívajúcu rozpúšťadlo/detergent. Membrána pre výhodnú tangenciálnu filtráciu je pripravená z polyvinylidénfluoridu (PVDF) značky Millipore (zariadenie Prostal alebo ekvivalentný model). Namiesto PVDF môžu byť výhodne použité aj iné materiály zlučiteľné s reagenciami, ktoré sú obsiahnuté v roztoku, ako polysulton. Veľkosť pórov filtračnej membrány je volená výhodne medzi 0,1 μ a 0,45 μ. Oddelenie filtrátu sa urobí pri membránovom pretlaku pod 0,15 MPa.

Keď bol znížený objem pôvodnej suspenzie výhodne 4 až 8-krát, začne sa s premývaním za pridania konštantného objemu roztoku obsahujúceho PEG, výhodne s rovnakou koncentráciou, aká bola použitá pri precipitácii a výhodne s rovnakým obsahom uhľovodíka použitého pri pasterizácii, výhodne s cukrovým alkoholom, vhodne s koncentráciou medzi 5 % a 20 hmotn. %. Po vhodnom použití 4 a 6 objemov uvedeného premývacieho roztoku je zostatok rozpustený v kyslom roztoku pri pH pod 5,5, ktorý výhodne obsahuje rovnaký uhľovodík použitý v predchádzajúcom výrobnom stupni. Roztok sa výhodne upraví roztokom kyseliny octovej 1 mM a 10 mM, ku ktorému je pridaný cukrový alkohol na koncentráciu vhodne medzi 5 % a 20 hmotn. %, a pH sa nastaví alkáliou na 4,0 až 4,5. Teplota roztoku nemá prekročiť 37 °C a je vhodne volená medzi 0 °C až 8 °C. Pridá sa také množstvo kyslého roztoku na rozpustenie, ktoré zodpovedá 2,5 a 4,5-násobnému množstvu zostatkovej suspenzie. Týmto spôsobom sa konečná koncentrácia PEG pohybuje medzi 2 % a 4 hmotn. % a výhodne medzi 2,8 % a 3,4 hmotn. %, koncentrácie cukrového alkoholu, výhodne medzi 5 % a 20 hmotn. %. Rozpúšťači roztok sa recirkuluje so zostatkovým precipitátom, pokiaľ sa plne nerozpustí.

pH rozpusteného výrobku sa upraví na hodnotu medzi 7,5 a 8,5, výhodne má hodnotu medzi 7,8 a 8,3, prísadou zriedeného alkalického hydroxidu alebo prijateľnou slabou zásadou pri zachovaní teploty 2 °C až 8 °C. Po homogenizácii môže byť vytvorený precipitát výhodne oddelený rovnakým zariadením TFF, aké bolo použité predtým, filtrát sa udržiava pre iný zaujímavý výrobok. Pri inom spôsobe pracovného postupu môže byť zariadenie TFF nahradené zodpovedajúcim membránovým filtrom, filtračnou doskou alebo mnohovrstvovou hlbokou filtračnou patrónou.

pH získaného filtrátu, v ktorom nie sú obsiahnuté agregáty s vysokou molekulárnou hmotnosťou a v ktorom je taktiež obsiahnutý väčší podiel reagencií z predchádzajúceho spracovania, t. j. rozpúšťadlo/detergent, sa upraví na hodnotu vhodne medzi 5 a 6 pridaním zriedenej kyseliny.

Roztok sa ultrafiltruje s cieľom zníženia obsahu PEG a iných zložiek s nízkou molekulárnou hmotnosťou a získa sa proteín s vhodnou koncentráciou na prípravu výrobku podľa konečného predpisu. Uprednostňovaná ultrafiltračná membrána má 100 kDa nominálnej molekulárnej hrany a je vhodne upravená polysulfónom (alebo jeho derivátmi), komerčnej značky Millipore a Pall-Filtron. Ultrafiltrácia sa začína s počiatočným pretlakom na membráne výhodne medzi 0,15 MPa a 0,2 MPa. Po znížení objemu, vhodne na 1/2 až 1/3 pôvodného objemu, sa výhodne urobí diafiltrácia do konštantného objemu, výhodne s použitím 1 objemu vody pre injekcie. Potom sa pH roztoku nastaví na hodnotu 4,0 až 4,8 a výhodne na hodnotu medzi 4,2 a 4,6 prísadou zriedenej minerálnej kyseliny. Pretlak na membráne sa nastaví na hodnotu pod 0,12 MPa, výhodne medzi 0,05 MPa a 0,1 MPa a roztok sa koncentruje znova za zníženia bežného objemu na 1/2 až 1/3 počiatočného objemu. Diafiltrácia sa výhodne uskutočňuje za pridania nie menej ako 5 objemov roztoku, ktorý obsahuje cukrový alkohol, výhodne sorbitol, s koncentráciou medzi 2 % a 10 hmotn./obj. % a hodnota pH je nastavená na pH 4 až 5 pomocou kyseliny octovej. Predchádzajúci roztok, diafiltrovaný a výhodne koncentrovaný na obsah 1 % až 3 hmotn. obj. % proteínu, ktorého pH sa nastaví na hodnotu medzi 4,4 a 5,0, ak je to nutné, sa vhodne zahreje na 25 ± 5 °C. Následne sa uskutoční vhodná filtrácia vírusov so zadržanou membránou s na7 nometrickými pórmi s nominálnou veľkosťou rovnajúcou sa alebo menšou ako 50 nm, výhodne približne 20 nm (DV20, značka Pall) a zadrží sa proteín v množstve viacej ako 90 % výťažnosť vyššia ako 1 kg proteínu/m² filtračnej plochy v kratšom výrobnom čase ako 25 h alebo vhodne podobným filtrom s pórmi s veľkosťou v rozsahu medzi 15 a 20 nm nominálne (BMM-Planova 15a alebo P21, obidve značky Asahi; VNF „Parvo“, Millipore) s výťažnosťou proteínu väčšou ako 80 %.

Konečne sa proteín koncentruje ultrafiltráciou s membránou o 100 kDa alebo menšou nominálnou molekulárnou hranou, až do požadovanej hodnoty, výhodne do konečnej optickej hustoty (pri 280 nm) približne 75 AU, aby sa získala koncentrácia IgG s 5 % alebo okolo 150 AU pre koncentráciu 10 %.

Diafiltrovaný roztok vhodne upravený na požadovanú koncentráciu stabilizátora (cukrového alkoholu) a pH upravené na hodnotu 5 až 6 sa číri hĺbkovým filtrom (stupeň 90LA, značky Cuno alebo ekvivalent). Sterilizuje sa absolútnou filtráciou s použitím membrány 0,22 μ a potom sa dávkuje do sklenených nádobiek. Výrobok dosahuje maximálnu záruku 15 dní pri 25 °C, roztok zostáva priesvitný a neobsahuje viditeľné Častice. Výrobok je stabilný pri teplotách 2 °C až 8 °C až do 25 °C.

Príklady uskutočnenia vynálezu

V nasledujúcom texte sú uvádzané príklady, ktoré však v ničom neobmedzujú informácie opisované vo vynáleze.

Príklad 1

90,0 kg pasty frakcie II + III (šarže č. 9003; ekvivalent 14909,9 I východiskovej plazmy) pripravenej Cohnovým frakčným spôsobom, sa suspenduje v 1 323 kg extrakčného roztoku, ktorý obsahuje 5 mM fosfátu disodného a 5 hmotn./obj. % sorbitolu a má hodnotu pH nastavenú na 4,83 prísadou 23,0 litra 0,5 M kyseliny octovej. Po jednohodinovom miešaní a po nastavení pH suspenzie na hodnotu 5,05 prísadou 1,4 litra 0,5 M kyseliny octovej sa miešalo počas ďalších 2 h pri teplote 2 °C a 6 °C. Bolo zistené, že sa pH suspenzie nezmenilo a vodivosť bola 1,05 mS/cm. Potom, za dostačujúceho miešania, bolo pridaných 135,5 kg roztoku PEG-4 000 (50 %). Následne okamžite bol pridaný bentonit (3 600 g) a pH znovu nastavené na hodnotu 5,03 pridaním 2 litrov 0,5 M kyseliny octovej a celý roztok sa nechal v pokoji precipitovať počas 4 hodín. Tesne pred oddelením precipitátu filtráciou bol za miešania pridaný Hylfo-supercel v množstve 32,5 g na každý kg suspenzie a zmes bola okamžite filtrovaná zahĺbenou filtračnou doskou (značka Cuno, stupeň 50 SA) s použitím tlakového filtračného zariadenia vhodného na zachytenie precipitátu. Na jednej strane bolo celkom získaných 1768 kg filtrovanej kvapaliny, ktorá bola transparentná a slabo nažltnutá, s optickou hustotou 8,38 AU (pri 280 nm) a zákalom s hodnotou 2,7 NTU. Na druhej strane bolo získaných 188,3 kg precipitátu, ktorý sa odložil.

pH uvedeného predchádzajúceho filtrovaného roztoku bolo upravené na hodnotu 5,92 prísadou 8 000 ml 0,5 M hydroxidu sodného, vodivosť výsledného roztoku bola 1,113 mS/cm.

Vopred sa pripravila iónomeničová kolóna s radiálnym tokom (zn. Sepragen), ktorá obsahovala 50 litrov živice DEAE-Sepharose FF (od Amersham-Pharmacia), umiestnenej radiálne s hrúbkou lôžka okolo 10 až 12 cm. Kolóna bola uvedená do rovnovážneho stavu roztokom octanu sodného a kyseliny octovej s iónovou silou a pH upravené na ekvivalentné roztoku s výrobkom. Roztok s výrobkom bol potom dávkovaný na kolónu za súčasnej filtrácie počas dávkovania s takou rýchlosťou prietoku, aby celý postup trval 12 h a 18 min. Konečne bola kolóna premytá 180 kg rovnovážneho roztoku. Celkový výtok z kolóny (neadsorbovaná frakcia) sa zhromaždil a obsahoval v podstate iba IgG ako jedinú proteínovú zložku, mal hodnotu pH 5,99, vodivosť 1,081 mS/cm, zákal s 2,4 NTU a optickú hustotu 6,95 AU (pri 280 nm).

pH roztoku bolo nastavené na hodnotu 5,19 prísadou 13 litrov 0,5 M roztoku kyseliny octovej a roztok sa koncentroval na 1030 kg membránovou ultrafiltráciou s membránovou hranou 100 kDa, značky Biomax A-2 (od Millipore) a pri membránovom pretlaku 0,195 až 0,220 MPa pri teplote okolo 4 °C. Optická hustota filtrátu bola <0,150 AU (pri 280 nm) a filtrát sa odložil. Okamžite následne bola urobená diafiltrácia pri konštantnom objeme 2 054 kg vodou pre injekcie, pričom konečná vodivosť získaného roztoku zostala na hodnote 0,134 mS/cm. Potom, bez zastavenia ultrafiltrácie, bolo pH nastavené na hodnotu 4,26 prísadou chladnej 0,2 M kyseliny chlorovodíkovej a s diafiltráciou sa pokračovalo do konštantného objemu, v tomto prípade 3 833 kg roztoku sorbitolu s 5 hmota. % a roztokom 2 mM kyseliny octovej bolo pH nastavené na 4,12 a membránový pretlak bol 0,105 až 0,110 MP a teplota asi 4 °C. Konečne bol zostatok koncentrovaný, pokiaľ optická hustota nedosiahla hodnotu 72,7 AU (pri 250 nm). Potom bolo zariadenie premyté diafiltračným roztokom tak, aby sa získalo 233,5 kg vloženej hmoty s optickou hustotou 55,5 AU (pri 280 nm) a nasledovala sterilizácia filtráciou membránou s pórmi 0,22 μ (typ CVGL od Millipore).

pH sterilizovaného roztoku ochladeného na 6,0 °C bolo nastavené na hodnotu 4,0 pomalým pridávaním chladného roztoku 0,2 M kyseliny chlorovodíkovej pri neustálom sledovaní hodnoty pH. Následne bol roztok so základnou hmotou v nádobe so zahrievacím plášťom a za intenzívneho miešania rýchlo ohriaty na teplotu 36,5 °C až 37,3 °C a táto teplota sa udržiavala počas 4 h.

Po ukončení tohto výrobného kroku bol roztok ochladený a stabilizovaný prísadou 114,3 kg pevného sorbitolu za miešania, pokiaľ sa sorbitol celkom rozpustil. pH roztoku bolo upravené na 4,85 pomalou prísadou

000 ml chladného 0,2 M roztoku hydroxidu sodného. Bolo tak získané 388,8 kg roztoku zo zákalom 1,41 NTU a optickou hustotou 36,0 AU (pri 282 nm). Uvedený roztok bol okamžite pasterizovaný pri teplote medzi 60,1 °C a 60,7 °C presne 10 hodín.

Následne bol roztok ochladený a zriedený prísadou 131 kg chladnej vody pre injekcie a bola stanovená hodnota optickej hustoty na 27,5 AU (pri 280 nm). Do 507 kg spracovávaného zriedeného roztoku bolo pridané 51,2 kg koncentrovaného roztoku SD, vytvoreného tri-n-butylfosfátom s koncentráciou 3 hmotn./obj. % a polysorbátu-80 (Tween-80) s 10 hmotn. % a urobená inkubácia počas presne 6 hodín pri teplote 25,8 °C a 26,4 °C.

Roztok spracovaný s SD bol zriedený 841,5 kg chladnej vody pre injekcie a pH bolo nastavené na hodnotu 8,05 pridaním 4 200 ml 0,5 M roztoku hydroxidu sodného. Následne bolo za stáleho miešania pomaly pridávané 654,3 kg PEG-4 000 v 50 % roztoku a výsledný roztok sa nechal v pokoji na precipitáciu pri teplote 2,6 °C až 3,8 °C.

065 kg predchádzajúcej suspenzie precipitátu s PEG sa koncentrovalo na 400 kg v mikrofiltračnom zariadení s tangenciálnym tokom (TFF), s použitím membránového filtra s pórmi 0,22 μ (typ Prostak, od Millipore), pri membránovom pretlaku 0,01 až 0,03 MPa pri teplote 3,6 °C až 5,0 °C. Suspenzia zachyteného precipitátu na TFF bola premytá konštantným objemom 2 000 kg roztoku obsahujúceho 15 hmotn. % PEG a hmotn. % sorbitolu a hodnotou pH nastavenou na 7,97.

Zadržaná suspenzia bola rozpustená v pridaných 1 226 kg roztoku so 17 hmotn. % sorbitolu a 4 mM kyseliny octovej a pH nastaveným na hodnotu 4,14 roztokom hydroxidu sodného. Roztok sa nechal v recirkulačnom styku so zariadením s TFF, pokiaľ nedošlo k úplnému rozpusteniu (25 min.). pH roztoku bolo potom upravené na 8,03 pomalým pridávaním 6500 ml roztoku 0,5 M hydroxidu sodného a asi po 15 minútach miešania sa začalo s filtráciou na rovnakom zariadení TFF (s membránovým filtrom s pórmi 0,22 μ) a IgG sa zadržal vo filtráte. Po odobratí 1474 kg filtrátu bola ostávajúca suspenzia premytá roztokom so zložením a charakteristikou podobnou suspenzii a získalo sa 1 827 celkového filtrátu. Filtrovaný roztok mal optickú hustotu 5,66 AU (pri 280 nm), zákal 1,99 NTU a vodivosť 0,158 mS/cm.

pH roztoku bolo nastavené na hodnotu 5,53 prísadou 3 000 ml 0,5 M roztoku kyseliny octovej a roztok koncentrovaný ultrafiltráciou membránového pretlaku medzi 0,175 MPa a 0,195 MPa. Tým bol objem redukovaný na 739 kg. Diafiltrácia bola robená na konštantný objem so 736 kg s použitím vody pre injekcie na hodnotu 4,51. Potom bol membránový pretlak znížený na 0,06 až 0,09 MPa a výťažok bol 296 kg a znova bolo pristúpené k diafiltrácii na konštantný objem 2072 kg roztokom s 5 hmotn. % sorbitolu, ktorého pH bolo upravené roztokom 2 mM kyseliny octovej na 4,16. Po spotrebe predchádzajúceho roztoku bola hodnota optickej hustoty stanovená na 142,5 AU a vyrobený roztok použitý na prípravu dvoch roztokov s koncentráciou 5 % a 10 % IgG. pH uvedených roztokov bolo nastavené na 5,25 a roztoky odfiltrované zahĺbenou filtračnou doskou (zn. Cuno, stupeň 90 LA) a absolútnou membránou s pórmi veľkosti 0,22 μ (typ CVGL od Millipore) za súčasného odmeriavania do 10 ml, 50 ml, 100 ml a 200 ml sklenených fľaštičiek. Výťažok konečného výrobku nastavených roztokov, s ohľadom na gramy IgG na liter počiatočnej plazmy, bol 4,68.

Príklad 2

Bolo spracovaných niekoľko šarží IVIG, pričom sa vždy vychádzalo z 90 kg frakcie II + III, spôsobom opisovaným v predloženom vynáleze. Konečný výrobok (5 % IVIG v 50 ml violách) bol podrobený dôkladnej analytickej kontrole, aby sa overilo zloženie a akosť výrobku. Výsledky sú zhrnuté v tabuľke 1.

Tabuľka 1

Parameter	Č. spracovania šarže
	9002	9003	0001	0002	0003
Proteín (%)	4,6	4,5	4,7	4,8	N
Zákal (NTU)	3,3	3,3	3,0	3,1	r 2,8
Sorbitol (%)	4,75	4,85 1	4,9	N	N
Čistota (%)	100	99,2	99,7	99,8	99,9
Polymér	0	0	0	0	0
Frakcia (%)	0	0	0	0	0
PEG (ppm)	164	311	224	N	N
Polysorbát(ppm)	<30	<30	34	<30	40
TNBP (ppm)	<3,6	<3,6	<3,6	<3,6	<3,6

PAK (lU/ml)	<2,8	<2,8	<2,8	<2,8	<2^8
ACÁ (CH 50/mg !g)	0,68	0,76	0,75	0,66	0,63
IgA (mg/ml)	<0,003	<0,003	<0,003	<0,003	<0,003
IgM (mg/ml)	<0,002	<0,002	<0,002	<0,002	<0,002

N - nestanovené

Obsah proteínu bol stanovený Bradfordovou technikou s použitím γ-globulínu ako kontroly. Intenzita zákalu bola meraná nefelometricky a kvantifikovaná pomocou kontrolného roztoku. Čistota γ-globulínu bola stanovená s prihliadnutím na celkové proteíny elektroforézou na celulózovej acetátovej doske zafarbením amidovou čerňou. Polyméry (alebo molekulárne agregáty vyššie ako sú diméry γ-globulínu) a proteínové frakcie s nižšou molekulovou hmotnosťou boli stanovené s použitím HPCL na vylučovacej kolóne s gélom (kolóna TSK G-3 000 SW od Toyosody), rozdeľovači koeficient molekulárnych foriem bol kvantifikovaný s ohľadom na celkové množstvo nájdeného proteínu na základe optickej hustoty stanovenej pri 280 nm. Obsah PEG bol stanovený metódou HPCL na filtračnej kolóne na géli (kolóna TSK G-3 000 SWXL) s použitím refrakčného indexného detektora. Koncentrácia sorbitolu bola stanovená enzymatickým spôsobom. Polysorbát80 bol analyzovaný kolometrickým postupom a TNBP prostredníctvom plynovej chromatografie. Aktivátor prekalikreín (PAK) bol stanovený chromatograficky. Obsahy sprevádzajúcich proteínov IgA a IgM boli určené imunonefelometriou. Aktivita antikomplementámych častíc (ACA) bola stanovená spôsobom podľa Eur. Phar., založenom na stanovení zostatku komplementu po inkubácii za prítomnosti alebo neprítomností vzorky.

Príklad 3

Podľa pracovného spôsobu uvedeného v predloženom vynáleze je množstvo reagencií pre inaktiváciu vírusov znižované precipitáciou s PEG a premytím na zariadení TFF. Po mnohých skúškach bol navrhnutý jednoduchý spôsob, ktorý dovoľuje nepriamo kontrolovať koncentráciu uvedených reagencií počas postupu využívajúceho TFF. Spôsob je založený na poznatku, že optická hustota filtrátu pri 280 nm po spracovaní prostredníctvom TFF závisí zásadne od koncentrácie neiónového detergentu a od zostatku rozpustných proteínov, ktoré odchádzajú súčasne s filtrovanou kvapalinou (PEG neadsorbuje v rozsahu 245 až 280 nm). Pri odpočte pri 245 nm sa stanoví iba minimálne množstvo proteínov, pretože pri tejto vlnovej dĺžke je adsorpcia proteínu nízka, ale naopak pri detergentoch veľmi vysoká (približne 14,5-krát vyššia ako pri proteíne v prípade komerčného polysorbátu-80).

Tak na základe stanovení optickej hustoty pri 280 nm a 245 nm môže byť kontrolovaný postup procesu pri TFF a tým je možné súčasne vhodne kontrolovať koncentráciu a účinnosť premývania na znižovanie obsahu SD. Na základe vyvinutého meracieho spôsobuje možné kvantifikovať zostatok SD zodpovedajúci spôsobu vedenia pracovného postupu v predchádzajúcom príklade 1. Nájdené výsledky sú zostavené v tabuľke 2.

Tabuľka 2

Postup TFF	Množstvo získaného výrobku (kg)	Optická hustota filtrátu (AU pri 280 nm)	Optická hustota filtrátu (AU pri 280 nm)	Kvocient optickej hustoty pri 245/280 nm	% O.D. pri 280 nm) podľa SD vo filtráte (D	% zachytené ho SD v zostatku (2)
Východisková koncentrácia	2065	0,339	N	n.a.	n.a.	n.a.
Konečná koncentrácia	400	0,346	4,72	13,6	94	95,94
1. premývací objem : 400 kg	400	0,156	1,82	11,6	80	36,81
2. premývací objem : 800 kg	400	0,080	0,790	9,87	68	16,05
3. premývací objem : 1 200 kg	400	0,046	0,345	7,6	52	7,06

4. premývací objem : 1 600 kg	400	0,050	0,190	3,8	26	3,83
5.	400	0,030	0,137	4,5	31	2,74
premývací
objem :
2 000 kg			____________	_

O. D. - optická hustota, SD - rozpúšťadlo/detergent N = nestanovené n. a. = nepoužiteľné (1) Hodnota optickej hustoty v % (O. D.) pri 280 nm, zodpovedajúca obsahu SD, bola vypočítaná na základe podielu optickej hustoty (245 nm/280 nm), delenej relatívnym absorpčným faktorom určeným pri 245 nm medzi SD a proteínom hodnotou 14,5 a násobené 100.

(2) % stanoveného obsahu SD boli vypočítané z koncentrácie v súlade s hodnotou O. D. pri 280 nm pri zodpovedajúcom výrobnom postupovom kroku s ohľadom na to, že na začiatku bola hodnota koncentrácie (0,339), opravená o % O. D., ktoré prispievajú (približne) k SD, podľa nasledujúceho výrazu: výťažok v % = = (O. D. odpočet (280 nm)/0,339 x (% O. D. v SD/100).

Výsledky ukazujú priebeh zníženia obsahu SD (polysorbátu-80) počas koncentračného pochodu a premývania, aký sa dosiahne počas päťnásobného premývania, kedy poklesne z východiskového obsahu iba na 2,74 % v konečnom výrobku. Podľa toho je hodnota redukčného faktora 36,5 (100 %/2,74), korigovaný podľa päťnásobného zvýšenia koncentrácie proteínu (2065 kg/400 kg), čím sa dosiahne aktuálny redukčný faktor s hodnotou 182. V súlade s predchádzajúcimi hodnotami vypočítaná koncentrácia polysorbátu-80 v získanom precipitáte je o niečo nižšia ako 100 ppm pri približnej koncentrácii proteínu 2 %.

Samozrejme, že na dosiahnutie koncentrácie <100 ppm pri obsahu proteínu 5 % a 10 % je treba znížiť množstvo polysorbátu viacej ako päťkrát. Toto sa výhodne dosiahne pri použití ultrafiltračnej membrány s hodnotou 100 kDa a tým sa dosiahne dostatočne nízka koncentrácia polysorbátu s hodnotou v blízkosti tvorby myciel a separácia je tým spôsobom najvýhodnejšia. V šarži podľa uvedeného príkladu bola v konečnom výrobku nájdená koncentrácia < 30 ppm (pri 5 % IgG), teda pod kvantifikačným limitom analytickej techniky. _v

Ďalšie dve šarže, č. 8006 a č. 8007, boli spracované v preparátorskom rozsahu rovnakým spôsobom ako šarža 3. Bola urobená precipitácia s PEG, koncentrácia a premývanie so zariadením TFF s rovnakým typom membrány ako v predchádzajúcich prípadoch, ale bol zmenený iba objem premývacieho roztoku na 4 a 2,5-násobok pre šarže č. 8006, resp. 8007. Po diafiltrácii a koncentrácii membránou so 100 kDa na konečnú koncentráciu (5 % IgG) bola stanovená koncentrácia zostávajúceho polysorbátu v každej šarži v konečnom výrobku (IVIG 5 %). Nájdené hodnoty (vrátane šarže č. 9003) sú zhrnuté v tabuľke 3.

Tabuľka 3

Šarža č.	Počet premývacích objemov (pri TFF)	Koncentrácia polysorbátu v konečnom výrobku 5 % IVIG (ppm)
9003	5	<30
8006	4	50
8007	2,5	200 ..... ....

Výsledky predchádzajúcej tabuľky 3 ukazujú závislosť medzí obsahom zostatkového polysorbátu a počtom premývacích objemov a dokazujú, že premývanie TFF podľa podmienok uvedených v predloženom vynáleze je základnou podmienkou na účinné zníženie obsahu neiónového detergentu (polysorbátu) vo výrobku. Na základe nájdených hodnôt je možné usúdiť, že je treba minimálne štvornásobné premytie na získanie menšieho zostatku v konečnom výrobku ako 100 ppm.

Príklad 4

Podľa spôsobu uvedeného v predloženom vynáleze bolo spracovaných niekoľko šarží IgG, kedy ako východiskový materiál boli použité frakcie II + III v množstve 90 kg. Keď bol získaný roztok vyčistený kolónou s obsahom DEAE - Sepharose FF, obsahujúci približne 4 % PEG-4 000, bola vo všetkých prípadoch urobená ultrafiltrácia na povrchu veľkosti 27,6 m² polysulfónovej membrány zn. Biomax A-2 od Millipore s nominálnou molekulárnou hranou 100 kDa za rovnakých podmienok, aké sú uvedené v príklade 1. Nájdené hodnoty koncentrácie proteínu (podľa stanovených hodnôt optickej hustoty) a koncentrácie PEG - 400 sú uvedené v tabuľke 4.

Tabuľka 4

Šarža č.	Proteín (O.D. 280 nm, v AU	Koncentrácia PEG -4000 (mg/ml)
9002	49,6	5,20
9003	55,5	4,92
0001	55,9	4,92
0002	54,1	4,83
0003	54,9	5,91

Koncentrácia PEG-4 000 bola určená metódou HPLC na vylučovacej kolóne s gélom s použitím lomového indexového detektora.

Pri inej skúške urobenej v laboratórnom meradle (vychádzalo sa z množstva 8 kg frakcia II + III) s jednou zo šarží (č. 9001) bol postup robený až po vyčistení s kolónou obsahujúcou FF DEAE-Sepharosu. Následná ultrafiltrácia bola urobená membránou s molekulárnou hranou so 100 kDa zn. Biomax A-2 za podmienok uvedených v príklade 1, po prispôsobení práce k množstvu východiskovej suroviny. V tomto prípade na rozdiel od príkladu 1 bola diafiltrácia urobená s ohľadom na množstvo sorbitolu 5 % bez nastavenia pH výrobku na 4,2 až 4,6 a na diafiltráciu sa použil membránový pretlak 0,15 MPa. Nakoniec sa získala približná koncentrácia proteínu zodpovedajúca hodnote O. D. (pri 282 nm) 45 a koncentrácia PEG bola 33 mg/ml, t. j. asi šesťkrát vyššia ako hodnoty uvedené v tabuľke 4. Výrobok získaný do pasterizácie obsahoval 4 % agregátov, chovajúcich sa odlišne od šarží uvedených v tab. 4, v ktorých bolo zistené navýšenie uvedených agregátov iba na 1,0 až 1,5 %.

Výsledky uvedené v tabuľke 4 ukazujú, že spôsob ultrafiltrácie podľa vynálezu (relatívne k pH a membránovému pretlaku) uspokojivo spĺňa požiadavku výkonného zníženia obsahu PEG a že je vhodný na prípravu roztokov s takými obsahmi proteínu a PEG, ktoré sú vhodné pre vírusové inaktivačné ošetrenie.

Príklad 5

Mnoho šarží bolo spracovaných za podmienok, ako sú uvedené a opisované v predloženom vynáleze. V nich bola pred uskutočnením záverečnej ultrafiltrácie upravená hodnota pH na 5,4 a 5,6 a boli 2,5-krát koncentrované membránami so 100 kDa pri membránovom pretlaku približne 0,15 až 0,2 MPa. Boli premyté jedným objemom vody pre injekcie a následne bolo pH nastavené na hodnotu medzi 4,3 a 4,5 prísadou roztoku 0,5 M kyseliny chlorovodíkovej, membránový pretlak bol znížený na hodnotu pod 0,1 MPa a objem zodpovedajúcich roztokov bol znova 2,5-krát koncentrovaný. Konečne bola urobená diafiltrácia so 7 objemami roztoku s 5 hmotn. % sorbitolu, ktorý obsahoval taktiež 2 mM kyselinu octovú na nastavenie hodnoty pH na 4,2 s hydroxidom sodným.

Výsledky označujúce koncentrácie zostatkového obsahu PEG v konečnom výrobku je možné nájsť v predchádzajúcej tabuľke 2, s hodnotami okolo 200 ppm (2,02 %) pri % IgG. Ak si uvedomíme, že koncentrácia PEG a IgG roztoku pred ultrafiltráciou boli približne 3,25 % resp. 4 mg/ml, je hodnota redukčného faktora pre IgG (po korekcii na proteín) 1 000 až 2 000.

Podobne ako v predchádzajúcich šaržiach bola táto skúška urobená v laboratórnom meradle spôsobom opisovaným vo vynáleze, ktorý je uvedený v príklade 1, iba s úpravou prispôsobenou veľkosti šarže. pH východiskového roztoku bolo upravené na hodnotu asi 5,0 a roztok koncentrovaný asi 4-krát pomocou membrán a s hodnotou molekulárnej hrany 100 kDa. Diafiltrácia bola potom urobená pri konštantnom objeme s rovnakým zariadením asi s 9 objemami 5 % roztoku sorbitolu pri membránovom pretlaku asi 0,12 MPa. Nájdené hodnoty koncentrácie PEG a proteínu rovnako ako redukčný faktor pre PEG sú zostavené v tabuľke 5.

Tabuľka 5

Fáza	Koncentrácia PEG (mg/ml)	Koncentrácia proteínov (mg/ml)	Redukčný faktor PEG (upravený) (1)
Východiskový roztok (2)	32,5	3,76	1
4 krát koncentrovaný roztok	55,6	4,9	2,31
1. DV s 5 % sorbitolu	Nest.	14,9 (pribi.)	Np.
3. DV s 5% sorbitolu	14,5	14,9 (pribi.)	8,74
5. DV s 5% sorbitolu	1,6	14,9 (pribi.)	11,08
7. DV s 5% sorbitolu	8,4	14,9 (pribi.)	15,43
9. DV s 5% sorbitolu a konečná koncentrácia	20,5	62,8	26,18
5% IVIG (konečná)	15,2	51,4	28,8

DV - počet objemov pri diafíltrácii nest. - nestanovené np. - nepoužíteľné (1) Redukčný faktor bol opravený podľa koncentrácie proteínu (2) Východiskový roztok zodpovedal filtrátu s PEG 3,28 % a pH 8.

Výsledky uvedené v tabuľke 5 dokumentujú jemné rozdiely v obsahu PEG pri filtrácii membránou so 100 kDa za uvedených skúšobných podmienok a zodpovedajú predovšetkým hodnote pH média > 4,8 a membránovom pretlaku >0,12 MPa. Preto bolo určené, že za aktuálnych pracovných podmienok podľa predloženého vynálezu je zníženie obsahu PEG podstatne účinnejšie, rádovo v hodnotách okolo 50-krát (pri porovnaní so znižujúcim faktorom 1 000 až 2 000 v predchádzajúcich šaržiach a o 28,8 v predloženej skúške).

Príklad 6

Nevyhnutná pasterizácia γ-globulínového roztoku rovnako ako okamžitá následná chemická inaktivácia s použitím rozpúšťadla/detergentu sotva spôsobujú agregáciu.

Niekoľko šarží bolo spracovaných v priemyselnom meradle (vždy s východiskovými 90 kg frakcií II + + III) a bol zachovaný pracovný postup podľa opisovaného vynálezu, ako je detailne uvedený v príklade 1. Keď bola urobená inkubácia pri kyslom pH, γ-globulínový roztok s koncentráciou 3,5 % bol stabilizovaný prísadou sorbitolu v takom množstve, aby konečná koncentrácia bola približne 33 hmotn. % a pH bolo nastavené na hodnotu 4,80 ± 0,05 prísadou roztoku 0,5 M hydroxidu sodného, optická hustota bola medzi 35,6 AU a 41,2 AU (pri 280 nm). Následne bola okamžite urobená celková pasterizácia v nádobe s ohrievacím plášťom a to počas 10 h pri teplote 60 °C až 61 °C. Potom bol roztok zriedený chladnou vodou na injekcie na optickú hustotu medzi 25,9 AU a 28,0 AU (pri 280 nm), tak, aby vo všetkých prípadoch bola koncentrácia sorbitolu < 25 %. Ďalej bol spracovávaný roztok ochladený na 25 °C až 26 °C a bol pridávaný koncentrovaný roztok (10-krát) rozpúšťadla/detergentu, tak, aby sa dosiahla konečná koncentrácia (hmotn./obj.) polysorbátu-80 v množstve 1 % a tri-n-butylfosfátu 0,3 %. Po miešaní asi 30 min. sa nechal roztok inkubovať počas 6 hodín pri teplote 25 °C až 26 °C.

Obsah polymérov alebo agregátov s vysokou molekulárnou hmotnosťou (stanovené prostredníctvom HPCL) v roztoku bol určený pred a po pasterizácii a po spracovaní rozpúšťadlom/detergentom. Množstvo koloidných častíc vzniknutých počas pasterizácie bolo stanovené meraním zákalu. Nájdené hodnoty sú zostavené v tabuľke 6.

Tabuľka 6

Šarža č.	% polyméru (alebo agregátov s vysokou [ Zákal (NTU) molekulárnou hmotnosťou)
i 1	Pred pasterizáciou	Po pasterizácii	Po prísade SD	Pred pasterizáciou	Po pasterizácii
9002	nd.	1,23	nest.	1,5	1,6
9003	nd.	1,16	1,97	1,4	1,8
0001	nd.	1,04	1,19	5,9	1,8
0002	nd.	1,21	1,30	2,3	2,4
0003	nd.	1,35 “I	1,15	1,7	2,0

nd - nedokázateľné nest. - nestanovené

Výsledky ukazujú, že tak pasterizácia, ako spracovanie rozpúšťadlom/detergentom za opisovaných podmienok teploty, času a zloženia materiálu (stabilizátor, koncentrácia proteínu a PEG, pH atď., nespôsobujú denaturáciu γ-globulínu, ale prinášajú iba nepatrné zväčšenie množstva agregátov (< 2 %) a zákalu. Podobne pri koncentrácii γ-globulínu (približne 3,5 %) je opisovaný postup najvhodnejším spôsobom na spracovanie veľkých množstiev v jednej šarži.

Príklad 7

Ďalej bolo uskutočnených niekoľko skúšok na určenie najlepších podmienok na čistenie celej šarže na iónomeničovej kolóne so živicou.

Vychádzalo sa z rovnakej šarže frakcií II + III, pričom bolo niekoľko prvých skúšok urobených v laboratórnom meradle s použitím 1 kg východiskového materiálu a postupovalo sa podľa spôsobu opisovaného v predloženom vynáleze, až po prípravu filtrovaného roztoku po prvej precipitácii s PEG.

V každej skúške bolo pH spracovaného množstva roztoku nastavené na 5,9 až 6,0 a nasledovalo čírenie (filtrom 0,5 g) a potom bol roztok vnášaný do kolóny primeru 65 mm alebo 90 mm, obsahujúci živicu DEAE-Sepharose FF (od Amersham Pharmacia) s výškou stĺpca 13 cm a 17 cm (bez jedného prípadu, ktorý je uvedený). Dávkovanie sa uskutočnilo pri teplote 2 °C až 8 °C a prietok bol nastavený tak, aby roztok prešiel za 12 až 15 h alebo 6 h, v závislosti od spôsobu vykonania skúšky. Celý výtok z kolóny sa zhromaždil a premytie po každej skúške bolo urobené roztokom 10 mM octanu sodného, ktorého pH bolo nastavené na hodnotu 5,95 ± 0,05 kyselinou octovou a ktorého použité množstvo zodpovedalo 3,5-násobku objemu kolóny.

Tab. 7 ukazuje hodnoty získaného γ-globulínu a jeho elektroforetickú čistotu pri odtoku z kolóny (v octane celulózy).

Tabuľka 7

Pomer násady (g frakcie II+ lll/ml živice)	Doba násady (hodiny)	Čistota odtoku z kolóny (elektroforéza)	Výťažok γ-globulinu (%) (2)
		Albumín (1)	Gamma (%)
4,0	12,15	(+)	97,2	97
2,5		(-)	98,7	95
2,25		(-)	98,3	105
1,25		(-)	97,7	97

0,875		(-)	100	98
0,625		0	1000	100
1,65	6	(+++)	85,6	Nest.

(1) Symboly: (-) označuje zistenú neprítomnosť; (+) prítomné stopy; (+++) značné prítomné množstvo (hlavné nečistoty).

(2) Výpočet výťažku v % podľa celkovej hodnoty proteínu (vo vzťahu k O. D. pri 280 nm a čistotu (elektoforeticky) odtoku z kolóny s ohľadom na počiatočný spracovávaný roztok.

Pri použití dávky 2,5 g frakcie II + III na 1 ml živice alebo menej bola dosiahnutá skoro úplná adsorpcia hlavných nečistôt, stanoviteľných elektroforézou (neprítomnosť albumínu) a nebol zistený negatívny vplyv na výťažok γ-globulínu, ktorý sa ukazuje ako výborný v celej študovanej oblasti. Bol však znížený obsah živice v kolóne na množstvo 1 g frakcie II + III na 1 ml živice, aby sa znížil zbytočne veľký objem kolóny. Na druhej strane, ako sa dalo očakávať, prietok dávkovaného množstva do kolóny s agarózovou matricou sa ukázal byť dominujúcim faktorom a ďalej, že 12 hodinový kontakt pri kontinuálnom prietoku je nevyhnutný.

Jedna zo skúšok (šarža č. 9001) bola urobená v laboratórnom meradle (s 8 kg východiskovej frakcie II + + III) pri zachovaní pracovného postupu opísaného v príklade 1, ale s nastavením takých podmienok šarže a so snahou objasniť zníženie množstva niektorých hlavných sprevádzajúcich proteínov počas adsorpcie na kolóne. Dávkovací pomer bol 1,8 frakcie II + III na 1 ml DEAE-Sepharose FF a kontaktný čas bol približne 12 h, koncentrácie IgG, albumínu a trasferínu boli stanovené v odtoku z kolóny a v roztoku dávkovanom do kolóny. Nájdené hodnoty sú zostavené v tabuľke 8.

Tabuľka 8

Proteín	Pred kolónou	Za kolónou	Výťažnosť v % (1)
IgA (mg/ml)	0,16	<0,003	<2
Albumín (mg/ml)	0,248	<0,0018	<1
Transferin (m/ml)	0,043	0,002	5
IgG (mg/ml)	5,15	4,49	94,7

Obsah proteínov bol stanovený imunonefelometricky (1) Výťažnosť v % bola vypočítaná s ohľadom na absolútne množstvo proteínu nájdeného v roztoku a pred a po dávkovaní do kolóny.

Z tabuľky 8 jasne vyplýva, že za špecifických podmienok opisovaných v predloženom vynáleze je živica vysoko selektívna a účinná pri oddeľovaní základných druhov proteínov prítomných spoločne s IgG vo východiskových frakciách II + III. V odtoku z kolóny, ktorý obsahuje IgG, je dokázateľné iba nepatrné množstvo transferínu. Vysoká výťažnosť IgG je výborným ukazovateľom dobrého rozdelenia vzájomného pomeru všetkých podtried odtoku z kolóny.

Príklad 8

S použitím vysoko vyčisteného I. V. γ-globulínového roztoku ako východiskového materiálu boli k štúdiu simulované podmienky pri spracovaní v kyslom pH (pH 4,0), t. j. k štúdiu ochranného účinku sorbitolu v závislosti od koncentrácie a od inkubačného času a taktiež ich význam pre nasledujúce pasterizačné spracovanie.

Boli spracované vzorky rovnakej šarže s 5 % IVIG (Flebogamma z Instituto Grifols) a urobené skúšky na overenie ochranného účinku sorbitolu v kyslom prostredí počas nastavenia hodnoty pH na 4,00 až 4,05 roztokom mM kyseliny chlorovodíkovej pri teplote miestností 20 °C až 25 °C. Súčasne boli urobené iné skúšky, aby sa vyhodnotil vplyv účinku koncentrácie γ-globulínu pri zriedení východiskového 5 % roztoku IVIG 5 % roztokom sorbitolu a taktiež určil pri nastavenej hodnote pH 4,0 vplyv teploty miestnosti 20 °C až 25 °C alebo chladu pri 2 °C až 8 °C. Po inkubácii pri pH 4 po 1 h a následnej pasterizácii pri 60 °C až 61 °C počas 10 h v prítomnosti 33 % roztoku sorbitolu bol stanovený obsah agregátov alebo polymérov stanoviteľných O. D. pri 280 nm pomocou HPLC. Výsledky sú uvedené v tabuľke 9.

Tabuľka 9

Sorbitol(%)	Protein (%)	Nastavenie hodnot	y pH na 4,0 pri	Nastavenie pH
		20°C až 25°C	na 4,0 pri 2°C
				až 8°C
		Agregáty % (po	Agregáty % (po	Agregáty % (po
		inkubácii pri pH 4)	pasterizácii)	inkubácii pri pH
				4)
5	0,25	nest.	nest.	ned.
5	1	0,31	0,57	ned.
5	2	0,34	0,64	nest.
5	2,5	nest.	nest.	ned.
5	3	0,37	1,01	nest.
5	4	0,93	1,57	nest.
5	5	0,83	1,81	0,43
5	5	0,86	3,50
10	5	0,15	0,83
20	5	0,10	nest.
33	5	ned.	0,70

ned. - nedokázateľné nest. - nestanovené

Vo všetkých prípadoch východiskový IVIG neobsahoval agregáty (ned.).

Dosiahnuté výsledky zdôrazňujú ochranný účinok sorbitolu v kyslom prostredí pri meniacom sa pH, aj keď podstatne zreteľnejšie pri vyššej teplote. Pri teplote miestnosti je potrebná koncentrácia sorbitolu 10 % alebo vyššia, aby sa udržal ochranný účinok na roztok γ-globulínu s jeho 5 % obsahom (alebo s vyššou kon10 centráciou). Vyššia koncentrácia γ-globulínu má za následok vyššiu mieru agregácie, ale pri nastavení pH na hodnotu 4,0 pri 2 °C až 8 °C a koncentrácii proteínu do 5 % (alebo zriedenejšie roztoky, vhodné do 3,5 ± 0,5 %), môže sa dosiahnuť stabilizácia iba s 5 % sorbitolu a táto koncentrácia je taktiež prijateľná pre inkubáciu v kyslom prostredí a na uskutočnenie následnej pasterizácie. Ale pri nastavení hodnoty pH pri nižšej teplote 2 °C až 8 °C bola v roztoku s koncentráciou 5 % γ-globulínu s 5 % sorbitolu pozorovaná iba nepatrná agre15 gácia (0,43 % polyméru), čo je zreteľnejšie nižšia hodnota, ako pri nastavení rovnakého pH pri 20 °C až 25 °C (za vzniku 0,83 % polyméru). Nižší stupeň pri nižšej teplote v rovnakom koncentračnom rozsahu proteínu a taktiež stupeň ochrany poskytovaný sorbitolom ospravedlňujú nájdené podmienky pri rôznych krokoch výrobného postupu podľa predloženého vynálezu.

Ďalej sa sledoval inkubačný čas pri kyslom pH (pH 4,0 a 36 °C až 37 °C) vzhľadom na vznik agregátov v roztoku γ-globulínu (Flebogamma) a sorbitolu pri dvoch rozdielnych koncentráciách obidvoch látok a nastavenie pH pri teplote 2 °C až 8 °C.

Nájdené výsledky sú uvedené v tabuľke 10.

Tabuľka 10

Sorbitol (%)	Protein (%)	Čas pri pH 4 (h)	Agregáty (%) (po spracovaní pri pH 4)	Agregáty (%) po spracovaní pasterizáciou
5	2,5	1	ned.	0,35 —

5	2,5	2	0,60	0,59
5	2,5	4	ned.	0,32
6	3	0	0,11	0,36
6	3	1	0,07	0,31
6	3	4	0,07	0,41
6	3	8	0,40	1,11
S	3	12	0,43	1,18
δ' H	3	24	0,15	0,58

ned. - nedokázateľné

Dosiahnuté výsledky celkom jasne dokazujú vhodnosť použitia pri skúškach dvoch druhov roztokov odporúčaných na uskutočnenie inkubácie pri kyslom pH a následnú pasterizáciu v prítomnosti sorbitolu v množstve 33 %. Vhodný inkubačný čas bol nájdený v maximálnom študovanom rozsahu od 0 do 24 h, s najvýhodnejším optimom pri 4 h vystavení pri 36 °C až 37 °C.

Príklad 9

Najvýhodnejšie pasterizačné podmienky boli sledované na východiskovom veľmi čistom materiáli s 5 % IVIG (Flebogamma), pri koncentrácii 5 % (s vodivosťou 450 pS/cm) alebo po zriedení 1 : 1 vodou pre injekcie až na koncentráciu 2,5 % (vodivosť tohto roztoku bola asi 225 gS/cm). Do každého z týchto roztokov sa pridal sorbitol do koncentrácie 33 hmotn. % a bolo nastavené odlišné pH roztokom 0,5 M kyseliny chlorovodíkovej. Po vystavení každej vzorky s rozdielnou koncentráciou a pH na 10 h tepelnému spracovaniu pri 60 °C až 61 °C bolo vždy stanovené molekulárne rozdelenie analýzou HPLC, aby sa určilo množstvo vytvorených agregátov (polymérov alebo vysokomolekulárnych agregátov a dimérov). Nájdené hodnoty sú v tabuľke 11.

Tabuľka 11

Protein (%)	pH	Polyméry (%)	Diméry (%)
2,5	5,52	0,46	4,36
2,5	5,03	0,35	3,49
2,5	4,72	0,30	3,31
2,5	4,51	0,45	3,34
5	4,2	4,89	4,54
5	4,0	14,42	5,60
5	3,8	24,51	6,23

Obsah polymérov vo východiskovom roztoku 5 % IVIG bol nezistiteľný.

Výsledky ukazujú, že je vhodné robiť pasterizáciu pri 60 °C až 61 °C počas 10 h pri veľmi slabej iónovej sile a pri koncentrácii proteínu približne 2,5 % v prostredí stabilizovanom sorbitolom a v rozsahu pH medzi 5,5 až 4,5. Optimálne pH je v rozmedzí 4,7 až 5,0, pri ktorom sa našla najnižšia tvorba agregátov (polymérov a dimérov).

Príklad 10

Ďalej boli urobené niektoré skúšky na určenie schopnosti spôsobu podľa predloženého vynálezu zaistiť elimináciu agregátov s vysokou molekulárnou hmotnosťou, ktoré sa vytvárajú (vznikajú) pri predchádzajúcich postupových krokoch pri vírusovej inaktivácii.

Roztoky boli pasterizované v prítomnosti 33 % sorbitolu a následne spracované s 0,03 % TNBP a 1 % polysorbátu-80 v rôznych pomeroch podľa spôsobov opisovaných v predloženom vynáleze a riedené vodou pre injekcie v pomere 1 kg až 1,5 kg vody na každý kg roztoku a potom ochladené na 2 °C až 8 °C. Okamžite bol následne pridaný PEG-4 000 a získané rôzne koncentrácie, ktorých pH bolo nastavené na hodnotu medzi 7,5 a 8,1. Roztoky boli nechané na precipitáciu agregátov s vysokou molekulárnou hmotnosťou, potom sa suspenzie filtrovali filtrom spormi v rozsahu 0,5 až 0,1 μ a v každom prípade sa získala priesvitná kvapalina obsahujúca čistený IgG.

Množstvo polymérov v % v každom roztoku bolo určené s použitím HPLC a nájdené hodnoty sú uvedené v tabuľke 12.

Tabuľka 12

Postup č.	Koncentrácia PEG (5)	Konečné pH	Východiskový roztok (% polyméru)	Filtrovaný roztok (% k polyméru)
61/50	3,00	7,88	2,31	0,00
63/53	3,00	7,62	2,94	0,35
65/58	3,15	7,51	0,88	0,33
63/60	3,15	8,06	2,94	0,00
77/61	3,23	7,75	2,28	0,08
7014/1	3,27	7,99	1,28	0,00
62/59	3,45	7,47	0,84	0,00

Nedokázateľné množstvá s použitím HPLC sú v uvedenom prípade uvedené ako 0,00.

Celková eliminácia polymérov bola zistená v rozsahu koncentrácií PEG od 3,00 % do 3,45 %, hoci tu existuje interakcia s pH v prostredí, ktoré je pre separáciu najúčinnejšie, t. j. pri pH medzi 7,75 a 8,06. Pre úplnú elimináciu polymérov bola potrebná pri najnižšej sledovanej hodnote pH 7,47 aspoň koncentrácia najmenej o 3,45 % PEG, pretože nižšie koncentrácie (napr. PEG 3,18 % - pH 7,51) nie sú schopné prinútiť všetky uvedené polyméry k precipitácii a môžu tak zanechať zostatky vo filtrovanom roztoku.

Prítomnosť sorbitolového stabilizátora pôsobí rovnakým spôsobom, zamedzuje koprecipitácii neagregátového podielu (monoméru a diméru) spoločne s polymérom a umožňuje tak pri uvedenej precipitácii zisk veľkého množstva požadovaného výrobku. Aby sa stanovil vplyv prítomnosti sorbitolu, boli urobené niektoré skúšky precipitácie a výťažnosti proteínu (na základe optickej hustoty) pri rôznych koncentračných pomeroch. Pri skúškach sa vychádzalo z čistého roztoku s obsahom 5 % IVIG (a ktorý neobsahoval stanoviteľné polyméry), ktorý sa zriedil na optickú hustotu (pri 280 nm) na hodnotu asi 6 AU vodou alebo roztokom s 10 % sorbitolu podľa druhu robenej skúšky a pH sa nastavilo na hodnotu 8,0. Roztok sa nechal na precipitáciu najmenej Íha potom sa sledoval vznik precipitátu. Rovnaká skúška sa opakovala s roztokom IgG vychádzajúca z postupu vo vírusovej inaktivácii podľa spôsobu opísaného v predloženom vynáleze (s obsahom polyméru 3,97 %), ktorý bol v tomto prípade zriedený roztokom 5 % sorbitolu alebo vodou a po precipitácii a oddelení segregátov filtráciou sa stanovil percentuálny výťažok proteínu z filtrátu a urobené porovnanie s obsahom vo východiskovej vzorke.

Nájdené výsledky sú uvedené v nasledujúcej tabuľke 13.

Tabuľka 13

Koncentrácia PEG (%)	pH	% polyméru vo východiskovom roztoku IVIG	Koncentrácia! Prítomnosť	Výťažnosť proteínu vo filtráte (2)
sorbitolu (%)	precipitátu d)
3,0	8,0	ned.	0,4	áno(+++)	nest.
3,0	8,0	ned.	5	áno(+)	nest.
3,0 -1	8,0	ned.	10	nie(-)	nest.

3,0	8,0	ned.	9,4	áno(+++)	83,6
3,0 _	8,0	3,97	13,0	áno(+++)	92,2

nest. - nestanovené ned. - nedokázané (1) : Počet + indikuje množstvo nájdeného precipitátu : (+++) početné; (+) začínajúce; (-) žiadne.

(2) : Percentá celkového nájdeného proteínu vo filtrovanom roztoku s ohľadom na východiskový roztok pred pecipitáciou.

Koncentrácia sorbitolu nad 5 % zamedzuje precipitáciu monoméru/diméru IgG, pokiaľ sú prítomné ako jednoduché súčasti v roztoku IVIG (neobsahujúce polymér) a sú potvrdené neprítomnosťou precipitátu po prísade PEG. Podobne ak sú eliminované polyméry obsiahnuté v roztoku IgG, je pozorovaná výhodnejšia výťažnosť IgG (bez polymérov) aj pri najvyššej skúšanej koncentrácii sorbitolu (13 %). Podľa toho prítomnosť sorbitolu počas precipitácie polymérov alebo agregátov s vysokou molekulárnou hmotnosťou je výhodná na zamedzenie koprecipitácie a na dosiahnutie najvýhodnejšej výťažnosti IgG.

Príklad 11

Filtrácia vírusov sa sledovala a porovnávala v laboratórnom meradle s použitím komerčných filtrov s pórmi v nanometrickom rozsahu. Boli skúšané rozdielne východiskové materiály získané postupom opísaným v príklade 1: roztok bol nastavený na kyslé pH (pH = 4,00 ± 0,05) pri 36 ± 1 °C (materiál B). Výsledky dosiahnuté s ohľadom na filtrované množstvo a použité filtračné plochy, potrebný čas a výťažok proteínu podľa druhu použiteľného filtra (Planova 35 N, Planova 15 N a DV20) sú uvedené v tabuľke 14.

Tabuľka 14.

Typ filtra	Materiál A
Typ filtra	Filtrovaný objem (l/m2)	Filtrovaný p rote i n (kg/m2)	Filtračný čas (h)	% vyťaženého proteínu	Filtrovaný objem (l/m2)
Planova 35 N(35 nm)	213	6,77	1,53	99,2	300 249 289
DV20 (Pall) (20 nm)	48,3	1,43	16,9	94,5	64,8 51,7
Planova 15 N (15 nm)	34,0	0,99	1,62	87,1	34,0 34,0

(*) Výťažok získaný pred následným premytím.

Z predchádzajúcej tabuľky je zrejmé, že obidva materiály, tak A ako B, sú vhodné pre filtráciu, či filtrom s prierezom pórov 35 nm alebo menším, až do 15 nm. Zdá sa však, že veľkosť pórov okolo 20 nm je najvhodnejšia, ako vzhľadom na parametre proteínu (>90 %) a produktivitu (> 1 kg/m2) s ohľadom na elimináciu vírusov vztiahnuté na kapacitu rozmeru pórov filtra.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (19)

1. Spôsob výroby humánneho γ-globulínu G s inaktivovanými vírusmi, vyznačujúci sa tým, že γ-globulín sa získa extrakciou z frakcie izolovanej frakčným delením etanolom v prítomnosti uhľovodíka a po znížení obsahu znečisťujúcich látok použitím PEG sa na ďalšie spracovanie použije kolóna s aniónovou iónomeničovou živicou, v ktorej odtoku sa následne koncentrácia PEG zníži ultrafitráciou a roztok sa koncentruje na následné vhodné spracovanie pri kyslom pH a potom sa použije najmenej jeden postup na ínaktiváciu vírusov, zahŕňajúci pasterizáciu a spracovanie rozpúšťadlom/detergentom, výrobok je násled19 ne vyprecipitovaný a premytý PEG na elimináciu akejkoľvek reagencie pre vírusovú inaktiváciu a ďalej rozpustený, zmenou pH zbavený znečisťujúcich proteínov a konečne vyčistený ultrafiltráciou, aby sa znížil celkový objem a obsah PEG, potom sa uskutoční konečné vhodné odfiltrovanie vírusov a potom sa koncentrácia proteínov upraví na obsah 5 % hmotn./obj. alebo 10 % hmotn./obj.

2. Spôsob výroby humánneho γ-globulínu G s inaktivovanými vírusmi podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že frakciou izolovanou frakčným delením etanolom je výhodne frakcia II + III.

3. Spôsob výroby humánneho γ-globulínu G s inaktivovanými vírusmi podľa predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že uhľovodíkom je prednostne cukrový alkohol, výhodnejšie sorbitol s koncentráciou medzi 2 % až 10 hmotn./obj. %.

4. Spôsob výroby humánneho γ-globulínu G s inaktivovanými vírusmi podľa predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že precipitácia s PEG sa uskutočňuje pri koncentrácii 2,5 až 5,5 hmotn. % a pri hodnote pH 4,8 až 5,5.

5. Spôsob výroby humánneho γ-globulínu G s inaktivovanými vírusmi podľa predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že pH roztoku dávkovaného do kolóny so živicou je nastavené na hodnotu medzi 5,7 až 6,3.

6. Spôsob výroby humánneho γ-globulínu G s inaktivovanými vírusmi podľa predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že kolóna s aniónovým iónomeničom výhodne obsahuje DEAE agarózovú živicu a zaťaženie je vhodne medzi 1 g a 2,5 g frakcie II + III na 1 ml živice.

7. Spôsob výroby humánneho γ-globulínu G s inaktivovanými vírusmi podľa predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že odtok z kolóny sa ultrafítruje membránou s 100 kDa nominálnou molekulárnou hranou po predchádzajúcej výhodnej diafiltrácii s nie menej ako 3 objemami roztoku, ktorý obsahuje cukrový alkohol, prednostne sorbitol, s koncentráciou 2 % až 10 hmotn./obj. % pri hodnote pH 4,0 až 4,8 a pri membránovom pretlaku pod 0,12 MPa.

8. Spôsob výroby humánneho γ-globulínu G s inaktivovanými vírusmi podľa predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že spracovanie sa robí výhodne v kyslom pH s hodnotou 3,95 až 4,03 pri teplote 35 °C až 38 °C počas 1 až 4 hodín a v prítomnosti cukrového alkoholu, prednostne sorbitolu, s koncentráciou 2 % až 10 hmotn./obj. %.

9. Spôsob výroby humánneho γ-globulínu G s inaktivovanými vírusmi podľa predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že pred výrobným postupom chemickej inaktivácie zmesí rozpúšťadla/detergentu sa po pasterizácii v prítomnosti prednostne cukrového alkoholu, najvýhodnejšie sorbitolu, s koncentráciou 25 % až 35 hmotn. %, uskutoční zriedenie roztoku pre injekcie na koncentráciu cukrového alkoholu na 25 hmotn. % alebo menej a koncentráciu proteínu na hodnotu medzi 1 % a 3 hmotn./obj. %.

10. Spôsob výroby humánneho γ-globulínu G s inaktivovanými vírusmi podľa predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že roztok obsahujúci inaktivované vírusy po spracovaní zmesi rozpúšťadla/detergentu sa zriedi vodou pre injekcie vhodne pridaním 1 kg až 2 kg na každý kg roztoku a po nastavení hodnoty pH medzi 7,0 a 9,0, výhodnejšie na pH medzi 7,8 a 8,4, sa urobí precipitácia prísadou PEG na konečnú koncentráciu medzi 12 % a 17 hmotn. %.

11. Spôsob výroby humánneho γ-globulínu G s inaktivovanými vírusmi podľa predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že suspenzia precipitátu s PEG sa oddelí filtráciou na membráne s tangenciálnym tokom, výhodne s veľkosťou pórov 0,1 μ až 0,45 μ, vedúcej k zníženiu objemu výhodne rádovo na 4 až 8-krát menšiemu, ako bol objem pôvodného roztoku.

12. Spôsob výroby humánneho γ-globulínu G s inaktivovanými vírusmi podľa predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že precipitát s PEG zachytený na membránovom filtre s tangenciálnym tokom je premývaný v rovnakom zariadení, výhodne 4-násobným alebo väčším množstvom roztoku s charakteristikou podľa nárokov 1 a 4.

13. Spôsob výroby humánneho γ-globulínu G s inaktivovanými vírusmi podľa predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že suspenzia premytého precipitátu s PEG sa rozpustí na rovnakom filtračnom zariadení s tangenciálnym tokom prísadou kyslého roztoku s pH nižším ako 5,5, ktorý obsahuje uhľovodík, pozostávajúci výhodne z kyseliny octovej s nastavenou koncentráciou 1 mM až 10 mM, ku ktorému je výhodne pridaný roztok cukrového alkoholu s koncentráciou 5 % až 20 hmotn. %, s výhodne nastaveným pH na hodnotu medzi 4,0 až 4,5 roztokom alkálie.

14. Spôsob výroby humánneho γ-globulínu G s inaktivovanými vírusmi podľa predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že množstvo kyslého roztoku na rozpustenie, pridaného do suspenzie na premytie precipitátu s PEG, je medzi 2,5 a 4,5-násobnom množstvom uvedenej suspenzie tak, aby konečná koncentrácia PEG bola od 2 % do 4 hmotn. %, výhodne od 2,8 až 3,4 % a koncentrácia uhľovodíka, prednostne cukrového alkoholu, bola 5 % až 20 hmotn. %.

15. Spôsob výroby humánneho γ-globulínu G s inaktivovanými vírusmi podľa predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že pH rozpusteného výrobku je nastavené na 7,5 až 8,5 prísadou alkálie a nerozpustené agregáty s vysokou molekulárnou hmotnosťou sú vyprecipitované a oddelené prednostne filtráciou.

16. Spôsob výroby humánneho γ-globulínu G s inaktivovanými vírusmi podľa predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že filtrát v podstate neobsahujúci agregáty s vysokou molekulárnou hmotnosťou je podrobený diafiltrácii a koncentrovaný ultrafiltráciou membránou s 100 kDa nominálnej molekulárnej hrany, keď pH roztoku bolo nastavené na 4,0 až 4,8, s použitím výhodne roztoku s objemom nie menším ako je päťnásobok pôvodného objemu roztoku, ktorý obsahuje cukrový alkohol, výhodne sorbitol, s koncentráciou 2 % až 10 hmotn./obj., prednostne pri membránovom pretlaku menšom ako 0,12 MPa a koncentrácii proteínu od 1 % do 3 hmotn./obj. %.

17. Spôsob výroby humánneho γ-globulínu G s inaktivovanými vírusmi podľa predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že diafiltrovaný a vhodne koncentrovaný roztok na obsah 1 % až 3 hmotn./obj. % proteínu, ktorého pH bolo nastavené na 4,4 a 5,0, sa výhodne zahreje na 25 ± 5 °C a tým sa získajú optimálne podmienky na oddelenie vírusov nanofiltráciou membránou s nominálnou veľkosťou pórov 50 nm alebo menšou a výhodne s veľkosťou približne 20 nm na zachytenie viacej ako 90 % proteínu a s filtračnou kapacitou väčšou ako 1 kg proteínu/m² plochy alebo taktiež výhodne medzi 15 a 20 nm s výťažnosťou proteínu nad 80 %.

18. Spôsob výroby humánneho γ-globulínu G s inaktivovanými vírusmi podľa predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že diafiltrovaný roztok s výhodne odfiltrovanými vírusmi sa koncentruje výhodne na 5 % alebo 10 hmotn./obj. % ultrafiltráciou membránou so 100 kDa a nominálnej molekulárnej hrany alebo aj s menšou veľkosťou pórov a po nastavení pH na 5 až 6 a vyčírení a sterilnej filtrácii sa odvedie do koncovej nádoby, kde potom obsahuje viacej ako 99 % monomérnej-dimérnej formy a výhodne viac ako 99,9 %, pričom viditeľné častice sú neprítomné a zákal je menší ako 0,003 NTU a množstvo IgA je nedokázateľné (menšie ako 0,003 mg/ml), taktiež aj množstvo IBM (menej ako 0,002 mg/ml), obsah neiónového detergentu je menší ako 50 ppm a obsah PEG je pod 500 ppm a organické rozpúšťadlo je nedokázateľné (menej ako 3,6 ppm), antikomplementárna aktivita je menšia ako 1 CH 50/mg proteínu a úplná molekulárna štruktúra, vrátane fragmentov Fc je nad 100 % a rovnako aj fyziologický rozsah rozdelenia podskupín IgG.

19. Spôsob výroby humánneho γ-globulínu G s inaktivovanými vírusmi podľa predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že balený konečný výrobok prechádza minimálnym karanténnym časom 15 dní pri teplote 25 °C, roztok si zachová priesvitnosť a zrejmú neprítomnosť viditeľných častíc a je stabilný pri skladovacej teplote pri 2 °C až 8 °C až do 25 °C.

Koniec dokumentu