CZ300413B6 - Zpusob výroby humánního gama-globulinu G a viry inaktivovaný humánní gama-globulin G - Google Patents

Abstract

.gama.-globulin se extrahuje z frakce izolované frakcním delením ethanolem za prítomnosti uhlohydrátu. Po snížení znecištujících doprovodných látek prostrednictvím PEG (polyethylenglykolu) se použije kolona s aniontovou iontovýmennou pryskyricí a v odtoku z kolony se obsah PEG i objem roztoku sníží ultrafiltrací pro vhodne volené následující zpracování. Roztok se prevede do kyselého pH a následuje alespon jeden z následujících postupu pro inaktivaci viru, a to pasterizace a zpracování rozpouštedlem/detergentem. Následne se výrobek vysráží a promyje s PEG k odstranení chemických látek po virové inaktivaci, pak se po rozpuštení a pozmeneném pH odstraní znecištující proteiny a konecne cištení se provede ultrafiltrací, vedoucí ke zmenšení objemu roztoku a ke snížení obsahu PEG. Konecne následuje vhodná filtrace viru a následne koncentrace proteinu na jeho obsah v roztoku na potrebných 5 nebo 10 %.

Description

Způsob výroby humánního γ-globulinu G a viry inaktivovaný humánní γ-globulin G

Oblast techniky

Předložený vynález se zabývá způsobem výroby humánního γ-globulinu G inaktivovaného viry. Výchozí materiál pro přípravu γ-globulinu (humánního imunoglobulinu G nebo IgG) podle předloženého vynálezu pochází od skupiny dárců (větší než 1 000) lidského plazmatu, kteiý tvoří polyvalentní směs aktivních antilátek, jejichž individuální jednotky byly přezkoušeny na nepříio tomnost typických infekčních znaků HIV, virus hepatitidy B, C).

Dosavadní stav techniky

Podávání γ-globulinu může být prováděno intramuskulámě, nebo účinněji intravenózně. Tento druhý způsob podávání má velké terapeutické výhody v porovnání s prvním postupem, především ve větší účinnosti, ale může zároveň vyvolat vážné vedlejší účinky. Pro intravenózní podávání jsou tedy vhodné jen výrobky získané za podmínek nepřipouštějících denaturaci a s odpovídajícím stupněm čistoty.

Upřednostňované a nej účinnější klinické použití výrobku podle tohoto vynálezu je intravenózní podávání výrobku, jehož terapeutické indikace jsou určené pro takový druh výrobku (IgG), který vykazuje potřebné charakteristické složení a molekulární strukturu. Nej běžnější terapeutické indikace IgG podle vynálezu je možno rozdělit do tří základních patologických skupin: první skupina se vyznačuje nedostačující imunitou (nedostatečná humánní reakce); druhá skupina získanou imunitní nedostatečností (např. následkem virové infekce), a konečně třetí skupina nedostatkem imunity vlastního původu (nedostatečné vytváření vlastních tělesních protilátek).

Pokud se týká první uvedené skupiny. IgG podle tohoto vynálezu je potenciálně vhodný k použití v boji proti běžným a proměnným nedostatkům v imunitě, proti nedostatku podtříd IgG, proti nepřítomnosti IgA a jiných. Nejběžnější druhy nemocí náležející do druhé skupiny jsou vyvolané infekcí viry a bakteriemi (HIV nebo humánní imunodeficientní virus, cytomegalovir, vir pásového oparu, vir hepatitidy B a pod.), novorozenecká sepse a pod. Identifikovatelné indikace nemocí zahrnujících nedostatečnou autoimunní složku IgG se neustále rozšiřují, významné mezi nimi jsou idiopatická trombocytopenická purpura (ITP), přispívající k destrukci krevních destiček, Kawasakiho syndrom a pod.

První poznatky týkající se přípravy a infuzí γ-globulinu se objevují ke konci čtyřicátých let a popisují známé způsoby trakčního dělení plazmatu podle Cohňová postupu (Cohn E. J.,

Strong L. E. a kol.: Separation into Fractions of the Protein and Lipoprotein Components, J. Am. Chem. Soc. 68, 459-475, 1946) nebo pozdější modifikace zavedené Kistlerem-Nitschmannem (Kistler P. a Nitschmann Hs.: Larg Scale Production of Human Plasma Fractions, Vox Sang. 7, 414-^424, 1962)). Dodatečné čistění zavedené Oncleyem (Oncley J. L, a kol., J. Am. Chem. Soc. 71, 541-550, 1949) vychází z materiálu meziproduktu získaného frakčním dělením plazmatu podle Cohna a dalo vznik známému způsobu podle Cohn-Oneleye, který stále používá pro obecné čistění γ-globulinu ethanol za chladu jako koncentrační médium, stejně jako předcházející způsoby, γ-globulin vyrobený podle kteréhokoliv předcházejícího způsobu vykazuje molekulární rozdělení s významným obsahem polymerizované nebo agregované formy, mající vysokou molekulární hmotnost, jak je určována při analýze postupem vysoce rozlišujícího gelu za použití kolony (HPLC). Původně kapalné výrobky získané tímto způsobem mají malou stabilitu, je pozorována opaliscence nebo zákal během skladování, rozkládání nebo polymerizace γ-globulínových molekul a snaha po snížení aktivity některých více nestálých protilátek, spontánní vznik antikomplementámí aktivity a pod.

-1 CZ 300413 B6

Problém dotýkající se terapeutického použití γ-globulinu intravenózní infuzí ustupuje do pozadí u prvních preparátů získaných podle Cohn-Oncleyova způsobu, včetně řady variant, které byly příčinou řady odmítavých reakcí (přecitlivělosti k některým bílkovinám) s velmi vysokým stupněm výskytu zvláště u pacientů s nedostatečnou přítomností γ-globulinu v krvi a kteří γ-globulin obdrželi (až do 90 % případů). Shora popsané reakce jsou spojené se sníženou vybavenosti pacientů komplementem při léčení tímto způsobem (Barandun S., a kol,, Vox Sang., 7, 157-174, 1962).

Bylo pozorováno, že γ-globulin připravený alkoholickým frakčním dělením, má význačnou ío schopnost spontánně vázat komplement, jako výsledek denaturace proteinu během způsobu výroby, a zvláště při vzniku γ-globulinových agregátů, které jsou příčinou vzniku forem s vysokou molekulární hmotností. Ty mohou působit jako komplexní antibody-antigeny se schopností volně zachytit komplement.

Oddělení γ-globulinových agregátů obvyklými technikami, buď ultracentrifugou, nebo vylučovací chromatografií (permeací gelu), umožní získat výrobek s malou anti-komplementámí aktivitou, tolerovatelnou při intravenózním podávání (Barandun a kol., viz nahoře). V každém případě však není možno techniku s ultracentrifugou nebo permeací v gelu využít ve velkém měřítku a průmyslově pro zpracování γ-globulinu v množství několika kilogramů (a ani ne v měřítku hmotnosti v gramech v případě použití ultracen tri fugy).

Na druhé straně při příprava γ-globulinu za použití alkoholického frakčního dělení, když byly odstraněny agregované složky s vysokou molekulární hmotností, se může snadno obnovit antikomplementámí aktivita při konečném postupu zpracování (při sterilizaci, lyofílizaci), nebo během skladování (v kapalné formě),

K zamezení vážných stinných stránek klasického způsobu výroby Cohn-Oncleyovou metodu precipitace s ethanolem (nebo variant těchto způsobů), je v dosavadním stavu využívána substituce nebo se vsunutí další přídavné kroky, aby se zvětšila stabilita a tolerance výrobku pro jeho intravenózn í použití.

Polson a kol., (Polson A. a kol., Biochim, Biophys. Acta 82, 463^175, 1964) popisuje způsob frakčního dělení humánního plazmatu prostřednictvím ethylenglykolových polymerů, a tímto způsobem je možné oddělit čistou frakci γ-globulinu. Coval L. (patenty US 4 093 606 a

US 4 165 370, s prioritou od 1976 a 1978) navrhují polyethylenglykol (PEG) jako čisticí činidlo při výrobě intravenózního γ-globulinu a vycházejí z materiálu odděleného Cohňovým frakčním dělením (frakce II nebo II + III). Následně byly zveřejněny způsoby čistění využívající polyethylenglykol, jak je popisuje Uemura Y. a kol., (španělský patent 506 679, využitelný od 1981), nebo podobný, pouze stím rozdílem, že je výhodná pasterizace materiálu obsahujícího γ-globu40 lin před nebo při čištění polyethylenglykolem, uváděný rovněž Uemurou Y a kol. (patent EP 0 246 579, od 1986). Uváděné jsou rovněž chemické způsoby inaktivace virů organickými rozpouštědly nebo detergenty, které jsou velmi účinné proti virům s lipidickým povlakem, a které byly využity pro proteiny odvozené z humánního plazmatu podle Neuratha a kol. (patent US 514 375).

Jsou popisované i další způsoby výroby γ-globulinu přijatelného pro intravenózní podávání, které využívají úpravu s enzymy, pepsinem (španělský patent 86 115 016 a francouzský patent 2382 M), plasminem (německý patent DE 2 752 694), imobilizujícím trypsinem (španělský patent P 0 530 592), nebo ošetření v moderujícím kyselém pH (Acta Chemica Scandinavica 22,

490-496, 1968, Barandun S. a kol., viz shora).

Jiné způsoby výroby γ-globulinu, který lze tolerovat pro intravenózní podávání jsou založeny na chemické a částečně modifikující úpravě molekul IgG během jejich úpravy redukujícími činidly (Wiederman a kol., Proč. Soc. Exp. Biol. Med. 113, 609-613, 1963), zpracování alkoholizací

-2CZ 300413 B6 (španělský patent 412 552), alky lácí (španělský patent 0 533 908), a sulfonací (Yamaka T. a kol., Vox Sang. 37, 14-20, 1979).

Dále jsou popisovány způsoby výroby využívající výměnnou chromatografii, eliminující nežá5 doučí znečiŠtěniny z výchozího materiálu použitého pro získávání γ-globulinu (patent US 3 869 436, španělský patent 518 181, EP 91 300 790 a WO 94/29 334). Samo Μ. E. a kol. (patent EP 0 440 483) popisuje kombinaci technik vhodných k usnadnění výroby intravenózně přijatelného výrobku, založených na iontové výměnné chromatografii a diafiltraci ve slabě kyselém pH.

Konečná formulace výroby je zvláště důležitá pro odpovídající stabilizaci výrobku. Byl zveřejněn lyofilní způsob výroby, zprvu v oboru přijatelný, pokud vykazoval minimální změny během skladování. Složení lyofilního výrobku přijatelného pro intravenózní podávání a popisovaného v literatuře, vykazuje odolnost proti denaturaci γ-globulinu, především při lyofilním zpracování (španělský patent 525 246), a využívá ktomu účelu uhlohydráty, polyoly, glykol nebo jejich deriváty, aminokyseliny a rovněž přítomnost sérového albuminu.

Nedávno byly popsány stabilní kapalné formulace využívající uhlohydráty ve vodném prostředí, při velmi malé iontové síle a při pH 4,25 (patent US 4 396 608), nebo ve slabě kyselém pH 5 až 6 (patent EP 0 278 422).

Z toho důvodu podle popisované situace v oboru, γ-globulin, který je tč. na trhu, náleží k jedné ze tří následujících skupin, které se v zásadě liší svým způsobem výroby:

první generace, vyrobená enzymatickými způsoby (pepsin, trypsin, plasmin a pod.) druhá generace, chemicky modifikovaná (redukce, sulfonace, alkylace, úprava s β-propiolaktonem a pod.) třetí generace, odpovídající nedotčené molekule IgG (diafiltrace při nízkém pH, ehromatografíe, precipitace s polyethylenglykolem, příprava za kyselého pH a při nízké iontové síle).

Intravenózní podávání běžných vyráběných preparátů nevyvolává vážné intoleranční reakce, ačkoliv každý z nich má určité terapeutické stinné stránky, pozůstávající v obtížích nebo v kontra indikacích. Tak enzymaticky zpracovaný výrobek má kratší střední poločas životnosti in vitro (asi 8 dnů), zatím co normální γ-globulinu G (20 až 25 dní), má nulovou opsonizační schopnost (nepřítomnost Fc fragmentů) a může vykazovat fragmentace a velmi omezené množ35 ství podtříd IgG 3 a IgG 4.

γ-globuliny vyrobené chemickými modifikacemi mají střední poloviční dobu životnosti in vitro (10 až 15 dnů), kratší než fyziologické, zachovávají opsonizační kapacitu a molekulární integritu, ale v závislosti na úpravě trpí sníženou bakteriolytickou kapacitou a vytváří nové antigenové determinanty (při zpracování s β-propiolaktonem).

Zcela nedávno byl připraven neporušený γ-globulin způsobem zamezujícím denaturaci molekul IgG. V některých případech nově vyvinuté výrobní způsoby mohou být případně propojeny s frakčním dělením ethanolem, takže je např. možné jako výchozí materiál použít jednu z frakcí bohatých γ-globulinem, získanou způsobem podle Cohna, Cohn-Oncleye nebo KistlerNischmanna.

Na základě dnes popisovaných výrobních způsobů je pro výrobu neporušeného IgG, lhostejné, jeli vyroben moderovanou úpravou v kyselém pH, diafiltraci v kyselém pH, stabilizací molekul so IgG při nízké iontové síle a pH 4,25. Těmito způsoby je možné volitelně redukovat množství agregovaných forem IgG (s vysokou molekulární hmotností polymerů a intermediámích oligomerů, až a do včetně dimerů) a zvětšit podíl monomemího IgG. Konečná kapalná formulace při pH 4,25 zamezuje reagregaci molekul IgG během skladování, který zůstává v roztoku stabilní

-3CZ 300413 B6 (ale jen při skladovací teplotě 2 až 8 °C s dostatečně nízkou hladinou anti-komplementámí aktivity.

Hlavním problémem při kapalinovém způsobu výroby výhradně v kyselém prostředí je reversi5 bilní inhibiční účinek na antikomplementámí aktivitu, který je vyvolán redukcí v prostředí s kyselým pH, tj. řečená aktivita se obnoví a znovu ustaví za podmínek pH v daném médiu při nebo v blízkosti fyziologických hodnot. Na druhé straně neškodnost intravenózní infuze velkých objemů γ-globuhnových preparátů vyrobených v takovém kyselém pH (pH 4,25) je skutečně sporná (u novorozeňat a pacientů s potížemi s ledvinami).

Při jiném způsobu čištění je používána kationtová a/nebo aniontová iontovýměníková pryskyřice, která se využívá při úpravě středních frakcí získaných Cohnovým nebo Cohn-Oncleyovým ethanolovým frakčním dělením (frakce II + III, nebo vhodněji frakce II). Takto čištěný γ-globulin může být kombinován s jedním z dříve uvedených kyselých postupů (střední, nebo podle vhodíš ného předpisu), nebo jiným ekvivalentním způsobem vhodným pro kapalné zpracování, jinak se uchovává stabilita v lyofilní formě.

Podle dřívějšího způsobu používané iontoměničové pryskyřice představují ligand silně aniontového typu (kvartemámí ethylammonium; QAE), a slabě aniontového typu (diethy lam inoethy 1;

DEAE), nebo silně kationtového typu (sulfopropyl; SP) a slabě kationtového typu (karboxymethyl; CM). Ligandy jsou kovalentně imobilizovány na nerozpustném nosiči nebo na matricích, které složení mohou být křemičitan (keramika), akrylát (polyakrylamidy, polystyren), uhlohydrát (celulóza, dextran, agaróza). V podstatě měniče na bázi dextranu (Sephadex od AmershamPharmacia) nebo na bázi agarózy (Sepharose, Amersham-Pharmacia) jsou nejvýkonnější a také nejpoužívanější. Mají ovšem i své nedostatky neodstraněné předcházejícími způsoby, především z toho důvodu, že je zapotřebí velké množství pryskyřice pro účinné oddělení kontaminujících proteinů ajejich zachycení s ohledem na zachování γ-globultnu a správného dělení podtříd, především IgG 4. Kompromisní situace vytvořená mezi čištěním (eliminací kontaminujících proteinů: IgA, IgM a jiných) a zachování IgG (IgG 4) závisí v tomto případě na příznivých vlastnos30 těch jedné nebo druhé strany, a proto se rovněž značně vzájemně liší různé druhy podávaného γglobulinu v účinnosti a v terapeutické kvalitě,

Frakčním dělením plazmatu prostřednictvím PEG nebo precipitací s PEG při použití střední frakce po frakčním dělení podle Cohna, nebo jejího ekvivalentu, jako jsou frakce II + III, je možné získat lyofilizovaný γ-globulin, který je možno podávat intravenózně, který však není dostatečně stabilní v kapalném stavu. Pokud se do přípravy zahrne pasterizační postup (před srážením s PEG), dojde k významnému molekulárnímu shlukování, a to i za přítomnosti stabilizátorů (jakým je např. sorbitol), patrně jako důsledek přítomnosti nestabilních proteinů. Protože však větší shluky musí být zcela eliminovány během následujícího postupového kroku, představuje to významné snížení výtěžnosti požadovaného výrobku. Pokud se však jako výchozí materiál použije významněji přečištěná frakce (frakce II nebo ekvivalentní), obsahující agregáty s vysokou molekulární hmotností, nebo agregáty vzniklé během pasterizace, není v podstatě možné je oddělit prostřednictvím PG za stanovených běžných a popisovaných technických podmínek. To značí koncentraci PEG v množství 4 až 5 % při pH 4 až 6 (Coval L. a kol. viz shora), a 4 až 10 %

PEG při pH 4,8 až 6,5 (Uemura Y. a kol., viz shora) což je platné výhradně tehdy, pokud γ-globulin je v přítomnosti jiných doprovázejících proteinů (přítomných např. ve frakci II + III), vhodných pro koprecipitaci společně s agregáty o vysoké molekulární hmotnosti.

Způsob podle předloženého vynálezu podstatně zlepšuje běžný způsob v daném oboru, protože prostřednictvím inovující kombinace výrobních kroků, prováděných za přesně stanovených podmínek popisovaných v předloženém vynálezu, je výsledný výrobek γ-globulinu skutečně prostý stanovitelných znečisťujících proteinů, i za použití nej citlivější analytické techniky, bez kompromisů v ohledu na molekulární celistvost nebo vznik a rozdělení podtříd IgG, a tím je rovněž zachována malá schopnost spontánního uchycení komplementu.

-4CZ 300413 B6

Podstata vynálezu

Vynález se týká způsobu humánního γ-globulinu G inaktivováného viry, vyznačující se tím, že γ-globulin se získá extrakcí z frakce izolované frakčním dělením ethanolem za přítomnosti derivátu uhlovodíku, a po snížení obsahu znečisťujících látek za použití polyethylenglykolu se pro další zpracování použije kolona saniontovou iontoměničovou pryskyřicí, v jejímž odtoku se následně koncentrace polyethylenglykolu sníží ultrafiltrací a roztok se koncentruje pro následné vhodné zpracování při kyselém pH 4 až 4,5 a následně se použije nejméně jeden postup pro io inaktivaci virů, zahrnující pasterizaci a zpracování rozpouštědlem/detergentem, a výrobek je následně vysrážen a promýt polyethylenglykolem k eliminaci jakékoliv reagencie pro virovou inaktivaci a následně rozpuštěn a změnou pH na 7,5 až 8,5 zbaven znečisťujících proteinů a konečně vyčištěn ultrafiltrací, aby se snížil celkový objem a obsah polyethylenglykolu, pak se provede konečné vhodné odfiltrování virů a následně se koncentrace proteinů upraví ultrafiltrací na obsah 5 % nebo 10 %.

Maximální požadavek pracovního způsobu v popisovaném předloženém vynálezu je zajištění bezpečnosti výrobku v ohledu na potenciální riziko přenosu virů. Proto do výroby byly zavedeny způsoby pasterizace za přítomnosti cukrového alkoholu (např. sorbitolu) a/nebo rozpouštědla20 detergentu s tri-n-butylfosfátem (TnBP) a polysorbátem-80 (Tween-80) nebo ekvivalentních látek, které vytvářejí základní výrobní krok pro kontrolu virové inaktivity, a které jsou proto vysoce účinné a vzájemně se doplňující. K těmto výrobním krokům byl přidán viricidní způsob vhodného předcházejícího zpracování v kyselém prostředí, které eliminuje nebo zmenšuje množství přítomných virů, než se přistoupí ke konečnému základnímu inaktivačnímu postupu. Je rov25 něž možné pro roztok výrobku využít nanofiltraci k zadržení virů během kyselého pracovního postupu nebo vhodně diafiltraci základu před konečnou koncentrací a formulaci.

Kombinace předcházejících způsobů eliminace virů zajišťuje výrobek s maximální virovou bezpečností a přesahuje dřívější způsoby výroby s jednoduchou individuální inaktivaci virů, a popi30 sovaný způsob výroby je proti dosavadnímu průmyslovému stavu dokonalejší a výrobní kroky (výhodně do čtyř) podle předloženého vynálezu mohou být prováděny sousledně a v jednoduchém inaktivovaném prostoru nebo se stejným stupněm bezpečnosti.

Přihlašovatelé vynálezu ke svému překvapení zjistili, že při použití středního frakčního materiálu po Cohnově alkoholickém frakčním dělení (vhodně frakce II + III), je výhodné extrahovat v podstatě veškerý γ-globulin za přítomnosti uhlohydrátu (výhodně cukrového alkoholu), za nastavení vhodných extrakčních podmínek pro IgG, jako je objem ředění, pH a iontovou sílu, a oddělit větší podíl doprovázejících proteinů precipitací PEG. Výsledný procházející roztok (filtrát) je kapalina zbavená částic a koloidů, má výhodný vysoký následný adsorpční koeficient na iontoměničové koloně, a vycházející roztok je v podstatě zbavený všech nežádoucích kontaminujících látek (IgA, AgM, proteolytických enzymů a pod.), aniž by se vytvářel jakýkoliv kompromis mezi IgG nebo v rozdělení podtříd.

Ještě překvapivěji podavatelé vynálezu ukazují, že ve vysoce Čistém odtoku z kolony a za speci45 fických podmínek podle vynálezu bylo možné velmi výhodně snížit obsah zbytkového PEG a přítomného ethanolu při ultrafiltrací a koncentrovat protein podle potřeby. Následně jsou dovoleny všechny postupy pro virovou inaktivaci (výhodně ošetřen za kyselého pH, pasterizace, rozpouštědlo/detergent) ve společném sledu a bez vzniku význačného znečistění (dokazující nepřítomnosti vzniku částic nebo koloidů), ani vznik agregátů (jedině 1 až 2 % rozpustných polymerů s vysokou molekulární hmotností). Snížený obsah polymerů je přijatelný za přítomnosti uhlohydrátu (mezi jinými složkami), které stabilizují roztok během všech výrobních kroků předcházejících pasterizaci.

Vynálezci dále s překvapením zjistili, že odlišný způsob od dříve popisovaných postupů pro eli55 minaci nebo snížení obsahu reagencí pro virovou inaktivaci přidáním pracovního kroku využíva-5 CZ 300413 B6 jící rozpouštědlo/detergent, doplněný k předcházejícímu výrobnímu kroku a založeném na vysrážení γ—gl obul inu za použití PEG a zachování zředění chemických činidel v roztoku při nízké teplotě, napomáhá ke snížení obsahu my cel. Pak, při zachycení precipitátu při mikrofiltraci s tangenciálním tokem a okamžitým následným promytím zachyceného materiálu je možné zrní5 něná chemická činidla zcela odstranit. Precipitát byl rozpuštěn přímo ve stejném zařízení pro mikrofiltraci přivedením do styku s vhodným roztokem a bez potřeby další fyzikální manipulace.

Roztok získaný uvedeným způsobem v důsledku obsahu i jen 1 až 2 % polymerů, nebyl považován za přijatelný pro intravenózní podávání. Vynálezci zjistili s překvapením, že vhodným způio sobem zředění předcházejícího rozpuštěného precipitátu, je možné dosáhnout specifickou koncentrací PEG a uhlohydrátů (dříve přidaných), a že v roztoku obsažené agregáty s vyšší molekulární hmotností jsou nerozpustné ve specifickém rozsahu pH, a jsou zcela odstraněny od velké většiny monomerů a dimerů v roztoku. Bylo zjištěno, že koncentrace uhlohydrátů (přednostně cukrového alkoholu) a také koncentrace PEG jsou rozhodující pro zamezení koprecipitace monomerů/dimerů IgG a pro uchování maxima IgG v roztoku. Vytvořený precipitát je možné snadno oddělit tangenciální mikrofiltraci nebo obvyklou filtrací. Konečně výsledný filtrát, zbavený agregátů, diafiltrovaný nebo ultrafiltrovaný za aktuálních výrobních podmínek, které tvoří součást předloženého vynálezu, představuje výrobek, který je možné úspěšně filtroval membránami zadržujícími viry a konečně koncentrovat (na roztok s 5 až 10 % γ-globulinu) za nepřítom20 nosti, nebo jen s velmi malým obsahem chemických činidel, které byly použity během výrobního postupu.

Způsob podle předloženého vynálezu převyšuje současný stav v oboru odstraněním obvyklých nedostatků γ-globulinu, který se v současné době nachází v obchodě. Takto vyrobený γ-globulin (s 10% koncentrací IgG) v podstatě neobsahuje (nebo nemohou být dokázány): agregované polymery s vysokou molekulární hmotností (monomery + dimery > 99 %, a výhodně > 99,9 %); různé znečisťující proteiny v γ-globulinu; IgA (< 0,003 mg/ml); IgM (< 0,002 mg/ml); PKA (< 2,77 IU/ml) a kalikrein; plasmin a plasminogen; albumin; tri-n-butylfosfát (< 3,6 ppm); polysorbát 80 (< 50 ppm); PEG-4000 (< 500 ppm). Má vysoký obsah více labilních podtříd IgG 3 a

IgG 4, a dostatečnou molekulární čistotu (fragment Fc > 100 %), s nízkou kapacitou pro spontánní aktivaci komplementu (ACA < 1 CH 50/mg proteinu). Kapalná formulace se sorbitolem je stabilní na nejméně dva roky, jak při 2 až 8 °C, tak do 25 °C. Společně s výbornou charakteristikou výrobku je zajištěna maximální bezpečnost v ohledu na riziko přenosu virů plazmovými deriváty, spočívající v potenciální inaktivační kapacitě provedené za použití rozpouštědla, deter35 gen tu, pasterizace, výhodné inkubace v kyselém prostředí a výhodným odfiltrováním virů (nanofiltrace), a dále rovněž výrobními kroky, které přispívají ke snížení virové zátěže (precipitace s ethanolem, precipitace s PEG, adsorpce nabitými ionty a pod.). Na druhé straně je třeba také poukázat na to, že celý výrobní postup může být proveden v čase kratším než je 5 dnů při využití vhodné instalace a konečný výtěžek IgG přesahuje 4,5 g z jednoho litru výchozího plazmatu.

Způsob podle předloženého vynálezu je v následujícím detailně vyložen.

Při provádění popisovaného způsobu se vychází z precipitátu bohatého na IgG, který se získá ethanolovým frakčním dělením humánního plazmatu, přednostně z frakce II + III podle Cohnova postupu. Každý kilogram zmíněného precipitátu se suspenduje ve vodném roztoku, výhodně v množství od 5 do 25 kg roztoku, který obsahuje uhlohydráty, přednostně cukrový alkohol, nejvýhodněji sorbitol v množství mezi 2 až 10 hmotn./obj. %. Jako pufr pH se výhodně použijí fosfátové nebo acetátové ionty takové koncentrace, aby pH vodné suspenze frakcí II + III bylo mezi

4,8 a 5,8, a vodivost nepřestoupila 2 mS/cm. Po minimálním čase míchání, který je vhodně delší než 1 h, se většina extrahovaných globulinů doprovázejících IgG vysráží s PEG s nominální molekulární hmotností 4000, v koncentračním rozsahu od 2,5 do 5,5 hmotn. % při vhodné teplotě od 2 do 8 °C. Následně se okamžitě, a před pokračováním postupu precipitace, vhodně přidá adsorbent lipidů a lipoproteinů, jako jsou např. bentoniny a současně vhodná přísada usnadňující filtrací, jako např. Hyflo-supercel nebo Celíte (obojí obchodováno J. Manvillem) nebo ekviva-6CZ 300413 B6 lentní látka, aby se usnadnila filtrovatelnost suspenze. Vytvořený precipitát se vhodně zadrží tlakovou filtraci za použití jemného celulózového filtračního listu nebo filtrační patrony (stupeň 50 SA, Cuno Brand, nebo KS-80 nebo K-200, výrobek Seitz, nebo ekvivalenty), aby získaný filtrát vykazoval menší zakalení než 5 NTU (nefelometrických turbidimetrických jednotek),

Výhodné je precipitát oddělit kombinovaně odstředěním a filtrací. Pokud se precipitát získá filtrací, promyje se vhodným roztokem upraveným na takovou koncentraci PEG, fosfátových a acetátových iontů a pH ekvivalentní podmínkám nastavením při precipitaci, čímž se usnadní vyšší výtěžnost IgG.

io pH získaného filtrátu se upraví na hodnotu mezi 5,7 a 6,3, vhodně přísadou zředěného roztoku hydroxidu sodného a převede se na vyěeření do iontoměniěové kolony.

lontoměničová kolona obsahuje pryskyřici s aniontovým ligandem, výhodně diethy lam inoethylového typu (DEAE), kteiým je napojena nerozpustná matrice zagarózy nebo vhodně DEAE15 agarózy, která je obchodně známá jako Sepharose, především takového druhu, který má vysokou dynamickou kapacitu (FF nebo rychlý tok). Výhodná je kolona s radiálním distribučním tokem, vhodně s délkou (nebo výškou lože) mezi 8 až 15 cm. Průtoková rychlost filtrátu v koloně s vhodnou pryskyřicí se vhodně nastaví na takovou hodnotu, aby kolonou prošel za hodinu asi čtyřnásobný objem kolony s pryskyřicí, a dávkuje se do vyčerpání roztoku, tj. až vnesené množ20 ství úměrné počátečnímu výchozímu materiálu (vhodně frakce II + III), je vhodně mezi 1 až 2,5 g na 1 ml pryskyřice. Když je dávkování roztoku skončeno, kolona se s výhodou promyje 2,5 až

4,5 násobným množstvím objemu kolony roztokem se stejnou iontovou silou a stejným pH, jakou má dávkovaný roztok.

Kapalný odtok z kolony během dávkování do kolony a promývání nebo vycházející z kolony (neadsorbovaná frakce) se ultrafiltruje s cílem snížit koncentraci PEG a získat vhodnou koncentraci proteinu k provedení následných výrobních kroků virové inaktivace. Výhodná ultrafiltrační membrána má 100 kDa nominální molekulární hranu, a je výhodně tvořena polysulfonem (nebo jeho deriváty), obchodní značky Millipore nebo Pall-Filtron. Předem se pH roztoku nastaví na hodnotu mezi 5,0 a 5,5 přísadou slabé kyseliny (např. zředěnou kyselinou octovou) a zpracuje se při teplotě 2 až 8 °C filtrací při membránovém přetlaku vhodně mezi 0,15 až 0,2 MPa, Po zmenšení objemu, výhodně na polovinu původního objemu, se vhodně provede diafiltrace do konstantního objemu, s výhodou za použití 1 až 3 objemů vody pro injekce. Pak se pH roztoku přídavkem minerální kyseliny nastaví na 4,0 až 4,8, výhodně na hodnotu 4,2 až 4,6, Membránový přetlak se upraví na hodnotu pod 1,2 bar a vhodně mezi 0,05 MPa a 0,1 MPa a vhodná koncentrace se dosáhne prostřednictvím snížení běžného objemu na jednu polovinu. Provede se diafiltrace, vhodně za přísady ne méně než 3 objemů roztoku, který obsahuje cukrový alkohol, výhodně sorbitol, v koncentraci mezi 2 a 10 hmotn./obj. % za pH nastaveného kyselinou octovou na hodnotou 4 až 5. Konečně se koncentrace proteinu převede na požadovaný objem, vhodně na optic40 kou hustotu (při 28 nm) vyšší než 45 AU (absorpční jednotky). Následně se roztok sterilizuje filtrací, vhodně za použití absolutní membrány o velikosti pórů 0,22 μ. Výhodně se pak roztok sterilizuje a stabilizuje (cukrovým alkoholem pocházejícím z diafiltračního roztoku), a roztok může být uchováván po dlouhý čas při teplotě 2 až 8 °C.

Během doby zpracování se roztok ochladí na 2 až 8 °C a pH se upraví na hodnotu mezi 3,75 a

4,25 pomalým přidáváním minerální kyseliny při teplotě 2 až 8 °C. Vhodně se roztok s upraveným pH inkubuje při 2 až 40 °C po 0,5 až 48 h, výhodněji při pH mezi 3,95 a 4,05 mezi 35 a 38 °C po dobu 1 až 4 h, za přítomnosti cukrového alkoholu, výhodně sorbitolu, s koncentraci 2 až 10 hmotn ./obj. %, přidaném dříve během diafiltrace. Je rovněž vhodné během úpravy na kyselé pH např. filtrovat viry z roztoku skrze nanometrickou porézní membránu, výhodně s velikostí pórů mezi 15 a 50 nm, jako jsou např. 50 nm filtr (DV50, výrobce Pall), 35 nm (BMM-Planova 35N, výrobce Asahi), 20 nm (DV20, výrobce Pall), 15 nm (BMM-Planova 15 N, výrobce Asahi) nebo jinou membránou s odpovídající velikostí pórů.

-7CZ 300413 B6

Když je dokončen vhodný výrobní postup s úpravou pH, teplota se upraví na 2 až 8 °C a roztok se zalkalizuje přísadou silné zásady, až pH dosáhne hodnotu mezi 4,7 a 5,2. Okamžitě se následně přidá uhlohydrát jako stabilizátor, výhodně cukrový alkohol, nejvýhodněji sorbitol, na konečnou koncentraci mezi 25 až 35 hmotn. %. Pasterizace se provede při teplotě 60 až 62 °C po dobu

10 až 12 h, výhodně v obou případech.

Pak se roztok zředí vodou na injekce do koncentrace uhlohydrátu, nebo vhodně koncentrace cukrového alkoholu pod 25 hmotn. %, aby koncentrace proteinu byla mezi 1 a 3 hmotn./obj. %. Když se roztok ochladí na teplotu místnosti, přidá se koncentrovaný roztok směsi rozpouštědlo la/detergentu, pozůstávající přednostně z alkylfosfátových reagencií a neiontového detergentu, výhodněji z tri—n-butylfosfátu a polysorbátu-80, tak, aby konečná koncentrace dosáhla 0,3 a hmotn./obj. % obou reagencií. Provede se inkubace při teplotě 24 až 28 °C po dobu 4 a 8 h, vhodně v obou případech. (Virově inaktivovaný roztok představuje nyní exkluzivně bezpečné virové prostředí pro inaktivované výrobky, se kterými se provádějí zbývající výrobní postupy).

Roztok se následně zředí studenou vodou pro injekce, výhodně přidáním 1 a 2 kg vody na každý 1 kg roztoku, a pak se vysráží veškerý přítomný protein přísadou dostatečného množství PEG (výhodně s molekulární hmotností 4000), roztok se upraví na konečnou koncentraci mezi 12 a 17 hmotn. % PEG a pH se nastaví na hodnotu mezi 7,0 a 9,0, výhodně na hodnotu mezi 7,8 a 8,4, při vhodné teplotě 2 až 8 °C. Po provedení důkladné homogenizace, výhodně po delší dobu než 1 h (míchání) a po vhodném ustání se provede sběr precipitátu výhodně za použití zařízení, které obsahuje membránu pro průtokovou tangenciální filtraci (TFF). Filtrovaná kapalina obsahuje kromě jiných složek inaktivační reagencií použitou pro předcházející krok výrobního postupu, využívající rozpouštědlo/detergent. Membrána pro výhodnou tangenciální filtraci je připravena z polyvinylidenfluoridu (PVDF) značky Millipore (zařízení Prostak nebo ekvivalentní model). Namísto PVDF mohou být s výhodou použity i jiné materiály slučitelné s reagenciemi, které jsou obsaženy v roztoku, jako polysulton. Velikost pórů filtrační membrány je volena výhodně mezi 0,1 a 0,45 μ. Oddělení filtrátu se provede při membránovém přetlaku pod 0,15 MPa.

Když byl snížen objem původní suspenze výhodně 4 až 8krát, počne se s promýváním za přidání konstantního objemu roztoku obsahujícího PEG, výhodně o stejné koncentraci, jaká byla předem použita při precipitaci a výhodně se stejným obsahem uhlovodíku použitém při pasterizaci, výhodně s cukrovým alkoholem, vhodně o koncentraci mezi 5 a 20 hmotn. %. Po vhodném použití 4 a 6 objemů shora uvedeného promývacího roztoku je zbytek rozpuštěn v kyselém roztoku při pH pod 5,5, který výhodně obsahuje stejný uhlohydrát použitý v předcházejícím výrobním stupni. Roztok se výhodně upraví roztokem kyseliny octové 1 mM a 10 mM, ke kterému je přidán cukrový alkohol na koncentraci vhodně mezi 5 a 20 hmotn. %, a pH se nastaví alkálií na 4,0 až 4,5. Teplota roztoku nemá překročit 37 °C a je vhodně volena mezi 0 a 8 °C. Přidá se takové množství kyselého roztoku pro rozpuštění, které odpovídá 2,5 a 4,5 násobnému množství zbylé suspenze. Tímto způsobem se konečná koncentrace PEG pohybuje mezi 2 a 4 hmotn. % a výhodně mezi 2,8 a 3,4 hmotn. %, koncentrace cukrového alkoholu výhodně mezi 5 a 20 hmotn. %. Rozpouštěcí roztok se recirkuluje se zbylým precipitátem, dokud se plně nerozpustí.

pH rozpuštěného výrobku se upraví na hodnotu mezi 7,5 a 8,5, výhodně na hodnotu mezi 7,8 a

8,3, přísadou zředěného alkalického hydroxidu nebo přijatelnou slabou zásadou při zachování teploty 2 až 8 °C. Po homogenizaci může být vytvořený precipitát výhodně oddělen stejným zařízením TFF, jaké bylo použito před tím, filtrát se uchová pro jiný zajímavý výrobek. Při jiném způsobu pracovního postupu může být zařízení TFF nahrazeno odpovídajícím membránovým filtrem, filtrační deskou nebo mnohovrstvou hlubokou filtrační patronou.

pH získaného filtrátu, ve kterém nejsou obsaženy agregáty s vysokou molekulární hmotností, a ve kterém je rovněž obsažen větší podíl reagencií z předcházejícího zpracování, tj. rozpouštědlo/detergent, se upraví na hodnotu vhodně mezi 5 a 6 přidáním zředěné kyseliny.

-8CZ 300413 B6

Roztok se ultrafiltruje s cílem snížení obsahu PEG a jiných složek s nízkou molekulární hmotností a získá se protein o vhodné koncentraci pro přípravu výrobku podle konečného předpisu. Upřednostňovaná ultrafíltrační membrána má 100 kDa nominální molekulární hrany a je vhodně upravena polysulfonem (nebo jeho deriváty), komerční značky Millipore a Pall-Filtron, Ultrafil5 trace se začíná s počátečním přetlakem na membráně výhodně mezi 0,15 a 0,2 MPa. Po snížení objemu, vhodně na 1/2 až 1/3 původního objemu, se výhodně provede diafiltrace do konstantního objemu, výhodně za použití 1 objemu vody pro injekce. Pak se pH roztoku nastaví na hodnotu 4,0 až 4,8 a výhodně na hodnotu mezi 4,2 a 4,6 přísadou zředěné minerální kyseliny. Přetlak na membráně se nastaví na hodnotu pod 0,12 MPa, výhodně mezi 0,05 a 0,1 MPa, a roztok se konio centruje opět za snížení běžného objemu na 1/2 až 1/3 počátečního objemu. Diafiltrace se výhodně provádí za přidání ne méně než 5 objemů roztoku, který obsahuje cukrový alkohol, výhodně sorbitol, o koncentraci mezi 2 a 10 hmotn./obj. % a hodnotou pH nastavenou na 4 až 5 pomocí kyseliny octové. Předcházející roztok, diafiltrovaný a výhodně koncentrovaný na obsah 1 až 3 hmotn./obj. % proteinu, jehož pH se nastaví na hodnotu mezi 4,4 a 5,0, je-li to nutné, se vhodně zahřeje na 25 ± 5 °C. Následně se provede vhodná filtrace virů se zadrženou membránou s nanometr i ckými póry o nominální velikosti rovné nebo menší než 50 nm, výhodně přibližně 20 nm (DV20, značka Pall) a zadrží se protein v množství více než 90 % s výtěžnost více než 1 kg protein u/m² filtrační plochy v kratším výrobním čase než 25 h, nebo vhodně podobným filtrem s póry o velikosti v rozsahu mezi 15 a 20 nm nominálně (BMM-Planova 15N nebo P21, obojí značky Asahi; VNF „Parvo“, Millipore) s výtěžností proteinu větší než 80 %.

Konečně se protein koncentruje ultrafiltrací s membránou o 100 kDa nebo menší nominální molekulární hranou, až do požadované hodnoty, výhodně do konečné optické hustoty (při 280 nm) přibližně 75 AU, aby se získal koncentrace IgG o 5 %, nebo kolem 150 AU pro koncent25 raci 10%.

Diafiltrovaný roztok vhodně upravený na požadovanou koncentraci stabilizátoru (cukrového alkoholu) a pH upraveným na hodnotu 5 až 6 se čeří hloubkovým filtrem (stupeň 90LA, značka Cuno nebo ekvivalent). Sterilizuje se absolutní filtrací za použití membrány 0,22 μ a pak se dozuje do skleněných nádobek. Výrobek dosahuje minimální dobu záruky 15 dnů při 25 °C, roztok zůstává průsvitný a neobsahuje viditelné částice. Výrobek je stabilní při teplotách 2 až 8 °C až do 25 °C.

Příklady provedení vynálezu

V následujícím jsou uváděny některé příklady, které však v ničem neomezují informace popisované ve vynálezu.

Příklad 1

90,9 kg pasty frakce II + ΠΙ (šarže č. 9003; ekvivalent 1490,9 1 výchozího plazmatu) připravené Cohnovým frakčním způsobem, se suspenduje v 1323 kg extrakčního roztoku, který obsahuje

5 mM fosfátu disodného a 5 hmotn./obj. % sorbitolu, a má hodnotu pH nastavenou na 4,83 přísadou 23,0 litru 0,5 M kyseliny octové. Po jednohodinovém míchání a po nastavení pH suspenze na hodnotu 5,05 přísadou 1,4 litru 0,5 M kyseliny octové bylo mícháno po další 2 h při teplotě 2 až 6 °C. Bylo zjištěno, že se pH suspenze nezměnilo a vodivost byla 1,05 mS/cm. Pak, za dostačujícího míchání, bylo přidáno 135,5 kg roztoku PEG—4000 (50%). Následně okamžitě byl přidán bentonit (3600 g) a pH znovu nastaveno na hodnotu 5,03 přidáním 2 litrů 0,5 M kyseliny octové, a celý roztok byl ponechán v klidu k precipitaci po 4 h. Těsně před oddělením přecipitátu filtrací byl za míchání přidán Hyflo-supercel v množství 32,5g na každý kg suspenze a směs byla okamžitě filtrována zahloubenou filtrační deskou (značka Cuno, stupeň 50 SA) za použití tlakového filtračního zařízení vhodného pro zachycení precipitátu. Na jedné straně bylo celkem získáno

1768 kg filtrované kapaliny, která byla transparentní a slabě nažloutlá, s optickou hustotou 8,38

-9CZ 300413 B6

AU (při 280 nm) a zákalem o hodnotě 2,7 NTU. Na druhé straně bylo získáno 188,3 kg precipitátu, který byl odložen.

pH uvedeného předcházejícího filtrovaného roztoku bylo upraveno na hodnotu 5,92 přísadou

8 000 ml 0,5 M hydroxidu sodného, vodivost výsledného roztoku byla 1,113 mS/cm.

Předem byla připravena iontoměničová kolona s radiálním tokem (zn. Sepragen), která obsahovala 50 litrů piyskyrice DEAE-Sepharose FF (od Amersham-Pharmacia), umístěné radiálně s tloušťkou lože kolem 10 až 12 cm. Kolona byla uvedena do rovnovážného stavu roztokem io octanu sodného a kyseliny octové a iontovou silou a pH upraveno na ekvivalentní roztoku s výrobkem. Roztok s výrobkem byl pak dávkován do kolony za současné filtrace během dávkování, s takovou rychlostí průtoku, aby celý postup trval 12 h a 18 min. Konečně byla kolona promyta 180 kg rovnovážného roztoku. Celkový výtok z kolony (neadsorbovaná frakce) byl shromážděn a obsahoval v podstatě pouze IgG jako jedinou proteinovou složku, měl hodnotu pH

5,99, vodivost 1,081 mS/cm, zákal o 2,4 NTU a optickou hustotu 6,95 AU (při 280 nm).

pH roztoku bylo nastaveno na hodnotu 5,19 přísadou 13 litrů 0,5 M roztoku kyseliny octové a roztok byl koncentrován na 1030 kg membránovou ultrafiltrací s membránovou hranou 100 kDa, značky Biomax A-2 (od Millipore) a za membránového přetlaku 0,195 a 0,220 MPa při teplotě kolem 4 °C. Optická hustota filtrátu byla < 0,150 AU (při 280 nm) a filtrát byl odložen. Okamžitě následně byla provedena diafiltrace při konstantním objemu 2054 kg vodou pro injekce, při čemž konečná vodivost získaného roztoku zůstala na hodnotě 0,164 mS/cm. Pak, bez zastavení ultrafiltrace, bylo pH nastaveno na hodnotu 4,26 přísadou chladné 0,2 M kyseliny chlorovodíkové a s diafiltrací bylo pokračováno do konstantního objemu, v tomto případě 3833 kg roztoku sorbi25 tolu s 5 hmotn. % a roztokem 2 mM kyseliny octové bylo pH nastaveno na 4,12 a membránový přetlak byl 0,105 až 0,110 MPa a teplota asi 4°C. Konečně byl zbytek koncentrován, dokud optická hustota nedosáhla hodnoty 72,7 AU (při 250 nm). Pak bylo zařízení promyto diafiItračním roztokem tak, aby bylo získáno 233,5 kg vložené hmoty s optickou hustotou 55,5 AU (při 280 nm), a následovala sterilizace filtrací membránou s póry 0,22 μ (typ CVGL od Millipore).

pH sterilizovaného roztoku ochlazeného na 6,0 °C bylo nastaveno na hodnotu 4,00 pomalým přidáváním chladného roztoku 0,2 M kyseliny chlorovodíkové při neustálém sledování hodnoty pH. Následně byl roztok se základní hmotou v nádobě se zahřívacím pláštěm a za intenzivního míchání rychle ohřát na teplotu 36,5 až 37,3 °C a tato teplota udržována po 4 h.

Po ukončení tohoto výrobního kroku byl roztok ochlazen a stabilizován přísadou 114,3 kg pevného sorbitolu za míchání, až se sorbitol zcela rozpustil. pH roztoku bylo upraveno na 4,85 pomalou přísadou 7000 ml chladného 0,2 M roztoku hydroxidu sodného. Bylo tak získáno

388,8 kg roztoku se zákalem 1,41 NTU a optickou hustotou 36,0 AU (při 282 mM). Zmíněný roztok byl okamžitě pasterizován při teplotě mezi 60,1 a 60,7 °C po dobu přesně 10 h.

Následně byl roztok ochlazen a zředěn přísadou 131 kg chladné vody pro injekce a byla stanovena hodnota optické hustoty na 27,5 AU (při 280 nm). K 507 kg zpracovávaného zředěného roztoku bylo přidáno 51,2 kg koncentrovaného roztoku SD, vytvořeného tri-n-butyl fosfátem o kon45 centraci 3 hmotn./obj. % a polysorbátu-80 (Tween-80) s 10 hmotn. % a provedena inkubace po dobu přesně 6 h při teplotě 25,8 a 26,4 °C,

Roztok zpracovaný s SD byl zředěn 841,5 kg chladné vody pro injekce a pH bylo nastaveno na hodnotu 8,05 přidáním 4200 ml 0,5 M roztoku hydroxidu sodného. Následně bylo za stalého míchání pomalu přidáváno 654,3 kg PEG-4000 v 50% roztoku a výsledný roztok ponechán v klidu k precipitaci při teplotě 2,6 až 3,8 °C,

2065 kg předcházející suspenze precipitátu s PEG bylo koncentrováno na 400 kg v mikrofiltračním zařízení s tangenciálním tokem (TFF), za použití membránového filtru s póry

0,22 μ (typ Prostak, od Millipore), za membránového přetlaku 0,01 až 0,03 MPa při teplotě 3,6

- 10CZ 300413 B6 až 5,0 °C. Suspenze zachyceného precipitátu na TFF byla promytá konstantním objemem 2000 kg roztoku obsahujícího 15 hmotn. % PEG a 8 hmotn. % sorbitolu a hodnotou pH nastavenou na 7,97.

Zadržená suspenze byla rozpuštěna v přidaných 1226 kg roztoku se 17 hmotn. % sorbitolu a 4 mM kyseliny octové a pH nastaveným na hodnotu 4,14 roztokem hydroxidu sodného. Roztok byl ponechán v recirkulačním styku se zařízením s TFF, dokud nedošlo k úplnému rozpuštění (25 min). pH roztoku bylo pak upraveno na 8,03 pomalým přidáváním 6500 ml roztoku 0,5 M hydroxidu sodného a asi po 15 minutách míchání bylo započato s filtrací na stejném zařízení io (TFF (s membránovým filtrem spory 0,22 μ) a IgG zachován ve filtrátu. Po shromáždění 1474 kg filtrátu, byla zbylá suspenze promytá roztokem se složením a s charakteristikou podobnou suspenzi a bylo získáno 1827 celkového filtrátu. Filtrovaný roztok měl optickou hustotu 5,66

AU (při 280 nm), zákal 1,99 NTU a vodivost 0,158 mS/cm.

pH roztoku bylo nastaveno na hodnotu 5,53 přísadou 3000 mí 0,5 M roztoku kyseliny octové a roztok koncentrován ultrafiltrací membránou s molekulární hranou 100 kDa (Omega serie Pall— Filtron) za membránového přetlaku mezi 0,175 a 0,195 MPa. Tím byl objem redukován na 739 kg. Diafiltrace byla prováděna na konstantní objem se 736 kg za použití vody pro injekce a následně upraveno pH pomocí 5 600 ml 0,2 M kyseliny chlorovodíkové na hodnotu 4,51. Pak byl membránový přetlak snížen na 0,06 až 0,09 MPa a vytěženo bylo 296 kg a znovu přistoupeno k diafiltrací na konstantní objem 2072 kg roztokem s 5 hmotn. % sorbitolu, jehož pH bylo upraveno roztokem 2 mM kyseliny octové na 4,16. Po spotřebě předcházejícího roztoku byla hodnota optické hustoty stanovena na 142,5AU a vyrobený roztok použit k přípravě dvou roztoků o koncentraci 5 a 10 % IgG. pH zmíněných roztoků bylo nastaveno na 5,25 a roztoky filtrovány zahloubenou filtrační deskou (zn. Cuno, stupeň 90 LA) a absolutní membránou s póry velikosti 0,22 μ (typ CVGL od Millipore) za současného odměřování do 10 ml, 50 ml, 100 ml a 200 ml skleněných lahviček. Výtěžek konečného výrobku nastavených roztoků, s ohledem na gramy IgG na litr počátečního plazmatu, byl 4,68.

Příklad 2

Bylo zpracováno několik šarží IVIG, přičemž se vždy vycházelo z 90 kg frakce II + III, způsobem popisovaným v předloženém vynálezu. Konečný výrobek (5 % IVIG v 50 ml violách) byl podroben důkladné analytické kontrole, aby se ověřilo složení a jakost výrobku. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 1.

Tabulka 1

Parametr	Č. zpracované šarže
	9002	9003	0001	0002	0003
Protein (%)	4,6	4,5	4,7	4,8	N
Zákal (NTU)	3,3	3,3	3,0	3,1	2,8
Sorbitol (%)	4,75	4,85	4,9	N	N
Čistota (%)	100	99,2	99,7	99,8	99,9
Polymer (%)	0	0	0	0	0
Frakce (%)	0	0	0	0	0
PEG (ppm)	164	311	224	N	N
Polysorbát (ppm)	<30	<30	34	<30	40
TNBP (ppm)	<3,6	<3,6	<3,6	<3,6	<3,6
PKA (lU/ml)	<2,8	<2,8	<2,8	<2,8	<2,8
ACA (CH 50/mg Ig)	0,68	0,76	0,75	0,66	0,63
IgA (mg/ml)	<0,003	<0,003	<0,003	<0,003	<0,003
IgM (mg/ml)	<0,002	<0,002	<0,002	<0,002	<0,002

N - nestanoveno

-11 CZ 300413 B6

Obsah proteinu byl stanoven Bradfordovou technikou za použití γ-globulinu jako kontroly. Intenzita zákalu byla měřena nefelometricky a kvantifikována pomocí kontrolního roztoku. Čistota γ-globulinu byla stanovena s přihlédnutím na celkové proteiny elektroforezí na celulózové acetátové desce zabarvením amidovou černí. Polymery (nebo molekulární agregáty vyšší než jsou dimery γ-globulinu) a proteinové frakce s nižší molekulovou hmotností byly stanoveny za použití HPLC na vylučovací koloně s gelem (kolona TSK G-3000 WS od Toyosody), rozdělovači koeficient molekulárních forem byl kvantifikován s ohledem na celkové množství nalezeného proteinu na základě optické hustoty stanovené při 280 nm. Obsah PEG byl stanoven metodou HPLC na filtrační koloně na gelu (kolona TSK G-3000 SWXL) za použití refrakčního indexního io detektoru. Koncentrace sorbitolu byla stanovena enzymatickým způsobem. Polysorbát-80 byl analyzován kolometrickým postupem a TNBP prostřednictvím plynové ehromatografie. Aktivátor prekalikrein (PKA) byl stanoven chromatografícky. Obsahy doprovázejících proteinů IgA a IgM byly urěeny imunonefelometrií. Aktivita antikomplementámích částic (ACA) byla stanovena způsobem podle Eur. Phar., založeném na stanovení zbytku komplementu po inkubaci za pří15 tomnosti nebo nepřítomnosti vzorku.

Příklad 3

Podle pracovního způsobu uvedeného v předloženém vynálezu je množství reagencií pro inaktivaci virů snižováno precipitací s PEG a promytím na zařízení TFF. Po řadě zkoušek byl navržen jednoduchý způsob, který dovoluje nepřímo kontrolovat koncentraci zmíněných reagencií během postupu využívajícího TFF. Způsob je založen na poznatku, že optická hustota filtrátu při 280 nm po zpracování prostřednictvím TFF závisí zásadně na koncentraci neiontového detergentů a na zbytku rozpustných proteinů, které odcházejí současně s filtrovanou kapalinou (PEG neabsorbuje v rozsahu 245 až 280 nm). Při odečtu při 245 nm se stanoví jen minimálnímu množství proteinů, protože při této vlnové délce je absorpce proteinu nízká, ale naopak u detergentů velmi vysoká (přibližně 14,5 krát vyšší než u proteinu v případě komerčního polysorbátu-80).

Tak na základě stanovení optické hustoty při 280 a 245 nm může být kontrolován postup procesu při TFF a tím je možné současně vhodně kontrolovat koncentraci a účinnost promývání na snižování obsahu SD. Na základě vyvinutého měřicího způsobu je možné kvantifikovat zbytek SD odpovídající způsobu vedení pracovního postupu u předcházejícího příkladu 1. Nalezené výsledky jsou sestaveny v tabulce 2.

- 12CZ 300413 B6

Tabulka 2

Postup TFF	Množství získaného výrobku (kg)	Optická hustota filtrátu (AU pří 280 nm)	Optická hustota filtrátu (AU při 280 nm)	Kvocient optické hustoty při 245/280 nm	% O. D. při 280 nm) podle SD ve filtrátu (1)	% zachyceného SD ve zbytku (2)
Výchozí koncentra- ce	2065	0,339	N	n.a.	n.a.	n.a.
Konečná koncentra- ce	400	0,346	4,72	13,6	94	95,94
1. promývací objem: 400 kg	400	0,156	1,82	11,6	80	36,81
2. promývací objem: 800 kg	400	0,080	0,790	9,87	68	16,05
3. promývací objem: 1 200 kg	400	0,046	0,345	7,6	52	7,06
4. promývací objem: 1 600 kg	400	0,050	0,190	3,8	26	3,83
5. promývací objem; 2 000 kg	400	0,030	0,137	4,5	31	2,74

O.D. - optická hustota, SD - rozpouštědlo/detergent 5 N = nestanoveno

n.a. = nepoužitelné (1) Hodnota optické hustoty v % (O.D.) při 280 nm, odpovídající obsahu SD, byla vypočtena na základě podílu optické hustoty (245 nm/280 nm), dělené relativním absorpčním faktorem určeío ném při 245 nm mezi SD a proteinem hodnotou 14,5 a násobené 100.

(2) % stanoveného obsahu SD bylo vypočteno z koncentrace v souladu s hodnotou O.D. při 280 nm při odpovídajícím výrobním postupovém kroku s ohledem na to, že na počátku byla hodnota koncentrace (0,339), opravená o % O.D,, která přispívají (přibližně) k SD, podle následují15 čího výrazu: výtěžek v % = (O. D. odečet (280 nm) / 0,339 x (% O.D. v SD / 100).

Výsledky ukazují průběh snížení obsahu SD (polysorbátu-80) během koncentračního pochodu a promývání, jaké se dosáhne během pětinásobného promývání, kdy poklesne z výchozího obsahu na pouhých 2,74 % v konečném výrobku. Podle toho je hodnota redukčního faktoru 36,5 (100%/ 2,74), korigovaný podle pětinásobného zvýšení koncentrace proteinu (2065 kg /

400 kg), čímž se dosáhne aktuální redukční faktor o hodnotě 182. V souhlase s předcházejícími

- 13CZ 300413 B6 hodnotami vypočtená koncentrace polysorbátu-80 v získaném precipitátu je o něco nižší než 100 ppm při přibližné koncentraci proteinu 2 %.

Samozřejmě pro dosažení koncentrace < 100 ppm při obsahu proteinu 5 a 10% je třeba snížit množství polysorbátu více než pětkrát. Toho se s výhodou dosáhne při použití ultrafiltrační membrány s hodnotou 100 kDa, a tím se dosáhne dostatečně nízká koncentrace polysorbátu, o hodnotě v blízkosti tvorby mycel a separace je tím způsobem nej výhodnější. U šarže podle uvedeného příkladu byla v konečném výrobku nalezená koncentrace < 30 ppm (při 5 % IgG), tedy pod kvantifíkačním limitem analytické techniky.

io

Další dvě šarže, č. 8006 ač, 8007, byly zpracovány v preparátorském rozsahu stejným způsobem jako šarže 3. Byla provedena precipitace s PEG, koncentrace a promývání se zařízením TFF se stejným typem membrány jako v předchozích případech, ale byl změněn jen objem promývacího roztoku na 4 a 2,5 násobek pro šarže č. 8006, resp. 8007. Po diafiltraci a koncentraci membránou se 100 kDa na konečnou koncentraci (5 % IgG), byla stanovena koncentrace zbylého polysorbátu v každé šarži v konečném výrobku (IVIG 5 %). Nalezené hodnoty (včetně šarže č. 9003) jsou shrnuty v tabulce 3.

Tabulka 3

Šarže č.	Počet promývacích objemů (při TFF)	Koncentrace polysorbátu v konečném výrobku 5 % IVIG (ppm)
9003	5	<30
8006	4	50
8007	2,5	200

Výsledky předcházející tabulky 3 ukazují závislost mezi obsahem zůstatkového polysorbátu a počtem promývacích objemů, a dokazuje, že promývání TFF podle podmínek uvedených v předloženém vynálezu je základní podmínkou pro účinné snížení obsahu neiontového deter25 gentu (polysorbátu) ve výrobku. Na základě nalezených hodnot lze soudit, zeje zapotřebí minimálně čtyřnásobné promyti k zajištění menšího zbytku v konečném výrobku než 100 ppm.

Příklad 4

Podle způsobu uvedeného v předloženém vynálezu bylo zpracováno několik šarží IgG, kdy jako 30 výchozí materiál byly použity frakce IH III v množství 90 kg. Když byl získán roztok vyčištěný kolonou s obsahem DEAE-Sepharose FF, obsahující přibližně 4 % PEG—4000, byla ve všech případech provedena ultrafiltrace na povrchu velikosti 27,6 m² polysulfonové membrány zn.

Biomax A-2 od Míllipore s nominální molekulární hranou 100 kDa za stejných podmínek, jaké jsou uvedeny u příkladu 1. Nalezené hodnoty koncentrace proteinu (podle stanovených hodnot optické hustoty) a koncentrace PEG-4000 jsou uvedeny v tabulce 4.

Tabulka 4

Šarže č.	Protein (O.D. 280 nm, v AU)	Koncentrace PEG-4000 (mg/ml)
9002	49,6	5,20
9003	55,5	4,92
0001	55,9	4,92
0002	54,1	4,83
0003	54,9	5,91

-14CZ 300413 B6

Koncentrace PEG—4000 byla určena metodou HPLC na vylučovací koloně s gelem za použití lomového indexového detektoru.

Při jiné zkoušce provedené v laboratorním měřítku (vycházeno z množství 8 kg frakce II + Hl) s jednou ze šarží (č. 9001) byl postup prováděn až po vyčištění s kolonou obsahující FF DEAESepharosou. Následná ultrafiltrace byla provedena membránou s molekulární hranou se 100 kDa zn. Biomax A-2 za podmínek uvedených u příkladu 1 po přizpůsobení práce k množství výchozí suroviny. V tomto případě na rozdíl od příkladu 1 byla diafíltrace provedena s ohledem na množio ství sorbitolu 5 % bez nastavení pH výrobku na 4,2 až 4,6, a pro diafiltraci byl použit membránový přetlak 0,15 MPa. Nakonec byla získána přibližná koncentrace proteinu odpovídající hodnotě O. D. (při 282 nm) 45 AU a koncentrace PEG byla 33 mg/ml, tj. asi šestkrát vyšší než hodnoty uvedené v tabulce 4. Výrobek získaný do pasterizace obsahoval 4 % agregátů, chovající se odlišné od šarží uvedených na tab. 4, u kterých bylo zjištěno navýšení zmíněných agregátů jen na 1,0 až 1,5%.

Výsledky uvedené v tabulce 4 ukazují, že způsob ultrafiltrace podle vynálezu (relativně k pH a membránovému přetlaku) uspokojivě splňují požadavek výkonného snížení obsahu PEG a že jsou vhodné pro přípravu roztoků s takovými obsahy proteinu a PEG, které jsou vhodného pro virové inaktivační ošetření.

Příklad 5

Rada šarží byla zpracována za podmínek, jak jsou uvedeny a popisovány v předloženém vynálezu. U nich byla před provedením závěrečné ultrafiltrace upravena hodnota pH na 5,4 a 5,6 a byly 2,5krát koncentrovány membránami se 100 kDa při membránovém přetlaku přibližně 0,15 až 0,2 MPa. Byly promyty jedním objemem vody pro injekce a následně bylo pH nastaveno na hodnotu mezi 4,3 a 4,5 přísadou roztoku 0,5 M kyseliny chlorovodíkové, membránový přetlak byl snížen na hodnotu pod 0,1 MPa a objem odpovídajících roztoků byl znova 2,5krát koncentrován. Konečně byla provedena diafíltrace se 7 objemy roztoku s 5 hmotn. % sorbitolu, který obsahoval rovněž 2 mM kyselinu octovou k nastavení hodnoty pH na 4,2 s hydroxidem sodným.

Výsledky koncentrací zbytkového obsahu PEG v konečném výrobku je možno nalézt v předcházející tabulce 2, s hodnotami kolem 200 ppm (2,02 %) při 5 % IgG. Uvědomuje-li si, že koncentrace PEG a IgG roztoku před ultrafiltrací byly přibližně 3,25 %, resp. 4 mg/ml, je hodnota redukčního faktoru pro IgG (po korekci na protein) 1000 až 2000.

Podobně jako u předcházejících šarží byla tato zkouška provedena v laboratorním měřítku způso40 bem popisovaným ve vynálezu a který je uveden u příkladu 1, pouze $ úpravou přizpůsobenou velikosti šarže. pH výchozího roztoku bylo upraveno na hodnotu asi 5,0 a roztok koncentrován asi 4krát pomocí membrán a s hodnotou molekulární hrany 100 kDa. Diafíltrace byla pak provedena při konstantním objemu se stejným zařízením asi s9 objemy 5% roztoku sorbitolu při membránovém přetlaku asi 0,12 MPa. Nalezené hodnoty koncentrací PEG a proteinu, stejně jako redukční faktor pro PEG jsou sestaveny v tabulce 5.

- 15 CZ 300413 B6

Tabulka 5

Fáze	Koncentrace PEG (mg/ml)	Koncentrace proteinů (mg/ml)	Redukční faktor PEG (upravený) (1)
Výchozí roztok (2)	32,5	3,76	1
4krát koncentrovaný roztok	55,6	4,9	2,31
1. DV s 5% sorbitolu	nést.	14,9 (přibl.)	np.
3. DV s 5 % sorbitolu	14,5	14,9 (přibl.)	8,74
5. DV s 5 % sorbitolu	1,6	14,9 (přibl.)	11,08
7. DV s 5 % sorbitolu	8,4	14,9 (přibl,)	15,43
9. DV s 5% sorbitolu a konečná koncentrace	20,5	62,8	26,18
5 % IVIG (konečná)	15,2	51,4	28,8

DV - počet objemů při diafiltraci 5 nést. - nestanoveno np. - nepoužitelné (1) Redukční faktor byl opraven podle koncentrace proteinu (2) Výchozí roztok odpovídal filtrátu s PEG 3,28 % a pH 8.

Výsledky uvedené v tabulce 5 dokumentují jemné rozdíly v obsahu PEG při filtraci membránou se 100 kDa za uvedených zkušebních podmínek, a odpovídají především hodnotě pH média > 4,8 a membránovému přetlaku > 0,12 MPa. Proto bylo určeno, že za aktuálních pracovních podmínek podle předloženého vynálezu je snížení obsahu PEG podstatně účinnější, řádově v hodnotách kolem 50krát (při porovnání se snižujícím faktorem 1000 až 2000 u předcházejících šarží a o 28,8 v předložené zkoušce).

Příklad 6

Bezodkladná pasterizace γ-globul i nového roztoku stejně jako okamžitá následná chemická inaktivace za použití rozpouštědla/detergentu sotva způsobují agregaci. Několik šarží bylo zpracování v průmyslovém měřítku (vždy s výchozími 90 kg frakcí II + III), a zachován byl pracovní způsob podle popisovaného vynálezu, jak je detailně uveden u příkladu 1. Když byla provedena inkubace při kyselím pH, γ -globulinový roztok o koncentraci 3,5 % byl stabilizován přísadou sorbitolu v takovém množství, aby konečná koncentrace byla přibližně 33 hmotn. % a pH bylo nastaveno na hodnotu 4,80 ±0,05 přísadou roztoku 0,5 M hydroxidu sodného, optická hustota byla mezi

35,6 AU a 41,2 AU (při 280 nm). Následně byla okamžitě provedena celková pasterizace v nádobě s ohřívacím pláštěm, a to po dobu 10 h při teplotě 60 až 61 °C. Pak byl roztok zředěn chladnou vodu na injekce na optickou hustotu mezi 25,9 AU a 28,0 AU (při 280 nm), tak, aby ve všech případech byla koncentrace sorbitolu < 25 %. Dále byl zpracovávaný roztok ochlazen na 25 až 26 °C a byl přidáván koncentrovaný roztok (1 Okřát) rozpouštědla/detergentu, tak, aby byla dosažena konečná koncentrace (hmotn./obj.) polysorbátu-80 v množství 1 % a tri-n-butylfosfátu 0,3 %. Po míchání asi po 30 min. byl roztok ponechán k inkubaci po 6 h při 25 až 26 °C.

Obsah polymerů nebo agregátů s vysokou molekulární hmotností (stanoveno prostřednictvím HPLC) v roztoku byl určen před a po pasterizaci a po zpracování rozpouštědlem/detergentem. Množství koloidních částic vzniklých během pasterizace bylo stanoveno měřením zákalu. Nalezené hodnoty jsou sestaveny v tabulce 6.

- 16CZ 300413 B6

Tabulka 6

Šarže č.	% polymeru (nebo agregátů s vysokou molekulární hmotností	Zákal (NTU)
	Před pasterizací	Po pasterizaci	Po přísadě SD	Před pasterizací	Po pasterizaci
9002	nd.	1,23	nést.	1,5	1,6
9003	nd.	1,16	1,97	1,4	1,8
0001	nd.	1,04	1,19	5,9	1,8
0002	nd.	1,21	1,30	2,3	2,4
0003	nd.	1,35	1,15	1,7	2,0

nd. - nedokazatelné 5 nést. - nestanoveno

Výsledky ukazují, že jak pasterizace, tak zpracování rozpouštědlem/detergentem za popisovaných podmínek teploty, času a složení materiálu (stabilizátor, koncentrace proteinu a PEG, pH atd.), nezpůsobují denaturaci γ-globulinu, ale přinášejí jen nepatrné zvětšení množství agregátů io (< 2 %) a zákalu. Podobně při koncentraci γ-globulinu (přibližně 3,5 %) je popisovaný postup nejvhodnějším způsobem pro zpracování velkých množství v jedné šarži.

Příklad 7 15

Dále bylo provedeno několik zkoušek k určení nej lepších podmínek pro přečištění celé šarže na iontoměničové koloně s pryskyřicí.

Bylo vycházeno ze stejné šarže frakcí II + III, při čemž bylo několik prvních zkoušek provedeno 20 v laboratorním měřítku za použití 1 kg výchozího materiálu, a postupováno podle způsobu popisovaného v předloženém vynálezu, až po přípravu filtrovaného roztoku po první precipitací sPEG.

U každé zkoušky bylo pH zpracovávaného množství roztoku nastaveno na 5,9 až 6,0, a následo25 válo čeření (filtrem 0,5 μ) a na to byl roztok vnášen do kolony průměru 65 nebo 90 mm, obsahující piyskyřici DEAE-Sepharose FF (od Amersham Pharmacia) s výškou sloupce 13 a 17 cm (vyjma v jednom případě, který je uveden). Dávkování bylo prováděno při teplotě 2 až 8 °C a průtok nastaven tak, aby roztok prošel za 12 do 15 h nebo 6 h, v závislosti na způsobu provedení zkoušky. Všechen výtok z kolony byl shromážděn a promytí při každé zkoušce bylo provedeno roztokem lOmM octanu sodného, jehož pH bylo nastaveno na hodnotu 5,95 ± 0,05 kyselinou octovou a jehož použité množství odpovídalo 3,5násobku objemu kolony.

Tab. 7 ukazuje hodnoty získaného γ-globulinu a jeho elektroforetickou čistotu při odtoku 35 z kolony (v octanu celulózy).

- 17CZ 300413 B6

Tabulka 7

Poměr vsázky (g frakce ll+lll/ml pryskyřice)	Doba vsázky (hodiny)	Čistota odtoku z kolony (elektroforeze)	Výtěžek γ-globulinu (%) (2)
		Albumin (1)	Gamma (%)
4,0	12,15	(+)	97,2	97
2,5		()	98,7	95
2,25		(-)	98,3	105
1,25		.()	97,7	97
0,875		{)	100	98
0,625		(·)	100	100
1,65	6	(+*+)	85,6	nést.

nést. - nestanoveno (1) Symboly: (-) označuje zjištěnou nepřítomnost; (+) přítomné stopy; (+++) značné přítomné množství (hlavní nečistota).

(2) Výpočet výtěžku v % podle celkové hodnoty proteinu (ve vztahu k O.D. při 280 nm) a čistoio tu) elektroforeticky) odtoku z kolony s ohledem na počáteční zpracovávaný roztok.

Při použití dávky 2,5 g frakce 11+ III na 1 ml piyskyřice nebo méně, byla dosažena skoro úplná adsorpce hlavních nečistot, stanovitelných elektroforezí (nepřítomnost albuminu) a nebyl zjištěn negativní vliv na výtěžnost γ-globulinu, která se ukazuje jako výborná v celé studované oblasti.

Nicméně byl však snížen obsah pryskyřice v koloně na množství 1 g frakce II + III na 1 ml pryskyřice, aby se snížil zbytečně velký objem kolony. Na druhé straně, jak bylo možno očekávat, průtok dávkovaného množství do kolony s agarózovou matricí se ukázalo být dominujícím faktorem, a dále, že 12 hodinový kontakt za kontinuálního průtoku je nezbytný.

Jedna ze zkoušek (šarže č. 9001) byla provedena v laboratorním měřítku (s 8 kg výchozí frakce II + III) za zachování pracovního postupu popsaného v příkladu 1, ale s nastavením takových podmínek šarže, a se snahou specificky objasnit snížení množství některých hlavních doprovázejících proteinů během adsorpce na koloně. Dávkovači poměr byl 1,8 g frakce II + lil na 1 ml DEAE-Sepharose FF a kontaktní čas byl přibližně 12 h, koncentrace IgG, albuminu a transferinu byly stanoveny v odtoku z kolony a v roztoku dávkovaném do kolony. Nalezené hodnoty jsou sestaveny v tabulce 8.

Tabulka 8

Protein	Před kolonou	Za kolonou	Výtěžnost v % (1)
IgA (mg/ml)	0,16	< 0,003	<2
Albumin (mg/ml)	0,248	<0,0018	< 1
Transferin (mg/ml)	0,043	0,002	5
IgG (mg/ml)	5,15	4,49	94,7

Obsah proteinů byl stanoven imunoefelometricky.

-18CZ 300413 B6 (1) Výtěžnost v % byla vypočtena s ohledem na absolutní množství proteinu nalezeného v roztoku před a po dávkování do kolony.

Z tabulky 8 jasně vyplývá, že za specifických podmínek popisovaných v předloženém vynálezu 5 je pryskyřice vysoce selektivní a účinná při oddělování základních druhů proteinů přítomných společně s IgG ve výchozích frakcích II + III. V odtoku z kolony, který obsahuje IgG, je dokazatelné jen nepatrné množství transferinu. Vysoká výtěžnost IgG je výborným ukazatelem dobrého rozdělení vzájemného poměru všech podtříd v odtoku z kolony.

Příklad 8

Za použití vysoce vyčištěného I.V. γ-globu li nového roztoku jako výchozího materiálu byly ke studiu simulovány podmínky při zpracování v kyselém pH (pH 4,0), tj. ke studiu ochranného is účinku sorbitolu v závislosti na koncentraci γ-globulinu a na inkubační době, a stejně jejich význam pro následující pasterizaění zpracování.. Byly zpracovány vzorky stejné šarže s 5% IVIG (Flebogama z Instituto Grifols) a provedeny zkoušky k ověření ochranného účinku sorbitolu v kyselém prostředí během nastavení hodnoty pH na 4,00 až 4,05 roztokem mM kyseliny chlorovodíkové při teplotě místnosti 20 až 25 °C. Současně byly provedeny jiné zkoušky, aby se vyhodnotil vliv účinku koncentrace γ-globulinu při zředění výchozího 5% roztoku IVIG 5% roztokem sorbitolu a rovněž určil při nastavené hodnotě pH 4,0 vliv teploty místnosti 20 až 25 °C nebo chladu při 2 až 8 °C. Po inkubaci při pH 4 po 1 h a následné pasterizaci při 60 až 61 °C po dobu lOh za přítomnosti 33% roztoku sorbitolu byl stanoven obsah agregátů nebo polymerů stanovitelných O.D. při 280 nm za pomoci HPLC, Nalezené výsledky jsou sestaveny v tabulce 9.

Tabulka 9

Sorbitol (%)	Protein (%)	Nastavení hodnoty pH na 4,0 při 20 °C až 25 °C.	Nastavení pH na 4,0 při 2 °C až 8° C
		Agregáty % (po inkubaci při pH 4)	Agregáty % (po pasterizaci)	Agregáty % (po inkubaci při pH 4)
5	0,25	nést.	nést.	ned.
5	1	0,31	0,57	ned.
5	2	0,34	0,64	nést.
5	2,5	nést.	nést.	ned.
5	3	0,37	1,01	nést.
5	4	0,93	1,57	nést.
5	5	0,83	1,81	0,43
5	5	0,86	3,50
10	5	0,15	0,83
20	5	0,10	nést.
33	5	ned.	0,70

ned. - nedokazatelné nést. - nestanoveno

Ve všech případech výchozí IVIG neobsahoval agregáty (ned.).

Dosažené výsledky zdůrazňují ochranný účinek sorbitolu v kyselém prostředí při měnícím se pH, 35 i když podstatně zřetelněji při vyšší teplotě. Při teplotě místnosti je zapotřebí koncentrace sorbi-19CZ 300413 B6 tolu 10 % nebo vyšší, aby se uchoval ochranný účinek na roztok γ-globulinu sjeho 5% obsahem (nebo o vyšší koncentraci). Vyšší koncentrace γ-globulinu má za následek vyšší míru agregace, ale při nastavení pH na hodnotu 4,0 při 2 až 8 °C a koncentraci proteinu do 5 % (nebo zředěnější roztoky, vhodně do 3,5 ± 0,5 %) může být dosažena stabilizace s pouhými 5 % sorbitolu, a tato koncentrace je rovněž přijatelná pro inkubaci v kyselém prostředí a pro provedení následné pasterizace. Avšak při nastavení hodnoty pH při nižší teplotě 2 až 8 °C byla u roztoku s koncentrací 5 % γ-globulinu s 5 % sorbitolu pozorována pouze nepatrná agregace (0,43 % polymeru), což je zřetelně nižší hodnota, než při nastavení stejného pH při 20 až 25 °C (za vzniku 0,83 % polymeru). Nižší stupeň agregace při nižší teplotě ve stejném koncentračním rozsahu proteinu a rovněž stupeň ochrany poskytovaný sorbitolem ospravedlňují nalezené podmínky při různých krocích výrobního postupu podle předloženého vynálezu.

Byl dále sledován inkubační čas při kyselém pH (pH 4,0 a 36 až 37 °C) vzhledem k vzniku agregátů u roztoku γ-globulinu (Flebogamma) a sorbitolu při dvou rozdílných koncentracích obou látek a nastavení pH při teplotě 2 až 8 °C. Nalezené výsledky jsou uvedeny v tabulce 10.

Tabulka 10

Sorbitoí (%)	Protein (%)	Čas při pH 4(h)	Agregáty (%) (po zpracování při pH 4)	Agregáty (%) po pasterizaci
5	2,5	1	ned.	0,35
5	2,5	2	0,30	0,59
5	2,5	4	ned.	0,32
6	3	0	0,11	0,36
6	3	1	0,07	0,31
6	3	4	0,07	0,41
6	3	8	0,40	1,11
6	3	12	0,43	1,13
6	3	24	0,15	0,58

ned. - nedokazatelné

Dosažené výsledky zcela jasně dokazují vhodnost použití při zkouškách dvou druhů roztoků doporučených pro provedení inkubace při kyselém pH a následnou pasterizaci za přítomnosti sorbitolu v množství 33 %. Vhodný inkubační čas byl nalezen v maximálním studovaném rozsahu od 0 do 24 h, s nej výhodnějším optimem při 4 h vystavení při 36 až 37 °C.

Příklad 9

Nejvýhodnější pasterizační podmínky byly sledovány na výchozím velmi čistém materiálu s 5 % 1VIG (Flebogamma), při koncentraci 5 % (s vodivostí 450 pS/cm) nebo po zředění 1:1 vodou pro injekce až na koncentraci 2,5 % (vodivost tohoto roztoku byl zhruba 225 pS/cm). Ke každému z těchto roztoků byl přidán sorbitoí do koncentrace 33 hmotn. % a nastaveno odlišné pH roztokem 0,5 M kyseliny chlorovodíkové. Po vystavení každého vzorku s rozdílnou koncentrací a pH na 10 h tepelnému zpracování při 60 až 61 °C bylo vždy stanoveno molekulární rozdělení analýzou HPLC, aby se určilo množství vytvořených agregátů (polymerů nebo vysokomolekulárních agregátů a dimerů). Nalezené hodnoty jsou sestaveny v tabulce 11.

-20CZ 300413 B6

Tabulka 11

Protein (%)	PH	Polymery (%)	Dimery (%)
2,5	5,52	0,46	4,36
2,5	5,03	0,35	3,49
2,5	4,72	0,30	3,31
2,5	4,51	0,45	3,34
5	4,2	4,89	4,54
5	4,0	14,42	5,60
5	3,8	24,51	6,23

Obsah polymerů ve výchozím roztoku 5 % IVIG byl nezjistitelný.

Výsledky ukazují, zeje vhodné provádět pasterizací při 60 až 61 °C po dobu 10 h při velmi slabé iontové síle a při koncentraci proteinu přibližně 2,5 % v prostředí stabilizovaném sorbitol em a io v rozsahu pH mezi 5,5 až 4,5. Optimální pH je v rozmezí 4,7 až 5,0, při kterém byla nalezena nejnižší tvorba agregátů (polymerů a dimerů).

Příklad 10 15

Dále byly provedeny některé zkoušky k určení schopnosti způsobu podle předloženého vynálezu zajistit eliminaci agregátů s vysokou molekulární hmotností, které se vytvářejí (vznikají) při předcházejících postupových krocích při virové inaktivaci.

Roztoky byly pasterizovány za přítomnosti 33 % sorbitolu a následně zpracovány s0,03 %

TNBP a 1 % polysorbátu-80 v různých poměrech podle způsobů popisovaných v předloženém vynálezu a ředěny vodou pro injekce v poměru 1 až 1,5 kg vody na každý kg roztoku a pak byly ochlazeny na 2 až 8 °C. Okamžitě byl následně přidán PEG^tOOO a získány různé koncentrace, jejichž pH bylo nastaveno na hodnotu mezi 7,5 a 8,1. Roztoky byly ponechány k precipitací agregátů s vysokou molekulární hmotností, pak byly suspenze filtrovány filtrem s póry v rozsahu

0,5 až 0,1 μ a v každém případě byla získána průsvitná kapalina obsahující čištěný IgG,

Množství polymerů v % v každém roztoku bylo určeno za použití HPLC a nalezené hodnoty jsou sestaveny v tabulce 12.

Tabulka 12

Postup č.	Koncentrace PEG (%)	Konečné pH	Výchozí roztok (% polymeru)	Filtrovaný roztok (% polymeru)
61/50	3,00	7,88	2,31	0,00
63/53	3,00	7,62	2,94	0,35
65/58	3,15	7,51	0,88	0,33
63/60	3,15	8,06	2,94	0,00
77/61	3,23	7,75	2,28	0,08
7014/1	3,27	7,99	1,28	0,00
62/59	3,45	7,47	0,84	0,00

Nedokazatelná množství za použití HPLC jsou v uvedeném případě uvedena jako 0,00.

-21 CZ 300413 B6

Celková eliminace polymerů byla zjištěna v rozsahu koncentrací PEG od 3,00 do 3,45 %, ačkoliv zde existuje interakce s pH v prostředí, které je pro separaci nejúěinnější, tj. při pH mezi 7,75 a 8,06. Pro úplnou eliminaci polymerů byla zapotřebí při nejnižší sledované hodnotě pH 7,47 alespoň koncentrace nejméně o 3,45 % PEG, protože nižší koncentrace (např. PEG 3,18%5 pH 7,51) nejsou schopné přimět všechny řečené polymery k precipitaci a mohou tedy ponechat zbytky ve filtrovaném roztoku.

Přítomnost sorbitolového stabilizátoru působí stejným způsobem, zamezuje koprecipitaci neagregátovaného podílu (monomeru a d i meru) společně s polymerem, a umožňuje tak při zmíněné io precipitaci zisk velkého množství požadovaného výrobku. Aby se stanovil vliv přítomnosti sorbitolu byly provedeny některé zkoušky precipitace a výtěžnosti proteinu (na základě optické hustoty) při různých koncentračních poměrech. Při zkouškách se vycházelo z čištěného roztoku s obsahem 5 % IVIG (a který neobsahoval stanovitelné polymery), který byl zředěn na optickou hustotu (při 280 nm) na hodnotu asi 6 AU vodou nebo roztokem s 10 % sorbitolu podle druhu prováděné zkoušky, a pH bylo nastaveno na hodnotu 8,0. Roztok byl ponechán k precipitaci nejméně 1 h a pak byl sledován vznik precipitátu. Stejná zkouška byla opakována s roztokem IgG vycházející z postupu po virové inaktivaci podle způsobu popsaného v předloženém vynálezu (s obsahem polymeru 3,97 %), který byl v tomto případě zředěn roztokem 5 % sorbitolu nebo vodou, a po precipitaci a oddělení segregátů filtrací byl stanoven procentický výtěžek proteinu z filtrátu a provedeno porovnání s obsahem ve výchozím vzorku.

Nalezené výsledky jsou sestaveny v následující tabulce 13.

Tabulka 13

Koncentrace PEG (%)	pH	% polymeru ve výchozím roztoku IVIG	Koncentrace sorbitolu (%)	Přítomnost precipitátu (1)	Výtěžnost proteinu ve filtrátu (2)
3,0	3,0	ned.	0,4	Ano (+++)	nést.
3,0	8,0	ned.	5	Ano(+)	nést.
3,0	8,0	ned.	10	Ne(-)	nést.
3,0	8,0	3,97	9,4	Ano (+++)	83,6
3,0	8,0	3,97	13,0	Ano (+++)	92,2

nést. - nestanoveno ned. - nedokázáno (1) : Počet + indikuje množství nalezeného precipitátu: (+++) hojný; (+) počínající;

(-) žádný.

(2) : Procenta celkového nalezeného proteinu ve filtrovaném roztoku s ohledem na výchozí roztok před precipitaci.

Koncentrace sorbitolu nad 5 % zamezují precipitaci monomeru/dimeru IgG, pokud jsou přítomny 35 jako jednoduché součásti v roztoku IVIG (neobsahující polymer) a jsou potvrzeny nepřítomností precipitátu po přísadě PEG. Podobně jsou-li eliminovány polymery obsažené v roztoku IgG, je pozorována výhodnější výtěžnost IgG (bez polymerů) i při nejvyšší zkoušené koncentraci sorbitolu (13 %). Podle toho přítomnost sorbitolu během precipitace polymerů nebo agregátů s vysokou molekulární hmotností je výhodná pro zamezení koprecipitace a pro dosažení nejvý40 hodnější výtěžnosti IgG.

Příklad 11

Filtrace virů byla sledována a porovnávána v laboratorním měřítku za použití komerčních filtrů s póry v nanometrickém rozsahu. Byly zkoušeny dva rozdílné výchozí materiály získané postu45 pem popsaném v příkladě 1: roztok byl nastaven na kyselé pH (pH = 4,00 ± 0,05) při 36 ± 1 °C

-22CZ 300413 B6 (materiál A) a konečný diafiltrovaný roztok s 2,5 ±0,5% proteinu, pH 4,5 ±0,1 při teplotě 26 ± 1 °C (materiál B). Výsledky dosažené s ohledem na filtrované množství a použité filtrační plochy, potřebný čas a výtěžek proteinu podle druhu použitého filtru (Plánová 35 N, Plánová 15 N a DV20) jsou sestaveny v tabulce 14,

Tabulka 14

Typ filtru	Materiál A
Typ filtru	Filtrovaný objem (l/m2)	Filtrovaný protein (kg/m2)	Filtrační čas (h)	% vytěženého proteinu	Filtrovaný objem (l/m2)
Plánová 35 N (35nm)	213	677	1,53	99,2	300 249 289
DV20 (Pall) (20 nm)	48,3	1,43	16,9	94,5	64,8 51,7
Plánová 15 N (15 nm)	34,0	0,99	16,2	87,1	31,0 34,0

(*) Výtěžek získaný před následným promytím.

Z předcházející tabulky je zřejmé, že oba materiály, jak A tak B, jsou vhodné pro filtraci virů, ať filtrem s průřezem pórů 35 nm nebo menším, až do 15 nm. Zdá se však, že velikost pórů kolem 20 nm je nej vhodnější, jak v ohledu na parametry výtěžnosti proteinu (>90 %) a produktivity (> 1 kg/m²) s ohledem na eliminaci virů vztaženou na kapacitu rozměru pórů filtru.

Claims (20)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob výroby humánního γ-globulinu G inaktivovaného viry, vyznačující se t í m, že γ-globulin se získá extrakcí z frakce izolované frakčním dělením ethanolem za přítomnosti derivátu uhlovodíku, a po snížení obsahu znečisťujících látek za použití polyethylenglykolu se pro další zpracování použije kolona s aniontovou iontoměničovou pryskyřicí, v jejímž odtoku

   25 se následně koncentrace polyethylenglykolu sníží ultrafí hrací a roztok se koncentruje pro následné vhodné zpracování při kyselém pH 4 až 4,5 a následně se použije nejméně jeden postup pro inaktivaci virů, zahrnující pasterizaci a zpracování rozpouštědlem/detergentem, a výrobek je následně vysrážen a promýt polyethylenglykolem k eliminaci jakékoliv reagencie pro virovou inaktivaci a následně rozpuštěn a změnou pH na 7,5 až 8,5 zbaven znečisťujících proteinů a

   30 konečně vyčištěn ultrafí ltrací, aby se snížil celkový objem a obsah polyethylenglykolu, pak se provede konečné vhodné odfiltrování virů a následně se koncentrace proteinů upraví ultrafí ltrací na obsah 5 nebo 10%.
2. 2. Způsob výroby humánního γ-globulinu G inaktivovaného viry podle nároku 1, vyzna35 ě u j í c í se t í m, že frakce izolovaná frakčním dělením ethanolem je výhodně frakce II + III.
3. 3. Způsob výroby humánního γ-globulinu G inaktivovaného viry podle předcházejících nároků, v y z n a č u j í c í se t í m , že derivát uhlovodíku je přednostně cukrový alkohol, výhodněji sorbitol, o koncentraci mezi 2 až 10 hmotn./obj. %.

   -23CZ 300413 B6
4. 4. Způsob výroby humánního γ-globulinu G s inaktivovaného viry podle předcházejících nároků, vyznačující se tím,že precipitace póly ethy lenglyko lem se provádí při koncentraci

   2,5 až 5,5 hmotn. % a při hodnotě pH 4,8 až 5,5.
5. 5 5. Způsob výroby humánního γ-globulinu G inaktivovaného viry podle předcházejících nároků, vyznačující se tím,žepH roztoku dávkovaného do kolony s pryskyřicí je nastaveno na hodnotu mezi 5,7 až 6,3.
6. 6. Způsob výroby humánního γ-globulinu G inaktivovaného viry podle předcházejících nároio ků, vyznačující se tím, že kolona saniontovým iontoměničem výhodně obsahuje diethy 1 aminoethy lovou agarózovou pryskyřici a připouští zatížení vhodně mezi 1 g a 2,5 g frakce II + III na 1 ml pryskyřice.
7. 7. Způsob výroby humánního γ-globulinu G inaktivovaného viry podle předcházejících náro15 ků, vyznačující se tím, že odtok z kolony se ultrafrltruje membránou se 100 kDa nominální molekulární hranou po předcházející výhodné diafiltraci s ne méně než 3 objemy roztoku, který obsahuje cukrový alkohol, přednostně sorbitol, o koncentraci 2 až 10 hmotn./obj. %, za nastavení hodnoty pH 4,0 až 4,
8. 8 a při membránovém přetlaku pod 0,12 MPa.

   20 8. Způsob výroby humánního γ-globulinu G inaktivovaného viry podle předcházejících nároků, vyznačující se tím, že zpracování se provádí výhodně v kyselém pH o hodnotě 3,95 až 4,03 při 35 až 38 °C po dobu 1 až 4 hodin a za přítomnosti cukrového alkoholu, přednostně sorbitolu, o koncentraci 2 až 10 hmotn./obj. %.

   25
9. 9. Způsob výroby humánního γ-globulinu G inaktivovaného viry podle předcházejících nároků, vyznačující se tím, že před provedením výrobního postupu chemické inaktivace směsí rozpouštědla/detergentu se po pasterizaci za přítomnosti přednostně cukrového alkoholu, nejvýhodněji sorbitolu, o koncentraci 25 až 35 hmotn. %, provede zředění roztoku vodou pro injekce na koncentraci cukrového alkoholu na 25 hmotn. % nebo méně, a koncentraci proteinu na

   30 hodnotu mezi 1 a 3 hmotn./obj, %.
10. 10. Způsob výroby humánního γ-globulinu G s inaktivovaného viry podle předcházejících nároků, vyznačující se tím, že roztok obsahující inaktivované viry po zpracování směsí rozpouštědla/detergentu se zředí vodou pro injekce vhodně přidáním 1 kg až 2 kg na každý kg

    35 roztoku a po nastavení hodnoty pH mezi 7,0 a 9,0, výhodněji na pH mezi 7,8 až 8,4, se provede vysrážení přísadou polyethylenglykolu na konečnou koncentraci mezi 12 a 17 hmotn. %.
11. 11. Způsob výroby humánního γ-globulinu G inaktivovaného viry podle předcházejících nároků, vyznačující se tím, že suspenze sraženiny s polyethylenglykolem se oddělí filtrací

    40 na membráně s tangenciálním tokem, výhodně s velikostí pórů 0,1 až 0,45 μ, vedoucí ke snížení objemu výhodně řádově na 4 až 8krát menšímu, než byl objem původního roztoku.
12. 12. Způsob výroby humánního γ-globulinu G inaktivovaného viry podle předcházejících nároků, vy z n ač u j í c í se tí m , že sraženina s polyethylenglykolem, zachycená na mem45 hranovém filtru průtokové filtrace s tangenciálním tokem, je promývána ve stejném zařízení, výhodně s množstvím čtyřnásobného nebo většího objemu roztoku se složením, jehož charakteristika je shodná s podmínkami při srážení.
13. 13. Způsob výroby humánního γ-globulinu G inaktivovaného viry podle předcházejících náro50 ků, vy z n a č u j í cí se tí m , že suspenze promyté sraženiny s polyethylenglykolem se rozpustí na stejném filtračním zařízení s tangenciálním tokem přísadou kyselého roztoku s pH nižším než 5,5, kteiý obsahuje derivát uhlovodíku, pozůstávající výhodně z kyseliny octové s nastavenou koncentrací 1 až 10 mM, ke kterému je výhodně přidán roztok cukrového alkoholu o koncentraci 5 až 20 hmotn. %, s výhodně nastaveným pH na hodnotu mezi 4,0 až 4,5 roztokem

    55 alkalie.

    -24CZ 300413 B6
14. 14. Způsob výroby humánního γ-globulínu G inaktivovaného viry podle předcházejících nároků, vyznačující se tím, že množství kyselého roztoku pro rozpuštění, přidaného k suspenzi pro promytí sraženiny s po lyethy lengly kolem, je mezi 2,5 a 4,5 násobném množství zmíněné suspenze, tak, aby konečná koncentrace polyethylenglykolu byla od 2 do 4 hmotn. %,

    5 výhodně od 2,8 do 3,4 %, a koncentrace derivátu uhlovodíku, přednostně cukrového alkoholu, byla 5 až 20 hmotn. %.
15. 15. Způsob výroby humánního γ-globulinu G inaktivovaného viry podle předcházejících nároků, vyznačující se tím,žepH rozpuštěného výrobku je nastaveno na 7,5 až io 8,5 přísadou alkalie, a nerozpuštěné agregáty s vysokou molekulární hmotností jsou vysráženy a odděleny přednostně filtrací.
16. 16. Způsob výroby humánního γ-globulinu G inaktivovaného viry podle předcházejících nároků, vy zn ač u j í cí se tí m , že filtrát v podstatě neobsahující agregáty s vysokou moleku(5 lámí hmotností je podroben diafiltraci a koncentrován ultrafiltrací membránou se 100 kDa nominální molekulární hrany, když pH roztoku bylo nastaveno na 4,0 až 4,8, za použití výhodně roztoku s objemem ne menším než je pětinásobek původního objemu roztoku, který obsahuje cukrový alkohol, výhodně sorbitol, o koncentraci 2 až 10 hmotn./obj. %, přednostně za membránového přetlaku menším než 0,12 MPa a koncentrace proteinu od 1 do 3 hmotn./obj. %.
17. 17. Způsob výroby humánního γ-globulinu G inaktivovaného viry podle předcházejících nároků, v y z n a č u j í c í se t í m, že diafiltrovaný a vhodně koncentrovaný roztok na obsah 1 až 3 hmotn./obj. % proteinu, jehož pH bylo nastaveno na 4,4 a 5,0, se výhodně zahřeje na 25 ± 5 °C, a tím se získají optimální podmínky pro oddělení virů nanofiltrací membránou s nominální veli25 kostí pórů 50 nm nebo menší a výhodně s velikostí přibližně 20 nm na zachycení více než 90 % proteinu a s filtrační kapacitou větší než 1 kg proteinu/m² plochy, nebo rovněž výhodně mezi 15 a 20 nm s výtěžností proteinu nad 80 %.
18. 18. Způsob výroby humánního γ-globulinu G inaktivovaného viry podle předcházejících náro30 ků, vyznačující se tím, že diafiltrovaný roztok svýhodně odfiltrovanými viry se koncentruje výhodně na 5 nebo 10 hmotn./obj. % ultrafiltrace membránou se 100 kDa nominální molekulární hrany nebo i s menší velikostí pórů, a po nastavení pH na 5 až 6 a vyčeření a sterilní filtrací se převede do konečné nádoby, kde pak obsahuje více než 99 % monomemí-dimemí formy a výhodně více než 99,9 %, při čemž viditelné částice jsou nepřítomné a zákal je menší

    35 než 0,003 NTU, a množství imunoglobulinu A je nedokazatelné - menší než 0,003 mg/ml, stejně i množství imunoglobulinu M - méně než 0,002 mg/ml, obsah neiontového detergentu je menší než 50 ppm a obsah polyethylenglykolu je pod 500 ppm a organické rozpouštědlo je nedokazatelné - méně než 3,6 ppm, antikomplementámí aktivita je menší než 1 CH 50/mg proteinu, a úplná molekulární struktura včetně fragmentů Fc je nad 100 % a stejně fyziologický rozsah roz40 dělení podskupin imunoglobulinu G.
19. 19. Způsob výroby humánního γ-globulinu G inaktivovaného viry podle předcházejících nároků, vyznačující se tím, že balený konečný výrobek prochází minimální karanténní dobou 15 dnů při teplotě 25 °C, roztok si zachovává průsvitnost a zřejmou nepřítomnost viditel45 ných částic, a je stabilní jak při skladovací teplotě při 2 až 8 °C a až do 25 °C.
20. 20. Humánní γ-globulin G inaktivovaný viry, vyrobený způsobem popisovaným v předcházejících nárocích 1 až 19.