TWI532498B - 供免疫球蛋白及玻尿酸酶之皮下投藥之用的組合及方法 - Google Patents

供免疫球蛋白及玻尿酸酶之皮下投藥之用的組合及方法 Download PDF

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Description

供免疫球蛋白及玻尿酸酶之皮下投藥之用的組合及方法 【相關申請案】
主張對Richard Schiff、Heinz Leibl及Gregory Frost於2008年3月17日申請之名為「Combinations and Methods for Subcutaneous Administration of Immune Globulin and Hyaluronidase」之美國臨時申請案第61/069,841號的優先權。在允許之情況下，上文所述之申請案之主題物係以引用之方式全文併入。
本發明提供經調配以供皮下投藥之含有免疫球蛋白(IG)組合物及可溶性玻尿酸酶組合物之組合、組合物及套組。該等產品可用於治療IG可治療性疾病或病狀之方法中。本發明亦提供用於皮下投予免疫球蛋白之方法，藉此給藥攝生法實質上與靜脈內投予相同劑量以治療相同IG可治療性疾病或病狀之給藥攝生法相同。
靜脈內(IV)投予免疫球蛋白(IVIG)為對具有免疫缺乏症之個體的一線治療(primary treatment)。儘管初始IVIG製劑會引起嚴重副作用，但目 前可用之IVIG製劑可為大多數免疫缺乏症患者良好耐受。儘管如此，小比例患者仍持續具有令人不快、甚至失能之反應，諸如頭痛、疲勞及肌痛。尤其當患者具有間發性感染時，存在發燒及寒冷問題。儘管嘗試其他IVIG製劑或用乙醯胺苯酚(acetaminophen)、苯海拉明(diphenhydramine)及皮質類固醇(corticosteroid)預先給藥，但該等反應常常持續存在。此外，由於IV投藥之需要，所以存在患者順應性之問題。
免疫球蛋白之皮下(SQ)投藥可替代靜脈內投藥。與IV輸注相比，SQ投予免疫球蛋白具有若干優勢。舉例而言，其減少全身性反應之發生率，不需要往往困難之IV進入，改良最低含量且給予患者更多獨立性。由於難以在單個部位中投予大量流體，所以需要每次使用兩個至多達5個部位來一週進行SQ輸注一次或兩次。因此，不同於一月一次給予之IVIG，皮下投藥通常每週進行一次。因此，存在對投予免疫球蛋白之替代方法的需求。
本文中提供用於皮下投予免疫球蛋白且用於治療IG可治療性疾病或病狀之方法、組合物、組合及套組。提供用於治療個體之IG可治療性疾病或病狀之方法，該方法係藉由向該個體皮下投予可溶性玻尿酸酶及免疫球蛋白(IG)以治療該疾病或病狀。共同投予IG及玻尿酸酶會增加經皮下投予之IG之生物可用率，從而允許針對特定疾病或病狀使用實質上與靜脈內IG(IVIG)投藥相同之給藥攝生法皮下投予IG。IG之投藥經達成以使所投予之量及投藥頻率實質上與經由IV以相同量用於相同疾病或病狀之IV(靜脈內)投藥相同。經由IV所投予之量對於特定疾病或病狀而言可經預定或為 已知的。在可溶性玻尿酸酶存在下，對於皮下投藥而言，投藥速率可典型地大於IV投藥之速率。因此，可減少投予特定劑量之時間。投藥速率可諸如藉由泵來控制或可依靠重力。
因此，在該等方法中，提供用於治療需要該治療之個體之IG可治療性疾病或病狀的方法，該等方法係藉由向該個體皮下投予可溶性玻尿酸酶及有效治療該疾病或病狀之量的免疫球蛋白(IG)來實施。以如下劑量攝生法進行該投予，其中：(a)IG之量及(b)用於向該個體連續投予IG之給藥頻率經選擇以使皮下IG投藥對患者之治療作用至少實質上等於使用相同給藥攝生法向個體靜脈內投予IG之治療作用。
在本文中所提供之方法的一些實例中，皮下投予IG之生物可用率至少約為經由IV投藥所投予之相同劑量之生物可用率的90%。所投予之可溶性玻尿酸酶之量可足以達成以所投予之劑量不超過一月一次皮下投予IG。在其他實例中，IG之投藥不超過每月一次。
本文中所提供之方法及用途中所用之可溶性玻尿酸酶為PH20或其截短形式。舉例而言，可溶性玻尿酸酶可為綿羊或牛或截短型人類PH20。在截短型人類PH20用於本文中所提供之方法及用途中之情況下，該截短型人類PH20可選自具有SEQ ID NO：4-9中之任一者所闡明之胺基酸序列的多肽或其對偶基因變異體或其他變異體。在一實例中，該可溶性玻尿酸酶為rHuPH20。
使用本文中之方法及用途所投予之IG可諸如藉由醇分餾(alcohol fractionation)而自人類血漿純化。在一些實例中，藉由以下各者中之任一或多者來進一步純化IG：化學修飾、在胃蛋白酶存在或不存在之情況下在4.0 之pH下培育、聚乙二醇(PEG)沈澱、離子交換層析、酶促裂解、溶劑清潔劑處理、透濾或超濾。本文中所提供之方法及用途可使用含有IgG、IgA及IgM之IG。在一些實例中，IG含有大於95%之IgG。
此外，IgG可為單體。諸如甘胺酸、麥芽糖、多元醇(poloyl)、人血清白蛋白、甘露醇、及非離子型清潔劑中之一或多者之蛋白質穩定賦形劑亦可存在於IG中。在一些實例中，IG製劑之pH為或約為4.2至5.4、4.6至5.1或4.8至5.0，且蛋白質濃度為或約為IG組合物之5%至15% w/v、6%至15% w/v、或8%至12% w/v。在一實例中，IG之蛋白質濃度為10% w/v。
本文中提供治療IG可治療性疾病或病狀之方法及用途，其中皮下投予用於治療疾病或病狀之可溶性玻尿酸酶及免疫球蛋白(IG)，且IG係以10ml/hr至300ml/hr之速率輸注，諸如等於或約10ml/hr、20ml/hr、30ml/hr、40ml/hr、50ml/hr、60ml/hr、70ml/hr、80ml/hr、90ml/hr、100ml/hr、150ml/hr、200ml/hr、250ml/hr及300ml/hr。可藉由泵或重力來控制速率。在一些實例中，分開、同時或間歇投予IG及玻尿酸酶。舉例而言，可在投予IG前投予玻尿酸酶，諸如在投予IG前0.5分鐘、1分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘、5分鐘、6分鐘、7分鐘、8分鐘、9分鐘、10分鐘、20分鐘或30分鐘。在其他實例中，IG及玻尿酸酶係處於單一組合物中。在其他實例中，投予約或等於5公克(g)、10g、15g、20g、21g、22g、23g、24g、25g、26g、27g、28g、29g、30g、31g、32g、33g、34g、35g、36g、37g、38g、39g或40g IG，且以等於或約為10U/公克(g)、20U/g、30U/g、35U/g、40U/g、50U/g、60U/g、70U/g、80U/g、90U/g、100U/g、150U/g、或300U/g之比率(玻尿酸酶單位數/IG公克數)來投予玻尿酸酶。
可使用本文中所提供之方法及用途來投予可溶性玻尿酸酶及IG以治療例如免疫缺乏症；血液惡性腫瘤繼發之後天低γ球蛋白血症；川崎氏病(Kawasaki's disease)；慢性發炎性髓鞘脫失多發性神經病(CIDP．)；格巴二氏症候群(Guillain-Barre Syndrome)；特發性血小板減少性紫癜；發炎性肌病；蘭伯特-伊頓肌無力症候群(Lambert-Eaton myasthenic syndrome)；多灶性運動神經病；重症肌無力；莫氏-沃特曼症候群(Moersch-Woltmann syndrome)；繼發性低γ球蛋白血症(包括醫原性免疫缺乏症)；特異性抗體缺乏；急性播散性腦脊髓炎；ANCA陽性全身壞死性脈管炎；自體免疫溶血性貧血；大水皰性天疱瘡樣病；瘢痕性天疱瘡樣病；伊文氏症候群(Evans syndrome)(包括具有免疫性血小板減少症之自體免疫溶血性貧血)；母胎/新生兒同種免疫性血小板減少症(Foeto-maternal/neonatal alloimmune thrombocytopenia，FMAIT/NAIT)；噬血細胞症候群(Haemophagocytic syndrome)；高風險同種異體造血幹細胞移植；IgM副蛋白血症神經病(IgM paraproteinaemic neuropathy)；腎移植；多發性硬化；眼陣攣肌陣攣運動失調；落葉型天疱瘡；尋常天疱瘡；輸血後紫癜；中毒性表皮壞死溶解/史蒂芬強生症候群(Toxic epidermal necrolysis/Steven Johnson syndrome，TEN/SJS)；中毒性休克症候群；阿耳滋海默氏病(Alzheimer's Disease)；全身性紅斑狼瘡；多發性骨髓瘤；膿毒病；B細胞瘤；創傷；及細菌、病毒或真菌感染。在投予IG及玻尿酸酶以治療免疫缺乏症之情況下，該免疫缺乏症可選自常見變異性免疫缺乏症(CVID)、先天無γ球蛋白血症、維斯科特-奧爾德裏奇症候群(Wiskott-Aldrich syndrome)、嚴重複合型免疫缺乏症(SCID)、原發性低γ球蛋白血症、具有抗體缺乏之原發性免疫缺乏疾病、X-連結無γ球 蛋白血症(XLA)、嬰兒期低γ球蛋白血症、及無抗體之副腫瘤性小腦變性。
在IG可治療性疾病或病狀為血液惡性腫瘤繼發之後天低γ球蛋白血症之情況下，該血液惡性腫瘤可為慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、多發性骨髓瘤(MM)或非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma，NHL)。在IG可治療性疾病或病狀為發炎性肌病之情況下，該發炎性肌病可為多發性肌炎、皮肌炎或包涵體肌炎。
在一些實例中，皮下投予可溶性玻尿酸酶及IG以治療細菌、病毒或真菌病狀，諸如B型流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)、A型及B型綠膿桿菌(Psuedomonas aeruginosa)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、B群鏈球菌(Streptococcus)、1型、3型、4型、6型、7型、8型、9型、12型、14型、18型、19型及23型肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、2型及5型腺病毒、細胞巨大病毒、E-B病毒VCA(Epstein Barr virus VCA)、A型肝炎病毒、B型肝炎病毒、疱疹單純型病毒-1、疱疹單純型病毒-2、A型流行性感冒、麻疹、1型、2型及3型副流行性感冒、脊髓灰質炎、水痘帶狀疱疹病毒(Varicella zoster virus)、麴菌(Apergillus)及白色念珠菌(Candida albicans)。
本文中提供含有第一組合物及第二組合物之組合物組合，該第一組合物含有經調配以用於不超過每月一次皮下單一劑量投藥之IG，且該第二組合物含有經調配以用於不超過每月一次單一劑量投藥之可溶性玻尿酸酶。組合物可處於雙腔室容器中或處於彼此分離之單個容器中。在一些實例中，玻尿酸酶係位於供在IG之前投藥的容器中。該容器可為注射器、管或 瓶，且可進一步含有注射用針。
本文中所提供之組合物組合可含有PH20或其截短形式。舉例而言，本文中所提供之組合物組合中可包括綿羊、牛或截短型人類PH20，諸如具有SEQ ID NO：4-9中之任一者中所闡明之胺基酸序列的多肽或其對偶基因變異體或其他變異體。在一些實例中，組合中之可溶性玻尿酸酶為rHuPH20。此外，組合物組合中之IG可自人類血漿純化，且可經冷凍乾燥或為液體。
在一些實例中，本文中所提供之組合物組合中之液體體積為或約為100ml、150ml、200ml、300ml、400ml、500ml、600ml或700ml。組合物組合中之IG可具有為或約為IG組合物之5%至15% w/v、6%至15% w/v、或8%至12% w/v之蛋白質濃度，諸如10% w/v。在一些實例中，組合物中之IG為或約為5公克(g)、10g、15g、20g、21g、22g、23g、24g、25g、26g、27g、28g、29g、30g、31g、32g、33g、34g、35g、36g、37g、38g、39g或40g。玻尿酸酶可為液體。在一些實例中，玻尿酸酶液體體積為或約為1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml、20ml或30ml，且玻尿酸酶為或約為10單位至500,000單位、100單位至100,000單位、500單位至50,000單位、1000單位至10,000單位、5000單位至7500單位、5000單位至50,000單位、或1,000單位至10,000單位。
本文中提供經調配以用於一月一次單一劑量投藥之含有免疫球蛋白(IG)及可溶性玻尿酸酶之組合物。組合物中所含有之可溶性玻尿酸酶可為PH20或其截短形式。舉例而言，本文中所提供之經調配以用於單一劑量投藥之組合物中可包括綿羊、牛或截短型人類PH20，諸如具有SEQ ID NO：4-9中之任一者中所闡明之胺基酸序列的多肽或其對偶基因變異體或其 他變異體。在一些實例中，組合物中之可溶性玻尿酸酶為rHuPH20。組合物中之IG可自人類血漿純化，且可為液體。
在例示性具體實例中，本文中所提供之經調配以用於單一劑量投藥之組合物中的IG具有為或約為IG組合物之5%至15% w/v、6%至15% w/v、或8%至12% w/v之蛋白質濃度，諸如10% w/v。組合物中之IG為或約為5公克(g)、10g、15g、20g、21g、22g、23g、24g、25g、26g、27g、28g、29g、30g、31g、32g、33g、34g、35g、36g、37g、38g、39g或40g，且玻尿酸酶為或約為10單位至500,000單位、100單位至100,000單位、500單位至50,000單位、1000單位至10,000單位、5000單位至7500單位、5000單位至50,000單位、或1,000單位至10,000單位。組合物中之液體體積可為或約為100ml、150ml、200ml、300ml、400ml、500ml、600ml或700ml。
本文中提供含有組合物組合之套組，該等組合物組合包含含有經調配以用於不超過每月一次皮下單一劑量投藥之IG的第一組合物，及含有經調配以用於不超過每月一次單一劑量投藥之可溶性玻尿酸酶的第二組合物。本文中亦提供含有免疫球蛋白(IG)及可溶性玻尿酸酶之組合物，其經調配以用於一月一次單一劑量投藥。視情況，在套組中可包括說明書。
提綱
A. 定義
B. 免疫球蛋白(IG)之皮下投藥
C. 免疫球蛋白
D. 玻尿酸酶
可溶性玻尿酸酶
可溶性人類PH20
可溶性重組人類PH20(rHuPH20)
E. 產生編碼可溶性玻尿酸酶及其多肽之核酸之方法
1. 載體及細胞
2. 表現
a. 原核細胞
b. 酵母細胞
c. 昆蟲細胞
d. 哺乳動物細胞
e. 植物
3. 純化技術
F. 免疫球蛋白及可溶性玻尿酸酶多肽之製備、調配及投藥
1. 調配物
冷凍乾燥粉末
2. 劑量及投藥
G. 評定活性、生物可用率及藥物動力學之方法
1. 藥物動力學及可耐受性
2. 生物活性
a. 免疫球蛋白
b. 玻尿酸酶
H. 治療用途
1. 具有抗體缺乏之原發性免疫缺乏症
2. 血液惡性腫瘤繼發之後天低γ球蛋白血症
3. 川崎氏病
4. 慢性發炎性髓鞘脫失多發性神經病
5. 格巴二氏症候群
6. 特發性血小板減少性紫癜
7. 發炎性肌病：多發性肌炎、皮肌炎及包涵體肌炎
8. 蘭伯特-伊頓肌無力症候群
9. 多灶性運動神經病
10. 重症肌無力
11. 莫氏-沃特曼症候群
12. 其他疾病及病狀
I. 製品及套組
J. 實施例
A. 定義
除非另外定義，否則本文中所用之所有技術及科學術語具有與熟習本發明所屬技術者通常所瞭解之意義相同之意義。除非另外說明，否則在本文中遍及整個揭示案所參考之所有專利、專利申請案、公開申請案及公開 案、Genbank序列、資料庫、網站及其他公開材料係以引用之方式全文併入。在對於本文中之術語存在複數個定義之情況下，以本節中之彼等定義為準。在參考URL或其他該種識別符或位址之情況下，應瞭解該等標識符可變化且網際網路上之特定資訊可來回變化，但可藉由搜尋網際網路發現等效資訊。對資訊之參考證明該資訊之可用性及公眾傳播。
如本文中所用，「免疫球蛋白」、「γ球蛋白」係指源自成人捐獻者之彙集血漿的血漿蛋白製劑。IgG抗體占大多數；存在其他抗體亞類，諸如IgA及IgM。治療性免疫球蛋白可藉由增加接受者之循環抗體之血清含量來提供被動免疫。IgG抗體可例如與細菌毒素結合且中和細菌毒素；使病原體受調理(opsonize)；活化補體；且經由與細胞因子及其受體(諸如CD5、介白素-1a(IL-1a)、介白素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)及T細胞受體)相互作用來抑制病原性細胞因子及吞噬細胞。治療性免疫球蛋白可抑制自.體抗體之活性。免疫球蛋白製劑亦包括(但不限於)免疫球蛋白靜脈內注射劑(immune globulin intravenous，IGIV)、免疫球蛋白IV、治療性免疫球蛋白。免疫球蛋白製劑為熟知的且包括諸如BayGam®、Gamimune® N、Gammagard® S/D、Gammar®-P、Iveegam® EN、Panglobulin®、Polygam® S/D、Sandoglobulin®、Venoglobulin®-I、Venoglobulin®-S、WinRho® SDF等商標名。
如本文中所用，IG可治療性疾病或病狀係指針對其使用免疫球蛋白製劑之任何疾病或病狀。該等疾病及病狀包括(但不限於)其中循環抗體增加具有改善性之任何疾病，諸如免疫缺乏症；血液惡性腫瘤繼發之後天低γ球蛋白血症；川崎氏病；慢性發炎性髓鞘脫失多發性神經病(CIDP)；格巴二氏症候群；特發性血小板減少性紫癜；發炎性肌病；蘭伯特-伊頓肌無 力症候群；多灶性運動神經病；重症肌無力；莫氏-沃特曼症候群；繼發性低γ球蛋白血症(包括醫原性免疫缺乏症)；特異性抗體缺乏；急性播散性腦脊髓炎；ANCA陽性全身壞死性脈管炎；自體免疫溶血性貧血；大水皰性天疱瘡樣病；瘢痕性天疱瘡樣病；伊文氏症候群(包括具有免疫性血小板減少症之自體免疫溶血性貧血)；母胎/新生兒同種免疫性血小板減少症；噬血細胞症候群；高風險同種異體造血幹細胞移植；IgM副蛋白血症神經病；腎移植；多發性硬化；眼陣攣肌陣攣運動失調(Opsoclonus myoclonus ataxia)；落葉型天疱瘡(Pemphigus foliaceus)；尋常天疱瘡；輸血後紫癜；中毒性表皮壞死溶解/史蒂芬強生症候群(TEN/SJS)；中毒性休克症候群；阿耳滋海默氏病；全身性紅斑狼瘡；多發性骨髓瘤；膿毒病；B細胞腫瘤；創傷；及細菌、病毒或真菌感染。
如本文中所用，給藥攝生法係指所投予之免疫球蛋白量及投藥頻率。給藥攝生法隨待治療之疾病或病狀而變，且因此可不同。
如本文中所用，「實質上與靜脈內IG(IVIG)給藥攝生法相同」係指其中劑量及/或頻率處於有效治療特定疾病或病狀之量的範圍內且典型地約為或等於IV劑量或頻率之10%的攝生法。有效治療特定疾病或病狀之IVIG之量為已知的或可由熟習此項技術者憑經驗判定。舉例而言，如下文所例示，300mg/kg(亦即，假定平均成人體重為70kg則投予21公克)至600mg/kg(亦即42公克)為向具有原發性免疫缺乏疾病之患者每月投予之IVIG的典型劑量。因此，當與玻尿酸酶組合投予IG時，以等於或約為300mg/kg至600mg/kg之劑量皮下投予IG來治療原發性免疫缺乏疾病。
如本文中所用，投藥頻率係指免疫球蛋白之逐次給藥之間的時間。舉 例而言，頻率可為一週、兩週、三週、四週且隨所治療之特定疾病或病狀而變。一般而言，頻率為至少每隔兩週或三週一次，且典型地不超過一月一次。
如本文中所用，玻尿酸酶係指降解玻尿酸之酶。玻尿酸酶包括細菌玻尿酸酶(EC 4.2.99.1)、來自水蛭、其他寄生蟲及甲殼類動物之玻尿酸酶(EC 3.2.1.36)及哺乳動物型玻尿酸酶(EC 3.2.1.35)。玻尿酸酶亦包括非人源性(包括(但不限於)鼠、犬、貓、野兔、鳥、牛、綿羊、豬、馬、魚、蛙科動物、細菌)玻尿酸酶中之任一者以及來自水蛭、其他寄生蟲及甲殼類動物之任何玻尿酸酶。例示性非人類玻尿酸酶包括：來自母牛(SEQ ID NO：10及11)、小黃蜂(yellow jacket wasp)(SEQ ID NO：12及13)、蜜蜂(SEQ ID NO：14)、白臉大黃蜂(SEQ ID NO：15)、胡蜂(paper wasp)(SEQ ID NO：16)、小鼠(SEQ ID NO：17-19、31)、豬(SEQ ID NO：20-21)、大鼠(SEQ ID NO：22-24、30)、家兔(SEQ ID NO：25)、羊(SEQ ID NO：26及27)、猩猩(SEQ ID NO：28)、獼猴(cynomolgus monkey)(SEQ ID NO：29)、豚鼠(SEQ ID NO：32)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(SEQ ID NO：33)、釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogeues)(SEQ ID NO：34)及產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)(SEQ ID NO：35)之玻尿酸酶。玻尿酸酶亦包括彼等人源性玻尿酸酶。例示性人類玻尿酸酶包括HYAL1(SEQ ID NO：36)、HYAL2(SEQ ID NO：37)、HYAL3(SEQ ID NO：38)、HYAL4(SEQ ID NO：39)及PH20(SEQ ID NO：1)。在玻尿酸酶中亦包括可溶性玻尿酸酶，包括綿羊及牛PH20、可溶性人類PH20及可溶性rHuPH20。
對玻尿酸酶之提及包括前驅玻尿酸酶多肽及成熟玻尿酸酶多肽(諸如 其中已移除信號序列之彼等玻尿酸酶多肽)、其具有活性之截短形式，且包括對偶基因變異體及物種變異體(species variant)、由剪接變異體編碼之變異體及其他變異體，包括與SEQ ID NO：1及10-39中所闡明之前驅多肽具有至少40%、45%、50%、55%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性的多肽或其成熟形式。舉例而言，對玻尿酸酶之提及亦包括SEQ ID NO：50-51中所闡明之人類PH20前驅多肽變異體。玻尿酸酶亦包括彼等含有化學或轉譯後修飾之玻尿酸酶及彼等不含化學或轉譯後修飾之玻尿酸酶。該等修飾包括(但不限於)聚乙二醇化、白蛋白化(albumination)、糖基化、法尼基化(farnysylation)、羧化、羥化、磷酸化及此項技術中已知之其他多肽修飾。
如本文中所用，可溶性玻尿酸酶係指特徵在於其在生理條件下之溶解性之多肽。舉例而言，可溶性玻尿酸酶可藉由將其分溶於升溫至37℃之Triton X-114溶液之水相中來區別(Bordier等人，(1981)J.Biol.Chem.,256：1604-7)。膜錨定(諸如脂錨定)玻尿酸酶將分溶於富含清潔劑之相中，但在用磷脂酶-C處理後將分溶於含清潔劑較少之相或水相中。在可溶性玻尿酸酶中包括膜錨定玻尿酸酶，其中在可溶形式保持玻尿酸酶活性之情況下，已移除或修飾一或多個與玻尿酸酶對膜之錨定相關之區域。可溶性玻尿酸酶包括重組可溶性玻尿酸酶及彼等在天然來源(諸如來自羊或母牛之睾丸提取物)中所含有或自天然來源純化之玻尿酸酶。該種可溶性玻尿酸酶之例示物為可溶性人類PH20。其他可溶性玻尿酸酶包括綿羊(SEQ ID NO：27)及牛(SEQ ID NO：11)PH20。
如本文中所用，可溶性人類PH20或sHuPH20包括成熟多肽，其缺乏所 有或一部分處於C末端之糖基磷脂醯肌醇(GPI)附著位點使得該等多肽在表現後為可溶性的。例示性sHuPH20多肽包括成熟多肽，其具有SEQ ID NO：4-9及47-48中之任一者中所闡明之胺基酸序列。該等例示性sHuPH20多肽之前驅多肽包括信號序列。該等前驅體之例示物為SEQ ID NO：3及40-46中所闡明之彼等前驅體，其各自含有處於1-35位胺基酸位置上之35個胺基酸信號序列。可溶性HuPH20多肽亦包括在本文中所述之製備及純化方法期間或之後降解之彼等HuPH20多肽。
如本文中所用，可溶性重組人類PH20(rHuPH20)係指以重組方式表現於中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中之人類PH20之可溶解形式。可溶性rHuPH20係藉由包括信號序列之核酸來編碼且在SEQ ID NO：49中闡明。亦包括為其對偶基因變異體及其他可溶性變異體之DNA分子。編碼可溶性rHuPH20之核酸係表現於分泌成熟多肽之CHO細胞中。如在培養基中所產生，在C末端處存在異質性使得產物包括可以各種含量包括SEQ ID NO：4-9中任一或多者之物質混合物。亦包括相應對偶基因變異體及其他變異體，包括彼等與SEQ ID NO：50-51中所闡明之前驅人類PH20多肽相應之變異體。只要其他變異體保持玻尿酸酶活性且為可溶性的，則該等變異體可與SEQ ID NO：4-9及47-48中任一者具有60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之序列一致性。
如本文中所用，活性係指與全長(完全)蛋白質相關之多肽或其部分之功能活性。功能活性包括(但不限於)生物活性、催化或酶促活性、抗原性(結合抗多肽抗體或與多肽競爭結合抗多肽抗體之能力)、免疫原性、形成多聚體之能力及與多肽之受體或配體特異性結合之能力。
如本文中所用，玻尿酸酶活性係指玻尿酸酶裂解玻尿酸之能力。測定玻尿酸酶(諸如可溶性rHuPH20)之玻尿酸酶活性之試管內檢定在此項技術中為已知的且描述於本文中。例示性檢定包括下文所述之微濁度(microturbidity)檢定(例如參見實例3)，其藉由偵測當未裂解之玻尿酸與血清白蛋白結合時所形成之不溶性沈澱物來間接量測玻尿酸酶對玻尿酸之裂解。
如本文中所用，天然存在之α胺基酸之殘基為在自然界中發現之20種α胺基酸之殘基，其係藉由人類中之負載tRNA分子之同源mRNA密碼子對負載tRNA分子之特異性識別而併入蛋白質中。
如本文中所用，核酸包括DNA、RNA及其類似物(包括肽核酸(PNA))及其混合物。核酸可為單股或雙股的。當提及視情況經諸如可偵測標記物(諸如螢光或放射性標記物)標記之探針或引子時，涵蓋單股分子。該等分子典型地具有使其標靶對於探測或啟動(priming)文庫而言為統計上唯一的或具有低複本數(典型地小於5，一般小於3)之長度。探針或引子一般含有與所關注之基因互補或相同之序列的至少14個、16個或30個連續核苷酸。探針及引子可為10個、20個、30個、50個、100個或100個以上核酸長。
如本文中所用，肽係指長度為2個胺基酸至40個胺基酸之多肽。
如本文中所用，本文中所提供之各種胺基酸序列中存在之胺基酸係根據其已知之三個字母或一個字母縮寫(表1)來標示。各種核酸片段中存在之核苷酸係以此項技術中常規使用之標準單字母名稱來表示。
如本文中所用，「胺基酸」為含有胺基及羧酸基團之有機化合物。多肽 含有兩個或兩個以上之胺基酸。出於本文中之目的，胺基酸包括20種天然存在之胺基酸、非天然胺基酸及胺基酸類似物(亦即，其中α碳具有側鏈之胺基酸)。
如本文中所用，「胺基酸殘基」係指在使多肽在其肽鍵處化學消化(水解)後所形成之胺基酸。本文中所述之胺基酸殘基假定為呈「L」異構形式。所指定之呈「D」異構形式之殘基可替代任何L-胺基酸殘基，只要多肽仍保持所需功能特性。NH2係指多肽之胺基末端處存在之自由胺基。COOH係指多肽之羧基末端處存在之自由羧基。符合J.Biol.Chem.,243：3557-3559(1968)中所述且37 C.F.R.§§1.821-1.822所採用之標準多肽命名，表1中展示胺基酸殘基之縮寫：
應注意，本文中藉由各式所表示之所有胺基酸殘基序列在胺基末端至羧基末端之習知方向上具有自左至右之定向。另外，短語「胺基酸殘基」經廣泛定義以包括對應表(表1)中所列之胺基酸及經修飾及不常見之胺基酸(諸如37 C.F.R.§§1.821-1.822中所提及且以引用之方式併入本文中之彼等胺基酸)。此外，應注意，在胺基酸殘基序列之開端或末端處之短劃線指示與具有一或多個胺基酸殘基之另一序列、與胺基端基(諸如NH2)或與羧基端基(諸如COOH)鍵結之肽鍵。
如本文中所用，「天然存在之胺基酸」係指多肽中存在之20種L-胺基酸。
如本文中所用，「非天然胺基酸」係指具有類似於天然胺基酸之結構但已在結構上經修飾以模擬天然胺基酸之結構及反應性的有機化合物。非天然存在之胺基酸因此包括例如除20種天然存在之胺基酸以外之胺基酸或胺基酸類似物且包括(但不限於)胺基酸之D-立體異構體。例示性非天然胺基酸描述於本文中且為熟習此項技術者所知。
如本文中所用，DNA構築體為單股或雙股、線狀或環狀DNA分子，其含有以在自然界中未發現之方式組合及並列之DNA片段。DNA構築體係作為人類操作之產物存在且包括所操作分子之純系及其他複本。
如本文中所用，DNA鏈段為具有特定屬性之較大DNA分子之一部分。舉例而言，編碼特定多肽之DNA鏈段為較長DNA分子之一部分，諸如質體或質體片段，當自5'至3'方向讀取時，其編碼特定多肽之胺基酸序列。
如本文中所用，術語多核苷酸意謂自5'末端至3'末端讀取之去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸鹼基之單股或雙股聚合物。多核苷酸包括RNA及DNA且可自天然來源分離、試管內合成或自天然與合成分子之組合製備。多核苷酸分子之長度在本文中係以核苷酸(縮寫為「nt」)或鹼基對(縮寫為「bp」)形式給出。在上下文允許之情況下術語核苷酸係用於單股及雙股分子。當該術語用於雙股分子時，其用於表示總長且應瞭解其等同於術語鹼基對。熟習此項技術者應認識到，雙股多核苷酸之兩條鏈可在長度上略微不同且其末端可交錯排列；因此雙股多核苷酸分子中之所有核苷酸可不成對。該等不成對末端之長度一般應不超過20個核苷酸。
如本文中所用，兩個蛋白質或核酸之間的「相似性」係指蛋白質之胺基酸序列或核酸之核苷酸序列之間的關聯性。相似性可基於殘基與其中所含有之殘基之序列一致度及/或同源度。評定蛋白質或核酸之間的相似度之方法為熟習此項技術者所知。舉例而言，在評定序列相似性之一方法中，以產生序列之間的最大程度之一致性的方式使兩個胺基酸或核苷酸序列比對。「一致性」係指胺基酸或核苷酸序列之不變程度。胺基酸序列及在某種程度上核苷酸序列之比對亦可考慮胺基酸(或核苷酸)中之保守差異及/或常見取代。保守差異為保留所涉及之殘基之物理化學特性之差異。比對可為全局的(在序列之整個長度上且包括所有殘基之所比較序列之比對)或局部的(僅包括最相似區域之一部分序列之比對)。
「一致性」本身具有此項技術公認之意義且可使用所公開之技術來計算(參見例如：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.編，Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.編，Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.及Griffin,H.G.編，Humana Press,New Jersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；及Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.及Devereux,J.編，M Stockton Press,New York,1991)。雖然存在許多量測兩個多核苷酸或多肽之間的一致性之方法，但術語「一致性」為熟習此項技術者所熟知(Carillo,H.& Lipton,D.,SIAM J Applied Math 48：1073(1988))。
如本文中所用，同源性(關於核酸及/或胺基酸序列)意謂約大於或等於25%序列同源性，典型地大於或等於25%、40%、50%、60%、70%、80%、 85%、90%或95%序列同源性；必要時可說明精確百分比。出於本文中之目的，除非另外說明，否則術語「同源性」與「一致性」常常可互換使用。一般而言，為測定同源性或一致性百分比，比對序列以獲得最高程度之匹配(參見例如：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.編，Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.編，Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.及Griffin,H.G.編，Humana Press,New Jersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；及Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.及Devereux,J.編，M Stockton Press,New York,1991；Carillo等人(1988)SIAM J Applied Math 48：1073)。藉由序列同源性，保守胺基酸之數目可藉由標準比對演算程式來測定且可與由每一供應者所建立之預設空隙處罰一起使用。實質上同源之核酸分子始終沿所關注核酸之長度以中等嚴格度或高嚴格度典型雜交。亦涵蓋含有簡并密碼子來代替雜交核酸分子中之密碼子的核酸分子。
無論任何兩個分子具有至少60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%「同一性」或「同源性」之核苷酸序列或胺基酸序列，一致性或同源性可使用已知電腦算法，諸如使用如Pearson等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444中之預設參數之「FASTA」程式(其他程式包括GCG程式包(Devereux,J.等人，Nucleic Acids Rescarch 12(I)：387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul,S.F.等人，J Molec Biol 215：403(1990)；Guide to Huge Computers,Martin J.Bishop編，Academic Press,San Diego,1994；及Carillo等人(1988)SIAM J Applied Math 48：1073))。舉例而言，國家生物技術資訊中心資 料庫(National Center for Biotechnology Information database)之BLAST功能可用於測定一致性。其他市售或公開可用之程式包括DNAStar「MegAlign」程式(Madison,WI)及威斯康星大學(University of Wisconsin)Genetics Computer Group(UWG)「Gap」程式(Madison WI)。蛋白質及/或核酸分子之同源性或一致性百分比可藉由例如使用GAP電腦程式比較序列資訊來測定(例如Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443(如藉由Smith及Waterman((1981)Adv.Appl.Math.2：482)所改編))。簡而言之，GAP程式將相似性定義為相似之所比對符號(亦即核苷酸或胺基酸)的數目除以兩個序列中較短者中之總符號數目。GAP程式之預設參數可包括：(1)如由Schwartz及Dayhoff編，ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE,National Biomedical Research Foundation，第353-358頁(1979)所述，Gribskov等人(1986)Nucl.Acids Res.14：6745之一元比較矩陣(含有一致性之1值及非一致性之0值)及加權比較矩陣；(2)每一空隙3.0之處罰及每一空隙中之每一符號之額外0.10之處罰；及(3)末端空隙無處罰。
因此，如本文中所用，術語「一致性」或「同源性」表示測試與參照多肽或多核苷酸之間的比較。如本文中所用，術語「至少90%一致性」係指相對於多肽之參照核酸或胺基酸序列90%至99.99%之一致性百分比。90%或90%以上程度之一致性指示下列事實，假定出於例示之目的比較100個胺基酸長度之測試及對照多肽。測試多肽中不超過10%(亦即，100個胺基酸中有10個胺基酸)之胺基酸與參照多肽中之胺基酸不同。可在測試多核苷酸與參照多核苷酸之間進行類似比較。該等差異可表現為隨機分布於多肽之整個長度範圍內之點突變或其可在不同長度之一或多個位置上叢集直至 達到最大可容許差異，例如10/100胺基酸差異(約90%一致性)。差異係定義為核酸或胺基酸取代、插入或缺失。在同源度或一致度高於約85%-90%之情況下，結果應獨立於程式及空隙參數組；該種高一致度常常可藉由手動比對來容易地評定而不依靠軟體。
如本文中所用，比對序列係指使用同源性(相似性及/或一致性)來比對核苷酸或胺基酸序列中之相應位置。典型地比對以50%或50%以上一致性相關之兩個或兩個以上序列。比對序列組係指在相應位置處比對之2個或2個以上序列且可包括與基因組DNA序列比對之源自RNA之比對序列(諸如EST及其他cDNA)。
如本文中所用，「引子」係指可在合適緩衝液中且在合適溫度下於合適條件(例如，在4種不同核苷三磷酸及聚合劑(諸如DNA聚合酶、RNA聚合酶或反轉錄酶)存在下)下可充當模板引導型DNA合成之起始點的核酸分子。應瞭解，某一核酸分子可用作「探針」及「引子」。然而，引子具有3'羥基以供延長。引子可用於多種方法中，包括例如聚合酶鏈反應(PCR)、反轉錄酶(RT)-PCR、RNA PCR、LCR、多重PCR(multiplex PCR)、鍋柄式PCR(panhandle PCR)、捕捉PCR(capture PCR)、表現PCR、3'及5' RACE、原位PCR、連接介導型PCR及其他擴增方案。
如本文中所用，「引子對」係指包括與待擴增(例如藉由PCR)之序列之5'末端雜交的5'(上游)引子及與待擴增序列之3'末端之互補序列雜交的3'(下游)引子的一組引子。
如本文中所用，「特異性雜交」係指藉由核酸分子(例如寡聚核苷酸)與目標核酸分子之互補鹼基配對來黏接。熟習此項技術者熟悉影響特異性 雜交之試管內及活體內參數，諸如特定分子之長度及組成。與試管內雜交尤其相關之參數進一步包括黏接及洗滌溫度、緩衝液組成及鹽濃度。移除非特異性結合之核酸分子之例示性洗滌條件在高嚴格度下為0.1×SSPE、0.1% SDS、65℃且在中等嚴格度下為0.2×SSPE、0.1% SDS、50℃。等效嚴格度條件在此項技術中為已知的。熟習此項技術者可容易地調節此等參數來達成核酸分子與適於特定應用之目標核酸分子的特異性雜交。當提及兩個核苷酸序列時，互補意謂兩個核苷酸序列能夠雜交，其中對置核苷酸之間的錯配典型地小於25%、15%或5%。必要時，說明互補性之百分比。典型地，兩個分子經選擇以使其在高嚴格度條件下雜交。
如本文中所用，實質上與產物相同意謂足夠相似以致所關注之特性充分保持不變使得實質上相同之產物可代替產物使用。
如本文中所用，亦應瞭解，術語「實質上相同」或「相似」隨如熟習相關技術者所理解之內容而變。
如本文中所用，對偶基因變異體或對偶基因變異係指佔據相同染色體位點之基因的兩種或兩種以上替代形式中之任一者。對偶基因變異天然地經由突變而發生且可引起群體內之表現型多型現象。基因突變可為沉默的(所編碼之多肽未發生變化)或可編碼具有改變之胺基酸序列的多肽。術語「對偶基因變異體」在本文中亦用於表示由基因之對偶基因變異體所編碼之蛋白質。基因之參照形式典型地編碼物種之群體或單個參照成員之多肽的野生型形式及/或主要形式。典型地，包括物種間及物種內之變異體的對偶基因變異體典型地與相同物種之野生型及/或主要形式具有至少80%、90%或90%以上之胺基酸一致性；一致度視基因而定且與比較為種間或種內 比較無關。種內對偶基因變異體一般與野生型及/或主要形式具有至少約80%、85%、90%或95%或95%以上之一致性，包括與多肽之野生型及/或主要形式具有96%、97%、98%、99%或99%以上之一致性。本文中對對偶基因變異體之提及一般係指相同物種之成員之間的蛋白質變異。
如本文中所用，在本文中可與「對偶基因變異體」互換使用之「對偶基因」係指基因或其部分之替代形式。對偶基因佔據同源樑色體上之相同位點或位置。當個體具有基因之兩個相同對偶基因時，認為該個體關於彼基因或對偶基因為純合的。當個體具有基因之兩個不同對偶基因時，認為該個體關於該基因為雜合的。特定基因之對偶基因在單個核苷酸或若干核苷酸中可互不相同，且可包括核苷酸之取代、缺失及插入。基因之對偶基因亦可呈含有突變之基因形式。
如本文中所用，物種變異體係指不同物種(包括不同哺乳動物物種，諸如小鼠及人類)間之多肽變異體。
如本文中所用，剪接變異體係指藉由對產生不只一種類型之mRNA的基因組DNA之初級轉錄物之分化加工所產生之變異體。
如本文中所用，修飾係指對多肽之胺基酸序列或核酸分子中之核苷酸序列之修飾，且分別包括胺基酸及核苷酸之缺失、插入及置換。修飾多肽之方法對於熟習此項技術者為常規的，諸如藉由使用重組DNA方法。
如本文中所用，術語啟動子意謂含有提供RNA聚合酶結合及轉錄開始之DNA序列的一部分基因。啟動子序列通常但不總是見於基因之5'非編碼區中。
如本文中所用，經分離或純化之多肽或蛋白質或其生物學活性部分實 質上不含來自細胞或組織(蛋白質自其得到)之細胞物質或其他污染蛋白質，或實質上不含化學合成時之化學前驅體或其他化學物質。若如藉由熟習此項技術者所用之用於評定純度之標準分析方法(諸如薄層層析法(TLC)、凝膠電泳及高效液相層析法(HPLC))所測定，製劑似乎不含可易於偵測之雜質，或其足夠純以至進一步純化不會可偵測地改變該物質之物理及化學特性(諸如酶及生物活性)，則可將製劑測定為實質上不含雜質的。用於純化化合物以產生實質上化學純化合物之方法為熟習此項技術者所知。然而，實質上化學純化合物可為立體異構體之混合物。在該等情況下，進一步純化可增加化合物之比活性。
術語實質上不含細胞物質包括蛋白質製劑，其中蛋白質係自細胞之細胞組份所分離，蛋白質係自該等細胞所分離或以重組方式產生。在一具體實例中，術語實質上不含細胞物質包括酶蛋白質製劑，其具有小於約30%(以乾重計)之非酶蛋白質(在本文中亦稱作污染蛋白質)，一般小於約20%之非酶蛋白質或10%之非酶蛋白質或小於約5%之非酶蛋白質。當以重組方式產生酶蛋白質時，其亦實質上不含培養基，亦即培養基相當於酶蛋白質製劑體積之小於約或等於20%、10%或5%。
如本文中所用，術語實質上不含化學前驅體或其他化學物質包括酶蛋白質製劑，其中蛋白質係自涉及該蛋白質合成之化學前驅體或其他化學物質所分離。該術語包括酶蛋白質製劑，該等酶蛋白質製劑具有小於約30%(以乾重計)、20%、10%、5%或5%以下之化學前驅體或非酶化學物質或組份。
如本文中所用，與合成有關之(例如)合成核酸分子或合成基因或合 成肽係指藉由重組方法及/或藉由化學合成方法所產生之核酸分子或多肽分子。
如本文中所用，藉由使用重組DNA方法之重組方式進行製備意謂使用熟知之分子生物學方法來表現由選殖DNA編碼之蛋白質。
如本文中所用，載體(或質體)係指用於將異源核酸引入細胞中以使其表現或複製之分立元件。載體典型地保持為游離型，但可經設計以達成將基因或其部分整合至基因組之染色體中。亦涵蓋為人工染色體之載體，諸如酵母人工染色體及哺乳動物人工染色體。該等運載體之選擇及使用為熟習此項技術者所熟知。
如本文中所用，表現載體包括與調節序列(諸如啟動子區)操作性連接之能夠表現DNA的載體，該等調節序列能夠達成該等DNA片段之表現。該等額外鏈段可包括啟動子及終止子序列，且視情況可包括一或多個複製起點、一或多個可選擇標記、增強子、聚腺苷酸化信號及其類似物。表現載體一般源自質體或病毒DNA或可含有此兩者之元件。因此，表現載體係指重組DNA或RNA構築體，諸如質體、噬菌體、重組病毒或其他載體，其在引入合適宿主細胞後引起選殖DNA之表現。合適表現載體為熟習此項技術者所熟知且包括彼等在真核細胞及/或原核細胞中可複製之載體及彼等保持游離型之載體或彼等整合至宿主細胞基因組中之載體。
如本文中所用，載體亦包括「病毒載體」。病毒載體為操作性連接至外源基因以(作為運載體或穿梭載體)將外源基因轉移至細胞中之工程改造病毒。
如本文中所用，當提及DNA鏈段時，可操作地或操作性連接意謂該等 鏈段經排列以使其功能與其預期目的相一致，例如轉錄在啟動子中開始且經由編碼鏈段進行至終止子。
如本文中所用，術語評定意欲包括在獲得樣品中所存在之蛋白酶或其結構域(domain)之活性的絕對值的意義上且亦在獲得表明該活性程度之指數、比率、百分比、視覺或其他值之意義上之定量及定性測定。評定可為直接或間接的且實際上所偵測之化學物質當然無需為蛋白質水解產物自身，但可為例如其衍生物或一些其他物質。舉例而言，可諸如藉由SDS-PAGE及用庫馬斯亮藍(Coomasie blue)對蛋白質染色來偵測補體蛋白質之裂解產物。
如本文中所用，生物活性係指化合物之活體內活性或活體內投予化合物、組合物或其他混合物後所產生之生理反應。生物活性因此涵蓋該等化合物、組合物及混合物之治療作用及醫藥活性。生物活性可在經設計以測試或使用該等活性之試管內系統中進行觀察。因此，出於本文中之目的，蛋白酶之生物活性為其使多肽水解之催化活性。
如本文中所用，當提及兩個核酸序列時，等效意謂所討論之兩個序列編碼胺基酸或等效蛋白質之相同序列。當等效用於提及兩個蛋白質或肽時，其意謂兩個蛋白質或肽具有實質上相同之胺基酸序列而僅僅胺基酸取代不會實質上改變該蛋白質或肽之活性或功能。當等效係指特性時，該特性無需以相同程度呈現(例如，兩個肽可展現相同類型酶促活性之不同速率)，但該等活性通常為實質上相同的。
如本文中所用，「調節」或「改變」係指諸如蛋白質之分子之活性變化。例示性活性包括(但不限於)諸如信號轉導之生物活性。調節可包括活性 增加(亦即，向上調節或促效活性)、活性降低(亦即，向下調節或抑制)或任何其他活性變化(諸如週期性、頻率、持續時間、動力學或其他參數之變化)。調節可視情況而變且典型地將調節與指定狀態相比擬，例如野生型蛋白質、處於構成狀態之蛋白質或如指定細胞類型或條件下所表現之蛋白質。
如本文中所用，組合物係指任何混合物。其可為溶液、懸浮液、液體、散劑、糊劑、水溶液、非水溶液或其任何組合。
如本文中所用，組合係指兩個或兩個以上項目之間或之中的任何聯合。組合可為兩個或兩個以上之分開項目(諸如兩個組合物或兩個集合)，可為其混合物(諸如兩個或兩個以上項目之單個混合物)或其任何變體。組合之組份一般在功能上有關或相關。
如本文中所用，套組為視情況包括其他組份(諸如額外試劑)及該組合或其組份之使用說明書之經包裝組合。
如本文中所用，「疾病或病症」係指在有機體中由包括(但不限於)感染、後天病狀、遺傳病狀之原因或病狀所引起之病理病狀，且該病理病狀之特徵在於可識別之症狀。本文中所關注之疾病及病症為彼等可由免疫球蛋白治療之疾病及病症。
如本文中所用，「治療」具有疾病或病狀之個體意謂治療後個體之症狀部分或完全減輕或保持靜止狀態。因此，治療涵蓋預防、治療及/或治癒。預防係指預防潛在疾病及/或預防症狀惡化或疾病進展。治療亦涵蓋本文中所提供之免疫球蛋白製劑及組合物之任何醫藥用途。
如本文中所用，醫藥學有效劑包括任何治療劑或生物活性劑，包括(但 不限於)例如麻醉劑、血管收縮劑、分散劑、習知治療藥物(包括小分子藥物及治療性蛋白質)。
如本文中所用，治療意謂改善或以其他方式有利地改變病狀、病症或疾病或其他適應症之症狀的任何方式。
如本文中所用，治療作用意謂由個體治療所引起之改變、典型地改良或改善疾病或病狀之症狀或治癒疾病或病狀的作用。治療有效量係指向個體投予後產生治療作用之組合物、分子或化合物之量。
如本文中所用，術語「個體」係指動物，包括諸如人類之哺乳動物。
如本文中所用，患者係指人類個體。
如本文中所用，藉由諸如投予醫藥組合物或其他治療劑之治療來改善特定疾病或病症之症狀係指可歸因於投予組合物或治療劑或與投予組合物或治療劑有關之任何症狀減輕作用(無論持久或暫時的，持續或短暫的)。
如本文中所用，防止或預防係指降低疾病或病狀發生風險之方法。
如本文中所用，「治療有效量」或「治療有效劑量」係指至少足以產生治療作用之劑、化合物、物質或含有化合物之組合物之量。因此，其為預防、治癒、改善、抑制或部分抑制疾病或病症之症狀所必需之量。
如本文中所用，單位劑型係指如此項技術中所知適用於人類及動物個體且經個別包裝之物理分立單元。
如本文中所用，單一劑量調配物係指用於直接投藥之調配物。
如本文中所用，「製品」為製成且出售之產品。如貫穿本申請案所使用，該術語意欲涵蓋包裝物品中所容納之IG及玻尿酸酶組合物。
如本文中所用，流體係指任何可流動之組合物。因此流體涵蓋呈半固 體、糊劑、溶液、水性混合物、凝膠、洗劑、乳膏劑及其他該等組合物形式之組合物。
如本文中所用，「套組」係指本文中所提供之組合物與出於包括(但不限於)活化、投藥、診斷及評定生物活性或特性之目的之另一項目的組合。套組視情況包括使用說明書。
如本文中所用，細胞提取物或溶解產物係指由溶解或破裂之細胞製成之製劑或部分。
如本文中所用，動物包括任何動物，諸如(但不限於)包括人類、大猩猩及猴之靈長類動物；齧齒動物，諸如小鼠及大鼠；家禽，諸如雞；反芻動物，諸如山羊、母牛、鹿、羊；綿羊，諸如豬及其他動物。非人類之動物不包括人類作為所涵蓋之動物。本文中所提供之酶係來自任何來源(動物、植物、原核及真菌來源)。大部分酶具有包括哺乳動物起源之動物起源。
如本文中所用，對照係指除未用測試參數處理以外與測試樣品實質上相同之樣品，或者若其為血漿樣品，則其可來自未受所關注之病狀影響之正常志願者。對照亦可為內部對照。
如本文中所用，除非上下文另外清楚規定，否則單數形式「一」及「該」包括複數個指示物。因此，例如，對包含「細胞外域」之化合物之提及包括具有一個或複數個細胞外域之化合物。
如本文中所用，範圍及量可以「約」特定值或範圍之形式來表示。約亦包括精確量。因此「約5個鹼基」意謂「約5個鹼基」及「5個鹼基」。
如本文中所用，「任選」或「視情況」意謂出現或不出現隨後所述之事件或情境，且該描述包括該事件或情境出現之情況及該事件或情境不出現 之情況。舉例而言，視情況經取代之基團意謂該基團未經取代或經取代。
如本文中所用，除非另外指示，否則任何保護基團、胺基酸及其他化合物之縮寫係根據其一般用法、公認縮寫或IUPAC-IUB生物化學命名委員會(IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature)(參見(1972)Biochem.11：1726)。
B. 免疫球蛋白(IG)之皮下投藥
本文中提供治療IG可治療性疾病及病狀之方法及用途，其係藉由皮下投予與可溶性玻尿酸酶組合之免疫球蛋白(IG)。因此，亦提供IG與可溶性玻尿酸酶之組合。藉助於玻尿酸酶分解細胞外基質中之玻尿酸的能力，玻尿酸酶有助於治療劑之皮下輸注。免疫球蛋白為治療劑，其主要藉由靜脈內投予以治療具有免疫缺乏症之個體(稱作IVIG治療)加以給予。在玻尿酸酶存在下，IG之生物可用率大於IVIG治療後IG之生物可用率之90%。因此，在本文中所提供之方法及用途中，玻尿酸酶與IG之組合治療允許以類似於IVIG治療之劑量及頻率來皮下投予免疫球蛋白。因此，在本文中所提供之方法及用途中，當在可溶性玻尿酸酶存在下皮下投予時，對於特定適應症而言IG可以主要IVIG劑量每月一次投予。此外，因為玻尿酸酶用以開放皮膚中之流動通道，所以其可加快輸注速率。因此，皮下投予與玻尿酸酶共同調配及/或共同投予之IG的方法增加輸注速率且從而減少IG治療之傳遞時間。
缺陷型抗體形成為大多數原發性免疫缺乏(PID)疾病之最常見異常症狀；其最常反映於血清免疫球蛋白減少，其繼而尤其導致竇肺呼吸道對細菌感染之敏感性增加。在具有抗體缺乏(諸如X-連結無γ球蛋白血症、免 疫球蛋白重鏈缺失、選擇性免疫球蛋白G(IgG)亞類缺乏、常見變異性免疫缺乏症或X-連結高免疫球蛋白M症候群)之個體中發現免疫球蛋白含量減少。在具有歸因於T細胞及B細胞缺乏之複合免疫缺乏症(諸如(但不限於)嚴重複合免疫缺乏症或維斯科特-奧爾德裏奇症候群)之個體中亦發現免疫球蛋白含量減少(IUIS Scientific Committee,1999)。
具有此等疾病之個體需要用免疫球蛋白產品進行替代治療以防止或降低感染嚴重度。最初，免疫球蛋白替代治療係以肌肉內途徑給予，但1981年開始已藉由靜脈內(IV)途徑治療絕大多數患者。當前，美國之大多數免疫球蛋白產品係用於IV投予。然而，近年來已開發用於皮下投予之免疫球蛋白製劑(Gardulf等人(2006)Curr.Opin.Allergy Clin.Immunol.,6：434-42；Gardulf等人(2006)J Clin.Immunol.,26：177-85；Ochs等人(2006)J Clin.Immunol.,26：265-73)。至少一種產品Vivaglobin®經批准用於皮下投予。
目前使用之所有免疫球蛋白製劑係以16%來調配，相比而言，IVIG製劑係以5%至12%來調配。相對於IV製劑之較高濃度使得輸注體積較小，該等製劑不可靜脈內輸注。免疫球蛋白替代治療之該等皮下方法視作安全有效且亦受到患者高度評估，因為其具有低全身性不良反應風險且引起與每月IV輸注相比較高之最低血清IgG濃度(Gardulf等人(1995)J Adv.Nurs.,21：917-27；Gardulf等人(1993)Clin.Exp.Immunol.,92：200-4；Gardulf等人(1991)Lancet,338：162-6)。
皮下投予之免疫球蛋白之生物可用率一般小於靜脈內輸注之免疫球蛋白之生物可用率。免疫球蛋白可直接到達血液中，且經3至5日緩慢平衡至血管外代謝區(Schiff等人(1986)J.Clin.Immunol.,6：256-64)。皮下投予之 免疫球蛋白自皮下空間緩慢吸收至血液中且同時與血管外代謝區平衡，不存在高IV峰值。未對生物可用率進行廣泛研究，但在ZLB-Behring製劑(亦即Vivaglobin®)之新近試驗中，藉由量測曲線下面積(AUC)測定出僅67%之免疫球蛋白得到吸收且因此推薦劑量為IV劑量之137%(Ochs等人(2006)J Clin.Immunol.,26：265-73)。儘管比較2種不同投藥途徑及頻率之AUC存在技術困難，但向家兔皮內投予免疫球蛋白之研究暗示經由皮下途徑存在降低之生物可用率。此可能歸因於大蛋白質分子之吸收模式，其不能經由毛細管壁容易地擴散且必須經由淋巴管吸收(Supersaxo等人(1990)Pharm.Res.,7：167-9)。
除與IG之皮下投藥有關之生物可用率問題以外，SC投藥之主要缺點在於在每一部位中僅可輸注小體積，使得以每週或每兩週(每隔一週)計需要使用多個部位。一般而言，使用16%溶液時，每部位可輸注約20ml；且接受每公斤體重(BW)400mg之成人患者因此需要每週至少3個部位或每月12個部位。即使每週或每兩週投藥比每月IV輸注具有保持較佳之最低含量之附加優勢，但對於許多患者而言多次針頭插入之要求已成為威懾因素。
SC空間係由以凝膠狀物質(玻尿酸)填充之膠原蛋白網狀物形成。玻尿酸經約5h之半衰期置換且主要負責阻礙流體流經組織。玻尿酸酶暫時消化玻尿酸，從而促進輸注液進入皮下空間。玻尿酸在24小時內恢復，未留下可觀察之變化。因此，歸因於玻尿酸酶經由降解葡糖胺聚糖而開放間質空間中之通道的能力，投予可溶性玻尿酸酶允許分子擴散，從而改良該等共同調配或共同投予之分子之生物可用率、藥物動力學及/或藥效學特徵。
在一些實例中，與玻尿酸酶皮下共同投予之IG之生物可用率為IVIG生物可用率之70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。生物可用率典型地大於90%。此外，與可溶性玻尿酸酶共同投予允許在單個皮下部位處大體積輸注。舉例而言，可以單個坐姿在單個部位投予至多600ml或更大體積之IG，舉例而言，在單次投藥中可在單個部位投予200ml、300ml、400ml、500ml、600ml或600ml以上。因此，以等於或介於5%-12%之間調配之IG製劑可以等於每月一次IVIG劑量之劑量(例如等於或約為100mg/kg、200mg/kg、300mg/kg、400mg/kg、500mg/kg、600mg/kg或600mg/kg以上)與可溶性玻尿酸酶皮下共同投予。因此，藉由在可溶性玻尿酸酶存在下皮下投予IG，解決了與IG之皮下投藥相關之一種或全部顧慮及問題。因此，藉助於玻尿酸酶之擴散特性，在可溶性玻尿酸酶存在下皮下投予IG允許以每月一次IVIG頻率投予IVIG劑量，同時保持IVIG生物可用率。
以下章節描述本文中之組合中之例示性免疫球蛋白及可溶性玻尿酸酶，其製造方法及使用其治療IG可治療性疾病及病狀之方法。
C. 免疫球蛋白
本文中提供免疫球蛋白(IG，亦稱作γ球蛋白或IgG)，其可與可溶性玻尿酸酶組合用於皮下投藥。IG用以藉由調節補體活性、抑制自體抗體產生、飽和或阻斷巨噬細胞及B淋巴細胞上之Fc受體及抑制諸如細胞因子、趨化因子及金屬蛋白酶之發炎性介體產生來增強免疫系統。
IG為在高等動物血漿中發現之蛋白質片段且含有大量具有不同特異性之抗體。一般而言，IG含有血清免疫球蛋白，其可為任何個體基因型(諸 如IgG)及各種亞類(IgA、IgM、IgD、IgE)。各種免疫球蛋白或亞類可以各種濃度及特異性存在，在免疫球蛋白製劑之間該等濃度及特異性可視例如血漿捐獻者對抗原之暴露(例如，藉由接種方式)而不同。免疫球蛋白常常以在血清中正常所見之量存在(參見表2)，但可使用純化步驟以改變特定免疫球蛋白類別之比率。IG製劑典型地含有90%或90%以上之IgG，諸如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之IgG。免疫球蛋白可為多株或單株的。製劑典型地包括高百分比之單體IgG及低IgA含量。
免疫球蛋白可自人類或動物血液分離或以其他方式產生，例如藉由重組DNA技術或融合瘤(hybridoma)技術製備。舉例而言，免疫球蛋白可使用任何合適分離程序(例如醇沈澱或離子交換分離)而自組織、淋巴細胞融合瘤培養物、血漿或血清或重組細胞培養物獲得。一般而言，IG可自血漿藉由醇分餾來製備，該方法(諸如)最初由Cohn使用且由Oncley修改(柯恩-昂柯利(Cohn-Oncley)方法，參見例如Cohn等人(1946)J.Am.Chem.Soc.68：459-475；Oncley等人(1949)J Am.Chem.Soc.,71：541-550)。在純化中使用醇可使潛在污染病毒滅活。柯恩-昂柯利方法可使蛋白質變性且聚集，其可 產生可用作抗體-抗原複合物之高分子量形式，該等抗體-抗原複合物具有自由固定補體之能力。
為防止該等不需要之作用，經修改之柯恩-昂柯利方法已經發展用於製備及純化IG。各種該等程序為已知的且可經調適及修改以用於本文中之IG製備。鑒於此項技術中已知且可用之詳細方法，製備IG製劑係在此項技術之技術範圍內。典型地使用一級低溫乙醇分餾及二級分離來製造IG，該等分離可包括化學修飾、在存在或不存在胃蛋白酶之情況下於4.0之pH下培育、PEG沈澱、離子交換層析、酶促裂解、溶劑清潔劑處理及透濾及超濾中之任一或多者。
舉例而言，藉由習知技術(諸如超離心或排阻層折)分離IG聚集體使得獲得具有低抗補體活性之產物成為可能。IG製備之其他方法包括(但不限於)藉助於乙二醇聚合物使人類血漿分離之方法(Polson等人(1964)Biochim.Biophys.Acta.,82：463-475)；自由柯恩分離所分離之物質開始將聚乙二醇(PEG)作為純化劑併入(餾分II或II+III，參見例如美國專利第4,093,606號及第4,165,370號)；及其他使用聚乙二醇之純化製程之類似方法(EP 0246579)。此外，已描述用於獲得展現低抗補體活性之IG的方法，其係藉由用諸如胃蛋白酶、血纖維蛋白溶酶、固定化胰蛋白酶之酶處理、在中度酸性pH下處理、B-丙內酯處理、使用聚乙二醇作為沈澱劑之分離方法及美國專利第4,093,606號、第4,126,605號、第3,966,906號及第4,124,576中所述之其他技術來進行。其他方法係基於藉由用還原劑、醇化、烷基化及磺化處理IG分子而對IG分子之化學及部分修飾(參見例如美國專利第6,875,848號)。離子交換層析可用於自用於獲得IG製劑之起始物質消除不 合需要之污染物(參見例如美國專利第3,869,436號、EP 91300790及WO 94/29334)。EP0440483描述基於離子交換層析及在弱酸性pH下透濾而適用於促進靜脈內產品製備之技術組合。亦描述此項技術中之其他方法且其為熟習此項技術者所知(參見例如美國專利第5,177,194號及第6,875,848號)
IG製劑應經處理以移除病毒負荷。存在兩種降低病毒負荷之方法：病毒滅活及病毒分離或移除。使病毒滅活之例示性方法包括(但不限於)低溫乙醇分餾、加熱(巴氏殺菌(pasterurization))、溶劑/清潔劑及酸性環境(低pH)。舉例而言，溶劑/清潔劑方法已經證明具有針對VSV(水皰性口炎病毒)、辛得比斯病毒(Sindbis virus)、HIV、HBV(B性肝炎病毒)及HCV(C型肝炎病毒)之殺病毒作用。例示性病毒分離或移除包括(但不限於)低溫乙醇分餾、相分離或PEG沈澱、親和層析、離子交換或凝膠排阻層析及過濾。
亦須製備最終經純化之調配物以避免過度聚集且使蛋白質穩定。可藉由製備經冷凍乾燥之製劑以改良儲存之穩定性來使IG製劑之聚集降至最低，該經冷凍乾燥之製劑在使用前用稀釋劑復水。在此項技術中熟知之增加IG製劑穩定性之另一方法為將蛋白質穩定賦形劑添加至IG製劑中。已知賦形劑包括(但不限於)糖、多元醇、胺基酸、胺、鹽、聚合物及界面活性劑。舉例而言，美國專利第4,499,073號描述經由選擇pH及離子強度進行穩定；日本專利54020124揭示將胺基酸添加至肌肉內製劑中以使其儲存穩定且安全；JP 57031623及JP 57128635揭示在5%至15% IG製劑中使用精胺酸及/或離胺酸與NaCl以達成肌肉內製劑之長期穩定性；JP 4346934揭示使用低電導率(小於毫姆歐)、5.3至5.7之pH及包括PEG、人血清白蛋 白及甘露醇之任選的一或多種穩定劑；US 4,439,421教示添加親水性巨分子、多元醇、及另一蛋白質以穩定而防止抗補體產生；U.S.5,945,098揭示若藉由添加胺基酸(0.1M至0.3M甘胺酸)及非離子型清潔劑(聚山梨醇酯及PEG)使其成為等張溶液則穩定；US 4,186,192揭示包括胺基酸之各種添加劑；WO 2005/049078揭示用麥芽糖及另外達到0.1M之甘胺酸進行穩定；US 4,362,661揭示使用中性及鹼性胺基酸來將穩定性賦予5% IG製劑。亦可製備穩定液體調配物，其使用具有極低離子強度及4.25之pH(美國專利第4,396,608號)或5-6之弱酸性pH(EP 0278422)之水性介質中的碳水化合物。
亦可控制IG製劑之二聚體形成。舉例而言，美國專利第5,871,736號揭示IG製劑(尤其液體製劑)含有一或多種兩親媒性穩定劑以使其穩定而防止二聚體形成。兩親媒性穩定劑包括菸鹼酸及其衍生物，特定而言菸鹼醯胺，及主要連同上述穩定劑之具有不帶電之親脂性側鏈之胺基酸，例如苯丙胺酸、甲硫胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸及纈胺酸。
製劑可藉由諸如本文中所述之任何方法的此項技術中已知之方法來製備。然而，一般可將最終製劑之pH調節至相對較高但仍為酸性pH，亦即處於約4.2至5.4之pH範圍內，諸如4.6至5.1之pH範圍。已發現此pH範圍尤其適用於改良IG製劑之儲存。
最終IG製劑一般具有約5%至25% w/v、一般6%至15% w/v、8%至12% w/v且典型地10% w/v之蛋白質濃度。最終蛋白質濃度視各種因素而定，諸如投藥途徑、待治療之患者及待治療之病狀類型。
在本文中亦預期任何用於IV投藥之IG製劑可與可溶性玻尿酸酶組合 用於本文中所提供之方法中以供皮下投藥。製劑包括冷凍乾燥及液體調配物。免疫球蛋白(IVIG)為市售的，如Carimune® NF、Flebogamma® 5%、Gammagard® Liquid、Gammagard® S/D、Gamunex®、Iveegam® EN、Octagam®及Polygam® S/D。該等製劑典型地皆使用低溫醇分餾方法，但使用不同之使免疫球蛋白分離且純化之方法及不同之減少潛在病毒污染之方法。此外，目前經調配用於肌肉內或皮下投藥之其他製劑可用於本文中所提供之組合及方法中。
例示性IG製劑為10%免疫球蛋白靜脈內注射劑(人類)(IVIG，10%，以Gammagard®液體出售，Baxter Healthcare公司)，其為IgG亞類分布類似於正常血漿之IgG亞類分布的未經修飾之液體IgG製劑。該製劑含有完整可結晶片段(Fc)及Fab區。製劑含有100mg/ml蛋白質，其中至少98%為IgG；IgA係以37μg/ml之濃度存在且IgM僅以痕量存在。其具有類似於生理滲透壓度之滲透壓度且不含所添加之糖、鈉或防腐劑。其與甘胺酸一起調配以在4.6至5.1之pH下穩定。製造方法使用經修改之柯恩-昂柯利低溫醇分餾程序且經由使用弱陽離子交換層析及弱陰離子交換層析之連續方法來進一步純化。製造方法亦包括3個獨立之病毒滅活或移除步驟：溶劑/清潔劑(S/D)處理、奈米過濾及在低pH及高溫下培育。
D. 玻尿酸酶
本文中提供含有免疫球蛋白及可溶性玻尿酸酶之組合及使用用於皮下投藥之該等組合來治療IG介導性疾病及病狀之方法。玻尿酸酶為降解玻尿酸之酶家族，玻尿酸為細胞外基質之基本組份及間質障壁之主要成份。藉由催化玻尿酸(間質障壁之主要成份)水解，玻尿酸酶降低玻尿酸黏性， 從而增加組織滲透性。因而，玻尿酸酶已例如作為展布劑或分散劑而連同其他劑、藥物及蛋白質一起使用以增強該等劑、藥物及蛋白質之分散及傳遞。本文中所提供之組合及方法中之例示性玻尿酸酶為可溶性玻尿酸酶。
存在三種一般類別之玻尿酸酶：哺乳動物玻尿酸酶、細菌玻尿酸酶及來自水蛭、其他寄生蟲及甲殼類動物之玻尿酸酶。哺乳動物型玻尿酸酶(EC 3.2.1.35)為內-β-N-乙醯基-己醣胺酶，其將玻尿酸之β1→4醣苷鍵水解成各種寡醣長度(諸如四醣及六醣)。哺乳動物型玻尿酸酶具有水解及轉醣苷酶活性，且可降解玻尿酸及硫酸軟骨素(CS)(一般為C4-S及C6-S)。此類型之玻尿酸酶包括(但不限於)來自母牛(牛)(SEQ ID NO：10及11)、小鼠(SEQ ID NO：17-19、31)、豬(SEQ ID NO：20-21)、大鼠(SEQ ID NO：22-24、30)、家兔(SEQ ID NO：25)、羊(綿羊)(SEQ ID NO：26及27)、猩猩(SEQ ID NO：28)、獼猴(SEQ ID NO：29)、豚鼠(SEQ ID NO：32)之玻尿酸酶及人類玻尿酸酶。
哺乳動物玻尿酸酶可進一步再分為中性活性玻尿酸酶(主要見於睾丸提取物中)及酸性活性玻尿酸酶(主要見於諸如肝臟之器官中)。例示性中性活性玻尿酸酶包括PH20，包括(但不限於)源自諸如綿羊(SEQ ID NO：27)、牛(SEQ ID NO：11)及人類(SEQ ID NO：1)之不同物種之PH20。人類PH20(亦稱作SPAM1或精子表面蛋白PH20)一般經由糖基磷脂醯肌醇(GPI)錨而鎖定至質膜。其自然地涉及精子-卵子黏著且藉由消化玻尿酸以協助精子穿透卵丘細胞層。PH20 mRNA轉錄物通常經轉譯以產生509個胺基酸之前驅多肽(SEQ ID NO：1)，其含有處於N末端處之35個胺基酸信號序列(1-35胺基酸殘基位置)及處於C末端之19個胺基酸GPI錨(491-509 胺基酸殘基位置)。成熟PH20因此為SEQ ID NO：2中所闡明之474個胺基酸之多肽。牛PH20為553個胺基酸之前驅多肽(SEQ ID NO：11)。將牛PH20與人類PH20比對僅展示微弱之同源性，在牛多肽中歸因於不存在GPI錨而存在自470位胺基酸直至各別羧基末端之多個缺口(參見例如Frost GI(2007)Expert Opin.Drug.Deliv.4：427-440)。事實上，預計除人類以外在任何其他PH20種類中均無明確GPI錨。因此，自綿羊及牛產生之PH20多肽以可溶解形式存在。雖然牛PH20以極鬆散地附接至質膜之形式存在，但其並非經由磷脂酶敏感性錨來錨定(Lalancette等人，Biol Reprod.2001年8月；65(2)：628-36.)。牛玻尿酸酶之此獨特特徵允許以提取物形式使用可溶性牛睾丸玻尿酸酶以供臨床使用(WydaseTM、HyalaseTM)。
除人類PH20(亦稱作SPAM1)以外，在人類基因組中已識別5種玻尿酸酶樣基因，亦即HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4及HYALP1。HYALP1為假基因，且HYAL3(SEQ ID NO：38)不展示具有針對任何已知受質之酶活性。HYAL4(SEQ ID NO：39中所闡明之前驅多肽)為軟骨素酶(chondroitinase)且幾乎不展現針對玻尿酸之活性。HYAL1(SEQ ID NO：36中所闡明之前驅多肽)為原型酸性-活性酶且PH20(SEQ ID NO：1中所闡明之前驅多肽)為原型中性-活性酶。諸如HYAL1及HYAL2(SEQ ID NO：37中所闡明之前驅多肽)之酸性-活性玻尿酸酶在中性pH(亦即pH=7)下一般缺乏催化活性。舉例而言，HYAL1在4.5之pH下幾乎不具有試管內催化活性(Frost等人(1997)Anal.Biochemistry,251：263-269)。HYAL2為酸性-活性酶，其具有極低之試管內比活性。玻尿酸酶樣酶之特徵亦在於彼等一般經由糖基磷脂醯肌醇錨鎖定至質膜之酶(諸如人類HYAL2及人類PH20) (Danilkovitch-Miagkova等人.(2003)Proc Natl Acad Sci USA.100(8)：4580-5)及彼等一般可溶解之酶(諸如人類HYAL1)(Frost等人，(1997)Biochem Biophys Res Commun.236(1)：10-5)。
一些玻尿酸酶之糖基化(包括N及O連接之糖基化)對於其催化活性及穩定性為極重要的。雖然改變修飾醣蛋白之多醣類型可對蛋白質之抗原性、結構摺疊、溶解性及穩定性具有顯著影響，但不認為大部分酶需要糖基化以達到最佳酶活性。該等玻尿酸酶在此方面為獨特的，因為移除N連接之糖基化可使玻尿酸酶活性近乎完全鈍化。對於該等玻尿酸酶而言，N連接多醣之存在對於產生活性酶為關鍵性的。
N連接寡醣分為若干主要類型(寡甘露糖型、複合型、雜合型、硫酸化型)，其均具有經由屬於-Asn-Xaa-Thr/Ser-序列(其中Xaa不為Pro)之Asn殘基之醯胺氮所連接之(Man)3-GlcNAc-GlcNAc-核心。對於凝血蛋白C已報導在-Asn-Xaa-Cys-位點處之糖基化。在一些情況下，玻尿酸酶可含有N-醣苷鍵及O-醣苷鍵。舉例而言，PH20具有O連接寡醣以及N連接寡醣。
在SEQ ID NO：1中所例示之人類PH20之N82、N166、N235、N254、N368、N393、N490處存在7個潛在N連接糖基化位點。半胱胺酸殘基C60與C351之間及C224與C238之間形成二硫鍵以形成核心玻尿酸酶結構域。然而，對於中性酶催化活性而言，在羧基末端需要額外之半胱胺酸以使SEQ ID NO：1之36位至464位胺基酸含有最小活性之人類PH20玻尿酸酶結構域。因此，對於合適玻尿酸酶活性而言不需要N連接糖基化位點N-490。
可溶性玻尿酸酶
在本文中之組合及方法中提供可溶性玻尿酸酶。可溶性玻尿酸酶包括 任何以可溶解形式存在之玻尿酸酶，包括(但不限於)Hyall、牛PH20及綿羊PH20、其對偶基因變異體及其他變異體。在可溶性玻尿酸酶中亦包括任何經修飾而具有可溶性之玻尿酸酶。舉例而言，通常經由GPI錨而與膜錨定之人類PH20可藉由截短且移除C末端處之全部或一部分GPI錨來製成可溶性人類PH20。可溶性玻尿酸酶亦包括中性活性及酸性活性玻尿酸酶，然而，出於皮下投藥之目的，中性活性玻尿酸酶預期用於本文中。
因此，只要玻尿酸酶為可溶解的且保持玻尿酸酶活性，則例示性可溶性玻尿酸酶為來自任何物種之PH20，諸如在SEQ ID NO：1、2、11、25、27、30及31中之任一者中所闡明之任何玻尿酸酶或其缺乏全部或一部分C末端GPI錨之截短形式。在可溶性玻尿酸酶中亦包括SEQ ID NO：1、2、11、25、27、30及31中之任一者之對偶基因變異體或其他變異體或其截短形式。對偶基因變異體及其他變異體為熟習此項技術者所知且包括與SEQ ID NO：1、2、11、25、27、30及31中之任一者具有60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%或95%以上序列一致性之多肽或其截短形式。
為用於本文中之方法中，典型地使用可溶性人類PH20。儘管可使用來自其他動物之PH20，但因為該等製劑為動物蛋白質，所以其潛在具有免疫原性。舉例而言，顯著比例之患者表現繼發於所攝取食物之前期致敏，且因為此等製劑為動物蛋白質，所以所有患者皆具有後繼致敏之風險。因此，非人類製劑可能不適於長期使用。若需要非人類製劑，則在本文中預期該等多肽可經製備以具有降低之免疫原性。該等修飾係在熟習此項技術者之技術範圍內。用於本文中之方法中的包括PH20之玻尿酸酶可以重組方式製備或可自天然來源(諸如自睾丸提取物)純化或部分純化。
可溶性人類PH20
例示性可溶性玻尿酸酶為可溶性人類PH20。已製備重組人類PH20之可溶解形式且其可用於本文中所述之方法中以與免疫球蛋白共同投予或共同調配以用於皮下投藥來治療IG可治療性疾病及病狀。PH20之該等可溶解形式之製備係描述於申請案第11/065,716號及第11/238,171號中且描述於以下實例2-6中。可溶解形式包括(但不限於)任何具有C末端截短以產生含有SEQ ID NO：1中所闡明之胺基酸序列之1位胺基酸至347、372、394、413、430、447、467、477、478、479、480、481、482及483位胺基酸之多肽的玻尿酸酶。當在哺乳動物細胞中表現時，在加工期間使35個胺基酸之N末端信號序列裂解且分泌蛋白質之成熟形式。因此，成熟可溶性多肽含有SEQ ID NO：1之36位胺基酸至347、372、394、413、430、447、467、477、478、479、480、481、482及483位胺基酸。終止於477至483位胺基酸位置之缺失突變體(對應於SEQ ID NO：1中所闡明之前驅多肽)展現高於全長GPI錨定形式之分泌性玻尿酸酶活性。因此，例示性可溶性玻尿酸酶為長度為442、443、444、445、446或447個胺基酸之彼等玻尿酸酶(諸如SEQ ID NO：4-9中之任一者中所闡明之玻尿酸酶)或其對偶基因變異體或物種變異體或其他變異體。一般而言，PH20之可溶解形式可使用蛋白表現系統來製備，該等蛋白表現系統有助於校正N-糖基化以確保多肽保持活性，因為糖基化對於玻尿酸酶之催化活性及穩定性而言十分重要。該等細胞包括例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞(例如DG44 CHO細胞)。
重組可溶性人類PH20(rHuPH20)
已產生重組可溶解形式之人類PH20(可溶性rHuPH20)且可使用本文 中所述之方法對其製備及純化。rHuPH20之該等可溶解形式之產生係描述於美國專利申請案第11/065,716號及第11/238,171號(以美國公開專利申請案第US20050260186號及第US 20060104968號公開)中且描述於以下實例2-6中。該等多肽之例示性多肽為彼等自編碼SEQ ID NO：3中所闡明之1-482位胺基酸之核酸分子所產生的多肽。轉譯後加工移除35個胺基酸之信號序列，使447個胺基酸之可溶性rHuPH20(SEQ ID NO：4)分泌。由於在製備及純化後肽酶存在於培養基中，所以所得之經純化之rHuPH20可為異質的。典型地，rHuPH20係在有助於校正N-糖基化以保持活性之細胞中產生，諸如CHO細胞(例如DG44 CHO細胞)。
E. 產生編碼可溶性玻尿酸酶及其多肽之核酸之方法
本文中所闡明之可溶性玻尿酸酶之多肽可藉由此項技術中熟知之用於蛋白質純化及重組蛋白質表現之方法來獲得。可使用任何為熟習此項技術者所知用於識別編碼所需基因之核酸之方法。此項技術中可用之任何方法可用於自諸如細胞或組織來源獲得編碼玻尿酸酶之全長(亦即，涵蓋整個編碼區)cDNA或基因組DNA純系。可藉由(諸如)定位突變而自野生型多肽工程改造經修飾或變異之可溶性玻尿酸酶。
可使用此項技術中已知用於選殖及分離核酸分子之任何可用方法來選殖或分離多肽。該等方法包括核酸之PCR擴增及包括核酸雜交篩選、基於抗體之篩選及基於活性之篩選的文庫篩選。
用於核酸擴增之方法可用於分離編碼所需多肽之核酸分子，該等方法包括例如聚合酶鏈反應(PCR)法。含有核酸之物質可用作起始物質，可自其分離所需之編碼多肽之核酸分子。舉例而言，DNA及mRNA製劑、細胞 提取物、組織提取物、流體樣品(例如血液、血清、唾液)、來自健康及/或患病個體之樣品可用於擴增方法中。核酸文庫亦可用作起始物質來源。引子可經設計以使所需多肽擴增。舉例而言，引子可基於自其產生所需多肽之所表現序列來設計。引子可基於多肽胺基酸序列之反轉譯(back-translation)來設計。藉由擴增所產生之核酸分子可經定序及確認以編碼所需多肽。
額外核苷酸序列可連接至編碼多肽之核酸分子，包括出於將合成基因選殖至載體中之目的含有限制性核酸內切酶位點之連接子序列，該載體為例如蛋白質表現載體或經設計以用於使編碼核心蛋白質之DNA序列擴增之載體。此外，指定功能性DNA元件之額外核苷酸序列可與編碼多肽之核酸分子操作性連接。該等序列之實例包括(但不限於)經設計以促進細胞內蛋白質表現之啟動子序列及經設計以促進蛋白質分泌之例如異源信號序列之分泌序列。該等序列為熟習此項技術者所知。諸如指定蛋白質結合區域之鹼基序列之額外核苷酸殘基序列亦可連接至編碼酶之核酸分子。該等區域包括(但不限於)促進或編碼有助於酶吸收至特定標靶細胞中，或以其他方式改變合成基因產物之藥物動力學的蛋白質的殘基序列。舉例而言，酶可連接至PEG部分。
另外，可添加標籤或其他部分(例如)以協助多肽之偵測或親和純化。舉例而言，諸如指定(specifying)抗原決定基標籤或其他可偵測標記之鹼基序列之額外核苷酸殘基序列亦可與編碼酶之核酸分子連接。該等序列之例示性序列包括編碼His標籤(例如，6×His，HHHHHH；SEQ ID NO：54)或Flag標籤(DYKDDDDK；SEQ ID NO：55)之核酸序列。
所識別及分離之核酸接著可插入合適之選殖載體中。可使用此項技術中已知之大量載體-宿主系統。可能的載體包括(但不限於)質體或經修飾之病毒，但載體系統須與所使用之宿主細胞相容。該等載體包括(但不限於)噬菌體(諸如λ衍生物)或質體(諸如pCMV4、pBR322或pUC質體衍生物或Bluescript載體(Stratagene,La Jolla,CA))。其他表現載體包括本文中所例示之HZ24表現載體。插入選殖載體中可例如伴隨有將DNA片段接合至具有互補黏性末端之選殖載體中。插入可使用TOPO選殖載體(INVITROGEN,Carlsbad,CA)來達成。若在選殖載體中不存在用於將DNA分段之互補限制性位點，則可用酶修飾DNA分子末端。或者，可藉由將核苷酸序列(連接子)接合至DNA末端上來產生所需之任何位點；此等所接合之連接子可含有編碼限制性核酸內切酶識別序列之特異性化學合成之寡聚核苷酸。在一替代方法中，所裂解之載體及蛋白質基因可藉由均聚物加尾來修飾。重組分子可經由例如轉型、轉染、感染、電穿孔及超音波穿孔(sonoporation)而引入宿主細胞中以產生基因序列之許多複本。
在特定具體實例中，用合併有所分離之蛋白基因、cDNA或合成DNA序列之重組DNA分子使宿主細胞轉型能夠產生基因之多個複本。因此，基因可藉由使轉型體生長、自轉型體分離重組DNA分子及必要時自所分離之重組DNA擷取所插入之基因來大量獲得。
1. 載體及細胞
為使諸如本文中所述之任何蛋白質之所需蛋白質中的一或多者重組表現，可將含有所有或一部分編碼該蛋白質之核苷酸序列的核酸插入合適表現載體中，亦即該載體含有所插入之蛋白質編碼序列轉錄及轉譯所需之元 件。必需之轉錄及轉譯信號亦可由酶基因之天然啟動子及/或其側接區來提供。
亦提供含有編碼酶之核酸的載體。亦提供含有載體之細胞。細胞包括真核細胞及原核細胞且載體為任何適用於細胞中之載體。
提供含有載體之包括內皮細胞之原核及真核細胞。該等細胞包括細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、古生菌(Archea)、植物細胞、昆蟲細胞及動物細胞。藉由使上述細胞在使細胞表現所編碼之蛋白質的條件下生長且回收所表現之蛋白質來使用該等細胞產生其蛋白質。出於本文中之目的，舉例而言，酶可分泌至培養基中。
提供含有編碼可溶性玻尿酸酶多肽之核苷酸序列之載體，該核苷酸序列係偶接至天然或異源信號序列以及其多個複本。載體可經選擇以在細胞中表現酶蛋白或使得酶蛋白以分泌性蛋白質形式表現。
多種宿主-載體系統可用於表現蛋白質編碼序列。此等系統包括(但不限於)感染病毒(例如牛痘病毒、腺病毒及其他病毒)之哺乳動物細胞系統；感染病毒(例如桿狀病毒)之昆蟲細胞系統；諸如含有酵母載體之酵母的微生物；或用噬菌體、DNA、質體DNA或黏接質體DNA轉型之細菌。載體之表現元件在其強度及特異性方面不同。視所用之宿主-載體系統而定，可使用許多合適轉錄及轉譯元件中之任一者。
熟習此項技術者已知用於將DNA片段插入載體中之任何方法可用於構建含有嵌合基因之表現載體，該嵌合基因含有合適之轉錄/轉譯控制信號及蛋白質編碼序列。此等方法可包括試管內重組DNA及合成技術及活體內重組物(遺傳重組)。編碼蛋白質或其結構域、衍生物、片段或同系物之核酸 序列之表現可藉由第二核酸序列來調節使得其基因或片段在用重組DNA分子轉型之宿主中得到表現。舉例而言，可藉由此項技術中已知之任何啟動子/增強子來控制蛋白質表現。在一特定具體實例中，啟動子不為所需蛋白質之基因自身所具有的。可使用之啟動子包括(但不限於)SV40早期啟動子(Bernoist及Chambon,Nature 290：304-310(1981))、勞氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)之3'長末端重複中所含有之啟動子(Yamamoto等人Cell 22：787-797(1980))、疱疹胸苷激酶啟動子(Wagner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1441-1445(1981))、金屬硫蛋白基因之調節序列(Brinster等人，Nature 296：39-42(1982))；原核表現載體，諸如β-內醯胺酶啟動子(Jay等人，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：5543)或tac啟動子(DeBoer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：21-25(1983)；亦參見「Useful Proteins from Recombinant Bacteria」：Scientific American 242：79-94(1980)中)；含有胭脂鹼(nopaline)合成酶啟動子之植物表現載體(Herrara-Estrella等人，Nature 303：209-213(1984))或花椰菜嵌紋病毒(cauliflower mosaic virus)35S RNA啟動子(Garder等人，Nucleic Acids Res.9：2871(1981))及光合成酶雙磷酸核酮糖羧化酶之啟動子(Herrera-Estrella等人，Nature 310：115-120(1984))；諸如Gal4啟動子之來自酵母及其他真菌之啟動子元件、醇脫氫酶啟動子、磷酸甘油激酶啟動子、鹼性磷酸酶啟動子；及展現組織特異性且已用於轉殖基因動物中之下列動物轉錄控制區：在胰腺腺泡細胞中具有活性之彈性蛋白酶I基因控制區(Swift等人，Cell 38：639-646(1984)；Ornitz等人，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50：399-409(1986)；MacDonald,Hepatology 7：425-515(1987))、在胰腺β細胞中具有活性之胰島素基因控制區(Hanahan等人，Nature 315：115-122 (1985))、在淋巴樣細胞中具有活性之免疫球蛋白基因控制區(Grosschedl等人，Cell 38：647-658(1984)；Adams等人，Nature 318：533-538(1985)；Alexander等人，Mol.Cell Biol.7：1436-1444(1987))、在睾丸、乳房、淋巴及肥大細胞中具有活性之小鼠乳房腫瘤病毒控制區(Leder等人，Cell 45：485-495(1986))、在肝中具有活性之白蛋白基因控制區(Pinckert等人，Genes and Devel.1：268-276(1987))、在肝中具有活性之α-胎蛋白基因控制區(Krumlauf等人，Mol.Cell.Biol.5：1639-1648(1985)；Hammer等人，Science 235：53-58 1987))、在肝中具有活性之α-1抗胰蛋白酶基因控制區(Kelsey等人，Genes and Devel.1：161-171(1987))、在骨髓細胞中具有活性之β球蛋白基因控制區(Magram 等人，Nature 315：338-340(1985)；Kollias等人，Cell 46：89-94(1986))、在腦之寡樹突神經膠質細胞中具有活性之髓鞘鹼性蛋白基因控制區(Readhead等人，Cell 48：703-712(1987))、在骨骼肌中具有活性之肌凝蛋白輕鏈-2基因控制區(Shani,Nature 314：283-286(1985))及在丘腦下部之促性腺激素細胞中具有活性之促性腺釋放激素基因控制區(Mason等人，Science 234：1372-1378(1986))。
在一特定具體實例中，使用含有與編碼所需蛋白質或其結構域、片段、衍生物或同系物之核酸操作性連接之啟動子、一或多個複製起點及視情況一或多個可選擇標記(例如抗生素耐藥基因(antibiotic resistance gene))的載體。用於轉型大腸桿菌(E.coli)細胞之例示性質體載體包括例如pQE表現載體(可自Qiagen,Valencia,CA得到；亦參見由Qiagen發表之描述該系統之文獻)。pQE載體具有噬菌體T5啟動子(由大腸桿菌RNA聚合酶識別)及雙lac操縱基因阻遏模組(以提供重組蛋白質於大腸桿菌中之緊密調節之 高程度表現)、用於有效轉譯之合成核糖體結合位點(RBS II)、6×His標籤編碼序列、t0及T1轉錄終止子、ColE1複製起點及用於賦予安比西林(ampicillin)耐藥性之β-內醯胺酶基因。pQE載體使6×His標籤能夠安置於重組蛋白質之N末端或C末端處。該等質體包括pQE 32、pQE 30及pQE 31，其提供用於所有三個閱讀框架之多個選殖位點且使N末端6×His-標記之蛋白質得到表現。用於轉型大腸桿菌細胞之其他例示性質體載體包括例如pET表現載體(參見美國專利4,952,496；可自NOVAGEN,Madison,WI得到；亦參見由Novagen發表之描述該系統之文獻)。該等質體包括pET 11a，其含有T7lac啟動子、T7終止子、誘導性大腸桿菌lac操縱基因及lac阻遏基因；pET 12a-c，其含有T7啟動子、T7終止子及大腸桿菌ompT分泌信號；及pET 15b及pET19b(NOVAGEN,Madison,WI)，其含有用於使用His管柱純化之His-TagTM前導序列及在經由管柱純化後允許裂解之凝血酶裂解位點、T7-lac啟動子區及T7終止子。
用於哺乳動物細胞表現之例示性載體為HZ24表現載體。HZ24表現載體係源自pCI載體骨架(Promega)。其含有編碼β-內醯胺酶耐藥基因(AmpR)之DNA、F1複製起點、細胞巨大病毒即刻早期增強子/啟動子區(CMV)及SV40晚期聚腺苷酸化信號(SV40)。表現載體亦具有來自ECMV病毒(Clontech)之內部核糖體進入位點(IRES)及小鼠二氫葉酸還原酶(DHFR)基因。
2. 表現
可藉由熟習此項技術者已知之包括活體內及試管內方法之任何方法來製備可溶性玻尿酸酶多肽。所需蛋白質可表現於適於產生所需量及形式之 該等蛋白質(諸如為投藥及治療所需)之任何有機體中。表現宿主包括原核及真核有機體，諸如大腸桿菌、酵母、植物、昆蟲細胞、哺乳動物細胞(包括人類細胞系及轉殖基因動物)。表現宿主可在其蛋白質產生量以及所表現蛋白質上所存在之轉譯後修飾類型方面有所不同。可基於此等因素及諸如調節及安全考慮、製備成本及純化需要及方法之其他因素來對表現宿主進行選擇。
許多表現載體為可得到的且為熟習此項技術者所知且可用於表現蛋白質。表現載體之選擇受宿主表現系統之選擇影響。一般而言，表現載體可包括轉錄啟動子及任選之增強子、轉譯信號及轉錄及轉譯終止信號。用於穩定轉型之表現載體典型地具有允許選擇及維持經轉型細胞之可選擇標記。在一些狀況下，複製起點可用於擴增載體之複本數。
可溶性玻尿酸酶多肽亦可以蛋白質融合形式使用或表現。舉例而言，可產生酶融合以將額外功能添加至酶。酶融合蛋白質之實例包括(但不限於)信號序列、諸如用於定位之標籤(例如his6標籤或myc標籤)或用於純化之標籤(例如GST融合)及用於引導蛋白質分泌及/或膜結合之序列的融合。
a. 原核細胞
原核生物(尤其大腸桿菌)提供用於產生大量蛋白質之系統。大腸桿菌之轉型為熟習此項技術者所熟知之簡單且快速之技術。大腸桿菌之表現載體可含有誘導性啟動子，該等啟動子適用於誘導高程度之蛋白質表現且適用於表現對宿主細胞展現某些毒性之蛋白質。誘導性啟動子之實例包括lac啟動子、trp啟動子、雜合tac啟動子、T7及SP6 RNA啟動子及溫度調節 性λ PL啟動子。
諸如本文中所提供之任何蛋白質之蛋白質可表現於大腸桿菌之細胞質環境中。細胞質為還原性環境且對於一些分子而言，此可引起不可溶性包涵體形成。諸如二硫蘇糖醇、及β-巰基乙醇之還原劑及諸如胍-HCl及尿素之變性劑可用於使蛋白質再溶解。替代方法為使蛋白質表現於細菌之周質空間(periplasmic space)中，該周質空間提供氧化性環境及類伴侶蛋白(chaperonin-like)及二硫化物異構酶且可引起可溶性蛋白質產生。前導序列典型地融合至待表現之蛋白質，從而將蛋白質引導至周質。接著在周質內部藉由信號肽酶移除前導序列。周質靶向性前導序列之實例包括來自果膠酸裂解酶基因之pelB前導序列及源自鹼性磷酸酶基因之前導序列。在一些狀況下，周質表現允許所表現之蛋白質滲漏至培養基中。蛋白質之分泌允許自培養物上清液快速及簡單純化。未經分泌之蛋白質可藉由滲透溶解而自周質獲得。類似於細胞質表現，在一些狀況下，蛋白質可變成不可溶的且可使用變性劑及還原劑來促進溶解及再摺疊。誘導及生長之溫度亦可影響表現量及溶解性，典型地使用介於25℃與37℃之間的溫度。細菌典型地產生無糖基化(aglycosylated)之蛋白質。因此，若蛋白質出於功能之考慮需要糖基化，則可在自宿主細胞純化後試管內添加糖基化。
b. 酵母細胞
諸如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)及巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)的酵母為熟知之可用於產生諸如本文中所述之任何蛋白質之蛋白質的酵母表現宿 主。酵母可用游離型複製載體或藉由經同源重組之穩定染色體整合來加以轉型。誘導性啟動子典型地用於調節基因表現。該等啟動子之實例包括GAL1、GAL7及GAL5及金屬硫蛋白啟動子，諸如CUP1、AOX1或其他畢赤酵母(Pichia)或其他酵母啟動子。表現載體常常包括用於選擇及維持經轉型DNA之諸如LEU2、TRP1、HIS3及URA3之可選擇標記。表現於酵母中之蛋白質常常為可溶解的。與諸如Bip之伴侶蛋白及蛋白質二硫化物異構酶共同表現可改良表現量及溶解性。另外，酵母中所表現之蛋白質可使用分泌信號肽融合(諸如來自釀酒酵母之酵母交配型α-因子分泌信號)及與酵母細胞表面蛋白質(諸如Aga2p交配型黏著受體或Arxula adeninivorans葡萄糖澱粉酶)之融合來引導分泌。諸如用於Kex-2蛋白酶之蛋白酶裂解位點可經工程改造以當所表現之多肽自分泌路徑排出時自該等多肽移除所融合之序列。酵母亦能夠在Asn-X-Ser/Thr基元處糖基化。
c. 昆蟲細胞
尤其使用桿狀病毒表現之昆蟲細胞適用於表現諸如玻尿酸酶多肽之多肽。昆蟲細胞表現高含量之蛋白質且能夠產生由高等真核細胞所用之大多數轉譯後修飾。桿狀病毒具有限制性宿主範圍，其改良安全性且減少真核表現之調節性顧慮。典型表現載體使用用於高程度表現之啟動子，諸如桿狀病毒之多角體蛋白啟動子(polyhedrin promoter)。常用之桿狀病毒系統包括諸如苜蓿銀紋夜蛾核多角體病病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus，AcNPV)及家蠶(Bombyx mori)核多角體病病毒(BmNPV)之桿狀病毒及諸如源自草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)之Sf9、一星黏蟲(Pseudaletia unipuncta)(A7S)及黑脈金斑蝶(Danaus plexippus)(DpN1) 之昆蟲細胞系。為高程度表現，待表現之分子之核苷酸序列直接與病毒之多角體蛋白起始密碼子之下游融合。哺乳動物分泌信號在昆蟲細胞中經精確加工且可用於使所表現之蛋白質分泌至培養基中。另外，細胞系一星黏蟲(A7S)及黑脈金斑蝶(DpN1)產生具有類似於哺乳動物細胞系統之糖基化模式之蛋白質。
在昆蟲細胞中之替代表現系統為經穩定轉型之細胞之使用。可使用諸如Schneider 2(S2)及Kc細胞(黑腹果蠅(Drosophila melanogaster))及C7細胞(白紋伊蚊(Aedes albopictus))之細胞系用於表現。果蠅(Drosophila)金屬硫蛋白啟動子可用於在具有鎘或銅之重金屬誘導存在下誘導高程度之表現。典型地藉由使用諸如新黴素(neomycin)及潮黴素(hygromycin)之可選擇標記來維持表現載體。
d. 哺乳動物細胞
哺乳動物表現系統可用於表現包括可溶性玻尿酸酶多肽之蛋白質。可藉由諸如腺病毒之病毒感染或藉由諸如脂質體、磷酸鈣、DEAE-葡聚糖之直接DNA轉移及藉由諸如電穿孔及顯微注射之物理方法將表現構築體轉移至哺乳動物細胞。用於哺乳動物細胞之表現載體典型地包括mRNA加帽位點(cap site)、TATA盒、轉譯起始序列(Kozak一致序列)及聚腺苷酸化元件。亦可添加IRES元件以允許與諸如可選擇標記之另一基因的雙順反子表現。該等載體常常包括用於高程度表現之轉錄啟動子-增強子，例如SV40啟動子-增強子、人類細胞巨大病毒(CMV)啟動子及勞氏肉瘤病毒(RSV)之長末端重複。此等啟動子-增強子在許多細胞類型中為活性的。亦可使用組織及細胞型啟動子及增強子區以用於表現。例示性啟動子/增強子區包括(但 不限於)彼等來自諸如彈性蛋白酶I、胰島素、免疫球蛋白、小鼠乳房腫瘤病毒、白蛋白、α胎蛋白、α 1抗胰蛋白酶、β球蛋白、髓鞘鹼性蛋白、肌凝蛋白輕鏈2及促性腺釋放激素基因控制之基因的彼等啟動子/增強子區。可使用可選擇標記來選擇及維持具有表現構築體之細胞。可選擇標記基因之實例包括(但不限於)潮黴素B磷酸轉移酶、腺苷去胺酶、黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶、胺基糖苷磷酸轉移酶、二氫葉酸還原酶(DHFR)及胸苷激酶。舉例而言，可在甲胺喋呤存在下進行表現以僅選擇表現DHFR基因之彼等細胞。與諸如TCR-ζ及FcεRI-γ之細胞表面信號分子之融合可引導呈活性狀態之蛋白質在細胞表面表現。
許多細胞系可用於哺乳動物表現，包括小鼠、大鼠、人類、猴、雞及倉鼠細胞。例示性細胞系包括(但不限於)CHO、Balb/3T3、HeLa、MT2、小鼠NS0(非分泌性)及其他骨髓瘤細胞系、融合瘤及雜交瘤(heterohybridoma)細胞系、淋巴細胞、纖維母細胞、Sp2/0、COS、NIH3T3、HEK293、293S、2B8及HKB細胞。亦可使用適應於無血清培養基之細胞系，該無血清培養基有助於自細胞培養基純化所分泌之蛋白質。實例包括CHO-S細胞(Invitrogen,Carlsbad,CA，目錄號11619-012)及無血清EBNA-1細胞系(Pham等人，(2003)Biotechnol.Bioeng.84：332-42.)。亦可使用適應於在經最佳化以供最大表現之特殊培養基中生長之細胞系。舉例而言，DG44 CHO細胞適應於在不含化學上定義之動物產品之培養基中的懸浮培養物中生長。
e. 植物
轉殖基因植物細胞及植物可用於表現諸如本文中所述之任何蛋白質之 蛋白質。典型地使用諸如微彈轟擊及PEG介導之向原生質體中之轉移的直接DNA轉移且使用土壤桿菌(agrobacterium)介導之轉型來將表現構築體轉移至植物中。表現載體可包括啟動子及增強子序列、轉錄終止元件及轉譯控制元件。表現載體及轉型技術通常在諸如芥菜(Arabidopsis)及煙草之雙子葉植物宿主與諸如玉米及稻米之單子葉植物宿主之間劃分。用於表現之植物啟動子之實例包括花椰菜嵌紋病毒啟動子、胭脂鹼合成酶啟動子、雙磷酸核糖羧化酶啟動子及泛素及UBQ3啟動子。諸如潮黴素、磷酸甘露糖異構酶及新黴素磷酸轉移酶之可選擇標記常用於促進轉型細胞之選擇及維持。轉型植物細胞可以細胞、聚集體(愈傷組織)形式維持於培養物中或再生於全植物中。轉殖基因植物細胞亦可包括經工程改造以產生玻尿酸酶多肽之海藻。因為植物具有不同於哺乳動物細胞之糖基化模式，所以此可影響此等宿主中所產生之蛋白質之選擇。
3. 純化技術
用於自宿主細胞純化包括可溶性玻尿酸酶多肽或其他蛋白質之多肽的方法將視所選宿主細胞及表現系統而定。對於分泌性分子而言，一般在移除細胞後自培養基純化蛋白質。對於細胞內表現而言，可使細胞溶解且自提取物純化蛋白質。當使用諸如轉殖基因植物及動物之轉殖基因有機體用於表現時，組織或器官可用作起始物質以製成溶解細胞提取物。另外，轉殖基因動物製備可包括在奶或蛋中製備可收集之多肽，且必要時可提取蛋白質且使用此項技術中之標準方法進一步純化。
諸如可溶性玻尿酸酶多肽之蛋白質可使用此項技術中已知之標準蛋白質純化技術加以純化，該等技術包括(但不限於)SDS-PAGE、尺寸分級(size fraction)及尺寸排阻層析、硫酸銨沈澱及諸如陰離子交換之離子交換層析。親和純化技術亦可用於改良製劑之效率及純度。舉例而言，與玻尿酸酶結合之抗體、受體及其他分子可用於親和純化中。表現構築體亦可經工程改造以將諸如myc抗原決定基、GST融合體或His6之親和標籤添加至蛋白質中且分別用myc抗體、麩胱甘肽樹脂及Ni-樹脂加以親和純化。可藉由此項技術中已知之任何方法來評定純度，包括凝膠電泳及染色及分光光度技術。
F. 免疫球蛋白及可溶性玻尿酸酶多肽之製備、調配及投藥
在本文中提供免疫球蛋白及可溶性玻尿酸酶之醫藥組合物以用於皮下投藥。例如PH20之可溶性玻尿酸酶之醫藥組合物的調配物在此項技術中為已知的(參見例如美國公開申請案第US20040268425號、第US20050260186號及第US20060104968號)。可溶性玻尿酸酶係與免疫球蛋白之醫藥調配物共同調配或共同投予以藉由增加免疫球蛋白之生物可用率來增強免疫球蛋白向身體中之所需部位之傳遞。舉例而言，IG與玻尿酸酶之共同投予或共同調配可藉由在投予後更快速之滲透以使較多之IG到達血液及/或使較少之IG降解來改良吸收程度及/或吸收速率且因此改良劑之生物可用率。可例如藉由在投藥後施加與體積注射有關之流體靜力壓組合與玻尿酸降解有關之流動阻抗降低來加速間質流動及潛在結締組織輸送來達成增加之吸收及生物可用率。因此，與皮下投藥之習知方法相比，可溶性玻尿酸酶可用於在皮下投藥後達成升高及/或更快速地達到之免疫球蛋白濃度以提供例如對於給定劑量之更有效及/或更快速反應。或者，可溶性玻尿酸酶可用於在所投予之IG劑量較低之情況下達成給定反應。可溶性玻尿酸酶在注射或輸注部位處或附近增強總體流體流動之能力亦可改良相關藥理傳遞之其他態 樣。舉例而言，總體流體流動增加可有助於使得所注射體積之流體更易於自注射部位擴散(潛在降低注射之疼痛或其他不良後果)。此對於皮下輸注尤其重要，其允許投予更高劑量。除生物可用率增加以外，與習知靜脈內投藥途徑相比，IG與可溶性玻尿酸酶之共同投予或共同調配提供更安全或更便利之投藥途徑。
因此，藉助於生物可用率增加，免疫球蛋白可以製備及投予當前靜脈內(IVIG)製劑之劑量及頻率來皮下投予。優於當前IG皮下調配物之優點在於共同投予或共同調配之玻尿酸酶/IG可產生更有利之給藥攝生法(例如給藥頻率較小)。藉由較小之頻率或較低之劑量，可減少與毒性有關之副作用。一般而言，皮下IG治療之藥物動力學及/或藥效學得到改良。另外，IG之皮下投藥亦具有優於當前靜脈內輸注之優點。舉例而言，皮下輸注允許由患者或家屬而非由熟練護士來輸注；可以較高速率達成輸注以使IG在1-3小時內輸注(相比習知IVIG治療之5-10小時IG輸注)；不存在對功能靜脈之要求；不存在輸注相關之副作用，諸如血栓形成、頭痛、血栓性靜脈炎及噁心及較小概率之不良事件；且輸注可在家中或任何地方進行。
組合物可調配成冷凍乾燥或液體形式。在組合物以冷凍乾燥形式提供之情況下，其可在臨用前藉由例如無菌鹽水溶液之合適緩衝液來復水。組合物可共同或分開提供。出於本文中之目的，典型地分開提供該等組合物。可溶性玻尿酸酶及IG可包裝成用於共同、連續或間斷投藥之分開的組合物。該等組合可包裝成套組。
1. 調配物
可將化合物調配成用於皮下投藥之任何合適醫藥製劑，諸如溶液、懸 浮液、散劑或持續釋放調配物。典型地可使用此項技術中所熟知之技術及程序將化合物調配成醫藥組合物(參見例如Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms,第四版，1985,126)。鑒於管理機構或其他機構之批准，根據一般公認之藥典來製備用於動物及人類之醫藥學上可接受組合物。調配物應適合於投藥模式。
醫藥組合物可包括諸如稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒劑之載劑，其可與玻尿酸酶或IG一起投予。E.W.Martin之「Remington's Pharmaceutical Sciences」中描述合適醫藥載劑之實例。該等組合物將含有一般呈純化形式或部分純化形式之治療有效量之化合物連同合適量之載劑以提供用於向患者適當投藥之形式。該等醫藥載劑可為無菌液體，諸如水及油，包括石油、動物油、植物油或合成起源之油，諸如花生油、大豆油、礦物油及芝麻油。當靜脈內投予醫藥組合物時，水為典型載劑。鹽水溶液及水性右旋糖及甘油溶液亦可用作尤其用於可注射溶液之液體載劑。組合物可含有連同活性成份一起之下列物質：稀釋劑，諸如乳糖、蔗糖、磷酸二鈣或羧甲基纖維素；潤滑劑，諸如硬脂酸鎂、硬脂酸鈣及滑石；及黏合劑，諸如澱粉、天然樹膠(諸如阿拉伯膠(gum acaciagelatin))、葡萄糖、糖蜜、聚乙烯吡咯啶、纖維素及其衍生物、聚乙烯吡咯酮、交聯聚乙烯吡咯酮及熟習此項技術者所知之其他該等黏合劑。合適醫藥賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水及乙醇。必要時，組合物亦可含有較少量之濕潤劑或乳化劑或pH緩衝劑，例如乙酸酯、檸檬酸鈉、環糊精衍生物、單月桂酸脫水山梨糖醇酯、三乙醇胺、乙酸鈉、油酸三乙醇胺 及其他該等試劑。
醫藥治療活性化合物及其衍生物典型地以單位劑型或多劑型調配及投予。每一單位劑量含有足以產生所需治療作用之預定量之治療活性化合物以及所需之醫藥載劑、媒劑或稀釋劑。單位劑型之實例包括安瓿及注射器及個別包裝之錠劑或膠囊。單位劑型可以其分數或倍數形式投予。多劑型為包裝於單個容器中之用於以分離之單位劑型投予的複數個相同單位劑型。多劑型之實例包括小瓶、錠劑或膠囊瓶或品脫或加侖瓶。因此，多劑型為未在包裝中分離之多個單位劑量。一般而言，可製備含有處於0.005%至100%範圍內之活性成份(其餘由無毒載劑組成)之劑型或組合物。
本文中所提供之組合物典型地經調配以用於藉由皮下途徑投予，但亦涵蓋其他投藥途徑，諸如熟習此項技術者已知之任何途徑，包括肌肉內、靜脈內、皮內、病變內、腹膜內注射、硬膜外、經鼻、經口、經陰道、經直腸、表皮、局部、經耳、吸入、頰內(例如舌下)及經皮投藥或任何途徑。適合於該等途徑之調配物為熟習此項技術者所知。投藥可視治療部位而為局部、表皮或全身性的。可例如(但不限於)藉由手術期間之局部輸注、表皮塗覆(例如手術後連同傷口塗劑一起)、藉由注射、藉助於導管、藉助於栓劑或藉助於植入物來達成對需要治療之區域之局部投藥。組合物亦可與其他生物活性劑一起連續、間斷或在同一組合物中投予。投藥亦可包括控制釋放系統，其包括控制釋放調配物及控制釋放之裝置(諸如藉助於泵)。
在任何給定狀況下，最合適之途徑視多種因素而定，諸如疾病性質、疾病進程、疾病嚴重度、所使用之特定組合物。出於本文中之目的，需要 投予玻尿酸酶以使其到達皮膚或組織之間質，從而降解間質空間以供免疫球蛋白之後繼傳遞。因此，涵蓋諸如藉由皮下投藥方法在皮膚下直接投藥。因此，在一實例中，局部投藥可藉由用諸如注射器或含有諸如針之注射裝置之其他製品注射來達成。在另一實例中，局部投藥可藉由輸注來達成，輸注可藉由使用泵或其他類似裝置而變得容易。亦涵蓋其他投藥模式。醫藥組合物可調配成適用於每一投藥途徑之劑型。
本文中涵蓋一般以注射或輸注為特徵之皮下投藥。可注射劑可以習知形式製備，該等習知形式為液體溶液或懸浮液、適於在注射前於液體中形成溶液或懸浮液之固體形式或乳液。合適賦形劑為例如水、鹽水、右旋糖、甘油或乙醇。醫藥組合物可含有其他較小量之無毒輔助物質，諸如濕潤劑或乳化劑、pH緩衝劑、穩定劑、溶解增強劑及其他該等試劑，諸如乙酸鈉、單月桂酸脫水山梨糖醇酯、油酸三乙醇胺及環糊精。本文中亦涵蓋緩慢釋放或持續釋放系統之植入以便維持恆定劑量含量(參見例如美國專利第3,710,795號)。該等組合物中所含有之活性化合物之百分比極其視其特定性質以及化合物活性及個體需要而定。
可注射劑經設計以用於局部及全身性投藥。出於本文中之目的，局部投藥需要直接投予至受影響之間質。用於非經腸投藥之製劑包括準備用於注射之無菌溶液、準備在臨用前與溶劑組合之諸如冷凍乾燥粉末之無菌乾燥可溶性產品(包括皮下錠劑)、準備用於注射之無菌懸浮液、準備在臨用前與媒劑組合之無菌乾燥不可溶性產品及無菌乳液。溶液可為水性或非水性的。若靜脈內投藥，則合適載劑包括生理鹽水或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)，及含有諸如葡萄糖、聚乙二醇、及聚丙二醇、及其混合物之增稠劑、及增 溶劑的溶液。
用於非經腸製劑中之醫藥學上可接受之載劑包括水性媒劑、非水性媒劑、抗微生物劑、等張劑、緩衝劑、抗氧化劑、局部麻醉劑、懸浮及分散劑、乳化劑、鉗合或螯合劑及其他醫藥學上可接受之物質。
水性媒劑之實例包括氯化鈉注射液、任氏注射液(Ringers Injection)、等張右旋糖注射液、無菌水注射液、右旋糖及乳酸任氏注射液。非水性非經腸媒劑包括植物源性不揮發性油、棉籽油、玉米油、芝麻油及花生油。可將抗微生物劑以抑菌或抑真菌濃度添加至包裝於多劑量容器中之非經腸製劑中，該等抗微生物劑包括酚或甲酚、汞劑、苯甲醇、氯丁醇、對羥基苯甲酸甲酯及對羥基苯甲酸丙酯、硫柳汞、羥基氯苯胺(benzalkonium chloride)及苄索氯銨(benzethonium chloride)。等張劑包括氯化鈉及右旋糖。緩衝劑包括磷酸鹽及檸檬酸鹽。抗氧化劑包括硫酸氫鈉。局部麻醉劑包括鹽酸奴佛卡因(procaine hydrochloride)。懸浮及分散劑包括羧甲基纖維素鈉、羥丙基甲基纖維素及聚乙烯吡咯啶酮。乳化劑包括聚山梨醇酯80(吐溫(TWEEN)80)。金屬離子之鉗合或螯合劑包括EDTA。醫藥載劑亦包括用於水可混溶媒劑之乙醇、聚乙二醇、及丙二醇、及用於pH調節之氫氧化鈉、鹽酸、檸檬酸或乳酸。
調節醫藥活性化合物之濃度使得注射提供產生所需藥理作用之有效量。如此項技術中所知，確切劑量視患者或動物年齡、重量及情況而定。單位劑量之非經腸製劑可包裝於安瓿、小瓶或具有針之注射器中。含有醫藥活性化合物之液體溶液或復水粉末製劑之體積隨待治療之疾病及選擇用於包裝之特定製品而變。如此項技術中所知及所實踐，用於非經腸投藥之 所有制劑必須為無菌的。
在一實例中，醫藥製劑可呈液體形式，例如溶液、糖漿或懸浮液。若以液體形式提供，則醫藥製劑可以濃縮製劑形式提供以在使用前稀釋至治療有效濃度。該等液體製劑可藉由習知方法用醫藥學上可接受之添加劑來製備，該等添加劑為諸如懸浮劑(例如山梨糖醇糖漿、纖維素衍生物或氫化食用脂肪)；乳化劑(例如卵磷脂或阿拉伯膠)；非水性媒劑(例如杏仁油、油性酯或經分餾之植物油)；及防腐劑(例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯或山梨酸)。在另一實例中，醫藥製劑可以冷凍乾燥形式呈現以在使用前用水或其他合適媒劑復水。
投藥方法可經使用以降低所選化合物對降解過程(諸如蛋白質水解降解及經由抗原性及免疫原性反應之免疫干預)之暴露。該等方法之實例包括在治療部位局部投藥。已報導使治療劑聚乙二醇化以增加對蛋白質水解之抵抗性、增加血漿半衰期及降低抗原性及免疫原性。聚乙二醇化方法之實例在此項技術中為已知的(參見例如Lu及Felix,Int.J.Peptide Protein Res.,43：127-138,1994；Lu及Felix,Peptide Res.,6：142-6,1993；Felix等人，Int.J.Peptide Res.,46：253-64,1995；Benhar等人，J. Biol.Chem.,269：13398-404,1994；Brumeanu等人，J Immunol.,154：3088-95,1995；亦參見Caliceti等人(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55(10)：1261-77及Molineux(2003)Pharmacotherapy 23(8 Pt 2)：3S-8S)。聚乙二醇化亦可用於活體內核酸分子傳遞。舉例而言，使腺病毒聚乙二醇化可增加穩定性及基因轉移(參見例如Cheng等人(2003)Pharm.Res.20(9)：1444-51)。
冷凍乾燥粉末
在本文中關注冷凍乾燥粉末，其可經復水而以溶液、乳液及其他混合物形式投予。其亦可以固體或凝膠形式復水及調配。
無菌冷凍乾燥粉末係藉由將活性化合物溶解於緩衝溶液中來製備。緩衝溶液可含有改良穩定性之賦形劑或粉末或自粉末製備之復水溶液之其他藥理組份。後續無菌過濾溶液，繼而在熟習此項技術者已知之標準條件下冷凍乾燥以提供所需調配物。簡而言之，冷凍乾燥粉末係藉由將諸如右旋糖、山梨糖醇、果糖、玉米糖漿、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其他合適試劑之賦形劑溶解於諸如檸檬酸鹽、磷酸鈉或磷酸鉀或熟習此項技術者已知之其他該等緩衝液之合適緩衝液中來製備。接著，將所選之酶添加至所得混合物中，且攪拌直至其溶解。所得混合物經無菌過濾或處理以移除微粒且確保無菌，且將其分配至小瓶中以供冷凍乾燥。每一小瓶容納單個劑量或多個劑量之化合物。冷凍乾燥粉末可在諸如約4℃至室溫之合適條件下儲存。用緩衝溶液使此冷凍乾燥粉末復水以提供用於非經腸投藥之調配物。
2. 劑量及投藥
本文中所提供之可溶性玻尿酸酶可調配成典型地用於單一劑量投藥之醫藥組合物。以足以在不存在對所治療患者之不合需要之副作用的情況下發揮治療有效作用之量包括所選之可溶性玻尿酸酶。治療有效濃度可藉由諸如使用本文中所提供或此項技術中已知之檢定在已知試管內及活體內系統中測試多肽來根據經驗判定(參見例如Taliani等人(1996)Anal.Biochem.,240：60-67；Filocamo等人(1997)J Virology,71：1417-1427；Sudo等人(1996)Antiviral Res.32：9-18；Buffard等人(1995)Virology,209：52-59；Bianchi等人 (1996)Anal.Biochem.,237：239-244；Hamatake等人(1996)Intervirology 39：249-258；Steinkuhler等人(1998)Biochem.,37：8899-8905；D'Souza等人(1995)J Gen.Virol.,76：1729-1736；Takeshita等人(1997)Anal.Biochem.,247：242-246；亦參見例如Shimizu等人(1994)J.Virol.68：8406-8408；Mizutani等人(1996)J.Virol.70：7219-7223；Mizutani等人(1996)Biochem.Biophys.Res.Commun.,227：822-826；Lu等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci(USA),93：1412-1417；Hahm等人，(1996)Virology,226：318-326；Ito等人(1996)J.Gen.Virol.,77：1043-1054；Mizutani等人(1995)Biochem.Biophys.Res.Commun.,212：906-911；Cho等人(1997)J.Virol.Meth.65：201-207)且接著自其推斷用於人類之劑量。
治療有效劑量典型地等於或約為500單位至100,000單位之可溶性玻尿酸酶。舉例而言，可溶性玻尿酸酶可以等於或約為500單位、1000單位、2000單位、5000單位、10,000單位、30,000單位、40,000單位、50,000單位、60,000單位、70,000單位、80,000單位、90,000單位、100,000單位或100,000單位以上皮下投予。在一些實例中，劑量可以與所投予之IG之比率形式提供。舉例而言，玻尿酸酶可以每公克IG 10U至500U或500U以上來投予，例如等於或約為10U/g、20U/g、30U/g、40U/g、50U/g、60U/g、70U/g、80U/g、90U/g、100U/g、150U/g、200U/g、300U/g、400U/g、500U/g或500U/g以上。本文中所涵蓋之玻尿酸酶之注射或輸注體積典型地等於或約為0.5ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml、15ml、20ml、30ml、40ml、50ml或50ml以上。玻尿酸酶可以等於或約為50U/ml、100U/ml、150U/ml、200U/ml、400U/ml或500U/ml之儲備溶 液形式提供或可以例如等於或約為1000U/ml、1500U/ml、2000U/ml、4000U/ml或5000U/ml之更濃縮形式提供以供直接使用或用於在使用前稀釋至有效濃度。可溶性玻尿酸酶可以液體或冷凍乾燥調配物形式提供。冷凍乾燥調配物對於儲存大單位劑量之可溶性玻尿酸酶而言為理想的。
本文中所提供之免疫球蛋白製劑可以用於單一或多劑量使用之醫藥組合物形式調配。免疫球蛋白製劑典型地係以足以提供每月一次劑量之量調配以用於單一劑量投藥，但免疫球蛋白製劑可以用於多劑量投藥之較少量提供。如本文中別處所述，IG製劑可以冷凍乾燥或液體形式提供。
以治療有效劑量提供免疫球蛋白。治療有效濃度可藉由在諸如本文中所提供之檢定的已知試管內及活體內系統中測試化合物來根據經驗判定。組合物中所選之免疫球蛋白之濃度視複合物之吸收、鈍化及排泄率、複合物之物理化學特徵、給藥時程及所投予之量以及熟習此項技術者已知之其他因素而定。舉例而言，應瞭解，精確劑量及治療持續時間隨所治療之組織而變且可使用已知測試方案或藉由自活體內或試管內測試資料推斷來根據經驗判定。應注意，濃度及劑量值亦可隨所治療之個體年齡而變。應進一步瞭解，對於任何特定個體而言，特定劑量攝生法應隨時間推移而根據個體需要及投藥或指導調配物投藥之人員之專業判斷來調整，且應瞭解本文中所闡明之濃度範圍僅為例示性的且不意欲限制其範疇。經投予用於治療疾病或病狀(例如IG可治療性疾病或病狀)之所選免疫球蛋白製劑之量可藉由標準臨床技術來判定。另外，可使用試管內檢定及動物模型來幫助識別最佳劑量範圍。
因此，可根據經驗判定之精確劑量可視特定免疫球蛋白製劑、可溶性 玻尿酸酶之攝生法及給藥時程、投藥途徑、待治療之疾病類型及疾病之嚴重度而定。對於所治療之特定適應症而言，一般以允許以等於每月一次IV劑量之劑量皮下投藥之量提供IG。特定之每月一次IV劑量隨待治療之疾病而變，且因此可不同。皮下投予IG之例示性劑量範圍等於或約為1公克(g)、5g、10g、20g、30g、40g、50g、60g、70g、80g、90g、100g或200g。其特定劑量及調配物視適應症及個體而定。舉例而言，可以每公斤體重(BW)50毫克(50mg/kg BW)、100mg/kg BW、200mg/kg BW、300mg/kg BW、400mg/kg BW、500mg/kg BW、600mg/kg BW或600mg/kg BW以上投予劑量。必要時，劑量可根據經驗來判定。為達成該等劑量，皮下投予之IG製劑之體積可等於或約為50ml、100ml、200ml、300ml、400ml、500ml、600ml、700ml或700ml以上。舉例而言，用於本文中所述之適應症的10%液體IG調配物(100 mg/ml)可以50ml至700ml之體積投予以達成0.5g至70g IG之劑量。
在投予大體積之情況下，典型地藉由輸注來投藥。可以等於或約為0.5ml/kg/BW/h、1ml/kg/BW/h、2ml/kg/BW/h、3ml/kg/BW/h、4ml/kg/BW/h或5ml/kg/BW/h之輸注速率對個體進行給藥。輸注速率可根據經驗判定且典型地隨個體之可耐受性而變。若在輸注期間出現不良反應，則可將輸注速率減慢至恰好低於出現不良事件之速率。若回應於速率降低而使不良事件消除，則可在醫師斟酌下緩慢增加輸注速率。可藉由重力、泵輸注或完全20公克-30公克劑量之注射來促進皮下IG輸注。對於輸注而言，一般可使用靜脈內輸注泵。IG可以等於或約為5ml/h、10ml/h、30ml/h、60ml/h、120ml/h、240ml/h或300ml/h之速率來輸注。只要輸注可為患者所耐受即可在治療過 程期間增加輸注速率。輸注之投藥時間一般等於或約為0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、4h或4h以上。歸因於藉由皮下投予與玻尿酸酶共同調配及/或共同投予之IG所達成之高輸注速率，所以輸注時間顯著小於習知IVIG治療之輸注時間。在輸注時間超過所需限度之情況下，可在醫師及個體之斟酌下開始使用第二輸注部位。典型地開始使用距初始部位至少10cm之第二部位。
用於輸注之技術為熟習此項技術者所知，且在治療醫師之技術範圍內。合適劑量之IG一般可儲集於標準IV袋中。舉例而言，可使用不通氣輸注裝置，其在末端附近具有Y形口。可將24號皮下輸注針在個體所偏好之部位處插入，但由於待輸注之溶液體積，所以推薦腹部且其次大腿。玻尿酸酶及IG可提供於相同Y形口設備中。出於藉由重力或泵來輸注之目的，在本文中亦可使用其他製品且其包括(但不限於)管、瓶、注射器或其他容器。
可溶性玻尿酸酶可在IG製劑之後、與之間歇或同時投予。一般在投予IG製劑之前投予玻尿酸酶以允許玻尿酸酶降解間質空間中之玻尿酸。舉例而言，可在投予IG製劑前第1分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘、5分鐘、6分鐘、7分鐘、8分鐘、9分鐘、10分鐘、20分鐘或30分鐘投予可溶性玻尿酸酶。在一些實例中，玻尿酸酶與免疫球蛋白製劑一起投予。如將由熟習此項技術者所瞭解，所需之共同投予接近度在顯著程度上視劑在特定組織環境中之作用半衰期及所治療之特定疾病而定，且可藉由在合適模型(諸如合適動物模型)中測試以不同時間投予劑之作用來容易地最佳化。在一些情境下，投予玻尿酸酶之最佳時間應超過60分鐘。
在輸注IG之前，一般以等於或約為0.2ml/min、0.5ml/min、1ml/min、2ml/min、5ml/min、10ml/min或10ml/min以上之速率注射可溶性玻尿酸酶。舉例而言，可經由用於後繼輸注IG之相同Y形口來注射可溶性玻尿酸酶。如上文所述，所投予之可溶性玻尿酸酶之體積隨所需劑量而變，但可視可用之可溶性玻尿酸酶儲備調配物之濃度而變化。舉例而言，在本文中預期不以大於約50ml之體積來投予可溶性玻尿酸酶，且典型地以5ml-30ml之體積來投予。在醫師之斟酌下，對於較大體積可使用注射泵。
在不耐受輸注(例如，其引起中度至重度局部反應)之情況下，可開始使用第二輸注部位以便個體接受完全劑量。
IG製劑可一次投予或可分為多個較小劑量以按時間間隔投予。可以一或多個劑量經治療時程(例如經若干小時、天、週或月)投予所選IG製劑。在一些狀況下，連續投藥為適用的。應瞭解，投藥之精確劑量及過程視適應症及患者可耐受性而定。
同樣，應瞭解精確劑量及治療持續時間隨所治療之疾病而變且可使用已知測試方案或藉由自活體內或試管內測試資料推斷來根據經驗判定。應注意，濃度及劑量值亦可隨待緩解之病狀之嚴重度而變。應進一步瞭解，對於任何特定個體而言，特定劑量攝生法應隨時間推移而根據個體需要及投藥或指導組合物投藥之人員之專業判斷來調整，且應瞭解本文中所闡明之濃度範圍僅為例示性的且不意欲限制含有其之組合物及組合之範疇或使用。可每小時、每天、每週、每月、每年或一次性投予組合物。劑量攝生法一般經選擇以限制毒性。應注意，歸因於毒性或骨髓、肝或腎或其他組織功能障礙，主治醫師應瞭解如何及何時終止、中斷或調整治療至較低劑 量。相反，若臨床反應不足(排除毒性副作用)，則主治醫師亦應瞭解如何及何時將治療調整至較高含量。
G. 評定活性、生物可用率及藥物動力學之方法
檢定可用於評定免疫球蛋白單獨或與可溶性玻尿酸酶組合之試管內及活體內活性。在該等檢定中包括彼等評定皮下投予之免疫球蛋白之藥物動力學特性(包括生物可用率及可耐受性)的檢定。亦可使用此項技術中熟知之檢定來評定免疫球蛋白及玻尿酸酶之生物活性。可使用該等檢定(例如)來判定用於治療之免疫球蛋白及玻尿酸酶之合適劑量及給藥頻率。
1. 藥物動力學及可耐受性
藥物動力學及可耐受性研究(諸如下文描述於實施例1中之彼等研究)可使用動物模型來進行或可在對患者進行臨床研究期間進行。動物模型包括(但不限於)小鼠、大鼠、家兔、犬、豚鼠及非人類之靈長類動物模型(諸如獼猴或恆河猴(rhesus macaques))。在一些情況下，使用健康動物進行藥物動力學及可耐受性研究。在其他實例中，使用具有考慮用免疫球蛋白治療之疾病之動物模型(諸如具有下文所述之疾病及病狀中之任一者的動物模型)來進行研究。
投藥後，可藉由量測下列參數來評定皮下投予之免疫球蛋白之藥物動力學：最大(峰值)血漿免疫球蛋白濃度(Cmax)、峰值時間(亦即出現最大血漿免疫球蛋白濃度之時間；Tmax)、最小血漿免疫球蛋白濃度(亦即免疫球蛋白劑量之間的最小血漿濃度；Cmin)、消除半衰期(T1/2)及曲線下面積(亦即由繪製血漿免疫球蛋白濃度隨時間之關係圖所產生之曲線下的面積；AUC)。藉由比較皮下傳遞後免疫球蛋白之曲線下面積(AUCsc)與靜脈 內傳遞後免疫球蛋白之AUC(AUCiv)來測定皮下投予之免疫球蛋白之絕對生物可用率。可使用公式：F=([AUC]sc×劑量sc)/([AUC]iv×劑量iv)來計算絕對生物可用率(F)。可使用此項技術中已知之任何適於評定血液樣品中之免疫球蛋白濃度之方法來量測皮下投藥後免疫球蛋白於血漿中之濃度。例示性方法包括(但不限於)ELISA及濁度測定法。
在藥物動力學研究中可投予給藥之劑量範圍及不同給藥頻率來評定增加或減少劑量中之免疫球蛋白及/或玻尿酸酶濃度之效應。亦可在共同投予或未共同投予玻尿酸酶之情況下評定皮下投予之免疫球蛋白之藥物動力學特性(諸如生物可用率)。舉例而言，可向犬(諸如米格魯犬(beagle))皮下投予與玻尿酸酶組合之免疫球蛋白或單獨皮下投予免疫球蛋白。亦向另一組米格魯犬給予免疫球蛋白之靜脈內劑量。接著可在各個時間點獲取血液樣品且諸如藉由濁度測定法來測定血漿中之免疫球蛋白量。接著可量測AUC且可測定在投予或未投予玻尿酸酶之情況下皮下投予之免疫球蛋白之生物可用率。可進行該等研究來評定與玻尿酸酶共同投予對皮下投予之免疫球蛋白之藥物動力學特性(諸如生物可用率)的影響。
評定安全性及可耐受性之研究在此項技術中亦為已知的且可在本文中使用。在共同投予或未共同投予玻尿酸酶之情況下，皮下投予免疫球蛋白後，可監視任何不良反應之出現。不良反應可包括(但不限於)諸如浮腫或腫脹之注射部位反應、頭痛、發燒、疲勞、寒冷、面部潮紅、眩暈、專麻疹、喘鳴或胸悶、噁心、嘔吐、寒戰、背痛、胸痛、肌肉痙攣、癲癇發作或抽搐、血壓變化及過敏性或嚴重超敏性反應。典型地在安全性及可耐受性研究中投予多種劑量及不同給藥頻率來評定增加或降低劑量中之免疫 球蛋白及/或玻尿酸酶濃度之效應。
2. 生物活性
a. 免疫球蛋白
可試管內或活體內評定免疫球蛋白用作治療劑之能力。舉例而言，可進行試管內檢定來評定免疫球蛋白中和病毒或細菌感染性之能力(Hiemstra等人，(1994)J Lab Clin Med 123：241-6)。可使用其他試管內檢定來評定免疫球蛋白之其他生物活性。舉例而言，可使用此項技術中已知之包括(但不限於)ELISA、西方墨點法(Western blot)、北方墨點法(Northern blot)及流式細胞法之任何方法來評定標記表現以評定免疫球蛋白製劑與補體活化產物相互作用及調節補體活化產物、結合個體遺傳型抗體、結合巨噬細胞上之Fc受體及抑制包括細胞因子、趨化因子及金屬蛋白酶之各種發炎性介體的能力。舉例而言，可使用流式細胞法來評定免疫球蛋白對外周血單核細胞上之趨化因子受體表現之影響(Trebst等人，(2006)Eur J Neurology)。在另一實例中，可使用北方墨點分析來評定免疫球蛋白對巨噬細胞上之金屬蛋白酶表現之影響(Shapiro等人，(2002)Cancer 95：2032-2037)。
亦可進行使用動物模型之活體內研究來評定免疫球蛋白之治療活性。可向感染一或多種微生物之動物模型投予免疫球蛋白且可諸如藉由量測微生物數目或量測重量作為發病標記來評定對感染進程之影響。亦可使用具有考慮使用免疫球蛋白治療之疾病及病狀之動物模型來評定免疫球蛋白之治療作用。該等動物模型在此項技術中為已知的，且包括(但不限於)下列疾病之小動物模型：X-連結無γ球蛋白血症(XLA)、SCID、維斯科特-奧爾德裏奇症候群、川崎氏病、格巴二氏症候群、ITP、多發性肌炎、蘭伯 特-伊頓肌無力症候群、重症肌無力及莫氏-沃特曼症候群(Czitrom等人(1985)J Immunol 134：2276-2280；Ellmeier等人，(2000)J Exp Med.192：1611-1624；Ohno(2006)Drug Discovery Today：Disease Models 3：83-89；Oyaizu等人(1988)J Exp Med 2017-2022；Hansen等人，(2002)Blood 100：2087-2093；Strongwater等人，(1984)Arthritis Rheum.27：433-42；Kim等人(1998)Annals NY Acad Sci 841：670-676；Christadoss等人(2000)94：75-87；Sommer等人，(2005)Lancet 365：1406-1411；美國專利第7309810號)。
b. 玻尿酸酶
可使用此項技術中熟知之方法來評定玻尿酸酶活性。在一實例中，使用微濁度檢定來量測活性。此係基於當玻尿酸與血清白蛋白結合時不溶性沈澱物之形成。藉由將玻尿酸酶與玻尿酸鈉(玻尿酸)一起培育設定時段(例如10分鐘)且接著藉由添加酸化之血清白蛋白來使未消化之玻尿酸鈉沈澱來量測活性。在額外發展時段後，於640nm處量測所得樣品之濁度。由玻尿酸酶對玻尿酸鈉受質之活性所引起之濁度降低為玻尿酸酶酶促活性之量度。在另一實例中，使用微量滴定檢定來量測玻尿酸酶活性，其中在與玻尿酸酶培育後量測剩餘之生物素標記玻尿酸(參見例如Frost及Stern(1997)Anal.Biochem.251：263-269；美國專利公開案第20050260186號)。玻尿酸之葡萄糖醛酸殘基上之自由羧基經生物素標記，且生物素標記之玻尿酸受質與微量滴定板共價偶合。在與玻尿酸酶一起培育後，使用抗生物素蛋白-過氧化酶反應來偵測剩餘之生物素標記之玻尿酸受質，且將其與在與具有已知活性之玻尿酸酶標準物反應後所獲得之結果比較。其他用於量測玻尿酸酶活性之檢定在此項技術中亦為已知的且可用於本文中之方法中 (例如參見Delpech等人，(1995)Anal.Biochem.229：35-41；Takahashi等人，(2003)Anal.Biochem.322：257-263)。
亦可評定玻尿酸酶充當展布劑或擴散劑之能力。舉例而言，可在玻尿酸酶存在或不存在之情況下將台盼藍染料皮下注射至裸小鼠之每一側上之側面皮膚中。接著諸如用測微計量測染色面積來測定玻尿酸酶充當展布劑之能力(美國專利第20060104968號)。
H. 治療用途
可使用本文中所述之方法來治療針對其使用免疫球蛋白之任何病狀。可皮下投予與玻尿酸酶組合之免疫球蛋白(IG)來治療可由免疫球蛋白治療來改善之任何病狀。本節提供IG之例示性治療用途。下文所述之治療用途為例示性的且不限制本文中所述方法之應用。治療用途包括(但不限於)用於各種免疫學、血液學、神經學、發炎性、皮膚病學及/或傳染性疾病及病狀之免疫球蛋白替代治療及免疫調節治療。在一些實例中，諸如在可能暴露於傳染性疾病(例如，意外針刺損傷)後，投予免疫球蛋白以強化健康患者之免疫反應。識別該等疾病或病狀係在治療醫師之技術範圍內。
與其他用於治療此等疾病及病狀之劑組合之免疫球蛋白可與玻尿酸酶皮下共同投予。舉例而言，其他可投予之劑包括(但不限於)抗生素、化學治療劑、類固醇消炎藥、非類固醇消炎藥及其他諸如細胞因子、趨化因子及生長因子之免疫調節劑。
必要時，可根據經驗判定或推斷特定劑量及持續時間及治療方案。舉例而言，可將靜脈內投予之免疫球蛋白之例示性劑量用作起點來判定合適劑量。劑量含量可基於多種因素加以判定，諸如個體體重、一般健康、年 齡、所用之特定化合物之活性、性別、膳食、投藥時間、排泄率、藥物組合、疾病之嚴重度及過程及患者對疾病之傾向及治療醫師之判斷。免疫球蛋白之劑量一般等於或約為每公斤體重100mg(亦即100mg/kg BW)至2g/kg BW，且玻尿酸酶之劑量等於或約為每公克免疫球蛋白10U至500U或500U以上，例如等於或約為10U/g、20U/g、30U/g、40U/g、50U/g、60U/g、70U/g、80U/g、90U/g、100U/g、150U/g、200U/g、300U/g、400U/g、500U/g或500U/g以上。應瞭解，所投予之量應隨所治療之適應症而變且可能隨將要耐受之副作用而變。可使用用於每一病症之公認模型來根據經驗判定劑量。
在改善患者病狀後，必要時，可與玻尿酸酶以組合方式皮下投予維持劑量之免疫球蛋白，且可修改劑量、劑型或投藥頻率或其組合。在一些狀況下，在任何疾病症狀復發後，個體可能需要基於長期之間歇治療。
1. 具有抗體缺乏之原發性免疫缺乏症
免疫球蛋白可用於治療具有抗體缺乏之原發性免疫缺乏症。原發性免疫缺乏症涵蓋特徵在於缺乏免疫系統之一或多種蛋白質之許多病症。原發性免疫缺乏症典型地為遺傳病症，且許多表現為保護性抗體產生障礙。因此，可向呈現該等疾病之患者投予免疫球蛋白作為免疫球蛋白替代治療。例示性原發性免疫缺乏症包括(但不限於)常見變異性免疫缺乏症(CVID)、先天性無γ球蛋白血症、維斯科特-奧爾德裏奇症候群、嚴重複合型免疫缺乏症(SCID)、原發性低γ球蛋白血症、具有抗體缺乏之原發性免疫缺乏疾病、X-連結無γ球蛋白血症(XLA)、嬰兒期低γ球蛋白血症、及無抗體之副腫瘤性小腦變性。可向患有具有抗體缺乏之原發性免疫缺乏症之患 者以類似於免疫球蛋白靜脈內投藥所用之劑量的劑量皮下投予與玻尿酸酶組合之免疫球蛋白。例示性劑量包括例如100mg/kg BW與800mg/kg BW免疫球蛋白之間的劑量(以四週之間隔時間)。視臨床反應而定，可增加或降低劑量，亦可增加或降低給藥頻率。
2. 血液惡性腫瘤繼發之後天低γ球蛋白血症
具有血液惡性腫瘤繼發之後天低γ球蛋白血症之患者歸因於該後天低γ球蛋白血症而易患上細菌感染，該等血液惡性腫瘤為諸如慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、多發性骨髓瘤(MM)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)及其他相關惡性腫瘤及造血幹細胞後移植。低γ球蛋白血症由血液中缺乏B-淋巴細胞及所造成之抗體含量較低引起且可見於具有CLL、MM、NHL之患者中且為白血病相關之免疫功能障礙及治療相關之免疫抑制的結果。體液性免疫缺乏主要為造成(尤其)受被膜包裹之微生物感染相關之發病風險及此等患者死亡率增加之原因。舉例而言，肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)及金黃色葡萄球菌(Staphyloccus aureus)以及退伍軍人桿菌(Legionella)及奴卡菌(Nocardia)屬為在具有CLL之患者中引起肺炎之常見細菌性病原體。亦已觀察到諸如肺炎肺囊蟲(Pneumocystis carinii)、真菌、病毒及分枝桿菌(mycobacteria)之機會性感染。可藉由投予免疫球蛋白來顯著降低此等患者中之感染數及嚴重度(Griffiths等人，(1989)Blood 73：366-368；Chapel等人(1994)Lancet 343：1059-1063)。因此，可使用本文中所述之方法向該等患者皮下投予與玻尿酸酶組合之免疫球蛋白來防止復發感染。例示性劑量包括向具有血液惡性腫瘤繼發之後天低γ球蛋白血症之患者靜脈內投予免疫球蛋白所用之彼 等劑量。舉例而言，可每3至4週皮下投予與玻尿酸酶組合之約400mg/kg BW免疫球蛋白。在另一實例中，在患者血清IgG小於4g/L之治療第一個月可投予400mg/kg BW之額外劑量。適當時，可增加或降低所投予之免疫球蛋白量及給藥頻率。
3. 川崎氏病
川崎氏病為常常累及冠狀動脈之兒童及小嬰兒之急性發熱性多系統疾病。其亦稱作淋巴結症候群、黏膜皮膚淋巴結疾病、嬰兒多動脈炎及川崎氏症候群且為瞭解較少之影響包括皮膚及黏膜、淋巴結、血管壁及心臟之多個器官的自限性脈管炎(self-limited vasculitis)。在恢復階段期間，冠狀動脈動脈瘤自疾病之第二週開始出現。儘管病狀之起因為未知的，但存在證據說明特徵性脈管炎由免疫反應引起，該免疫反應特徵在於T細胞及巨噬細胞針對未知抗原活化、細胞因子分泌、多株B細胞機能亢進及針對內皮細胞及平滑肌細胞之自體抗體形成。在遺傳易感性個體中，一或多種可能具有超抗原活性之不典型之常見感染因子可觸發該疾病。在川崎氏病早期投予免疫球蛋白可預防冠狀動脈病變。向具有與川崎氏病有關之進行性炎症之患者皮下投予與玻尿酸酶組合之免疫球蛋白可改善症狀。例示性劑量包括向具有川崎氏病之患者靜脈內投予免疫球蛋白所用之彼等劑量。舉例而言，可向具有川崎氏病之患者投予每公斤患者體重約1g-2g免疫球蛋白。舉例而言，此劑量可以4份400mg/kg BW之劑量分連續4日投予。在另一實例中，可經10小時之時段以單一劑量形式投予1g/kg BW之免疫球蛋白。適當時，可增加或降低所投予之免疫球蛋白量。
4. 慢性發炎性髓鞘脫失多發性神經病
慢性發炎性髓鞘脫失多發性神經病(CIDP)為特徵在於腿及手臂進行性無力及感覺功能受損之神經病症。有時稱作慢性復發性多發性神經病之該病症係由周邊神經之髓鞘遭損壞而引起。儘管其可發生於任何年齡及兩種性別，但CIDP更常見於年輕成人中且男性多於女性。其常常以包括發麻或麻痹(開始於腳趾及手指)、手臂及腿無力、深部腱反射喪失(反射消失)、疲勞及感覺異常之症狀呈現。CIDP與格巴二氏症候群密切相關且被視作彼急性病之慢性對應疾病。不存在特異性診斷性測試，但特徵性臨床及實驗室研究結果有助於將此病症與其他免疫介導性神經病症候群相辨別。研究指示用免疫球蛋白治療會減輕症狀(van Schaik等人，(2002)Lancet Neurol.1：497-498)。因此，可使用本文中所述之方法向呈現CIDP之患者皮下共同投予玻尿酸酶及免疫球蛋白。例示性劑量包括向具有CIDP之患者靜脈內投予免疫球蛋白所用之彼等劑量。在一實例中，向具有CIDP之患者皮下投予與玻尿酸酶組合之約2g/kg BW之免疫球蛋白。舉例而言，此劑量可以5份400mg/kg BW之劑量分連續五日投予。適當時，可增加或降低所投予之免疫球蛋白量。
5. 格巴二氏症候群
格巴二氏症候群為涉及周邊神經之發炎性髓鞘脫失之神經自體免疫病症。第一症狀包括不同程度之腿部無力或發麻感，其可波及手臂及上身。此等症狀之強度可增加直至肌肉完全不能使用且患者幾乎完全癱瘓，引起危及生命之病狀。儘管大多數患者一般恢復良好或完全恢復，但已報導約20%患者存在永久傷殘且4%至15%患者死亡。格巴二氏症候群可在呼吸道或胃腸道病毒感染症狀後數日或數週時出現。在一些情況下，手術或疫苗 接種可觸發該症候群。該病症可經數小時或數日之時程發展，或其可持續3至4週。神經傳導速度(NCV)測試可向醫生提供線索以協助診斷。在一些情況下，脊椎抽液(spinal tap)可用於診斷中，因為格巴二氏症候群患者之腦脊髓液典型地比正常個體含有更多蛋白質。
儘管不存在用於格巴二氏症候群之已知治療，但用免疫球蛋白治療可減輕疾病之嚴重度且加速恢復。可以合適劑量向患者皮下投予與玻尿酸酶組合之免疫球蛋白，該合適劑量為諸如與用於向具有格巴二氏症候群之患者靜脈內投予免疫球蛋白之劑量相類似之劑量。舉例而言，可向具有格巴二氏症候群之患者皮下投予與玻尿酸酶組合之約2g/kg BW之免疫球蛋白。舉例而言，此劑量可以5份400mg/kg BW之劑量分連續5日投予。視例如可由熟習此項技術者容易地評估的疾病嚴重度及對治療之臨床反應而定，可增加或降低所投予之免疫球蛋白量。
6. 特發性血小板減少性紫癜
亦稱作原發性免疫性血小板減少性紫癜及自體免疫性血小板減少性紫癜之特發性血小板減少性紫癜(ITP)為由抗血小板抗體導致血小板存活縮短所引起之血小板計數減少(血小板減少症)。當血小板計數極低(例如<30×109/L)時，可出現血液滲出至皮膚(紫癜)及黏膜中。具有ITP之患者之骨髓血小板生成(巨核細胞生成(megakaryopoiesis))在形態上為正常的。在一些情況下，存在額外血小板功能障礙，其與結合至血小板表面上之醣蛋白之抗體有關。ITP可以慢性及急性形式存在。約80%之具有ITP之成人具有慢性疾病形式。慢性ITP之最高發病率在年齡為15歲-50歲之女性中，但一些報導暗示發病率隨年齡增加。ITP相對常見於具有HIV之患者中。雖 然ITP可見於感染之任何階段，但其發病率隨HIV疾病推進而增加。
研究已表明免疫球蛋白可用於治療具有ITP之患者(Godeau等人(1993)Blood 82(5)：1415-21；Godeau等人(1999)Br J Haematol 1999；107(4)：716-9)。為治療具有ITP之患者，可以類似於用於靜脈內投予免疫球蛋白之劑量的劑量向患者皮下投予與玻尿酸酶組合之免疫球蛋白。舉例而言，可向具有ITP之患者皮下投予與玻尿酸酶組合之約1g/kg至2g/kg之免疫球蛋白。此劑量可經若干天投予或可以一次劑量投予。在一些實例中，以5份400mg/kg BW之免疫球蛋白之劑量分連續數日投予。在另一實例中，視血小板計數及臨床反應而定，投予1g/kg BW，持續連續1-2日。視例如可由熟習此項技術者容易地評估之血小板計數及對治療之臨床反應而定，可增加或降低所投予之免疫球蛋白量及給藥頻率。
7. 發炎性肌病：多發性肌炎、皮肌炎及包涵體肌炎
發炎性肌病為涉及骨骼肌組織炎症及變性之一組肌肉疾病。此等疾病為後天的且皆呈現顯著肌肉無力及肌肉內存在發炎性反應。皮肌炎(DM)由於其特殊皮疹而為最易於識別之發炎性肌病，該皮疹以眼瞼、面頰及鼻樑上及背部或上胸部、肘、膝及關節上之片狀暗黑色、微紅或淡紫色皮疹之形式出現。在一些患者中，在皮膚下出現鈣化節結或硬化凸塊。皮疹常常先於肌肉無力，其典型地經數週之時段出現但可經數月或甚至數日出現。皮肌炎可出現於兒童期至成人期之任何年齡且女性比男性更常見。報導約三分之一的DM患者具有吞咽困難。小於25%之具有DM之成人一般出現肌肉疼痛及觸痛，但多於50%之具有DM之兒童抱怨肌肉疼痛及觸痛。
多發性肌炎(PM)不具有皮肌炎之特徵性皮疹，且肌肉無力之發作通 常比DM進展更為緩慢。許多PM患者具有吞咽困難。在一些情況下，患者亦具有歸因於肌肉衰竭之呼吸困難。多達三分之一的PM患者具有肌肉疼痛。與男性相比，較多女性感染該疾病，且年齡在20歲以下之人群很少感染該疾病，但已報導兒童期及嬰兒期多發性肌炎之病例。
包涵體肌炎(IBM)與多發性肌炎極類似。IBM中之肌肉無力之發作通常極為漸進，經數月或數年發生。其與PM不同之處在於近端及遠端肌肉皆受到影響，而在PM中一般僅近端肌肉受到影響。典型發現包括腕屈肌及指屈肌無力。前臂萎縮為該疾病之特徵，且常見四頭肌萎縮及不同程度之其他肌肉無力。約一半患有IBM之患者具有吞咽困難。IBM之症狀通常在50歲後開始，但不排除任何年齡組。與女性相比，IBM更常出現於男性中。約十分之一的IBM病例為遺傳性的。
研究指示投予免疫球蛋白可有益於具有此等發炎性肌病之患者。免疫球蛋白可改善肌肉力量，減輕炎症且減輕疾病進程及嚴重度(Dalakas等人(1993)N Engl J Med 329(27)：1993-2000；Dalakas等人(2001)Neurology 56(3)：323-7；Dalakas(2004)Pharmacol Ther 102(3)：177-93；Walter等人(2000)J Neurol 247(1)：22-8)。可向具有DM、PM或IBM之患者以類似於用於靜脈內投予免疫球蛋白之劑量的劑量皮下投予與玻尿酸酶組合之免疫球蛋白。舉例而言，可典型地經若干天投予2g/kg BW之免疫球蛋白，諸如以5份400mg/kg BW之劑量分連續數日投予。
8. 蘭伯特-伊頓肌無力症候群
蘭伯特-伊頓肌無力症候群(LEMS)為罕見之自體免疫性神經肌肉傳遞病症，其首先被認為臨床上與肺癌有關且隨後出現於未偵測出任何贅瘤之 病例中。具有LEMS之患者具有突觸前神經肌肉接合點缺損。該疾病之臨床特徵在於近端肌肉無力(練習後力量增加)，輕度動眼體征、深部腱反射壓抑及自主神經功能障礙(口乾燥、便秘、勃起障礙)。向具有LEMS之患者皮下投予與玻尿酸酶組合之免疫球蛋白可改善症狀。例示性劑量包括彼等用於向具有LEMS之患者靜脈內投予免疫球蛋白之劑量。舉例而言，可經由若干次給藥向具有LEMS之患者投予每公斤患者體重2g之免疫球蛋白。舉例而言，可以5份400mg/kg BW免疫球蛋白之劑量分連續5日投予。合適時，可增加或降低所投予之免疫球蛋白量。
9. 多灶性運動神經病
具有傳導阻滯之多灶性運動神經病(MMN)為後天免疫介導性髓鞘脫失神經病，其具有緩慢漸進性無力、自發性收縮及痙攣而無顯著感覺受累。在診斷之前，疾病之持續時間處於若干月至多於15年之範圍內。MMN之明確成因為未知的。組織病理學及電診斷研究表明存在髓鞘脫失及軸突損傷。主要影響運動神經，但已表明感覺神經中亦存在輕度髓鞘脫失。免疫調節及免疫抑制治療之功效進一步支持MMN之免疫性質。在超過一半之具有MMN之患者中，抗GM1抗體之力價升高。儘管抗GM1抗體在該疾病中之作用為未知的，但其存在可用作MMN之診斷標誌。
向具有MMN之患者皮下投予與玻尿酸酶組合之免疫球蛋白可改善症狀。例示性劑量包括彼等用於向具有MMN之患者靜脈內投予免疫球蛋白之劑量。舉例而言，可經由若干次給藥向具有MMN之患者投予每公斤患者體重2g之免疫球蛋白。舉例而言，可以5份400mg/kg BW免疫球蛋白之劑量分連續5日投予。在另一實例中，1g/kg BW可分連續2日投予。可向一 些患者給予維持治療，其可包括例如每2-6週給予400mg/kg BW至2g/kg BW之劑量。考慮患者反應，合適時，可增加或降低所投予之免疫球蛋白量。
10. 重症肌無力
重症肌無力(MG)為慢性自體免疫性神經肌肉疾病，其特徵在於身體骨骼肌不同程度之無力。其與存在針對乙醯膽鹼受體(AChR)之抗體有關或與神經肌肉接合點處之肌肉特異性酪胺酸激酶(MuSK)有關，但一些患者為抗體陰性的。MG之臨床特徵包括波動性無力及隨意肌之易疲勞性(尤其提上瞼肌、眼外肌、眼球肌、肢體肌肉及呼吸肌)。患者通常呈現眼瞼單側或雙側下垂(下垂)、複視、吞咽困難及近端肌肉無力。在嚴重狀況下或在急性嚴重惡化(肌無力危症)中，呼吸肌無力可引起呼吸衰竭。重症肌無力出現於所有種族群體及兩種性別中。其最常感染低於40歲之年輕成人女性及高於60歲之年長男性，但其可出現於任何年齡。在一些情況下，可進行胸腺切除術以減輕症狀。
典型地當其他治療無效或引起嚴重副作用時，可將免疫球蛋白例如作為維持治療用於具有中度至重度MG之患者，且亦可在胸腺切除術之前或疾病急性惡化(肌無力危症)期間投予免疫球蛋白。可使用本文中所述之方法向具有重症肌無力之患者皮下投予與玻尿酸酶組合之免疫球蛋白。例示性劑量包括彼等用於向具有MG之患者靜脈內投予免疫球蛋白之劑量。舉例而言，可向具有MG之患者每4週-6週投予400mg/kg BW至2g/kg BW之劑量以供維持治療。胸腺切除術之前或肌無力危症期間，可經由若干次給藥來投予1g/kg BW-2g/kg BW，諸如以5份400mg/kg BW之劑量分連續5日投予。在另一實例中，1g/kg BW可分連續2日投予。
11. 莫氏-沃特曼症候群
亦稱作僵人症候群之莫氏-沃特曼症候群為具有自體免疫疾病特徵之罕見神經病症。患者呈現與肌肉僵硬及併發陣發性痙攣有關之症狀。肌肉僵硬波及主要腹部及胸腰部肌肉之中軸肌肉以及近端肢體肌肉。軀幹主動肌及拮抗肌共同收縮典型地導致具有脊柱前凸過度之板狀外觀。較不常見的是，呼吸肌受累導致呼吸困難且面部肌肉受累導致假面樣面容。用免疫球蛋白治療可達成具有莫氏-沃特曼症候群之患者之僵硬減輕及敏感性評分增高(Dalakas等人(2001)N Engl J Med 345(26)：1870-6)。可使用本文中所述之方法向具有莫氏-沃特曼症候群之患者皮下投予與玻尿酸酶組合之免疫球蛋白。例示性劑量包括彼等用於向具有莫氏-沃特曼症候群之患者靜脈內投予免疫球蛋白之劑量。舉例而言，免疫球蛋白可以400mg/kg BW之劑量分連續5日投予。可向一些患者給予維持治療，其可包括例如每4-6週投予1g/kg BW-2g/kg BW免疫球蛋白。合適時，可增加或降低所投予之免疫球蛋白量。
12. 其他疾病及病狀
臨床資料指示免疫球蛋白可用於治療許多病狀。在一些情況下，免疫球蛋白可用作一線治療，然而，在其他狀況下，當標準治療經證明無效、變得不可耐受或顯示不當時，可投予免疫球蛋白以作為二線治療。識別該等疾病或病狀係在治療醫師之技術範圍內。此等疾病或病狀之實例包括(但不限於)繼發性低γ球`白血症(包括醫原性免疫缺乏症)；特異性抗體缺乏；急性播散性腦脊髓炎；ANCA陽性全身壞死性脈管炎；自體免疫溶血性貧血；大水皰性天疱瘡樣病；瘢痕性天疱瘡樣病；伊文氏症候群(包括具有免疫性血小板減少症之自體免疫溶血性貧血)；母胎/新生兒同種免疫 性血小板減少症(FMAIT/NAIT)；阿耳滋海默氏病；噬血細胞症候群；高風險同種異體造血幹細胞移植；IgM副蛋白血症神經病；腎移植；多發性硬化；眼陣攣肌陣攣運動失調；落葉型天疱瘡；尋常天疱瘡；輸血後紫癜；中毒性表皮壞死溶解/史蒂芬強生症候群(TEN/SJS)；中毒性休克症候群；全身性紅斑狼瘡；多發性骨髓瘤；膿毒病；骨髓移植；B細胞腫瘤；及創傷。
免疫球蛋白亦已展示具有針對多種細菌、病毒及真菌感染之抗微生物活性，該等細菌、病毒及真菌包括(但不限於)B型流感嗜血桿菌、A型及B型綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、B群鏈球菌、1型、3型、4型、6型、7型、8型、9型、12型、14型、18型、19型及23型肺炎鏈球菌、2型及5型腺病毒、細胞巨大病毒、E-B病毒VCA、A型肝炎病毒、B型肝炎病毒、疱疹單純型病毒-1、疱疹單純型病毒-2、A型流行性感冒、麻疹、1型、2型及3型副流行性感冒、脊髓灰質炎、水痘帶狀疱疹病毒、麴菌及白色念珠菌。因此，可向具有細菌、病毒及真菌感染之患者皮下投予與玻尿酸酶組合之免疫球蛋白以強化患者之免疫系統且治療疾病。在一些實例中，亦可投予抗生素或其他抗微生物劑。
I. 製品及套組
可將共同或分別提供之免疫球蛋白及可溶性玻尿酸酶之醫藥組合物包裝成製品，該等製品含有包裝材料、有效用於治療IG可治療性疾病或病狀之醫藥組合物及指示組合物及組合打算用於治療IG可治療性疾病及病狀之標籤。例示性製品為包括單腔室及雙腔室容器之容器。容器包括(但不限於)管、瓶及注射器。容器可進一步包括用於皮下投藥之針。
本文中所提供之製品含有包裝材料。用於包裝醫藥產品之包裝材料為 熟習此項技術者所熟知。例如參見美國專利第5,323,907號、第5,033,252號及第5,052,558號，其每一者係全部併入本文中。醫藥包裝材料之實例包括(但不限於)發泡包裝、瓶、管、吸入器、泵、袋、小瓶、容器、注射器、瓶及適用於所選調配物及預期投藥及治療模式之任何包裝材料。預期本文中所提供之化合物及組合物之多種調配物為對任何IG可治療性疾病或病狀之多種治療。
共同或分別提供之免疫球蛋白及可溶性玻尿酸酶之組合物亦可以套組形式提供。套組可包括本文中所述之醫藥組合物及用於投藥之項目。舉例而言，組合物可與諸如注射器、吸入器、劑量杯、滴管或塗藥器之用於投藥之裝置一起提供，套組可視情況包括關於包括劑量、給藥攝生法之應用之說明書及關於投藥模式之說明書。套組亦可包括本文中所述之醫藥組合物及用於診斷之項目。舉例而言，該等套組可包括用於量測IG之濃度、量或活性之項目。
J. 實施例
僅出於說明性目的而包括下列實施例且該等實施例不意欲限制本發明之範疇。
實施例1
可溶性重組人類PH20(rHuPH20)促進免疫球蛋白(IG)之皮下投藥及生物可用率
與靜脈內(IV)投藥相比，免疫球蛋白(IG)之皮下(SQ)投藥引起生物可用率降低。一項研究報導與IV投藥相比之63%生物可用率，從而需要使用IV劑量之137%之SQ劑量來達成相等生物可用率(亦即，時間-濃 度曲線下之面積(AUC))(Ochs等人(2006)J Clin.Immunol.,26：265-273)。因此，進行實驗來測定在可溶性重組人類PH20(rHuPH20)存在下皮下投予IG(GAMMAGARD LIQUID(GGL)，Baxter Biosciences)是否會增加SQ投藥後IG之生物可用率，從而排除增加劑量之必要。實驗研究經設計以評定1)經由皮下(SQ)途徑個體在單個部位耐受GGL之每月劑量之能力；2)在僅僅輕度局部不良藥物反應之情況下耐受每月GGL劑量所需之每公克GGL rHuPH20劑量；3)SC投藥所需之時間；及4)比較藉由GGL之曲線下面積(AUC)所量測之IV生物可用率與SQ生物可用率。
簡而言之，11個免疫缺乏症成人患者參與研究中，其接受穩定靜脈內γ球蛋白(IVIG)劑量。所有患者保持與其在研究前所接受之劑量相同之每月IVIG劑量。關於皮下投藥，每四週以IV方式接受至多每公斤體重600mg GGL之患者在單個部位以4週IV劑量之¼之劑量(亦即1週劑量)開始接受SQ輸注以測定耐受1週劑量所需之rHuPH20劑量。隨後，降低rHuPH20劑量且患者接受2週GGL劑量、3週GGL劑量且最終完全4週GGL劑量以測定耐受每月一次GGL之SQ輸注所需之最少rHuPH20。
使用每公克GGL 150U rHuPH20進行初始輸注。在輸注GGL之前，經由24號SQ針以1ml/min.-2ml/min.之速率投予濃度為150U/ml或1500U/ml之rHuPH20。若使用1500U/ml rHuPH20，則其如下稀釋：a)若所需濃縮rHuPH20溶液(1500U/ml)之體積為1.5ml或1.5ml以下，則使用注射用生理鹽水以1：10將其稀釋；b)若所需濃縮rHuPH20(1500U/ml)之體積高於1.5ml但低於15ml，則用注射用生理鹽水將其稀釋至151；c)若所需濃縮rHuPH20溶液(1500U/ml)之體積為15ml或15ml以上，則其以未稀釋形 式使用。
在輸注rHuPH20後(且在5分鐘內)立即經由相同24號SQ針自4週劑量之¼之劑量(亦即1週劑量)開始輸注GGL以測定在單個部位給予4週劑量之四分之一所需的rHuPH20量。若耐受輸注，則評定每一患者以供測定；若存在中度或重度局部反應，則認為不耐受輸注，從而需要不只一處投藥部位或不能在不到3小時內完成輸注。若耐受每週GGL劑量，則使用100U/g GGL之rHuPH20來投予一半劑量(2週劑量)且rHuPH20之劑量進一步降低至66U/g GGL，接著50U/g GGL。重複以每公克GGL計之rHuPH20劑量，其中增加GGL量直至在單個部位耐受完全4週GGL劑量。若在任一點處不耐受rHuPH20量，則接著以下一時間間隔重複每週GGL劑量且增加rHuPH20量直至耐受該劑量。若個體不能耐受rHuPH20劑量2次連續增加之劑量(亦即以GGL之各別劑量3次嘗試)，則接著將先前耐受劑量判定為最大耐受劑量。
僅評估前4名患者之可耐受性；最後7名患者經IV輸注，繼而進行藥物動力學(PK)研究以比較IV輸注與後繼SQ輸注。關於SQ輸注，在達成GGL之每月劑量投藥後，重複相同每月劑量且進行PK研究以評估T1/2、Tmax及AUC。若AUC(SQ)不在AUC(IV)之90%範圍內，則在下一次輸注時將rHuPH20劑量增加4倍且重複PK評定。
11名患者中有10名患者在單個SQ部位以120毫升/小時至300毫升/小時之速率達成25.5公克至61.2公克GGL(255ml至612ml)之每月劑量。第11名患者在1週輸注引發局部不適後退出。對於第一名患者(39001)而言，藉由重力進行初始輸注。然而，儘管rHuPH20劑量自150U/g GGL增加 至300U/g GGL，但速率為不可接受的。因此，所有後繼輸注皆使用IV蠕動泵來進行。剩餘9名患者在不需要重複劑量或增加rHuPH20濃度之情況下達成GGL每月劑量。因此，嘗試降低rHuPH20劑量之所有9名患者完成本研究且能夠耐受使用50U/g GGL之輸注。為測定50U/g GGL是否為可投予之最少rHuPH20，對兩名患者嘗試25U/g GGL之劑量而未成功：一者具有不適且另一者之可耐受性降低且需要在兩個部位投藥。因此，允許GGL之每月劑量投藥(SQ)的rHuPH20之最小量為50U/g GGL。結果概述於下表3中。結果展示除前兩名患者以外所有患者以至多300ml/hr之速率經輸注1.64h(270ml)至3.55h(537ml)之輸注時間。主要藉由所用之泵類型來限制投藥速率。IV泵常常在快速輸注速率下發出警報。一者減慢輸注且一者歸因於輕度輸注部位疼痛而中斷輸注。兩者輸注恢復且完成。
1. 可耐受性評定
對個體評定其對SQ輸注之可耐受性。大部分輸注僅與輕度輸注相關反 應有關(表4)。最常見之輕度反應為輸注部位紅斑、疼痛、腫脹、發熱及搔癢。中度輸注部位反應包括三個疼痛病例及各一搔癢、腫脹及發熱病例。未報導重度反應。在10次輸注中在輸注rHuPH20期間，存在短暫高熱之不適，1名患者5次輸注出現該等不適。
認為可能或也許與輸注有關之全身性不良事件列於表5中。三者為中度的且無一者為重度的。僅輕度胸痛事件與中斷輸注有關，但仍完成輸注且對後繼輸注良好耐受。表6描述完成皮下輸注而未因不良反應中斷之比例。
1名患者出現一種重度不良事件(過敏性反應)，其與研究治療無關。該患者具有對抗生素之既往過敏反應病史，其在輸注GGL/rHuPH20後第二天接受抗生素，且隨後出現過敏性反應。此患者完全恢復且能夠成功完成研究。
在此PID患者試驗期間，不存在所記錄之細菌感染。存在9個所報導 之病毒感染病例，皆不認為與研究治療有關：2個病毒性胃腸炎病例、1個疱疹性角膜炎病例、2個鼻竇炎病例、1個結膜炎病例及3個類流行性感冒疾病病例(出現於1名患者)。
2. 藥物動力學評定
對血清IgG含量進行藥物動力學(PK)分析。參與此研究之PK評定階段之7名患者在單個部位使用每公克GGL 50U rHuPH20達成27公克GGL至61公克GGL之每月劑量(參見表3)。在接受GGL之第二每月劑量輸注後進行PK研究。收集輸注前、輸注後第1小時及輸注後第1、2、3、4、5、7、14、21及28天(若以28天時程)之血清樣品。7名患者之藥物動力學參數描述於表7中。7名患者之AUC(SQ)與AUC(IV)之比率展示於表8中。結果展示7名患者中之5名患者具有處於AUC(IV)之90%範圍內的AUC(SQ)。使比率小於90%之2名個體之rHuPH20劑量增加4倍並未進一步改良生物可用率。
3. 結果概述
在此研究中，在輸注GGL之前藉由注射使用rHuPH20使得在單個皮下部位以至多每小時300ml之輸注速率輸注多達600ml GGL成為可能。主要藉由所用之IV泵來限制速率，該等IV泵經設計以當IV滲透及壓力增加時發出警報且關閉。儘管泵直至速率接近300ml/h時才出現關閉，但重新啟動泵之需要增加輸注時間。由於對於皮下投藥而言，不存在對壓力警報之需要，因此藉由更換成能夠在不發出警報之情況下產生更高壓力之泵來消除關閉問題。
儘管大部分輸注與一些腫脹、發紅或偶而疼痛或發癢有關，但除少數以外皆為輕度的。6個中有兩個在輸注中出現中度反應，其中降低rHuPH20以試圖找到最小有效劑量；11名個體中有10名個體耐受50U/g GGL之rHuPH20劑量。先前未經受皮下輸注之一名個體在下腹部部位出現第一一週劑量引起之不適後退出。儘管出現輕度反應，但所有其他輸注皆完成，其中97%之輸注在無中斷之情況下完成。大部分反應用冷卻包處理且僅少數 反應需要乙醯胺苯酚或苯海拉明。
在與rHuPH20組合皮下投予後，平均GGL生物可用率為IV投藥後GGL生物可用率之92%。此研究暗示由rHuPH20所提供之擴散增加改良GGL之吸收。此外，在此研究中由每月皮下給予GGL所達成之最低含量與由IV投藥所達成之最低含量相同。因此，相對於IV給藥，不需要增加皮下給予GGL之投藥頻率；皮下投予與rHuPH20組合之GGL僅需要單個SQ部位且可以至多300ml/h之輸注速率達成。
總之，rHuPH20有助於在成人免疫缺乏個體之群體中以至多300ml/h之速率在單個部位投予完全每月GGL劑量。基於IgG濃度隨時間變化曲線之AUC，該組合之生物可用率為IV生物可用率之92%。此結果暗示rHuPH20改良皮下投予之GGL之吸收。大部分局部副作用為輕度的且不導致輸注減慢或中斷。
實施例2
可溶性rHuPH20表現細胞系之產生
使用HZ24質體(SEQ ID NO：52中所闡明)轉染中國倉鼠卵巢(CHO細胞)(參見例如申請案第10,795,095號、第11/065,716號及第11/238,171號)。用於表現可溶性rHuPH20之HZ24質體載體含有pCI載體骨架(Promega)、編碼人類PH20玻尿酸酶(SEQ ID NO：49)之1-482位胺基酸之DNA、來自ECMV病毒(Clontech)之內部核糖體進入位點(IRES)及小鼠二氫葉酸還原酶(DHFR)基因。pCI載體骨架亦包括編碼β-內醯胺酶耐藥基因(AmpR)之DNA、f1複製起點、細胞巨大病毒即刻早期增強子/啟動子區(CMV)、嵌合內含子及SV40晚期聚腺苷酸化信號(SV40)。編 碼可溶性rHuPH20構築體之DNA含有在編碼人類PH20之天然35個胺基酸信號序列之1位胺基酸位置上的甲硫胺酸的DNA之前的NheI位點及Kozak一致序列，及在編碼對應於人類PH20玻尿酸酶(SEQ ID NO：1中所闡明)之482位胺基酸位置之酪胺酸的DNA之後的終止密碼子，繼之以BamHI限制性位點。構築體pCI-PH20-IRES-DHFR-SV40pa(HZ24)因此在CMV啟動子驅動下產生單一mRNA物質，其編碼由內部核糖體進入位點(IRES)所分離之人類PH20(SEQ ID NO：3中所闡明)之1-482位胺基酸及小鼠二氫葉酸還原酶(SEQ ID NO：53中所闡明)之1-186位胺基酸。
未轉染之DG44 CHO細胞在補充有4mM麩胺醯胺及18ml/L Plurionic F68/L(Gibco)之用於DHER(-)細胞之GIBCO改良CD-CHO培養基中生長，且以0.5×106個細胞/毫升接種於震盪燒瓶中以為轉染作準備。在加濕培育箱中使細胞在37℃下於5% CO2中生長，同時以120rpm震盪。在轉染前測試指數生長之未轉染DG44 CHO細胞之活力。
使未轉染之DG44 CHO細胞培養物之6千萬個活細胞粒化且以0.7mL之2×轉染緩衝液(2×HeBS：40mM Hepes(pH=7.0)、274mM NaCl、10mM KCl、1.4mM Na2HPO4、12mM右旋糖)中2×107個細胞之密度再懸浮。向再懸浮細胞之每一等分試樣中添加0.09mL(250μg)線狀HZ24質體(藉由使用Cla I(New England Biolabs)消化隔夜而經直線化)，且在室溫下將細胞/DNA溶液轉移至0.4cm間隙之BTX(Gentronics)電穿孔管中。在未將質體DNA與細胞混合之情況下進行陰性對照電穿孔。在330V及960μF或350V及960μF之電容器放電下對細胞/質體混合物進行電穿孔。
電穿孔後自電穿孔管移除細胞且轉移至5mL補充有4mM麩胺醯胺及 18ml/L Plurionic F68/L(Gibco)之用於DHFR(-)細胞之改良CD-CHO培養基中且在加濕培育箱中使其在未經選擇之情況下在6孔組織培養板之孔中於37℃下5% CO2中生長2天。
電穿孔後第2天，自各孔移除0.5mL組織培養基且使用實施例3中所述之微濁度檢定來測試玻尿酸酶活性之存在。
自組織培養孔收集來自轉染2(350V)之細胞，計數且稀釋至每毫升1×104至2×104個活細胞。將細胞懸浮液之0.1mL等分試樣轉移至5個96孔圓底組織培養板之各孔中。向容納細胞之孔中添加100微升含有4mM GlutaMAXTM-1補充劑(GIBCOTM,Invitrogen公司)且不含次黃嘌呤及胸苷補充劑之CD-CHO培養基(GIBCO)(最終體積為0.2mL)。
自在無甲胺喋呤之情況下生長之5塊板識別出10個純系。
使6個HZ24純系在培養物中繁殖且以單細胞懸浮液形式轉移至震盪燒瓶中。使用二維無限稀釋策略將純系3D3、3E5、2G8、2D9、1E11及4D10鋪於96孔圓底組織培養板中，在該策略中自上部左手邊孔中之5000個細胞開始沿板向下以1：2稀釋細胞且沿板橫向以1：3稀釋細胞。所稀釋之純系在每孔500個未轉染之DG44 CHO細胞之背景中生長以提供培養初始數日所需之生長因子。每個次純系使用10塊板，5塊板含有50nM甲胺喋呤且5塊板不含甲胺喋呤。
純系3D3產生24個可見次純系(13個次純系來自未經甲胺喋呤處理之板且11個次純系來自經50nM甲胺喋呤處理之板)。在來自24個次純系中之8者之上清液中量測到顯著玻尿酸酶活性(>50單位/毫升)，且使此8個次純系繁殖至T-25組織培養燒瓶中。在50nM甲胺喋呤存在下，使自甲胺喋呤處理方案分離之純系繁殖。在震盪燒瓶中，使純系3D35M在500nM甲胺喋呤中進一步繁殖，得到產生超過1,000單位/毫升之純系(純系3D35M；或Gen1 3D35M)。接著製備3D35M細胞之母細胞庫(master cell bank，MCB)。
實施例3
測定可溶性rHuPH20之玻尿酸酶活性
使用濁度檢定來測定諸如細胞培養物、純化部分及純化溶液之樣品中之可溶性rHuPH20的玻尿酸酶活性，該濁度檢定係基於當玻尿酸與血清白蛋白結合時形成不溶性沈澱。藉由將可溶性rHuPH20與玻尿酸鈉(玻尿酸)培育固定時段(10分鐘)且接著添加酸化之血清白蛋白使未消化之玻尿酸鈉沈澱來量測活性。30分鐘發生時段後，在640nm下量測所得樣品之濁度。 由酶對玻尿酸鈉受質之活性所引起之濁度降低為可溶性rHuPH20玻尿酸酶活性之量度。使用由稀釋可溶性rHuPH20檢定工作參照標準所產生之校正曲線來進行該方法，且相對於此校正曲線進行樣品活性量測。
在酶稀釋劑溶液中製備樣品之稀釋液。酶稀釋劑溶液係藉由將33.0mg±0.05mg水解明膠溶解於25.0mL之50mM PIPES反應緩衝液(140mM NaCl、50mM PIPES，pH=5.5)及25.0mL SWFI中且將0.2mL之25% Buminate溶液稀釋至混合物中且渦旋30秒來製備。在使用2小時內進行此製備且冰上儲存直至需要。將樣品稀釋至估計1-2U/mL。一般而言，每步驟最大稀釋度不超過1：100且用於第一稀釋之初始樣品體積不小於20μL。進行該檢定所需之最小樣品體積為：處理中樣品、FPLC溶離份：80μL；組織培養上清液：1mL；濃縮物質：80μL；純化或最終步驟物質：80μL。將稀釋液在低蛋白結合96孔板中製成三份，且將30μL每一稀釋液轉移至Optilux黑色/透明底板(BD BioSciences)中。
在酶稀釋劑溶液中製備濃度為2.5U/mL之已知可溶性rHuPH20之稀釋液以產生標準曲線且分三份添加至Optilux板中。稀釋液包括0U/mL、0.25U/mL、0.5U/mL、1.0U/mL、1.5U/mL、2.0U/mL及2.5U/mL。在板中包括容納60μL酶稀釋劑溶液之「試劑空白」孔作為陰性對照。接著蓋上板且在37℃下在加熱塊(heat block)上加熱5分鐘。移除蓋子且將板震盪10秒。震盪後，將板放回至加熱塊上且用溫熱之0.25mg/mL玻尿酸鈉溶液(藉由將100mg玻尿酸鈉(LifeCore Biomedical)溶解於20.0mL SWFI來製備)填充MULTIDROP 384液體操作裝置。藉由在2℃-8℃下輕輕旋轉及/或搖動2-4小時或直至完全溶解來使其混合。將反應板轉移至MULTIDROP 384且藉由 按下開始鍵開始反應以將30μL玻尿酸鈉分配至各孔。接著自MULTIDROP 384移除該板且震盪10秒，之後在放回板蓋之情況下轉移至加熱塊上。在37℃下將該板培育10分鐘。
藉由用血清工作溶液預充MULTIDROP 384且將體積設置變化至240μL來使該機器準備停止反應(於75mL之500mM乙酸鹽緩衝溶液中之25mL血清儲備溶液[用9體積500mM乙酸鹽緩衝溶液稀釋1體積馬血清(Sigma)且用鹽酸將pH調節至3.1])。自加熱塊移除板且置放於MULTIDROP 384上且將240μL血清工作溶液分配至孔中。移除該板且在板讀取器上震盪10秒。另外15分鐘後，在640nm處量測樣品濁度且藉由擬合於標準曲線來測定各樣品之玻尿酸酶活性(以U/mL計)。
藉由用玻尿酸酶活性(U/ml)除以蛋白質濃度(mg/mL)來計算比活性(單位/毫克)。
實施例4
Gen1人類sPH20之製備及純化
A. 5L生物反應器製程
使一瓶3D35M融化且自震盪燒瓶經由1L旋轉式燒瓶在補充有100nM甲胺喋呤及GlutaMAXTM-1(Invitrogen)之CD-CHO培養基(Invitrogen,Carlsbad Calif.)中繁殖。以每毫升4×105個活細胞之接種密度將細胞自旋轉式燒瓶轉移至5L生物反應器(Braun)。參數為37℃之溫度設定點、7.2之pH(開始設定點)、25%之溶氧設定點及0cc/min-100cc/min之空氣覆蓋。第168小時，添加250ml 1號補料培養基(具有50g/L葡萄糖之CD CHO)。第216小時，添加250ml 2號補料培養基(具有50g/L葡萄糖及10mM丁酸鈉之CD CHO)，且第264小時，添加250ml 2號補料培養基。此製程以6×106個細胞/毫升之最大細胞密度產生每毫升1600單位之最終生產率。在最終製備階段，添加丁酸鈉顯著增強可溶性rHuPH20之產生。
藉由深層過濾及向10mM Hepes(pH為7.0)中之切向流透濾作用以使來自3D35M純系之條件培養基淨化。可溶性rHuPH20接著藉由Q瓊脂糖(Pharmacia)離子交換、苯基瓊脂糖(Pharmacia)疏水性相互作用層析、苯基酉朋酸酯(Prometics)及羥基磷灰石層析(Biorad,Richmond,CA)之連續層析來純化。
可溶性rHuPH20與Q瓊脂糖結合且以於相同緩衝液中之400mM NaCl溶離。用2M硫酸銨將溶離液稀釋至500mM硫酸銨之最終濃度且通過苯基瓊脂糖(low sub)管柱，繼而在相同條件下與苯基酉朋酸酯樹脂結合。在無硫酸銨之情況下，在pH9.0下於50mM N-二甘胺酸(bicine)中洗滌後，在Hepes(pH=6.9)中自苯基瓊脂糖溶離可溶性rHuPH20。將溶離液負載於5mM磷酸鉀及1mM CaCl2中之陶瓷羥基磷灰石樹脂(pH=6.9)上且用具有0.1mM CaCl2之80mM磷酸鉀(pH=7.4)溶離。
使用USP參照標準經由微濁度檢定(實施例16)，所得經純化之可溶性rHuPH20具有超過每毫克蛋白質65,000 USP單位之比活性。經純化之sPH20自Pharmacia 5RPC苯乙烯二乙烯苯管柱自第24分鐘至第26分鐘在單個峰下溶離，梯度處於0.1% TFA/H2O與0.1% TFA/90%乙腈/10% H20之間且藉由SDS電泳解析為單個寬61kDa條帶，用PNGASE-F處理後，其縮減為清晰51kDa條帶。N末端胺基酸定序揭示已有效移除前導肽。
B. 上游細胞培養物至100L生物反應器細胞培養物中之繁殖 (expansion)製程
使用按比例放大製程來自4瓶不同3D35M細胞分別純化可溶性rHuPH20以產生4個分開批次之sHuPH20：HUA0406C、HUA0410C、HUA0415C及HUA0420C。經由125L生物反應器使各瓶細胞分別繁殖且培養，接著使用管柱層析純化。在整個製程期間獲得樣品以評定如酶產率之該等參數。下文所提供之製程描述闡明如生物反應器開始及補料培養基體積、轉移細胞密度及洗滌及溶離體積之該等情況之代表性說明。各批次之確切數字略有不同，且詳細描述於表11至18中。
在37℃水浴槽中將4瓶3D35M細胞融化，添加含有100nM甲胺喋呤及40mL/L GlutaMAX之CD CHO且將細胞離心。在125mL震盪燒瓶中用20mL新鮮培養基使細胞再懸浮且置放於37℃ 7% CO2培育箱中。在125mL震盪燒瓶中使細胞繁殖至40mL。當細胞密度達到1.5-2.5×106個細胞/毫升時，使培養物以100mL培養體積繁殖至125mL旋轉式燒瓶中。將燒瓶在37℃、7%CO2下培育。當細胞密度達到1.5-2.5×106個細胞/毫升時，使培養物以200mL培養體積繁殖至250mL旋轉式燒瓶中，且將燒瓶在37℃、7% CO2下培育。當細胞密度達到1.5-2.5×106個細胞/毫升時，使培養物以800mL培養體積繁殖至1L旋轉式燒瓶中，且培育於37℃、7%CO2下。當細胞密度達到1.5-2.5×106個細胞/毫升時，使培養物以5L培養體積繁殖至6L旋轉式燒瓶中，且培育於37℃、7%CO2下。當細胞密度達到1.5-2.5×106個細胞/毫升時，使培養物以20L培養體積繁殖至36L旋轉式燒瓶中，且培育於37℃、7%CO2下。
在121℃、20PSI下用蒸汽對125L反應器進行滅菌且添加65L CD CHO 培養基。使用前，針對污染檢查反應器。當36L旋轉式燒瓶中之細胞密度達到1.8-2.5×106個細胞/毫升時，將細胞培養物自36L旋轉式燒瓶轉移至125L生物反應器(Braun)中，得到85L之最終體積及約4×105個細胞/毫升之接種密度。參數為溫度設定點：37℃；pH：7.2；溶氧：25%±10%；轉子速度：50rpm；容器壓力：3psi；空氣噴射：1L/min.；空氣覆蓋：1L/min。每日對反應器採樣以用於細胞計數、pH核對、培養基分析、蛋白質製備及留存。在進行期間添加營養補料。第6天，添加3.4L 1號補料培養基(CD CHO+50g/L葡萄糖+40mL/L GlutaMAXTM-1)，且將培養溫度變為36.5℃。第9天，添加3.5L 2號補料(CD CHO+50g/L葡萄糖+40mL/LGlutaMAXTM-1+1.1g/L丁酸鈉)且將培養溫度變為36℃。第11天，添加3.7L 3號補料(CD CHO+50g/L葡萄糖+40mL/L GlutaMAXTM-1+1.1g/L丁酸鈉)且將培養溫度變為35.5℃。第14天或當細胞活力降低於50%時，收集反應器。該製程以8百萬個細胞/毫升之最大細胞密度產生酶活性為1600單位/毫升之可溶性rHuPH20。收集時，對培養物採樣以檢驗試管內及活體內支原體、生物負荷、內毒素及病毒、病毒粒子之透射電子顯微(TEM)及酶活性。
將100公升生物反應器細胞培養收集物經由一系列具有聚醚碸介質之膠囊式過濾器(Sartorius)過濾：首先經由8.0μm深度之膠囊、0.65μm深度之膠囊、0.22μm膠囊且最終經由0.22μm Sartopore 2000cm2過濾器過濾，且進入100L無菌儲存袋中。使用具有螺旋聚醚碸30kDa MWCO過濾器(Millipore)之兩個TFF將培養物濃縮成10×，繼而與10mM HEPES、25mM Na2SO4(pH=7.0)進行6×緩衝液交換，經0.22μm最終過濾器過濾至20L無 菌儲存袋中。表11提供與細胞培養、收集、濃縮及緩衝液交換步驟有關之監測資料。
製備Q瓊脂糖(Pharmacia)離子交換管柱(3L樹脂，高度=20cm，直徑=14cm)。收集沖洗樣品以測定pH、傳導性及內毒素(LAL)檢定。管柱係用5倍管柱體積之10mM Tris、20mM Na2SO4(pH=7.5)來平衡。以100cm/hr之流速將經濃縮之經透濾之收集物負載於Q管柱上。用5倍管柱體積之10mM Tris、20mM Na2SO4(pH=7.5)及10mM Hepes、50mM NaCl(pH=7.0)來洗滌管柱。用10mM Hepes、400mM NaCl(pH=7.0)來溶離蛋白質且經 由0.22μm最終過濾器過濾至無菌袋中。
接著進行苯基瓊脂糖(Pharmacia)疏水性相互作用層析。製備苯基瓊脂糖(PS)管柱(9.1L樹脂，高度=29cm，直徑=20cm)。用5倍管柱體積之5mM磷酸鉀、0.5M硫酸銨、0.1mM CaCl2(pH=7.0)來平衡管柱。向來自上文之蛋白質溶離液中補充2M硫酸銨、1M磷酸鉀及1M CaCl2儲備溶液直至分別得到5mM硫酸銨、0.5M磷酸鉀及0.1mM CaCl2之最終濃度。以100 cm/hr之流速將蛋白質負載於PS管柱上。以100 cm/hr添加5mM磷酸鉀、0.5M硫酸銨及0.1mM CaCl2(pH=7.0)。經由0.22μm最終過濾器通過而流入無菌袋中。
將經PS純化之蛋白質負載於胺基苯基酉朋酸酯管柱(ProMedics)(6.3L樹脂，高度=20cm，直徑=20cm)上，該管柱已用5倍管柱體積之5mM磷酸鉀、0.5M硫酸銨來平衡。蛋白質以100cm/hr之流速通過管柱，且用5mM磷酸鉀、0.5M硫酸銨(pH=7.0)來洗滌管柱。接著用20mM N-二甘胺酸、100mM NaCl(pH=9.0)來洗滌管柱且用50mM Hepes、100mM NaCl(pH=6.9)來溶離蛋白質，經由無菌過濾器且進入20L無菌袋中。測試溶離液之生物負荷、蛋白質濃度及酶活性。
用5mM磷酸鉀、100mM NaCl、0.1mM CaCl2(pH=7.0)來平衡羥基磷灰石(HAP)管柱(BioRad)(1.6L樹脂，高度=10cm，直徑=14cm)。收集沖洗樣品且測試pH、傳導性及內毒素(LAL檢定)。向經胺基苯基酉朋酸酯純化之蛋白質中補充磷酸鉀及CaCl2以得到5mM磷酸鉀及0.1mM CaCl2之最終濃度，且以100cm/hr之流速負載於HAP管柱上。用5mM磷酸鉀(pH=7.0)、100mM NaCl、0.1mM CaCl2，接著10mM磷酸鉀(pH=7.0)、100 mM NaCl、0.1mM CaCl2來洗滌管柱。用70mM磷酸鉀(pH=7.0)溶離蛋白質且經由0.22μm過濾器過濾至5L無菌儲存袋中。測試溶離液之生物負荷、蛋白質濃度及酶活性。
接著經由壓力槽抽汲經HAP純化之蛋白質而經過20nM病毒移除過濾器。將蛋白質添加至DV20壓力槽及過濾器(Pall公司)中，通過具有20nm微孔之Ultipor DV20過濾器(Pall公司)而進入無菌20L儲存袋中。測試濾液之蛋白質濃度、酶活性、寡醣、單醣及唾液酸分布及製程相關雜質。接著使用10kD分子量截斷(MWCO)Sartocon Slice切向流過濾(TFF)系統(Sartorius)將濾液中之蛋白質濃縮至1mg/mL。首先藉由用Hepes/鹽水溶液(10mM Hepes，130mM NaCl，pH=7.0)洗滌來使過濾器作準備且對滲透物採樣以檢測pH及傳導性。濃縮後，對經濃縮之蛋白質採樣且測試蛋白質濃度及酶活性。對經濃縮之蛋白質進行6×緩衝液交換而使其處於最終緩衝液(10mM Hepes、130mM NaCl，pH7.0)中。使經濃縮之蛋白質通過0.22μm過濾器而進入20L無菌儲存袋中。對蛋白質採樣且測試蛋白質濃度、酶活性、自由硫氫基、寡醣分布及容積滲透濃度。
表12至18提供每一3D35M細胞批次之與上文所述之純化步驟中之每一者有關之監測資料。
將經純化及濃縮之可溶性rHuPH20蛋白質無菌填充至具有5mL及1mL填充體積之無菌瓶中。使蛋白質通過0.22μm過濾器而到達操作者控制之泵，該泵使用重量讀出器而用於填充該等瓶。用塞子封閉該等小瓶且用捲拉蓋密封。視覺上檢查所封閉之小瓶之外來粒子且接著貼標籤。貼標籤後，藉由在液氮中浸泡不超過1分鐘而使小瓶急驟冷凍且在-15℃(-20℃±5℃)下儲存。
實施例5
含有可溶性人類PH20(rHuPH20)之Gen2細胞的產生
使實施例2中所述之Gen1 3D35M細胞系適應於較高甲胺喋呤含量以產生2代(Gen2)純系。將3D35M細胞自已形成之含甲胺喋呤之培養物接種至含有4mM GlutaMAX-1TM及1.0μM甲胺喋呤之CD CHO培養基中。藉由使細胞在37℃、7% CO2加濕培育箱中經46天之時段生長且續代9次而使細胞適應於較高甲胺喋呤含量。在容納具有2.0μM甲胺喋呤之培養基的96孔組織培養板中藉由限制稀釋而選殖出擴增之細胞群體。約4週後，識別純系且選擇純系3E10B以供繁殖。使3E10B細胞在含有4mM GlutaMAX-1TM及2.0μM甲胺喋呤之CD CHO培養基中生長20代。形成3E10B細胞系之主 細胞庫(MCB)且冷凍且用於後繼研究。
藉由將3E10B細胞培養於含有4mM GlutaMAX-1TM及4.0μM甲胺喋呤之CD CHO培養基中而使細胞系繼續擴增。第12代後，將細胞在小瓶中冷凍以作為研究細胞庫(RCB)。將一小瓶RCB融化且培養於含有8.0μM甲胺喋呤之培養基中。5天後，培養基中之甲胺喋呤濃度增加至16.0μM，接著在18天後增加至20.0μM。在容納含有4mM GlutaMAX-1TM及20.0μM甲胺喋呤之CD CHO培養基之96孔組織培養板中藉由限制稀釋而選殖出處於含有20.0μM甲胺喋呤之培養基中之第8代細胞。5-6週後識別純系且選擇純系2B2以供在含有20.0μM甲胺喋呤之培養基中繁殖。第11代後，將2B2細胞在小瓶中冷凍以作為研究細胞庫(RCB)。
所得2B2細胞為二氫葉酸還原酶缺乏之(dhfr-)DG44 CHO細胞，其表現可溶性重組人類PH20(rHuPH20)。可溶性PH20係以約206個複本/細胞之複本數存在於2B2細胞中。使用rHuPH20特異性探針對Spe I-、Xba I-及BamH I/Hind III-消化之基因組2B2細胞DNA之南方墨點分析揭示下列限制性消化特徵：在用Spe I消化DNA之情況下，1條約7.7kb之較大雜交條帶及4條較小雜交條帶(約13.9kb、約6.6kb、約5.7kb及約4.6kb)；在用Xba I消化DNA之情況下，1條約5.0kb之較大雜交條帶及2條較小雜交條帶(約13.9kb及約6.5kb)；及使用由BamH I/Hind III消化之2B2 DNA，所觀察到之1條約1.4kb之單一雜交條帶。mRNA轉錄物之序列分析指示除1131位置處之一個鹼基對差異以外所衍生之cDNA(SEQ ID NO：56)與參照序列(SEQ ID NO：49)一致，該鹼基對差異經觀察為胸苷(T)代替預期之胞嘧啶(C)。此為沉默突變，而不影響胺基酸序列。
實施例6
A. Gen2可溶性rHuPH20於300L生物反應器細胞培養物中之產生
使一小瓶HZ24-2B2融化且自震盪燒瓶經由36L旋轉式燒瓶於補充有20μM甲胺喋呤及GlutaMAX-1TM(Invitrogen)之CD-CHO培養基(Invitrogen,Carlsbad,CA)中繁殖。簡而言之，在37℃水浴槽中使一小瓶細胞融化，添加培養基且將細胞離心。在125mL震盪燒瓶中用20mL新鮮培養基使細胞再懸浮且置放於37℃、7%培育箱中。使細胞在125mL震盪燒瓶中繁殖至40mL。當細胞密度達到大於1.5×106個細胞/mL時，使培養物以100mL培養體積繁殖至125mL旋轉式燒瓶中。在37℃、7% CO2下培育燒瓶。當細胞密度達到大於1.5×106個細胞/毫升時，使培養物以200mL培養體積繁殖至250mL旋轉式燒瓶中，且在37℃、7% CO2下培育燒瓶。當細胞密度達到大於1.5×106個細胞/毫升時，使培養物以800mL培養體積繁殖至1L旋轉式燒瓶中，且培育於37℃、7% CO2下。當細胞密度到達大於1.5×106個細胞/毫升時，使培養物以5000mL培養體積繁殖至6L旋轉式燒瓶中且培育於37℃、7% CO2下。當細胞密度到達大於1.5×106個細胞/毫升時，使培養物以32L培養體積繁殖至36L旋轉式燒瓶中且培育於37℃、7% CO2下。
對400L反應器進行滅菌且添加230mL CD-CHO培養基。使用前，針對污染檢查反應器。將約30L細胞以每毫升4.0×105個活細胞之接種密度及260L之總體積自36L旋轉式燒瓶轉移至400L生物反應器(Braun)中。參數為溫度設定點：37℃；轉子速度：40RPM-55RPM；容器壓力：3psi；空氣噴射：0.5L/Min.-1.5L/Min.；空氣覆蓋：3L/min.。每日對反應器採樣以用於細胞計數、pH核對、培養基分析、蛋白質製備及留存。同樣，在進行期 間，添加營養補料。第120小時(第5天)，添加10.4L 1號補料培養基(4×CD-CHO+33g/L葡萄糖+160mL/L Glutamax-1TM+83mL/L酵母自溶液(Yeastolate)+33mg/L重組人類胰島素(rHuInsulin))。第168小時(第7天)，添加10.8L 2號補料(2×CD-CHO+33g/L葡萄糖+80mL/L Glutamax-1TM+167mL/L酵母自溶液+0.92g/L丁酸鈉)且將培養溫度變為36.5℃。第216小時(第9天)，添加10.8L 3號補料(1×CD-CHO+50g/L葡萄糖+50mL/L Glutamax-1TM+250mL/L酵母自溶液+1.80g/L丁酸鈉)，且將培養溫度變為36℃。第264小時(第11天)，添加10.8L 4號補料(1×CD-CHO+33g/L葡萄糖+33mL/L Glutamax-1TM+250mL/L酵母自溶液+0.92g/L丁酸鈉)，且將培養溫度變為35.5℃。在最終製備階段，觀察到添加補料培養基顯著增強可溶性rHuPH20之產生。第14天或15天或當細胞活力降低於40%時，收集反應器。該製程以12百萬個細胞/毫升之最大細胞密度得到每毫升17,000單位之最終生產率。收集時，自培養物採樣以檢驗試管內及活體內支原體、生物負荷、內毒素及病毒、透射電子顯微(TEM)及酶活性。
藉由蠕動泵抽汲培養物而通過4個並聯之Millistak過濾系統模組(Millipore)(每一者含有一層屬於4μm-8μm等級之矽藻土及一層屬於1.4μm-1.1μm等級之矽藻土，繼之以纖維素膜)接著通過含有一層屬於0.4μm-0.11μm等級之矽藻土及一層屬於<0.1μm等級之矽藻土，繼之以纖維素膜之第二單個Millistak過濾系統(Millipore)，且接著通過0.22μm最終過濾器而進入具有350L容量之無菌一次性可撓性袋中。用10mM EDTA及10 mM Tris補充所收集之細胞培養物直至pH為7.5。用使用4個Sartoslice TEF 30kDa分子量截斷(MWCO)聚醚碸(PES)過濾器(Sartorious)之切 向流過濾(TFF)設備將培養物濃縮成10×，繼而與10mM Tris、20mM Na2SO4(pH=7.5)進行10×緩衝液交換，經由0.22μm最終過濾器而進入50L無菌儲存袋中。
使經濃縮、經透濾之收集物之病毒滅活。在病毒滅活之前，製備10% Triton X-100、3%三(正丁基)磷酸酯(TNBP)之溶液。在經Q管柱純化前立即使經濃縮、經透濾之收集物在36L玻璃反應容器中暴露於1% Triton X-100、0.3% TNBP，歷時1小時。
B. Gen2可溶性rHuPH20之純化
製備Q瓊脂糖(Pharmacia)離子交換管柱(9L樹脂，H=29cm，D=20cm)。收集沖洗樣品以測定pH、傳導性及內毒素(LAL)檢定。管柱用5倍管柱體積之10mM Tris、20mM Na2SO4(pH=7.5)來平衡。病毒滅活後，以100cm/hr之流速將經濃縮透濾之收集物負載於Q管柱上。用5倍管柱容積之10mM Tris、20mM Na2SO4(pH=7.5)及10mM Hepes、50mM NaCl(pH=7.0)洗滌管柱。用10mM Hepes、400mM NaCl(pH=7.0)溶離蛋白質，經由0.22μm最終過濾器而進入無菌袋中。測試溶離液樣品之生物負荷、蛋白質濃度及玻尿酸酶活性。在交換開始及結束時獲得A280吸光度讀數。
接著進行苯基瓊脂糖(Pharmacia)疏水性相互作用層析。製備苯基瓊脂糖(PS)管柱(19L-21L樹脂，H=29cm，D=30cm)。收集沖洗液且採樣以檢驗pH、傳導性及內毒素(LAL檢定)。用5倍管柱體積之5mM磷酸鉀、0.5M硫酸銨、0.1mM CaCl2(pH=7.0)來平衡管柱。向來自Q瓊脂糖管柱之蛋白質溶離液中補充2M硫酸銨、1M磷酸鉀及1M CaCl2儲備溶液以分別得到5mM硫酸銨、0.5M磷酸鉀及0.1mM CaCl2之最終濃度。以100cm/hr 之流速將蛋白質負載於PS管柱上且收集經過管柱之流。以100cm/hr用5mM磷酸鉀、0.5M硫酸銨及0.1mM CaCl2(pH=7.0)洗滌管柱且將洗滌液添加至所收集之經過流中。將經過流與管柱洗滌液組合，通過0.22μm最終過濾器而進入無菌袋中。對經過流採樣以檢驗生物負荷、蛋白質濃度及酶活性。
製備胺基苯基酉朋酸酯(Promtics)管柱。收集洗滌液且採樣以檢驗pH、傳導性及內毒素(LAL檢定)。用5倍管柱體積之5mM磷酸鉀、0.5M硫酸銨平衡管柱。將含有經純化之蛋白質之PS經過流以100cm/hr之流速負載於胺基苯基酉朋酸酯管柱上。用5mM磷酸鉀、0.5M硫酸銨(pH=7.0)洗滌管柱。用20mM N-二甘胺酸、0.5M硫酸銨(pH=9.0)洗滌管柱。用20mM N-二甘胺酸、100mM氯化鈉(pH=9.0)洗滌管柱。用50mM Hepes、100mM NaCl(pH=6.9)溶離蛋白質且通過無菌過濾器而進入無菌袋中。測試所溶離樣品之生物負荷、蛋白質濃度及酶活性。
製備羥基磷灰石(HAP)管柱(Biorad)。收集洗滌液且測試pH、傳導性及內毒素(LAL檢定)。用5mM磷酸鉀、100mM NaCl、0.1mM CaCl2(pH=7.0)平衡管柱。將經胺基苯基酉朋酸酯純化之蛋白質補充至5mM磷酸鉀及0.1mM CaCl2之最終濃度，且以100cm/hr之流速負載於HAP管柱上。用5mM磷酸鉀(pH=7.0)、100mM NaCl、0.1mM CaCl2洗滌管柱。其次用10mM磷酸鉀(pH=7.0)、100mM NaCl、0.1mM CaCl2洗滌管柱。用70mM磷酸鉀(pH=7.0)溶離蛋白質且通過0.22μm無菌過濾器而進入無菌袋中。測試所溶離樣品之生物負荷、蛋白質濃度及酶活性。
接著使經HAP純化之蛋白質通過病毒移除過濾器。首先藉由用2L 70mM磷酸鉀(pH=7.0)洗滌來使經滅菌之Viosart過濾器(Sartorius)作準備。 使用前，對經過濾之緩衝液採樣以檢驗pH及傳導性。經由蠕動泵抽汲經HAP純化之蛋白質而經過20nM病毒移除過濾器。使70mM磷酸鉀(pH=7.0)中之經過濾蛋白質通過0.22μm最終過濾器而進入無菌袋中。測試經病毒過濾之樣品之蛋白質濃度、酶活性、寡醣、單醣及唾液酸分布。亦測試樣品之製程相關雜質。
接著使用10kD分子量截斷(MWCO)Sartocon Slice切向流過濾(TFF)系統(Sartorius)將濾液中之蛋白質濃縮至10mg/mL。首先藉由用10mM組胺酸、130mM NaCl(pH=6.0)洗滌來使過濾器作準備且對滲透物採樣以檢測pH及傳導性。濃縮後，對經濃縮之蛋白質採樣且測試蛋白質濃度及酶活性。對經濃縮之蛋白質進行6×緩衝液交換而使其處於最終緩衝液：10mM組胺酸、130mM NaCl(pH=6.0)中。緩衝液交換後，使經濃縮之蛋白質通過0.22μm過濾器而進入20L無菌儲存袋中。對蛋白質採樣且測試蛋白質濃度、酶活性、自由硫氫基、寡醣分布及容積滲透濃度。
接著將無菌經過濾之主體蛋白質以20mL無菌分配於30mL無菌鐵氟龍小瓶(Nalgene)中。接著使小瓶急驟冷凍且在-20℃±5℃下儲存。
C. Gen1可溶性rHuPH20與Gen2可溶性rHuPH20之製備及純化比較
與Gen1可溶性rHuPH20於100L生物反應器細胞培養物中之製備及純化(實施例4.B中所述)相比，Gen2可溶性rHuPH20於300L生物反應器細胞培養物中之製備及純化的方案含有一些變化。表19闡明該等方法之間的除簡單按比例放大變化以外之例示性差異。
因為修改對於熟習此項技術者而言為顯而易見的，所以本發明意欲僅受隨附之申請專利範圍之範疇所限制。
<110> 巴克斯特保健公司 巴克斯特國際公司 哈羅賽公司 理查 史夫 赫恩斯 雷柏 葛傑瑞 芙羅斯
<120> 供免疫球蛋白及玻尿酸酶之皮下投藥之用的組合及方法
<130> 01 19374-00114/3058TW
<140> 尚未指定
<141> 同此
<150> US 61/069,841
<151> 2008-03-17
<160> 56
<170> 適用Windows 4.0版的FastSEQ
<210> 1
<211> 509
<212> PRT
<213> 智慧人
<220>
<223> 前驅人類PH20
<400> 1
<210> 2
<211> 474
<212> PRT
<213> 智慧人
<220>
<223> 成熟PH20
<400> 2
<210> 3
<211> 482
<212> PRT
<213> 智慧人
<220>
<223> 前驅可溶性rHuPH20
<400> 3
<210> 4
<211> 447
<212> PRT
<213> 智慧人
<220>
<223> 可溶性rHuPH20 1-447
<400> 4
<210> 5
<211> 446
<212> PRT
<213> 智慧人
<220>
<223> 可溶性rHuPH20 1-446
<400> 5
<210> 6
<211> 445
<212> PRT
<213> 智慧人
<220>
<223> 可溶性rHuPH20 1-445
<400> 6
<210> 7
<211> 444
<212> PRT
<213> 智慧人
<220>
<223> 可溶性rHuPH20 1-444
<400> 7
<210> 8
<211> 443
<212> PRT
<213> 智慧人
<220>
<223> 可溶性rHuPH20 1-443
<400> 8
<210> 9
<211> 442
<212> PRT
<213> 智慧人
<220>
<223> 可溶性rHuPH20 1-442
<400> 9
<210> 10
<211> 450
<212> PRT
<213> 歐洲牛(Bos taurus)
<220>
<223> 玻尿酸酶
<400> 10
<210> 11
<211> 553
<212> PRT
<213> 歐洲牛
<220>
<223> PH20
<400> 11
<210> 12
<211> 331
<212> PRT
<213> 黃胡蜂(Vespula vulgaris)
<220>
<223> 玻尿酸酶A
<400> 12
<210> 13
<211> 340
<212> PRT
<213> 黃胡蜂
<220>
<223> 玻尿酸酶B
<400> 13
<210> 14
<211> 382
<212> PRT
<213> 西方蜂(Apis mellifera)
<220>
<223> 玻尿酸酶
<400> 14
<210> 15
<211> 331
<212> PRT
<213> 白麵長黃胡蜂(Dolichovespula maculata)
<220>
<223> 玻尿酸酶
<400> 15
<210> 16
<211> 367
<212> PRT
<213> 馬蜂(Polistes annularis)
<220>
<223> 玻尿酸酶
<400> 16
<210> 17
<211> 462
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<223> 玻尿酸酶
<400> 17
<210> 18
<211> 473
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<223> 玻尿酸酶2
<400> 18
<210> 19
<211> 412
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<223> 玻尿酸酶3
<400> 19
<210> 20
<211> 435
<212> PRT
<213> 豬(Sus scrofa)
<220>
<223> 玻尿酸酶
<400> 20
<210> 21
<211> 419
<212> PRT
<213> 豬
<220>
<223> 玻尿酸酶3
<400> 21
<210> 22
<211> 449
<212> PRT
<213> 褐鼠(Rattus norvegicus)
<220>
<223> 玻尿酸酶1
<400> 22
<210> 23
<211> 473
<212> PRT
<213> 褐鼠
<220>
<223> 玻尿酸酶2
<400> 23
<210> 24
<211> 412
<212> PRT
<213> 褐鼠
<220>
<223> 玻尿酸酶3
<400> 24
<210> 25
<211> 545
<212> PRT
<213> 兔(Oryctolagus cuniculus)
<220>
<223> PH20
<400> 25
<210> 26
<211> 476
<212> PRT
<213> 綿羊(Ovis aries)
<220>
<223> 玻尿酸酶2
<400> 26
<210> 27
<211> 114
<212> PRT
<213> 綿羊
<220>
<223> PH20部分序列
<400> 27
<210> 28
<211> 414
<212> PRT
<213> 紅毛猩猩(Pongo pygmaeus)
<220>
<223> 玻尿酸酶3
<400> 28
<210> 29
<211> 510
<212> PRT
<213> 食蟹猴(Macaca fascicularis)
<220>
<223> PH20
<400> 29
<210> 30
<211> 529
<212> PRT
<213> 豚鼠(Cavia porcellus)
<220>
<223> PH20
<400> 30
<210> 31
<211> 512
<212> PRT
<213> 褐鼠
<220>
<223> PH20
<400> 31
<210> 32
<211> 512
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<223> PH20
<400> 32
<210> 33
<211> 807
<212> PRT
<213> 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
<220>
<223> 玻尿酸酶
<400> 33
<210> 34
<211> 371
<212> PRT
<213> 釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)噬菌體H4489A
<220>
<223> 玻尿酸酶
<400> 34
<210> 35
<211> 1628
<212> PRT
<213> 產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)
<220>
<223> 玻尿酸酶
<400> 35
<210> 36
<211> 435
<212> PRT
<213> 智慧人
<220>
<223> 玻尿酸酶-1[前驅體]
<400> 36
<210> 37
<211> 473
<212> PRT
<213> 智慧人
<220>
<223> 玻尿酸酶-2[前驅體]
<400> 37
<210> 38
<211> 417
<212> PRT
<213> 智慧人
<220>
<223> 玻尿酸酶-3[前驅體]
<400> 38
<210> 39
<211> 481
<212> PRT
<213> 智慧人
<220>
<223> 玻尿酸酶-4
<400> 39
<210> 40
<211> 467
<212> PRT
<213> 智慧人
<220>
<223> sHuPH20前驅體1-467
<400> 40
<210> 41
<211> 477
<212> PRT
<213> 智慧人
<220>
<223> sHuPH20前驅體1-477
<400> 41
<210> 42
<211> 478
<212> PRT
<213> 智慧人
<220>
<223> sHuPH20前驅體1-478
<400> 42
<210> 43
<211> 479
<212> PRT
<213> 智慧人
<220>
<223> sHuPH20前驅體1-479
<400> 43
<210> 44
<211> 480
<212> PRT
<213> 智慧人
<220>
<223> sHuPH20前驅體1-480
<400> 44
<210> 45
<211> 481
<212> PRT
<213> 智慧人
<220>
<223> sHuPH20前驅體1-481
<400> 45
<210> 46
<211> 483
<212> PRT
<213> 智慧人
<220>
<223> sHuPH20前驅體1-483
<400> 46
<210> 47
<211> 432
<212> PRT
<213> 智慧人
<220>
<223> sHuPH20成熟36-467
<400> 47
<210> 48
<211> 448
<212> PRT
<213> 智慧人
<220>
<223> sHuPH20成熟36-483
<400> 48
<210> 49
<211> 1446
<212> DNA
<213> 智慧人
<220>
<223> 編碼可溶性rHuPH20「前驅體」之DNA
<400> 49
<210> 50
<211> 509
<212> PRT
<213> 智慧人
<220>
<223> PH20變異體P48A
<400> 50
<210> 51
<211> 509
<212> PRT
<213> 智慧人
<220>
<223> 前驅PH20變異體L499W
<400> 51
<210> 52
<211> 6630
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HZ24載體
<400> 52
<210> 53
<211> 186
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<223> 二氫葉酸還原酶
<400> 53
<210> 54
<211> 6
<212> PRT
<213> His人工序列
<220>
<223> His標籤
<400> 54
<210> 55
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Flag標籤
<400> 55
<210> 56
<211> 1449
<212> DNA
<213> 智慧人
<220>
<223> Gen2 mRNA序列
<400> 56

Claims (46)

  1. 一種可溶性玻尿酸酶之用途，其係用於調配用於將皮下投藥的單一劑量的免疫球蛋白(IG)之生物可用率增加至通過靜脈內投藥來投藥以治療IG可治療性疾病或病狀的相同單一劑量的IG之生物可用率之至少90%的醫藥品，其中：該生物可用率之增加係在當該玻尿酸酶是在投藥IG前投藥且在和IG相同的位置投藥時實現；該玻尿酸酶係經調配以用於皮下投藥；該玻尿酸酶係與該IG分開調配；且該玻尿酸酶係經調配以用於以以下者的量直接單一劑量投藥：每克(g)IG 10-500單位(U)玻尿酸酶的比例，藉此投藥的IG之單一劑量的量與用於相同的IG可治療性疾病或病狀時每月不超過一次靜脈內投藥的量實質上相同。
  2. 如申請專利範圍第1項的用途，其中該IG之單一劑量係0.5克(g)至70g。
  3. 如申請專利範圍第1項的用途，其中該IG之單一劑量係介於或約介於20至30克(g)、21g至42g、27g至61g或25.5g至61.2g的IG。
  4. 如申請專利範圍第1項的用途，其中該IG係自人類血漿純化。
  5. 如申請專利範圍第4項的用途，其中該自人類血漿純化的IG係藉由醇份化純化。
  6. 如申請專利範圍第5項的用途，其中組合物中的IG係藉由以下者之任一或多者進一步純化：化學修飾、在胃蛋白酶存在或不存在下在pH 4.0 培育、聚乙二醇(PEG)沈澱、離子交換層析、酶促裂解、溶劑清潔劑處理、透濾(diafiltration)或超濾。
  7. 如申請專利範圍第1項的用途，其中該IG含有IgG、IgA與IgM。
  8. 如申請專利範圍第1項的用途，其中該IG含有大於95% IgG。
  9. 如申請專利範圍第8項的用途，其中該IG係單體的。
  10. 如申請專利範圍第1項的用途，其中組合物中的IG進一步含有蛋白穩定賦形劑。
  11. 如申請專利範圍第10項的用途，其中該蛋白穩定賦形劑係選自以下者之一或多者：甘胺酸、麥芽糖、多元醇、人類血清白蛋白、甘露醇、及非離子型清潔劑。
  12. 如申請專利範圍第1項的用途，其中組合物中的IG製劑之pH係或約係4.2至5.4、4.6至5.1或4.8至5.0。
  13. 如申請專利範圍第1項的用途，其中組合物中的IG具有係或約係IG組合物之5%至15% w/v、6%至15% w/v、或8%至12% w/v的蛋白質濃度。
  14. 如申請專利範圍第13項的用途，其中該蛋白質濃度係10% w/v。
  15. 如申請專利範圍第1項的用途，其中調配物中玻尿酸酶之量係介於或約介於1000單位至10,000單位或5000單位至7500單位。
  16. 如申請專利範圍第1項的用途，其中該可溶性玻尿酸酶係PH20。
  17. 如申請專利範圍第1項的用途，其中該可溶性玻尿酸酶係綿羊或牛PH20。
  18. 如申請專利範圍第1項的用途，其中該可溶性玻尿酸酶係選自以下者：具有SEQ ID NOS：4-9之任一者所示的胺基酸之序列、或對SEQ ID NOS： 4-9之任一者展現至少95%序列一致性的胺基酸之序列的多肽。
  19. 如申請專利範圍第18項的用途，其中該PH20具有對SEQ ID NOS：4-9之任一者展現至少98%序列一致性的胺基酸之序列。
  20. 如申請專利範圍第18項的用途，其中包含該可溶性玻尿酸酶的組合物係名為rHuPH20。
  21. 一種用於增進用於治療IG可治療性疾病或病狀的皮下投藥之免疫球蛋白(IG)的生物可用率之組合，其包含：第一組合物，其包含經調配以用於直接皮下單一劑量投藥之IG，投藥之量與對於相同IG可治療性疾病每月不超過一次的靜脈內投藥之量實質上相同；及第二組合物，其包含經調配以用於直接皮下單一劑量投藥之可溶性玻尿酸酶，投藥之量為每克(g)該IG 10-500單位(U)玻尿酸酶之比例，其中該玻尿酸酶係與該IG分開調配以在投藥該IG前投藥且在和該IG相同的位置投藥；且當與該IG組合投藥時，玻尿酸酶的量實現增加的IG之生物可用率至藉由靜脈內投藥來投藥以治療相同IG可治療性疾病或病狀的相同單一劑量的IG之生物可用率的至少90%。
  22. 如申請專利範圍第21項的組合，其中該IG具有係或約係IG組合物之5%至25% w/v、5至15% w/v、6至15% w/v、或8至12% w/v的蛋白質濃度。
  23. 如申請專利範圍第21項的組合，其中該IG係以係0.5克(g)至70g的單一劑量之量調配。
  24. 如申請專利範圍第21項的組合，其中該IG係以介於或約介於20至30克(g)、21g至42g、27g至61g或25.5g至61.2g的IG的單一劑量之量調配。
  25. 如申請專利範圍第21項的組合，其中該IG係自人類血漿純化。
  26. 如申請專利範圍第25項的組合，其中該自人類血漿純化的IG係藉由醇份化純化。
  27. 如申請專利範圍第26項的組合，其中該IG係藉由以下者之任一或多者進一步純化：化學修飾、在胃蛋白酶存在或不存在下在pH 4.0培育、聚乙二醇(PEG)沈澱、離子交換層析、酶促裂解、溶劑清潔劑處理、透濾或超濾。
  28. 如申請專利範圍第21項的組合，其中該IG含有IgG、IgA與IgM。
  29. 如申請專利範圍第21項的組合，其中該IG含有大於95% IgG。
  30. 如申請專利範圍第29項的組合，其中該IG係單體的。
  31. 如申請專利範圍第21項的組合，其中該IG進一步含有蛋白穩定賦形劑。
  32. 如申請專利範圍第31項的組合，其中該蛋白穩定賦形劑係選自以下者之一或多者：甘胺酸、麥芽糖、多元醇、人類血清白蛋白、甘露醇、及非離子型清潔劑。
  33. 如申請專利範圍第21項的組合，其中組合物中的IG製劑之pH係或約係4.2至5.4、4.6至5.1或4.8至5.0。
  34. 如申請專利範圍第21項的組合，其中該IG具有係或約係IG組合物之5至15% w/v、6至15% w/v、或8至12% w/v的蛋白質濃度。
  35. 如申請專利範圍第34項的組合，其中該蛋白質濃度係10% w/v。
  36. 如申請專利範圍第21項的組合，其中該玻尿酸酶係以介於或約介於1000單位至10,000單位或5000單位至7500單位的量調配。
  37. 如申請專利範圍第21項的組合，其中該可溶性玻尿酸酶係PH20。
  38. 如申請專利範圍第21項的組合，其中該可溶性玻尿酸酶係綿羊或牛PH20。
  39. 如申請專利範圍第21項的組合，其中該可溶性玻尿酸酶係選自以下者：具有SEQ ID NOS：4-9之任一者所示的胺基酸之序列或對SEQ ID NOS：4-9之任一者展現至少95%序列一致性的胺基酸之序列的多肽。
  40. 如申請專利範圍第39項的組合，其中該PH20具有對SEQ ID NOS：4-9之任一者展現至少98%序列一致性的胺基酸之序列。
  41. 如申請專利範圍第39項的組合，其中包含該可溶性玻尿酸酶的組合物係名為rHuPH20。
  42. 如申請專利範圍第21項的組合，其中該IG可治療性疾病或病狀係選自免疫缺乏症、血液惡性腫瘤繼發之後天低γ球蛋白血症、川崎氏病(Kawasaki's disease)、慢性發炎性髓鞘脫失多發性神經病(CIDP)、格巴二氏症候群(Guillain-Barre Syndrome)、特發性血小板減少性紫癜、發炎性肌病、蘭伯特-伊頓肌無力症候群(Lambert-Eaton myasthenic syndrome)、多灶性運動神經病、重症肌無力、莫氏-沃特曼症候群(Moersch-Woltmann syndrome)、繼發性低γ球蛋白血症、特異性抗體缺乏、急性播散性腦脊髓炎、ANCA陽性全身壞死性脈管炎、自體免疫溶血性貧血、大水皰性天疱瘡樣病、瘢痕性天疱瘡樣病、伊文氏症候群(Evans syndrome)、母胎/新生 兒同種免疫性血小板減少症(Foeto-maternal/neonatal alloimmune thrombocytopenia，FMAIT/NAIT)、噬血細胞症候群(Haemophagocytic syndrome)、高風險同種異體造血幹細胞移植、IgM副蛋白血症神經病(IgM paraproteinaemic neuropathy)、腎移植、多發性硬化、眼陣攣肌陣攣運動失調、落葉型天疱瘡、尋常天疱瘡、輸血後紫癜、中毒性表皮壞死溶解/史蒂芬強生症候群(Toxic epidermal necrolysis/Steven Johnson syndrome，TEN/SJS)、中毒性休克症候群、阿滋海默氏病(Alzheimer's Disease)、全身性紅斑狼瘡、多發性骨髓瘤、膿毒病、B細胞瘤、創傷、及細菌、病毒或真菌感染。
  43. 如申請專利範圍第42項的組合，其中該IG可治療性疾病或病狀係免疫缺乏症且該免疫缺乏症係選自常見變異性免疫缺乏症(CVID)、先天無γ球蛋白血症、維斯科特-奧爾德裏奇症候群(Wiskott-Aldrich syndrome)、嚴重複合型免疫缺乏症(SCID)、原發性低γ球蛋白血症、具有抗體缺乏之原發性免疫缺乏疾病、X-連結無γ球蛋白血症(XLA)、嬰兒期低γ球蛋白血症、及無抗體之副腫瘤性小腦變性。
  44. 如申請專利範圍第42項的組合，其中該IG可治療性疾病或病狀係血液惡性腫瘤繼發之後天低γ球蛋白血症且該血液惡性腫瘤係選自慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、多發性骨髓瘤(MM)或非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma，NHL)。
  45. 如申請專利範圍第42項的組合，其中該IG可治療性疾病或病狀係發炎性肌病且該發炎性肌病係選自多發性肌炎、皮肌炎或包涵體肌炎。
  46. 如申請專利範圍第42項的組合，其中該IG可治療性疾病或病狀係細菌、病毒或真菌病狀且該細菌、病毒或真菌病狀係選自B型流感嗜血桿 菌(Haemophilus influenzae)、A型及B型綠膿桿菌(Psuedomonas aeruginosa)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、B群鏈球菌(Streptococcus)、1型、3型、4型、6型、7型、8型、9型、12型、14型、18型、19型及23型肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、2型及5型腺病毒、細胞巨大病毒、E-B病毒VCA(Epstein Barr virus VCA)、A型肝炎病毒、B型肝炎病毒、疱疹單純型病毒-1、疱疹單純型病毒-2、A型流行性感冒、麻疹、1型、2型及3型副流行性感冒、脊髓灰質炎、水痘帶狀疱疹病毒(Varicella zoster virus)、麴菌(Apergillus)及白色念珠菌(Candida albicans)。
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