TWI395593B - 可活化的基質降解酵素之活體內暫時性控制 - Google Patents

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Description

可活化的基質降解酵素之活體內暫時性控制 相關申請案
本發明主張2008年3月6日申請之Gilbert Keller及Gregory Frost之標題為「In Vivo Temporal Control of Activatable Matrix-Degrading Enzymes」的美國臨時申請案第61/068,667號，及2008年5月14日申請之Gilbert Keller及Gregory Frost之標題為「In Vivo Temporal Control of Activatable Matrix-Degrading Enzyme」的美國臨時申請案第61/127,725號之優先權。容許時，上述申請案之要點以全文引用的方式併入本文中。
本發明提供用於控制基質降解酵素之活體內作用之持續時間的方法及組合。該等方法及組合容許在向細胞外基質(或「ECM」)投藥之後暫時性活體內活化基質降解酵素。具有受控作用持續時間之基質降解酵素可用於治療特徵在於一或多種ECM組份之沈積或積累增加的ECM介導之疾病或病症。
細胞外基質(extracellular matrix，ECM)對細胞及組織提供重要結構支撐。由ECM組份之過量沈積或積累引起之細胞外基質的缺陷或變化會導致ECM介導之疾病或病狀。此等疾病中包含膠原蛋白(collagen)介導之疾病或病狀，其特徵在於存在豐富的膠原蛋白纖維中隔(fibrous septae)。對於該等疾病或病狀之唯一批准治療方法通常為會具有高度侵襲性之手術。諸如用於治療杜普宜特朗氏症候群(Dupuytren's syndrome)(亦稱為杜普宜特朗氏攣縮(Dupuytren's contracture))之刺穿腱膜切開術(needle aponeurotomy)或用於脂肪團之吸脂術的其他治療亦具有高度侵襲性。
降解膠原蛋白之於中性pH值下具活性的酵素膠原酶(collagenase)已用於治療ECM介導之病狀，諸如脂肪團(參見例如，公開美國申請案第US20070224184號)；杜普宜特朗氏症候群(參見例如，美國專利第USRE39941號；第5589171號；第6086872號)；及帕榮雷氏病(Peyronie’s disease)(參見例如，美國專利6022539)。然而，膠原酶能夠不可逆地裂解I型、II型及III型膠原蛋白。延長之膠原酶活性限制可投予之劑量且亦冒與延長活化相關之副作用的危險。因此，對ECM介導之疾病及病狀的替代性治療存在需要。因此，本文之目的在於提供用於治療ECM介導之疾病及病狀之可活化的基質降解酵素的方法及組合。
本發明提供藉由投予可活化的基質降解酵素(activatable matrix-degrading enzyme，AMDE)及活化劑來治療細胞外基質(ECM)之疾病或病狀的方法。通常投予治療有效量之AMDE。該量與所治療之疾病或病狀有關且可憑經驗確定。所選之AMDE為在活體內投藥位點無活性之AMDE(諸如ECM)。AMDE包括天然存在之基質降解(matrix-degrading，MD)酵素，其物種及對偶基因及其他變異體，諸如經修飾以改變活性(諸如受質特異性)或性質(諸如穩定性)之酵素。AMDE可藉由製程及方法來修飾以具有諸如增加之對裂解特定類型之膠原蛋白的特異性之性質，或具有改變之pH值曲線或對於本文之方法最佳。與活化劑或活化劑組合(不存在於投藥位點處)結合投藥產生當該活化劑耗散或以其他方式自該位點移除時在有限時期內具活性之AMDE。AMDE及活化劑可以同一或分開的組成物形式依次、同時投予，或間歇投予。病狀可經選擇從而使活性之時期得以預先確定。AMDE可需要活性或全部活性之一種以上活化劑。AMDE可以酵素原(zymogen)形式、以全長成熟多肽(諸如單鏈或雙鏈多肽)形式或以前軀多肽形式投予。AMDE可以組成物(諸如溶液或懸浮液)形式提供，或以結晶或凍乾形式提供。例示性AMDE包括(但不限於)組織蛋白酶(cathepsin)、鈣激活中性蛋白酶(calpain)及肝素酶(heparanase)。
通常，AMDE係經表皮下投予。當向其他位點投予(包括局部投予)時，選擇AMDE以使AMDE於pH 5.5下實質上具活性(典型地與於其最大pH值下相比保留活性之至少約10%、11%、12%、13%或15%)。另外，對於該投藥而言，AMDE典型地於中性pH值下無活性(保留活性之小於約10%、11%、12%、13%或15%)。ECM之疾病及病狀包括(例如)膠原蛋白介導之疾病及病狀。該等疾病及病狀包括(但不限於)：脂肪團；杜普宜特朗氏病(Dupuytren's disease)手術黏連、瘢痕瘤、肥厚性瘢痕及凹陷性瘢痕；帕榮雷氏病(Peyronie's disease)；萊德豪斯纖維化(Ledderhose fibrosis)；關節僵硬；包括凍肩；現有瘢痕，包括手術黏連、瘢痕瘤、肥厚性瘢痕及凹陷性瘢痕；硬皮病；淋巴水腫及膠原性結腸炎。表皮下投藥包括(但不限於)皮下投藥、肌肉內投藥、病灶內投藥及皮內投藥。
因此，本發明提供藉由向細胞外基質(ECM)經表皮下投予可活化的基質降解酵素(AMDE)及活化劑來治療ECM之疾病或病狀的方法。AMDE在該活化劑不存在之情況下在該ECM中無活性或部分無活性；該活化劑在向ECM投予時提供該酵素活化條件，藉此AMDE具活性，且在投予該活化劑之前該活化條件通常不存在於ECM中。在一些具體實例中，選擇AMDE為實質上於中性pH值下無活性之酵素。
本發明亦提供藉由投予可活化的基質降解酵素(AMDE)及活化劑來治療細胞外基質(ECM)之疾病或病狀的方法，其中該AMDE於中性pH值下無活性，該活化劑提供該酵素之酸性pH值活化條件以使得AMDE在投予之後具活性，且在投予活化劑之前該活化條件不存在於投藥位點；且AMDE實質上於pH 5.5下具活性。AMDE及活化劑可藉由任何合適之途徑投予，包括(但不限於)皮下、肌肉內、病灶內、皮內、表面(topical)、經皮、靜脈內、經口及經直腸投藥。舉例而言，投藥可為表皮下投藥。
本發明亦提供藉由投予可活化的基質降解酵素(AMDE)及活化劑來治療細胞外基質(ECM)之疾病或病狀的方法，其中該AMDE在該活化劑不存在之情況下在該ECM中無活性以使得該活化劑在投予時提供該酵素活化條件以使AMDE具活性，在投予活化劑之前該活化條件不存在於ECM中，且活化劑係選自金屬離子、溫度及賦形劑或還原劑或氧化劑之離子強度。AMDE及活化劑或活化劑組合可藉由任何合適之途徑投予，包括(但不限於)皮下、肌肉內、病灶內、皮內、表面、經皮、靜脈內、經口及經直腸投藥。舉例而言，投藥可為表皮下投藥。
在一例示性具體實例中，提供藉由向細胞外基質(ECM)投予可活化的基質降解酵素(AMDE)及活化劑來治療ECM之疾病或病狀的方法，其中AMDE在該活化劑不存在之情況下在ECM中無活性以使得活化劑在向ECM投予時提供該酵素活化條件以使AMDE具活性，在投予活化劑之前該活化條件不存在於ECM中；且活化劑係選自金屬離子、溫度及離子強度。AMDE及活化劑可藉由任何合適之途徑投予，包括(但不限於)皮下、肌肉內、病灶內、皮內、表面、經皮、靜脈內、經口及經直腸投藥。舉例而言，投藥可為表皮下投藥。
在其他例示性具體實例中，提供藉由向ECM經表皮下投予治療有效量之可活化的組織蛋白酶L及活化劑來治療膠原蛋白介導之疾病或病狀的方法，其中該可活化的組織蛋白酶L在該活化劑不存在之情況下在該ECM中無活性，活化劑在向ECM投予時提供酵素活化條件以使可活化的組織蛋白酶L具活性，在投予活化劑之前該活化條件不存在於ECM中；且活化條件為酸性pH值。例示性組織蛋白酶L多肽為包括SEQ ID NO:1中所闡明之胺基酸序列者，或其對偶基因，物種或其他變異體，其中該等變異體經修飾以具有改變之性質或活性且典型地與SEQ ID NO:1中之任一者中所闡明之胺基酸序列相比具有至少或具有60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。
一般而言，隨時間，在本文之方法中，活化劑將由局部環境移除或耗散或中和以致AMDE不再具活性。可選擇或製備活化條件及/或活化劑以使AMDE在有限或預定時間內具活性。活化劑可與AMDE在同一組成物中或以分開的組成物形式提供或投予，且其可依次、同時或間歇投予。舉例而言，在投藥之前或投藥之後使AMDE暴露於活化劑，藉此酵素在投藥之後具活性。活化條件包括(但不限於)pH值、離子強度、溫度及金屬離子。活化條件中之一者為pH值，諸如酸性pH值，例如在或約在3至6.5、或3.5至6、或3至5.5、或3至4.5、或4至6、或4至5.5、或4.5至5、或5至6範圍內，諸如3、3.5、4、4.5、5、5.5、6或6.5。pH值可藉由使AMDE與具有所需pH值之緩衝溶液接觸來獲得。緩衝液可包括含有選自2-(N-嗎啉基)乙烷磺酸(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid，MES)、乙酸、檸檬酸、順丁烯二酸鹽、丁二酸鹽，乳酸鹽、甘胺酸鹽、檸檬酸磷酸鹽及組胺酸之酸者。其他例示性活性條件包括(但不限於)金屬離子及溫度。舉例而言，活化條件可為金屬離子，諸如Ca2+ 、Zn2+ 或Mg2+ 。溫度可為低溫或高溫，其中酵素實質上於投藥位點之溫度(典型地為37℃)下無活性。因此，活化條件為溫度且該溫度為或約為20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃或37℃以上，諸如40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、80℃且更高至不活體內損害組織或細胞之任何耐受溫度。
對活性之暫時性控制可例如藉由選擇緩衝液之緩衝能力及/或其離子強度來達成。活性之預定時間可藉由選擇該等條件來實現，其可憑經驗確定或藉由熟習此項技術者已知之任何方法來確定。預定時間可在少於或約一分鐘至數小時之範圍內，諸如約為或為1分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘、5分鐘、6分鐘、7分鐘、8分鐘、9分鐘、10分鐘、20分鐘、30分鐘、40分鐘、50分鐘、1小時、2小時、3小時及4小時。
應注意，AMDE可為可活化或經修飾以使其可藉由特定活化劑或活化條件活化的任何基質降解酵素。供本文之方法中所用的AMDE為溶酶體酵素。AMDE包括(例如)組織蛋白酶，諸如為半胱胺酸蛋白酶(cysteine protease)或天冬胺酸蛋白酶(aspartic protease)之組織蛋白酶。此等組織蛋白酶包括(例如)組織蛋白酶S、組織蛋白酶K、組織蛋白酶L、組織蛋白酶B、組織蛋白酶C、組織蛋白酶H、組織蛋白酶F、組織蛋白酶O、組織蛋白酶R、組織蛋白酶V、組織蛋白酶W、組織蛋白酶D及組織蛋白酶E。該等組織蛋白酶之實例為選自具有SEQ ID NO:57、60、1、65、180、68、71、74、77、183、186、189、80、195、90、93及96中之任一者中所闡明之胺基酸序列，或為SEQ ID NO:57、60、1、65、180、68、71、74、77、183、186、189、80、195、90、93及96中之任一者的對偶基因或物種變異體或其他變異體之組織蛋白酶的任何組織蛋白酶。其他變異體包括(例如)經修飾以具有改變之性質(諸如穩定性)或活性(諸如受質特異性)之酵素。變異體可與胺基酸序闡明於SEQ ID NO:57、60、1、65、180、68、71、74、77、183、186、189、80、195、90、93及96中之任一者的多肽中之任一者具有(例如)60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高之序列一致性。
在本文之方法中，AMDE在投藥之後可裂解任一或多種細胞外基質(ECM)組份。該裂解可進行可預定之有限時間。所裂解之ECM組份包括(但不限於)例如膠原蛋白、彈性蛋白(elastin)、纖維結合蛋白(fibronectin)及蛋白聚糖(proteoglycan)，諸如I型、II型、III型或IV型膠原蛋白。AMDE可諸如藉由直接演化方法或其他方法來修飾，以具有改變之性質或活性，諸如相對於IV型膠原蛋白具有增加之對I型膠原蛋白之受質特異性。
可將其他藥劑與活化劑及酵素一起投予。投藥可與活化劑及/或酵素在同一組成物中或以分開的組成物進行。投藥可同時、分開或間歇執行。例示性藥劑包括(但不限於)例如選自其他生物製劑、小分子化合物、分散劑、麻醉劑及血管收縮劑及/或其組合之藥理劑。分散劑之實例為玻尿酸降解酵素(hyaluronan degrading enzyme)，例如玻尿酸酶(hyaluronidase)，諸如PH20，諸如其可溶形式，尤其rHuPH20。該玻尿酸酶典型地在投予酵素及活化劑之前投予。可溶性玻尿酸酶之實例為稱作rHuPH20之產物，其由編碼具有SEQ ID NO:226中所闡明之胺基酸序列或為其對偶基因或物種變異體或其他變異體的多肽或與SEQ ID NO:226中所闡明之胺基酸序列具有至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之該多肽的變異體之核酸編碼。
其他藥劑包括麻醉劑，諸如利多卡因(lidocaine)；及血管收縮劑，諸如α腎上腺素能受體促效劑(alpha adrenergic receptor agonist)，包括(例如)可巴君(levonordefrin)、腎上腺素(epinephrine)及去甲腎上腺素(norepinephrine)。典型地該等藥劑與AMDE及活化劑一起或在其之前投予。因此，提供藉由經表皮下投予如上文所述之可活化的基質降解酵素(AMDE)、活化劑、玻尿酸酶、利多卡因及腎上腺素來治療細胞外基質(ECM)之疾病或病狀的方法。該AMDE在該活化劑不存在之情況下在該ECM中無活性。該酵素、玻尿酸酶、利多卡因及腎上腺素可同時、依次或間歇投予，其限制條件為利多卡因在酵素之前投予。舉例而言，玻尿酸酶、利多卡因及腎上腺素在投予酵素之前投予，或玻尿酸酶、利多卡因及腎上腺素同時投予，或玻尿酸酶、利多卡因及腎上腺素可在單一組成物中投予。AMDE及活化劑及其他藥劑可藉由任何合適之途徑投予，包括(但不限於)皮下、肌肉內、病灶內、皮內、表面、經皮、靜脈內、經口及經直腸投藥。舉例而言，投藥可為表皮下投藥。
本發明亦提供可用於實現方法之產品，包括組成物、容器、組合及套組。舉例而言，提供含有兩個隔室之容器。第一隔室含有治療有效量之可活化的基質降解酵素(AMDE)，其中該量係用於單一劑量或複數個劑量且單一劑量有效治療ECM之疾病或病狀；且第二隔室含有活化劑，其中該活化劑為活化該酵素之活化劑。AMDE包括(例如)溶酶體酵素，諸如組織蛋白酶、鈣激活中性蛋白酶及肝素酶，包括上述供方法中所用者。該等容器中之AMDE為如上文所述者，包括(例如)於pH 5.5下實質上具活性且視情況於中性pH值下實質上無活性之AMDE。活化劑提供諸如上述者之活化條件。因此，該第二隔室可含有實現變化或維持pH值(諸如緩衝液)或離子強度或提供金屬離子(諸如Ca2+ 、Zn2+ 、Mg2+ )之組成物。例示性緩衝液可包括含有選自2-(N-嗎啉基)乙烷磺酸(MES)、乙酸、檸檬酸、順丁烯二酸鹽、丁二酸鹽、乳酸鹽、甘胺酸鹽、檸檬酸磷酸鹽及組胺酸之酸的彼等緩衝液。該等疾病及病狀包括上述彼等疾病及病狀。容器亦可包括用於實現第一及第二隔室中之組份之混合的混合隔室。例示性容器包括管及瓶、無菌容器，諸如有或無注射用針之注射器。
AMDE及活化劑係以用於單劑量或多劑量投藥之量提供。容器中之AMDE可以為或約為10μg至100mg、50μg至75mg、100μg至50mg、250μg至25mg、500μg至10mg、1mg至5mg或2mg至4mg之量提供。其可以固體形式，諸如以結晶形式或凍乾形式提供，或以液體形式，諸如溶液或懸浮液、凝膠或其他合適之形式提供。容器中之液體的總體積例如可為或約為1-100ml、1-50ml、10-50ml、10-30ml、1-20ml及1-10ml。
在一例示性具體實例中，提供具有至少兩個隔室之容器，其中第一隔室含有治療有效量之可活化的組織蛋白酶L且該量有效治療細胞外基質(ECM)之疾病或病狀；且第二隔室含有活化該組織蛋白酶L之酸性緩衝液。該等疾病及病狀為上文對於治療方法所述者。活化劑可為由緩衝液、尤其具有為或約為pH 4.0-5.0、尤其4.5至6、更尤其4.0、4.5、5、5.5或6之範圍的酸性緩衝液提供之pH值。例示性緩衝液為含有諸如2-(N-嗎啉基)乙烷磺酸(MES)、乙酸、檸檬酸、丁二酸、乳酸、順丁烯二酸、甘胺酸-鹽酸、檸檬酸磷酸鹽及組胺酸之酸的酸性緩衝液。例示性組織蛋白酶L多肽為包括SEQ ID NO:1中所闡明之胺基酸序列的彼等多肽，或其對偶基因、物種或其他變異體，其中該等變異體經修飾以具有改變之性質或活性且典型地與SEQ ID NO:1中之任一者中所闡明之胺基酸序列相比具有至少或具有60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性。可活化的組織蛋白酶L可以凍乾粉末形式，尤其以呈雙鏈或單鏈形式之活化成熟形式的凍乾粉末形式提供。容器中之可活化的組織蛋白酶L之量對於特定疾病或病狀在治療上有效，且可例如在約為或為10μg至100mg、50μg至75mg、100μg至50mg、250μg至25mg、500μg至10mg、1mg至5mg及2mg至4mg之範圍內。特定量可取決於特定疾病或病狀，且必要時可憑經驗確定。組織蛋白酶L可以固體(諸如凍乾粉末)、糊狀物或液體(諸如懸浮液、分散液或溶液)形式提供。容器中之體積對於組織蛋白酶L之量及預定投藥途徑及/或位點而言適合。舉例而言，容器中之典型體積為或約為1-100ml、1-50ml、10-50ml、10-30ml、1-20ml或1-10ml。
亦提供包括上述容器及一或多個含有另一藥理學有效藥劑之其他容器之組合。該等藥劑可選自生物製劑、小分子化合物、分散劑、麻醉劑及血管收縮劑及其組合。此等藥劑包括如上文關於方法所述之藥劑及量。舉例而言，另一容器可含有玻尿酸酶，諸如rHuPH20。量可例如為或約為：10單位至500,000單位、100單位至100,000單位、500單位至50,000單位、1000單位至10,000單位、5000單位至7500單位、5000單位至50,000單位或1,000單位至10,000單位。其他容器可含有例如為或約為10mg至1000mg、100mg至500mg、200mg至400mg、20mg至60mg或30mg至50mg之麻醉劑，諸如利多卡因；及/或於投藥位點及區域實現血管收縮之量的血管收縮劑，諸如α腎上腺素能受體促效劑，包括可巴君、腎上腺素或去甲腎上腺素。該量例如可為或約為10μg至5mg、50μg至1mg、50μg至500μg、50μg至250μg、100μg至500μg、200μg至400μg、1mg至5mg或2mg至4mg之(例如)腎上腺素或其他血管收縮劑。其他藥理學有效藥劑中之每一者可以任何組合混合於一個容器中或可提供於單一容器中。其可以如上文對於組織蛋白酶L所例示及所述之液體或固體形式提供。
在例示性具體實例中，該等組合可含有AMDE及活化劑，且該容器可含有至少兩種藥理學有效藥劑，其中該等藥理劑係以彼此分開之分開的組成物形式提供或以同一組成物形式提供於同一容器中。舉例而言，其他容器可含有玻尿酸酶、利多卡因及腎上腺素中之一或多者。其他容器可呈有或無針之注射器的形式。該一或多個其他容器中之總體積為或約為1-100ml、1-50ml、10-50ml、10-30ml、1-20ml或1-10ml。
在例示性具體實例中，組合包括組織蛋白酶L及玻尿酸酶(諸如rHuPH20)。其可以分開的組成物形式提供或以單一組成物形式處於一個容器中。組合可包括活化組織蛋白酶L之酸性緩衝液。該緩衝液可提供於分開的容器中或與組織蛋白酶L與玻尿酸酶中之一或兩者混合。
亦提供含有在與酸性緩衝液同時或依次投予之後有效治療ECM介導之疾病或病狀的量之組織蛋白酶L的醫藥組成物，其中該組成物經調配以供單劑量投藥；且該緩衝液具有活化組織蛋白酶L之pH值。組織蛋白酶L之量對於特定疾病或病狀有效，且例如為或約為10μg至100mg、50μg至75mg、100μg至50mg、250μg至25mg、500μg至10mg、1mg至5mg或2mg至4mg。該組成物可進一步含有利多卡因、腎上腺素及玻尿酸酶中之一或多者。
容器及/或組合及組成物可以套組形式包裝。該等套組含有容器及/或組合及視情況供本文提供之方法中使用的其他試劑、本文提供之投藥裝置(諸如小瓶、管、注射器及針)及/或關於該用途之說明書。
 概述 A.　定義 B.　細胞外基質
1.　ECM之組份
a.　膠原蛋白
b.　彈性蛋白
c.　纖維結合蛋白
d.　葡糖胺聚糖(Glycosaminoglycan，GAG)
i.　蛋白聚糖
ii.　玻尿酸(Hyaluronic Acid)
2.　皮膚組織學
a.　表皮
b.　真皮
c.　下皮
3.　ECM之疾病
C.　基質降解酵素
1.　酵素活化
a.　絲胺酸蛋白酶(Serine Protease)
b.　半胱胺酸蛋白酶
i.　組織蛋白酶
組織蛋白酶L
ii.　鈣激活中性蛋白酶
c.　天冬胺酸蛋白酶
d.　金屬蛋白酶(Metalloprotease)
e.　肝素酶
D.　可活化的基質降解酵素(AMDE)
1.　活化可活化的基質降解酵素之活化條件及方法
a.　活化條件-酸性pH值
b.　活化條件-金屬陽離子濃度
2.　基質降解酵素與活化劑之組合
E.　產生編碼基質降解酵素之核酸及其多肽的方法
1.　載體及細胞
2.　表現
a.　原核細胞
b.　酵母細胞
c.　蟲細胞
d.　哺乳動物細胞
e.　植物
3.　純化技術
F.　可活化的基質降解酵素之製備、調配及投藥
1.　可注射劑、溶液及乳液
凍乾粉末
2.　表面投藥
3.　用於其他投藥途徑之組成物
4.　組合療法
a.　玻尿酸降解酵素
i.　玻尿酸酶
1)　哺乳動物型玻尿酸酶
2)　細菌玻尿酸酶
3)　來自水蛭、其他寄生蟲及甲殼動物之玻尿酸酶
ii.　其他玻尿酸降解酵素
iii.　可溶性玻尿酸降解酵素
1)　可溶性人類PH20
2)　rHuPH20
iv.　修飾玻尿酸降解酵素以改良其藥物動力學性質
G.　可活化的基質降解酵素之包裝及製品
1.　單腔室設備
2.　雙腔室設備
3.　套組
H.　評估基質降解酵素之活性的方法
1.　評估酵素活性之方法
2.　評估ECM降解之方法
a.　試管內檢定
b.　活體內檢定
c.　非人類動物模型
I.　治療ECM之疾病或缺陷的例示性方法
膠原蛋白介導之疾病或病狀
a.　脂肪團
b.　杜普宜特朗氏病
c.　帕榮雷氏病
d.　萊德豪斯纖維化
e.　關節僵硬
f.　現有瘢痕
i.　手術黏連
ii.　瘢痕瘤
iii.　肥厚性瘢痕
iv.　凹陷性瘢痕
g.　硬皮病
h.　淋巴水腫
i.　膠原性結腸炎
J.　實施例 A.　定義
除非另作定義，否則本文中所用之所有技術及科學術語具有與熟習本發明所屬技術者通常所理解相同之含義。除非另有註釋，否則本文整個揭示案中通篇所提及之所有專利、專利申請案、公開申請案及公開案、Genbank序列、資料庫、網站及其他公開材料係以整體引用的方式併入。在關於本文之術語存在複數個定義之情況下，以本部分中之彼等定義為主。當提及URL或其他此類識別符或位址時，應瞭解該等識別符可變化且關於網際網路之特定資訊可來往，但等效資訊可藉由檢索網際網路而找到。對其之提及證明該資訊之可用性及公開傳播。
如本文中所使用，細胞外基質(ECM)係指包圍特化組織及器官之細胞且對特化組織及器官之細胞提供結構支撐的複雜網狀結構。該ECM由以下蛋白質組成：結構蛋白，諸如膠原蛋白及彈性蛋白；特化蛋白，諸如纖維結合蛋白；及蛋白聚糖。確切生物化學組成在組織之間不同。舉例而言，在皮膚中，其為含有ECM之真皮層。對「間質」之提及在本文中可互換使用以指ECM。
如本文中所使用，ECM之組份(components of the ECM)係指由結締組織之細胞產生且分泌至間質中的任何物質。出於本文之目的，對ECM組份之提及係指蛋白質及糖蛋白，而非其他細胞組份或ECM之其他組份。例示性ECM組份包括(但不限於)膠原蛋白、纖維結合蛋白、彈性蛋白及蛋白聚糖。
如本文中所使用，基質降解酵素(matrix degrading enzyme)係指降解ECM之一或多種組份的任何酵素。基質降解酵素包括蛋白酶，其為催化共價肽鍵之水解的酵素。基質降解酵素包括熟習此項技術者已知之任何酵素，諸如本文所述之任何酵素(參見例如表3)，其對偶基因或物種變異體或其他變異體。
如本文中所使用，經修飾之基質降解酵素(modified matrix-degrading enzyme)(或基質降解酵素之變異體(variant of a matrix-degrading enzyme))係指與野生型酵素相比在一級序列中具有一或多個修飾之酵素。一或多個突變可為一或多個胺基酸置換(取代)、插入、缺失及其任何組合。經修飾之酵素包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20處或更多處經修飾位置者。經修飾之酵素保留野生型酵素之活性，但可具有改變之受質特異性或穩定性。經修飾之酵素典型地與野生型酵素之相應胺基酸序列具有60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性。
如本文中所使用，溶酶體酵素(lysosomal enzyme)係指降解功能於酸性pH值下最佳之酵素。由於需要低pH值，該等酵素通常存在於細胞之溶酶體中。溶酶體酵素包括(但不限於)組織蛋白酶S、K、L、B、C、H、F、O、R、V、D及E。溶酶體酵素之實例包括SEQ ID NO:56、59、62、64、179、67、70、73、76、182、185、188、79、194、89、92及95中之任一者中所闡明之前軀體形式及SEQ ID NO:57、60、1、65、180、68、71、74、77、183、186、189、80、195、90、93及96中所闡明之其成熟形式，或其對偶基因變異體或物種變異體或其他變異體。其他溶酶體酵素包括(但不限於)溶酶體酸性脂肪酶、胃脂肪酶、溶酶體磷脂酶及膽汁鹽活化脂肪酶(編碼包括其成熟形式之胺基酸序列之核酸序列闡明於SEQ ID NO:196-207中之任一者中)。
如本文中所使用，「酵素原(zymogen)」係指為無活性前軀體且需要一些變化(諸如多肽之蛋白水解)以變為具活性之酵素。一些酵素原亦需要添加用於活化之輔助因素，諸如(但不限於)pH值、離子強度、金屬離子或溫度。酵素原包括酵素之酵素原(proenzyme)形式。因此，酵素原通常無活性且可藉由在其他輔助因素存在或不存在之情況下自酵素原催化或自體催化裂解前區來轉化為成熟多肽。
如本文中所使用，前區段(prosegment)或前區(proregion)係指經裂解以產生成熟蛋白之區域或區段。其可包括起作用以藉由遮蔽催化機構來抑制酵素活性之區段。前區為位於成熟多肽之胺基末端處的胺基酸序列且可少至數個胺基酸或可為多域結構。
如本文中所使用，活化序列(activation sequence)係指酵素原中為活化裂解或成熟裂解形成活性蛋白酶所需之位點的胺基酸序列。活化序列之裂解可以自體催化方式或藉由活化搭配物來催化。
活化裂解為一種類型之成熟裂解，其中出現活性所需之構形變化。活化會導致產生蛋白酶之多鏈形式(例如雙鏈形式)。在一些情況下，蛋白酶之單鏈形式可展現如單鏈之蛋白水解活性。
如本文中所使用，輔助因素(cofactor)係指酵素活性所需之條件或因素。輔助因素包括酵素活性所需之任何因素。輔助因素之實例包括(但不限於)pH值、離子強度、金屬離子或溫度。當提及酵素之活體內投藥時，輔助因素包括內源性存在之因素及外源性提供之因素。
如本文中所使用，活化條件(activating condition)係指酵素活性所需之任何物理條件或條件組合。出於本文之目的，用於可活化的基質降解酵素(AMDE)之活化條件包括不以活化酵素所需之量(亦即數量、程度、含量或其他物理度量)存在於投藥位點處(例如不存在於細胞外基質中)者。活化條件之實例包括(但不限於)pH值、金屬離子、還原劑或氧化劑、溫度及離子強度。舉例而言，在於低pH值之條件下具活性、但於中性pH值下無活性之溶酶體基質降解酵素的情況下，使無活性酵素暴露於酸性pH值之活化條件使得酵素活化。由於活化條件不存在於酵素之投藥位點處、而必須外源性添加的事實，活化條件將隨時間耗散及/或中和，以致活化條件不再存在來活化酵素。因此，酵素將在投藥之後的有限或預定時間內具活性。
如本文中所使用，活化劑(activator)係指提供可活化的基質降解酵素活化條件的任何組成物。活化劑之實例包括(但不限於)酸性pH值緩衝液、冷緩衝液或鈣緩衝液。
如本文中所使用，「可活化的基質降解酵素(AMDE)」係指需要活化條件以便具活性之基質降解酵素。舉例而言，出於本文之目的，除非在投予AMDE之前、同時或之後暴露於活化劑，藉此提供酵素活化條件，否則AMDE在ECM中實質上無活性。因此，可活化的酵素之活化受外來條件控制以便活體內位置或位點處之時期(在此期間酵素具活性)可因活化條件之耗散及/或中和而得以預先確定及/或受到控制(亦即時間上可控制或受時間控制)。因此，藉助於暴露於活化條件，酵素在ECM中在有限時間內及/或在有限程度上具活性(亦即條件性地具活性)。活化之程度及時間可藉由選擇活化劑或活化條件來控制，且可持續預定時間。舉例而言，諸如組織蛋白酶L之溶酶體酵素為可活化的，因為其可藉由暴露於pH值之活化條件(諸如由酸性緩衝溶液提供)而活化。在向ECM之中性pH值環境中投予經活化酵素之後，該pH值環境將在可基於酸性緩衝液之緩衝能力預先確定的時期內恢復至中性，以致酵素將變為無活性。
如本文中所使用，「活化劑之量(amount of an activator)」係指活化劑之數量、程度或含量。活化劑之量可為濃度或絕對量，或特定溫度或pH值。出於本文之目的，活化劑之量典型地為足以使得酵素條件性活化的量。可調整該量以改變活化之持續時間以使活化可持續有限或預定時間。
如本文中所使用，「治療有效量(therapeutically effective amount)」或「治療有效劑量(therapeutically effective dose)」係指含有至少足以產生治療作用之化合物的藥劑、化合物、物質或組成物。
如本文中所使用，在有限時間內或在有限持續時間內具活性之酵素(an enzyme that is active for a limited time or for limited duration)係指具有隨時間耗散及/或中和之活性的活性酵素。因此，藉助於不存在活化條件，使酵素無活性。
如本文中所使用，預定時間(predetermined time)意謂先前已知且可控制之有限時間。可滴定酵素活性所需之活化條件之耗散及/或中和以使活性酵素變為無活性所需之時間為已知的。舉例而言，將隨時間使投入酸性培養基中且暴露於具有中性pH值之活體內環境(亦即ECM)之經酸活化酵素暴露於逐漸增加之pH值以使該酵素將僅在有限時間內保持活性。pH值增加之速率可例如藉由改變酸性緩衝液之緩衝能力來控制以使得可預先確定活性酵素變為無活性所需之時期。出於本文之目的，酵素可在為或約為1分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘、5分鐘、15分鐘、7分鐘、8分鐘、9分鐘、10分鐘、15分鐘、20分鐘、30分鐘、1小時、2小時、3小時或4小時之預定時間內具活性。
如本文中所使用，於中性pH值下實質上無活性(substantially inactive at neutral pH)意謂酵素在處於中性pH值時展現小於酵素於類似條件(除pH值差異外，亦即檢定、緩衝液、離子強度)下處於其最佳pH值下之活性的10%。
如本文中所使用，於pH 5.5下實質上具活性(substantially active at pH 5.5)意謂酵素在處於pH 5.5時展現大於酵素於類似條件(除pH值差異外，亦即檢定、緩衝液、離子強度)下處於其最佳pH值之活性的10%(例如20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)。
如本文中所使用，表皮下投藥(sub-epidermal administration)係指使酵素傳遞於皮膚最外層下方之任何投藥。表皮下投藥並不包括對皮膚外層上之表面施用。表皮下投藥之實例包括(但不限於)皮下、肌肉內、病灶內及皮內投藥途徑。
如本文中所使用，受質(substrate)係指由酵素裂解之分子。最低限度地，標靶受質包括含有由蛋白酶識別之裂解序列的肽，且因此長度可為2、3、4、5、6個或6個以上殘基。受質亦包括全長蛋白質、對偶基因變異體、同功異型物或其由酵素裂解之任何部分。另外，受質包括含有不影響酵素裂解該受質之另一部分的肽或蛋白質。舉例而言，受質可包括4個胺基酸之肽，或以化學方式與螢光部分連接之全長蛋白質。
如本文中所使用，裂解(cleavage)係指酵素使肽鍵或其他鍵斷開，此產生一或多種降解產物。
如本文中所使用，活性(activity)係指與全長(完整)蛋白質相關之多肽或其部分的功能活性。功能活性包括(但不限於)生物學活性、催化或酶促活性、抗原性(結合抗多肽抗體或與多肽競爭結合抗多肽抗體之能力)、免疫原性、形成多聚體之能力及與該多肽之受體或配位體特異性結合的能力。
如本文中所使用，酶促活性(enzymatic activity)或催化活性(catalytic activity)或裂解活性(cleavage activity)係指如在偵測所選受質之蛋白水解的試管內蛋白水解檢定中所評估之蛋白酶之活性。
如本文中所使用，活性酵素(active enzyme)係指展現酶促活性之酵素。出於本文之目的，活性酵素為裂解ECM之任一或多種組份(諸如膠原蛋白)的彼等酵素。活性酵素包括呈單鏈或雙鏈形式者。
如本文中所使用，無活性酵素(inactive enzyme)係指展現實質上無活性(亦即催化活性或裂解活性)之酵素，諸如小於酵素最大活性之10%。酵素可因其構形、其活性所需活化條件之不存在或抑制劑或使酵素實質上無活性之任何其他條件或因素或形式之存在而無活性。
如本文中所使用，人類蛋白質為由存在於人類基因組中之核酸分子(諸如DNA)編碼的蛋白質，包括所有其對偶基因變異體及保守性變異。蛋白質之變異體或修飾為人類蛋白質，若該修飾係基於人類蛋白質之野生型或主要序列。
如本文中所使用，玻尿酸降解酵素(hyaluronan degrading enzyme)係指催化玻尿酸聚合物(亦稱為玻尿酸或HA)裂解為較小分子量片段之酵素。玻尿酸降解酵素之實例為玻尿酸酶，及具有使玻尿酸解聚之能力的特定軟骨素酶及解離酶。為玻尿酸降解酵素之例示性軟骨素酶包括(但不限於)軟骨素ABC解離酶(亦稱為軟骨素酶ABC)、軟骨素AC解離酶(亦稱為硫酸軟骨素(chondroitin sulfate)解離酶或硫酸軟骨素消除酶)及軟骨素C解離酶。軟骨素-ABC解離酶包含兩種酵素，硫酸軟骨素-ABC內解離酶(EC 4.2.2.20)及硫酸軟骨素-ABC外解離酶(EC 4.2.2.21)。例示性硫酸軟骨素-ABC內解離酶及硫酸軟骨素-ABC外解離酶包括(但不限於)來自普通變形桿菌(Proteus vulgaris )及肝素黃桿菌(Flavobacterium heparinum )者(普通變形桿菌硫酸軟骨素ABC內解離酶闡明於SEQ ID NO:305中；Sato等人(1994)Appl. Microbiol. Biotechnol. 41(1):39-46)。來自細菌之例示性軟骨素酶AC酵素包括(但不限於)來自肝素黃桿菌、SEQ ID NO:308中所闡明之食物穀菌(Victivallis vadensis )及金黃節桿菌(Arthrobacter aurescens )者(Tkalec等人(2000)Applied and Environmental Microbiology 66(1):29-35；Ernst等人(1995)Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 30(5):387-444)。來自細菌之例示性軟骨素酶C酵素包括(但不限於)來自鏈球菌(Streptococcus )及黃桿菌(Flavobacterium )者(Hibi等人(1989)FEMS-Microbiol-Lett. 48(2):121-4；Michelacci等人(1976)J. Biol. Chem. 251:1154-8；Tsuda等人(1999)Eur. J. Biochem. 262:127-133)。
如本文中所使用，玻尿酸酶(hyaluronidase)係指降解玻尿酸之酵素。玻尿酸酶包括細菌玻尿酸酶(EC 4.2.99.1)，來自水蛭、其他寄生蟲及甲殼動物之玻尿酸酶(EC 3.2.1.36)，及哺乳動物型玻尿酸酶(EC 3.2.1.35)。玻尿酸酶亦包括包含(但不限於)鼠類、犬類、貓類、兔類、禽類、牛類、羊類、豬類、馬類、魚類、蛙類、細菌之非人類來源的任何玻尿酸酶，及來自水蛭、其他寄生蟲及甲殼動物之任何玻尿酸酶。例示性非人類玻尿酸酶包括SEQ ID NO:237-260中之任一者中所查明之任何玻尿酸酶。例示性人類玻尿酸酶包括HYAL1(SEQ ID NO:262)、HYAL2(SEQ ID NO:263)、HYAL3(SEQ ID NO:264)、HYAL4(SEQ ID NO:265)及PH20(SEQ ID NO:232)。玻尿酸酶中亦包括可溶性人類PH20及可溶性rHuPH20。
對玻尿酸酶之提及包括前軀體玻尿酸酶多肽及成熟玻尿酸酶多肽(諸如信號序列已移除者)，其具有活性之截短形式，且包括對偶基因變異體及物種變異體，由剪接變異體編碼之變異體，及其他變異體，包括與SEQ ID NO:232中之任一者所闡明之前軀多肽或其成熟形式具有至少40%、45%、50%、55%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性的多肽。玻尿酸酶亦包括含有化學或轉譯後修飾者及不含化學或轉譯後修飾者。該等修飾包括(但不限於)聚乙二醇化、白蛋白化、糖基化、法尼基化、羧基化、羥基化、磷酸化及此項技術中已知之其他多肽修飾。
如本文中所使用，可溶性人類PH20或sHuPH20包括缺乏全部或一部分C-末端處之糖基磷脂醯肌醇(glycosylphospatidylinositol，GPI)連接位點以使得在表現後多肽為可溶性的成熟多肽。例示性sHuPH20多肽包括具有SEQ ID NO:226-231中之任一者中所闡明之胺基酸序列的成熟多肽。該等例示性sHuPH20多肽之前軀多肽包括胺基酸信號序列。前軀體之實例闡明於SEQ ID NO:225中，其於胺基酸位置1-35處含有35個胺基酸之信號序列。可溶性HuPH20多肽可在本文所述之製備及純化方法期間或之後降解。
如本文中所使用，可溶性rHuPH20(soluble rHuPH20)係指重組表現於中國倉鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary，CHO)細胞中之人類PH20之可溶性形式。可溶性r HuPH20由編碼SEQ ID NO:225中所闡明之胺基酸1-482的核酸編碼。亦包括為其對偶基因變異體及其他可溶性變異體之DNA分子。編碼可溶性rHuPH20之核酸表現於分泌成熟多肽之CHO細胞中。當產生於培養基中時，於C-末端處存在異質性以使產物包括SEQ ID NO:226-231之物質的混合物。亦包括相應對偶基因變異體及其他變異體。其他變異體可與SEQ ID NO:226-231中之任一者具有60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%，97%、98%、99%或更高序列一致性，只要其保留玻尿酸酶活性且為可溶性的即可。
如本文中所使用，玻尿酸酶活性(hyaluronidaseactivity)係指由玻尿酸酶多肽展現之任何活性。該等活性可在試管內及/或活體內進行測試且包括(但不限於)酶促活性(諸如實現玻尿酸裂解)、充當分散劑或展布劑之能力及抗原性。例示性檢定包括微濁度檢定(microturbidity assay)(參見例如實施例16)，其藉由偵測未裂解之玻尿酸與血清白蛋白結合時所形成之不溶性沈澱物來間接量測玻尿酸酶對玻尿酸之裂解。
如本文中所使用，天然存在之α-胺基酸之殘基為存在於自然界中之彼等20種α-胺基酸之藉由在人類體內具有其同源mRNA密碼子之負載tRNA分子的特異性識別而併入蛋白質中的殘基。
如本文中所使用，核酸包括DNA、RNA及其類似物，包括肽核酸(peptide nucleic acid，PNA)及其混合物。核酸可為單鏈或雙鏈。當提及視情況經標記(諸如經可偵測標記進行標記，諸如螢光或放射性標記)之探針或引子時，涵蓋單鏈分子。該等分子典型地具有使得其標靶在統計學上獨特之長度或具有低複本數(典型地小於5個、通常小於3個)以用於探測或引發文庫。通常，探針或引子含有至少14、16或30個與所關注基因互補或一致之序列的相連核苷酸。探針及引子之長度可為10、20、30、50、100個或100個以上核酸。
如本文中所使用，肽(peptide)係指長度為2至40個胺基酸之多肽。
如本文中所使用，存在於本文所提供之各種胺基酸序列中之胺基酸係根據其已知三字母或單字母縮寫來鑑別(表1)。存在於各種核酸片段中之核苷酸係以此項技術中常規使用之標準單字母名稱來命名。
如本文中所使用，「胺基酸(amino acid)」為含有胺基及羧基之有機化合物。多肽含有兩個或兩個以上胺基酸。出於本文之目的，胺基酸包括20種天然存在之胺基酸、非天然胺基酸及胺基酸類似物(亦即α-碳具有側鏈之胺基酸)。
如本文中所使用，「胺基酸殘基(amino acid residue)」係指化學消化(水解)多肽之肽鍵後所形成之胺基酸。假定本文所述之胺基酸殘基呈「L」異構形式。如此命名之呈「D」異構形式之殘基可取代任何L-胺基酸殘基，只要多肽保留所需功能性質即可。NH2 係指存在於多肽之胺基末端處的游離胺基。COOH係指存在於多肽之羧基末端處的游離羧基。遵照J. Biol. Chem. ,243:3552-3559(1969)及被採納之37 C.F.R..§§ 1.821-1.822中所述之標準多肽命名法，胺基酸殘基之縮寫展示於表1中：
應注意本文由式表示之所有胺基酸殘基序列具有在胺基末端至羧基末端之習知方向上的左至右取向。另外，片語「胺基酸殘基」經廣泛定義以包括對應表(表1)中所列之胺基酸及經修飾之胺基酸與稀有胺基酸，諸如37 C.F.R.§§ 1.821-1.822中所提及之彼等胺基酸，且以引用的方式併入本文中。此外，應注意胺基酸殘基序列之開始或結束時之破折號指示與一或多個胺基酸殘基之另一序列、與諸如NH2 之胺基末端基或與諸如COOH之羧基末端基連接的肽鍵。
如本文中所使用，「天然存在之胺基酸(naturally occurring amino acid)」係指存在於多肽中之20種L-胺基酸。
如本文中所使用，「非天然胺基酸(non-natural amino acid)」係指具有類似於天然胺基酸之結構、但結構上經修飾以模擬天然胺基酸及反應性之結構的有機化合物。因此，非天然存在之胺基酸包括(例如)除20種天然存在之胺基酸外的胺基酸或胺基酸之類似物且包括(但不限於)胺基酸之D-立體異構體。例示性非天然胺基酸在本文中描述且為熟習此項技術者所已知。
如本文中所使用，DNA構築體為含有以自然界中未見之方式組合及鄰接之DNA區段的單鏈或雙鏈、直鏈或環狀DNA分子。DNA構築體作為人類操作之結果而存在，且包括所操作分子之純系及其他複本。
如本文中所使用，DNA區段為具有指定屬性之較大DNA分子之一部分。舉例而言，編碼指定多肽之DNA區段為較長DNA分子之一部分，諸如質體或質體片段，當自5'至3'方向讀取時，其編碼該指定多肽之胺基酸序列。
如本文中所使用，術語聚核苷酸意謂自5'至3'端讀取之脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸鹼基之單鏈或雙鏈聚合物。聚核苷酸包括RNA及DNA，且可自天然來源分離，試管內合成，或由天然分子與合成分子之組合來製備。本文根據核苷酸(簡寫「nt」)或鹼基對(簡寫「bp」)給出聚核苷酸分子之長度。當情況允許時，術語核苷酸用於單鏈及雙鏈分子。當該術語應用於雙鏈分子時，其用於表示全長且將理解為相當於術語鹼基對。熟習此項技術者將認識到，雙鏈聚核苷酸之兩條鏈的長度可略微不同且其末端可交錯；因此，雙鏈聚核苷酸分子中之所有核苷酸可均不配對。一般而言，該等未配對之末端的長度將不超過20個核苷酸。
如本文中所使用，兩種蛋白質或核酸之間的「相似性(similarity)」係指蛋白質之胺基酸序列或核酸之核苷酸序列之間的相關性。相似性可基於殘基序列之一致性及/或同源性之程度及其中所含之殘基。評估蛋白質或核酸之間的相似度之方法為熟習此項技術者所已知。舉例而言，在一種評估序列相似性之方法中，使兩個胺基酸或核苷酸序列以產生序列之間的最大一致性程度之方式比對。「一致性(identity)」係指胺基酸或核苷酸序列不變之程度。胺基酸序列及在某種程度上核苷酸序列之比對亦可考慮胺基酸(或核苷酸)中之保守性差異及/或頻繁取代。保守性差異為保持所涉及之殘基之物理化學性質的彼等差異。比對可為整體比對(比較序列在序列之整個長度上之比對且包括所有殘基)或局部比對(僅包括最類似區域之序列之一部分的比對)。
「一致性」本身具有業內公認之含義且可使用公開技術計算。(參見例如：Computational Molecular Biology ,Lesk,A.M.編,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects ,Smith,D.W.編,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data ,Part I,Griffin,A.M.,及Griffin,H.G.編，Humana Press,New Jersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology ,von Heinje,G.,Academic Press,1987；及Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.及Devereux,J.編,M Stockton Press,New York,1991)。雖然存在許多量測兩種聚核苷酸或多肽之間的一致性之方法,但術語「一致性」為熟習技術者所熟知(Carillo,H.及Lipton,D.,SIAM J Applied Math 48 ：1073(1988))。
如本文中所使用，同源(對於核酸及/或胺基酸序列而言)意謂大約大於或等於25%序列同源性,典型地大於或等於25%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%序列同源性；必要時可指定精確百分比。出於本文之目的，除非另有指示，否則術語「同源性(homology)」與「一致性」通常可互換使用。一般而言，對於測定同源性或一致性百分比而言，比對序列以便獲得最高順序匹配(參見例如：Computational Molecular Biology ,Lesk,A.M.編,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects ,Smith,D.W.編,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data ,Part I ,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.編,Humana press,New Jersey,1994；Sequence Analysisin Molecular Biology ,von Heinje,G.,Academic Press,1987；及Sequence Analysis Primer ,Gribskov,M.及Devereux,J.編,M Stockton Press,New York,1991;Carillo等人(1988)SIAM J Applied Math 48 :1073)。藉由序列同源性，藉由標準比對演算法程式確定保守性胺基酸之數目，且該數目可用於由各供應商制定之預設間隙懲罰。實質上同源核酸分子典型地會於中等嚴格度下或於高嚴格度下沿所關注之核酸的整個長度雜交。亦涵蓋含有簡并密碼子以替代雜交核酸分子中之密碼子的核酸分子。
任何兩個分子是否具有至少60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%「一致性」或「同源性」之核苷酸序列或胺基酸序列可使用已知電腦算法來判定，諸如使用例如預設參數之「FASTA」程式，如在Pearson等人(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :2444中(其他程式包括GCG程式包(Devereux,J.,等人,Nucleic Acids Research 12(I) :387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul,S.F.,等人,J Molec Biol 215 :403(1990))；Guide to Huge Computers,Martin J. Bishop編,Academic press,San Diego,1994及Carillo等人(1988)SIAM J Applied Math 48 :1073)。舉例而言，國家生物技術資訊中心資料庫(National Center for Biotechnology Information database)之BLAST功能可用於測定一致性。其他商業或公開可用程式包括DNAStar「MegAlign」程式(Madison,WI)及威斯康星大學遺傳電腦組(University of Wisconsin Genetics Computer Group，UWG)「Gap」程式(Madison WI)。蛋白質及/或核酸分子之同源性或一致性百分比可例如藉由使用GAP電腦程式比較序列資訊來測定(例如Needleman等人(1970)J. Mol. Biol. 48:443，由Smith及Waterman修訂((1981)Adv. Appl. Math. 2:482))。簡言之，GAP程式將相似性定義為類似之所比對符號(亦即核苷酸或胺基酸)之數目除以兩個序列中之較短者中符號的總數。用於GAp程式之預設參數可包括：(1)一元比較矩陣(含有對於一致性為1及對於非一致性為0之值)及Gribskov等人(1986)Nucl. Acids Res. 14:6745之加權比較矩陣，如Schwartz及Dayhoff編,ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STR UCTURE, National Biomedical Research Foundation,第353-358頁(1979)所述；(2)對於各間隙之3.0罰分及對於各間隙中之各符號的另一0.10罰分；及(3)對於末端間隙無罰分。
因此，如本文中所使用，術語「一致性」或「同源性」表示測試多肽或聚核苷酸與參考多肽或聚核苷酸之間的比較。如本文中所使用，術語至少「與...90%一致(90% identical to)」係指相對於多肽之參考核酸或胺基酸序列90至99.99之一致性百分比。90%或更高程度之一致性指示如下事實，假定出於舉例目的，比較100個胺基酸之測試多肽與參考多肽長度，不超過測試多肽中之胺基酶的10%(亦即百分之十)不同於參考多肽中之胺基酸。可在測試聚核苷酸與參考聚核苷酸之間進行類似比較。該等差異可表示為隨機分布於多肽之整個長度內之點突變或其可在不同長度之一或多個位置處叢集至最大允許(例如10/100)胺基酸差異(約90%一致性)。將差異定義為核酸或胺基酸取代、插入或缺失。在約85-90%以上之同源性或一致性程度下，結果應與程式及間隙參數組無關；該等高一致性程度可易於通常藉由手動比對而不依賴於軟體來評估。
如本文中所使用，所比對序列(aligned sequence)係指使用同源性(相似性及/或一致性)來比對核苷酸或胺基酸之序列中的相應位置。典型地，比對相關性為50%或更大之兩個或兩個以上序列。一組比對序列(an aligned set of sequences)係指於相應位置處比對之2個或2個以上序列且可包括與基因組DNA序列比對之來源於RNA之比對序列，諸如EST及其他cDNA。
如本文中所使用，「引子(primer)」係指可於適當條件下(例如，在四種不同核苷三磷酸及諸如DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆轉錄酶之聚合劑存在下)在適當緩衝液中且於合適溫度下充當模板指導DNA合成之起始點的核酸分子。應瞭解某一核酸分子可充當「探針」及「引子」。然而，引子具有3'羥基以供延長。引子可用於多種方法中，包括(例如)聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)、逆轉錄酶(reverse-transcriptase，RT)-PCR、RNA PCR、LCR、多重PCR、鍋柄式PCR、捕捉PCR、表現PCR、3'及5' RACE、原位PCR、連接介導PCR及其他擴增方案。
如本文中所使用，「引子對(primer pair)」係指包括與欲擴增(例如藉由PCR)之序列的5'末端雜交之5'(上游)引子及與欲擴增之序列的3'末端之互補序列雜交之3'(下游)引子的一組引子。
如本文中所使用，「特異性雜交(specifically hybridizes)」係指藉由核酸分子(例如寡核苷酶)與標靶核酸分子之互補鹼基配對進行的黏接。熟習此項技術者熟悉影響特異性雜交之試管內及活體內參數，諸如特定分子之長度及組成。尤其與試管內雜交有關之參數進一步包括黏接及洗滌溫度、緩衝液組成及鹽濃度。移除非特異性結合核酸分子之例示性洗滌條件於高嚴格度下為0.1×SSPE、0.1% SDS、65℃，且於中等嚴格度下為0.2×SSPE、0.1% SDS、50℃。等效嚴格度條件為此項技術中所已知。熟習此項技術者可易於調整此等參數以達成適合於特定應用之核酸分子與標靶核酸分子之特異性雜交。當提及兩個核苷酸序列時，互補意謂兩個核苷酸序列能夠雜交，典型地相對核苷酸之間的錯配少於25%、15%或5%。必要時，將指定互補百分比。典型地，選擇兩個分子以使得其將於高嚴格度之條件下雜交。
如本文中所使用，與產物實質上一致意謂充分類似以便所關注之性質充分未改變以使可使用實質上一致產物來替代該產物。
如本文中所使用，亦應瞭解術語「實質上一致(substantially identical)」或「類似(similar)」如熟習相關技術者所瞭解隨情形而變化。
如本文中所使用，對偶基因變異體(allelic variant)或對偶基因變異(allelic variation)係指佔據同一染色體位點之基因的兩種或兩種以上替代形式中之任一者。對偶基因變異經由突變天然發生，且會導致群體中之表型多態現象。基因突變可為沉默突變(所編碼之多肽無變化)或可編碼具有改變之胺基酸序列的多肽。術語「對偶基因變異體」在本文中亦用於表示由基因之對偶基因變異體編碼的蛋白質。典型地，該基因之參考形式編碼來自物種之群體或單一參考成員之多肽的野生型形式及/或主要形式。典型地，包括物種間及物種內之變異體的對偶基因變異體典型地與來自同一物種之野生型及/或主要形式具有至少80%、90%或更高胺基酸一致性；一致性程度視基因及比較為種間或種內而定。通常，種內對偶基因變異體與野生型及/或主要形式具有至少約80%、85%、90%或95%或更高一致性，包括與多肽之野生型及/或主要形式具有96%、97%、98%、99%或更高一致性。本文中對對偶基因變異體之提及通常指在相同物種之成員中蛋白質之變異。
如本文中所使用，在本文中可與「對偶變異體(allelic variant)」互換使用之「對偶基因(allele)」係指基因或其部分之替代形式。對偶基因佔據同源樑色體上之同一基因座或位置。當個體具有基因之兩個一致對偶基因時，該個體稱為對於該基因或對偶基因為純合的。當個體具有基因之兩個不同對偶基因時，該個體稱為對於該基因為雜合的。特定基因之對偶基因可在單一核苷酸或若干核苷酸中互不相同，且可包括核苷酸之取代、缺失及插入。基因之對偶基因亦可為含有突變之基因形式。
如本文中所使用，物種變異體(species variant)係指在不同物種中多肽之變異體，該等物種包括不同哺乳動物物種，諸如小鼠及人類。
如本文中所使用，剪接變異體(splice varian)係指藉由產生一種以上類型之mRNA的對基因組DNA之初級轉錄物的差異加工所產生之變異體。
如本文中所使用，修飾係指對多肽之胺基酸序列或核酸分子中之核苷酸序列的修飾且分別包括胺基酸及核苷酸之缺失、插入及置換。修飾多肽之方法對於熟習此項技術者而言為常規的，諸如藉由使用重組DNA方法。
如本文中所使用，術語啟動子(promoter)意謂含有提供RNA聚合酶結合及轉錄啟始之DNA序列之基因部分。啟動子序列通常(但並不始終)存在於基因之5'非編碼區中。
如本文中所使用，經分離或經純化之多肽或蛋白質或其生物學活性部分實質上不含細胞物質或來自蛋白質所來源之細胞或組織的其他污染蛋白質，或當以化學方式合成時實質上不含化學前軀體或其他化學物質。可確定製劑實質上不含雜質，若其藉由熟習此項技術者用來評估該純度之標準分析方法所測定時似乎不含可易於偵測之雜質，諸如薄層層析法(thin layer chromatography，TLC)、凝膠電泳及高效液相層析法(high performance liquid chromatography，HPLC)；或足夠純以使得進一步純化不會可偵測地改變物質之物理及化學性質，諸如酶促及生物學活性。純化化合物以產生實質上化學純化合物之方法為熟習此項技術者所已知。然而，實質上化學純化合物可為立體異構體之混合物。在該等情況下，進一步純化可增加化合物之比活性。
術語實質上不含細胞物質包括蛋白質自其所分離或重組產生之細胞的細胞組份分離之蛋白質製劑。在一具體實例中，術語實質上不含細胞物質包括具有少於約30%(以乾重計)之非酵素蛋白質(本文中亦稱為污染蛋白質)、通常少於約20%之非酵素蛋白質或10%之非酵素蛋白質或少於約5%之非酵素蛋白質的酵素蛋白質之製劑。當重組產生酵素蛋白質時，其亦實質上不含培養基，亦即培養基佔少於約或少於20%、10%或5%之酵素蛋白質製劑的體積。
如本文中所使用，術語實質上不含化學前軀體或其他化學物質(substantially free of chemical precursors or other chemicals)包括蛋白質自蛋白質合成所涉及之化學前軀體或其他化學物質分離的酵素蛋白質之製劑。該術語包括具有少於約30%(以乾重計)、20%、10%、5%或更少之化學前軀體或非酵素化學物質或組份之酵素蛋白質之製劑。
如本文中所使用，關於(例如)合成核酸分子或合成基因或合成肽之合成係指藉由重組方法及/或藉由化學合成方法產生之核酸分子或多肽分子。
如本文中所使用，藉由重組方法藉由使用重組DNA方法來製備意謂使用分子生物學之熟知方法來表現由經選殖DNA編碼之蛋白質。
如本文中所使用，載體(vector)(或質體(plasmid))係指用於將異源核酸引入細胞中以供其表現或複製之不連續元件。該等載體典型地保持游離型，但可經設計以實現基因或其部分整合於基因組之染色體中。亦涵蓋為人工染色體之載體，諸如酵母人工染色體及哺乳動物人工染色體。該等運載體之選擇及使用為熟習此項技術者所熟知。
如本文中所使用，表現載體包括能夠表現DNA之載體，該DNA係與能夠實現該等DNA片段之表現的調節序列(諸如啟動子區域)操作性連接。該等其他區段可包括啟動子及終止子序列，且視情況可包括一或多個複製起點、一或多個可選擇標誌、增強子，聚腺苷酸化信號及其類似物。表現載體通常來源於質體或病毒DNA，或可含有兩者之元件。因此，表現載體係指在引入適當宿主細胞中後使得所選殖DNA表現的重組DNA或RNA構築體，諸如質體、噬菌體、重組病毒或其他載體。適當表現載體為熟習此項技術者所熟知且包括可在真核細胞及/或原核細胞內複製者及保持游離型者或整合於宿主細胞基因組中者。
如本文中所使用，載體亦包括「病毒載體(virus vector/viral vector)」。病毒載體為操作性連接於外源基因以將該等外源基因轉移(以運載體或穿梭體形式)至細胞中之工程化病毒。
如本文中所使用，當提及DNA區段時可操作或操作性連接意謂該等區段經排列以便其一齊起作用以實現其預定目的，例如轉錄在啟動子中啟始且自編碼區段進行至終止子。
如本文中所使用，術語評估(assessing)意欲包括在獲得樣品中存在之蛋白酶或其域之活性的絕對值且亦獲得指示活性程度之指數、比率、百分比、可見或其他值之意義上的定量及定性測定。評估可為直接或間接評估且當然實際偵測之化學物質無需自身為蛋白水解產物，但可例如為其衍生物或一些其他物質。舉例而言，諸如藉由SDS-PAGE及使用庫馬斯藍(Coomasie blue)之蛋白質染色偵測補體蛋白之裂解產物。
如本文中所使用，生物學活性(biological activity)係指化合物之活體內活性或活體內投予化合物、組成物或其他混合物後所產生之生理學反應。因此，生物學活性涵蓋該等化合物、組成物及混合物之治療作用及醫藥活性。生物學活性可在經設計以測試或使用該等活性之試管內系統中觀察到。因此，出於本文之目的，蛋白酶之生物學活性為其水解多肽之催化活性。
如本文中所使用，當提及兩個核酸序列時，等效意謂該所述兩個序列編碼相同胺基酸序列或等效蛋白質。當提及兩種蛋白質或肽時使用等效時，其意謂該兩種蛋白質或肽具有實質上相同的胺基酸序列，僅具有不實質上改變蛋白質或肽之活性或功能的胺基酸取代。當等效係指性質時，該性質並不需要相同程度地存在(例如，兩種肽可展現不同速率之相同類型之酵素活性)，但該等活性通常實質上相同。
如本文中所使用，「調節(modulate/modulation)」或「改變(alter)」係指分子(諸如蛋白質)之活性的變化。例示性活性包括(但不限於)生物學活性，諸如信號轉導。調節可包括活性增強(亦即上調或促效劑活性)、活性降低(亦即下調或抑制)或活性之任何其他變化(諸如週期性、頻率、持續時間、動力學或其他參數之變化)。調節可與環境相關且典型地將調節比作指定狀況，例如野生型蛋白質、組成性狀態之蛋白質或表現於指定細胞類型或條件中之蛋白質。
如本文中所使用，組成物(composition)係指任何混合物。其可為溶液、懸浮液、液體、粉末、糊狀物、水溶液、非水溶液或其任何組合。
如本文中所使用，組合(combination)係指兩種或兩種以上物品之間或之中的任何結合。該組合可為兩種或兩種以上分開的物品，諸如兩種組成物或兩種收集物，可為其混合物，諸如兩種或兩種以上物品之單一混合物，或其任何變化形式。組合之成份通常功能上相關或有關。
如本文中所使用，套組(kit)為包裝組合，其視情況包括其他成份(諸如其他試劑)及該組合或其成份之使用說明書。詳言之，出於本文之目的，「套組」係指本文所提供之可活化的基質降解酵素與另一物品之組合以實現包括(但不限於)活化、投藥、診斷及評估生物學活性或性質之目的。套組視情況包括使用說明書。
如本文中所使用，「疾病或病症」係指由包括(但不限於)感染、後天性條件、遺傳條件之病因或條件引起且特徵為可鑑別症狀之生物體的病理學病狀。本文所關注之疾病及病症為涉及ECM之組份者。
如本文中所使用，ECM介導之疾病或病狀為任一或多種ECM組份與病理學或病源學有關之疾病或病狀。出於本文之目的，ECM介導之疾病或病狀包括由一或多種ECM組份之沈積或積累增加引起之彼等疾病或病狀。該等病狀包括(但不限於)脂肪團、杜普宜特朗氏症候群、帕榮雷氏病、凍肩、現有瘢痕(諸如瘢痕瘤)、硬皮病及淋巴水腫。
如本文中所使用，「治療(treating)」患有疾病或病狀之個體意謂在治療後該個體之症狀部分或完全減輕，或保持不變。因此，治療涵蓋預防、治療及/或治癒。預防係指預防潛在疾病及/或預防症狀惡化或疾病進展。治療亦涵蓋本文所提供之經修飾之干擾素及組成物的任何醫藥用途。
如本文中所使用，醫藥有效藥劑(pharmaceutically effective agent)包括任何治療劑或生物活性劑，其包括(但不限於)例如麻醉劑、血管收縮劑、分散劑、習知治療藥物(包括小分子藥物)及治療性蛋白質。
如本文中所使用，治療(treatment)意謂緩解或有利地以其他方式改變病狀、病症或疾病或其他適應症之症狀的任何方式。
如本文中所使用，治療作用(therapeutic effect)意謂由治療個體引起之改變、典型地改善或緩解疾病或病狀之症狀或治癒疾病或病狀的作用。治療有效量係指在向個體投藥後產生治療作用之組成物、分子或化合物之量。
如本文中所使用，術語「個體」係指動物，包括哺乳動物，諸如人類。
如本文中所使用，患者係指人類個體。
如本文中所使用，藉由治療、諸如藉由投予醫藥組成物或其他治療劑來緩解特定疾病或病症之症狀係指可歸因於投予組成物或治療劑或與投予組成物或治療劑相關之症狀的任何減輕(無論為持久性或暫時性、持續或瞬時)。
如本文中所使用，預防(prevention/prophylaxis)係指降低發展疾病或病狀之危險的方法。
如本文中所使用，有效量為預防、治癒、緩解、阻止或部分阻止疾病或病症之症狀所必需之治療劑的量。
如本文中所使用，單位劑型(unit dose form)係指適合於人類及動物個體且如此項技術中已知個別包裝之物理離散單位。
如本文中所使用，單劑量調配物(single dosage formulation)係指用於直接投藥之調配物。
如本文中所使用，「製品(article of manufacture)」為製造及出售之產品。如本申請案中通篇所使用，該術語意欲涵蓋包裝物品中所含之可活化的基質降解酵素。
如本文中所使用，流體(fluid)係指可流動之任何組成物。因此，流體涵蓋呈半固體、糊狀物、溶液、水性混合物、凝膠、洗劑、乳膏及其他此類組成物之形式的組成物。
如本文中所使用，細胞萃取物或溶解物(cellular extract or lysate)係指由溶解或碎裂之細胞製成之製劑或部分。
如本文中所使用，動物包括任何動物，諸如(但不限於)靈長類動物，包括人類、大猩猩及猴子；齧齒動物，諸如小鼠及大鼠；家禽，諸如雞；反芻動物，諸如山羊、母牛、鹿、綿羊；羊類，諸如豬及其他動物。非人類動物不包括人類作為所涵蓋之動物。本文所提供之酵素來自任何來源，動物、植物、原核生物及真菌。大多數酵素具有動物來源，包括哺乳動物來源。
如本文中所使用，對照(control)係指與測試樣品實質上一致之樣品，其例外之處在於其未以測試參數處理，或若其為血漿樣品，則其可來自未感染所關注之病狀的正常志願者。對照亦可為內部對照。
如本文中所使用，除非上下文另外明確規定，否則單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數個指示物。因此，舉例而言，對包含「細胞外域」之化合物的提及包括具有一個或複數個細胞外域之化合物。
如本文中所使用，範圍及量可以「約(about)」特定值或範圍來表示。約亦包括精確量。因此，「約5個鹼基」意謂「約5個鹼基」以及「5個鹼基」。
如本文中所使用，「可選(optional)」或「視情況(optionally)」意謂隨後所述事件或情況出現或不出現且描述包括該事件或情況出現之情況及其不出現之情況。舉例而言，視情況經取代之基團(optionally substituted group)意謂該基團未經取代或經取代。
如本文中所使用，除非另外指示，否則任何保護基、胺基酸及其他化合物之縮寫根據其常見用途為公認的縮寫或IUPAC-IUB生物化學命名委員會(Commission on Biochemical Nomenclature)(參見(1972)Biochem. 11:1726)。
B.　細胞外基質
本文提供以時間受控方式降解細胞外基質(ECM)之一或多種蛋白質組份之可活化的基質降解酵素(AMDE)。藉助於該靶向及暫時性活體內活化，可治療ECM之疾病及/或病狀。可活化的基質降解酵素可降解ECM之任何組份；酵素選擇可視所靶向組份及/或欲治療之特定疾病或病狀而定。
ECM構成包圍細胞外空間及血管與淋巴系統之結締組織或間質，從而提供對不同組織及不同組織之間的機械及結構支撐。ECM之複雜及動力學微環境代表結締組織(諸如皮膚)中之結構及信號傳輸系統。由於ECM之複雜性質，其可發揮多種功能，諸如提供對於細胞之支撐及固著、隔開組織、調節細胞間通訊及隔離細胞生長因子。ECM之組織化或構成之缺陷或改變可造成許多疾病或病狀。舉例而言，膠原纖維之合成、降解及組織化之改變造成脂肪代謝障礙(例如脂肪團)及淋巴水腫。
ECM由以下各者組成：纖維結構蛋白，諸如膠原蛋白；多醣，諸如蛋白聚糖及玻尿酸；及使基質之組份彼此連接及連接於細胞之黏著蛋白。諸如腱及軟骨之一些結締組織主要由ECM構成。然而，構成皮膚之結締組織的ECM亦與纖維母細胞、血管及其他組份一起分布。ECM亦充當水及其溶解組份自血漿移動至淋巴之空間。間質液幾乎與細胞質等張且為經緩衝之碳酸氫鹽，從而提供處於中性pH值之細胞外環境。
1.　ECM之組份
ECM(亦稱為間隙基質)為含有諸多結構大分子(包括纖維狀蛋白，諸如膠原蛋白、彈性蛋白及纖維結合蛋白)之複雜三維動態結構，其中葡糖胺聚糖(GAG)形成水合凝膠狀物質。ECM之組份由固有細胞(典型地為纖維母細胞或纖維母細胞家族之細胞)產生，且經由其與ECM之其他組份相互作用之胞吐作用分泌。產生多種結締組織，諸如骨、皮膚或角膜在於相對量及組份組織化並共同形成之方式的變化(Albert等人,「Cell Junctions,Cell Adhesions and the Extracellular Matrix.」Molecular Biology of the Cell . New York:Garland Publishers,1994.第972頁.)。
a.　膠原蛋白
膠原蛋白為結締組織(諸如皮膚)之主要結構組份，且在組織結構、組織強度及細胞-細胞相互作用之發展及維持中起作用。膠原蛋白包括ECM之含有一或多個具有膠原蛋白三股螺旋之構形的域之結構相關蛋白質之家族(Van der Rest等人(1991)FASEB J.,5:2814-2823)。膠原蛋白含有Gly-X-Y重複結構，其使得膠原蛋白鏈捲曲成螺旋結構。各膠原蛋白分子含有彼此捲繞以形成三股螺旋之3條鏈，稱為α1-α3。該三股螺旋結構向膠原蛋白分子提供高機械強度。存在至少27種不同類型之膠原蛋白，其在胺基酸序列及鏈組成方面不同。舉例而言，視膠原蛋白之類型而定，形成三股螺旋之3條鏈可相同或不同。膠原蛋白可為同源三聚體(亦即三股螺旋之所有3條多肽鏈由相同膠原蛋白構成)或可為異型的(亦即原纖維由一種以上膠原蛋白類型組成)。膠原蛋白可分為若干個家族，其視其形成之結構而定。此等家族包括纖維狀膠原蛋白(亦稱為間質膠原蛋白；例如I型、II型、III型、V型及XI型)及非纖維狀膠原蛋白，諸如斷續三股螺旋纖維結合膠原蛋白(facit)(例如IX型、XII型、XIV型)、短鏈(例如VIII型、X型)、基底膜(例如IV型)及其他膠原蛋白(例如VI型、VII型及XIII型)。下表2陳述常見膠原蛋白類型及其代表性位置(Van der Rest等人(1991)FASEB J.,5:2814-2823)；www.collagenlife.com/page_1167323108078.html；www.indstate.edu/thcme/mwking/extracellularmatrix.html)。
在間質膠原蛋白中，膠原蛋白分子結合形成具有特殊帶型之大原纖維。該帶型由相鄰分子之間的重疊產生。膠原纖維之強度係基於形成結締組織之緻密膠原纖維網之膠原纖維的許多分子內及分子間鍵聯。最常見纖維狀膠原蛋白包括I型、II型及III型膠原蛋白。I型膠原蛋白見於大多數結締組織中，諸如皮膚、骨、腱及角膜，且由兩條α1(I)鏈及一條α2(I)鏈構成([α1(I)]2 α2(I))。II型膠原蛋白為同源三聚體([α1(II)]3 )且主要見於軟骨中。III型膠原蛋白亦為同源三聚體([α1(III)]3 )且主要見於皮膚及血管中。
並非所有膠原蛋白均形成原纖維網。舉例而言，基底膜IV型膠原蛋白為非纖維狀且在螺旋中具有非螺旋間斷，其充當鉸鏈，從而給予分子更大可撓性。因此，IV型膠原蛋白形成由長絲網而非線性原纖維構成之薄片。
皮膚之最豐富蛋白質為膠原蛋白，其主要由皮膚之總膠原蛋白之I型(80-85%)及III型(8-11%)構成。I型膠原蛋白與III型膠原蛋白結合形成真皮之主要膠原纖維。皮膚之拉伸強度主要歸因於此等纖維狀膠原蛋白分子，其以頭接尾及交錯之邊對邊橫向排列方式組裝成微原纖維。膠原蛋白分子變為與相鄰膠原蛋白分子交聯，產生膠原纖維之額外強度及穩定性。舉例而言，V型膠原蛋白亦與I型/III型膠原纖維結合，且調節原纖維直徑。皮膚中之其他膠原蛋白類型包括(例如)IV型、VI型、VII型、XII型、XIV型及XVII型。
b.　彈性蛋白
ECM中之彈性纖維網向需要回彈性以在拉伸後彈回之組織(諸如皮膚、動脈及肺)提供可撓性。彈性纖維之主要組份為彈性蛋白分子，其與相鄰彈性蛋白分子形成交聯。此等分子形成彈性纖維之核心且由肌原纖維蛋白(fibrillin)覆蓋，肌原纖維蛋白為與彈性蛋白結合且對於彈性纖維之完整性至關重要的大醣蛋白。
c.　纖維結合蛋白
纖維結合蛋白為以一對由靠近羧基末端之一對二硫鍵聯接的兩個大亞單位形式存在之醣蛋白。各亞單位含有對於其他基質大分子及細胞表面上之受體具特異性的功能上不同之域。舉例而言，纖維結合蛋白上之不同域結合膠原蛋白(對於I型、II型及III型為分開的域)、肝素(heparin)、纖維蛋白及細胞表面受體(諸如整合素(integrin))。纖維結合蛋白存在於血漿與組織中。在組織中，纖維結合蛋白起將不同類型之ECM分子與細胞連接在一起的作用。其亦含有由三個胺基酸Arg-Gly-Asp(RGD)構成之重要細胞結合域，此域由細胞之質膜中的整合素受體識別。纖維結合蛋白分子與細胞上之整合素受體的結合產生對信號傳輸路徑之刺激，促進細胞黏附、遷移及分化。此等特徵使得纖維結合蛋白在細胞黏著中發揮重要作用且在細胞與ECM組份之間傳遞信號。
d.　葡糖胺聚糖(GAG)
GAG為由強親水性重複雙醣單元構成之非支鏈多醣鏈。GAG高度帶負電且因此吸引滲透活性Na+ ，引起大量水吸入其結構中以保持ECM水合。諸如硫酸皮膚素(dermatan sulfate)之GAG典型地含有自線性蛋白質核心分枝之長度為70-200個糖之多條葡糖胺聚糖鏈(由重複雙醣單元形成)。此使得GAG相對於其質量佔據極大體積且於極低濃度下形成凝膠。GAG之親水性引起膨脹壓力或膨壓，此使得ECM經受壓縮力。
在ECM中，GAG連接於ECM蛋白質以形成蛋白聚糖，或在玻尿酸(hyaluronic acid)(亦稱為玻尿酸(hyaluronan))之情況下以非蛋白聚糖基質組份形式存在。細胞外蛋白聚糖為輔助ECM中之墊細胞之大的高度水合分子。諸如玻尿酸之葡糖胺聚糖藉由對流過間質膠原性基質之大量流體流經由其黏度及水合水形成障壁而有助於「基底物質」。蛋白聚糖及非蛋白聚糖GAG在ECM中結合形成大聚合複合物。其相互結合，且亦與諸如膠原蛋白之纖維狀蛋白結合。
i.　蛋白聚糖
存在形成ECM之蛋白聚糖的三種主要類型之GAG，包括硫酸皮膚素及硫酸軟骨素、肝素及硫酸乙醯肝素及硫酸角質素。通常，蛋白聚糖為95重量%碳水化合物，典型地呈長的未分枝GAG鏈之形式。除提供細胞周圍之水合空間外，蛋白聚糖亦調節分子及細胞之運輸，結合信號傳輸分子，從而在細胞活化中起作用，並結合諸如蛋白酶及蛋白酶抑制劑之其他分泌蛋白質以調節分泌蛋白質之活性(Albert等人，「Cell Junctions,Cell Adhesions and the Extracellular Matrix.」Molecular Biology of the Cell . New York:Garland Publishers,1994.第972-978頁.)。舉例而言，蛋白聚糖之硫酸肝素鏈與若干不同生長因子結合，包括纖維母細胞生長因子(fibroblast growth factor，FGF)，從而有助於其與其特異性細胞表面受體結合。
聚集蛋白聚糖(aggrecan)為主要含有硫酸軟骨素及硫酸乙醯肝素GAG之蛋白聚糖，且典型地見於軟骨中，與玻尿酸形成大聚集體以提供機械支撐。核心蛋白聚糖(decorin)為主要由硫酸軟骨素及硫酸皮膚素GAG構成之結締組織的另一例示性GAG。其與I型膠原原纖維結合。基底膜蛋白聚糖(perlecan)及β聚糖(betaglycan)為ECM之其他例示性蛋白聚糖。並非所有蛋白聚糖均與ECM結合：舉例而言，絲甘蛋白聚糖(serglycin)與有助於包裝及儲存分泌分子之分泌小泡結合，且多配體蛋白聚糖(syndecan)見於細胞表面上且充當輔助受體(Albert等人,「Cell Junctions,Cell Adhesions and the Extracellular Matrix.」Molecular Biology of the Cell . New York:Garland Publishers,1994.第972-978頁)。
硫酸乙醯肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycan，HSPG)為與多種脊椎動物及無脊椎動物組織之細胞的細胞表面及細胞外基質(ECM)結合之普遍存在的大分子(Wight,T. N.,Kinsella,M. G.,及Qwarnstromn,E. E.(1992)Curr .Opin .Cell Biol .,4,793-801；Jackson,R. L.,Busch,S. J.,及Cardin,A. L.(1991)Physiol .Rev .,71,481-539；Wight,T. N.(1989)Arteriosclerosis ,9,1-20;Kjellen，L.及Lindahl,U.(1991)Annu .Rev .Biochem .,60,443-475；及Ruoslahti,E.及Yamaguchi,Y.(1991)Cell ,64,867-869)。基礎HSPG結構由蛋白質核心組成，若干線性硫酸乙醯肝素鏈共價連接於該蛋白質核心。多醣鏈典型地由在不同程度上經N-及O-連接型硫酸酯部分及N-連接型乙醯基取代之重複己醣醛酸及D-葡糖胺雙醣單元構成。對ECM分子參與細胞黏附、生長及分化之研究揭露HSPG在胚胎形態發生、血管生成、癌轉移、神經突外生長及組織修復中之主要作用。在其結合眾多蛋白質之能力方面獨特的硫酸乙醯肝素(heparansulfate，HS)鏈確保多種效應分子黏著於細胞表面。HSPG亦為血管之主要組份。在大血管中，其主要集中於內膜及內介質中，而在毛細管中其主要見於內皮下基底膜中，在此處其支持內皮細胞增殖及遷移且使毛細管壁之結構穩定。HSPG與ECM大分子(諸如膠原蛋白、層黏蛋白(laminin)及纖維結合蛋白)及與質膜上之不同連接位點相互作用之能力表明此蛋白聚糖在自組裝及ECM組份之不溶性以及在細胞黏著及移動方面的關鍵作用。
ii.　玻尿酸
玻尿酸(hyaluronic acid)(HA；亦稱為玻尿酸(hyaluronan))為吸引水之大GAG，且當與水結合時以黏性凝膠狀形式存在。因此，HA充當潤滑劑，使凝膠狀結締組織結合在一起。HA為雙醣之聚合物(長度有時多達25,000個重複)且由兩個經修飾之簡單糖葡糖醛酸及N-乙醯基葡糖胺之重複單元組成。HA為許多結締組織之ECM的部分。HA以最大量見於皮膚中，幾乎為見於皮膚中之身體HA之50%。HA藉由結合水而向皮膚提供連續水份。HA之產生降低(諸如因年齡)導致皮膚起皺且不健康。
HA主要經由其受體CD44亦在胚胎發育及形態發生、創口癒合、修復及再生、炎症及腫瘤發展及侵襲期間起調控細胞行為之作用(Harada等人(2006)J. Biol. Chem. ,8:5597-5607)。HA由玻尿酸酶降解。HA之降解產物可以增加量見於損傷或生長組織中，且見於多種發炎性病狀中。HA片段促進血管生成且可刺激組織損傷及皮膚移植中之巨噬細胞及樹突狀細胞產生細胞激素。
2.　皮膚組織學
皮膚由若干不同層組成，主要為表皮及真皮。表皮為來源於外胚層之特化上皮，且在其下方為真皮，其為中胚層之衍生物並為血管緻密結締組織。此兩個層相互牢牢黏著且形成在身體之不同區域總厚度自約0.5mm至4mm變化之區域。在真皮下方為一層疏鬆結締組織，其在性質上自網形結締組織至脂肪不同。將其稱為下皮，但典型地認為其並非皮膚之部分。真皮藉由自一層延伸至另一層之連接組織纖維連接於下皮。
a.　表皮
表皮為直接位於真皮上方之皮層，且為皮膚之表面層。表皮之基本功能在於充當針對失水、化學損傷及侵襲性病原體之防護障壁。表皮為約0.1毫米至1.5毫米厚之約15個細胞層之薄層，其主要由角質細胞構成(Inlander,Skin,New York,N.Y.:People’s Medical Society,1-7(1998))。表皮自身根據角質細胞之分化狀況分成若干層(例如基層、棘狀層、顆粒層、透明層、角質層)。角質細胞來源於基底層中之角質細胞幹細胞。當角質細胞生長及分裂時，其經歷逐漸分化，最終達到其形成一層稱為鱗狀細胞(稱為角質細胞)之無核、平坦、高度角質化細胞的角質層。除由角質細胞構成外，角質層亦含有皮脂。皮脂由皮脂腺分泌，其通常見於連接於毛囊之毛髮覆蓋區域中。皮脂為有助於使角質細胞結合在一起且保持水份之微酸性層。此酸度歸因於構成皮脂之兩性胺基酸、乳酸及脂肪酸之存在。因此，皮膚表面之pH值通常介於5與6之間，典型地為約5.5。皮脂起使毛髮及皮膚防水之作用，及使其不會變乾、變脆及開裂，並且其亦抑制皮膚上微生物之生長。術語「酸罩(acid mantle)」係指皮膚之大部分區域上存在水溶性物質。
b.真皮
皮膚之結締組織稱為真皮。真皮為1.5毫米至4毫米厚。在皮膚中，真皮含有ECM組份；主要蛋白質組份為膠原蛋白及彈性蛋白。真皮亦為大多數皮膚結構之所在地，包括經由稱為毛孔之皮膚開口分泌物質的汗腺及脂腺、或粉刺、毛囊、神經末梢及血管與淋巴管(Inlander, Skin, New York,N.Y.：People's Medical Society,1-7(1998))。
c.下皮
在真皮下方為下皮，其為脂肪層且為皮膚之最深層。其既充當保存身體熱量之隔離物，亦充當保護器官之減震器(Inlander,Skin,New York,N.Y.：People's Medical Society,1-7(1998))。另外，下皮亦儲存脂肪用於能量儲備。
3.ECM之疾病
某些疾病及病狀由因ECM組份之異常表現或產生所致之細胞外基質之結構的缺陷或變化引起。舉例而言，在一些發炎性病狀(諸如在創口癒合之後出現)中，分泌刺激纖維母細胞分泌ECM組份(諸如膠原蛋白)之細胞激素。ECM組份積累且變得局部沈積，導致多種纖維變性病狀。基質沈積為許多慢性發炎性疾病及其他疾病及病狀之常見特點。此等病狀包括膠原蛋白介導之疾病及病狀，諸如(但不限於)諸如瘢痕瘤及肥厚性瘢痕之瘢痕、杜普宜特朗氏症候群、帕榮雷氏病及淋巴水腫。脂肪團亦為ECM之主要疾病，除脂肪形成增加外，其特徵亦在於結締組織基質之變化導致膠原蛋白之異常纖維中隔網(Rawlings等人(2006)Int. J Cos. Science,28:175-190)。
特徵在於基質組份之異常表現或過量產生、導致其積累及不當沈積的ECM之疾病及病狀可藉由本文所提供之可活化的基質降解酵素來治療。由於活體內投藥之後該等酵素之暫時性活化，調節該等疾病及病狀之治療以限制基質組份之酶促降解。舉例而言，藉由限制基質降解之作用持續時間，使與不受控蛋白質降解相關的不當副作用降至最少。
C.　基質降解酵素
本文提供含有可活化的基質降解酵素之組成物、組合及容器，及使用可活化的基質降解酵素治療ECM介導之疾病或病狀的方法。基質降解酵素降解ECM之蛋白質組份或醣蛋白，包括(但不限於)膠原蛋白、彈性蛋白、纖維結合蛋白及蛋白聚糖。藉助於其裂解一或多種ECM組份之能力，本文所提供之可活化的基質降解酵素可用於改良組織之基質，尤其展現由一或多種ECM蛋白質之過量或富含一或多種ECM蛋白質(諸如膠原蛋白)之纖維組織的不當積累引起之結構缺陷或變化的彼等基質。因此，該等酵素適用於治療涉及ECM蛋白質之疾病或病狀。
基質降解酵素為蛋白酶及糖基水解酶。因此，基質降解酵素包括作為識別標靶蛋白質中之胺基酸序列或多肽受質的蛋白質降解酵素以及識別諸如酯鍵或糖基之非肽鍵的水解酶之蛋白質。蛋白酶為絲胺酸、半胱胺酸、天冬胺酸及金屬蛋白酶家族之外蛋白酶(exoprotease)。在識別受質序列之後，蛋白酶催化標靶蛋白質之水解或裂解。視標靶序列之全長序列範圍內之肽鍵的位置而定，標靶蛋白質之該水解可使標靶失活，或在一些情況下活化標靶。
蛋白酶使用若干不同類型之催化機制(Barret等人(1994)Meth. Enzymol. 244:18-61；Barret等人(1994)Meth. Enzymol 244:461-486；Barret等人(1994)Meth. Enzymol. 248:105-120；Barret等人(1994)Meth. Enzymol. 248:183-228)。根據其催化機制，將裂解肽鍵之蛋白酶再分為絲胺酸、半胱胺酸、天冬胺酸、蘇胺酸及金屬蛋白酶。絲胺酸型肽酶(peptidase)具有參與活性中心之絲胺酸殘基，天冬胺酸型肽酶在催化中心中具有兩個天冬胺酸，半胱胺酸型肽酶具有半胱胺酸殘基，蘇胺酸型肽酶具有蘇胺酸殘基，且金屬肽酶在催化機制中使用金屬離子。蛋白酶之催化活性為裂解標靶受質所需。絲胺酸及金屬蛋白酶於中性pH值下最具活性，而主要見於溶酶體中之半胱胺酸及天冬胺酸蛋白酶具有酸性pH值最佳條件。因此，溶酶體蛋白酶包括半胱胺酸及天冬胺酸蛋白酶家族之蛋白酶。其他酵素家族包括水解酶，諸如作用於酯鍵之酯酶及水解O-糖基化合物或S-糖基化合物或N-糖基化合物之乙二醇酯酶(glycolase)。糖基水解酶之實例為肝素酶。
例示性基質降解酵素闡明於表3中(參見例如，Chapman等人,Am J. Physiol Heart Circ. Physiol. (2004)286:1-10；Iozzo RV,Proteoglycans:Structure,biology,and Molecular Interactions, CRC press(2000),第94-96頁；Owen等人(1999)J. Leuk. Biol.,65:137-150；Buhling等人(2004)Eur. Respir. J. ,23:620-628；Thomas Kreis and Ronald Cale,Extracellular Matrix,Anchor and Adhesion Proteins ,Oxford University Press(1999)第515-523頁；Ian M. Clark及Gillian Murphy. 「Matrix Proteinases,」於Dynamics of Bone and Cartilage Metabolism中,Academic Press(2006),第181-198頁；Buck等人(1992)Biochem J.,282:273-278)。各例示性蛋白酶之前軀多肽的核苷酸序列(mRNA)及所編碼之胺基酸序列的序列識別符(SEQ ID NO)描述於表中。各例示性蛋白酶之蛋白原(proprotein)的胺基酸序列之序列識別符(SEQ ID NO)以及蛋白原中對應於肽原之胺基酸位置亦描述於表中。此項技術中已知之對偶基因及物種變異體及其他變異體中亦存在變化，且亦涵蓋該等變異體以用作可活化的酵素。該表亦闡明各酵素之例示性ECM標靶受質。對該等受質之提及僅供參考及例示，且不欲代表所有標靶受質之詳細清單。熟習此項技術者已知或可憑經驗使用常規檢定(正如本文所述之任何檢定)判定所需酵素之ECM標靶受質。
基質降解酵素可藉由此項技術中已知之任何方法(包括自天然來源分離，分離細胞、組織及生物體中重組產生之蛋白質)及藉由重組方法及藉由包括電腦(in silico)步驟之方法、合成方法及熟習此項技術者已知之任何方法產生或分離。酵素典型地以無活性形式產生或分離。條件性活化可如下文所述來達成。
1.　酵素活化
大多數蛋白酶係以無活性形式合成及分泌且需要進一步加工以變為具活性。活化典型地藉由暴露酵素活性位點之構形、空間或其他變化來達成。除鈣激活中性蛋白酶外，所有蛋白酶典型地以酵素原形式合成。酵素原活化防止蛋白酶始終以活性形式存在之情況下可能會出現之不當蛋白質降解。通常，酵素原含有空間上阻斷蛋白酶之活性位點且防止受質接近蛋白酶之活性位點的N-末端部分(或前區)。酵素原之前區的尺寸在2個殘基至150個殘基之範圍內。自前酵素原(preproenzyme)形式分泌之後，酵素原(含有前區)無活性。
以自體催化方式或藉由其他蛋白酶來蛋白水解移除酵素原之前區之後，酵素之活性位點得以暴露，產生成熟蛋白酶，且典型地導致活化。然而，在一些情況下，完全活化亦需要其他輔助因素。舉例而言，pH值變化引發半胱胺酸、天冬胺酶及金屬蛋白酶家族之酵素的活化。低pH值用於在酵素原轉化期間增加前區作為受質之敏感性或引起前區或酵素之構形變化(Jerala等人(1998)J Biol. Chem.,273:11498-11504)。諸如半胱胺酸及天冬胺酸蛋白酶家族之組織蛋白酶的溶酶體酵素在達成完全活化之前需要酸性條件。除pH值外，其他輔助因素亦包括(但不限於)鹽濃度、還原劑(諸如半胱胺酸、DTT及TCEP)、金屬離子(諸如鈣)、熱量或溫度。因此，存在多種酵素原轉化機制且該等機制在蛋白酶家族之間不同(參見例如，Khan等人(1998)Protein Science ,7:815-836；Khan等人(1999)PNAS,96:10968-10975)。舉例而言，常常由於藉由自體催化或其他蛋白酶之作用、pH值之變化或涉及輔助分子或離子或以上條件之組合或一或多者進行蛋白水解，發生酵素原轉化為活性酵素。對時間及作用位置之進一步控制通常藉由蛋白質抑制劑達成(Stroud等人(1977)Ann. Rev. Biophys. Bioeng.,6:177-93)。
a.　絲胺酸蛋白酶
包括分泌性酵素及隔離在細胞質儲存細胞器中之酵素的絲胺酸蛋白酶(SP)具有多種生理學作用，包括血液凝結、創口癒合、消化、免疫反應及腫瘤侵襲與轉移。許多絲胺酸蛋白酶降解細胞外基質之組份(參見上表2)。舉例而言，參與細胞外基質(ECM)之降解及重塑之蛋白酶有助於組織重塑，且為癌症侵襲及轉移所必需。
絲胺酸蛋白酶家族中之蛋白酶的活性取決於形成其活性位點之一組胺基酸殘基。該等殘基中之一者始終為絲胺酸；因此，其稱為絲胺酸蛋白酶。由絲胺酸蛋白酶裂解標靶蛋白質之機制係基於絲胺酸對所靶向肽鍵之親核性攻擊。催化性絲胺酸與受質之易斷肽鍵之羰基原子形成共價連接的四面體中間物。在許多情況下，基團之親核性質藉由組胺酸之存在而提高，由天冬胺酸保持於「質子受體狀態」。絲胺酸、組胺酸及天冬胺酸之對準側鏈形成為大多數絲胺酸蛋白酶所共有之催化性三合物。
大多數絲胺酸蛋白酶以呈前軀體形式之酵素原形式存在，且因此無活性。在蛋白酶之酵素原形式中，用於催化之活性位點與活性酵素相比經扭曲。事實上，絲胺酸蛋白酶為在酵素原與蛋白酶之活性形式之間在活性位點中具有構形差異的唯一蛋白酶家族。因此，催化性三合物以酵素原形式存在，但來自酵素原之扭曲環部分阻塞受質結合間隙。因此，受質多肽不會有效地結合，且不會發生蛋白水解。僅在活化之後，在此期間酵素原之構形及結構發生變化且打開活性位點，可進行蛋白水解。
絲胺酸蛋白酶於中性pH值下具活性。酵素原轉化在諸如藉由另一蛋白酶之高度特異性催化裂解或藉由自體活化進行之有限蛋白水解後進行。舉例而言，無活性凝血酵素原轉化為酵素(凝血酶)之活性形式係藉由另一凝固酶(因子Xa)對前區之高度特異性催化裂解而達成。其他絲胺酸蛋白酶使用類似機制，但活化裂解位點不同且因此絲胺酸蛋白酶典型地藉由不同轉化酶活化。
包括(但不限於)顆粒酶A及B、組織蛋白酶G、嗜中性白血球彈性蛋白酶、蛋白酶3及肥大細胞類胰蛋白酶及凝乳酶之顆粒相關絲肽酸蛋白酶需要雙重蛋白水解事件以便活化。此等酵素係以前酵素原形式合成；信號肽之裂解產生無活性之酵素原(proenzyme/zymogen)形式。顆粒相關絲胺酸蛋白酶於酵素之N-末端處含有二肽原(prodipeptide)，且亦含有羧基末端延伸部分，對於活化而言亦必須將其移除。該二肽原防止成熟酵素摺疊成催化活性形式。顆粒相關絲胺酸蛋白酶之活化係藉由羧基末端延伸部分與二肽原兩者之裂解而達成。組織蛋白酶C與至少一些顆粒相關絲胺酸蛋白酶中之二肽原之裂解有關(Kummer等人(1996)J Biol. Chem.,271:9281-9286)。
b.　半胱胺酸蛋白酶
半胱胺酸蛋白酶於其活性位點處含有Cys-His對，且其催化活化涉及半胱胺酸氫硫基。藉由相鄰組胺酸殘基使半胱胺酸氫硫基去質子化，隨後半胱胺酸對肽羰基碳進行親核性攻擊。使斯羧基末端連接於半胱胺酸硫醇之硫基酯為反應之中間物(相當於絲胺酸蛋白酶之醯基-酵素中間物)。半胱胺酸蛋白酶包括木瓜蛋白酶(papain)、組織蛋白酶、卡斯蛋白酶(caspase)及鈣激活中性蛋白酶。此等半胱胺酸蛋白酶之不同家族的活化機制不同。
i.　組織蛋白酶
木瓜蛋白酶樣半胱胺酸蛋白酶(包括組織蛋白酶)為因結構相似性與木瓜蛋白酶有關之硫醇依賴性內肽酶之家族。其形成具有標記為R及L(對於右及左而言)之兩個域的蛋白質且來自兩個域之環形成受質識別間隙。組織蛋白酶係以含有前區之酵素原形式合成；該前區充當N-末端抑制性前區。儘管成熟酵素之間存在約25%序列一致性，但前區展現極少序列相似性。前區起成熟酵素之有效抑制劑的作用。前區亦發揮其他功能，諸如在於中性pH值下合成及運輸期間在酵素之摺疊及穩定性方面起作用。
半胱胺酸蛋白酶家族之組織蛋白酶為溶酶體酵素且因此在低於pH 7下具最佳活性並在高於pH 7下變為無活性。組織蛋白酶係以無活性前軀體(亦即酵素原)形式合成，且藉由蛋白水解移除前區而活化。此使得產生單鏈酵素。通常，單鏈酵素可加工成含有重鏈及輕鏈之雙鏈形式。典型地，兩條鏈經由非共價相互作用或經由二硫橋結合在一起。因此，成熟組織蛋白酶以單鏈形式或以雙鏈形式存在。
前區之移除可藉由其他蛋白酶之活化或藉由於酸性pH值下自體催化活化來促進(Turk等人(2001)The EMBO Journal,20:4629-4633)。酵素原轉化過程之pH值依賴性由前區中之保守性鹽橋(例如，SEQ ID NO:62中所闡明之組織蛋白酶原(procathepsin)L中的Asp82p及Arg38p及Glu87p及Arg48p)來調節。藉由於較低pH值下使羧酸酯基質子化破壞鹽橋破壞前區之疏水性核心，從而使得前區自活性位點解離(Khan等人(1998)Protein Science ,7:815-836)。使鹽橋形成之殘基可在組織蛋白酶之間不同。舉例而言，組織蛋白酶原B使用替代性鹽橋相互作用以實現其pH值依賴性酵素原轉化(Coulombe等人(1996)EMBO J.,15:5492-5503)。
酸性pH值條件為成熟組織蛋白酶之活性所需；酵素原轉化自身對於酵素活性不足。除其用於活性之需求外，酸性pH值亦使酵素穩定。於較高pH值條件下組織蛋白酶之失活及不穩定係由活性位點-S- /H+ im-離子對之咪唑部分的去質子化及結構沿活性位點凹槽之「解鏈(unzipping)」引起(Dehrmann等人(1995)Arch. Biochem. Biophys.,324:93-98)。因此，大多數組織蛋白酶於酸性pH值下具有最佳活性及穩定性。舉例而言，組織蛋白酶B、F、H、K、L及V於酸性環境中具最佳活性且於中性pH值下僅具弱活性或無活性(Lutgens等人(2007)The FASEB J .,21:3029-3041)。一些組織蛋白酶(例如組織蛋白酶L)在於中性pH值下培養後快速喪失其活性。一些組織蛋白酶甚至在於中性pH值下培養後亦維持其酵素活性，且因此可於生理學條件下降解基質蛋白質。已發現組織蛋白酶C及S具有最高pH值穩定性，但組織蛋白酶K及V顯示中間物pH值穩定性。試管內研究已證明組織蛋白酶K可於中性pH值下降解原纖維蛋白質(Buhling等人(2004)Eur. Respir. J.,23:620-628)。
組織蛋白酶L
組織蛋白酶L(CatL)為屬於木瓜蛋白酶家族之溶酶體酸半胱胺酸蛋白酶。人類組織蛋白酶L基因編碼含有17個胺基酸之信號肽、96個胺基酸之前肽及220個胺基酸之成熟區域的333個胺基酸之半胱胺酸蛋白酶(參見SEQ ID NO:61及62與GenBank寄存編號P07711)。組織蛋白酶L亦包括對偶基因及物種變異體，及其他變異體。該等變異體之實例為SEQ ID NO:208至223及234中所闡明之任何變異體。組織蛋白酶L係以無活性酵素原形式合成，且類似其他蛋白酶，含有對應於SEQ ID NO:62中所闡明之胺基酸序列的胺基酸18-113之前肽。該前肽抑制酵素之蛋白水解活性。前肽區段亦起使酵素原穩定避免自中性至鹼性pH值之變性作用之作用(Coulombe等人(1996)The EMBOJ. ,15:5492-5503)。前肽之裂解藉由於酸性條件下自體加工而進行，從而產生具活性且於酸性條件下具有催化活性之成熟酵素。成熟組織蛋白酶L(SEQ ID NO:1中所闡明)可以約28kDa之單鏈形式形式及/或以約24kDa與4kDa(分別為重鏈與輕鏈)之雙鏈形式存在。組織蛋白酶L之對偶基因及物種變異體為已知的。例示性物種變異體為SEQ ID NO:208-223中所闡明之任何變異體，包括核酸及所編碼之多肽及其缺乏信號序列與前肽之成熟形式。例示性對偶基因變異體為SEQ ID NO:234中所闡明之任何變異體。
組織蛋白酶L主要定位於內體及溶酶體。成熟組織蛋白酶L之最佳蛋白水解能力係於約5.5之酸性pH值下達成，且其於中性pH值下無活性(Bohley P等人，「Intracellular Protein Turnover.」在S. Holzer及H. Tschcsche(編).Biological Functions of Proteinases ,第17-34頁中,Berlin:Springer-Verlag. 1979)。組織蛋白酶L之最佳pH值可受離子強度影響，且因此最佳pH值在緩衝液之間不同(Dehrmann等人(1995)Arch. Biochem. Biophys. ,324:93-98)。組織蛋白酶原L於中性及弱鹼性pH值條件下穩定，於該等條件下成熟組織蛋白酶L失活(Jerala等人(1998)J. Biol. Chem., 273:11498-11504)。
組織蛋白酶L降解蛋白質受質，包括(但不限於)膠原蛋白、IL-8前軀體、神經傳遞素前軀體(neurotransmitter precursor)、腦啡肽原(pro-enkephalin)及免疫球蛋白輕鏈相關(AL)澱粉樣蛋白(amyloid)沈積物及偶氮酪蛋白(azocasein)(Barret & Kirschke(1981)Methods Enzymol.,80:535-561；Mason等人,(1985)Biochem. J.,226:233-241)。CatL由Z-Phe-Ala-CHN2快速抑制。
ii.　鈣激活中性蛋白酶
鈣激活中性蛋白酶為Ca2+ 依賴性細胞質半胱胺酸蛋白酶，其以兩種主要形式μ-鈣激活中性蛋白酶(鈣激活中性蛋白酶1)及m-鈣激活中性蛋白酶(鈣激活中性蛋白酶2)存在。鈣激活中性蛋白酶受質包括細胞骨架蛋白質、信號轉導酵素、轉錄調控因子及整合膜蛋白。在ECM組份中，鈣激活中性蛋白酶降解纖維結合蛋白、玻璃連結蛋白及蛋白聚糖(Ian M. CLark及GiLLian Murphy. 「Matrix Proteinases,」在Dynamics of Bone and Cartilage Metabolism,Academic Press(2006),第181-198頁中)。
鈣激活中性蛋白酶以無活性雜二聚體(及約80kDa與約30kDa亞單位)形式存在，且需要Ca2+ 以供自體催化。μ-鈣激活中性蛋白酶及m-鈣激活中性蛋白酶在其對活化所需之Ca2+ 之敏感性方面不同；μ-鈣激活中性蛋白酶於低微莫耳鈣濃度下活化至其最大活性的一半，其大致為低於活化m-鈣激活中性蛋白酶所需之彼等濃度的數量級(Meyer等人(1996)Biochem. J,314:511-519)。活化之後，鈣激活中性蛋白酶之兩個亞單位經受有限自體分解，此移除N-末端前區且增加鈣敏感性。自體分解本身並不足以活化鈣激活中性蛋白酶，因為自體分解之蛋白酶仍需要鈣來裂解受質(Meyer等人(1996)Biochem. J. ,314:511-519)。因此，鈣激活中性蛋白酶之持續活化需要鈣之存在。鈣需求顯著高於生理學Ca2+ 濃度，其通常為1μM。舉例而言，試管內μ-鈣激活中性蛋白酶需要10-50μM之鈣濃度且m-鈣激活中性蛋白酶需要300-500μM之鈣濃度(Hosfield等人(1999)The EMBO J. ,18:6880-6889)。由於鈣需求，故鈣激活中性蛋白酶藉由區域性鈣通量及/或膜結合來調節(Molinari and Carafoli(1997)J Membr. Biol., 43:543-5.)。鈣可能誘發構形變化以暴露蛋白酶之活性位點。鈣激活中性蛋白酶抑制蛋白(calpastatin)為鈣激活中性蛋白酶之特異性細胞抑制劑。
c.　天冬胺酸蛋白酶
天冬胺酸鹽蛋白酶包括見於溶酶體中之已證明降解ECM組份的一些蛋白酶。此等蛋白酶中包括組織蛋白酶D及E。對於活性而言，兩個天冬胺酸殘基參與活性位點處之酸/鹼催化。在初始反應中，一個天冬胺酸接受來自活性位點H2 O之一個質子，其攻擊肽鍵之羰基碳。同時，另一天冬胺酸向肽羰基之氧提供一個質子。
天冬胺酸蛋白酶之酵素原形式含有帶正電之N-末端前區，其與該酵素之中心部分相互作用從而與帶負電區段形成鹽橋。由於前區之定位及鹽橋之形成，防止受質接近活性位點。酵素原轉化為活性酵素藉由於低pH值下破壞鹽橋來進行。暴露於低pH值使得Asp及Glu殘基之羧酸側鏈質子化，從而導致前區與成熟酵素之間的鹽橋不穩定。移除後，前區由活性酵素以自體催化方式降解。前區之後續水解確保活化不可逆，且所釋放之前區不會充當活性酵素之競爭性抑制劑。此外，轉化不需要其他輔助分子(Khan等人(1998)Protein Science ,7:815-836)。然而，類似半胱胺酸蛋白酶家族之組織蛋白酶，酸性pH值條件為成熟酵素之活性及穩定性所需。
d.　金屬蛋白酶
金屬蛋白酶(亦稱為鋅蛋白酶)包括消化酵素羧肽酶(carboxypeptidase)、由細胞分泌之各種基質金屬蛋白酶(matrix metalloprotease，MMP)、ADAM(解整合素(disintegrin)及金屬蛋白酶域)、ADAMTS(具有血小板反應蛋白基元之解整合素及金屬蛋白酶域)及溶酶體蛋白酶。包括ADAM及MMP之此等酵素在胚胎發育、細胞生長及增殖、發炎性反應、創傷修復、多發性硬化症、關節炎及癌症進展與轉移方面具有作用(Manzetti等人,(2003)J of Computer-Aided Mol. Design, 17:551)。大多數MMP(例如膠原酶)參與細胞外基質之降解，例如在組織重塑期間。舉例而言，此等酵素中之許多可裂解基底膜及細胞外基質之組份。
金屬蛋白酶於酵素之活性中心處含有催化活性所需之Zn++ 離子。金屬蛋白酶之活性位點處的鋅結合基元包括兩個組胺酸殘基，其咪唑側鏈為Zn++ 之配位體。在催化期間，Zn++ 促使活性位點處水分子的氧原子對羰基碳之親核性攻擊。活性位點鹼(羧肽酶中之麩胺酸殘基)藉由自攻擊水分子提取一個質子而促進此反應。通常，此等酵素於其活性位點處具有常見鋅結合基元(HExxHxxGxxH)，及在活性位點後之保守性甲硫胺酸轉角。組胺酸之任一者的突變消除催化活性。
金屬蛋白酶之酵素原形式含有長度為約80-100個殘基之前區。在酵素原形式中，成熟酵素之受質結合位點中的殘基與催化Zn++ 離子處於與活性形式相同之構形位置，且在酵素原轉化後並不改變。因為前區經定位以阻斷位點，由此防止接近受質，所以酵素無活性。酵素原轉化為活性酵素由前區自成熟酵素裂解引起。多種機制能夠啟動裂解事件，包括其他蛋白酶之作用、熱量、汞劑(例如乙酸4-胺基-苯汞酯)、SH反應劑、反應性氧及清潔劑(參見例如，Khan等人(1998)Protein Science ,7:815-836；Okada等人(1988)Biochem J .,254:731-741；Okada & Nakanashi(1989)FEBS Lett .,249:353-356；Nagase等人(1990)Biochemistry ,29:5783-5789；Koklitis等人(1991)Biochem J .,276:217-221；Springman等人(1990)PNAS ,87:364-8；Murphy等人(1997)Matrix Biol .,15:511-8)。
e.肝素酶
肝素酶為參與某些葡糖胺聚糖之分解代謝的糖基化酵素。其為裂解特異性鏈內位點處之硫酸乙醯肝素的內-β-葡糖醛酸酶。肝素酶為A族糖基水解酶(glycosyl hydrolase clan A，GH-A)之成員，其共用涉及兩個保守性酸性殘基、Glu225 處之假定質子供體及Glu343 處之親核體的常見催化機制(Hulett等人(2000)Biochemistry ,39:15659-15667)。T及B淋巴細胞、血小板、粒細胞、巨噬細胞及肥大細胞與內皮下細胞外基質(ECM)之相互作用與肝素酶活性對硫酸乙醯肝素之降解相關。
人類肝素酶cDNA編碼起初以前蛋白原(pre-pro-protein)形式合成之蛋白質，其具有在遷移至內質網(endoplasmic reticulum，ER)中後由信號肽酶移除之信號肽序列。所得65kDa酵素原形式進一步藉由蛋白水解裂解加工，使得切除插入6kDa片段，產生8kDa多肽及50kDa多肽，從而形成雜二聚體。成熟肝素酶之胺基酸序闡明於SEQ ID NO:156中。肝素酶活性及定位受到嚴格調節。舉例而言，酵素對於局部pH值之變化高度敏感，於存在於腫瘤附近及發炎部位中之酸性條件下發揮高酶促活性，其於生理學pH值下活性極小或無活性。因此，肝素酶介導之HS骨架的裂解為pH值依賴性過程；最大酶促活性於範圍為4至6.8之pH值下達成(Gilat等人(1995)J Exp. Med. ,181:1929-1934;Goldshmidt等人(2003)The FASEB J. ,17:1015-1025)。於生理學pH值下，肝素酶展現極小活性。pH值依賴性確保ECM之結構破裂限於較高酸性條件，諸如在內體中且於損傷或炎症部位處發生(McKenzie等人(2003)Biochem.J .,373:423-435)。
D.　可活化的基質降解酵素(AMDE)
基質降解酵素需要酵素原轉化以藉由裂解前區產生成熟酵素而活化。如以上所討論，許多基質降解酵素之活性亦需要一或多種其他活化條件之持續存在。該等活化條件之實例包括(但不限於)pH值、金屬離子、溫度、還原劑、氧化劑及鹽濃度。舉例而言，許多酵素之活性需要特定pH值或金屬離子濃度或鹽濃度或還原劑的存在。在一實例中，溶酶體酵素之活性需要酸性pH值條件。舉例而言，半胱胺酸及天冬胺酸家族之蛋白酶的組織蛋白酶之活性需要酸性pH值條件。肝素酶亦為積累於溶酶體中以在酸性環境中正常加工之溶酶體酵素。通常，酸性環境提供於溶酶體蛋白酶通常定位之酸性溶酶體中。在此環境外部，溶酶體蛋白酶無活性或活性較低且其活性需要外源性暴露於酸性pH值。在另一實例中，活化條件包括金屬離子濃度。舉例而言，鈣激活中性蛋白酶之活性需要足夠濃度的Ca2+ 。該酵素之活性在活化條件不存在之情況下為可逆的。
藉由利用對外源性活化條件之需求，可使可活化的基質降解酵素在活體內投藥後(例如向ECM投藥)在有限持續時間內暫時具活性。該等可活化的基質降解酵素僅當暴露於外源性活化條件時具活性。因為活化條件不存在於投藥位點處且必須外源性施用，所以活化條件將在活體內投予提供適當活化條件之活化劑後隨時間中和或耗散。因此，因為活化劑耗散或以其他方式中和，所以AMDE之活化在活體內投藥後為可逆的。舉例而言，AMDE之暫時性活化可在皮膚及其他組織之間質環境中藉由在不存在於投藥位點處之外源性活化條件(亦即活化劑)存在下投予AMDE而達成。典型地，該活化條件為在投予提供活化條件之活化劑之前不存在於ECM中的條件。因此，使可活化的基質降解酵素暴露於活化條件使得酵素在有限或預定時間內活化，因為活化條件在間質環境中耗散或中和。
因此，本文提供含有可活化的基質降解酵素之組成物、組合及容器，該等酵素在活體內投藥之後允許酵素在有限或預定時期內活化，在此期間酵素可發揮其生物作用。藉助於可活化的酵素之可逆活性，酵素變得失活，從而控制該等酵素之生物作用的持續時間。可活化的基質降解酵素係與提供活化條件之活化劑的組合提供及與其一起提供於容器中。另外，可活化的基質降解酵素及活化劑亦可與諸如麻醉劑、α腎上腺素劑或分散劑中之任一或多者的其他藥劑組合或以組合形式提供，諸如提供於容器中。可活化的基質降解酵素係以治療有效量提供，該量在投藥之後(諸如皮下投藥之後)在活化時降解ECM之一或多種組份。所得可活化的基質降解酵素可用作治療ECM介導之疾病或病狀的治療劑。
任何合成或自天然來源分離之基質降解酵素(諸如表3或本文其他地方所述者)、其對偶基因或物種變異體或其他變異體，或熟習此項技術者已知之任何酵素意欲用於本文所提供之組成物、組合、方法及設備中，只要該酵素由於需要活化條件而可活化即可。可活化的基質降解酵素係以呈單鏈或雙鏈形式之無活性形式(以酵素原或無活性成熟多肽形式)提供。舉例而言，甚至呈其成熟形式之組織蛋白酶亦無活性且其構形穩定性需要酸性pH值條件。可活化的基質降解酵素包括溶酶體蛋白酶，諸如半胱胺酸及天冬胺酸家族之組織蛋白酶及肝素酶。例示性可活化的基質降解酵素為SEQ ID NO:56、59、62、64、179、67、70、73、76、182、185、188、79、194、89、92、95及155中之任一者中所闡明的任何酵素及SEQ ID NO:57、60、1、65、180、68、71、74、77、183、186、189、80、195、90、93、96及156中所闡明之其成熟形式，或其對偶基因變異體或物種變異體或其他變異體。熟習此項技術者已知或可鑑別可活化的基質降解酵素。舉例而言，熟習此項技術者可使用酵素活化之常規檢定(諸如本文所提供及此項技術中已知之任何檢定)來評估任何所需酵素之持續或可逆活化對外源性活化條件之需求。
可活化的基質降解酵素可經修飾以改變任一或多種性質或活性。舉例而言，經改變之性質或活性包括(但不限於)使酵素更穩定之修飾、改變受質特異性及/或賦予酵素溫度敏感性。需要時，酵素穩定性亦可藉由對酵素之聚乙二醇化或糖基化來增強。使用標準重組DNA技術修飾多肽對於熟習此項技術者為常規的。出於本文之目的，經修飾之基質降解酵素保留未經修飾之酵素的一或多種活性且為可活化的。所保留之活性可為未經修飾之酵素之活性的40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或95%以上。
在一實例中，基質降解酵素(例如組織蛋白酶)可經修飾以使得其前區不具抑制性。修飾可藉由在前區自身中或在發生抑制性相互作用之活性位點區域中之胺基酸置換、取代或插入來進行。因此，組織蛋白酶可以酵素原形式提供，其中於酸性條件下發生自體催化；若以酵素原形式提供，則該經修飾之酵素的經裂解之前區不會導致野生型組織蛋白酶所發生之失活。
在另一實例中，可活化的酵素可經修飾以改變其受質特異性。舉例而言，酵素可經修飾以具有增強之對特定受質的特異性。因此，舉例而言，展現對I型及IV型膠原蛋白之受質特異性的組織蛋白酶L可經修飾以使其具有增強之對I型膠原蛋白而非IV型膠原蛋白的受質特異性，且反之亦然。對多肽之修飾可藉由常規分子生物學技術達成，且在熟習此項技術者之技能範圍內。可使用對於受質裂解之常規檢定(諸如本文所述或此項技術中已知)測試經修飾之酵素的受質特異性。舉例而言，可對螢光肽或對經純化之蛋白質評估受質裂解。可使用試管內或活體內檢定來評估裂解。舉例而言，可藉由將酵素與受質一起培養，且接著使混合物於SDS-PAGE凝膠上電泳來評估裂解。可藉由西方墨點法(Western Blot)或藉由使用諸如庫馬斯藍或銀染色(Silver Stain)試劑之標準蛋白質染色來評估降解。
在另一實例中，基質降解酵素可經修飾以具有溫度敏感性。舉例而言，於生理學溫度(例如37℃)下具活性之基質降解酵素可經修飾且選擇於較低溫度(例如低於37℃；例如20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃左右)下具活性、但於生理學溫度下不具活性之酵素。因此，該等經修飾之酵素可用作可活化的基質降解酵素，其中活化條件為低溫。與提供冷溫之活化條件(例如冷緩衝液)同時、間歇或相繼投予酵素使得酵素活化。因為活體內溫度恢復至37℃之生理學溫度，所以酵素之活化得到暫時控制。
1.　活化可活化的基質降解酵素之活化條件及方法
可活化的基質降解酵素在活化條件不存在之情況下無活性。活體內投藥之後，該可活化的基質降解酵素之暫時性活化係藉由暴露(在相繼、間歇或同時投藥之前或之後)於一或多種提供足以活化酵素活化條件之特定活化劑而達成。舉例而言，活化可藉由使可活化的基質降解酵素暴露於(例如)溫度(例如熱或冷)、pH值、鹽、含有用於活化之足夠濃度之金屬離子(例如Ca2+ )的溶液、含有用於活化之足夠濃度之還原劑或氧化劑的溶液或如本文中所述或熟習此項技術者已知之其他方法來達成。活化劑之選擇將視如本文中所述或熟習此項技術者已知之酵素的選擇而變化。通常，使用足以產生活性酵素之量(例如濃度、含量或程度)的活化劑。此量可易於憑經驗確定且視所選酵素及所選應用而定。
藉助於可活化的酵素之可逆及條件性活化，達成暫時性活化，從而調節對細胞外基質(ECM)組份之酶促作用的持續時間。此為本發明方法之優勢，以使得與酵素之不當延長活化相關的有害副作用可得到控制。因為可活化的基質降解酵素需要連續暴露於活化條件以便保持活性，所以達成暫時性活化。活化條件通常並不以足以活化酵素之量內源性存在於活體內投予可活化的基質降解酵素之位點處。舉例而言，皮膚間質具有中性pH值，且因此通常不存在低pH值活化條件。在另一實例中，皮膚間質中金屬離子(諸如鈣)之生理學含量遠低於活化一些酵素所需之有效量。因此，酵素之失活可在減少酵素暴露於外源性活化條件之後發生，如可在活體內投予可活化的酵素後，外源性提供之活化條件逐漸耗散或中和時發生。
因此，本文所提供之活化條件為活化可活化的基質降解酵素所需、但通常不以足夠量存在於投藥位點中之彼等條件。對活化可活化的基質降解酵素之活化條件的需求允許在有限時間內活化基質降解酵素，直至活化條件耗散或中和以致酵素變為無活性或變得不穩定且被降解。酵素具活性之時間量可歷時預定時間。舉例而言，可提供含有一定量之活化條件(諸如濃度、有效量、含量或程度)的活化劑，該量經選擇以使得於活體內投藥之後酵素所暴露的環境及條件下酵素在規定時間內具活性。在一實例中，當酸性pH值為活化條件時，酸性緩衝液之緩衝能力可經調整以調節其對pH值變化之抵抗力的時間。活化劑活化可條件性活化的基質降解酵素之預定時間可憑經驗確定且與欲治療之疾病、所治療之個體、酵素之選擇及活化劑有關。可活化的基質降解酵素可在活體內投藥後在提供活化條件之活化劑存在下在以下時間內具活性：為或約為1分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘、5分鐘、10分鐘、20分鐘、30分鐘、40分鐘、50分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時或更長時間。
例示性活化條件及活化劑及暫時性活化之方法在下文描述。鑒於該描述，其他具體實例對於熟習此項技術者將顯而易見。
a.活化條件-酸性pH值
本文提供條件性活化基質降解酵素(藉由pH值調節其活性)之組成物及方法，及該等酵素治療ECM介導之疾病或病狀的用途。該等方法利用僅於酸性pH值下具有酵素活性而於中性pH值下保持無活性或變得不穩定且被降解之蛋白質。該等蛋白質包括溶酶體蛋白酶，包括(但不限於)半胱胺酸及天冬胺酸家族之組織蛋白酶，以及肝素酶。舉例而言，酸性細胞內隔室溶酶體含有多種降解蛋白質及由胞吞作用內化之其他物質之水解酶。所有溶酶體內蛋白酶(例如組織蛋白酶L)展現最佳酸性pH值。該等蛋白酶之實例為SEQ ID NO:57、60、1、65、180、68、71、74、77、183、186、189、80、195、90、93、96及156中之任一者中所闡明之任何蛋白酶。
使用僅在暴露於某些pH值條件之後具活性的基質降解酵素之方法在本文中用於利用皮膚中之pH值差。人類表皮系統在皮膚之層化層中維持pH值梯度。已報導外層展現5.5之平均pH值(W.P. Smith(1994)Cosmetics and Toiletries ,109:41-48)。表皮之連續層的pH值隨深度增加，在真皮層達到更接近生理學範圍(約pH 7.4)的最終pH值。
因此，本文涵蓋使用於酸性條件下展現活性、但於中性pH值下實質上無活性(諸如存在於ECM中)之可活化的基質降解酵素。實質上無活性酵素為於其最佳pH值下展現酵素活性之10%或10%以下的任何酵素，例如為或約為於酵素最佳pH值下存在時之1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、9.5%或10%。熟習此項技術者已知或可測定酵素之最佳pH值且可評估不同pH值條件下之活性差異。舉例而言，組織蛋白酶L之最佳pH值為或約為5.5，但可在4.5至6之範圍內變化，此視組織蛋白酶L之特定種類、緩衝條件或離子強度而定。組織蛋白酶L於pH 7.4下或高於pH 7.4下實質上無活性(Dehrmann等人(1995)Arch. Biochem. Biophys .,324:93-98)。在另一實例中，用於組織蛋白酶D之活性的最佳pH值為或約為3.0至4.0，且其於或約在6.0或更高pH值下實質上無活性(Rojas-Espinosa等人(1973)Infection and Immunity,8:1000-1008)。組織蛋白酶S為於pH 7.0下穩定之少數溶酶體蛋白酶中之一者(Bromme等人(1993)J Biol. Chem.,268:4832-4838)。
出於本文之目的，可活化的酵素於為或約為3、3.5、4、4.5、5、5.5、6或6.5之pH值條件下具活性，但於中性pH值下實質上無活性。可對酵素執行pH值活性概況，且評估相對活性以於多種條件下測定其最佳pH值(Dehrmann等人(1995)Arch. Biochem. Biophys. ，324:93-98)。應瞭解最佳pH值可視所用受質、緩衝條件、離子強度及酵素種類而不同。因此，本文對最佳pH值之提及僅用於舉例。熟習此項技術者可憑經驗確定於特定條件下酵素之最佳pH值。舉例而言，可改變緩衝條件及離子強度以測定於各種pH值條件下之酵素活性。用於測定pH值活性概況之酵素檢定可使用諸如本文所述及熟習此項技術者已知之螢光受質來執行。所用螢光受質之選擇將在酵素之間不同，且為熟習此項技術者所已知或可憑經驗確定。
因此，藉由在通常不存在於投藥位點處之活化條件下投藥來條件性活化基質降解酵素之能力允許暫時調節及改變展現中性pH值之器官及組織(諸如間質)之生理學參數。於正常生理學條件下，間質之pH值為中性。因此，於低pH值下具活性之可活化的基質降解酵素(諸如本文所述之溶酶體酵素)在存在於間質中時通常將由於間質之中性pH值而無催化活性。當例如藉由投予經緩衝酸性溶液暫時使間質之pH值呈酸性時，具有最佳酸性pH值之溶酶體酵素在向間質投予時將變得活化。當間質之pH值恢復為中性時，則需要酸性pH值之基質降解酵素變得失活且停止發揮其酶促活性。
因此，本文涵蓋於中性pH值下實質上無活性之可活化的基質降解酵素可經由pH值為中性之皮膚經表皮下投予(亦即藉由皮下、皮內或肌肉內投予)。亦涵蓋可條件性活化的基質降解酵素之其他投藥途徑且其可根據特定酵素之最佳pH值憑經驗確定以使得酵素之活性由於投藥後pH值條件之變化而變得可逆。其他投藥途徑包括(但不限於)經口、表面及經皮投藥途徑。
因為大多數組織及器官之間質展現中性pH值，所以暫時性酸化可藉由將酸性溶液注入組織或器官間質來達成。酸性緩衝液為當投予時暫時使間質之pH值降低至低於或大致為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0或6.5以使可活化的基質降解酵素具活性之組成物。緩衝液之酸性組份易由間質之中性pH值中和。酸性緩衝液為熟習此項技術者所已知。出於本文之目的，緩衝液之酸性組份可為有機酸或無機酸。通常，溶液為弱酸溶液。例示性酸包括(但不限於)2-(N-嗎啉基)乙烷磺酸(MES)、乙酸、檸檬酸、丁二酸、乳酸、順丁烯二酸、甘胺酸-鹽酸、檸檬酸磷酸鹽及組胺酸。酸性緩衝液之有效pH值範圍為已知的，且因此可根據所選酵素之最佳pH值選擇適當緩衝液。例示性酸性緩衝液包括(但不限於)乙酸鹽、檸檬酸鹽、甲酸鹽、甘胺酸、蘋果酸鹽、MES、磷酸鹽、哌口井、丙酸鹽、吡啶及丁二酸鹽緩衝液。舉例而言，MES緩衝液之有效pH值範圍為5.5至6.7。
可酸活化的基質降解酵素之中和及隨後失活所需之時期視酸性緩衝液之調配物而定。舉例而言，若酸性緩衝液中之酸及/或緩衝劑相對於間質之中和能力較弱，則產生較短時期；若使用較強酸性或酸性緩衝液中使用較強緩衝劑，則產生較長時期。因此，對pH值變化之抵抗力視特定緩衝液之緩衝能力而定。緩衝液之離子強度或濃度愈高，緩衝能力愈高。因此，在本文所提供之方法及組成物中，於給定pH值下活化之基質降解酵素的暫時性調節可進一步藉由所選緩衝液之緩衝能力來控制。此在實施例7中舉例說明。對給定應用所需緩衝液之判定為常規的且在熟習此項技術者之技術範圍內。
典型地，直接將酸性溶液注入需要降解一或多種ECM組份之位點以例如治療ECM介導之疾病或病狀。呈酸性溶液活化劑之形式之活化條件的輸注可與無活性可活化的基質降解酵素之投藥同時、依次或間歇執行。當同時進行投藥時，可活化的基質降解酵素及經緩衝酸性溶液可處於同一或分開的組成物中。當處於同一組成物中時，酵素及經緩衝酸性溶液可以混合物形式提供於組成物中。酵素之活化亦可在投藥之前藉由將酸性溶液添加至酵素之濃縮液體溶液或懸浮液或凍乾或粉末形式中來達成。通常，當提供可活化的基質降解酵素之液體溶液或懸浮液時，其為當暴露於提供適當活化條件之活化劑時經得起藉由活化條件活化酵素之溶液或懸浮液。
另外，在本文所提供之組合及方法中，可提供具有活化條件(例如經緩衝酸性溶液)之活化劑及可活化的基質降解酵素且與任一或多種其他藥劑(諸如麻醉劑、α腎上腺素能受體促效劑或分散劑中之任一或多者)組合投予。該等藥劑之實例在下文題為「組合療法」之部分中論述。該等其他藥劑可與活化劑及/或基質降解酵素同時、依次或間歇投予。
在本文所提供之方法的一實例中，向皮膚間質或存在ECM病狀或疾病之其他組織投予經緩衝酸性溶液。該經緩衝酸性溶液可根據活化基質降解酵素所需之pH值及達成有限持續時間之活化之所需緩衝能力進行選擇。舉例而言，組織蛋白酶L為用於治療膠原蛋白介導之疾病(諸如脂肪團)之目的的例示性酵素。因此，將在用於活化組織蛋白酶L之最適pH值5.5下製備酸性緩衝液。該酸性緩衝液之實例為MES。酸性溶液之緩衝能力亦可視需要以實驗方式測定，例如實施例7中所述。通常，酸性緩衝液在即將投予基質降解酵素之前或與其一起投予。舉例而言，若基質降解酵素以凍乾形式提供，則酵素可在即將投予之前用酸性緩衝溶液復水，且共同投予酵素與活化劑之組合。在酸性緩衝液存在下，在活體內投藥之後活化酵素。視酸性緩衝液之緩衝能力而定，間質之pH值將在有限或預定時間後恢復至中性，從而逆轉基質降解酵素之降解作用。
在本文所提供之方法的另一實例中，麻醉劑與血管收縮劑(例如利多卡因/腎上腺素)之組合係在投予活化劑及基質降解酵素之前投予。通常，在該等方法中，諸如玻尿酸降解酵素(例如玻尿酸酶)之分散劑亦與麻醉劑及血管收縮劑(諸如α腎上腺素能受體促效劑)一起投予。
b.　活化條件-金層陽離子濃度
本文提供含有需要暴露於適合於活化之金屬離子(例如Ca2+ 、Mg2+ 或Zn2+ )之可活化的基質降解酵素之組成物、組合、容器及方法。該酵素之實例為需要Ca2+ 以供活化的鈣激活中性蛋白酶(例如SEQ ID NO:82(鈣激活中性蛋白酶1)及SEQ ID NO:85(鈣激活中性蛋白酶2)中所闡明之大亞單位及SEQ ID NO:87中所闡明之小亞單位，或其對偶基因或物種變異體或其他變異體)。金屬離子可以水性組成物之形式提供，例如以鈣鹽形式提供。無活性酵素可以與金屬離子之混合物形式提供，或可以分開的組成物形式提供。若以分開的組成物形式提供，諸如以濃縮液體組合物之形式或以凍乾或粉末形式提供，則將金屬離子添加至酵素中將產生經活化之酵素。
通常，活化係藉由使無活性酵素暴露於足以活化之濃度的金屬陽離子(例如Ca2+ )來達成。精確量可憑經驗確定或為熟習此項技術者所已知。舉例而言，μ-鈣激活中性蛋白酶及m-鈣激活中性蛋白酶之試管內活化分別需要10-50μM及300-500μM鈣濃度(Hosfield等人(1999)The EMBO J .,18:6880-6889.)。可執行酵素活性檢定以測定最佳濃度。典型地，出於本文之目的，可活化的基質降解酵素包括需要足以於超過存在於間質中之金屬離子的生理學含量之濃度下活化之金屬離子濃度的彼等酵素。對於μ-鈣激活中性蛋白酶及m-鈣激活中性蛋白酶而言，活化所需之鈣含量超過生理學含量(參見例如，美國專利第6,620,592號；Hosfield等人(1999)The EMBO J .,18:6880-6889.)。
一般而言，包裝或提供無活性酵素以便存在不足以引醱酵素活化之金屬離子。因此，當無活性酵素以與金屬離子活化劑分開之組成物形式提供時，可能必需添加乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)或乙二醇四乙酸(ethylene glycol tetraacetic acid，EGTA)(濃度為約5mM至約100mM或100mM以上，視應用而定)以凍結任何Ca2+ 或其他金屬離子以防止引發活化反應直至需要時。接著可藉由添加足以克服螯合劑作用之濃度的Ca2+ (或其他金屬陽離子)來引發活化反應。精確量可憑經驗確定。
視酵素而定，暫時性活化可僅藉由停止暴露於金屬離子而達成。舉例而言，鈣激活中性蛋白酶之持續活化需要鈣之存在。因此，無活性形式之鈣激活中性蛋白酶可藉由添加Ca2+ 來活化，且可向器官或組織之間質投予處於同一或分開的組成物中之所得混合物。然而，投藥之後，持續活化所需之鈣的有效濃度不再可用；所得活性酵素將最終恢復至其無活性狀態。在其他實例中，活化需要金屬離子的酵素之暫時性調節可藉由投予金屬螯合劑或其他逆轉劑來控制。
2.　基質降解酵素與活化劑之組合
本文提供可活化的基質降解酵素與足以活化基質降解酵素之活化劑之組合。出於本文之目的，該可活化的基質降解酵素係以無活性形式提供。通常，可活化的基質降解酵素之組成物可與活化劑分開提供。該等組成物可分開提供於同一容器中或分開的容器中。通常，當單獨包裝時，提供酵素以便存在不足以使酵素具活性之活化條件。
基質降解酵素可以液體或凍乾形式以治療有效濃度提供。或者，基質降解酵素可以濃縮液體形式提供，以使得添加足夠量之活化劑產生治療性有效濃度之酵素。酵素可以溶液或懸浮液形式提供或囊封於合適之傳遞媒劑中，諸如脂質體、玻璃粒子、毛細管、藥物傳遞媒劑、明膠、錠劑、膠囊、丸劑、定時釋放包衣以及經皮貼片製劑及乾粉吸入器或其他此類媒劑。活化劑典型地以液體溶液或懸浮液形式提供以供單獨或在復水及/或暴露於基質降解酵素後向間質投藥。如以下F部分中所述，亦提供含有此等組合以及製品(諸如容器)之套組。
因此，當需要時，使可活化的基質降解酵素經受使酵素暴露於活化劑以產生活性酵素活化條件。暴露於活化劑可在試管內或活體內達成。舉例而言，當分開提供可活化的酵素及活化劑時，其可共同或分開投予。當分開投予時，可條件性活化的基質降解酵素可與活化劑同時、相繼或間歇投予。在另一實例中，呈凍乾或濃縮液體形式之基質降解酵素可在即將使用之前用活化劑復水。在該實例中，基質降解酵素與活化劑之混合物係共同投予。該等活化方法可由熟習此項技術者憑經驗確定，且可視酵素及活化劑之選擇及所需治療方法與治療方案而不同。
可活化的基質降解酵素可單獨或與活化劑組合提供於製品中。舉例而言，若酵素與活化劑組合提供，則製品可在一個隔室中含有呈凍乾或液體形式之酵素，且在相鄰隔室中含有活化劑。該等隔室可由分隔部件分隔。此類製品在本文其他地方描述。
基質降解酵素與活化劑之組合亦可進一步含有下文詳細論述之其他藥劑。舉例而言，除活化劑及基質降解酵素外，提供亦含有麻醉劑、血管收縮劑或分散劑中之一或多者的組合。
E.　產生編碼基質降解酵素及其多肽之核酸的方法
本文所述之基質降解酵素的多肽可藉由此項技術中熟知用於蛋白質純化及重組蛋白質表現之方法來獲得。可使用熟習此項技術者已知用於鑑別編碼所需基因之核酸的任何方法。此項技術中可用之任何方法可用於獲得編碼所需基質降解酵素之全長(亦即涵蓋整個編碼區)cDNA或基因組DNA純系，諸如自細胞或組織來源獲得。經修飾或變異型基質降解酵素可諸如藉由定點突變誘發自野生型多肽進行工程化。
多肽可使用此項技術中已知用於選殖及分離核酸分子之任何可用方法來選殖或分離。該等方法包括核酸之PCR擴增及文庫之篩選，包括核酸雜交篩選、基於抗體之篩選及基於活性之篩選。
擴增核酸之方法可用於分離編碼所需多肽之核酸分子，包括(例如)聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)方法。含核酸物質可用作起始物質，可自其分離所需多肽編碼核酸分子。舉例而言，DNA及mRNA製劑、細胞提取物、組織提取物、流體樣品(例如血液、血清、唾液)、來自健康及/或患病個體之樣品可用於擴增方法。核酸文庫亦可用作起始物質之來源。可設計引子以擴增所需多肽。舉例而言，可根據產生所需多肽之所表現序列設計引子。可根據多肽胺基酸序列之反向轉譯設計引子。可對藉由擴增所產生之核酸分子進行定序且證實其編碼所需多肽。
可將其他核苷酸序列連接於多肽編碼核酸分子，其包括含有限制性核酸內切酶位點之連接子序列以用於將合成基因選殖至載體(例如蛋白質表現載體或經設計用於擴增核心蛋白質編碼DNA序列之載體)中之目的。此外，可將表示功能性DNA元件之其他核苷酸序列操作性連接於多肽編碼核酸分子。該等序列之實例包括(但不限於)經設計以促進細胞內蛋白質表現之啟動子序列及經設計以促進蛋白質分泌之分泌序列(例如異源信號序列)。該等序列為熟習此項技術者所已知。舉例而言，例示性異源信號序列包括(但不限於)SEQ ID NO:2中所闡明之人類κ IgG異源信號序列。諸如表示蛋白質結合區之鹼基序列的其他核苷酸殘基序列亦可連接於酵素編碼核酸分子。該等區域包括(但不限於)促進或編碼促進酵素吸收至指定標靶細胞中之蛋白質或者以其他方式改變合成基因之產物之藥物動力學的殘基序列。舉例而言，可將酵素連接於PEG部分。
另外，可例如添加標籤或其他部分以幫助偵測或親和力純化多肽。舉例而言，亦可將諸如表示抗原決定基標籤之鹼基序列或其他可偵測標誌的其他核苷酸殘基序列連接於酵素編碼核酸分子。該等序列之實例包括編碼His標籤(例如6×His，HHHHHH；SEQ ID NO:235)或Flag標籤(DYKDDDDK；SEQ ID NO:236)之核酸序列。
接著可將經鑑別及分離之核酸插入適當選殖載體中。可使用此項技術中已知之大量載體-宿主系統。可能載體包括(但不限於)質體或經修飾之病毒，但載體系統必須與所用宿主細胞相容。該等載體包括(但不限於)諸如λ衍生物之噬菌體，或諸如pCMV4、pBR322或pUC質體衍生物之質體，或Bluescript載體(Stratagene,La Jolla,CA)。其他表現載體包括本文所例示之HZ24表現載體。插入選殖載體中可例如藉由使DNA片段連接至具有互補黏性末端之選殖載體中來實現。插入可使用TOPO選殖載體(Invitrogen,Carlsbad,CA)來實現。若用於使DNA斷裂之互補限制性位點不存在於選殖載體中，則可酶促修飾DNA分子之末端。或者，任何所需位點可藉由使核苷酸序列(連接子)連接至DNA末端上來產生；此等經連接之連接子可含有編碼限制性核酸內切酶識別序列之特定化學合成寡核苷酸。在一替代性方法中，可將經裂解之載體及蛋白質基因藉由同聚物加尾(homopolymeric tailing)來修飾。可經由(例如)轉型、轉染、感染、電穿孔及音波穿孔(sonoporation)將重組分子引入宿主細胞中以便產生基因序列之許多複本。
在特定具體實例中，用併有經分離之蛋白質基因、cDNA或合成DNA序列之重組DNA分子轉型宿主細胞使得能夠產生該基因之多個複本。因此，基因可藉由使轉型體生長、自轉型體分離重組DNA分子及必要時自經分離之重組DNA回收所插入之基因而以大量獲得。
1.　載體及細胞
對於所需蛋白質之一或多者(諸如本文所述之任何蛋白質)的重組表現而言，可將含有編碼蛋白質之核苷酸序列的全部或一部分之核酸插入適當表現載體，亦即含有對於所插入蛋白質編碼序列之轉錄及轉譯必需之元件之載體中。必需轉錄及轉譯信號亦可由酵素基因之天然啟動子及/或其側接區域提供。
亦提供含有編碼酵素之核酸的載體。亦提供含有該等載體之細胞。該等細胞包括真核及原核細胞，且載體為適用於其中之任何載體。
提供含有載體之原核及真核細胞(包括內皮細胞)。該等細胞包括細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、古菌(Archea)、植物細胞、昆蟲細胞及動物細胞。藉由於由上述細胞表現所編碼之蛋白質的條件下使細胞生長及回收所表現之蛋白質來使用該等細胞產生其蛋白質。出於本文之目的，例如可使酵素分泌於培養基中。
提供含有編碼偶合於天然或異源信號序列之酵素原多肽之核苷酸序列以及其多個複本的載體。該等載體可選擇用於在細胞中表現酵素蛋白質或使得酵素蛋白質以分泌蛋白質形式表現。酵素原(proenzyme/zymogen)形式之酵素可經純化以用作本文之可活化的酵素。或者，分泌之後，前區可經催化或自體催化裂解以產生成熟酵素。必要時，酵素可經純化以使得前區自製劑移除。該等成熟形式若無活性，則亦可在本文中用作呈單鏈或雙鏈形式之可活化的酵素。
可使用多種宿主-載體系統來表現蛋白質編碼序列。其包括(但不限於)受病毒(例如痘苗病毒、腺病毒及其他病毒)感染之哺乳動物細胞系統；受病毒(例如桿狀病毒)感染之昆蟲細胞系統；微生物，諸如含有酵母載體之酵母；或用噬菌體、DNA、質體DNA或黏質體DNA轉型之細菌。載體之表現元件在其強度及特異性方面不同。視所用宿主-載體系統而定，可使用許多合適之轉錄及轉譯元件中的任一者。
可使用熟習此項技術者已知用於將DNA片段插入載體中之任何方法來建構含有嵌合基因之表現載體，該嵌合基因含有適當轉錄/轉譯控制信號及蛋白質編碼序列。此等方法可包括試管內重組DNA及合成技術及活體內重組(遺傳重組)。編碼蛋白質或其域、衍生物、片段或同源物之核酸序列的表現可藉由第二核酸序列來調控以使基因或其片段表現於經重組DNA分子轉型之宿主中。舉例而言，蛋白質之表現可由此項技術中已知之任何啟動子/增強子來控制。在一特定具體實例中，啟動子對於所需蛋白質之基因而言非原生。可使用之啟動子包括(但不限於)SV40早期啟動子(Bernoist及Chambon,Nature 290 :304-310(1981))、勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)之3'長末端重複序列中所含之啟動子(Yamamoto等人Cell 22 :787-797(1980))、疱疹胸苷激酶啟動子(Wagner等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 :1441-1445(1981))、金屬硫蛋白基因之調控序列(Brinster等人,Nature 296 :39-42(1982))；原核表現載體，諸如β-內醯胺酶啟動子(Jay等人,(1981)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 :5543)或tac 啟動子(DeBoer等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 :21-25(1983)；亦參見「Useful Proteins from Recombinant Bacteria」：在Scientific American242 :79-94中(1980))；含有胭脂鹼(nopaline)合成酶啟動子(Herrar-Estrella等人,Nature 303 :209-213(1984))或花椰菜花葉病毒35S RNA啟動子(Gardner等人,Nucleic Acids Res. 9 :2871(1981))之植物表現載體，及光合成酶二磷酸核酮糖羧化酶之啟動子(Herrera-Estrella等人,Nature 310 :115-120(1984))；來自酵母及其他真菌之啟動子元件，諸如Ga14啟動子、乙醇脫氫酶啟動子、磷酸甘油激酶啟動子、鹼性磷酸酶啟動子，及以下展現組織特異性且已用於轉殖基因動物中之動物轉錄控制區：在胰腺腺泡細胞中具活性之彈性蛋白酶I基因控制區(Swift等人,Cell 38 :639-646(1984)；Ornitz等人,Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50 :399-409(1986)；MacDonald,Hepatology 7 :425-515(1987))；在胰腺β細胞中具活性之胰島素基因控制區(Hanahan等人 ,Nature 315 :115-122(1985))、在淋巴樣細胞中具活性之免疫球蛋白基因控制區(Grosschedl等人,Cell 38 :647-658(1984)；Adams等人,Nature 318 :533-538(1985)；Alexander等人,Mol. Cell Biol. 7 :1436-1444(1987))、在睾丸、乳房、淋巴及肥大細胞中具活性之小鼠乳腺瘤病毒控制區(Leder等人,Cell 45 :485-495(1986))、在肝中具活性之白蛋白基因控制區(Pinckert等人,Genes and Devel. 1 :268-276(1987))、在肝中具活性之α胎蛋白基因控制區(Krumlauf等人,Mol. Cell. Biol . 5:1639-1648(1985)；Hammer等人,Science 235 :53-581987))、在肝中具活性之α-1抗胰蛋白酶基因控制區(Kelsey等人,Genes and Devel. 1 :161-171(1987))、在骨髓細胞中具活性之β球蛋白基因控制區(Kollias等人,Cell 46 :89-94(1986))、在腦之寡樹突神經膠質細胞中具活性之髓鞘質鹼性蛋白質基因控制區(Readhead等人,Cell 48 :703-712(1987))、在骨骼肌中具活性之肌凝蛋白輕鏈-2基因控制區(Shani,Nature 314 :283-286(1985))及在下視丘之促性腺細胞中具活性之促性腺釋放激素基因控制區(Mason等人,Science 234 :1372-1378(1986))。
在一特定具體實例中，使用含有操作性連接於編碼所需蛋白質或其域、片段、衍生物或同源物之核酸之啟動子、一或多個複製起點及視情況一或多個可選擇標誌(例如抗生素抗性基因)的載體。用於大腸桿菌(E. coli )細胞轉型之例示性質體載體包括(例如)pQE表現載體(購自Qiagen，Valencia,CA；亦參見由Qiagen公開之描述該系統的文獻)。pQE載體具有噬菌體T5啟動子(由大腸桿菌RNA聚合酶識別)及提供重組蛋白質在大腸桿菌中之嚴格調控、高水準表現的雙重乳糖操縱子阻遏模組、用於有效轉譯之合成核糖體結合位點(RBS II)、6×His標籤編碼序列、t0 及T1轉錄終止子、ColE1複製起點及用於賦予胺苄青黴素(ampicillin)抗性之β-內醯胺酶基因。pQE載體使得能夠將6×His標籤置於重組蛋白質之N-末端或C-末端。該等質體包括pQE 32、pQE 30及pQE 31，其提供用於所有三種閱讀框架之多個選殖位點且提供N-末端經6×His標籤標記之蛋白質的表現。用於大腸桿菌細胞轉型之其他例示性質體載體包括(例如)pET表現載體(參見美國專利4,952,496；購自Novagen，Madison,WI；亦參見由Novagen公開之描述該系統的文獻)。該等質體包括pET 11a，其含有T71ac啟動子、T7終止子、誘導型大腸桿菌1ac操縱子及1ac阻遏基因；pET 12a-c，其含有T7啟動子、T7終止子及大腸桿菌ompT分泌信號；及pET 15b與pET19b(NOVAGEN,Madison,WI)，其含有用於以His管柱純化之His-TagTM 前導序列及允許在經由管柱純化後裂解之凝血酶裂解位點、T7-1ac啟動子區及T7終止子。
用於哺乳動物細胞表現之載體之實例為HZ24表現載體。HZ24表現載體係來源於pCI載體骨架(Promega)。其含有編碼β-內醯胺酶抗性基因(AmpR)之DNA、F1複製起點、細胞巨大病毒極早期增強子/啟動子區(CMV)及SV40晚期聚腺苷酸化信號(SV40)。該表現載體亦具有來自ECMV病毒(Clontech)之內部核糖體進入位點(internal ribosome entry site，IRES)及小鼠二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase，DHFR)基因。
2.表現
基質降解酵素可藉由熟習此項技術者已知之任何方法(包括活體內及試管內方法)來產生。所需蛋白質可表現於適合於產生所需要之量及形式之蛋白質(例如投藥及治療所需)的任何生物體中。表現宿主包括原核及真核生物，諸如大腸桿菌、酵母、植物、昆蟲細胞、哺乳動物細胞，包括人類細胞系及轉殖基因動物。表現宿主可在其蛋白質產生量以及存在於所表現蛋白質上之轉譯後修飾的類型方面不同。表現宿主之選擇可根據此等及其他因素來進行，諸如調節及安全性考慮、生產成本及用於純化之需求與方法。
許多表現載體為可得的且為熟習此項技術者所已知並可用於蛋白質之表現。表現載體之選擇將受宿主表現系統之選擇影響。一般而言，表現載體可包括轉錄啟動子及視情況增強子、轉譯信號及轉錄與轉譯終止信號。用於穩定轉型之表現載體典型地具有允許選擇及維持經轉型細胞之可選擇標誌。在一些情況下，可使用複製起點來擴增載體之複本數。
基質降解酵素亦可以蛋白質融合體形式使用或表現為蛋白質融合體。舉例而言，可產生酵素融合體以將其他功能添加至酵素中。酵素融合蛋白之實例包括(但不限於)信號序列、諸如用於定位之標籤(例如his6 標籤或myc標籤)或用於純化之標籤(例如GST融合體)及用於指導蛋白質分泌及/或膜結合之序列的融合體。
通常，基質降解酵素係以無活性酵素原形式表現。酵素原轉化可藉由暴露於其他蛋白酶或自體催化以產生成熟酵素來達成。本文涵蓋任何形式之酵素，只要其在活化劑不存在之情況下無活性即可。
a.　原核細胞
原核生物，尤其大腸桿菌提供用於產生大量蛋白質之系統。大腸桿菌之轉型為熟習此項技術者所熟知之簡單且快速之技術。用於大腸桿菌之表現載體可含有誘導型啟動子，該等啟動子適用於誘導高水準之蛋白質表現且表現對宿主細胞展現一些毒性之蛋白質。誘導型啟動子之實例包括lac啟動子、trp啟動子、雜合tac啟動子、T7及SP6 RNA啟動子及溫度調節型λPL啟動子。
可使蛋白質(諸如本文所提供之任何蛋白質)表現於大腸桿菌之細胞質環境中。該細胞質為還原環境且對於一些分子而言，此會導致形成不溶性包涵體。諸如二硫蘇糖醇及β-巰基乙醇之還原劑與諸如胍-HCl及脲之變性劑可用於使蛋白質重新溶解。一替代性方法為使蛋白質表現於細菌之提供氧化環境及伴侶蛋白樣及二硫化物異構酶的周質空間中且會使得產生可溶性蛋白質。典型地，使將蛋白質導向周質之前導序列與欲表現之蛋白質融合。接著藉由周質中之信號肽酶移除該前導序列。周質靶向前導序列之實例包括來自果膠酸解離酶基因之pelB前導序列及來源於鹼性磷酸酶基因之前導序列。在一些情況下，周質表現允許所表現之蛋白質滲漏至培養基中。蛋白質之分泌允許自培養上清液快速及簡單純化。未分泌之蛋白質可藉由滲透溶解自周質獲得。類似於細胞質表現，在一些情況下，蛋白質可變得不溶且可使用變性劑及還原劑促進溶解及再摺疊。誘導及生長之溫度亦可影響表現量及溶解度，典型地使用介於25℃與37℃之間的溫度。典型地，細菌產生無糖基化之蛋白質。因此，若蛋白質之功能需要糖基化，則可在自宿主細胞純化後試管內添加糖基化。
b.酵母細胞
諸如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisae )、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe )、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica )、乳酸刻魯維酵母(Kluyveromyces lactis )及甲醇酵母(Pichia pastoris )之酵母為可用於產生蛋白質(諸如本文所述之任何蛋白質)之熟知酵母表現宿主。酵母可用游離型複製載體或藉由經由同源重組進行之穩定染色體整合來轉型。典型地，使用誘導型啟動子來調控基因表現。該等啟動子之實例包括GAL1、GAL7及GAL5及諸如CUP1、AOX1或其他畢赤酵母(Pichia )或其他酵母啟動子之金屬硫蛋白啟動子。表現載體通常包括用於選擇及維持經轉型DNA之可選擇標誌，諸如LEU2、TRP1、HIS3及URA3。表現於酵母中之蛋白質通常為可溶性的。與諸如Bip之伴侶蛋白及蛋白質二硫化物異構酶共表現可改良表現量及溶解度。另外，可指導表現於酵母中之蛋白質使用分泌信號肽融合體(諸如來自釀酒酵母之酵母接合型α-因子分泌信號)及與酵母細胞表面蛋白質(諸如Aga2p接合黏著受體或Arxula adeninivorans 葡糖澱粉酶)之融合體進行分泌。諸如用於Kex-2蛋白酶之裂解位點的蛋白酶裂解位點可經工程化以在所表現之多肽離開分泌路徑時自該多肽移除融合序列。酵母亦能夠於Asn-X-Ser/Thr基元處糖基化。
c.　昆蟲細胞
昆蟲細胞，尤其使用桿狀病毒表現之昆蟲細胞適用於表現多肽，諸如基質降解酵素。昆蟲細胞表現高含量之蛋白質且能夠進行高等真核生物所使用之大多數轉譯後修飾。桿狀病毒具有改良安全性且減少真核表現之調控問題的限定宿主範圍。典型表現載體使用用於高水準表現之啟動子，諸如桿狀病毒之多角體蛋白啟動子。常用桿狀病毒系統包括以下桿狀病毒，諸如苜蓿銀紋夜蛾核多角體病病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus，AcNPV)及家蠶核多角體病病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus，BmNPV)及昆蟲細胞系，諸如來源於草地黏蟲(Spodoptera frugiperda )之Sf9、美州黏蟲(Pseudaletia unipuncta )(A7S)及黑脈金斑蝶(Danaus plexippus )(DpN1)。對於高水準表現而言，直接將欲表現之分子的核苷酸序列融合於病毒之多角體蛋白起始密碼子的下游。哺乳動物分泌信號在昆蟲細胞中經準確加工且可用於使所表現之蛋白質分泌至培養基中。另外，細胞系美州黏蟲(A7S)及黑脈金斑蝶(DpN1)產生具有類似於哺乳動物細胞系統之糖基化模式之蛋白質。
昆蟲細胞中之一替代性表現系統使用經穩定轉型之細胞。諸如Schneider 2(S2)及Kc細胞(黑腹果蠅(Drosophila melanogaster ))及C7細胞(白紋伊蚊(Aedes albopictus ))之細胞系可用於表現。果蠅屬(Drosophila )金屬硫蛋白啟動子可用於在重金屬誘導存在下用鎘或銅誘導高水準表現。表現載體典型地藉由使用諸如斯黴素(neomycin)及潮黴素(hygromycin)之可選擇標誌來維持。
d.　哺乳動物細胞
哺乳動物表現系統可用於表現包括基質降解酵素之蛋白質。表現構築體可藉由病毒感染(諸如腺病毒)或藉由直接DNA轉移(諸如脂質體、磷酸鈣、DEAE-葡聚糖)及藉由物理方式(諸如電穿孔及顯微注射)轉移至哺乳動物細胞中。用於哺乳動物細胞之表現載體典型地包括mRNA加帽位點、TATA盒、轉譯起始序列(Kozak一致序列)及聚腺苷酸化元件。亦可添加IRES元件以允許與另一基因(諸如可選擇標誌)一起雙順反子表現。該等載體通常包括用於高水準表現之轉錄啟動子-增強子，例如SV40啟動子-增強子、人類細胞巨大病毒(cytomegalovirus，CMV)啟動子及勞斯肉瘤病毒(RSV)之長末端重複序列。此等啟動子-增強子在許多細胞類型中具活性。組織及細胞型啟動子及增強子區域亦可用於表現。例示性啟動子/增強子區域包括(但不限於)來自諸如彈性蛋白酶I、胰島素、免疫球蛋白、小鼠乳房腫瘤病毒、白蛋白、α胎蛋白、α1抗胰蛋白酶、β球蛋白、髓鞘質鹼性蛋白質、肌凝蛋白輕鏈2及促性腺釋放激素基因控制序列之基因的彼等區域。可選擇標誌可用於選擇及維持具有表現構築體之細胞。可選擇標誌基因之實例包括(但不限於)潮黴素B磷酸轉移酶、腺苷去胺酶、黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶、胺基糖苷磷酸轉移酶、二氫葉酸還原酶(DHFR)及胸苷激酶。舉例而言，可在甲胺喋呤(methotrexate)存在下執行表現以僅選擇表現DHFR基因之彼等細胞。與細胞表面信號傳輸分子(諸如TCR-ζ及FcRI-γ)之融合體可指導蛋白質以活性狀態表現於細胞表面上。
許多細胞系可用於哺乳動物表現，包括小鼠、大鼠、人類、猴、雞及倉鼠細胞。例示性細胞系包括(但不限於)CHO、Balb/3T3、海拉(HeLa)、MT2、小鼠NS0(非分泌性)及其他骨髓瘤細胞系、融合瘤及異融合瘤細胞系、淋巴細胞、纖維母細胞、Sp2/0、COS、NIH3T3、HEK293、293S、2B8及HRB細胞。亦可用適應於促進分泌性蛋白自細胞培養基純化之無血清培養基的細胞系。實例包括CHO-S細胞(Invitrogen,Carlsbad,CA，目錄號11619-012)及無血清EBNA-1細胞系(Pham等人,(2003)Biotechnol .Bioeng .84 :332-42.)。亦可用適應於生長於經優化用於最大表現之特殊培養基中之細胞系。舉例而言，DG44 CHO細胞適於以懸浮液培養形式生長於化學上界定之無動物產物培養基中。
e.　植物
轉殖基因植物細胞及植物可用於表現蛋白質，諸如本文所述之任何蛋白質。典型地使用直接DNA轉移(諸如微粒轟擊)將表現構築體轉移至植物中且使用PEG介導之轉移將其轉移至原生質體中，且用農桿菌屬(agrobacterium)介導之轉型進行轉移。表現載體可包括啟動子及增強子序列、轉錄終止元件及轉譯控制元件。表現載體及轉型技術通常在雙子葉植物宿主(諸如芥菜屬(Arabidopsis )及煙草)與單子葉植物宿主(諸如玉米及稻穀)之間不同。用於表現之植物啟動子的實例包括花椰菜花葉病毒(cauliflower mosaic virus)啟動子、胭脂鹼合成酶啟動子、核糖二磷酸羧化酶啟動子及泛素與UBQ3啟動子。諸如潮黴素、磷酸甘露糖異構酶及新黴素磷酸轉移酶之可選擇標誌通常用於促進經轉型細胞之選擇及維持。經轉型之植物細胞可以細胞、聚集體(胼胝體組織)形式維持於培養物中或再生為完整植物。轉殖基因植物細胞亦可包括經工程化以產生基質降解酵素之藻類。因為植物具有與哺乳動物細胞不同之糖基化模式，所以此可影響此等宿主中所產生之蛋白質的選擇。
3.　純化技術
自宿主細胞純化多肽(包括基質降解酵素或其他蛋白質)之方法將視所選之宿主細胞及表現系統而定。對於分泌性分子而言，通常在移除細胞後自培養基純化蛋白質。對於細胞內表現而言，可溶解細胞且自提取物純化蛋白質。當使用諸如轉殖基因植物及動物之轉殖基因生物體進行表現時，組織或器官可用作起始物質以產生溶解之細胞提取物。另外，轉殖基因動物生產可包括於可收集之奶或蛋中產生多肽，且必要時可提取蛋白質且使用此項技術中之標準方法進行進一步純化。
通常，使基質降解酵素表現且純化為無活性形式(酵素原形式)以用於隨後如本文所提供之系統及方法中所述的活化。在一些應用中，基質降解酵素如本文中所述在活化劑不存在的情況下其成熟形式無活性。因此，在表現後，成熟形式可藉由自體催化以移除前區而產生。對於許多酵素而言，該自體催化需要活化劑之存在。必要時，可執行其他純化步驟以自經純化之製劑移除前區。在一些情況下，諸如對於用作對照而言，所表現之基質降解酵素可藉由自體催化以移除前區或藉由添加活化劑而純化為活性形式。在該等實例中，自體活化可在純化過程期間進行，或藉由於室溫下培養24-72小時來進行。活化之速率及程度視蛋白質濃度及特定酵素而定，以使得例如可能需要將較稀之樣品於室溫下培養較長時期。活化可藉由SDS-PAGE(例如3千道爾頓(kilodalton)位移)及藉由酵素活性(螢光受質之裂解)來監測。當需要活性酵素時，典型地，在純化之前使酵素達到＞75%活化。
諸如基質降解酵素之蛋白質可使用此項技術中已知之標準蛋白質純化技術來純化，該等技術包括(但不限於)SDS-PAGE、尺寸分級及尺寸排阻層析法、硫酸銨沈澱及離子交換層析法(諸如陰離子交換)。親和力純化技術亦可用於改良製劑之效能及純度。舉例而言，結合基質降解酵素之抗體、受體及其他分子可用於親和力純化。表現構築體亦可經工程化以將親和力標籤(諸如myc抗原決定基、GST融合體或His6 )添加至蛋白質中且分別用myc抗體、麩胱甘肽樹脂及Ni-樹脂進行親和力純化。純度可藉由此項技術中已知之任何方法來評估，包括凝膠電泳及染色與分光光度技術。
F.　可活化的基質降解酵素之製備、調配及投藥
本文所提供之醫藥組成物含有以無活性形式提供之可活化的基質降解酵素。亦提供含有活化劑之組成物。該等化合物可經調配為合適之醫藥製劑，諸如用於經口、非經腸投藥之溶液、懸浮液、凝膠、錠劑、可分散錠劑、丸劑、膠囊、散劑、持續釋放調配物或酏劑，以及經皮貼片製劑及乾粉吸入器。典型地，使用此項技術中熟知之技術及程序將化合物調配為醫藥組成物(參見例如，AnselIntroduction to Pharmaceutical Dosage Forms ,Fourth Edition,1985,126)。
所選基質降解酵素係以活化時在不存在對所治療患者之不當副作用的情況下發揮治療有效作用之足夠量包括在內。含有可活化的基質降解酵素之組成物可包括醫藥學上可接受之載劑。治療有效濃度可藉由在已知試管內及活體內系統(諸如本文所提供之檢定)中測試化合物憑經驗確定。組成物中之所選基質降解酵素的濃度視複合物之吸收、失活及排出率，複合物之物理化學特徵，劑量時程及投藥量以及熟習此項技術者已知之其他因素而定。舉例而言，應瞭解治療之精確劑量及持續時間與所治療之組織有關且可使用已知測試方案憑經驗確定或藉由自活體內或試管內測試資料推斷來確定。應注意濃度及劑量值亦可隨所治療個體之年齡而變化。應進一步瞭解對於任何特定個體而言，特定給藥方案應隨時間根據個體需求及投予調配物或監督調配物之投藥之人員的專業判斷而調整，且本文所述之濃度範圍僅為例示性的且不欲限制其範疇。欲投予以治療疾病或病狀(例如ECM介導之疾病或病狀，諸如脂肪團或淋巴水腫)之所選基質降解酵素的量可藉由標準臨床技術來確定。另外，試管內檢定及動物模型可用於幫助確定最佳劑量範圍。可憑經驗確定之精確劑量可視特定酵素、投藥途徑、欲治療之疾病類型及疾病之嚴重性而定。例示性劑量範圍為或約為10μg至100mg、尤其50μg至75mg、100μg至50mg、250μg至25mg、500μg至10mg、1mg至5mg或2mg至4mg。特定劑量及其調配物視適應症及個體而定。必要時，劑量可憑經驗確定。典型地，對於本文所述之適應症而言，以復水(諸如藉由添加活化劑)後為1-100ml、尤其1-50ml、10-50ml、10-30ml、1-20ml或1-10ml之體積投予劑量。典型地，該等劑量為或約為100μg至50mg、通常1mg至5mg，最終體積為10-50ml。
所選活化劑典型地以經緩衝溶液形式以在暴露於基質降解酵素時活化基質降解酵素之量提供。典型地，緩衝液中之活化劑的量為暫時使存在於間質中之該活化劑的生理量改變至足以暫時活化所選可活化的基質降解酵素之含量的量。舉例而言，當酸性pH值為活化條件時，呈酸性緩衝液組成物之形式的活化劑含有至少一種酸，當與基質降解酵素一起或分開向ECM投予時，該酸暫時使ECM之pH值降低至生理學pH值以下，亦即中性pH值以下。如本文其他地方所述，酸性緩衝液為具有在所選酵素之最佳pH值中的有效pH值範圍之緩衝液。酸性緩衝液之中和將由於間質之中性pH值環境而在投藥之後發生，且與緩衝能力有關。本文亦涵蓋其他經緩衝溶液，其視所選可活化的基質降解酵素及所選活化劑而定。舉例而言，緩衝液可於不同溫度下，或用不同量之鹽、還原劑或金屬離子製備。含有低pH值活化條件之經緩衝活化劑溶液亦可含有醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。
基質降解酵素可一次性投予，或可分為許多較小劑量以一定時間間隔投予。所選基質降解酵素可在治療時間過程中(例如在若干小時、天、週或月中)以一或多個劑量投予。在一些情況下，連續投藥為適用的。應瞭解精確劑量及投藥過程視所預期之活化的方法及系統而定。舉例而言，基質降解酵素可與活化劑一起或分開投予。典型地，若共同投予，則在即將使用之前使活化劑暴露於基質降解酵素，例如藉由凍乾粉末之復水。在其他陳述中，活化劑可為AMDE調配物之組份或可與AMDE之液體基劑型混合。又，AMDE可在混合活化劑之前用適當稀釋劑稀釋。若分開投予，基質降解酵素組成物可與活化劑製劑依次、同時或間歇投予。
又，應瞭解治療之精確劑量及持續時間與所治療之疾病有關且可使用已知測試方案憑經驗確定或藉由自活體內或試管內測試資料推斷來確定。應注意濃度及劑量值亦可隨欲減輕之病狀的嚴重性而變化。應進一步瞭解對於任何特定個體而言，特定給藥方案應隨時間根據個體需求及投予組成物或監督投予組成物之人員的專業判斷而調整，且本文所述之濃度範圍僅為例示性的且不欲限制組成物及含有其之組合的範疇或用途。該等組成物可每小時、每日、每週、每月、每年投予一次或一次性投予。通常，給藥方案經選擇以限制毒性。應注意主治醫師將瞭解由於毒性或骨髓、肝或腎或其他組織功能障礙而如何及何時終止、中斷或調整療法以降低劑量。相反地，主治醫師亦將瞭解在臨床反應不足(排除毒性副作用)之情況下如何及何時將治療調整至較高含量。
鑒於管理機構或其他機構之批准，根據通常認可用於動物及人類之藥典來製備醫藥學上可接受之組成物。組成物可採用溶液、懸浮液、乳液、凝膠、錠劑、丸劑、膠囊、散劑及持續釋放調配物之形式。組成物可用傳統黏合劑及載劑(諸如甘油三酯)調配為栓劑。經口調配物可包括標準載劑，諸如醫藥級甘露糖醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂及其他此類藥劑。該調配物應適合投藥方式。
醫藥組成物可包括與酵素或活化劑一起投予之載劑，諸如稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒劑。合適之醫藥載劑的實例描述於E. W. Martin之「Remington's Pharmaceutical Sciences」中。該等組成物將含有治療有效量之通常呈經純化形式的化合物，以及適量載劑以便提供用於向患者適當投藥之形式。該等醫藥載劑可為無菌液體，諸如水及油，包括石油、動物、蔬菜或合成來源者，諸如花生油、大豆油、礦物油及芝麻油。水為靜脈內投予醫藥組成物時之典型載劑。生理食鹽水溶液及右旋糖與甘油水溶液亦可用作液體載劑，尤其用於可注射溶液。組成物可含有活性成份以及：稀釋劑，諸如生理食鹽水、乳糖、蔗糖、右旋糖、林格氏乳酸鹽(Ringers lactate)、磷酸氫鈣或羧甲基纖維素；潤滑劑，諸如硬脂酸鎂、硬脂酸鈣及滑石粉；及黏合劑，諸如澱粉、天然膠(諸如阿拉伯膠明膠)、葡萄糖、糖蜜、聚乙烯吡咯啶、纖維素及其衍生物、聚乙烯吡咯酮、交聯聚乙烯吡咯酮及熟習此項技術者已知之其他此類黏合劑。合適之醫藥賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘露糖、海藻糖、甘露糖醇、山梨糖醇、明膠、麥芽、稻穀、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙二醇、水及乙醇。需要時，組成物亦可含有少量濕潤劑或乳化劑或pH值緩衝劑，例如乙酸鹽、檸檬酸鈉、順丁烯二酸鹽、甘胺酸鹽、組胺酸、丁二酸鹽、乳酸鹽、環糊精衍生物、脫水山梨糖醇單月桂酸酯、三乙醇胺乙酸鈉、三乙醇胺油酸酯、聚乙二醇及其他此類藥劑。調配物中之其他賦形劑可包括氧化劑或還原劑，諸如半胱胺酸、氧化型麩胱甘肽或半胱胺酸、還原型麩胱甘肽；界面活性劑，諸如聚山梨醇酯80、聚山梨酸酯20、泊洛尼克(pluronic)(F68)或防腐劑。如上所述，出於本文之目的，酸性緩衝劑可作為活化劑提供，其通常以與基質降解酵素分開之組合提供直至使用。
提供調配物以便以單位劑型向人類及動物投藥，該等單位劑型諸如錠劑、膠囊、丸劑、散劑、顆粒、無菌非經腸溶液或懸浮液、及經口溶液或懸浮液、及含有適量化合物或其醫藥學上可接受之衍生物的油水乳液。醫藥治療活性化合物及其衍生物典型地以單位劑型或多劑型調配及投予。每一單位劑量含有足以產生所需治療作用之預定量的治療活性化合物，以及所需醫藥載劑、媒劑或稀釋劑。單位劑型之實例包括安瓶、小瓶及注射器以及個別包裝之錠劑或膠囊。單位劑型可以其部分或多個投予。多劑型為包裝於單一容器中之欲以分開之單位劑型投予的複數個相同單位劑型。多劑型之實例包括小瓶、錠劑或膠囊瓶或品脫(pint)或加侖(gallon)瓶。因此，多劑型為在包裝時不分開之多個單位劑量。通常，可製備含有在0.005%至100%之範圍內的活性成份及由無毒載劑組成之其餘部分的劑型或組成物。
組成物可經調配以藉由熟習此項技術者已知之任何途徑投予，該等途徑包括肌肉內、靜脈內、皮內、病灶內、腹膜內注射、皮下、表皮下、硬膜外、經鼻、經口、經陰道、經直腸、表面、局部、經耳、吸入、頰內(例如舌下)及經皮投藥或任何途徑。視治療部位而定，投藥可為局部、表面或全身性投藥。向需要治療之區域局部投藥可藉由例如(但不限於)在手術期間局部輸注、表面施用(例如手術後結合傷口敷裹)、藉由注射、藉助於導管、藉助於栓劑或藉助於植入物來達成。組成物亦可與其他生物活性劑一起依次、間歇或以同一組成物形式投予。投藥亦可包括受控釋放系統，包括受控釋放調配物及受控釋放裝置，諸如藉助於泵。
在任何給定情況下最合適之途徑視多種因素而定，諸如疾病性質、疾病進展、疾病嚴重性、所使用之特定組成物。出於本文之目的，希望投予基質降解酵素及活化劑以便其到達皮膚或組織之間質。因此，涵蓋直接投予皮膚下方，諸如藉由表皮下投藥方法。此等方法包括(例如)皮下、皮內及肌肉內投藥途徑。因此，在一實例中，局部投藥可藉由注射達成，諸如自含有注射裝置(諸如針)之注射器或其他製品注射。亦涵蓋其他投藥方式。醫藥組成物可以適合於各投藥途徑之劑型調配。
在一實例中，醫藥製劑可呈液體形式，例如溶液、糖漿或懸浮液。若以液體形式提供，則可活化的基質降解酵素之醫藥製劑可以在添加活化劑之後稀釋至治療有效濃度之濃縮製劑形式提供。活化劑可在投藥之前添加至製劑中，或活化劑可與基質降解酵素製劑同時、間歇或依次添加。該等液體製劑可藉由習知方法用醫藥學上可接受之添加劑來製備，該等添加劑諸如懸浮劑(例如山梨糖醇糖漿、纖維素衍生物或氫化食用脂肪)；乳化劑(例如卵磷脂或阿拉伯膠)；非水性媒劑(例如杏仁油、油性酯或分餾植物油)；及防腐劑(例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯或山梨酸)。
在另一實例中，醫藥製劑可以凍乾形式提供以在使用之前用水或其他合適之媒劑復水。舉例而言，基質降解酵素之醫藥製劑可用含有適當活化劑之溶液復水。製劑之復水產生於合適活化劑中含有治療有效量之基質降解酵素的混合物，其可使用任何所需投藥途徑共同投予。
投藥方法可用於減少所選基質降解酵素暴露於降解過程，諸如蛋白水解降解及經由抗原性及免疫原性反應之免疫干預。該等方法之實例包括於治療部位處之局部投藥。已報導治療劑之聚乙二醇化增加對蛋白水解之抵抗力，增加血漿半衰期，且降低抗原性及免疫原性。聚乙二醇化方法之實例為此項技術所已知(參見例如，Lu及Felix,Int. J. Peptide Protein Res .,43:127-138,1994；Lu及Felix,Peptide Res.,6: 142-6,1993；Felix等人，Int. J. Peptide Res. ,46:253-64,1995；Benhar等人,J. Biol. Chem .,269:13398-404,1994；Brumeanu等人,J Immuno1 .,154:3088-95,1995；亦參見Caliceti等人(2003)Adv. Drug De1iv. Rev. 55(10) :1261-77及Molineux(2003)Pharmacotherapy 23(8 Pt 2) :3S-8S)。聚乙二醇化亦可用於活體內傳遞核酸分子。舉例而言，腺病毒之聚乙二醇化可增加穩定性及基因轉移(參見例如，Cheng等人(2003)Pharm. Res. 20(9) :1444-51)。
1.可注射劑、溶液及乳液
本文涵蓋通常特徵在於皮下、肌肉內或皮內注射之非經腸投藥。可注射劑可以習知形式，以液體溶液或懸浮液、適合於在注射之前溶解或懸浮於液體中之固體形式或乳液形式製備。合適賦形劑為(例如)水、生理食鹽水、右旋糖、甘油或乙醇。另外，需要時，欲投予之醫藥組成物亦可含有呈溶劑形式之活化劑，諸如pH值緩衝劑、還原劑或氧化劑、金屬離子鹽或其他此類緩衝液。醫藥組成物亦可含有其他少量無毒助劑物質，諸如濕潤劑或乳化劑、pH值緩衝劑、穩定劑、溶解度增強劑及其他此類藥劑，例如乙酸鈉、脫水山梨糖醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯及環糊精。本文亦涵蓋植入緩慢釋放或持續釋放系統以使得維持恆定劑量水準(參見例如美國專利第3,710,795號)。該等非經腸組成物中所含之活性化合物的百分比高度視其特定性質以及化合物之活性及個體之需求而定。
組成物之非經腸投藥通常包括表皮下投藥途徑，諸如皮內、皮下及肌肉內投藥。需要時，亦涵蓋靜脈內投藥。可注射劑經設計用於局部及全身性投藥。出於本文之目的，對於向受影響間質直接投藥，局部投藥為合意的。用於非經腸投藥之製劑包括備用於注射之無菌溶液、備用於在即將使用之前與溶劑組合的無菌乾燥可溶性產物(諸如凍乾粉末)(包括皮下錠劑)、備用於注射之無菌懸浮液、備用於在使用之前與媒劑組合之無菌乾燥不溶性產物及無菌乳液。該等溶液可為水性或非水性溶液。若靜脈內投予，則合適載劑包括生理食鹽水或磷酸鹽緩衝生理食鹽水(phosphate buffered saline，PBS)，及含有增稠劑及增溶劑之溶液，諸如葡萄糖、聚乙二醇及聚丙二醇及其混合物。
用於非經腸製劑中之醫藥學上可接受之載劑包括水性媒劑、非水性媒劑、抗微生物劑、等張劑、緩衝劑、抗氧化劑、局部麻醉劑、懸浮劑及分散劑、乳化劑、錯隔劑或螯合劑、胺基酸、肽及其他醫藥學上可接受之物質。水性媒劑之實例包括氯化鈉注射液、林格氏注射液(Ringers Injection)、等張右旋糖注射液、無菌水注射液、右旋糖及乳酸鹽林格氏注射液。非水性非經腸媒劑包括植物來源之不揮發性油、棉籽油、玉米油、芝麻油及花生油。可將抗細菌或抗真菌濃度之抗微生物劑添加至包裝於多劑量容器中之非經腸製劑中，該等抗微生物劑包括酚或甲酚、汞劑、苄醇、氯丁醇、對羥基苯甲酸酯(諸如對羥基苯甲酸甲酯及對羥基苯甲酸丙酯)、硫柳汞、氯苄烷銨及苄索氯銨。等張劑包括氯化鈉及右旋糖。緩衝劑包括磷酸鹽及檸檬酸鹽。抗氧化劑包括硫酸氫鈉。局部麻醉劑包括鹽酸普魯卡因(procaine hydrochloride)。懸浮劑及分散劑包括羧甲基纖維素鈉、羥丙基甲基纖維素及聚乙烯吡咯啶酮。乳化劑包括聚山梨醇酯80(TWEEN 80)、聚山梨酸酯20(TWEEN 20)、泊洛尼克(F68)。金屬離子之錯隔劑或螯合劑包括EDTA。醫藥載劑亦包括用於水混溶性媒劑及氫氧化鈉之乙醇、聚乙二醇及丙二醇，用於調整pH值之鹽酸、檸檬酸或乳酸。
調整醫藥活性化合物之濃度以便注射液提供產生所需藥理學作用之有效量。如此項技術中所已知，精確劑量視患者或動物之年齡、體重及病狀而定。將單位劑量非經腸製劑包裝於安瓶、小瓶或具有針之注射器中。含有醫藥活性化合物之液體溶液或復水粉末製劑之體積與欲治療之疾病及選用於包裝之特定製品有關。舉例而言，對於脂肪團之治療而言，預期對於非經腸注射液而言，所注射體積為或約為10毫升至50毫升。通常，此體積代表活化劑及基質降解酵素在兩者共同投予時之體積。因此，在一實例中，提供一種雙重容器或雙腔室注射器，其含有與含有10毫升至50毫升活化劑之第二隔室分開的凍乾酵素製劑。用活化劑使酵素復水後，可投予混合物。如此項技術中所已知及實踐，用於非經腸投藥之所有制劑必須無菌。可將可注射調配物儲存於適當條件下，諸如為或約為-80℃、-40℃、-20℃、2-8℃、15℃、室溫或受控室溫。
凍乾粉末
本文關注凍乾粉末，其可經復水用於以溶液、乳液及其他混合物形式投予。其亦可復水及調配為固體或凝膠。
無菌凍乾粉末藉由將無活性酵素之化合物溶解於緩衝溶液中來製備。該緩衝溶液可含有改良粉末或由該粉末製備之復水溶液之穩定性或其他藥理學組份的賦形劑。隨後無菌過濾溶液，接著於熟習此項技術者已知之標準條件下凍乾提供所需調配物。簡言之，凍乾粉末係藉由將賦形劑(諸如右旋糖、山梨糖、果糖、玉米糖漿、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖、甘露糖、山梨糖醇、海藻糖、甘露糖醇、山梨糖醇、羥乙基澱粉或其他合適藥劑)溶解於合適緩衝液(諸如檸檬酸鹽、磷酸鈉或磷酸鉀或熟習此項技術者已知之其他此類緩衝液)來製備。可添加之其他賦形劑包括胺基酸，諸如甘胺酸、丙胺酸、脯胺酸；胺，諸如甜菜鹼、三甲胺N-氧化物；及銨、鈉或鎂之鹽。接著將所選酵素添加至所得混合物中，且攪拌直至其溶解。將所得混合物無菌過濾或處理以移除微粒且確保無菌，並分配至小瓶中以進行凍乾。各小瓶將含有單劑量(1mg-1g，通常1-100mg，諸如1-5mg)或多劑量之化合物。凍乾粉末可儲存於適當條件下，諸如儲存於約4℃至室溫下。
用緩衝溶液使此凍乾粉末復水提供用於非經腸投藥之調配物。選用於復水之溶液可為任何緩衝液，但典型地為含有活化劑之緩衝液。根據欲復水之酵素來選擇活化劑。舉例而言，用約pH 5.5之酸性緩衝液使組織蛋白酶L之凍乾製劑復水。對於復水而言，每毫升緩衝液或其他合適載劑添加約1μg-20mg、較佳10μg-1mg、更佳約100μg。精確量視所治療之適應症及所選化合物而定。該量可憑經驗確定。
2.　表面投藥
如關於局部及全身性投藥所述來製備表面混合物。所得混合物可為溶液、懸浮液、乳液或其類似物且調配為乳膏、凝膠、軟膏、乳液、溶液、酏劑、洗劑、懸浮液、酊劑、糊狀物、泡沫、氣溶膠、灌洗劑、噴霧、栓劑、繃帶、皮膚貼片或適合於表面投藥之任何其他調配物。
化合物或其醫藥學上可接受之衍生物可以氣溶膠形式調配以用於表面施用，諸如藉由吸入(參見例如美國專利第4,044,126號；第4,414,209號；及第4,364,923號，其描述用於傳遞適用於治療發炎性疾病、尤其哮喘之類固醇的氣溶膠)。此等用於向呼吸道投藥之調配物可單獨或與諸如乳糖之惰性載劑組合呈用於霧化器之氣溶膠或溶液之形式，或呈用於吹入之微細粉末形式。在該情況下，調配物之粒子典型地將具有小於50微米、較佳小於10微米之直徑。
化合物可經調配用於以凝膠、乳膏及洗劑之形式局部或表面施用，諸如表面施用於皮膚及黏膜(諸如眼睛中)，及施用於眼睛或用於腦池內或脊椎內施用。預期表面投藥用於經皮傳遞以及向眼睛或黏膜投藥，或用於吸入療法。亦可投予單獨或與其他醫藥學上可接受之賦形劑組合的活性化合物之經鼻溶液。
提供適合於經皮投藥之調配物。其可以任何合適之形式提供，諸如適於保持與受體表皮緊密接觸較長時期之離散貼片。該等貼片含有於相對於活性化合物(例如)0.1至0.2M濃度之視情況經緩衝水溶液中的活性化合物。適合於經皮投藥之調配物亦可藉由離子導入療法(參見例如Pharmaceutical Research 3(6) ,318(1986))傳遞且典型地採用活性化合物之視情況經緩衝水溶液之形式。
3.　用於其他投藥途徑之組成物
視所治療之病狀而定，本文亦涵蓋其他投藥途徑，諸如表面施用、經皮貼片、經口及經直腸投藥。舉例而言，用於經直腸投藥之醫藥劑型為用於全身性作用之直腸栓劑、膠囊及錠劑。直腸栓劑包括用於插入直腸中之固體，其於體溫下熔融或變軟，從而釋放一或多種藥理學或治療活性成份。直腸栓劑中所用之醫藥學上可接受之物質為主劑或媒劑及升高熔點之藥劑。主劑之實例包括可可脂(可可油)、甘油-明膠、碳蠟(聚氧乙二醇)及脂肪酸之甘油單酯、甘油二酯及甘油三酯的適當混合物。可使用各種主劑之組合。升高栓劑熔點之藥劑包括鯨蠟及蠟。直腸栓劑可藉由壓縮方法或藉由模製來製備。直腸栓劑之典型重量為約2gm至3gm。用於經直腸投藥之錠劑及膠囊係使用與用於經口投藥之調配物相同的醫藥學上可接受之物質且藉由相同方法製造。
適合於經直腸投藥之調配物可以單位劑量栓劑形式提供。其可藉由將活性化合物與一或多種習知固體載劑(例如可可脂)混合且接著使所得混合物成形來製備。
對於經口投藥而言，醫藥組成物可採用(例如)藉由習知方法用以下醫藥學上可接受之賦形劑製備的錠劑或膠囊形式：諸如黏合劑(例如預膠凝化玉米澱粉、聚乙烯吡咯啶酮或羥丙基甲基纖維素)；填充劑(例如乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣)；潤滑劑(例如硬脂酸鎂、滑石粉或二氧化矽)；崩解劑(例如馬鈴薯澱粉或羥基乙酸澱粉鈉)；或濕潤劑(例如十二烷基硫酸鈉)。錠劑可藉由此項技術中熟知之方法來包衣。
適合於頰內(舌下)投藥之調配物包括(例如)於經調味主劑(通常蔗糖及阿拉伯膠或黃蓍膠)中含有活性化合物的含片；及於惰性主劑(諸如明膠及甘油或蔗糖及阿拉伯膠)中含有化合物的片劑。
醫藥組成物亦可藉由受控釋放調配物及/或傳遞裝置來投予(參見例如美國專利第3,536,809號；第3,598,123號；第3,630,200號；第3,845,770號；第3,847,770號；第3,916,899號；第4,008,719號；第4,687,610號；第4,769,027號；第5,059,595號；第5,073,543號；第5,120,548號；第5,354,566號；第5,591,767號；第5,639,476號；第5,674,533號及第5,733,566號)。
已知各種傳遞系統且可用於投予所選基質降解酵素，諸如(但不限於)襲封於脂質體、微粒、微膠囊中，能夠表現化合物之重組細胞，受體介導之內飲作用，及傳遞編碼所選基質降解酵素之核酸分子(諸如反轉錄病毒傳遞系統)。
因此，在某些具體實例中，脂質體及/或奈米粒子亦可用於投予基質降解酵素。脂質體由分散於水性介質中且自發地形成多層微脂粒同心雙層小泡(亦稱為多層微脂粒(multilamellar vesicle，MLV))之磷脂形成。MLV通常具有25nm至4μm之直徑。典型地，亦製備含有用於使奈米粒子穩定之膽固醇的脂質體。對MLV之超音波處理使得形成於核心中含有水性溶液、直徑在200埃(angstrom)至500埃之範圍內的單層小微脂粒(small unilamellar vesicle，SUV)。
磷脂在分散於水中時可形成不同於脂質體之多種結構，其視脂質與水之莫耳比而定。於低比率下，形成脂質體。脂質體之物理特徵視pH值、離子強度及二價陽離子之存在而定。脂質體可展示對離子及極性物質之低滲透性，但於高溫下經歷顯著改變其滲透性之相轉變。該相轉變涉及自稱為凝膠狀態之緊密堆積有序結構變為稱為流體狀態之疏鬆堆積有序性較小的結構。此於特徵相轉變溫度下發生且使得對離子、糖及藥物之滲透性增加。
脂質體經由不同機制與細胞相互作用：藉由網狀內皮系統之巨噬細胞(諸如巨噬細胞及嗜中性白血球)的胞吞作用；藉由非特異性弱疏水力或靜電力或藉由與細胞表面組份之特異性相互作用而吸附至細胞表面；藉由將脂質體之脂質雙層插入質膜中而與漿細胞膜融合，同時將脂質體內含物釋放至細胞質中；且藉由將脂質體脂質轉移至細胞或亞細胞膜中，或反之亦然，而無脂質體內含物之任何結合。改變脂質體調配物可改變運作之機制，但可同時運作一種以上機制。奈米膠囊通常可以穩定及可再現方式包埋化合物。為避免由細胞內聚合超負荷引起之副作用，該等超細粒子(尺寸為約0.1μm)應使用能夠活體內降解之聚合物來設計。本文涵蓋使用滿足此等需求之生物可降解的聚烷基-氰基丙烯酸酯奈米粒子，且該等粒子可易於製造。
4.　組合療法
本文所述之可活化的基質降解酵素及活化劑組合中之任一者可進一步與其他治療劑或藥理劑或程序一起、在其之前、與其間歇或在其之後共調配或共投予。該等藥劑包括(但不限於)其他生物製劑、小分子化合物、分散劑、麻醉劑、血管收縮劑及手術及其組合。舉例而言，對於其他藥劑及治療可用之任何疾病或病狀(包括上文所有所例示者)而言，用於該等疾病及病狀之所選可活化的基質降解酵素及活化劑組合可與其組合使用。在另一實例中，可投予局部麻醉劑(例如利多卡因)以提供疼痛緩解。在一些實例中，該麻醉劑可與血管收縮劑組合提供以增加麻醉作用之持續時間。本文所提供之藥理劑中的任一者可與促進接近藥理劑之組織(例如在皮下投藥後)的分散劑組合。該等物質為此項技術所已知且包括(例如)可溶性葡糖胺聚糖酶(glycosaminoglycanase)，諸如玻尿酸降解酵素，例如玻尿酸酶醣蛋白家族之成員(參見例如美國公開案第20050260186號及第20060104968號)。
本文所提供之可活化的基質降解酵素之組成物可與局部麻醉共調配或共投予。舉例而言，當以活化條件形式提供pH值時，需要施用局部麻醉以使與暴露於酸性pH值相關之疼痛降至最低。麻醉包括短效及持久局部麻醉藥物調配物。短效局部麻醉藥物調配物含有利多卡因或溶解於生理食鹽水或其他合適注射媒劑中的有關局部麻醉藥物。典型地，用短效局部麻醉劑進行局部麻醉持續約20-30分鐘。例示性麻醉劑包括(例如)非吸入局部麻醉劑，諸如胺布卡因(ambucaines)；阿莫卡因(amoxecaines)；阿米卡因(amylocaines)；阿托卡因(aptocaines)；阿替卡因(articaines)；奧布卡因(benoxinates)；苄醇；苯佐卡因(benzocaines)；貝托卡因(betoxycaines)；珍尼柳酯(biphenamines)；丁吖卡因(bucricaines)；布美卡因(bumecaines)；布比卡因(bupivacaines)；布他卡因(butacaines)；胺苯丁酯(butambens)；布坦卡因(butanilicaines)；carbizocaines；氯普魯卡因(chloroprocaine)；氯丁卡因(clibucaines)；氯達卡因(clodacaines)；可卡因(cocaines)；地昔卡因(dexivacaines)；二胺卡因(diamocaines)；狄步卡因(dibucaines)；達克羅寧(dyclonines)；依魯卡因(elucaines)；依替卡因(etidocaines)；尤普羅辛(euprocins)；苯氧卡因(fexicaines)；福莫卡因(fomocaines)；海普他卡因(heptacaines)；海克卡因(hexylcaines)；羥普魯卡因(hydroxyprocaines)；羥丁卡因(hydroxytetracaines)；胺苯異丁酯(isobutambens)；凱托卡因(ketocaines)；亮胺卡因(leucinocaines)；利多卡因(lidocaines)；甲哌卡因(mepivacaines)；美普卡因(meprylcaines)；奧妥卡因(octocaines)；奧索卡因(orthocaines)；奧昔卡因(oxethacaines)；奧布卡因(oxybuprocaines)；非那卡因(phenacaines)；哌諾卡因(pinolcaines)；哌羅卡因(piperocaines)；匹多卡因(piridocaines)；聚醚醇(polidocanols)；普莫卡因(pramocaines)；丙胺卡因(prilocaines)；普魯卡因(procaines)；丙泮卡因(propanocaines)；丙哌卡因(propipocaines)；丙氧卡因(propoxycaines)；丙美卡因(proxymetacaines)；吡咯卡因(pyrrocaines)；誇他卡因(quatacaines)；奎尼卡因(quinisocaines)；利索卡因(risocaines)；羅多卡因(rodocaines)；羅哌卡因(ropivacaines)；水楊醇(salicyl alcohols)；蘇卡因(suicaines)；丁卡因(tetracaines)；曲噴卡因(trapencaines)；及三甲卡因(trimecaines)；以及各種其他非吸入麻醉劑，諸如阿法沙龍(alfaxalones)；阿莫拉酮(amolanones)；乙苯惡啶(etoxadrols)；芬太尼(fentanyls)；氯胺酮(ketamines)；左沙屈爾(levoxadrols)；美西妥拉(methohexitals)；美索比妥(methohexitals)；咪達唑侖(midazolams)；米那索龍(minaxolones)；丙泮尼地(propanidids)；丙帕酯(propoxates)；普莫卡因(pramoxines)；丙泊酚(propofols)；瑞芬太尼(remifentanyls)；舒芬太尼(sufentanyls)；替來他明(tiletamines)；及佐拉敏(zolamine)。調配物之有效量將視特定患者、欲治療之疾病、投藥途徑及其他考慮因素而不同。該等劑量可憑經驗確定。
由於局部麻醉劑之短半衰期，因此通常需要將該等麻醉劑與血管收縮劑共投予或共調配。血管收縮劑之實例包括α腎上腺素能受體促效劑，包括兒茶酚肽及兒茶酚胺衍生物。特定實例包括(但不限於)可巴君、腎上腺素及去甲腎上腺素。舉例而言，諸如利多卡因之局部麻醉調配物可經調配以含有低濃度之腎上腺素或另一腎上腺素能受體促效劑(諸如可巴君)。將局部麻醉劑與腎上腺素能受體促效劑組合在醫藥製劑中為常見的(參見例如，美國專利第7,261,889號及第5,976,556號)。血管收縮劑為增加麻醉劑之半衰期所必需。諸如腎上腺素之血管收縮劑刺激經注射組織中之血管上的α-腎上腺素能受體。此具有收縮組織中之血管的作用。血管收縮使得局部麻醉劑在組織中停留更長時間，使得麻醉作用之持續時間大大增加。
通常，血管收縮劑在本文中與麻醉劑組合使用。麻醉劑及血管收縮劑可作為單一醫藥組成物之部分或作為分開的醫藥組成物之部分共同投予，只要血管收縮劑起作用收縮無論是否已投予麻醉劑之處附近的血管以使得麻醉延長即可。在一實例中，麻醉劑及血管收縮劑係以溶液形式共同投予。另外，麻醉劑及血管收縮劑可共同調配或與可活化的基質降解酵素及活化劑分開。單一調配物較佳。麻醉劑及血管收縮劑可藉由注射、藉由浸潤或藉由表面投藥(例如作為凝膠或糊狀物之部分)來投予。典型地，麻醉劑及血管收縮劑係藉由直接注入欲麻醉之部位，例如藉由皮下投藥來投予。調配物之有效量將視特定患者、欲治療之疾病、投藥途徑及其他考慮因素而不同。該等劑量可憑經驗確定。舉例而言，利多卡因之例示量為或約為10mg至1000mg、100mg至500mg、200mg至400mg、20mg至60mg或30mg至50mg。所投予之利多卡因之劑量將視個體及投藥途徑而不同。腎上腺素可以諸如10μg至5mg、50μg至1mg、50μg至500μg、50μg至250μg、100μg至500μg、200μg至400μg、1mg至5mg或2mg至4mg之量投予。典型地，腎上腺素可以1:100,000至1:200,000稀釋度與利多卡因組合，其意謂100ml麻醉劑含有0.5mg至1mg腎上腺素。所投予之體積可視欲治療之疾病及投藥途徑而調整。本文涵蓋1-100ml、1-50ml、10-50ml、10-30ml、1-20ml或1-10ml(典型地10-50ml)麻醉劑/血管收縮劑調配物可經皮下投予以用於治療ECM介導之疾病或病狀(諸如脂肪團)。該投藥可與投予可活化的基質降解酵素及活化劑相繼、同時或間歇進行。
本文所提供之可活化的基質降解酵素之組成物亦可與分散劑共調配或共投予。該分散劑亦可與諸如麻醉劑、血管收縮劑或其他生物藥劑之其他藥理劑共調配或共投予。分散劑之實例為經由降解葡糖胺聚糖而打開間質間隙中之通道的葡糖胺聚糖酶，諸如玻尿酸降解酵素，例如玻尿酸酶。視劑量及調配物而定，此等通道可保持相對打開歷時24-48小時之時期。該等通道可用於促進外源性添加分子之擴散，該等分子諸如流體、小分子、蛋白質(諸如基質降解酵素)、核酸及基因治療載體及尺寸小於約500nm之其他分子。另外，認為該等通道之形成可促進大量流體在間質間隙中流動，其又可促使在有時稱為「對流運輸」或簡稱為對流之過程中有效地由流體攜帶之溶質(諸如可偵測分子或其他診斷劑、麻醉劑或其他組織調節劑、藥理劑或醫藥有效藥劑或化妝品或其他美容劑)的分散或移動。該對流運輸可實質上超過分子擴散之速率及積累作用且因此可使得治療劑或其他所投予分子更快速及有效地灌注組織。此外，當諸如基質降解酵素、麻醉劑或其他藥劑之藥劑與葡糖胺聚糖酶共調配或共投予且將兩者注入相對有限局部部位(諸如非靜脈內非經腸投藥(例如皮內、皮下、肌肉內)之部位)中或注入其他內部組織、器官或身體內之其他相對有限間隙中或周圍時，則與所投予劑量相關之流體可提供局部驅動力(亦即流體靜壓)以及較低流動阻力(藉由打開基質中之通道)，其兩者皆可增加流體流動，及流體中所含之治療劑或其他分子與其之對流運輸。因此，葡糖胺聚糖酶之使用可對於改良生物可用性以及操作共調配或共投予藥劑(諸如基質降解酵素)之其他藥物動力學及/或藥效學特徵具有實質效用。
a.　玻尿酸降解酵素
葡糖胺聚糖酶之實例為玻尿酸降解酵素。玻尿酸降解酵素包括降解玻尿酸之任何酵素。例示性玻尿酸降解酵素包括(但不限於)玻尿酸酶及具有裂解玻尿酸之能力的特定軟骨素酶及裂解酶。本文所提供之組成物、組合及方法中之玻尿酸降解酵素的實例為可溶性玻尿酸降解酵素。舉例而言，葡糖胺聚糖酶之實例為玻尿酸酶。諸如玻尿酸酶之玻尿酸降解酵素為降解玻尿酸之酵素家族。藉由催化玻尿酸之水解，間質障壁之主要組份玻尿酸酶降低玻尿酸之黏度，從而增加組織滲透性。
亦稱為玻尿酸(hyaluronic acid)或玻尿酸酯之玻尿酸(hyaluronan)為廣泛分布於結締、上皮及神經組織中之非硫酸化葡糖胺聚糖。玻尿酸為細胞外基質之基本組份及間質障壁之主要組份。藉由催化玻尿酸之水解，玻尿酸降解酵素降低玻尿酸之黏度，從而增加組織滲透性且增加非經腸投予之流體的吸收速率。因此，諸如玻尿酸酶之玻尿酸降解酵素已例如用作結合其他藥劑、藥物及蛋白質來增強其分散及傳遞之擴散劑或分散劑。
玻尿酸降解酵素用於藉由裂解玻尿酸聚合物來降解玻尿酸，該等聚合物由經由交替β-1→4及β-1→3糖苷鍵連接在一起之重複雙醣單元、D-葡糖醛酸(GlcA)及N-乙醯基-D-葡糖胺(GlcNAc)組成。玻尿酸鏈長度可達約25,000個雙醣重複或更長且玻尿酸之聚合物的尺寸在活體內可在約5,000Da至20,000,000Da之範圍內。因此，用於所提供之用途及方法的玻尿酸降解酵素包括具有催化玻尿酸雙醣鏈或聚合物裂解之能力的任何酵素。在一些實例中，玻尿酸降解酵素裂解玻尿酸鏈或聚合物中之β-1→4糖苷鍵。在其他實例中，玻尿酸降解酵素催化玻尿酸鏈或聚合物中之β-1→3糖苷鍵的裂解。
i.　玻尿酸酶
存在三種玻尿酸酶大體類別：哺乳動物型玻尿酸酶(EC 3.2.1.35)，其為內-β-N-乙醯基己醣胺酶，其中四醣及六醣作為主要終產物；降解玻尿酸及在各種程度上降解硫酸軟骨素(CS)及硫酸皮膚素(DS)之細菌玻尿酸酶(EC 4.2.99.1)，其為藉由β消去反應操作之內-β-N-乙醯基己醣胺酶，主要產生雙醣終產物；及來自水蛭、其他寄生蟲及甲殼動物之玻尿酸酶EC3.2.1.36)，其為經由水解β-1-3鍵聯而產生四醣及六醣終產物的內-β-葡萄糖苷酸酶(glucuronidase)。
1)哺乳動物型玻尿酸酶
哺乳動物型玻尿酸酶具有水解與轉糖苷酶兩種活性，且可降解玻尿酸及硫酸軟骨素(CS)，通常為C4-S及C6-S。此類型之玻尿酸酶包括(但不限於)來自母牛(牛類)(SEQ ID NO:237、266及272及BH55)(美國專利第5,747,027號及第5,827,721號)、綿羊(家綿羊(ovis aries))(SEQ ID NO:252、267、271及272)、黃蜂(SEQ ID NO:238及239)、蜜蜂(SEQ ID NO:240)、白臉大黃蜂(SEQ ID NO:241)、胡蜂(SEQ ID NO:242)、小鼠(SEQ ID NO:243-245、257)、豬(SEQ ID NO:246、247)、大鼠(SEQ ID NO:248-250、256)、兔(SEQ ID NO:251)、猩猩(SEQ ID NO:253)、獼猴(SEQ ID NO:254)、豚鼠(SEQ ID NO:255)之玻尿酸酶及人類玻尿酸酶。本文所提供之組成物、組合及方法中之玻尿酸酶的實例為可溶性玻尿酸酶。
人類基因組中存在6種玻尿酸酶樣基因：HYAL1(SEQ ID NO:262)、HYAL2(SEQ ID NO:263)、HYAL3(SEQ ID NO:264)、HYAL4(SEQ ID NO:265)及PH20/SPAM1(SEQ ID NO:232)。在玻尿酸酶中，PH20為原型中性活性酵素，而其他玻尿酸酶對玻尿酸或任何已知受質不展現催化活性，或僅於pH值條件下具活性。玻尿酸酶類酵素之特徵亦可為通常經由糖基磷脂醯肌醇錨鎖定於質膜者(諸如人類HYAL2及人類PH20)(Danilkovitch-Miagkova,等人(2003)Proc Natl Acad Sci USA. 100(8):4580-5)，及通常可溶者(諸如人類HYAL1)(Frost等人,(1997)Biochem Biophys Res Commun. 236(1):10-5)。一些玻尿酸酶之N-連接型糖基化對於其催化活性及穩定性可極其重要。雖然改變修飾醣蛋白之聚糖的類型可對蛋白質之抗原性、結構摺疊、溶解度及穩定性具有顯著影響，但並不認為許多酵素之最佳酵素活性需要糖基化。因此，在此方面玻尿酸酶為獨特的，因為N-連接型糖基化之移除會導致玻尿酸酶活性近乎完全失活。對於該等玻尿酸酶而言，N-連接聚糖之存在對於產生活性酵素至關重要。
因此，哺乳動物玻尿酸酶可進一步再分為主要見於睪丸提取物中之具中性活性者及主要見於諸如肝之器官中之具酸性活性者。例示性中性活性玻尿酸酶包括PH20，其包括(但不限於)來源於諸如羊類(SEQ ID NO:267)、牛類(SEQ ID NO:266)及人類(SEQ ID NO:232)之不同物種之PH20。
人類PH20(亦稱為精子表面蛋白PH20)天然參與精子-卵子黏著且藉由消化玻尿酸而幫助精子穿透卵丘細胞層。PH20 mRNA轉錄物(對應於SEQ ID NO:224中所闡明之序列的核苷酸1058-2503)通常經轉譯產生於N-末端含有35個胺基酸之信號序列(胺基酸殘基位置1-35)及於C-末端含有19個胺基酶之GPI錨(對應於胺基酸殘基491-509)的509個胺基酸之前軀體蛋白質。前軀體序列闡明於SEQ ID NO:232中。亦存在於SEQ ID NO:224中所闡明之胺基酸序列的核苷酸位置2188處含有C至T之突變的mRNA轉錄物且其為產生SEQ ID NO:232中所闡明之轉譯產物的沉默突變。因此，成熟PH20為SEQ ID NO:233中所闡明之474個胺基酸的多肽。於SEQ ID NO:232中所例示之人類PH20的N82、N166、N235、N254、N368、N393、N490處存在玻尿酸酶活性所需之潛在N-連接型糖基化位點。在半胱胺酸殘基C60與C351之間及在C224與C238之間(對應於SEQ ID NO:232中所闡明之胺基酸)形成二硫鍵以形成核心玻尿酸酶域。然而，中性酵素催化活性需要羧基末端具有額外半胱胺酸以使得SEQ ID NO:232之胺基酸36至464含有活性最小之人類PH20玻尿酸酶域。
牛類PH20為553個胺基酸之前軀體多肽(SEQ ID NO:266)。牛類PH20與人類PH20之比對僅展示弱同源性，其中由於牛類多肽中不存在GPI錨，故自胺基酸470至各別羧基末端存在多個間隙(參見例如，Frost GI(2007)Expert Opin. Drug. Deliv. 4:427-440)。預計在除人類外之其他PH20種類中無明顯GPI錨。舉例而言，由羊類及牛類產生之PH20多肽以可溶性形式存在。儘管存在極鬆散地連接於質膜之牛類PH20，但其並不經由磷脂酶敏感性錨來錨定(Lalancette等人(2001)Biol Reprod. 65(2):628-36)。牛類玻尿酸酶之此獨特特性已允許使用可溶性牛類睪丸玻尿酸酶酵素以提取物形式供臨床使用(WydaseTM 、HyalaseTM )。
2)細菌玻尿酸酶
細菌玻尿酸酶(EC 4.2.2.1或EC 4.2.99.1)降解玻尿酸及在各種程度上降解硫酸軟骨素及硫酸皮膚素。自細菌分離之玻尿酸解離酶因其作用方式而不同於玻尿酸酶(來自其他來源，例如玻尿酸葡糖胺酶(hyaluronoglucosaminidases)、EC 3.2.1.35)。其為催化玻尿酸中之N-乙醯基-β-D-葡糖胺與D-葡糖醛酸殘基之間的β1→4-糖苷鍵之消去反應、而非水解反應之內-β-N-乙醯基己醣胺酶，產生3-(4-脫氧-β-D-糖-4-烯醛酸基)-N-乙醯基-D-葡糖胺四醣及六醣及雙醣終產物。該反應使得形成於其非還原性末端處具有不飽和己糖醛酸殘基之寡醣。
用於所提供之組成物、組合及方法中之來自細菌的例示性玻尿酸酶包括(但不限於)微生物中之玻尿酸降解酵素，該等微生物包括節桿菌屬(Arthrobacter )、蛭弧菌屬(Bdellovibrio )、梭狀芽胞桿菌屬(Clostridium )、微球菌屬(Micrococcus )、鏈球菌屬(Streptococcus )、消化球菌屬(Peptococcus )、丙酸桿菌屬(Propionibacterium )、擬桿菌屬(Bacteroides )及鏈黴菌屬(Streptomyces )之菌株。該等酵素之特定實例包括(但不限於)節桿菌屬(Arthrobacter sp .)(菌株FB24)(SEQ ID NO:275)、噬菌蛭弧菌(Bdellovibrio bacteriovorus )(SEQ ID NO:276)、瘡皰丙酸桿菌(Propionibacterium acnes )(SEQ ID NO:277)、無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae )(SEQ ID NO:278)；18RS21(SEQ ID NO:279)；血清型Ia(SEQ ID NO:280)；清型III(SEQ ID NO:281)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(菌株COL(SEQ ID NO:282)；菌株MRSA252(SEQ ID NO:283及284)；菌株MSSA476(SEQ ID NO:285)；菌株NCTC 8325(SEQ ID NO:286)；菌株牛類RF122(SEQ ID NO:287及288)；菌株USA300(SEQ ID NO:289)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae )(SEQ ID NO:290)；菌株ATCC BAA-255/R6(SEQ ID NO:291)；血清型2，菌株D39/NCTC 7466(SEQ ID NO:292)、化膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes )(血清型M1)(SEQ ID NO:293)；血清型M2，菌株MGAS10270(SEQ ID NO:294)；血清型M4，菌株MGAS10750(SEQ ID NO:295)；血清型M6(SEQ ID NO:296)；血清型M12，菌株MGAS2096(SEQ ID NO:297及298)；血清型M12，菌株MGAS9429(SEQ ID NO:299)；血清型M28(SEQ ID NO:300)；豬鏈球菌(Streptococcus suis )(SEQ ID NO:301-303)；費氏弧菌(Vibrio fischeri )(菌株ATCC 700601/ES114(SEQ ID NO:304))，及鏈黴菌(Streptomyces hyaluronolyticus )玻尿酸酶酵素，其對玻尿酸具特異性且並不裂解軟骨素或硫酸軟骨素(Ohya,T.及Kaneko,Y.(1970)Biochim. Biophys. Acta 198:607)。
3)來自水蛭、其他寄生蟲及甲殼動物之玻尿酸酶
來自水蛭、其他寄生蟲及甲殼動物之玻尿酸酶(EC 3.2.1.36)為產生四醣及六醣終產物之內-β-葡萄糖醛酸酶。此等酵素催化玻尿酸酯中之β-D-葡萄糖醛酸與N-乙醯基-D-葡糖胺殘基之間的β1→3-鍵之水解。來自水蛭之例示性玻尿酸酶包括(但不限於)來自以下各科之玻尿酸酶：水蛭科(Hirudinidae)(例如醫蛭(Hirudo medicinalis ))、石蛭科(Erpobdellidae)(例如Nephelopsis obscura 及斑點石蛭(Erpobdella punctata ))、舌蛭科(Glossiphoniidae)(例如Desserobdella picta 、靜澤蛭(Helobdella stagnalis )、平扁舌蛭(Glossiphonia complanata )、潤飾盾蛭(Placobdella ornata )及晶蛭屬(Theromyzon sp. ))及黃蛭科(Haemopidae)(黃蛭(Haemopis marmorata ))(Hovingh等人(1999)Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 124(3):319-26)。具有與水蛭玻尿酸酶相同之作用機制的來自細菌之一例示性玻尿酸酶為來自藍細菌(cyanobacteiia)、聚球藻屬(Synechococcus sp.)(菌株RCC307，SEQ ID NO:305)之玻尿酸酶。
ii.　其他玻尿酸降解酵素
除玻尿酸酶家族外，在所提供之組成物、組合及方法中可結合可活化的基質降解酵素使用其他玻尿酸降解酵素。舉例而言，可使用具有裂解玻尿酸之能力的酵素，包括特定軟骨素酶及裂解酶。可降解玻尿酸之例示性軟骨素酶包括(但不限於)軟骨素ABC解離酶(亦稱為軟骨素酶ABC)、軟骨素AC解離酶(亦稱為硫酸軟骨素解離酶或硫酸軟骨素消除酶)及軟骨素C解離酶。產生及純化用於所提供之組成物、組合及方法中之該等酵素的方法為此項技術所已知(例如美國專利第6,054,569號；Yamagata,等人(1968)J. Biol. Chem. 243(7):1523-1535；Yang等人(1985)J. Biol. Chem. 160(30):1849-18570)。
軟骨素-ABC解離酶含有兩種酵素，硫酸軟骨素-ABC內解離酶(EC 4.2.2.20)及硫酸軟骨素-ABC外解離酶(EC 4.2.2.21)(Hamai等人(1997)J Biol Chem. 272(14):9123-30)，其降解硫酸軟骨素及硫酸皮膚素類型之多種葡糖胺聚糖。硫酸軟骨素、硫酸軟骨素蛋白聚糖及硫酸皮膚素為硫酸軟骨素-ABC內解離酶之較佳受質，但該酵素亦可以較低速率作用於玻尿酸。硫酸軟骨素-ABC內解離酶降解硫酸軟骨素及硫酸皮膚素類型之多種葡糖胺聚糖，產生不同大小之Δ4-不飽和寡醣的混合物，其最終降解為Δ4-不飽和四醣及雙醣。硫酸軟骨素-ABC外解離酶具有相同受質特異性，但移除來自由硫酸軟骨素-ABC內解離酶所產生之兩種聚合硫酸軟骨素及其寡醣片段之非還原末端的雙醣殘基(Hamai,A.等人(1997)J. Biol. Chem. 272:9123-9130)。例示性硫酸軟骨素-ABC內解離酶及硫酸軟骨素-ABC外解離酶包括(但不限於)來自普通變形桿菌及肝素黃桿菌者(普通變形桿菌硫酸軟骨素-ABC內解離酶闡明於SEQ ID NO:306中(Sato等人(1994)Appl. Microbiol. Biotechnol. 41(1):39-46))。
軟骨素AC解離酶(EC 4.2.2.5)對硫酸軟骨素A及C、軟骨素及玻尿酸具活性，但對硫酸皮膚素(硫酸軟骨素B)無活性。來自細菌之例示性軟骨素酶AC酵素包括(但不限於)來自肝素黃桿菌及食物穀菌(分別在SEQ ID NO:307及308中闡明)以及金黃節桿菌者(Tkalec等人(2000)Applied and Environmental Microbiology 66(1):29-35；Ernst等人(1995)Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 30(5):387-444)。
軟骨素酶C裂解硫酸軟骨素C，產生四糖加不飽和6-硫酸化雙醣(ΔDi-6S)。其亦裂解玻尿酸，產生不飽和非硫酸化雙醣(ΔDi-OS)。來自細菌之例示性軟骨素酶C酵素包括(但不限於)來自鏈球菌及黃桿菌者(Hibi等人(1989)FEMS -Microbiol -Lett . 48(2):121-4；Michelacci等人(1976)J. Biol. Chem. 251:1154-8；Tsuda等人(1999)Eur. J. Biochem. 262:127-133)。
iii.　可溶性玻尿酸降解酵素
包括可溶性玻尿酸酶之可溶性玻尿酸降解酵素可用於本文所提供之方法、組合或組成物中以與基質降解酵素、活化劑、麻醉劑、血管收縮劑、其他藥理劑或治療劑或其組合共投予或共調配，以允許擴散至組織中。可溶性玻尿酸降解酵素包括以可溶性形式存在之任何玻尿酸降解酵素，其包括(但不限於)諸如牛類PH20及羊類PH20之玻尿酸酶、其對偶基因變異體及其他變異體。在可溶性玻尿酸降解酵素中亦包括已經修飾為可溶性之任何玻尿酸降解酵素。舉例而言，含有GPI錨之玻尿酸降解酵素可藉由截短及移除GPI錨之全部或一部分而變得可溶。在一實例中，通常經由GPI錨錨定於膜之人類玻尿酸酶PH20可藉由於C-末端處截短及移除GPI錨之全部或一部分而變得可溶。
可溶性玻尿酸降解酵素亦包括中性活性及酸性活性玻尿酸酶。視諸如(但不限於)投藥後酵素之所需活性程度及/或投藥位點而定，可選擇中性活性及酸性活性玻尿酸酶。在一特定實例中，用於組成物、組合及方法中之玻尿酸降解酵素為可溶性中性活性玻尿酸酶。
可溶性玻尿酸酶之實例為來自任何物種之PH20，諸如SEQ ID NO:232、233、266、251、267、255、257、271-274中之任一者中所闡明之任何玻尿酸酶，或其缺乏C-末端GPI錨之全部或一部分的截短形式，只要玻尿酸酶為可溶性的且保留玻尿酸酶活性即可。在可溶性玻尿酸酶中亦包括SEQ ID NO:232、233、266、251、267、255、257、271-274或其截短形式之對偶基因變異體或其他變異體。對偶基因變異體及其他變異體為熟習此項技術者所已知，且包括與SEQ ID NO:232、233、266、251、267、255、257、271-274中之任一者或其截短形式具有60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%或更高序列一致性的多肽。
典型地，對於用於本文之組成物、組合及方法中而言，使用可溶性人類PH20。儘管可使用來自其他動物之PH20，但因為其為動物蛋白質，所以該等製劑潛在地具免疫原性。舉例而言，高比例之患者顯示繼發於攝取食物之先敏化，且因為其為動物蛋白質，所以所有患者均具有隨後敏化之危險。因此，非人類製劑可能不適合於長期使用。若需要非人類製劑，則本文涵蓋該等多肽可製備為具有降低之免疫原性。該等修改在熟習此項技術者之技藝範圍內且可包括(例如)移除及/或置換分子上之一或多個抗原性抗原決定基。
用於本文之方法中的包括玻尿酸酶(例如PH20)之玻尿酸降解酵素可重組產生或可自天然來源(諸如自睪丸提取物)純化或部分純化。本文其他地方提供產生重組蛋白質(包括重組玻尿酸降解酵素)之方法且其為此項技術所熟知。
1)　可溶性人類PH20
舉例而言，已產生可溶性形式之重組人類PH20且其可用於本文所述之方法中以與基質降解酵素、活化劑、麻醉劑、血管收縮劑、其他藥理劑或治療劑或其組合共投藥或共調配，以允許擴散至組織中。該等可溶性形式之PH20的產生描述於相關申請案第11/065,716號及第11/238,171號及以下實施例12-15中。可溶性形式包括(但不限於)具有C-末端截短以產生含有SEQ ID NO:232中所闡明之胺基酸序列之胺基酸1至胺基酸347、372、394、413、430、447、467、477、478、479、480、481、482及483的多肽之任何形式。當表現於哺乳動物細胞中時，35個胺基酸之N-末端信號序列在加工期間裂解，且分泌蛋白質之成熟形式。因此，成熟可溶性多肽含有SEQ ID NO:232之胺基酸36至347、372、394、413、430、447、467、477、478、479、480、481、482及483。結束於胺基酸位置477至483(對應於SEQ ID NO:232中所闡明之前軀體多肽)的缺失突變體展現高於全長GPI錨定形式之分泌性玻尿酸酶活性。因此，可溶性形式包括(但不限於)具有C-末端截短以產生含有SEQ ID NO 226-231中之任一者中分別闡明之胺基酸序列的胺基酸1至胺基酸442、443、444、445、446及447之多肽的任何形式，或其對偶基因或物種變異體或其他變異體。通常，使用促進正確N-糖基化以確保多肽保留活性之蛋白質表現系統來產生可溶性形式之PH20，因為糖基化對於玻尿酸酶之催化活性及穩定性而言至關重要。該等細胞包括(例如)中國倉鼠卵巢(CHO)細胞(例如DG44 CHO細胞)。
2)　rHuPH20
已產生重組可溶性形式之人類PH20且可使用本文所述之方法產生及純化。該等可溶性形式之重組人類PH20的產生描述於相關申請案第11/065,716號及第11/238,171號及以下實施例12-15中。該多肽之實例為自編碼SEQ ID NO:225中所闡明之胺基酸1-482的核酸分子產生者。此PH20之產生、製備及純化描述於以下實施例12-15中。由於產生及純化之後培養基中存在肽酶，故所得經純化之rHuPH20可為異質的。當產生於培養基中時，於C-末端處存在異質性從而稱為rHuPH20之產物包括可包括各種量之SEQ ID NO. 226-231之任一或多者的物質之混合物。通常，使用促進正確N-糖基化以確保多肽保留活性之蛋白質表現系統產生可溶性形式之PH20(諸如rHuPH20)，因為糖基化對於玻尿酸酶之催化活性及穩定性而言至關重要。該等細胞包括(例如)中國倉鼠卵巢(CHO)細胞(例如DG44 CHO細胞)。
諸如任何玻尿酸酶(尤其可溶性PH20，諸如rHuPH20)之玻尿酸降解酵素可藉由如本文其他地方所述之任何合適之途徑來投予。典型地，投藥係藉由非經腸投藥進行，諸如藉由皮內、肌肉內、皮下或血管內投藥進行。本文所提供之化合物可經調配用於藉由注射(例如藉由快速注射或連續輸注)進行非經腸投藥。用於注射之調配物可以添加防腐劑之單位劑型提供，例如於安瓶中或於多劑量容器中。組成物可為於油性或水性媒劑中之懸浮液、溶液或乳液，且可含有調配劑，諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑。或者，活性成份可呈粉末形式以在使用之前用合適媒劑(例如無菌無熱原質水或其他溶劑)復水。舉例而言，本文提供呈經穩定溶液或懸浮液或凍乾形式之含有有效量之可溶性pH20的非經腸調配物，諸如10單位至500,000單位、100單位至100,000單位、500單位至50,000單位、1000單位至10,000單位、5000單位至7500單位、5000單位至50,000單位或1,000單位至10,000單位，通常為10,000單位至50,000單位。該等調配物可以單位劑型提供，諸如(但不限於)安瓶、注射器及個別包裝之錠劑或膠囊。該分散劑可單獨投予，或以1-100ml、1-50ml、10-50ml、10-30ml、1-20ml或1-10ml(典型地10-50ml)之總體積與其他藥理學有效藥劑一起投予。
在組合療法之一實例中，本文涵蓋將麻醉劑、血管收縮劑及分散劑與可活化的基質降解酵素及/或活化劑共投予或共調配，該可活化的基質降解酵素及/或活化劑欲與其相繼、同時或間歇投予。一例示性調配物為含有利多卡因、腎上腺素及可溶性PH20之調配物，例如SEQ ID NO:226中所闡明之可溶性PH20。可溶性PH20可直接與利多卡因(木卡因(Xylocaine))混合，且視情況與腎上腺素混合。該調配物可以單位劑型製備，諸如於注射器中。舉例而言，利多卡因/腎上腺素/可溶性PH20調配物可以諸如1-100ml、1-50ml、10-50ml、10-30ml、1-20ml或1-10ml(典型地10-50ml)之體積提供，預先包裝於注射器中以供使用。
在組合療法中，諸如利多卡因/腎上腺素/可溶性PH20調配物之其他藥理學藥劑可與可活化的基質降解酵素(及活化劑)一起共投予或與可活化的基質降解酵素(及活化劑)之投予在時間上極接近地共投予。典型地，較佳麻醉劑及/或分散劑在藥理劑之前不久(例如之前5至60分鐘)或出於最大方便性與其一起投予。如熟習此項技術者應瞭解，共投藥之所需接近度在很大程度上視在特定組織環境中藥劑之有效半衰期及所治療之特定疾病而定，且可易於藉由在合適模型中(諸如在合適動物模型中)測試以不同時間投予藥劑之作用來優化。
iv.　修飾玻尿酸降解酵素以改良其藥物動力學性質
玻尿酸降解酵素可經修飾以改良其藥物動力學性質，諸如增加其活體內半衰期及/或活性。對用於所提供之組成物、組合及/或方法中之玻尿酸降解酵素的修飾可包括直接或經由連接子、諸如葡聚糖、聚乙二醇(聚乙二醇化(PEG))或唾液酸基部分之聚合物或諸如天然或糖聚合物之其他此類聚合物間接連接(諸如共價或藉由其他穩定鍵聯)。
已知治療劑之聚乙二醇化增加對蛋白水解之抵抗力，增加血漿半衰期，且降低抗原性及免疫原性。因此諸如聚乙二醇部分(PEG)之聚合分子之共價或其他穩定連接(接合)於玻尿酸降解酵素可賦予所得酵素-聚合物組成物有益性質。該等性質包括改良之生物相容性，蛋白質(及酵素活性)在血液、細胞及/或在個體體內之其他組織中半衰期延長，有效保護蛋白質以免蛋白酶作用及水解，生物分布改良，藥物動力學及/或藥效學增強，及水溶性增加。
可與玻尿酸降解酵素接合之例示性聚合物包括天然及合成均聚物，諸如多元醇(亦即poly-OH)、多元胺(亦即poly-NH2 )及聚羧酸(亦即poly-COOH)，且進一步包括雜聚物，亦即包含一或多種不同偶合基團(例如羥基及胺基)之聚合物。合適聚合分子的實例包括選自以下各物之聚合分子：聚伸烷基氧化物(polyalkylene oxide，PAO)，諸如聚伸烷基二醇(polyalkylene glycol，PAG)，包括聚丙二醇(polypropylene glycol，PEG)、甲氧基聚乙二醇(methoxypolyethylene glycol，mPEG)及聚丙二醇；PEG-縮水甘油醚(Epox-PEG)；PEG-氧羰基咪唑(CDI-PEG)；支鏈聚乙二醇(PEG)；聚乙烯醇(polyvinyl alcohol，PVA)；聚羧酸酯；聚乙烯吡咯啶酮；聚-D,L-胺基酸；聚乙烯-共-順丁烯二酸酐；聚苯乙烯-共-順丁烯二酸酐；葡聚糖，包括羧甲基-葡聚糖；肝素；同源白蛋白；纖維素，包括甲基纖維素、羧甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羧乙基纖維素及羥丙基纖維素；聚葡萄胺糖(chitosan)之水解物；澱粉，諸如羥乙基-澱粉及羥丙基-澱粉；糖原；瓊脂糖及其衍生物；瓜爾膠(guar gum)；支鏈澱粉；菊糖；三仙膠(xanthan gum)；角叉菜膠；果膠；海藻酸水解物及生物聚合物。
典型地，該等聚合物為聚伸烷基氧化物(PAO)，諸如聚氧化乙烯，諸如PEG，典型地為mPEG，與諸如葡聚糖、支鏈澱粉及其類似物之多醣相比，其具有能夠交聯之反應性更小的基團。典型地，該等聚合物為無毒聚合分子，諸如(m)聚乙二醇(mPEG)，其可使用相對簡單化學與玻尿酸降解酵素(例如與蛋白質表面上之連接基團)共價接合。
適合於連接於玻尿酸降解酵素之聚合分子包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)及PEG衍生物，諸如甲氧基-聚乙二醇(mPEG)、PEG-縮水甘油醚(Epox-PEG)、PEG-氧羰基咪唑(CDI-PEG)、支鏈PEG及聚氧化乙烯(PEO)(參見例如，Roberts等人,Advanced Drug Delivery Review 2002,54:459-476；Harris及Zalipsky,S (eds.) 「Poly(ethylene glycol),Chemistry and Biological Applications」 ACS Symposium Series 680,1997；Mehvar等人,J. Pharm. Pharmaceut. Sci .,3(1):125-136,2000；Harris,Nature Reviews 2:215以及下列等等(2003)；及TSubery,J Biol. Chem 279(37):38118-24,2004)。該聚合分子可具有典型地範圍為約3kDa至約60kDa之分子量。在一些具體實例中，與蛋白質(諸如rHuPH20)接合之聚合分子具有5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa、35kDa、40kDa、45kDa、50kDa、55kDa、60kDa或大於60kDa之分子量。
藉由共價連接(接合)PEG或PEG衍生物(亦即「聚乙二醇化(PEGylation)」)來修飾多肽之各種方法為此項技術所已知(參見例如，美國專利第5,672,662號及US 6,737,505；及美國公開案第 2006/0104968號及第2004/0235734號)。聚乙二醇化之技術包括(但不限於)指定連接子及偶合化學(參見例如，Harris,Adv. Drug Deliv.Rev. 54:459-476,2002)、使多個PEG部分連接於單一接合位點(諸如經由使用支鏈PEG；參見例如，Veronese等人，Bioorg. Med. Chem. Lett. 12:177-180,2002)、位點特異性聚乙二醇化及/或單聚乙二醇化(參見例如，Chapman等人，Nature Biotech. 17:780-783,1999)及定點酶促聚乙二醇化(參見例如，Sato,Adv.DrugDeliv.Rev., 54:487-504,2002)(亦參見例如，Lu及Felix(1994)Int.J.Peptide Protein Res. 43:127-138；Lu及Felix(1993)Peptide Res. 6:142-6,1993；Felix等人(1995)Int.J.Peptide Res. 46:253-64；Benhar等人(1994)J.Biol.Chem. 269:13398-404；Brumeanu等人(1995)J Immunol. 154:3088-95；亦參見Caliceti等人(2003)Adv. Drug Deliv. Rev. 55(10):1261-77及Molineux(2003)Pharmacotherapy 23(8 Pt 2):3S-8S)。此項技術中所述之方法及技術可製備具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或大於10個連接於單一蛋白質分子之PEG或PEG衍生物的蛋白質(參見例如，美國公開案第2006/0104968號)。
用於聚乙二醇化之諸多試劑已在此項技術中描述。該等試劑包括(但不限於)經N-羥基丁二醯亞胺基(N-hydroxysuccinimidyl，NHS)活化之PEG、丁二醯亞胺基mPEG、mPEG2-N-羥基丁二醯亞胺、mpEG丁二醯亞胺基α-甲基丁酸酯、mPEG丁二醯亞胺基丙酸酯、mPEG丁二醯亞胺基丁酸酯、mPEG羧甲基3-羥基丁酸丁二醯亞胺基酯、同雙官能PEG-琥珀醯亞胺基丙酸酯、同雙官能PEG丙醛、同雙官能PEG丁醛、pEG順丁烯二醯亞胺、PEG醯肼、對硝基苯基-碳酸酯PEG、mPEG-苯并三唑碳酸酯、丙醛PEG、mPEG丁醛、支鏈mPEG2丁醛、mPEG乙醯基、mPEG哌啶酮、mPEG甲基酮、mPEG「無連接子」順丁烯二醯亞胺、mPEG乙烯碸、mPEG硫醇、mPEG鄰吡啶基硫酯(orthopyridylthioester)、m PEG鄰吡啶基二硫化物、Fmoc-PEG-NHS、Boc-PEG-NHS、乙烯碸PEG-NHS、丙烯酸酯PEG-NHS、螢光素PEG-NHS及生物素pEG-NHS(參見例如，Monfardini等人，Bioconjugate Chem. 6:62-69,1995；Veronese等人，J. Bioactive Compatible Polymers 12:197-207,1997；US 5,672,662；US 5,932,462；US 6,495,659；US 6,737,505；US 4,002,531；US 4,179,337；US 5,122,614；US 5,183,550；US 5,324,844；US 5,446,090；US 5,612,460；US 5,643,575；US 5,766,581；US 5,795,569；US 5,808,096；US 5,900,461；US 5,919,455；US 5,985,263；US 5,990,237；US 6,113,906；US 6,214,966；US 6,258,351；US 6,340,742；US 6,413,507；US 6,420,339；US 6,437,025；US 6,448,369；US 6,461,802；US 6,828,401；US 6,858,736；US 2001/0021763；US 2001/0044526；US 2001/0046481；US 2002/0052430；US 2002/0072573；US 2002/0156047；US 2003/0114647；US 2003/0143596；US 2003/0158333；US 2003/0220447；US 2004/0013637；US 2004/0235734；US 2005/000360；US 2005/0114037；US 2005/0171328；US 2005/0209416；EP 01064951；EP 0822199；WO 00176640；WO 0002017；WO 0249673；WO 9428024；及WO 0187925)。
在一實例中,用於所提供之方法、組成物及組合中之玻尿酸降解酵素為經聚乙二醇化之可溶性玻尿酸酶。在一特定實例中,該可溶性玻尿酸酶為經聚乙二醇化之PH20玻尿酸酶。在另一特定實例中,可溶性玻尿酸酶為經聚乙二醇化之rHuPH20。
G.　可活化的基質降解酵素之包裝及製品
所選基質降解酵素或編碼所選基質降解酵素之核酸或其衍生物或變異體的醫藥化合物可包裝為含有包裝材料、有效治療疾病或病症之醫藥組成物及指示所選基質降解酵素或核酸分子欲用於治療疾病或病症之標籤的製品。所選基質降解酵素或其衍生物或變異體與活化劑之組合亦可包裝於製品中。
本文所提供之製品含有包裝材料。用於包裝醫藥產品之包裝材料為熟習此項技術者所熟知。參見例如,美國專利第5,323,907號、第5,052,558號及第5,033,252號，其中每一者係以全文引用的方式併入本文中。醫藥包裝材料之實例包括(但不限於)發泡包裝、瓶、管、吸入器、泵、袋、小瓶、容器、注射器、瓶及適合於所選調配物及所欲投藥方式及治療之任何包裝材料。出於局部注射目的，該製品可包括針或其他注射裝置以便於投藥(例如表皮下投藥)。涵蓋本文所提供之化合物及組成物之各種調配物，以及用於任何ECM介導之疾病或病症的各種治療。
包裝之選擇視基質降解酵素及活化劑及該等組成物是否將包裝在一起或分開包裝而定。一般而言，該包裝不與其中所含之組成物反應以使可活化的基質降解酵素之活化不在添加活化劑之前發生。在一實例中，該可活化的基質降解酵素可以與活化劑之混合物形式包裝。因此，舉例而言，需要低pH值以供活化的溶酶體酵素(例如組織蛋白酶L)可以與緩衝酸性溶液之混合物形式包裝。
在另一實例中，該等組份可以分開的組成物形式包裝，此在混合之後使基質降解酵素活化。舉例而言，含有基質降解酵素之組成物可與含有活化劑(諸如經緩衝酸性溶液)之組成物分開提供，且與其一起使用。因此，在該等實例中，將可活化的基質降解酵素包裝於與活化劑分開之容器中，且在使用者願意時藉由暴露於活化劑而達成活化。暴露於活化劑可在投藥之前的任何時間藉由將活化劑添加至酵素中來進行。舉例而言，該容器可具有單一隔室，其含有基質降解酵素且經受得住使用者添加活化劑，例如經由該隔室中之開口。涵蓋經受得住具有容納基質降解酵素之界定空間且經受得住簡單操作以允許添加活化所必需之最終組份的任何容器或其他製品。在使用之前添加該活化劑。暴露於活化劑亦可在向間質投藥之後進行。舉例而言，若熱量為活化劑，則可投予基質降解酵素且使局部注射部位經受加熱。在一替代性實例中，可向間質投予酸性緩衝溶液，接著投予基質降解酵素，例如需要酸性pH值來活化的任何酵素，諸如組織蛋白酶。
在其他實例中，將可活化的基質降解酵素與活化劑一起包裝於容器中，以使基質降解酵素之活化在該容器中經受使用者隨意活化。通常，該等容器之實例包括具有含有基質降解酵素之密封界定空間及含有活化劑之分開的密封界定空間的彼等容器，以使兩個空間由易於移動之膜分隔，該膜在移除之後允許組份混合且從而反應，使蛋白酶活化。涵蓋任何容器或其他製品，只要基質降解酵素與活化劑分開即可。在使用之前使活化劑暴露於基質降解酵素。舉例而言，物理分隔方法為易於由使用者移除以允許混合、使酵素活化之方法。舉例而言，製品可在一個隔室中含有基質降解酵素且在相鄰隔室中含有活化劑。該等隔室由分隔部件(諸如膜)分隔，在壓縮製品之後其破裂，允許分開之組份混合。對於合適之具體實例而言，參見例如美國專利第3,539,794號及第5,171,081號中所述之容器。
以下為可活化的基質降解酵素之各種最終用途之包裝需求的一些實例。此等實例僅作為實例提供且決不意欲作為限制。
1.　單腔室設備
在本文之最簡單具體實例中為設備含有單一腔室或容器且需要時含有噴射構件者。單腔室外殼或容器包括基質降解酵素包括於容器中之任何物品。基質降解酵素以液相或以粉末或其他糊狀物或其他習知組成物形式容納於容器中。在即將使用之前引入活化劑組份。在使用之前，添加典型地以緩衝溶液形式提供之活化劑且使其與基質降解酵素接觸以允許混合及/或基質降解酵素之復水。舉例而言，當需要時且視基質降解酵素而定，將含有Ca2+ 之液體，諸如於適當緩衝液或酸性緩衝溶液或含有活化條件之其他溶液中含有Ca2+ 的混合物添加至容器中。亦提供含有物品及活化劑之套組。
2.　雙腔室設備
用於本文中之所涵蓋之設備的一實例為雙腔室容器。一般而言，此設備具有兩個腔室或隔室，從而保持基質降解酵素與活化劑分開直至需要活化。設備可包括允許在自設備分配之前混合組份之混合腔室。或者，混合可藉由將活化劑自一個腔室噴射至含有可活化的基質降解酵素之第二腔室中來進行。舉例而言，可活化的基質降解酵素可以凍乾形式提供，且復水可藉由將諸如酸性緩衝溶液之活化劑自第一腔室噴射至該含有凍乾酵素之第二腔室中來達成。
在一具體實例中，雙腔室設備在其操作時使用機械泵機制。在該實例中，分配裝置使組份保持在分開的腔室中。泵機制經操作以自各腔室取出內含物且置於混合腔室中，或自一個腔室取出置於第二腔室中。混合之後，藉由腔室中之組份的反應來活化經混合組成物。該泵機制可例如藉由活塞手動操作。該雙腔室設備之實例包括雙腔室注射器(參見例如，美國專利第6,972,005號、第6,692,468號、第5,971,953號、第4,529,403號、第4,202,314號、第4,214,584號、第4,983,164號、第5,788,670號、第5,395,326號；及國際專利申請案第WO2007006030號及第WO2001047584號)。
用於本文中之所涵蓋之雙腔室流體分配裝置的另一具體實例採用可壓縮瓶或管或其他類似裝置之形式。該裝置在其中具有保持組份分開之兩個隔室。裝置之蓋子可充當混合腔室，混合腔室可位於兩個腔室與該蓋子之間，或混合可在腔室之一者中達成。藉由壓縮將組份自分開的隔室推動至該混合腔室中。接著將其自混合腔室分配。舉例而言，可藉由使活塞/注射器設備連接於分配末端且經此取出內含物將混合之內含物自裝置移出。該等裝置為此項技術所已知(參見例如，國際專利申請案第WO1994015848號)。
3.　套組
所選基質降解酵素、活化劑及/或其製品亦可以套組形式提供。套組可包括本文所述之醫藥組成物及以製品形式提供之用於投藥的物品。舉例而言，所選基質降解酵素可由用於投藥之裝置供應，諸如注射器、吸入器、劑量杯、滴管或施藥器。組成物可含於用於投藥之物品中或可分開提供以稍後添加。通常，套組含有具有基質降解酵素及含有活化條件之活化劑組成物之物品。該套組可視情況包括關於包括劑量、給藥方案之應用的說明書及關於投藥方式之說明書。套組亦可包括本文所述之醫藥組成物及用於診斷之物品。舉例而言，該等套組可包括用於量測個體體內之所選蛋白酶之濃度、量或活性的物品。
H.　評估基質降解酵素之活性的方法
1.　評估酵素活性之方法
可測試可活化的基質降解酵素之針對已知受質之酶促活性。可在活化劑存在或不存在之情況下執行活性評估。亦可於不同條件下執行活性評估，例如藉由改變用於活化之活化劑的量來執行。在一實例中，可執行pH值概況以測定於各種pH值條件下酵素之相對活性(參見例如，Dehrmann等人(1995)Arch. Biochm. Biophys., 324:93-98)。可對條件培養基或其他上清液或經純化之蛋白質執行活性評估。
可藉由使用酵素之已知受質檢定受質裂解來評估酶促活性。該等受質可呈經純化之蛋白質的形式或以肽受質形式提供。舉例而言，組織蛋白酶L之酶促活性可藉由裂解經純化之蛋白質(如偶氮酪蛋白(Azocasein)、膠原蛋白、彈性蛋白、人類血清白蛋白及rHuPH20)，藉由將其個別地與ADME一起培養或以兩種或兩種以上經純化之蛋白質的混合物形式培養來評估。藉由酵素使經純化之蛋白質裂解可使用任何蛋白質偵測方法來評估，該方法包括(但不限於)HPLC、CE、質譜法、SDS-PAGE分析、ELISA、西方墨點法(Western blotting)、免疫組織化學、免疫沈澱、NH2 -末端定序及蛋白質標記。
使用受質上之螢光基團促進對裂解之偵測。舉例而言，受質可以肽受質之螢光標記四肽形式，諸如ACC-或7-胺基-4-甲基香豆素(AMC)-四肽提供。其他螢光基團為已知的且可使用並偶合於蛋白質或肽受質。其包括(例如)7-胺基-4-甲基-2-喹啉酮(AMeq)、2-萘胺(NHNap)及7-胺基-4-甲基香豆素(NHMec)及螢光素-5-異硫氰酸酯(FITC)(Sarath等人「Protease Assay Methods,」在Proteolytic Enzymes:A Practical Approach. Robert J. Beynon及Judith S. Bond.編Oxford University Press,2001.第45-76頁中)。肽受質為熟習此項技術者所已知，如例示性螢光肽受質。舉例而言，用於組織蛋白酶B之例示性受質包括N-αBZ-Phe-Val-Arg-p-NA、DNA-Phe-Arg-Nph-Leu、Z-Ala-Arg-Arg-F3 MCA、Z-Arg-Arg-MBNA、Z-Arg-Arg-NHMec、Z-Phe-Arg-NHMec及Z-Leu-Arg-AMC及其變化形式(諸如具有不同螢光基團)。在另一實例中，用於組織蛋白酶L之例示性受質包括Z-Phe-Arg-NHMec及Z-Leu-Arg-AMC及Z-His-Arg-Tyr-Arg-AMC及其變化形式(諸如具有不同螢光基團)。因此，因為組織蛋白酶B及組織蛋白酶L共用相同受質，例如Z-Phe-Arg-NHMec及Z-Leu-Arg-AMC，所以組織蛋白酶L之活性評估可在組織蛋白酶B之特異性抑制劑存在下執行。該抑制劑之實例為CA-074。此在本文之實施例9中舉例說明。用於藉由螢光強度來量測酶促活性之酵素檢定為標準檢定，且典型地根據酵素及受質之培養時間來執行(參見例如，Dehrmann等人(1995)Arch. Biochem. Biophys .,324:93-98；Barrett等人(1981)Methods Enzymol .,80:536-561)。
雖然螢光化合物之偵測可使用螢光計完成，但偵測可藉由熟習此項技術者所熟知之多種其他方法來完成。因此，舉例而言，當螢光團發射可見波長時，偵測可簡單地藉由目測對光源激發作出反應之螢光來進行。偵測亦可藉助於使用連接於數位轉換器之視訊攝影機的圖像分析系統或其他圖像獲取系統來進行。偵測亦可藉由經由濾光器(如在螢光顯微鏡下)觀測來進行。該顯微鏡可提供由操作者簡單地觀測之信號。或者，該信號可記錄於感光膠片上或使用視訊分析系統來記錄。信號亦可簡單地使用圖像分析系統或光度計即時量化。
因此，舉例而言，用於樣品之酵素活性的基礎檢定涉及使該樣品懸浮或溶解於緩衝液中(於所檢定之特定蛋白酶的最佳pH值及離子強度下)，將螢光酵素肽指示劑添加至該緩衝液中，且於用於培養之特定溫度下使用光譜螢光計監測產生之螢光變化，例如如Harris等人，(1998)J Biol Chem 273:27364中所示。該光譜螢光計設定為於螢光團之激發波長下激發螢光團且於螢光團之發射波長下偵測信號。該螢光酵素指示劑為酵素之(例如蛋白酶之)由於蛋白酶裂解指示劑而改變螢光之受質序列。酵素活性典型地根據用不同濃度之螢光受質所產生的校正曲線，以標準單位/毫升表示。
2.　評估ECM降解之方法
可在試管內或活體內評估基質降解酵素(包括(但不限於)上文所述者(諸如組織蛋白酶L))對細胞外基質蛋白質之降解。用於該評估之檢定為熟習此項技術者所已知，且可用於測試多種基質降解酵素對多種細胞外基質蛋白質之活性，該等蛋白質包括(但不限於)膠原蛋白(I、II、III及IV)、纖維結合蛋白、玻璃連結蛋白及蛋白聚糖。
a.　試管內檢定
例示性試管內檢定包括在與基質降解酵素一起培養後評估細胞外基質蛋白質之降解產物的檢定。在一些實例中，該等檢定偵測單一特定降解產物。在其他實例中，檢定偵測多種降解產物，其一致性可能已知或可能未知。降解產物之評估可使用此項技術中熟知之方法執行，該等方法包括(但不限於)HpLC、CE、質譜法、SDS-PAGE分析、ELISA、西方墨點法、免疫組織化學、免疫沈澱、NH2 -末端定序及蛋白質標記。細胞外基質降解產物可在與基質降解酵素一起於適當溫度下培養適量時間後例如藉由SDS-PAGE分析觀測。舉例而言，可將膠原蛋白與經活化之組織蛋白酶L一起培養且經受使用(例如)4-20% Tris/甘胺酸凝膠之SDS-PAGE以分離產物。對該凝膠之庫馬斯染色利於觀測與完整膠原蛋白相比較小之降解產物，或膠原蛋白條帶之消失。使用(例如)對細胞外基質蛋白質具特異性之多株Ig的免疫墨點法亦可用於在用SDS-PAGE分離後觀測降解產物。
在降解細胞外基質蛋白質後特異性偵測單一產物之檢定亦為此項技術所已知且可用於評估基質降解酵素降解細胞外基質蛋白質之能力。舉例而言，羥基脯胺酸(HP)檢定可用於量測膠原蛋白之降解。4-羥基脯胺酸為佔膠原蛋白重量之約12%的經修飾之亞胺基酸。HP檢定藉由在與基質降解酵素(諸如經活化之組織蛋白酶L)一起培養後測定上清液中之HP的量來量測溶解之膠原蛋白的量(參見例如以下實施例2及Reddy及Enwemeka(1996)Clinical Biochemistry 29:225-229)。HP之量測可藉由例如比色法、高效液相層析法、質譜法及酶促方法實現(參見例如，Edwards等人,(1980)Clin. Chim. Acta 104:161-167；Green(1992)Anal. Biochem . 201:265-269；Tredget等人,(1990)Anal. Biochem. 190:259-265；It0等人,(1985)Anal. Biochem. 151:510-514；Garnero等人(1998)J. Biol. Chem 273:32347-32352)。
用於該等試管內檢定中之膠原蛋白來源可包括(但不限於)市售經純化之膠原蛋白、骨顆粒、皮膚、軟骨及大鼠尾腱。諸如組織蛋白酶L之基質降解酵素之溶膠原活性可藉由將經活化之酵素與不溶性膠原蛋白懸浮液一起培養，接著諸如用HCl水解來評估。來源於溶解(降解)之膠原蛋白之羥基脯胺酸的量可在與艾利希試劑(Ehrlich's reagent)一起培養後藉由光譜分析法來測定，諸如量測於550nm下之吸光度。在一些實例中，膠原蛋白來源為以手術方式自麻醉動物移除且接著首先用酸性溶液且接著用基質降解酵素(諸如組織蛋白酶L)灌注之大鼠或豬皮膚外植體(參見例如以下實施例3-4)。接著可評估灌注液中之HP含量。在此方法之改良形式中，可評估例如組織蛋白酶L對外植體中之纖維中隔的作用(參見例如實施例5)。簡言之，在用基質降解酵素灌注後，將外植體切成小塊且包埋於石蠟中並在馬松三色染色(Masson's Trichrome staining)後藉由顯微術分析以觀測膠原蛋白。可觀測膠原蛋白纖維中隔之數目且與尚未用基質降解酵素處理之組織相比較。
偵測特定膠原蛋白之降解的檢定亦為此項技術所已知。該等檢定可使用免疫方法來偵測特定膠原蛋白獨有之降解產物。舉例而言，一些基質降解酵素對膠原蛋白I之降解釋放具有不同抗原決定基之端肽，其可使用免疫檢定來偵測。該等檢定偵測交聯N-端肽(NTx)及交聯C-端肽(CTx及ICTP)，其中每一者均含有獨特抗原決定基。典型地，CTx檢定使用識別8個胺基酸之序列EKAHD-β-GGR八肽的CrossLaps(Nordic Biosciences)抗體，其中在α1鏈之C-末端端肽區域中天冬胺酸呈β-異構化構型(Eastell(2001)Bone Markers:Biochemical and Clinical Perspectives,第40頁)。偵測ICTP之免疫檢定亦為此項技術所已知且可用於偵測膠原蛋白I之降解(美國專利第5,538,853號)。在其他實例中，諸如ELISA之免疫檢定可用於在將I型膠原蛋白與蛋白酶(諸如組織蛋白酶K、S、L及B)一起培養後偵測NTx(Atley等人,(2000)Bone ,26:241-247)。對於降解之膠原蛋白具特異性的其他抗體及檢定為此項技術所已知且可用於偵測由基質降解酵素進行之降解。其包括對於降解之膠原蛋白I(Hartmann等人(1990)Clin. Chem. 36:421-426)、膠原蛋白II(Hollander等人(1994)J. Clin. Invest. 93:1722-1732)、膠原蛋白III(美國專利第5,34,2756號)及膠原蛋白IV(Wilkinson等人(1990)Anal. Biochem. 185:294-6)具特異性的抗體及檢定。
b.　活體內檢定
偵測ECM之活體內降解的檢定亦為此項技術所已知。該等檢定可使用上述偵測生物樣品(諸如尿、血液、血清及組織)中之(例如)羥基脯胺酸及N-端肽與C-端肽及降解之膠原蛋白或其他ECM的方法。對降解之ECM的偵測可在向患者投予一或多種基質降解酵素後執行。對吡啶啉(PYD)及脫氧吡啶啉(DPYD)之偵測亦可用於評估膠原蛋白之降解。分別亦稱為羥基離胺醯基吡啶啉(hydroxylysylpyridinoline)及離胺醯基吡啶啉(lysylpyridinoline)之PYD及DPYD為兩種不可還原性三價交聯，其使I型膠原蛋白鏈穩定且在成熟膠原纖維之降解期間釋放。吡啶啉在骨及軟骨中豐富，而脫氧吡啶啉基本上侷限於骨中。III型膠原蛋白於胺基末端處亦含有吡啶啉交聯。可在逆相HPLC後藉由螢光偵測來量測例如水解之尿樣品或血清中的總PYD及DPYD(Hata等人(1995)Clin .Chimica .Acta . 235:221-227)。
c.　非人類動物模型
可使用非人類動物模型來評估基質降解酵素之活性。舉例而言，非人類動物可用作疾病或病狀之模型。可在投予基質降解酵素之前給非人類動物注射疾病及/或表型誘導物質。遺傳模型亦適用。可藉由一或多種基因之過度表現、表現不足(underexpression)或剔除來產生模擬疾病或病狀之動物(諸如小鼠)。舉例而言，在此項技術中已知包括(但不限於)以下病狀之動物模型：帕榮雷氏病(Davila等人(2004)Biol .Reprod .,71:1568-1577)、肌腱變性(Warden等人,(2006)Br .J .Sports Med . 41:232-240)及硬皮病(Yamamoto(2005)Cur .Rheum .Rev . 1:105-109)。
亦可使用非人類動物來活體內測試非患病動物體內之基質降解酵素之活性。舉例而言，可向諸如小鼠、大鼠或豬之非人類動物投予基質降解酵素，且可測定ECM降解之程度。在一些實例中，使用該等動物獲得外植體以活體外評估ECM降解，諸如上文及以下實施例3-5中所述之該降解。在其他實例中，活體內評估ECM降解。在一實例中，評估經麻醉之大鼠之皮膚的膠原蛋白降解(參見例如以下實施例6)。簡言之，經由將針插入尾部皮膚之真皮層中來灌注於具有pH 5之緩衝液中之基質降解酵素(諸如組織蛋白酶L)。自尾部皮膚收集灌注液部分且藉由羥基脯胺酸分析來分析膠原蛋白降解。可使用其他方法來偵測降解，包括(但不限於)上述檢定中之任一者，諸如偵測特定降解產物之免疫檢定。向皮膚投予促進最佳活性之酸性溶液(諸如含有組織蛋白酶L之緩衝液)之作用亦可在非人類動物模型中評估(參見例如實施例7)。對pH值變化敏感之染料(諸如酚紅)可用於此等目的。
I.　治療ECM之疾病或缺陷的例示性方法
本文所提供之可活化的基質降解酵素可用於治療由任一或多種ECM組份介導之任何病狀。本部分提供可活化的基質降解酵素之例示性用途及投藥方法。此等所述療法為例示性的且並不限制酵素之應用。該等方法包括(但不限於)治療由任一或多種ECM組份之過量、異常或積累表現所引起的任何ECM病狀或疾病之方法。欲治療之疾病或病狀之實例為由膠原蛋白、彈性蛋白、纖維結合蛋白或葡糖胺聚糖(諸如蛋白聚糖)介導之任何疾病或病狀。舉例而言，膠原蛋白介導之疾病或病症之實例包括(但不限於)脂肪團、杜普宜特朗氏病(亦稱為杜普宜特朗氏攣縮)、帕榮雷氏病、凍肩、腱之慢性肌腱變性或瘢痕組織、局部硬皮病及淋巴水腫。其在治療醫師確定該等疾病或病狀之技能範圍內。
欲治療之特定疾病或病狀指定所選擇之可活化的基質降解酵素。舉例而言，膠原蛋白介導之疾病或病症的治療可藉由投予裂解膠原蛋白之基質降解酵素來實現。該等基質降解酵素列於上文表3中，且/或為熟習此項技術者所已知。因此可選擇可活化的基質降解酵素及用於活化之系統及方法以治療特定疾病或病狀。舉例而言，半胱胺酸及天冬胺酸家族之組織蛋白酶可藉由如本文中所述之酸性pH值條件使得暫時具活性。因此，在一實例中，裂解膠原蛋白之組織蛋白酶(例如組織蛋白酶L)可在諸如酸性pH值之活化條件存在下投予以治療膠原蛋白介導之疾病或病狀。
用可活化的基質降解酵素治療疾病及病狀可藉由任何合適投藥途徑使用如本文中所述之合適調配物來實現，該等途徑包括(但不限於)皮下注射、肌肉內、皮內及表面與經皮投藥。如上文所述，典型地選擇使得在皮膚下方直接向受影響部位投予之可活化的基質降解酵素之投藥途徑。該等投藥途徑之實例包括(但不限於)皮下、肌肉內或皮內投藥。
必要時，特定劑量及持續時間及治療方案可憑經驗確定或推斷。舉例而言，重組及天然活性基質降解酵素或可活化的基質降解酵素之例示性劑量可用作確定適當劑量之起點。劑量水準可根據多種因素來確定，諸如個體之體重、一般健康情況、年齡、所用特定化合物之活性、性別、飲食、投藥時間、排泄速率、藥物組合、疾病之嚴重性及病程及患者患病之傾向及治療醫師之判斷。可與載劑物質組合以製備單一劑型之活性成份之量將視特定基質降解酵素、所治療之宿主、特定投藥方式及活化所需之活化條件及/或需要活化之預定時間或時間長度而不同。醫藥組成物典型地應提供約1μg/ml至約20mg/ml之劑量。通常，劑量為或約為每單劑量投藥10至1mg/ml，典型地為約100μg/ml。應瞭解投藥量將與所選可活化的基質降解酵素及活化條件、所治療之適應症及將耐受之可能副作用有關。劑量可使用各病症之公認模型憑經驗確定。又，如本文其他地方所述，可活化的基質降解酵素可與其他藥劑組合依次、同時或間歇投予。該等藥劑之實例包括(但不限於)利多卡因、腎上腺素、諸如玻尿酸酶之分散劑及其組合。
在改善患者病狀之後，必要時可投予維持劑量之化合物或組成物；且可修改劑量、劑型、或投藥頻率或其組合。在一些情況下，在任何疾病症狀復發後，個體可能需要長期間歇治療。
以下作為ECM組份在不同疾病及病狀中之作用的實例提供對膠原蛋白與膠原蛋白介導之疾病或病狀之相關性的描述。該等描述意欲僅為例示性的且並不限於特定可活化的基質降解酵素或特定ECM介導之疾病或病狀。熟習此項技術者可根據特定酵素裂解或降解特定疾病或病狀所涉及之ECM組份之能力選擇可活化的基質降解酵素及用於其活化之活化條件，以用於治療任何所需ECM介導之疾病。特定治療及劑量可由熟習此項技術者確定。評估治療中之考慮因素包括(例如)欲治療之疾病、疾病所涉及之ECM組份、疾病之嚴重性及病程、出於預防性或治療性目的投予可活化的基質降解酵素、先前療法、患者之臨床病史及對療法之反應及主治醫師之判斷。
膠原蛋白介導之疾病或病狀
膠原蛋白為哺乳動物生物體之主要結構組份且佔皮膚及動物體之其他部分之總蛋白質含量的大部分。諸多疾病及病狀與過量膠原蛋白沈積相關，例如由於富含膠原蛋白之纖維組織的錯誤積累或其他原因。膠原蛋白介導之疾病或病狀(亦稱為纖維變性組織病症)為熟習此項技術者所已知(參見例如，公開美國申請案第20070224183號；美國專利第6,353,028號；第6,060,474號；第6,566,331號；第6,294,350號)。過量膠原蛋白已與諸如(但不限於)以下疾病及病狀相關：導致瘢痕形成之纖維變性疾病或病狀、脂肪團、杜普宜特朗氏症候群、帕榮雷氏病、凍肩、局部硬皮病、淋巴水腫、間質性膀胱炎(Interstitial cystitis，IC)、毛細管擴張(Telangrectase)、巴瑞特氏化生(Barrett's metaplasia)、腸管囊腫樣氣腫(Pneumatosis cytoides intestinalis)、膠原性結腸炎。舉例而言，諸如皺紋、脂肪團形成及贅生性纖維變性之皮膚的損毀性病狀由過量膠原蛋白沈積引起，其產生正常組織結構之不當結合及變形。
可使用包括(但不限於)組織蛋白酶L之本文所述之可活化的基質降解酵素來治療膠原蛋白介導之疾病或病狀。用於治療本文所述之疾病及病狀之可活化的基質降解酵素之實例為於中性pH值下具活性且其活性需要持續酸性條件的彼等酵素。舉例而言，細胞外基質(諸如皮膚間質)之暫時性酸化可藉由於受影響部位處直接輸注經緩衝酸性溶液來達成。在一實例中，緩衝酸溶液可經由上皮下投藥(亦即皮膚下方)來投予，以使得直接於存在及積累ECM組份之部位處實現投藥。鑒於本文之描述，可使用其他活化方法，且其為熟習此項技術者所已知。
a.　脂肪團
諸如本文所述者之可活化的基質降解酵素(包括組織蛋白酶L)可用於治療脂肪團。在正常脂肪組織中，血管及淋巴管之細孔供應組織必需營養物及氧，且負責代謝產物之移除。舉例而言，甘油三酯儲存於分組成富含毛細管之小葉的個別脂肪細胞中。各脂肪小葉由脂肪細胞構成。稱為纖維中隔之膠原纖維的垂直線分隔脂肪小葉且使上層淺筋膜拴連於下層肌肉。
脂肪團典型地特徵在於由血管完整性之破壞及皮膚之真皮及皮下層面中之毛細管網的損失引起之真皮退化。血管退化傾向於減少真皮代謝。此減少之代謝阻礙蛋白質合成及修復過程，其導致真皮變薄。該病狀進一步特徵在於脂肪細胞變得充滿脂質，腫脹且聚集在一起，以及過量流體滯留在皮膚之真皮及皮下區域中。脂肪小球或脂肪細胞之積累造成需要較大血液供應以提供額外營養。為了向組織提供血液，形成新毛細管，其釋放更多濾液，導致組織之間質液飽和，引起脂肪組織水腫。間質組織中豐富的網狀纖維在聚集之脂肪細胞附近積累且變厚；其形成囊或中隔，該等囊或中隔逐漸轉化為膠原纖維且感覺如節結。此等中隔之形成進一步滯留脂肪細胞。膠原纖維亦沈積於間質組織空間中，使得結締組織硬化(變硬)。
因此，當病狀進一步發展時，真皮區域中形成由中隔包圍之脂肪細胞之硬節結及脂肪之結塊。此導致皮膚表面顯示相當大的不均勻性且表徵為具有「乾酪」或「橘皮」外觀。當使皮膚連接於真皮及較深組織層之纖維中隔收緊且拉入皮膚中時產生凹痕。因此，脂肪團之「橘皮」外觀係歸因於由對脂肪組織之外力引起的脂肪小葉之變形。脂肪小葉可例如大至1cm寬，且容易突出至上層真皮中，引起皮膚表面上之明顯變形。最後結果為當將脂肪向上推時表皮出現波浪形外觀。當結締中隔在與此等向外力相同之方向上移動時，其會不提供反作用力來防止脂肪突出至真皮中。
脂肪團在女性中比在男性中更普遍。脂肪團之發生率估計在女性群體之60%與80%之間且其嚴重性傾向於隨肥胖惡化。最近，公開研究藉由活體內磁共振成像展示，患有脂肪團之女性的垂直纖維中隔之百分比高於未患脂肪團之女性或男性(Querleux等人，(2002)Skin Research and Technology ,8:118-124)。脂肪團最常發生在臀部、大腿及上臂。舉例而言，停經前女性傾向於皮下積累脂肪，主要在脂肪團最常見之臀肌/大腿區域。臨床上，脂肪團伴隨有包括表皮變薄、導致流體皮下積累之微脈管系統的減少及破壞及脂肪組織之皮下聚集的症狀。
b.　杜普宜特朗氏病
諸如本文所述者之可活化的基質降解酵素可用於治療杜普宜特朗氏症候群(亦稱為杜普宜特朗氏攣縮)。杜普宜特朗氏攣縮(亦稱為杜普宜特朗病(Morbus Dupuytren))為手部固定性屈曲攣縮，其中手指彎向手掌且不能完全伸展。類似病變有時發生在腳部。手部之結締組織變得異常厚且伴隨有存在含有纖維母細胞及膠原蛋白(尤其III型膠原蛋白)之節結。膠原蛋白之纖維索帶常常與脂肪組織之中隔樣排列交替。臨床上以不同尺寸之床墊型「團塊」存在且杜普宜特朗氏病中存在之此等物質稱為節結。此可引起手指捲曲，且會導致手指(尤其小指及無名指)之功能減弱。杜普宜特朗氏病主要在男性中出現。其通常見於中年及老年人，北歐血統者，及患有某些慢性疾病(諸如糖尿病、酒精中毒及吸煙)者中。
杜普宜特朗氏病為存在許多年之緩進型疾病，其引起手指之掌指(MP)及近端指間(PIP)關節的固定性屈曲畸形。小指及無名指最常受影響。該疾病經由三個階段進展(Luck等人(1959)J. Bone Joint Surg. ,41A:635-664)。初始增殖階段之特徵在於手掌筋膜中形成節結，其中稱為肌纖維母細胞之細胞出現且開始增殖。退化或中期疾病階段涉及肌纖維母細胞增生及活性III型膠原蛋白形成。在最後或剩餘階段中，節結消失，留下無細胞組織及膠原蛋白之厚條帶。III型膠原蛋白與I型膠原蛋白之比率增大。用可活化的基質降解酵素治療杜普宜特朗氏病典型地在中期疾病及剩餘疾病階段中進行。
c.　帕榮雷氏病
諸如本文所述者之可活化的基質降解酵素可用於治療帕榮雷氏病。帕榮雷氏病為涉及陰莖軟組織中之纖維斑塊生長的結締組織病症，其影響多達1-4%之男性。膠原蛋白為帕榮雷氏病中之斑塊的主要組份。具體言之，在白膜(包圍陰莖海綿體之纖維包膜)中出現纖維化過程。與帕榮雷氏病相關之疼痛及損毀與陰莖之物理結構有關，其中發現兩個稱為海綿體(其為尿自膀胱所流經之管道(尿道))之勃起桿，及將海綿體與陰莖皮膚之外層分隔的被膜。展現帕雷榮氏病之人將在被膜與皮膚之此等外層之間(本申請案中稱為「皮下」)形成斑塊或瘢痕組織。膜之瘢痕形成或斑塊積累降低其彈性，使得在受影響區域中其不會伸展至與周圍未受影響之組織相同的程度(即使如此)。因此，勃起陰莖在瘢痕或斑塊積累之方向上彎曲，常常伴有一定程度之相關疼痛。在帕雷榮氏病之所有(但次要)表現中，患者具有一定程度之性功能障礙。在更嚴重情況下，無法進行性交，或者如此疼痛以致實際上受到阻礙。
實驗證據指示帕雷榮氏病發病率約為男性群體之1%。儘管疾病主要出現在中年男性中，但較年輕及老年男性可患該病。約30%患有帕雷榮氏病之男性亦在身體之其他彈性組織中(諸如手或腳上)發展纖維化(硬化細胞)。該等其他病狀之常見實例包括手部杜普宜特朗氏攣縮及腳部萊德豪斯纖維化(Ledderhose Fibrosis)。
d.　萊德豪斯纖維化
諸如本文所述者之可活化的基質降解酵素可用於治療萊德豪斯纖維化。萊德豪斯纖維化類似於杜普宜特朗氏病及帕榮雷氏病，其例外之處在於由纖維母細胞增生及膠原蛋白沈積引起之纖維化發生在腳部。萊德豪斯病之特徵在於遍及腳底內側之腳底纖維化，且有時稱為腳底纖維化。
e.　關節僵硬
諸如本文所述者之可活化的基質降解酵素可用於治療關節僵硬，例如凍肩。凍肩(黏連性關節囊炎)為關節囊之慢性纖維化病狀，其特徵在於肩部之疼痛及運動喪失或僵硬。其影響約2%之普通群體。凍肩由纖維母細胞基質合成增加引起。該合成由導致細胞激素及生長因子過量產生之過量發炎性反應引起。纖維母細胞及肌纖維母細胞在肩部囊中沈積膠原蛋白(尤其I型及III型膠原蛋白)之稠密基質。此導致有瘢痕、收縮之肩部囊且引起關節僵硬。
關節僵硬之其他實例包括(但不限於)由囊攣縮、黏連性關節囊炎及關節纖維化引起者，其由肌肉骨骼手術引起。該等關節僵硬可發生在包括(例如)膝關節、肩關節、肘關節、踝關節及髖關節之關節。類似於凍肩，該等關節疾病由基質合成增加及瘢痕形成引起。關節僵硬不可避免地可引起異常高壓力傳輸至受影響區域之關節軟骨。隨時間，此等壓力導致發展退化性關節病及關節炎。舉例而言，在關節纖維化及囊攣縮中，纖維母細胞對局部創傷(諸如關節錯位)作出反應而形成過量基質。
f.　現有瘢痕
諸如本文所述者之可活化的基質降解酵素可用於治療現有瘢痕。膠原蛋白在創口癒合過程中及在自然老化之過程中尤其重要，其中其由成纖維細胞產生。然而，在一些情況下，過度癒合反應會導致產生大量癒合組織(基礎物質)，亦稱為瘢痕組織。舉例而言，諸如灼傷、手術、感染、創口及事故之各種皮膚創傷特徵常在於富含膠原蛋白之纖維組織的錯誤積累。常常亦存在蛋白聚糖內含物增加。除替換已損傷或破壞之正常組織外，有時在癒合過程期間形成新組織之過量及損毀性沈積。過量膠原蛋白沈積係歸因於膠原蛋白合成與膠原蛋白降解之間平衡的紊亂。瘢痕中包括(例如)腱之慢性肌腱變性或瘢痕組織、手術黏連、瘢痕瘤、肥厚性瘢痕及凹陷性瘢痕。
i.　手術黏連
手術黏連為經由瘢痕形成使器官或組織相互連接，其可引起嚴重臨床問題。手術或組織損傷後一些瘢痕組織之形成為正常的。然而，在一些情況下，瘢痕組織長滿損傷區域且造成手術黏連，其傾向於限制受影響身體部分之正常活動及功能。詳言之，纖維母細胞增生及基質合成在該軟組織損傷後局部增加。接著當身體試圖藉由誘導癒合反應來修復組織時形成黏連。舉例而言，此癒合過程可在兩種或兩種以上另外健康分開的結構之間(諸如在腹部手術後腸袢之間)發生。或者，在周邊神經局部創傷後，可形成纖維黏連，導致在正常運動期間產生劇痛。
ii.　瘢痕瘤
瘢痕瘤為含有增生塊之結締組織的瘢痕，其發生在真皮及相鄰皮下組織中，最通常在創傷後發生。瘢痕瘤通常為顏色可自粉紅色或紅色至深棕色變化之纖維狀節結。由於參與創口修復之膠原蛋白之過度生長，瘢痕組織中形成瘢痕瘤。當局部皮膚纖維母細胞對局部刺激作出反應而經歷活躍增生及增殖時，形成瘢痕瘤病變。產生之病變會導致比初始瘢痕大許多倍之團塊。除由於創口或其他創傷而發生外，瘢痕瘤亦可因刺破、丘疹、刮傷、嚴重粉刺、水痘瘢痕形成、創口部位感染、一定區域之重複創傷或在創口閉合期間過度皮膚拉伸而形成。
iii.　肥厚性瘢 痕
肥厚性瘢痕為形成於創傷部位之凸起瘢痕。其通常不會生長超過初始創口之邊界。類似於癍痕瘤，肥厚性瘢痕為身體過度產生膠原蛋白之結果。
iv.　凹陷性瘢痕
凹陷性瘢痕通常由發炎性發作引起且特徵在於皮膚收縮，並留下美觀上不愉快及永久性之瘢痕。最常見實例為發炎性粉刺後發生之瘢痕形成。凹陷作為創口癒合之正常結果出現，且引起凹陷之瘢痕組織主要由自纖維母細胞增殖及代謝產生之膠原蛋白構成。
g.　硬皮病
諸如本文所述者之可活化的基質降解酵素可用於治療硬皮病。硬皮病之特徵在於膠原變厚。該疾病之較常見形式局部硬皮病僅影響皮膚，通常僅在少數位置，且有時在面部。其有時稱為CREST症候群。症狀包括皮膚硬化及相關瘢痕形成。皮膚亦呈現紅色或鱗片狀，且血管可更明顯。在更嚴重情況下，硬皮病可影響血管及內臟。彌漫性硬皮病由於心臟、腎、肺或腸道損傷而具致死性，此係歸因於肌肉骨骼、肺、胃腸、腎及其他併發症。
該病狀之特徵在於膠原蛋白累積，導致彈性喪失。膠原蛋白之過量產生係歸因於自體免疫功能障礙，導致T細胞積累及刺激膠原蛋白自纖維母細胞沈積之細胞激素與其他蛋白質的產生。
h.　淋巴水腫
諸如本文所述者之可活化的基質降解酵素可用於治療淋巴水腫。淋巴水腫為引起手臂及腿之腫脹的淋巴液之積累。淋巴水腫可進行至包括皮膚變化，諸如淋巴滯留性纖維化、硬化及乳頭瘤(良性皮膚腫瘤)及腫脹。與淋巴水腫相關之組織變化包括結締組織細胞(諸如纖維母細胞)之增殖、膠原纖維產生、脂肪沈積物增加及纖維變性變化。此等變化首先發生在下肢末端，亦即手指及腳趾。淋巴水腫可根據末端之腫大程度來鑑別。舉例而言，一種評估淋巴水腫之方法係根據鑑別所涉及與未涉及之末端的四個比較點之間的2cm或3cm差異。
i.　膠原性結腸炎
諸如本文所述者之可活化的基質降解酵素可用於治療膠原性結腸炎。膠原性結腸炎首先描述為慢性水瀉(Lindstrom等人(1976)Pathol. Eur.,11:87-89)。膠原性結腸炎之特徵在於膠原蛋白沈積，可能由黏膜纖維母細胞產生膠原蛋白與膠原蛋白降解之間的不平衡引起。其導致分泌性腹瀉。膠原性結腸炎之發病率類似於原發性膽汁性肝硬化。該疾病具有每100,000人1.8人之年發病率及每100,000人15.7人之發生率，其類似於原發性膽汁性肝硬化(每100,000人12.8人)且低於潰瘍性結腸炎(每100,000人234人)、克羅恩氏病(Crohn's disease)(每100,000人146人)或乳糜瀉(每100,000人5人)。在患有慢性腹瀉之患者中，約0.3%至5%患有膠原性結腸炎。膠原性結腸炎為導致刺激纖維母細胞增殖之細胞激素及其他藥劑之產生增加、從而導致膠原蛋白積累增加的發炎性疾病。
J.　實施例
僅出於說明性目的包括以下實施例且其不欲限制本發明之範疇。
實施例1 經活化之重組組織蛋白酶-L之製備
經組胺酸(His)標籤標記之經純化重組人類組織蛋白酶-L係購自R&D systems(Minneapolis,MN.，目錄號952-CY)且以0.9mg/mL之濃度調配於50mM乙酸鹽(pH 4.0)、100mM NaCl中。將500μL之等分試樣儲存於-80℃下直至其使用。
在使用之前對所儲存之等分試樣執行濃縮及緩衝液交換。簡言之，將2mL之0.9mg/mL組織蛋白酶-L於冰上解凍且將500μL轉移至具有30KDa截斷之4個microcon離心過濾膜管(Millipore；Bedford,MA，目錄號42410)中。將該等microcon管於9000rpm下旋轉5分鐘，產生50μl之最終體積。將450μL冷濃縮緩衝液(100mM甲酸鈉pH 4、100mM NaCl、5mM DTT、10mM EDTA)添加至各微米管中。在加工期間添加5mM DTT使組織蛋白酶-L轉化為如SDS-PAGE所評估之約36KDa之單鏈蛋白質。濃縮及緩衝液交換步驟移除抑制性10-16KDa前肽。另外，在濃縮及緩衝液交換期間添加之DTT及EDTA使組織蛋白酶-L之蛋白水解降解降至最少。將離心程序重複三次。因為組織蛋白酶-L對溫度敏感，所以冷卻管及濃縮溶液以使降解降至最少。最終旋轉後，倒置microcon管且藉由於5000rpm下離心5分鐘將液體收集於保留物杯中。回收之最終體積為400μL，產生5倍濃縮。將濃縮之組織蛋白酶-L以67μL之體積等分，其含有約300μg經活化之酵素。將等分試樣儲存於-80℃下，且在使用之前於冰上解凍。
在使用之前，藉由將一個等分試樣添加至3mL MES緩衝溶液(2-(N-嗎啉基)乙烷磺酸)(pH 5)中來於其最佳pH值5下調配組織蛋白酶-L，產生100μg/mL經活化組織蛋白酶-L之最終濃度。作為對照，於HEPES緩衝液(pH 7.4)中調配組織蛋白酶-L，在該緩衝液中酵素活性最小。
實施例2 羥基脯胺酸檢定
羥基脯胺酸檢定用於量測在用組織蛋白酶-L灌注後皮膚樣品中之膠原蛋白含量變化。當其他蛋白質之羥基脯胺酸含量可忽略不計時，膠原蛋白含有濃度為8%之羥基脯胺酸(TV. Burjanadze,Hydroxyproline content and location in relation to collagen thermal stability. Biopolymers 18:4931-4938(2002))。所用之羥基脯胺酸(HP)檢定為Reddy及Enwemeka(Clinical Biochemistry 29:225-229(1996))之程序的修改形式。
詳言之，試劑之體積經修改以在8孔0.2mL洗提管(Brandtech,Essex,CT)中於標準熱循環儀(Eppenforf Mastercycler,Westbury,NY)中完成反應。包括水解、酸化及用艾利希試劑偵測之所有步驟均在0.2mL管中進行。所有化學品均購自Sigma(St. Louis,MO)。簡言之，藉由用5體積之200標準酒度乙醇沈澱來萃取來自灌注實驗之灌注液樣品並加以離心。使用1mL或200μL移液管量測所收集之灌注液之體積。將該等灌注液轉移至經標記之15mL錐形離心管中。將乙醇灌注液混合物儲存於中-80℃冷凍器中歷時30分鐘，隨後在Eppendorf吊桶式離心機中於3000rpm下離心10分鐘。離心後，視離心塊之大小而定，將沈澱物溶解於150-400μL 2N NaOH中。將上清液在凍乾器中乾燥，且溶解於150-200μL 2N NaOH中。溶解於NaOH中後，將樣品以每管200μL或200μL以下之體積轉移至8孔洗提管中且於99℃下在熱循環儀中水解12小時以使得膠原蛋白完全水解及羥基脯胺酸釋放。用濃HCl酸化樣品(每25μL水解樣品5.2μL HCl)。將60μL氯胺-T(Sigma；目錄號C9887)添加至等體積之酸化水解物中以完成羥基脯胺酸氧化。完全氧化後，添加120μL艾利希試劑(Sigma,Saint Louis,MO，目錄號39070(Fluka))且於65℃下培養25分鐘，產生紫色。顯色之強度視來源於釋放於灌注液中之膠原蛋白之羥基脯胺酸的量而定。在Spectramax 2E讀板器(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)中於550nm下在可見光範圍內對樣品進行讀數。使用經純化之羥基脯胺酸溶液(Sigma,Saint Louis,MO，目錄號H54409)建立標準曲線，且自該標準曲線確定皮膚樣品中之羥基脯胺酸含量。
實施例3 藉由用經活化之組織蛋白酶-L灌注活體外大鼠皮膚外植體來降解膠原蛋白
以手術方式自經2%異氟醚麻醉之3月齡的雄性Sprague-Dawley大鼠(Harlan Sprague Dawley,Indianapolis,IN)之背外側部位移除皮膚外植體(2cm×2cm)。用針將外植體壓在膠合至100mm皮氏培養皿(Petri dish)之聚苯乙烯發泡塑料(Styrofoam)墊上且用加熱板保持於37℃下。首先使用輸注泵(Thermo Orion，型號M361，Boston,MA)將6mL含有MES緩衝液(2-(N-嗎啉基)-乙烷磺酸)(pH 5)及2500單位/毫升之rHuPH20(rHuPH20 Halozyme內部製造，批號056-100；比活性：124,000U/mL且蛋白質含量為1.05mg/mL)之溶液經由插入外植體之真皮層中的27號蝶形針灌注穿過皮膚外植體歷時35分鐘。完成酸灌注後，用有或無100μg/mL經活化組織蛋白酶-L的MES緩衝液(pH 5)或有或無對照組織蛋白酶-L之HEPES緩衝液(pH 7.4)將皮膚外植體灌注約30分鐘。藉由用200μL微量移液管吸出且在整個灌注程序期間以5-10分鐘之時間間隔將內含物收集在1.5mL Eppendorf管中來收集部分。將該等部分混合於Eppendorf管中且快速冷凍直至如實施例2中所述執行羥基脯胺酸(HP)分析。
三個不同實驗之結果展示HP含量僅在於最適pH值5下用經活化之組織蛋白酶-L灌注的樣品中顯著增加。平均(n=3)HP含量自約6分鐘時之小於1μg/mL灌注液增加至約30分鐘之大於30μg/mL灌注液。在來自僅用MES緩衝液(pH 5)、僅用HEPES緩衝液(pH 7.4)及對照組織蛋白酶-L(pH 7.4)輸注之灌注液中量測到無HP或極少HP。
實施例4 藉由用經活化之組織蛋白酶-L灌注活體外豬皮膚外植體來降解膠原蛋白
使3月齡的雌性約克夏(Yorkshire)豬(S 及SFarm,Ramona,CA)禁食隔夜且藉由肌肉內注射氯胺酮(Ketamine)(20mg/kg)/甲苯噻(Xylazine)(2mg/kg)及阿托品(atropine)(0.04mg/kg)麻醉。接著對動物插管且經吸入2%於氧氣(Airgas,San Diego,CA)中之異氟烷(Baxter,Deerfield,IL)維持麻醉。以手術方式自動物背部移除完整皮膚外植體(5cm×5cm)，於4℃下將其置於磷酸鹽緩衝生理食鹽水(phosphate buffered saline，PBS)中，且在切除後2小時內使用。基本上如實施例3中所述進行外植體之灌注及羥基脯胺酸分析，其例外之處在於用MES緩衝液(pH 5)或含有100μg/ml組織蛋白酶-L而無PH20之MES緩衝液(pH 5)灌注豬皮膚外植體。起初，用6mL MES緩衝液(pH 5)將外植體灌注約30分鐘，且每隔5-10分鐘收集部分。此後，用3mL於MES緩衝液(pH 5)中之100μg/ml組織蛋白酶-L或作為對照之單獨緩衝液灌注外植體，每隔5分鐘收集，歷時約25分鐘。HP分析展示用組織蛋白酶-L灌注之樣品中之HP含量的時間依賴性增加。在用無組織蛋白酶-L之MES緩衝液(pH5)灌注的樣品中未量測到可偵測的HP。15分鐘時間時量測到最高含量之HP。25分鐘時量測到之HP含量類似於15分鐘時量測到者。
實施例5 藉由用經活化之組織蛋白酶-L灌注豬外植體來減少皮下間隙中之纖維中隔
基本上如實施例4中所述，藉由以每分鐘0.17mL之速率用含有2500U/mL rHuPH20之MES緩衝液(pH 5)灌注30分鐘，接著以0.12mL/min用3mL於無rHuPH20之MES緩衝液(pH5)中的100μg/ml組織蛋白酶-L灌注25分鐘來處理豬皮膚外植體。用組織蛋白酶-L輸注後，將外植體修剪成小塊，將其固定於4%緩衝福馬林(formalin)中隔夜。類似地處理對照未經處理之豬外植體。將組織於PBS中洗滌，於分級乙醇及二甲苯溶液中脫水，且包埋於石蠟中。將塊狀體切成4μm薄的切片，將其轉移至載玻片上且用馬松三色染色進行染色以觀測膠原蛋白。簡言之，使切片脫石蠟，於蒸餾水中水合且於56℃下用於波恩氏溶液(Bouin's solution)中之媒染劑(Sigma，目錄號HT10-132)處理15至30分鐘。將該等切片冷卻且以流水洗滌直至黃色消失並以蒸餾水沖洗。接著以魏格特氏鐵蘇木素工作溶液(Weigert's Iron Hematoxylin Working solution)(Sigma，目錄號HT107及HT109)將切片染色5分鐘且以流水洗滌10分鐘。以去離子水將切片沖洗5分鐘且置於比布裏希猩紅-酸性品紅(Biebrich Scarlet-Acid Fuchsin)(Sigma，目錄號HT151)中5分鐘。將切片轉移至工作磷鎢酸/磷鉬酸溶液(Phosphotungstic/Phosphomolybdic Acid solution)(Sigma，目錄號HT152及HT153)中且最後以苯胺藍溶液(Aniline Blue Solution)(Sigma，目錄號HT154)染色5分鐘並於1%乙酸中區分2分鐘。將切片以蒸餾水沖洗，於95%酒精及無水酒精中脫水，且以二甲苯清洗，變化兩次。固定切片且以Nikon倒置顯微鏡觀察。以Nikon螢光顯微鏡結合含有SPOT晚期成像程序之攝像掃描器(Diagnostic Instrument Inc.,Sterling Heights,MI)使用20×物鏡獲得圖像。
下皮主要含有脂肪組織。由膠原蛋白纖維中隔組成之緻密結締組織條帶自真皮深處延伸至下皮中且使皮膚錨定於下層結構。組織學結果展示在未經處理之樣品中在整個下皮中可見分隔脂肪細胞腔室之纖維中隔。用於MES緩衝液(pH 5)中之組織蛋白酶-L處理後，膠原蛋白纖維中隔之數目實質上低於未經處理之樣品，表明用組織蛋白酶-L處理顯著改變下皮中之膠原蛋白網路結構。
實施例6 A.經麻醉之活大鼠之皮膚中的膠原蛋白降解
對以2%異氟烷保持麻醉之3月齡的雄性Sprague-Dawley大鼠(Harlan Sprague-Dawley,Inc.Indianapolis,IN)執行灌注實驗。使用組織蛋白酶-L在pH 5下執行灌注實驗，且作為特定性之對照，以pH 7.4之HEPES緩衝液執行灌注實驗。簡言之，首先使用輸注泵，將約15mL含有25mM MES緩衝液(pH 5)或25mM HEPES緩衝液(pH 7.4)及2500單位/毫升rHuPH20(Halozyme內部製造批號056-100，比活性為124,000U/mL且蛋白質含量為1.05mg/mL)之溶液經由尾部皮膚使用27號插入皮膚之真皮層中的蝶形針灌注約60分鐘。此後，灌注3mL含有組織蛋白酶-L或緩衝液對照之溶液歷時25分鐘。含有Cat-L之灌注溶液含有於5mM MES中之處於最適pH值5的100μg/mL經活化之Cat-L或於20mM HEPES中之處於對照pH值7.4的100μg/mL經活化之Cat-L。使pH 5緩衝液之離子強度自25mM降至5mM以促進藉由局部組織環境中和pH值且從而限制活性酵素之擴散。在於HEPES緩衝液(pH 7.4)中之Cat-L的情況下，維持至少20mM之離子強度以確保於高離子強度緩衝液(pH 4)中活化及調配之所添加的Cat-L不會實質上改變HEPES緩衝液之pH值(pH 7.4)。用pH試紙檢查添加至20mM HEPES(pH 7.4)中之Cat-L的小等分試樣以確保在已添加Cat-L後所得溶液之pH值實際上接近pH 7.4。用於灌注之緩衝液對照溶液為不添加酵素之5mM MES(pH 5)或20mM HEPES(pH 7.4)。以規律時間間隔，亦即在初始灌注期間於20、40及60分鐘時且在用Cat-L灌注期間於8及25分鐘時，自尾部皮膚收集灌注液部分。將該等部分彙集於Eppendorf管中且快速冷凍以防止進一步酵素作用。如實施例2中所述執行羥基脯胺酸分析。結果展示僅在用經活化之組織蛋白酶-L灌注的樣品中可量測到HP。在25分鐘灌注液樣品中量測到最高含量之HP。在僅用MES緩衝液(pH 5)或僅用HEPES緩衝液(pH 7.4)或用於HEPES緩衝液(pH 7.4)中之組織蛋白酶-L灌注的樣品中不存在可偵測的Hp。
B.　組織蛋白酶-L處理導致試管內pH值依賴性膠原蛋白降解
評估組織蛋白酶B、D、L及S及細菌膠原酶於pH 5.0及pH 8.0下對大鼠膠原蛋白之降解。組織蛋白酶B、D、L及S係購自R&D systems且根據來自酵素製造之個別說明書使每一酵素活化。細菌膠原酶係購自Sigma Chemicals，且不需要活化。於37℃下藉由於製造商指定緩衝液中或於Tris(pH 8.0)緩衝生理食鹽水中與經活化之組織蛋白酶B、D、L或S或細菌膠原酶一起培養，使可溶性大鼠尾部I型膠原蛋白消化1小時，接著進行SDS-Page凝膠處理且庫馬斯藍染色。其他組織蛋白酶不於pH 5下進行測試，而以製造商指定pH值及緩衝液測試。結果展示組織蛋白酶-L為於pH 5.0下而非於pH 8.0下具活性之唯一酵素。組織蛋白酶B、D及S於製造商指定pH值下展示大鼠膠原蛋白之一些略微降解及於pH 8.0下展示大鼠膠原蛋白無降解，而細菌膠原酶於pH 5.0與pH 8.0皆降解大鼠膠原蛋白。
實施例7 A.　酸化活大鼠之皮膚後恢復至中性
當將稀酸水溶液注入皮膚間質中時，pH值之變化為暫時性的且由於間質之顯著緩衝能力而快速恢復至中性皮膚pH值。使用酚紅作為間質pH值之觀測指示劑。酚紅之鈉鹽廣泛用於細胞培養基中以鑑別中性至酸性pH值之變化。酚紅溶液於6.4或6.4以下之pH值時具有黃色，於pH 7.0時具有橙色，於pH 7.4及以上時具有紅色，且於pH 7.8時具有紫色。
以2%異氟烷使3月齡的雄性Sprague-Dawley大鼠(Harlan Sprague Dawley,Indianapolis,IN)保持麻醉。將皮膚刮去毛髮以便易於觀測酚紅染色。將2-2.5mL含有500U/ml rHuPH20之25mM MES(pH 5)經由插入真皮層中之27號蝶形針灌注至尾部皮膚中。在此之後灌注1-1.5mL0.05%酚紅(Sigma-Aldrich,St. Louis,MO，目錄號P0290)於10mM、25mM、50mM及100mMMES緩衝液(pH 5)中之溶液。MES(2-(N-嗎啉基)-乙烷磺酸(C16H13NO4A))具有195.2之分子量。該酚紅溶液中不包括rHuPH20。使用測微計，於不同時間點，以兩個維度量測酚紅前緣，且使用下式計算面積：面積=(D1×D2)×π/4。觀察到顏色變化且記錄恢復至中性之時間。表4A之結果總結恢復至中性之平均時間(以分鐘計)且指示恢復至中性可藉由緩衝液之離子強度來調節。
B .　酸化小鼠皮膚後恢復至中性
恢復至中和之時期及隨後組織蛋白酶-L之失活視所注射緩衝液之濃度而定。在裸鼠體內藉由於pH 5.0下在增加緩衝液濃度(10-100mM MES)下使用酚紅指示劑染色量測恢復至中和之時間來評估間質之固有緩衝能力。給經麻醉之裸鼠注射0.125mL含有酚紅之MES緩衝液(10mM至100mM)(pH 5)。肉眼量測在真皮中至酚紅中和之時間。結果描述於下表4B中。
SD：標準偏差
因此，藉由漸增之緩衝液濃度(10-100mM MES，pH 5.0)經皮內注射pH值指示劑，確定可獲得來自1-20分鐘/100平方公分注射之酸性時空細胞外環境。
實施例8 重組人類肝組織蛋白酶-L之工程化
使用根據人類腎組織蛋白酶原-L cDNA之公開定序資料設計的引子將人類Cat-L cDNA SEQ ID NO:9(由SEQ ID NO:10中所闡明之核苷酸的序列編碼)及Cat-L-His cDNA SEQ ID NO:12(由SEQ ID NO:13中所闡明之核苷酸的序列編碼)自人類肝cDNA(Clonetech QUICK-Clone cDNA 637205)進行PCR擴增。添加5'NheI及3'BamHI限制性位點作為PCR引子合成之部分。用於擴增之引子闡明於表5中。
兩種基於cDNA之構築體皆具有藉由單鹼基突變以形成一致Kozak序列的天然Cat-L分泌性前導肽之第二胺基酸，從而使該第二胺基酸自N變為D(如SEQ ID NO:9及12中所闡明)。藉由標準瓊脂糖凝膠電泳及DNA序列分析來驗證純系之一致性。
引入所得擴增產物以選殖入HZ24(b/s)表現載體中。該表現載體為用於表現由來自腦心肌炎病毒之內部核糖體進入位點(IRES)分隔之組織蛋白酶-L蛋白質與鼠類DHFR基因的基於CMV之雙順反子序列盒。所得HZ24-Cat-L表現載體之序列闡明於SEQ ID NO:11中。所得HZ24-Cat-L-His表現載體之序列闡明於SEQ ID NO:14中。
藉由轉染，使用Genejuice轉染試劑(EMD Biosciences,San Diego,CA，目錄號70967)將Cat-L與Cat-L-His表現質體皆引入CHO-S細胞(適於無血清懸浮液培養之CHO-K1細胞，Invitrogen,Carlsbad,CA，目錄號11619-012)中。亦藉由電穿孔將該等表現質體引入適於以懸浮液培養方式生長於化學界定之無動物產物培養基(Invitrogen，目錄號10743-029)中的DG44 CHO細胞(藉由來自Columbia University之Lawrence Chasin博士的特許而獲得)中。對於電穿孔而言，每一質體之每次電穿孔使用大於100μg之ClaI線性化質體。於350伏特恆定電壓下轉染每次電穿孔2千萬個DG44 CHO細胞。電穿孔緩衝液含有2×HeBS(40mM HEPES，pH 7.0；274mM NaCl；10mM KCl；1.4mMNa2 HPO4 ；12mM右旋糖)。在無次黃嘌呤鈉及胸苷之標準CD-CHO培養基(Invitrogen #12610-010)中電穿孔後72小時藉由限制稀釋法來選殖經轉染之細胞以選擇帶有DHFR質體之細胞。將在無次黃嘌呤鈉及胸苷情況下生長之所選純系進一步次選殖，使用甲胺喋呤擴增以增加插入物複本數。模擬物轉染充當陰性對照。
轉染後72小時收集上清液且於1500rpm下旋轉5分鐘。將來自經his-Cat-L、Cat-L及模擬物轉染之CHO-S及CHO-DG44細胞的無細胞上清液施加於10kDa截斷微米離心濃縮器(Millipore；Bedford,MA.，目錄號42407)上且藉由於4℃下於12000rpm下離心而濃縮約10倍。藉由捕捉ELISA(Calbiochem組織蛋白酶-L ELISA套組#QIA94)，西方墨點分析，如實施例10中所.述使用單株Mab33/1(Bender MedSystems,Burlingame,CA)且對於酵素活性而言如實施例9中所述使用螢光肽受質(Z-L-R-AMC)篩選分泌至組織培養上清液中之重組人類組織蛋白酶-L。
實施例9 使用螢光肽受質測定組織蛋白酶-L之酶促活性
使用稱為Z-Leu-Arg-AMC(Z=:N-苄氧羰基；AMC：7-胺基-4-甲基香豆素，R&D Systems,Minneapolis,MN，目錄號ES008)之市售螢光受質檢定組織蛋白酶-L之酶促活性。該肽受質含有高度螢光7-胺基-4-甲基香豆素基團(AMC)，其藉由形成於其胺基與Arg殘基之羧基之間的醯胺鍵淬滅。經活化之組織蛋白酶-L裂解此醯胺鍵，使得釋放之螢光增加。雖然肽受質可由其他組織蛋白酶裂解，但其中主要為組織蛋白酶-B，組織蛋白酶-L活性特定地藉由使用適合於組織蛋白酶-B之特異性抑制劑且在抑制劑存在及不存在之情況下量測活性來確定。特定言之，使用最終濃度為1μM之選擇性組織蛋白酶-B抑制劑CA-074(Calbiochem,San Diego,CA，目錄號205530)且在CA-074存在及不存在之情況下檢定樣品。藉由添加pH 5之濃MES緩衝液將在CHO細胞中轉染後72小時之細胞培養物上清液調整至pH 5且於冰上培養30分鐘。此酸活化步驟裂解前肽且產生成熟組織蛋白酶-L。為稀釋為組織蛋白酶-L酵素活性之有效抑制劑的前肽片段(Carmona,E.等人Potency and selectivity of the cathepsin-L propeptide as an inhibitor of cysteine proteases. Biochemistry 35:8149-8157(1996))，濃縮該等樣品且於30 KDa microcon管上用50mM MES(pH 5)緩衝液進行緩衝液交換3次。接著藉由對Z-AMC受質進行螢光肽受質檢定來檢定樣品之酵素活性。
以類似於樣品之方式活化市售組織蛋白酶-L製劑(R&D Systems；目錄號952-CY)，且藉由連續稀釋將其用作標準物。活化後，將樣品及標準物在不透明底微板中於含有5mM DTT及10mM EDTA之100mM MES緩衝液(pH 5)中連續稀釋且於37℃下與螢光肽受質Z-AMC一起培養30分鐘。當與樣品或標準物組合時，使用總體積為200μL、最終濃度為10μM之Z-AMC受質。
在螢光板讀取器(Molecular Devices,SpectraMax 3,Sunnyvale,CA)中於受質之推薦最佳激發-發射(380nm-460nm)條帶下讀取所得螢光。樣品值來源於由自標準物之稀釋系列獲得的相對螢光單位(relative fluorescence unit，RFU)值所繪之標準曲線。用Softmax軟體(Molecular Devices,SpectraMax 3,Sunnyvale,CA)進行4參數擬合後，該標準曲線在10-100ng/mL之濃度範圍之間為假線性。結果展示於下表6中。來自經轉染之CHO-S細胞之組織蛋白酶-L的活性比來自經模擬物轉染之宿主細胞且藉由在選擇性組織蛋白酶-B抑制劑CA-074存在下檢定之背景活性高至少10-20倍。因此經組織蛋白酶-L轉染之組織培養基中的酶促活性增加可歸因於Cat-L比活性。
實 施例10 所表現之人類重組組織蛋白酶-L的西方墨點分析
如實施例8中所述表現及濃縮無細胞上清液後，執行西方墨點分析以證實表現。簡言之，對於6種不同樣品(來自CHO-S或CHO-DG44細胞每一者之cat-L、cat-L-His及模擬物)中之每一者而言，將30μL濃縮上清液與用於SDS-PAGE之10μL 4×(替代凝膠加樣樣品緩衝液)(EMD Bioscience,San Diego,CA，目錄號70607-3)及2μL 100mM DTT混合且於80℃下培養20分鐘。作為陽性對照，包括於30μL 1×PBS中之750ng市售經純化之重組組織蛋白酶-L(R&D Systems)且同等處理。將總體積(42μL)之樣品加樣於4-20% Tris-甘胺酸凝膠(Invitrogen,Carlsbad,CA，目錄號EC6028BOX)上且於Tris-甘胺酸SDS電泳緩衝液中進行電泳直至預染色之分子量標誌(Invitrogen，目錄號LC5925)之染料前緣到達凝膠底部。藉由I-Blot半乾墨點設備(Invitrogen，目錄號IB1001)根據製造商之說明書將蛋白質轉移至PVDF膜上。藉由凝膠上幾乎完全不存在預染色標誌條帶之顏色而驗證轉移。於室溫下於由於PBS中之5%脫脂奶粉組成之阻斷劑緩衝液中阻斷該膜2小時。用以於阻斷劑中之1μg/mL最終濃度使用之人類組織蛋白酶-L之小鼠單株抗體(Mab 33/1)(Bender MedSystems,Burlingame,CA，目錄號BMS 166)偵測組織蛋白酶-L且於4℃下培養隔夜，接著於室溫下用以於阻斷劑中之33ng/mL濃度的HRP接合之抗-小鼠IgG(Calbiochem,San Diego,CA，目錄號DC02L)偵測1小時。藉由不溶性TMB(Calbiochem，目錄號613548)膜顯影液使HRP信號顯影且於室溫下30分鐘後停止反應。
西方墨點分析展示對Cat-L具特異性之蛋白質條帶。在經模擬物轉染之細胞中未偵測到特異性條帶。Cat-L及His-Cat-L之表現量似乎在CHO-S細胞中比在DG44細胞中高，此可能歸因於兩種細胞系之轉染效率。西方墨點分析結果與使用如實施例9中所述用螢光肽受質進行之Z-AMC酵素活性檢定的結果一致。表現於CHO-S及DG44中之組織蛋白酶-L的分子量為44-45KDa，其對應於仍含有前肽之蛋白質的預期大小。用作陽性對照之市售組織蛋白酶(R&D Systems)的分子量對成熟組織蛋白酶-L而言為36KDa。表現於經轉染之CHO-S及CHO-DG44細胞中之蛋白質與市售組織蛋白酶-L之間的大小差異可能歸因於不同宿主細胞特異性糖基化或前肽自市售Cat-L移除。
實施例11 合成組織蛋白酶-L及組織蛋白酶-L-His之產生
對於CHO細胞使用密碼子優化合成編碼成熟人類組織蛋白酶-L之DNA構築體(GenBank寄存編號EAW62736之胺基酸18-333；SEQ ID NO:1)。密碼子優化係基於由Blue Heron Biotech(www.blueheronbio.com)列出之用於黑線倉鼠(Cricetulus griseus)之密碼子優化表。合成含有自人類κ IgG基因家族(SEQ ID NO:2)設計之異源信號肽的構築體以允許將重組蛋白質分泌至組織培養上清液中。經優化之組織蛋白酶-L構築體的序列闡明於SEQ ID NO:3中且編碼SEQ ID NO:4中所闡明之多肽。添加5'NheI及3'BamHI限制性位點作為構築體合成之部分，且將該位點引入以選殖至HZ24(b/s)表現載體中(如實施例8中所述)。合成Cat-L表現載體稱為HZ24(B/S)-CAT-L且闡明於SEQ ID NO:5中。亦合成含有由連接子(GGGGSG；SEQ ID NO:15)分隔之C-末端6組胺酸標籤的類似合成構築體。合成之Cat-L-His構築體的序列闡明於SEQ ID NO:6中且編碼SEQ ID NO:7中所闡明之多肽。此構築體亦具有作為構築體合成之部分添加的5'NheI及3'BamHI限制性位點，且將該位點引入以供選殖至HZ24(b/s)表現載體中。合成Cat-L-His表現載體稱為HZ24(B/S)-Cat-L-His且闡明於SEQ ID NO:8中。
如實施例8中所述藉由電穿孔將SEQ ID NO:5中所闡明之合成Cat-L表現載體及SEQ ID NO:8中所闡明之合成Cat-L-His表現載體轉染至CHO-DG44細胞中。轉染後72小時收集上清液且如實施例8中所述進行處理(不進行pH值調整)以產生未活化之組織蛋白酶-L。亦經pH 4之調整來處理組織培養上清液以活化組織蛋白酶，接著於30KDa膜上濃縮且藉由西方墨點分析來分析組織蛋白酶-L。簡言之，於低pH值下，裂解出組織蛋白酶-L之前肽，使酵素活化。藉由以1:10之比率將濃縮酸性緩衝液(1000mM甲酸鹽pH 4、1000mM NaCl、50mM DTT、100mM EDTA)分別添加至來自經合成構築體轉染之細胞及未經轉染之對照細胞的上清液中而將該等上清液調整至pH 4。將上清液於冰上培養30分鐘以使活化完成。藉由經由30KDa分子量截斷離心濃縮裝置(Microcon 30,Millipore,Bedford,MA.，目錄號42410)離心來使其濃縮。30KDa截斷尺寸允許經裂解之前肽(預測大小為約12-14KDa)穿過，而成熟蛋白質被保留(預測大小為約36-40kDa)。濃縮後，使經活化(B)及未經活化之上清液(A)於4-12% SDS-PAGE凝膠上電泳，接著如實施例10中所述藉由西方墨點法，使用單株Mab 33/1加以分析。在經轉染之細胞的組織培養上清液中偵測到類似含量之合成組織蛋白酶-L及Cat-His-L。未經活化之上清液的分子量為約44kDa，而對於經活化之上清液而言為約36至40kDa，此歸因於由於蛋白質於較低pH值下活化而不存在前肽。
亦如實施例9中所述使用螢光肽受質(Z-L-R-AMC)針對酶促活性篩選經活化之上清液。轉染後72小時在經轉染之CHO-DG44細胞中藉由Z-AMC檢定在組織蛋白酶-B抑制劑存在下量測Cat-L酵素活性。結果闡述於下表7中。轉染後72小時來自經轉染之CHO-DG44細胞之組織蛋白酶-L的活性比來自經模擬物轉染之宿主細胞且藉由在選擇性組織蛋白酶-B抑制劑CA-074存在下檢定之背景活性高至少5-10倍，阻斷宿主組織蛋白酶-B之作用(如酵素活性)。因此，在經組織蛋白酶-L轉染之組織培養基中之酵素活性增加可歸因於自經轉染之Cat-L純系表現的Cat-L比活性。
實 施例12 可溶性重組人類PH20(rHuPH20)表現細胞系之產生
使用HZ24質體(SEQ ID NO:224中所示)轉染中國倉鼠卵巢(CHO細胞)。編碼可溶性rHuPH20構築體之DNA含有在編碼人類PH20玻尿酸酶之天然信號前導序列的胺基酸位置1處之甲硫胺酸的DNA之前的NheI位點及Kozak一致序列，及在編碼人類PH20玻尿酸酶之胺基酸位置482處的酪胺酸之後的DNA終止密碼子，接著為BamHI限制性位點。因此，構築體pCI-PH20-IRES-DHFR-SV40pa(HZ-24)產生由CMV啟動子驅動之編碼由內部核糖體進入位點(IRES)分隔之PH20之胺基酸1-482(SEQ ID NO:225中所示)及二氫葉酸還原酶之胺基酸1-187(SEQ ID NO:261中所示)的單一mRNA物質。
使未經轉染之DG44 CHO細胞生長於補充有4mM GlutamaxTm 及18ml Plurionic F68/L(Gibco)之用於DHFR(-)細胞的GIBCO改良型CD-CHO培養基，且以0.5×106 個細胞/毫升接種於搖瓶中以為轉染作準備。使細胞於37℃、5% CO2 下在濕潤恆溫箱中生長，於120rpm下震盪。在轉染之前測試按指數規律生長之未經轉染之DG44 CHO細胞的生存力。
將未經轉染之DG44 CHO細胞培養物中的6千萬個活細胞粒化且再懸浮於0.7mL 2×轉染緩衝液(2× HeBS：40mM Hepes(pH 7.0)、274mM NaCl、10mM KCl、1.4mM Na2 HPO4 、12mM右旋糖)中至2×107 個細胞之密度。向再懸浮細胞之每一等分試樣中添加0.09mL(250μg)線性HZ24質體(藉由用Cla I(New England Biolabs)消化隔夜而線性化；SEQ ID NO:19中所闡明之線性HZ24質體)，且於室溫下將細胞/DNA溶液轉移至0.4cm間隙BTX(Gentronics)電穿孔比色管中。在無與細胞混合之DNA情況下執行陰性對照電穿孔。用330V之電容器放電及960μF或於350V及960μF下對細胞/質體混合物進行電穿孔。
電穿孔後將細胞自比包管移出且轉移至補充有4mM麩胺醯胺及18ml Plurionic F68/L(Gibco)之5mL用於DHFR(-)細胞的改良型CD-CHO培養基中，且在無選擇情況下使其於37℃、5% CO2 下在濕潤恆溫箱中生長於6孔組織培養板之孔中。
電穿孔後兩天，自各孔移出0.5mL組織培養基且測試玻尿酸酶活性之存在(參見實施例16)。結果闡述於下表8中。
自組織培養孔收集來自轉染2(350 V)之細胞，對其進行計數且稀釋至每毫升1×104 個至2×104 個活細胞。將細胞懸浮液之0.1mL等分試樣轉移至5個96孔圓底組織培養板之各孔中。將100微升含有4mM GlutaMAXTM -1補充劑(GIBCOTM ,Invitrogen Corporation)且無次黃嘌呤及胸苷補充劑之CD-CHO培養基(GIBCO)添加至含有細胞之孔中(最終體積為0.2mL)。
鑑別來自5個培養板之在無甲胺喋呤情況下生長的10個純系(參見表9)。
在培養物中擴增6個HZ24純系且以單細胞懸浮液形式轉移至搖瓶中。使用二維無限稀釋策略將純系3D3、3E5、2G8、2D9、1E11及4D10塗鋪於96孔圓底組織培養板中，其中將細胞沿培養板向下1:2稀釋，且沿培養板橫向1:3稀釋，在頂部左手孔中以5000個細胞開始。使經稀釋之純系生長於每孔500個未經轉染之DG44 CHO細胞的背景中，以提供必需生長因子歷時培養最初數天。每個次純系製作10個培養板，其中5個培養板含有50nM甲胺喋呤且5個培養板無甲胺喋呤。
純系3D3產生24個可見次純系(13個來自無甲胺喋呤處理，且11個來自50nM甲胺喋呤處理)。在來自24個次純系中之8個的上清液中量測到顯著玻尿酸酶活性(大於50單位/毫升)，且適當時在50nM甲胺喋呤存在下將此等8個次純系擴增至T-組織培養燒瓶中。使純系3D3 50nM進一步在500nM甲胺喋呤中擴增，在搖瓶中得到產生超過1,000單位/毫升之純系(純系3D35M；1代或Gen13D35M)。
實施例13 Gen1人類sPH20之製備及純化 A.　5L生物反應器製程
將一小瓶3D35M解凍且自搖瓶經由1L旋轉燒瓶在補充有100nM甲胺喋呤及GlutaMAXTM -1(Invitrogen)之CD-CHO培養基(Invitrogen,Carlsbad Calif.)中擴增。將細胞以每毫升4×105 個活細胞之接種密度自旋轉燒瓶轉移至5L生物反應器(Braun)中。參數為溫度設定點37℃、pH7.2(起始設定點)、溶解氧設定點25%及0-100cc/min之空氣覆蓋。168小時時，添加250ml 1號饋料培養基(具有50g/L葡萄糖之CD CHO)。216小時時，添加250m12號饋料培養基(具有50g/L葡萄糖及10mM丁酸鈉之CD CHO)，且264小時時添加250m12號饋料培養基。此製程產生每毫升1600單位之最終生產力及6×106 個細胞/毫升之最大細胞密度。丁酸鈉之添加用於在製備之最後階段顯著增強可溶性rHuPH20之產生。
藉由深部過濾及切向流動透濾至10mM Hepes(pH7.0)中來使來自3D35M純系之條件培養基澄清。接著藉由依次於Q瓊脂糖(pharmacia)離子交換管柱層析、苯基瓊脂糖(Pharmacia)疏水性相互作用層析法、硼酸苯酯(Prometics)及羥基磷灰石層析法(Biorad,Richmond,CA)來純化可溶性rHuPH20。
使可溶性rHuPH20與Q瓊脂糖結合且於相同緩衝液中以400mM NaCl溶離。用2M硫酸銨將溶離液稀釋至500mM硫酸銨之最終濃度且通過苯基瓊脂糖(低取代)管柱，接著於相同條件下與硼酸苯酯樹脂結合。於pH 9.0下以50mM無硫酸銨之二甘胺酸(bicine)洗滌後，將可溶性rHuPH20以Hepes(pH 6.9)自苯基瓊脂糖樹脂溶離。將溶離液以5mM磷酸鉀及1mM CaCl2 加樣於pH 6.9之陶瓷羥基磷灰石樹脂上且用具有0.1mM CaCl2 之80mM磷酸鉀(pH 7.4)溶離。
所得經純化之可溶性rHuPH20具有經由使用USP參考標準之微濁度檢定(實施例16)得出超過65,000USP單位/毫克蛋白質之比活性。經純化之sPH20自24至26分鐘時自Pharmacia 5RPC苯乙烯二乙烯基苯管柱以介於0.1% TFA/H2 O與0.1% TFA/90%乙腈/10% H2 O之間的梯度以單一峰溶離且藉由SDS電泳以單一寬峰61kDa條帶解析，在用PNGASE-F處理後減小為尖的51kDa條帶。N-末端胺基酸序列揭示已有效地移除前導肽。
B.　達到100L生物反應器細胞培養之上游細胞培養物擴增製程
使用按比例擴大製程分別純化來自四個不同小瓶之3D35M細胞的可溶性rHuPH20以產生4批分開的sHuPH20；HUA0406C、HUA0410C、HUA0415C及HUA0420C。分別擴增每一小瓶且經由125L生物反應器培養，接著使用管柱層析法純化。在整個製程中採集樣品以酵素產量形式評估該等參數。以下所提供之對製程之描述陳述諸如生物反應器起始及饋料培養基體積、轉移細胞密度及洗滌與溶離體積之情況的代表性規格。精確數目隨各批次略有變化，且詳述於表3至10中。
將四個小瓶之3D35M細胞於37℃水浴中解凍，添加含有100nM甲胺喋呤及40mL/L GlutaMAX之CD CHO且將該等細胞離心。將細胞再懸浮於125mL具有20mL新鮮培養基之搖瓶中且置於37℃、7% CO2 恆溫箱中。使細胞在該125mL搖瓶中擴增至40mL。當細胞密度達到1.5-2.5×106 個細胞/毫升時，使培養物以100mL培養體積擴增至125mL旋轉燒瓶中。於37℃、7% CO2 下培養該燒瓶。當細胞密度達到1.5-2.5×106 個細胞/毫升時，使培養物以200mL培養體積擴增至250mL旋轉燒瓶中，且於37℃、7% CO2 下培養該燒瓶。當細胞密度達到1.5-2.5×106 個細胞/毫升時，使培養物以800mL培養體積擴增至1L旋轉燒瓶中且於37℃、7% CO2 下培養。當細胞密度達到1.5-2.5×106 個細胞/毫升時，使培養物以5L培養體積擴增至6L旋轉燒瓶中且於37℃、7% CO2 下培養。當細胞密度達到1.5-2.5×106 個細胞/毫升時，使培養物以20L培養體積擴增至36L旋轉燒瓶中且於37℃、7% CO2 下培養。
於121℃、20PSI下用蒸汽使125L反應器滅菌且添加65L CD CHO培養基。在使用之前，檢查反應器之污染情況。當36L旋轉燒瓶中之細胞密度達到1.8-2.5×106 個細胞/毫升時，將20L細胞培養物自36L旋轉燒瓶轉移至125L生物反應器(Braun)中，得到85L之最終體積及約4×105 個細胞/毫升之接種密度。參數為溫度設定點37℃；pH值：7.2；溶解氧：25%±10%；葉輪速度50rpm；容器壓力3psi；空氣噴射1L/min；空氣覆蓋：1L/min。每日對反應器進行取樣以用於細胞計數、pH值驗證、培養基分析、蛋白質產生及滯留。在運作期間添加營養物饋料。第6天時，添加3.4L 1號饋料培養基(CD CHO+50g/L葡萄糖+40mL/L GlutaMAXTM -1)，且使培養溫度變為36.5℃。第9天時，添加3.5L 2號饋料(CD CHO+50g/L葡萄糖+40mL/L GlutaMAXTM -1+1.1g/L丁酸鈉)，且使培養溫度變為36℃。第11天時，添加3.7L 3號饋料(CD CHO+50g/L葡萄糖+40mL/L GlutaMAXTM -1+1.1g/L丁酸鈉)，且使培養溫度變為35.5℃。第14天時或當細胞之生存力下降至50%以下時對反應器進行收集。該製程使得產生具有1600單位/毫升之酶促活性的可溶性rHuPH20及8百萬個細胞/毫升之最大細胞密度。收集時，對培養物進行取樣以測定黴漿菌(mycoplasma)、生物負荷、內毒素，及進行病毒試管內及活體內透射電子顯微術(transmission electron microscopy，TEM)以測定病毒顆粒，及測定酵素活性。
將100公升生物反應器細胞培養收集物經由一系列具有聚醚碸介質之拋棄式囊式過濾器(Sartorius)過濾：首先經由8.0μm深囊(depth capsule)、0.65μm深囊、0.22μm囊，且最後經由0.22μm Sartopore 2000cm2 過濾器且過濾至100L無菌儲存袋中。使用兩個具有螺旋聚醚碸30kDa MWCO過濾器(Millipore)之TFF使培養物濃縮10倍，接著用10mM HEPES、25mM Na2 SO4 (pH 7.0)進行6×緩衝液交換至0.22μm終濾器中進入20L無菌儲存袋中。表10提供與細胞培養、收集、濃縮及緩衝液交換步驟有關之監測資料。
製備Q瓊脂糖(Pharmacia)離子交換柱(3L樹脂，高度=20cm，直徑=14cm)。收集洗滌樣品以測定pH值、傳導率及內毒素(LAL檢定)。用5管柱體積之10mM Tris、20mM Na2 SO4 (pH 7.5)使該管柱平衡。將經濃縮、透濾之收集物以100cm/hr之流速加樣於該Q管柱上。用5管柱體積之10mM Tris、20mM Na2 SO4 (pH 7.5)及10mM Hepes、50mM NaCl(pH 7.0)洗滌管柱。用10mM Hepes、400mM NaCl(pH 7.0)溶離蛋白質且經由0.22μm終濾器過濾至無菌袋中。
隨後執行苯基-瓊脂糖(Pharmacia)疏水性相互作用層析法。製備苯基-瓊脂糖(PS)管柱(9.1L樹脂，高度=29cm，直徑=20cm)。用5管柱體積之5mM磷酸鉀、0.5M硫酸銨、0.1mM CaCl2 (pH 7.0)使該管柱平衡。分別用2M硫酸銨、1M磷酸鉀及1M CaCl2 儲備溶液將來自上文之蛋白質溶離液補充至5mM、0.5M及0.1mM之最終濃度。將蛋白質以100cm/hr之流速加樣於PS管柱上。以100cm/hr添加5mM磷酸鉀、0.5M硫酸銨及0.1mM CaCl2 (pH 7.0)。使流過物質通過0.22μm終濾器至無菌袋中。
將經PS純化之蛋白質加樣於已用5管柱體積之5mM磷酸鉀、0.5M硫酸銨平衡的硼酸胺基苯酯管柱(ProMedics)6.3L樹脂，高度=20cm，直徑=20cm)上。使蛋白質以100cm/hr之流速通過該管柱，且用5mM磷酸鉀、0.5M硫酸銨(pH 7.0)洗滌管柱。接著用20mM二甘胺酸、100mM NaCl(pH 9.0)洗滌管柱且經由無菌過濾器用50mM Hepes、100mM NaCl(pH 6.9)溶離蛋白質且溶離至20L無菌袋中。測試溶離液之生物負荷、蛋白質濃度及酵素活性。
用5mM磷酸鉀、100mM NaCl、0.1mM CaCl2 (pH 7.0)使羥基磷灰石(HAP)管柱(BioRad)(1.6L樹脂，高度=10cm，直徑=14cm)平衡。收集洗滌樣品且測試pH值、傳導率及內毒素(LAL檢定)。用磷酸鉀及CaCl2 補充經硼酸胺基苯酯純化之蛋白質以得到5mM磷酸鉀及0.1mMCaCl2 之最終濃度且以100cm/hr之流速加樣於HAP管柱上。用5mM磷酸鉀(pH 7.0)、100mM NaCl、0.1mM CaCl2 接著10mM磷酸鉀(pH 7.0)、100mM NaCl、0.1mM CaCl2 (pH)洗滌管柱。用70mM磷酸鉀(pH 7.0)溶離蛋白質且經由0.22μm過濾器過濾至5L無菌儲存袋中。測試溶離液之生物負荷、蛋白質濃度及酵素活性。
接著經由壓力槽將經HAP純化之蛋白質抽汲通過20nM病毒移除過濾器。將蛋白質添加至DV20壓力槽及過濾器(Pall Corporation)中，通過具有20nm孔之Ultipor DV20過濾器(Pall Corporation)至無菌20L儲存袋中。測試濾液之蛋白質濃度、酵素活性、寡醣、單醣及唾液酸概況，及製程相關雜質。接著使用10kD分子量截斷(molecular weight cut off，MWCO)Sartocon Slice切向流動過濾(tangential flow filtration，TFF)系統(Sartorius)使濾液中之蛋白質濃縮至1mg/mL。首先藉由用Hepes/生理食鹽水溶液(10mM Hepes、130mM NaCl，pH 7.0)洗滌來準備過濾器且對滲透物進行取樣以測定pH值及傳導率。濃縮後，對經濃縮之蛋白質進行取樣且測試蛋白質濃度及酵素活性。對經濃縮之蛋白質執行6×緩衝液交換至最終緩衝液中：10mM Hepes、130mM NaCl(pH7.0)。使經濃縮之蛋白質通過0.22μm過濾器至20L無菌儲存袋中。對蛋白質進行取樣且測試蛋白質濃度、酵素活性、游離巰基、寡醣概況及滲透壓度。
表11至17提供每一3D35M細胞批號的與上述純化步驟中之每一者有關的監測資料。
將經純化及濃縮之可溶性rHuPH20蛋白質無菌填充至具有5mL及1mL填充體積之無菌小瓶中。使該蛋白質通過0.22μm過濾器至用於使用重量分析讀數器填充小瓶之操作者控制的泵中。用塞子封閉小瓶且用螺紋蓋緊固。對封閉之小瓶目測檢查外來顆粒且接著加以標記。標記後，藉由浸入液氮中不長於1分鐘將小瓶急驟冷凍且儲存於(-20±5℃)下。
實施例14 含有可溶性人類PH20(rHuPH20)之Gen2細胞之製備
使實施例12中所述之Gen1 3D35M細胞系適應於較高甲胺喋呤含量以產生2代(Gen2)純系。將3D35M細胞自所建立之含有甲胺喋呤之培養物接種至含有4mM GlutaMAX-1TM 及1.0μM甲胺喋呤之CD CHO培養基中。藉由經46天時期使細胞在37℃、7% CO2 濕潤恆溫箱中生長及繼代9次而使其適應於較高甲胺喋呤含量。在含有具有2.0μM甲胺喋呤之培養基的96孔組織培養板中藉由限制稀釋法來選殖出擴增之細胞群。約4週後，鑑別純系且選擇純系3E10B用於擴增。使3E10B細胞生長於含有4mM GlutaMAX-1TM 及2.0μM甲胺喋呤之CD CHO培養基中達20次繼代。產生3E10B細胞系之主細胞庫(master cell bank，MCB)且將其冷凍並用於隨後研究。
藉由將3E10B細胞培養於含有4mM GlutaMAX-1TM 及4.0μM甲胺喋呤之CD CHO培養基中繼續細胞系之擴增。第12次繼代後，將細胞冷凍於小瓶中作為研究細胞庫(research cell bank，RCB)。將一小瓶RCB解凍且培養於含有8.0μM甲胺喋呤之培養基中。5天後，使培養基中之甲胺喋呤濃度增加至16.0μM，接著18天後增加至20.0μM。在含有4mM GlutaMAX-1TM 及20.0μM甲胺喋呤之CD CHO培養基的96孔組織培養板中藉由限制稀釋法選殖出含有20.0μM甲胺喋呤之培養基中之來自第8次繼代的細胞。5-6週後鑑別純系且選擇純系2B2用於在含有20.0μM甲胺喋呤之培養基中擴增。第11次繼代後，將2B2細胞冷凍於小瓶中作為研究細胞庫(RCB)。
所得2B2細胞為表現可溶性重組人類PH20(rHuPH20)之二氫葉酸還原酶缺陷型(dhfr-)DG44 CHO細胞。該可溶性pH20以約206個複本/細胞之複本數存在於2B2細胞中。使用rHupH20特異性探針對經Spe I-、Xba I-及BamH I/Hind III消化之基因組2B2細胞DNA進行南方墨點法分析揭示以下限制性消化特徵：在用Spe I消化之DNA情況下一個約7.7kb之主要雜交條帶及四個次要雜交條帶(約13.9、約6.6、5.7及約4.6kb)；在用Xba I消化之DNA情況下一個約5..0kb之主要雜交條帶及兩個次要雜交條帶(約13.9及6.5kb)；及使用用BamH I/Hind III消化之2B2 DNA觀察到一個約1.4kb之單一雜交條帶。
實施例15 A.　在300L生物反應器細胞培養中製備Gen2可溶性rHuPH20
將一小瓶HZ24-2B2解凍且自搖瓶經由36L旋轉燒瓶在補充有20μM甲胺喋呤及GlutaMAX-1TM (Invitrogen)之CD-CHO培養基(Invitrogen,Carlsbad,CA)中擴增。簡言之，將一小瓶細胞於37℃水浴中解凍，添加培養基且將該等細胞離心。將細胞再懸浮於125mL具有20mL新鮮培養基之搖瓶中且置於37℃、7%CO2 恆溫箱中。使細胞在該125mL搖瓶中擴增至40mL。當細胞密度達到大於1.5×106 個細胞/毫升時，使培養物以100mL培養體積擴增至125mL旋轉燒瓶中。於37℃、7% CO2 下培養該燒瓶。當細胞密度達到大於1.5×106 個細胞/毫升時，使培養物以200mL培養體積擴增至250mL旋轉燒瓶中，且於37℃、7% CO2 下培養該燒瓶。當細胞密度達到大於1.5×106 個細胞/毫升時，使培養物以800mL培養體積擴增至1L旋轉燒瓶中且於37℃、7% CO2 下培養。當細胞密度達到大於1.5×106 個細胞/毫升時，使培養物以5000mL培養體積擴增至6L旋轉燒瓶中且於37℃、7% CO2 下培養。當細胞密度達到大於1.5×106 個細胞/毫升時，使培養物以32L培養體積擴增至36L旋轉燒瓶中且於37℃、7% CO2 下培養。
將400L反應器滅菌且添加230mL CD-CHO培養基。在使用之前，檢查反應器之污染情況。將約30L細胞以每毫升4.0×105個活細胞之接種密度及260L之總體積自36L旋轉燒瓶轉移至400L生物反應器(Braun)。參數為溫度設定點37℃；葉輪速度40-55RPM；容器壓力：3psi；空氣噴射0.5-1.5L/Min；空氣覆蓋：3L/min。每日對反應器進行取樣以進行細胞計數、pH值驗證、培養基分析、蛋白質產生及滯留。又，在運作期間添加營養物饋料。120小時(第5天)時，添加10.4L1號饋料培養基(4×CD-CHO+33g/L葡萄糖+160mL/L GlutaMAX-1TM +83mL/L Yeastolate+33mg/LrHuInsulin)。168小時(第7天)時，添加10.8L 2號饋料(2×CD-CHO+33g/L葡萄糖+80mL/L GlutaMAX-1TM +167mL/L Yeastolate+0.92g/L丁酸鈉)，且使培養溫度變為36.5℃。216小時(第9天)後，添加10.8L 3號饋料(1×CD-CHO+50g/L葡萄糖+50mL/L GlutaMAX-1TM +250mL/L Yeastolate+1.80g/L丁酸鈉)，且使培養溫度變為36℃。264小時(第11天)後，添加10.8L4號饋料(1×CD-CHO+33g/L葡萄糖+33mL/L GlutaMAX-1+250mL/L Yeastolate+0.92g/L丁酸鈉)，且使培養溫度變為35.5℃。在製備之最後階段觀察到饋料培養基之添加顯著增強可溶性rHuPH20之產生。第14天或第15天時或當細胞之生存力下降至40%以下時對反應器進行收集。該製程產生每毫升17,000單位之最終生產力及1千萬個細胞/毫升之最大細胞密度。收集時，對培養物進行取樣以測定黴漿菌、生物負荷、內毒素及病毒試管內及活體內透射電子顯微術(TEM)以測定病毒顆粒及測定酵素活性。
藉由螺形壓縮泵經由並聯的四個各含有一層屬於4-8μm等級之矽藻土及一層屬於1.4-1.1μm等級之矽藻土、接著纖維素膜的Millistak過濾系統模組(Millipore)，隨後經由含有一層屬於0.4-0.11μm等級之矽藻土及一層屬於小於0.1μm等級之矽藻土的第二單一Millistak過濾系統(Millipore)，且接著經由0.22μm終濾器將培養物抽汲至具有350L容量之無菌單一用途可撓性袋中。用10mM EDTA及10mM Tris補充所收集之細胞培養液至7.5之pH值。用切向流動過濾(TFF)設備使用四個Sartoslice TFF 30kDa分子量截斷(MWCO)聚醚碸(PES)過濾器(Sartorious)使培養物濃縮10倍，接著用10mM Tris、20mM Na2 SO4 (pH 7.5)進行10×緩衝液交換至0.22μm終濾器中進入50L無菌儲存袋中。
使經濃縮、透濾之收集物中之病毒失活。在病毒失活之前，製備10% Triton X-100、3%三(正丁基)磷酸鹽(tri(n-butyl)phosphate，TNBP)之溶液。使經濃縮、透濾之收集物在36L玻璃反應容器中暴露於1% Triton X-100、0.3% TNBP歷時1小時，緊接著隨後於Q管柱上純化。
B.Gen2可溶性rHuPH20之純化
製備Q瓊脂糖(Pharmacia)離子交換柱(9L樹脂，H=29cm，D=20cm)。收集洗滌樣品以測定pH值、傳導率及內毒素(LAL檢定)。用5管柱體積之10mM Tris、20mM Na2SO4(pH 7.5)使該管柱平衡。病毒失活後，將經濃縮、透濾之收集物以100cm/hr之流速加樣於Q管柱上。用5管柱體積之10mM Tris、20mM Na2 SO4 (pH 7.5)及10mM Hepes、50mM NaCl(ph7.0)洗滌管柱。用10mM Hepes、400mM NaCl(pH 7.0)將蛋白質溶離至0.22μm終濾器中進入無菌袋中。測試溶離液樣品之生物負荷、蛋白質濃度及玻尿酸酶活性。在交換之開始及結束時進行A280 吸光度讀數。
隨後執行苯基-瓊脂糖(Pharmacia)疏水性相互作用層析。製備苯基-瓊脂糖(PS)管柱(19-21L樹脂，H=29cm，D=30cm)。收集洗液且進行取樣以測定pH值、傳導率及內毒素(LAL檢定)。用5管柱體積之5mM磷酸鉀、0.5M硫酸銨、0.1mM CaCl2 (pH 7.0)使該管柱平衡。分別用2M硫酸銨、1M磷酸鉀及1M CaCl2 儲備溶液補充來自Q瓊脂糖管柱之蛋白質溶離液以得到5mM、0.5M及0.1mM之最終濃度。將蛋白質以100cm/hr之流速加樣於PS管柱上且收集管柱流過物質。用5mM磷酸鉀、0.5硫酸銨及0.1mM CaCl2 (pH 7.0)以100cm/hr洗滌管柱且將洗液添加至所收集之流過物質中。與管柱洗液合併，使流過物質通過0.22μm終濾器至無菌袋中。對流過物質進行取樣以測定生物負荷、蛋白質濃度及酵素活性。
製備硼酸胺基苯酯管柱(Promtics)。收集洗液且進行取樣以測定pH值、傳導率及內毒素(LAL檢定)。用5管柱體積之5mM磷酸鉀、0.5M硫酸銨使該管柱平衡。將含有經純化之蛋白質的PS流過物質以100cm/hr之流速加樣於硼酸胺基苯酯管柱上。用5管柱體積之5mM磷酸鉀、0.5M硫酸銨(pH 7.0)洗滌管柱。用20mM二甘胺酸、0.20M硫酸銨(pH 9.0)洗滌管柱。用20mM二甘胺酸、100mM氯化鈉(pH 9.0)洗滌管柱。用50mM Hepes、100mM NaCl(pH 6.9)溶離蛋白質且使其通過無菌過濾器至無菌袋中。測試經溶離之樣品的生物負荷、蛋白質濃度及酵素活性。
製備羥基磷灰石(HAP)管柱(Biorad)。收集洗液且測試pH值、傳導率及內毒素(LAL檢定)。用5mM磷酸鉀、100mM NaCl、0.1mM CaCl2 (pH 7.0)使該管柱平衡。將經硼酸胺基苯酯純化之蛋白質補充至5mM磷酸鉀及0.1mM CaCl2 之最終濃度且以100cm/hr之流速加樣於HAP管柱上。用5mM磷酸鉀(pH 7)、100mM NaCl、0.1mM CaCl2 洗滌管柱。隨後用10mM磷酸鉀(pH 7)、100mM NaCl、0.1mM CaCl2 洗滌管柱。用70mM磷酸鉀(pH 7.0)溶離蛋白質且使其通過0.22μm無菌過濾器至無菌袋中。測試經溶離之樣品的生物負荷、蛋白質濃度及酵素活性。
接著使經HAP純化之蛋白質通過病毒移除過濾器。首先藉由用2L 70mM磷酸鉀(pH 7.0)洗滌來製備經滅菌之Viosart過濾器(Sartorius)。在使用之前，對經過濾之緩衝液進行取樣以測定pH值及傳導率。經由壓力槽經由20nM病毒移除過濾器抽汲經HAP純化之蛋白質。使於70mM磷酸鉀(pH 7.0)中之經過濾之蛋白質通過0.22μm終濾器至無菌袋中。測試經過濾病毒之樣品的蛋白質濃度、酵素活性、寡醣、單醣及唾液酸概況。亦測試該樣品之製程相關雜質。
接著使用10kD分子量截斷(MWCO)Sartocon Slice切向流動過濾(TFF)系統(Sartorius)使濾液中之蛋白質濃縮至10mg/mL。首先藉由用10mM組胺酸、130mM NaCl(pH 6.0)洗滌來製備過濾器且對滲透物進行取樣以測定pH值及傳導率。濃縮後，對經濃縮之蛋白質進行取樣且測試蛋白質濃度及酵素活性。對經濃縮之蛋白質執行6×緩衝液交換至最終緩衝液中：10mM組胺酸、130mM NaCl(pH 6.0)。緩衝液交換後，使經濃縮之蛋白質通過0.22μm過濾器至20L無菌儲存袋中。對蛋白質進行取樣且測試蛋白質濃度、酵素活性、游離巰基、寡醣概況及滲透壓度。
接著將經無菌過濾之塊狀蛋白質以20mL無菌分配於30mL無菌鐵氟龍(Teflon)小瓶(Nalgene)中。接著將該等小瓶急驟冷凍且儲存於-20±5℃下。
C.　Gen1可溶性rHuPH20與Gen2可溶性rHuPH20之製備及純化的比較
在300L生物反應器細胞培養中Gen2可溶性rHuPH20之製備及純化在方案方面與在100L生物反應器細胞培養中Gen1可溶性rHuPH20之製備及純化(實施例13.B中所述)相比含有一些變化。表18陳述除簡單按比例擴大變化外該等方法之間的例示性差異。
實 施例16 可溶性rHupH20之玻尿酸酶活性的測定
使用比濁檢定測定諸如細胞培養物、純化部分及經純化溶液之樣品中之可溶性rHuPH20的玻尿酸酶活性，該檢定係根據當玻尿酸與血清白蛋白結合時形成不溶性沈澱物。藉由將可溶性rHuPH20與透明質酸鈉(玻尿酸)一起培養規定時期(10分鐘)且接著在添加酸化血清白蛋白下使未經消化之透明質酸鈉沈澱來量測該活性。30分鐘發展時期後於640nm下量測所得樣品之混濁度。由於酵素對透明質酸鈉受質之活性而使混濁度降低為可溶性rHupH20酶促活性之量度。使用以可溶性rHupH20檢定工作參考標準之稀釋液產生的校正曲線運作該方法，且相對於此校正曲線進行樣品活性量測。
於酵素稀釋劑溶液中製備樣品之稀釋液。該酵素稀釋劑溶液係藉由將33.0±0.05mg經水解之明膠溶解於25.0mL 50mM PIPES反應緩衝液(140mM NaCl、50mM PIpES，pH5.5)及25.0mL SWFI中且將0.2mL 25% Buminate溶解於混合物中並渦旋30秒來製備。在2小時使用時間內執行此步驟且儲存於冰上直至需要時。將樣品稀釋至估算的1-2U/mL。通常，每步驟之最大稀釋度不超過1:100且用於首次稀釋之初始樣品體積不小於20μL。執行檢定所需之最小樣品體積為：處理中樣品，FpLC部分：80μL；組織培養上清液：1mL；經濃縮之物質80μL；經純化或最後步驟之物質：80μL。在低蛋白質結合96孔板中以一式三份方式製備稀釋液，且將各30 μL稀釋液轉移至Optilux黑色/透明底培養板(BD BioSciences)。
於酵素稀釋劑溶液中製備濃度為2.5U/mL之已知可溶性rHuPH20的稀釋液以產生標準曲線且將其以一式三份方式添加至Optilux培養板中。該等稀釋液包括0U/mL、0.25U/mL、0.5U/mL、1.0U/mL、1.5U/mL、2.0U/mL及2.5U/mL。該培養板中包括作為陰性對照之含有60μL酵素稀釋劑溶液的「試劑空白」孔。接著覆蓋培養板且於37℃下於加熱塊上加溫5分鐘。移除覆蓋物且將培養板震盪10秒。震盪後，將培養板放回至該加熱塊上且給MULTIDROP 384液體操作裝置裝填溫熱0.25mg/mL透明質酸鈉溶液(藉由將100mg透明質酸鈉(LifeCore Biomedical)溶解於20.0mL SWFI中來製備。藉由輕輕地旋轉且/或於2-8℃下搖動2-4小時將其混合，或直至完全溶解)。將反應培養板轉移至MULTIDROP 384且藉由按啟動鍵來起始反應以將30μL透明質酸鈉分配於各孔中。接著將培養板自MULTIDROP 384移出且震盪10秒，隨後在更換培養板覆蓋物之情況下轉移至加熱塊。將培養板於37℃下培養10分鐘。
藉由給機器裝填血清工作溶液且將體積設定變為240μL來使MULTIDROP 384準備停止反應。(於75mL 500mM乙酸鹽緩衝溶液中之25mL血清儲備溶液[用9體積之500mM乙酸鹽緩衝溶液稀釋1體積之馬血清(Sigma)且用鹽酸將pH值調整至3.1])。自加熱塊移出培養板且置於MULTIDROP 384上並將240μL血清工作溶液分配於孔中。移出培養板且於讀板器上震盪10秒。再過15分鐘後，於640nm下量測樣品之混濁度且藉由擬合標準曲線來測定各樣品之酵素活性(以U/mL計)。
藉由將酵素活性(U/ml)除以蛋白質濃度(mg/mL)來計算比活性(U/mg)。
實施例17 組織蛋白酶-L充當Zucker大鼠之皮下間隙中的纖維中隔
藉由投予於MES緩衝液(pH 5.3)中之90μg/ml組織蛋白酶-L來處理Zucker大鼠且對皮膚切片執行組織學以觀測纖維中隔。作為對照，單獨用MES緩衝液(pH 5.3)處理大鼠。如實施例5中所述固定切片且用馬松三色染色來染色以觀測膠原蛋白。亦用蘇木素(Hemotoxylin)及伊紅(Eosin)對切片進行染色。簡言之，使切片脫石蠟且與水水合。若切片經Zenker固定，則用碘移除氯化汞晶體且用硫代硫酸鈉清洗。用邁爾蘇木素(Mayer's hematoxylin)將樣品染色15分鐘，接著以流動自來水洗滌20分鐘。用伊紅將切片對比染色15秒至2分鐘，其視伊紅之老化及所需對比染色深度而定。為得到均勻染色結果，將載玻片浸漬若干次，隨後使其固定於伊紅中。使切片於95%酒精及無水酒精中脫水，兩分鐘變化兩次(一分鐘一次)，直至移除過量伊紅。於顯微鏡下檢驗載玻片，隨後以二甲苯清洗，兩分鐘變化兩次(一分鐘一次)。將切片置於Permount或Histoclad中。結果展示在僅用酸性緩衝液處理之對照動物體內，皮下脂肪小葉由垂直地延伸至皮膚表面之膠原蛋白纖維中隔的複雜網分隔。用組織蛋白酶-L處理大鼠使得下皮纖維中隔降解。
在用無組織蛋白酶-L之MES緩衝液(pH 5.3)、用90μg/ml組織蛋白酶-L或用於50mM HEPES緩衝液(pH 7.4)中之90μg/ml細菌膠原酶處理後，進一步用兔抗-膠原蛋白抗體觀測纖維中隔之組織。結果展示在僅用酸性MES緩衝液處理之對照大鼠體內的正常膠原蛋白分布。用組織蛋白酶-L處理大鼠展示膠原蛋白染色減少，從而證明膠原蛋白降解。然而，藉由用細菌膠原酶處理大鼠使膠原蛋白之降解更顯著。此等結果表明組織蛋白酶-L與細菌膠原酶相比對膠原蛋白降解具有更強暫時性控制。
實施例18 在Zucker大鼠真皮中組織蛋白酶-L之酶促作用的持續時間
在Zucker大鼠之真皮中使用兩種互補方法評估組織蛋白酶-L之酶促作用的持續時間：西方墨點法及酶促活性。給大鼠在真皮中注射1mL含有腎上腺素(2.5μg/mL)之1200單位/毫升rHuPH20(pH 5.3)以誘導血管收縮。此後緊接著注射1mL於50mM MES緩衝液中之100μg/mL重組組織蛋白酶-L(pH5.3)。在注射部位處製造切口且注射後3至70分鐘用20μL及200μL Eppendorf移液管收集間質灌注液。如實施例10中所述藉由西方墨點分析及如實施例9中所述藉由經一個小時量測組織蛋白酶-L之酶促活性(如自稱為Z-Leu-Arg-AMC之市售螢光受質的水解速率所測定)來分析流體之膠原蛋白降解，該活性以相對螢光單位(relative fluorescence unit，RFU)/分鐘表示。使用pH值指示條(EMD Chemicals,Inc.,Gibbstown,NJ，目錄號9588)記錄間質液灌注液之pH值。資料展示於表19中。
在處理後10分鐘內量測到最大酶促活性。在真皮中投藥後，活性在30min時降低約50%且在60min時降低約70%。
實 施例19 組織蛋白酶-L對Zucker大鼠真皮中之膠原蛋白降解的劑量-反應作用
在Zucker大鼠之真皮中投予1ml 1200U/ml rHuPH20(pH 5.3)後，向Zucker大鼠之真皮中投予1ml範圍為1μg/mL至500μg/mL之組織蛋白酶-L劑量。注射後20分鐘，收集活組織檢查，將其固定於波恩氏固定劑(Bouin's fixative)中，且經處理以供組織學分析。用蘇木素及伊紅對切片進行染色，且如實施例5中所述用馬松三色染色以觀測膠原蛋白。在注射部位用解剖刀製造切口且收集間質流體。
分別如實施例5及10中所述進行經處理之皮膚之組織學分析及灌注液之西方墨點分析。將25μL間質之等分試樣與5μL 6x凝膠加樣樣品緩衝液混合以供SDS-PAGE。將總體積之樣品加樣於4-20% Tris-甘胺酸凝膠(Invitrogen,Carlsbad,CA，目錄號EC6038)上且於Tris-甘胺酸SDS電泳緩衝液中進行電泳直至預染色之分子量標誌(Invitrogen，目錄號LC5925)之染色前緣到達凝膠底部。於4℃下使用XCell II墨點模組(Invitrogen，目錄號IB1001)於20V下以20%甲醇、25mM Tris及220mM甘胺酸之緩衝液將蛋白質轉移至硝基纖維素膜(Invitrogen，目錄號LC2001)上歷時1.5小時。藉由凝膠上幾乎完全不存在預染色標誌條帶之顏色而證實轉移。於室溫下將該膜在由2%於PBST(磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)溶液(137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM磷酸鹽，pH 7.4)，以及用作ELISA之洗滌緩衝液及稀釋劑的清潔劑Tween 20(0.05% v/v))中之脫脂奶粉組成之緩衝液中阻斷30分鐘。於室溫下用以於PBST中之1μg/mL最終濃度使用且於室溫下培養1小時的人類膠原蛋白I之兔多株抗體(Abcam,Cambridge,MA，目錄號ab34710)，接著用以於PBST中之33ng/mL濃度使用的HRP接合之山羊抗-兔IgG(Calbiochem,San Diego,CA，目錄號DC03L)偵測膠原蛋白I歷時1小時。藉由不溶性TMB(Calbiochem，目錄號613548)膜顯影液使HRP信號顯影且於室溫下5-10分鐘後藉由以ddH2 O沖洗來停止反應。
組織學及西方墨點分析展示組織蛋白酶-L之劑量增加產生劑量依賴性膠原蛋白降解。西方墨點分析指示如藉由用100μg/mL處理之樣品中存在諸多低分子量條帶所判斷，組織蛋白酶-L之濃度愈高使得膠原蛋白降解規模愈大。
實施例20 組織蛋白酶-L對纖維中隔破壞之劑量依賴性作用
投予1mL於50mM MES、150mM NaCl(pH 5.3)中之1200U/ml rHuPH20後，向Zucker大鼠之真皮投予1mL範圍為於MES緩衝液(pH 5.3)中之1、10、50、100、250及500μg/mL的人類重組組織蛋白酶-L劑量。作為對照，單獨用MES緩衝液(pH 5.3)處理大鼠。注射後20分鐘，如實施例18中所述自注射部位收集間質灌注液。收集皮膚活組織，將其固定於波恩氏固定劑中且經處理以供組織學分析。用蘇木素及伊紅對脫蠟之切片進行染色，如實施例5中所述用馬松三色染色以觀測膠原蛋白。如實施例10中所述進行西方墨點法。
來自組織學及西方墨點分析之結果展示Zucker大鼠中之膠原蛋白的重組組織蛋白酶-L降解具劑量依賴性。纖維中隔之破壞在用10μg/mL組織蛋白酶-L處理之皮膚中明顯可見。
實施例21 離子強度對Zucker大鼠真皮中之組織蛋白酶-L之作用的作用
根據緩衝液及腎上腺素之離子強度研究注射於真皮中之組織蛋白酶-L酵素活性的時期。
給Zucker大鼠注射1mL之1200U/ml rHuPH20，接著注射1mL於1、5、10及50mM MES緩衝液、150mM NaCl(pH 5.3)中之25μg/mL組織蛋白酶-L。投藥後20分鐘時收集間質灌注液。使用pH值指示條(EMD Chemicals,Inc.,Gibbstown,NJ，目錄號9588)記錄間質液灌注液之pH值且如實施例9中所述量測真皮中之組織蛋白酶-L酶促活性。對於低離子緩衝液濃度(1、5及10mM MES，pH 5.3)而言真皮灌注液之pH值為7.5。當以50mM MES(pH 5.3)傳遞組織蛋白酶-L時，真皮灌注液之pH值為6.5。當以低離子緩衝液濃度(1、5及10mM MES)傳遞組織蛋白酶-L時，未偵測到可量測之酶促活性。在投予以50mM MES調配之組織蛋白酶-L之注射部位的灌注液中偵側到穩定的酶促活性。此等結果指示組織蛋白酶-L之酶促活性可受到緩衝液離子強度之嚴格調節。
實施例22 注入Zucker大鼠皮下層之組織蛋白酶-L對纖維中隔之破壞
在投予於50mM MES、150mM NaCl(pH 5.3)中之1200U/ml rHuPH20後用於50mM MES緩衝液、150mM NaCl(pH 5.3)中之10μg/mL或100μg/mL組織蛋白酶-L處理的22隻雄性Zucker大鼠體內評估注入Zucker大鼠之皮下層中之一個單劑量的組織蛋白酶-L之作用。每週進行活組織檢查一次歷時20週之時期且如實施例5中所述進行組織學分析。如實施例17中所述用10μg/ml或100μg/ml劑量之組織蛋白酶-L的單一處理導致纖維中隔之快速破壞。第4週時進行之組織學分析指示纖維中隔之數目在經處理之區域中比在未經處理之區域中少。自第20週起，在經處理之區域中未見纖維中隔之典型垂直取向。相反地，下皮中之膠原蛋白的取向為水平的且平行於皮膚表面，此與組織重塑一致。
實施例23 投予組織蛋白酶-L與副作用無關
對經血管內注射之組織蛋白酶L的安全性研究展示無明顯副作用。向25g雄性balb/c小鼠(Charles River)及200g雄性Sprague Dawley大鼠(Harlan Laboratories)之尾部靜脈中投予濃度達12mg/kg之於50mM MES、150mM NaCl(pH 5.3)中之重組組織蛋白酶L。針對副作用觀察動物歷時一週。藉由籠側觀察未記錄到副作用。
實施例24 組織蛋白酶-L改變豬下皮中之纖維中隔微結構之結構
經由插入側腹之下皮中的23號蝶形針(Terumo,Leuven,Belgium，目錄號CE0197)使經麻醉之約克夏豬(SNS農場，Ramona,Ca)接受5mL含有1200U/mL rHuPH20之50mM MES、150mM NaCl緩衝液(pH5.3)，緊接著隨後接受：i)5mL於50mM MES、150mM NaCl緩衝液(pH 5.3)中之50μg/ml組織蛋白酶-L；或ii)50μg於50mM HEPES、150mM NaCl緩衝液(pH 7.4)中之細菌膠原酶。對照為50mM MES緩衝液、150mM NaCl(pH 5.3)；單獨rHuPH20(pH 5.3)及組織蛋白酶-L(pH 7.4)。處理後2小時、24小時及7天時收集全厚度活組織且將其固定於波恩氏固定劑中。切割6mm組織切片且用蘇木素及伊紅或用馬松三色膠原蛋白染色進行染色。在膠原酶注射部位觀察到特徵為強烈棕色褪色之總體變化，但在經組織蛋白酶-L處理之部位程度小得多。在注射對照之部位或在未經處理之皮膚中未見總體變化。此等結果展示用組織蛋白酶-L處理與細菌膠原酶注射相比伴有最小限度的出血。
總體變化典型地與用膠原酶之實質皮下注射部位出血的組織學發現有關，但用組織蛋白酶-L出血最少。纖維中隔之微結構的特徵在於與僅經MES緩衝液處理之皮膚中之緻密包裝的膠原蛋白中隔相比，注射組織蛋白酶-L及細菌膠原酶之皮膚中之膠原纖維縱向分裂、崩解及形成角度。然而，組織學結果展示與經組織蛋白酶-L處理之部位相比，經膠原酶處理之部位中之中隔的微結構之變化更嚴重，此與出血結果一致。另外，用低至5μg/mL之劑量的細菌膠原酶處理導致嚴重橫紋肌溶解。此等結果證明雖然組織蛋白酶-L降解膠原蛋白且改變纖維中隔之結構，但其作用比細菌膠原酶更受控制，因為組織蛋白酶-L於生理學pH值下快速失活，而膠原酶於生理學pH值下在較長時期內具活性。
在另一研究中，使豬接受5mL之120U/ml rHuPH20(pH 5.3)，隨後接受5mL於50mM MES、150mM NaCl(pH 5.3)中之劑量範圍為5μg/mL至1000μg/mL(5、25、50、100、200、500及1000μg/mL)重組組織蛋白酶-L。處理後2小時及24小時時收集全厚度皮膚活組織，將其固定於波恩氏固定劑中且經處理以供H&E染色或如實施例5中所述用馬松三色處理以用於膠原蛋白染色。對注射後2小時及24小時時切下之皮膚的目測檢查展示用25μg/mL及25μg/mL以上劑量處理之注射部位存在中度出血。僅在500μg/mL及1000μg/mL之高劑量的重組組織蛋白酶-L情況下在注射部位區域中觀察到橫紋肌溶解。
因為修改形式對於熟習此項技術者將顯而易見，所以預期本發明僅由隨附申請專利範圍之範疇限制。

Claims (178)

  1. 一種可活化的基質降解酵素(activatable matrix-degrading enzyme，AMDE)之用途，其係用於調配用於表皮下投藥以暫時地降解細胞外基質(ECM)之組份以治療ECM疾病或病狀之醫藥品，其中：該AMDE係以當暴露於活化劑時足以降解與該疾病或病狀相關之ECM組份的量調配；該AMDE為在該活化劑不存在之情況下在表皮下投藥後在ECM中無活性之基質降解酵素；且該AMDE在ECM中在表皮下投藥後在暴露於該活化劑提供之活化條件後有限的時間內具有活性。
  2. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該醫藥品係用於單劑量投藥，且含有為或約為10 μg至100 mg、50 μg至75 mg、100 μg至50 mg、250 μg至25 mg、500 μg至10 mg、1 mg至5 mg或2 mg至4 mg之量的AMDE。
  3. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該酵素於中性pH值下實質上無活性。
  4. 如申請專利範圍第1項之用途，其是經調配用於皮下投藥、肌肉內投藥、病灶內投藥或皮內投藥。
  5. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該活化劑係與該AMDE調配於同一組成物中或調配於分開的組成物中。
  6. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該AMDE係選自組織蛋白酶(cathepsin)、鈣激活中性蛋白酶(calpain)及肝素酶(heparanase)。
  7. 如甲請專利範圍第6項之用途，其中該AMDE為組織蛋白酶且該組織蛋白酶為半胱胺酸蛋白酶(cysteine protease)或天冬胺酸蛋白酶(aspartic protease)。
  8. 如申請專利範圍第7項之用途，其中該組織蛋白酶係選自組織蛋白酶S、組織蛋白酶K、組織蛋白酶L、組織蛋白酶B、組織蛋白酶C、組織蛋白酶H、組織蛋白酶F、組織蛋白酶O、組織蛋白酶R、組織蛋白酶V、組織蛋白酶W、組織蛋白酶D及組織蛋白酶E。
  9. 如申請專利範圍第8項之用途，其中該組織蛋白酶為組織蛋白酶L。
  10. 如申請專利範圍第7項之用途，其中該組織蛋白酶具有選自SEQ ID NO：57、60、1、65、180、68、71、74、77、183、186、189、80、195、90、93及96中之任一者的胺基酸序列，或為SEQ ID NO：57、60、1、65、180、68、71、74、77、183、186、189、80、195、90、93及96中之任一者的對偶基因或物種變異體或其他變異體。
  11. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該活化條件係選自pH值、離子強度、溫度及金屬離子。
  12. 如申請專利範圍第11項之用途，其中該AMDE需要超過一種用於活性之活化條件。
  13. 如申請專利範圍第11項之用途，其中該活化條件為pH值。
  14. 如申請專利範圍第13項之用途，其中該活化條件為酸性pH值。
  15. 如申請專利範圍第14項之用途，其中：該AMDE於中性pH值下無活性；該活化劑提供酸性pH值活化條件以活化該酵素；且該AMDE於pH 5.5下具活性。
  16. 一種組織蛋白酶L之用途，其係用於調配用於在外層皮膚之下的表皮下投藥以治療膠原蛋白介導之疾病或病狀之醫藥品，其中：該膠原蛋白介導之疾病或病狀與膠原蛋白中富含之累積的纖維組織相關；且該組織蛋白酶L係於酸性緩衝液中調配，該酸性緩衝液提供用於投藥之酸性pH值活化條件，藉此該組織蛋白酶L在表皮下投藥後有限的時間內具有活性以降解皮膚之纖維中的ECM之膠原蛋白組份。
  17. 如申請專利範圍第14或16項之用途，其中該pH值為在或約在3至6.5、或3.5至6、或3至5.5、或3至4.5、或4至6、或4至5.5、或4.5至5、或5至6之範圍內的酸性pH值。
  18. 如申請專利範圍第17項之用途，其中該pH值約為或為3、3.5、4、4.5、5、5.5、6或6.5。
  19. 如申請專利範圍第14項之用途，其中活化劑作為緩衝溶液於該pH值下提供酸性pH值活化條件。
  20. 如申請專利範圍第16或19項之用途，其中該緩衝液含有選自2-(N-嗎啉基)乙烷磺酸(MES)、乙酸、檸檬酸、檸檬酸磷酸鹽及組胺酸之酸。
  21. 如申請專利範圍第16或19項之用途，其中該緩衝液之離子強度經選擇以使得該AMDE於中性pH值下在預定時間內具活性。
  22. 如申請專利範圍第21項之用途，其中該預定時間為或約為1分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘、5分鐘、6分鐘、7分鐘、8分鐘、9分鐘、10分鐘、20分鐘、30分鐘、40分鐘、50分鐘、1小時、2小時、3小時或4小時。
  23. 如申請專利範圍第15項之用途，其中該AMDE為溶酶體酵素。
  24. 如申請專利範圍第15項之用途，其中該AMDE為組織蛋白酶或肝素酶。
  25. 如申請專利範圍第24項之用途，其中該AMDE為組織蛋白酶且該組織蛋白酶為半胱胺酸蛋白酶或天冬胺酸蛋白酶。
  26. 如申請專利範圍第25項之用途，其中該組織蛋白酶係選自組織蛋白酶B、組織蛋白酶F、組織蛋白酶H、組織蛋白酶K、組織蛋白酶L、組織蛋白酶V及組織蛋白酶D。
  27. 如申請專利範圍第26項之用途，其中該組織蛋白酶具有選自SEQ ID NO：65、71、183、68、60、1、189及90中之任一者的胺基酸序列，或為SEQ ID NO：65、71、183、68、60、1、189及90中之任一者的對偶基因或物種變異體或其他變異體。
  28. 如申請專利範圍第26項之用途，其中該組織蛋白酶為組織蛋白酶L。
  29. 如申請專利範圍第16或28項之用途，其中該組織蛋白酶L酵素為呈單鏈形式。
  30. 如申請專利範圍第16或28項之用途，其中該組織蛋白酶L酵素為呈雙鏈形式。
  31. 如申請專利範圍第16或28項之用途，其中該組織蛋白酶L酵素包含：具有如SEQ ID NO：1胺基酸1-175所述之胺基酸序列或與胺基酸1-175之序列展示至少90%序列一致性之序列的重鏈；及具有如SEQ ID NO：1胺基酸179-220所述之胺基酸序列或與胺基酸179-220之序列展示至少90%序列一致性之序列的輕鏈。
  32. 如申請專利範圍第16或28項之用途，其中該組織蛋白酶L具有如SEQ ID NO：1所述之胺基酸序列或為其對偶基因、物種變異體或其他變異體。
  33. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該AMDE為呈單鏈或雙鏈形式之成熟蛋白質。
  34. 如申請專利範圍第11項之用途，其中：該AMDE經修飾以具溫度敏感性，藉此該AMDE在低於37℃之溫度下具有活性，該活化劑提供了低於37℃之溫度下之活化條件；該AMDE於37℃下無活性。
  35. 如申請專利範圍第11項之用途，其中該活化條件為溫度且該溫度為或約為20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、 26℃、27℃、28℃、29℃或30℃。
  36. 如申請專利範圍第34項之用途，其中該AMDE係選自胰腺彈性蛋白酶、彈性蛋白酶-2A、彈性蛋白酶-2B、嗜中性白血球彈性蛋白酶、蛋白酶-3、內源性血管彈性蛋白酶、組織蛋白酶G、肥大細胞凝乳酶、肥大細胞類胰蛋白酶(tryptase)、纖溶酶(plasmin)、凝血酶、顆粒酶(granzyme)B、組織蛋白酶S、組織蛋白酶K、組織蛋白酶L、組織蛋白酶B、組織蛋白酶C、組織蛋白酶H、組織蛋白酶F、組織蛋白酶O、組織蛋白酶R、組織蛋白酶V、組織蛋白酶W、鈣激活中性蛋白酶1、鈣激活中性蛋白酶2、豆蛋白酶(legumain)、組織蛋白酶Z、組織蛋白酶D、組織蛋白酶E、MMP-1、MMP-8、MMP-13及MMP-18、MMP-2、MMP-9、MMP-3、MMP-10、MMP-11、MMP-7、MMP-26、MMP-12、MMP-14、MMP-15、MMP-16及MMP-17、MMP-19、MMP-20、ADAMTS-1、ADAMTS-2、ADAMTS-3、ADAMTS-4、ADAMTS-5、ADAMTS-14及肝素酶或其對偶基因或物種變異體或其他變異體。
  37. 如申請專利範圍第34項之用途，其中該活化劑為冷緩衝液。
  38. 如申請專利範圍第34項之用途，其中該活化劑與該AMDE提供於同一組成物中或提供於分開的組成物中。
  39. 如申請專利範圍第11項之用途，其中該活化條件為金屬離子且該金屬離子為Ca2+ 。
  40. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該一或多種 ECM組份係選自膠原蛋白、彈性蛋白、纖維結合蛋白(fibronectin)或蛋白聚糖。
  41. 如申請專利範圍第16或40項之用途，其中該ECM組份為膠原蛋白且該膠原蛋白係選自I型、II型、III型或IV型膠原蛋白。
  42. 如申請專利範圍第16或40項之用途，其中該膠原蛋白為I型膠原蛋白。
  43. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該ECM之疾病或病狀為膠原蛋白介導之疾病或病狀。
  44. 如申請專利範圍第16或43項之用途，其中該膠原蛋白介導之疾病或病狀係選自脂肪團、杜普宜特朗氏病(Dupuytren's disease)、帕榮雷氏病(Peyronie's disease)、萊德豪斯纖維化(Ledderhose fibrosis)、關節僵硬、現有瘢痕、硬皮病、淋巴水腫及膠原性結腸炎。
  45. 如申請專利範圍第44項之用途，其中該膠原蛋白介導之疾病或病狀為關節僵硬，該關節僵硬為凍肩。
  46. 如申請專利範圍第44項之用途，其中該膠原蛋白介導之疾病或病狀為選自手術黏連、瘢痕瘤、肥厚性瘢痕及凹陷性瘢痕之現有瘢痕。
  47. 一種醫藥組成物，其包含經調配用於表皮下投藥以用於暫時地降解細胞外基質(ECM)之組份以治療ECM之疾病或病狀的可活化的基質降解酵素(AMDE)，其中：該AMDE係以當暴露於活化劑時足以降解與該疾病或病狀相關之ECM組份的量調配； 該AMDE為在該活化劑不存在之情況下在表皮下投藥後在ECM中無活性之基質降解酵素；且該AMDE在ECM中在表皮下投藥後在暴露於該活化劑提供之活化條件後有限的時間內具有活性。
  48. 如申請專利範圍第47項之組成物，其中該組成物係用於單劑量投藥，且含有為或約為10 μg至100 mg、50 μg至75 mg、100 μg至50 mg、250 μg至25 mg、500 μg至10 mg、1 mg至5 mg或2 mg至4 mg之量的AMDE。
  49. 如申請專利範圍第47項之組成物，其中該酵素於中性pH值下實質上無活性。
  50. 如申請專利範圍第47項之組成物，其經調配用於皮下投藥、肌肉內投藥、病灶內投藥或皮內投藥。
  51. 如申請專利範圍第47項之組成物，其中該活化劑係與該AMDE調配於同一組成物中或調配於分開的組成物中。
  52. 如申請專利範圍第47項之組成物，其中該AMDE係選自組織蛋白酶、鈣激活中性蛋白酶及肝素酶。
  53. 如申請專利範圍第52項之組成物，其中該AMDE為組織蛋白酶且該組織蛋白酶為半胱胺酸蛋白酶或天冬胺酸蛋白酶。
  54. 如申請專利範圍第53項之組成物，其中該組織蛋白酶係選自組織蛋白酶S、組織蛋白酶K、組織蛋白酶L、組織蛋白酶B、組織蛋白酶C、組織蛋白酶H、組織蛋白酶F、組織蛋白酶O、組織蛋白酶R、組織蛋白酶V、組織蛋白酶 W、組織蛋白酶D及組織蛋白酶E。
  55. 如申請專利範圍第54項之組成物，其中該組織蛋白酶為組織蛋白酶L。
  56. 如申請專利範圍第53項之組成物，其中該組織蛋白酶具有選自SEQ ID NO：57、60、1、65、180、68、71、74、77、183、186、189、80、195、90、93及96中之任一者的胺基酸序列，或為SEQ ID NO：57、60、1、65、180、68、71、74、77、183、186、189、80、195、90、93及96中之任一者的對偶基因或物種變異體或其他變異體。
  57. 如申請專利範圍第47項之組成物，其中該活化條件係選自pH值、離子強度、溫度及金屬離子。
  58. 如申請專利範圍第57項之組成物，其中該AMDE需要超過一種用於活性之活化條件。
  59. 如申請專利範圍第57項之組成物，其中該活化條件為pH值。
  60. 如申請專利範圍第59項之組成物，其中該活化條件為酸性pH值。
  61. 如申請專利範圍第60項醫藥組成物，其中：該AMDE於中性pH值下無活性；該活化劑提供酸性pH值活化條件以活化該酵素；且該AMDE於pH 5.5下具活性。
  62. 一種醫藥組成物，其包含經調配用於在外層皮膚之下的表皮下投藥以治療膠原蛋白介導之疾病或病狀的組織蛋白酶L，其中： 該膠原蛋白介導之疾病或病狀與膠原蛋白中富含的累積之纖維組織相關；且該組織蛋白酶L係於酸性緩衝液中調配，該酸性緩衝液提供用於投藥之酸性pH值活化條件，藉此該組織蛋白酶L在表皮下投藥後有限的時間內具有活性以降解皮膚之纖維中的ECM之膠原蛋白組份。
  63. 如申請專利範圍第60或62項之組成物，其中該pH值為在或約在3至6.5、或3.5至6、或3至5.5、或3至4.5、或4至6、或4至5.5、或4.5至5、或5至6之範圍內的酸性pH值。
  64. 如申請專利範圍第63項之組成物，其中該pH值約為或為3、3.5、4、4.5、5、5.5、6或6.5。
  65. 如申請專利範圍第60項之組成物，其中活化劑作為緩衝溶液於該PH值下提供酸性pH值活化條件。
  66. 如申請專利範圍第62或65項之組成物，其中該緩衝液含有選自2-(N-嗎啉基)乙烷磺酸(MES)、乙酸、檸檬酸、檸檬酸磷酸鹽及組胺酸之酸。
  67. 如申請專利範圍第62或65項之組成物，其中該緩衝液之離子強度經選擇以使得該AMDE於中性pH值下在預定時間內具活性。
  68. 如申請專利範圍第67項之組成物，其中該預定時間為或約為1分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘、5分鐘、6分鐘、7分鐘、8分鐘、9分鐘、10分鐘、20分鐘、30分鐘、40分鐘、50分鐘、1小時、2小時、3小時或4小時。
  69. 如申請專利範圍第61項之組成物，其中該AMDE為溶酶體酵素。
  70. 如申請專利範圍第61項之組成物，其中該AMDE為組織蛋白酶或肝素酶。
  71. 如申請專利範圍第70項之組成物，其中該AMDE為組織蛋白酶且該組織蛋白酶為半胱胺酸蛋白酶或天冬胺酸蛋白酶。
  72. 如申請專利範圍第71項之組成物，其中該組織蛋白酶係選自組織蛋白酶B、組織蛋白酶F、組織蛋白酶H、組織蛋白酶K、組織蛋白酶L、組織蛋白酶V及組織蛋白酶D。
  73. 如申請專利範圍第72項之組成物，其中該組織蛋白酶具有選自SEQ ID NO：65、71、183、68、60、1、189及90中之任一者的胺基酸序列，或為SEQ ID NO：65、71、183、68、60、1、189及90中之任一者的對偶基因或物種變異體或其他變異體。
  74. 如申請專利範圍第72項之組成物，其中該組織蛋白酶為組織蛋白酶L。
  75. 如申請專利範圍第47項之組成物，其中該AMDE為呈單鏈或雙鏈形式之成熟蛋白質。
  76. 如申請專利範圍第62或74項之組成物，其中該組織蛋白酶L酵素包含：具有如SEQ ID NO：1胺基酸1-175所述之胺基酸序列或與胺基酸1-175之序列展示至少90%序列一致性之序列的重鏈；及 具有如SEQ ID NO：1胺基酸179-220所述之胺基酸序列或與胺基酸179-220之序列展示至少90%序列一致性之序列的輕鏈。
  77. 如申請專利範圍第62或74項中之醫藥組成物，其中該組織蛋白酶L具有如SEQ ID NO：1所述之胺基酸序列或為其對偶基因、物種變異體或其他變異體。
  78. 如申請專利範圍第57項之醫藥組成物，其中：該AMDE經修飾以具溫度敏感性，藉此該AMDE在低於37℃之溫度下具有活性，該活化劑提供了低於37℃之溫度下之活化條件；且該AMDE於37℃下無活性。
  79. 如申請專利範圍第78項之醫藥組成物，其中該活化條件為溫度且該溫度為或約為20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃。
  80. 如申請專利範圍第78項之醫藥組成物，其中該AMDE係選自胰腺彈性蛋白酶、彈性蛋白酶-2A、彈性蛋白酶-2B、嗜中性白血球彈性蛋白酶、蛋白酶-3、內源性血管彈性蛋白酶、組織蛋白酶G、肥大細胞凝乳酶、肥大細胞類胰蛋白酶、纖溶酶、凝血酶、顆粒酶B、組織蛋白酶S、組織蛋白酶K、組織蛋白酶L、組織蛋白酶B、組織蛋白酶C、組織蛋白酶H、組織蛋白酶F、組織蛋白酶O、組織蛋白酶R、組織蛋白酶V、組織蛋白酶W、鈣激活中性蛋白酶1、鈣激活中性蛋白酶2、豆蛋白酶、組織蛋白酶Z、組織蛋白酶D、組織蛋白酶E、MMP-1、MMP-8、MMP-13及MMP-18、 MMP-2、MMP-9、MMP-3、MMP-10、MMP-11、MMP-7、MMP-26、MMP-12、MMP-14、MMP-15、MMP-16及MMP-17、MMP-19、MMP-20、ADAMTS-1、ADAMTS-2、ADAMTS-3、ADAMTS-4、ADAMTS-5、ADAMTS-14及肝素酶或其對偶基因或物種變異體或其他變異體。
  81. 如申請專利範圍第78項之醫藥組成物，其中該活化劑為冷緩衝液。
  82. 如申請專利範圍第78項之醫藥組成物，其中該活化劑與該AMDE提供於同一組成物中或提供於分開的組成物中。
  83. 如申請專利範圍第57項之組成物，其中該活化條件為金屬離子且該金屬離子為Ca2+ 。
  84. 如申請專利範圍第47項之醫藥組成物，其中該一或多種ECM組份係選自膠原蛋白、彈性蛋白、纖維結合蛋白或蛋白聚糖。
  85. 如申請專利範圍第84項之醫藥組成物，其中該ECM組份為膠原蛋白且該膠原蛋白係選自I型、II型、III型或IV型膠原蛋白。
  86. 如申請專利範圍第47項之醫藥組成物，其中該ECM之疾病或病狀為膠原蛋白介導之疾病或病狀。
  87. 如申請專利範圍第62或86項之醫藥組成物，其中該膠原蛋白介導之疾病或病狀係選自脂肪團、杜普宜特朗氏病、帕榮雷氏病、萊德豪斯纖維化、關節僵硬、現有瘢痕、硬皮病、淋巴水腫及膠原性結腸炎。
  88. 如申請專利範圍第87項之醫藥組成物，其中該膠原蛋白介導之疾病或病狀為關節僵硬，該關節僵硬為凍肩。
  89. 如申請專利範圍第87項之醫藥組成物，其中該膠原蛋白介導之疾病或病狀為選自手術黏連、瘢痕瘤、肥厚性瘢痕及凹陷性瘢痕之現有瘢痕。
  90. 一種組合，其包含：可活化的基質降解酵素(AMDE)，其中該AMDE為在活化劑不存在之情況下在表皮下投藥後在ECM中無活性之基質降解酵素；活化劑，其提供AMDE之活化條件使得當AMDE暴露於該活化劑時為具有活性的；及一或多種選自其他生物製劑(biologic)、小分子化合物、分散劑、麻醉劑及血管收縮劑之其他藥劑。
  91. 如申請專利範圍第90項之組合，其中該活化劑提供選自pH值、金屬離子、溫度及離子強度之活化條件。
  92. 如申請專利範圍第90項之組合，其中該AMDE係選自胰腺彈性蛋白酶、彈性蛋白酶-2A、彈性蛋白酶-2B、嗜中性白血球彈性蛋白酶、蛋白酶-3、內源性血管彈性蛋白酶、組織蛋白酶G、肥大細胞凝乳酶、肥大細胞類胰蛋白酶、纖溶酶、凝血酶、顆粒酶B、組織蛋白酶S、組織蛋白酶K、組織蛋白酶L、組織蛋白酶B、組織蛋白酶C、組織蛋白酶H、組織蛋白酶F、組織蛋白酶O、組織蛋白酶R、組織蛋白酶V、組織蛋白酶W、鈣激活中性蛋白酶1、鈣激活中性蛋白酶2、豆蛋白酶、組織蛋白酶Z、組織蛋白酶D、組織 蛋白酶E、MMP-1、MMP-8、MMP-13及MMP-18、MMP-2、MMP-9、MMP-3、MMP-10、MMP-11、MMP-7、MMP-26、MMP-12、MMP-14、MMP-15、MMP-16及MMP-17、MMP-19、MMP-20、ADAMTS-1、ADAMTS-2、ADAMTS-3、ADAMTS-4、ADAMTS-5、ADAMTS-14及肝素酶或其對偶基因或物種變異體或其他變異體。
  93. 如申請專利範圍第90項之組合，其中該組合中之AMDE係用於單劑量投藥，且含有約10 μg至100 mg、50 μg至75 mg、100 μg至50 mg、250 μg至25 mg、500 μg至10 mg、1 mg至5 mg或2 mg至4 mg之量的AMDE。
  94. 如申請專利範圍第90項之組合，其中該其他藥劑為分散劑，該分散劑為玻尿酸酶。
  95. 如申請專利範圍第94項之組合，其中該玻尿酸酶經糖基化。
  96. 如申請專利範圍第94項之組合，其中該玻尿酸酶為PH20或其截短形式。
  97. 如申請專利範圍第96項之組合，其中該PH20係選自羊類、牛類或人類PH20。
  98. 如申請專利範圍第94項之組合，其中該玻尿酸酶為可溶性的。
  99. 如申請專利範圍第98項之組合，其中該玻尿酸酶具有SEQ ID NO：226-231中所闡明之胺基酸序列，或為其對偶基因或物種變異體或其他變異體。
  100. 如申請專利範圍第94項之組合，其中該玻尿酸酶 為以稱為rHuPH20之組成物形式提供的可溶性玻尿酸酶。
  101. 如申請專利範圍第94項之組合，其中該組合中之玻尿酸酶係用於單劑量投藥，且含有為或約為10單位至500,000單位、100單位至100,000單位、500單位至50,000單位、1000單位至10,000單位、5000單位至7500單位、5000單位至50,000單位或1000單位至10,000單位之量的玻尿酸酶。
  102. 如申請專利範圍第90項之組合，其中該其他藥劑為麻醉劑，該麻醉劑為利多卡因(lidocaine)。
  103. 如申請專利範圍第102項之組合，其中該組合中之利多卡因係用於單劑量投藥且含有為或約為10 mg至1000 mg、100 mg至500 mg、200 mg至400 mg、20 mg至60 mg或30 mg至50 mg之量的利多卡因。
  104. 如申請專利範圍第90項之組合，其中該其他藥劑為血管收縮劑，該血管收縮劑為α腎上腺素能受體促效劑。
  105. 如申請專利範圍第104項之組合，其中該α腎上腺素能受體促效劑係選自可巴君(levonordefrin)、腎上腺素(ephinephrine)及去甲腎上腺素(norepinephrine)。
  106. 如申請專利範圍第104項之組合，其中該α腎上腺素能受體促效劑為實現血管收縮之量的腎上腺素。
  107. 如申請專利範圍第106項之組合，其中該組合中之腎上腺素係用於單劑量投藥，且含有為或約為10 μg至5 mg、50 μg至1 mg、50 μg至500 μg、50 μg至250 μg、100 μg至500 μg、200 μg至400 μg、1 mg至5 mg或2 mg至4 mg之量的腎上腺素。
  108. 如申請專利範圍第90項之組合，其係用於治療ECM之疾病或病狀。
  109. 如申請專利範圍第108項之組合，其中該AMDE為組織蛋白酶L且該ECM之疾病或病狀為脂肪團。
  110. 一種醫藥組成物，其包含用於治療ECM介導的疾病或病狀之量的之組織蛋白酶L，其中：該組成物經調配用於單劑量投藥；且該組成物調配於具有活化該組織蛋白酶L之pH值之酸性緩衝液中。
  111. 如申請專利範圍第110項之組成物，其中該組成物中之組織蛋白酶L的量為或約為10 μg至100 mg、50 μg至75 mg、100 μg至50 mg、250 μg至25 mg、500 μg至10 mg、1 mg至5 mg或2 mg至4 mg。
  112. 如申請專利範圍第110項之組成物，其進一步包含利多卡因、腎上腺素及玻尿酸酶中之一或多者。
  113. 一種組合，其包含組織蛋白酶L與玻尿酸酶。
  114. 如申請專利範圍第113項之組合，其中該玻尿酸酶為稱為rHuPH20之組成物。
  115. 如申請專利範圍第113項之組合，其中該組織蛋白酶L及該玻尿酸酶處於分開的組成物中或處於單一組成物中。
  116. 如申請專利範圍第113項之組合，其進一步包含活化該組織蛋白酶L之酸性緩衝液。
  117. 如申請專利範圍第113項之組合，其中該組織蛋白酶L及該玻尿酸酶處於調配為醫藥組成物之單一組成物中。
  118. 一種套組，其包含如申請專利範圍第90或113項之組合，及視情況投藥說明書。
  119. 一種容器，其包含兩個隔室，其中：第一隔室含有治療有效量之可活化的基質降解酵素(AMDE)，其中：該AMDE為在該活化劑不存在之情況下在表皮下投藥後在ECM中無活性之基質降解酵素；且該量係用於單一劑量或複數個劑量且當暴露於活化劑時單一劑量有效治療ECM之疾病或病狀；且第二隔室含有活化劑，其中該活化劑提供該酵素活性所需之活化條件。
  120. 如申請專利範圍第119項之容器，其中該酵素於pH 5.5下實質上具活性。
  121. 如申請專利範圍第119項之容器，其中該酵素於中性pH值下實質上無活性。
  122. 如申請專利範圍第119項之容器，其進一步包含混合隔室。
  123. 如申請專利範圍第119項之容器，其為管或瓶。
  124. 如申請專利範圍第119項之容器，其為注射器。
  125. 如申請專利範圍第124項之容器，其中該注射器進一步包含注射用針。
  126. 如申請專利範圍第119項之容器，其中： 該活化劑提供選自pH值、金屬離子或離子強度之活化條件，且該活化劑以液體溶液或懸浮液形式提供。
  127. 如申請專利範圍第126項之容器，其中該液體溶液為緩衝液。
  128. 如申請專利範圍第126項之容器，其中該活化條件為酸性之pH值。
  129. 如申請專利範圍第128項之容器，其中該pH值在或約在3至6.5、或3.5至6、或3至5.5、或3至4.5、或4至6、或4至5.5、或4.5至5、或5至6之範圍內。
  130. 如申請專利範圍第128項之容器，其中該pH值約為或為3、3.5、4、4.5、5、5.5、6或6.5。
  131. 如申請專利範圍第127項之容器，其中該活化劑為酸性緩衝溶液。
  132. 如申請專利範圍第131項之容器，其中該緩衝液含有選自2-(N-嗎啉基)乙烷磺酸(MES)、乙酸、檸檬酸、檸檬酸磷酸鹽及組胺酸之酸。
  133. 如申請專利範圍第132項之容器，其中該緩衝液之離子強度經選擇以使得該AMDE在投藥之後在預定時間內具活性。
  134. 如申請專利範圍第126項之容器，其中該活化條件為金屬離子且該金屬離子為Ca2+ 。
  135. 如申請專利範圍第119項之容器，其中該AMDE係選自胰腺彈性蛋白酶、彈性蛋白酶-2A、彈性蛋白酶-2B、 嗜中性白血球彈性蛋白酶、蛋白酶-3、內源性血管彈性蛋白酶、組織蛋白酶G、肥大細胞凝乳酶、肥大細胞類胰蛋白酶、纖溶酶、凝血酶、顆粒酶B、組織蛋白酶S、組織蛋白酶K、組織蛋白酶L、組織蛋白酶B、組織蛋白酶C、組織蛋白酶H、組織蛋白酶F、組織蛋白酶O、組織蛋白酶R、組織蛋白酶V、組織蛋白酶W、鈣激活中性蛋白酶1、鈣激活中性蛋白酶2、豆蛋白酶、組織蛋白酶Z、組織蛋白酶D、組織蛋白酶E、MMP-1、MMP-8、MMP-13、MMP-18、MMP-2、MMP-9、MMP-3、MMP-10、MMP-11、MMP-7、MMP-26、MMP-12、MMP-14、MMP-15、MMP-16及MMP-17、MMP-19、MMP-20、ADAMTS-1、ADAMTS-2、ADAMTS-3、ADAMTS-4、ADAMTS-5、ADAMTS-14及肝素酶或其對偶基因或物種變異體或其他變異體。
  136. 如申請專利範圍第119項之容器，其中該AMDE係選自組織蛋白酶、鈣激活中性蛋白酶及肝素酶。
  137. 如申請專利範圍第119項之容器，其中該AMDE為溶酶體酵素。
  138. 如申請專利範圍第119項之容器，其中該AMDE為呈單鏈或雙鏈形式之成熟蛋白質。
  139. 如申請專利範圍第136項之容器，其中該AMDE為組織蛋白酶且該組織蛋白酶為半胱胺酸蛋白酶或天冬胺酸蛋白酶。
  140. 如申請專利範圍第139項之容器，其中該組織蛋白酶係選自組織蛋白酶S、組織蛋白酶K、組織蛋白酶L、組 織蛋白酶B、組織蛋白酶C、組織蛋白酶H、組織蛋白酶F、組織蛋白酶O、組織蛋白酶R、組織蛋白酶V、組織蛋白酶W、組織蛋白酶D及組織蛋白酶E。
  141. 如申請專利範圍第140項之容器，其中該組織蛋白酶具有選自SEQ ID NO：57、60、1、65、180、68、71、74、77、183、186、189、80、195、90、93及96中之任一者的胺基酸序列，或為SEQ ID NO：57、60、1、65、180、68、71、74、77、183、186、189、80、195、90、93及96中之任一者的對偶基因或物種變異體或其他變異體。
  142. 如申請專利範圍第119項之容器，其中該AMDE及活化劑係以用於多劑量投藥之量提供。
  143. 如申請專利範圍第119項之容器，其中該AMDE及活化劑係以單一單位劑量提供。
  144. 如申請專利範圍第143項之容器，其中該容器中之AMDE為或約為10 μg至100 mg、50 μg至75 mg、100 μg至50 mg、250 μg至25 mg、500 μg至10 mg、1 mg至5 mg或2 mg至4 mg。
  145. 如申請專利範圍第119項之容器，其中該容器中之液體的總體積為或約為1-100 ml、1-50 ml、10-50 ml、10-30 ml、1-20 ml或1-10 ml。
  146. 如申請專利範圍第119項之容器，其中該AMDE處於溶液或懸浮液中。
  147. 如申請專利範圍第119項之容器，其中該AMDE經凍乾。
  148. 一種容器，其包含兩個隔室，其中：第一隔室含有治療有效量之組織蛋白酶L，其中該量有效治療細胞外基質(ECM)之疾病或病狀；且第二隔室含有酸性緩衝液，其為活化該組織蛋白酶L之酸性緩衝液。
  149. 如申請專利範圍第148項之容器，其中該酸性緩衝液之pH值具有為或約為4.5至6之範圍。
  150. 如申請專利範圍第148項之容器，其中該酸性緩衝液之pH值為或約為4.5、5、5.5或6。
  151. 如申請專利範圍第148項之容器，其中該緩衝液含有選自2-(N-嗎啉基)乙烷磺酸(MES)、乙酸、檸檬酸、檸檬酸磷酸鹽及組胺酸之酸。
  152. 如申請專利範圍第151項之容器，其中該緩衝液之離子強度經選擇以使得該AMDE在投藥之後在預定時間內具活性。
  153. 如申請專利範圍第148項之容器，其中該組織蛋白酶L具有SEQ ID NO：1中所闡明之胺基酸序列，或為SEQ ID NO：1的對偶基因或物種變異體或其他變異體。
  154. 如申請專利範圍第148項之容器，其中該組織蛋白酶L經凍乾。
  155. 如申請專利範圍第148項之容器，其中該容器中之組織蛋白酶L係用於單劑量投藥，且含有為或約為10 μg至100 mg、50 μg至75 mg、100 μg至50 mg、250 μg至25 mg、500 μg至10 mg、1 mg至5 mg或2 mg至4 mg之量的 組織蛋白酶L。
  156. 如申請專利範圍第148項之容器，其中該容器中之總體積為或約為1-100 ml、1-50 ml、10-50 ml、10-30 ml、1-20 ml或1-10 ml。
  157. 如申請專利範圍第148項之容器，其中該ECM之疾病或病狀為選自脂肪團、杜普宜特朗氏病、帕榮雷氏病、萊德豪斯纖維化、關節僵硬、現有瘢痕、硬皮病、淋巴水腫及膠原性結腸炎之膠原蛋白介導之疾病或病狀。
  158. 如申請專利範圍第148項之容器，其中該ECM之疾病或病狀為脂肪團。
  159. 一種組合，其包含：如申請專利範圍第148項之容器；及一或多個其他容器，其含有選自生物製劑、小分子化合物、分散劑、麻醉劑及血管收縮劑之另一藥理學有效藥劑及其組合。
  160. 如申請專利範圍第159項之組合，其中該醫藥有效藥劑為分散劑，該分散劑為玻尿酸酶。
  161. 如申請專利範圍第160項之組合，其中該玻尿酸酶為PH20。
  162. 如申請專利範圍第160項之組合，其中該玻尿酸酶為可溶性的。
  163. 如申請專利範圍第162項之組合，其中該玻尿酸酶具有SEQ ID NO：226-231中所闡明之胺基酸序列，或為其對偶基因或物種變異體或其他變異體。
  164. 如申請專利範圍第160項之組合，其中該玻尿酸酶經糖基化。
  165. 如申請專利範圍第160項之組合，其中該容器中之玻尿酸酶係用於單劑量投藥，且含有為或約為10單位至500,000單位、100單位至100,000單位、500單位至50,000單位、1000單位至10,000單位、5000單位至7500單位、5000單位至50,000單位或1000單位至10,000單位之量的玻尿酸酶。
  166. 如申請專利範圍第159項之組合，其中該醫藥有效藥劑為麻醉劑，該麻醉劑為利多卡因，且該容器中之利多卡因係用於單劑量投藥，且含有為或約為10 mg至1000 mg、100 mg至500 mg、200 mg至400 mg、20 mg至60 mg或30 mg至50 mg之量的利多卡因。
  167. 如申請專利範圍第159項之組合，其中該醫藥有效藥劑為血管收縮劑，該血管收縮劑為α腎上腺素能受體促效劑。
  168. 如申請專利範圍第167項之組合，其中該α腎上腺素能受體促效劑係選自可巴君、腎上腺素及去甲腎上腺素。
  169. 如申請專利範圍第168項之組合，其中該α腎上腺素能受體促效劑為實現血管收縮之量的腎上腺素。
  170. 如申請專利範圍第169項之組合，其中該容器中之腎上腺素係用於單劑量投藥，且該腎上腺素之量為或約為10 μg至5 mg、50 μg至1 mg、50 μg至500μg、50 μg至250μg、100 μg至500μg、200 μg至400 μg、1 mg至5 mg 或2 mg至4 mg。
  171. 如申請專利範圍第159項之組合，其中該藥理學有效藥劑提供於分開的容器中。
  172. 如申請專利範圍第159項之組合，其中：該其他容器包含至少兩種藥理學有效藥劑；且該等藥劑以彼此分開之分開的組成物形式提供。
  173. 如申請專利範圍第159項之組合，其中該等藥理學有效藥劑以同一組成物被提供於同一容器中。
  174. 如申請專利範圍第159項之組合，其中該其他容器含有玻尿酸酶、利多卡因及腎上腺素。
  175. 如申請專利範圍第159項之組合，其中該其他容器為注射器。
  176. 如申請專利範圍第159項之組合，其中該其他容器中之總體積為或約為1-100 ml、1-50 ml、10-50 ml、10-30 ml、1-20 ml或1-10 ml。
  177. 一種套組，其包含如申請專利範圍第119項之容器、投藥裝置及視情況投藥說明書。
  178. 一種套組，其包含如申請專利範圍第159項之組合、投藥裝置及視情況投藥說明書。
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