KR102486046B1 - 근육질환, 비만 또는 당뇨병 치료, 또는 예방용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 M3 돌연변이 펩타이드 및 이를 유효성분으로 포함하는 근육질환, 비만 또는 당뇨병 완화, 억제, 예방, 또는 치료용 조성물, M3 돌연변이 펩타이드를 이용한 근육질환, 비만 또는 당뇨병 완화, 억제, 예방, 또는 치료 방법, 및 M3 돌연변이 펩타이드의 근육질환, 비만 또는 당뇨병의 완화, 억제, 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다.

Description

근육질환, 비만 또는 당뇨병 치료, 또는 예방용 조성물 {Compositions for treating or preventing muscle diseases, obesity or diabetes}

본 발명은 M3 돌연변이 펩타이드 및 이를 유효성분으로 포함하는 근육질환, 비만 또는 당뇨병 완화, 억제, 예방 또는 치료용 조성물, M3 돌연변이 펩타이드를 이용한 근육질환, 비만 또는 당뇨병 완화, 억제, 예방 또는 치료 방법, 및 M3 돌연변이 펩타이드의 근육질환, 비만 또는 당뇨병의 완화, 억제, 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다.

근육과 지방 조직으로의 체질량 분포는 개인의 건강에 중대한 영향을 미친다. 지방 세포와 근육 세포 분화의 균형에 많은 요인이 관여하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 코르티솔, 천연 호르몬 또는 다수의 합성 코르티솔 유사체 (예를 들어, 프레드니손, 하이드로 코르티손 및 덱사메타손 포함)와 같은 글루코 코르티코이드는 글루코 코르티코이드 수용체(GR)를 통해 몸에 작용한다. 글루코 코르티코이드는 생체 내 및 생체 외 둘 다에서 분화 결정을 조절하는 데 중요한 역할을 하며, 지방 생성을 촉진하고 근육 형성을 억제한다. 안드로겐 투여는 체성분에 영향을 주어 지방량을 줄이면서 근육량을 증가시키는 것으로 나타났다.

비만의 발달에서 지방 조직 질량의 증가는 지방 세포의 크기와 수의 증가로 인한 것일 수 있다. 세포 수의 증가는 다 분화능 줄기 세포 집단으로부터 또는 성숙한 백색 지방 조직 (WAT)에 상주하는 세포의 하위 집단으로부터 전 지방 세포를 동원한 결과 일 수 있다. 골수 중간엽 줄기 세포 (MSC)는 지방, 근육, 연골 및 뼈를 포함한 다양한 세포 유형으로 분화 될 수 있다. 노화와 함께, 골수 지방 생성은 생체 내에서 가속화되는 반면, MSC의 뼈 형성 능력은 감소한다. MSC 전구체는 상호 관계를 갖는 뼈가 아닌 지방으로 분화되어 연령 관련 체성분 변화에 기여할 수 있다고 제안되었다.

노인의 지방 재분배는 당뇨병, 고혈압, 이상 지질 혈증, 죽상 동맥 경화증 및 비교적 증가 된 복부 내 지방을 포함한 대사 증후군의 위험 증가와 관련이 있다. 또한, 근육 노화와 정상적인 노화와 관련된 성능의 저하가 있으며, 종종 근육 감소증이 점진적으로 시작된다. 골격근에는 자체 재생 능력이 있지만, 노인에서는 이 과정이 활성화되지 않는다 골격근 조직 및 숙주 환경 내에서 연령 관련 변화는 노령 동물의 손상에 대한 반응으로 근 모세포의 증식 및 융합에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.

근육 불충분 또는 기능 약화는 가장 치명적인 아동 건강 문제 중 하나이다. 이러한 근육 질환은 Duchenne Muscular Dystrophy (DMD)와 같은 다양한 선천성 근병증 및 근이영양증 환자에서 3000 명 중 1 명 이상에게 영향을 미친다. 이러한 장애는 일반적으로 유전적 또는 자발적 유전자 돌연변이와 관련이 있다. 이러한 장애를 가진 어린이는 광범위한 합병증으로 고통 받고 있다. 현재 효과적인 치료법의 부족으로 인한 높은 사망률은 새로운 치료 전략 개발이 필요한 실정이다.

성체 척추 동물의 근육 조직은 위성 세포 또는 근육 줄기 세포(MuSC)로 알려진 줄기 세포로부터 재생된다. 위성 세포는 근육 조직 전체에 분포되어 있으며, 상해 또는 질병이 없을 때 유사하게 정지되어 있으며, 해부학적으로 정의된 틈새에 위치한다. 위성 세포 이외에, 근육 재생에 기여할 수 있는 세포 유형은 간엽 모세포, 골수 유래 세포, 근육 간질 세포, 중간엽 줄기 세포를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

조직 공학은 세포, 생체 물질 스캐폴드, 생물학적 활성 분자 및 유전자의 조합을 이식함으로써 신체의 손상되거나 병에 걸린 조직을 복구하거나 대체하려고한다. 이 접근법의 기본 전제는 외인적으로 도입된 세포가 조직 복구 속도 및 범위를 개선 할 것이라는 것이다.

성인 MuSC는 손상되거나 결함이 있는 골격근에 이식되어 근육 섬유를 재구성하고 기능을 향상시켜 잠재적으로 MuSC에 대한 치료적 적용을 제공 할 수 있다. 그러나, 이 기술을 번역하는 데있어 주요 장애물은 차별화 결정이 어떻게 결정되는지에 대한 이해가 부족하고 치료상의 이점에 대한 이러한 결정을 제어하고 촉진하는 도구가 개발되지 않은 것이다. 이러한 영역을 발전 시키면 근육량이나 기능이 손상된 개인을 위한 다양한 새로운 치료법을 개척하거나 근육과 지방 조직 사이의 불균형을 해결할 수 있다.

인간의 신체활동 감소는 현대 사회의 산업화로 인한 생활습관 변화의 결과이며 이에 따른 신체적, 정신적 건강 측면의 부정적 영향에 대한 심각성이 제기 된지는 상당히 오래 전부터의 일이다. 신체활동 감소에 따른 운동부족은 비만과 대사증후군을 비롯한 각종 생활 습관병에 주요 원인이 되고, 그에 따른 근육량의 감소를 유발한다. 체내 근육량은 생존에 있어 그 역할이 매우 중요하며, 골격근 부피의 감소는 기초대사량의 감소, 근력의 감소 등으로 이어져 일상적인 신체활동을 유지하는데 상당한 어려움을 겪게 한다.

근위축(muscle atrophy)은 근부피가 감소하는 현상을 말하며, 이는 암이나 각종 면역 결핍성 질병을 겪는 환자들에 있어서 뚜렷하게 그 증상을 볼 수 있고, 장기간의 침상 생활로 인해 신체활동이 극히 제한된 환자나 움직임이 제한적인 신체장애인 그리고, 노인들에게 있어서는 더욱 두드러지게 나타난다. 노화의 진행은 지속적인 근부피의 감소로 인해 근력이 감소하는 근감소증(sarcopenia) 현상을 야기하고, 이는 노인들에 있어서 각종 생활 사고에 노출될 수 있는 위험한 결과를 초래한다.

나이가 들면서, 남녀 모두 체성분의 변화가 발생하게 되고, 이와같은 변화는 체중의 변화와는 무관하게 일어난다. 일반적으로 체성분의 변화는 체중증가에 따른 에너지 균형의 변화 때문으로 판단되며, 이때 나타나는 체성분의 변화는 체지방은 증가 하지만, 근육량은 감소하게 된다. 또한, 근육량의 감소는 약 30대부터 서서히 진행되며, 노인에게서 근감소(sarcopenia)는 기능장애, 삶의 질, 의료비용 등에 심각한 영향을 미친다.

근육량의 감소와 함께 지방량이 증가하는 것을 가리켜 근감소성 비만이라고 한다. 체지방의 증가와 근감소(muscle atrophy)가 상승적으로 작용하게 되면 체내 기능장애 및 대사 장애의 위험성이 더욱 상승할 것으로 추정된다.

임상에서의 접근 용이성으로 비만의 지표로 사용되는 체질량지수(BMI)와 허리둘레(WHR)는 연령이나 운동의 영향, 체중감소로 인한 신체구성 성분의 변화 등을 잘 반영하지 못한다는 제한점이 있다. 특히, 신체구성 중에서 근육량은 대사증후군과 관련이 있는 것으로 보고되고 있으며, 모든 사망률의 원인을 예측하는 인자로 제시되고 있다. 최근에는 건강과 관련해서 인슐린 저항성, 당대사, 지질농도 및 혈압에 보다 관련 있는 요인으로 체지방률 증가와 근손실에 관심을 가질 필요성이 대두되고 있다.

이에, 본 발명자들은 근육감소와 관련된 근육질환의 완화, 억제, 예방 또는 치료제를 개발하기 위해, 근육감소에 효력을 보일 가능성이 있는 펩타이드들을 대상으로 스크리닝하였으며, 이중 M3 돌연변이 펩타이드의 유의성 있는 근육감소 억제 활성을 발견하였고, 또한, 활성이 있는 단백질을 분리하고 특정하였으며, 상기 돌연변이 펩타이드가 현재 사용되는 근육감소와 관련된 근육질환의 치료제보다 활성이 월등히 우수한 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 M3 돌연변이 펩타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 M3 돌연변이 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 근육질환 완화, 억제, 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 M3 돌연변이 펩타이드를 근육질환 완화, 억제, 예방 또는 치료 유효량으로 이를 필요로 하는 대상에 투여하여 근육감소 완화, 억제, 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 근육질환 완화, 억제, 예방 또는 치료에 사용되는 M3 돌연변이 펩타이드의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 M3 돌연변이 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 비만 완화, 억제, 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 M3 돌연변이 펩타이드를 비만 완화, 억제, 예방 또는 치료 유효량으로 이를 필요로 하는 대상에 투여하여 비만 완화, 억제, 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 비만 완화, 억제, 예방 또는 치료에 사용되는 M3 돌연변이 펩타이드의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 M3 돌연변이 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 완화, 억제, 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 M3 돌연변이 펩타이드를 당뇨병 완화, 억제, 예방 또는 치료 유효량으로 이를 필요로 하는 대상에 투여하여 당뇨병 완화, 억제, 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 당뇨병 완화, 억제, 예방 또는 치료에 사용되는 M3 돌연변이 펩타이드의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명은 M3 돌연변이 펩타이드 및 이를 유효성분으로 포함하는 근육질환, 비만 또는 당뇨병 완화, 억제, 예방, 또는 치료용 조성물, 및 M3 돌연변이 펩타이드를 이용한 근육질환, 비만 또는 당뇨병 완화, 억제, 예방, 또는 치료 방법에 관한 것이다.

이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명의 일 양태는 M3 돌연변이 펩타이드에 관한 것이다.

본 발명에 있어서 M3 돌연변이 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 일부가 결실된 것일 수 있다.

본 발명의 구체적일 일 양태에 있어서, 본 발명의 M3 돌연변이 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 223 내지 261번 위치의 아미노산으로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 아미노산의 결실을 포함하는 펩타이드인 것일 수 있다.

본 발명의 구체적일 일 양태에 있어서, 본 발명의 M3 돌연변이 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 249번 위치의 아르기닌(Arginine), 250번 위치의 라이신(Lysine), 251번 위치의 라이신 및 252번 위치의 아르기닌으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 위치의 결실을 포함하는 펩타이드인 것일 수 있으며, 예를 들어, 249 내지 251번 위치의 결실을 포함하는 펩타이드인 것일 수 있다.

본 발명의 구체적일 일 양태에 있어서, 본 발명의 M3 돌연변이 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 249번 위치의 아르기닌(Arginine), 250번 위치의 라이신(Lysine), 251번 위치의 라이신 및 252번 위치의 아르기닌으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 위치의 결실, 및 223 내지 248번 및 253 내지 261번 위치의 아미노산으로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 아미노산의 결실을 포함하는 펩타이드인 것일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 249번 위치의 아르기닌(Arginine), 250번 위치의 라이신(Lysine), 251번 위치의 라이신 및 252번 위치의 아르기닌으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 위치의 결실 및 223 내지 248번 위치의 아미노산으로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 아미노산의 결실을 포함하는 펩타이드인 것일 수 있다.

본 발명에 있어서 223 내지 248번 위치의 아미노산으로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 아미노산의 결실은 223번, 223 내지 224번, 223 내지 225번, 223 내지 226번, 223 내지 227번, 223 내지 228번, 223 내지 229번, 223 내지 230번, 223 내지 231번, 223 내지 232번, 223 내지 233번, 223 내지 234번, 223 내지 235번, 223 내지 236번, 223 내지 237번, 223 내지 238번, 223 내지 239번, 223 내지 240번, 223 내지 241번, 223 내지 242번, 223 내지 243번, 223 내지 244번, 223 내지 245번, 223 내지 246번, 223 내지 247번 또는 223 내지 248번 위치의 아미노산 결실인 것일 수 있다.

본 발명에 있어서 253 내지 261번 위치의 아미노산으로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 아미노산의 결실은 253번, 253번 내지 254번, 253번 내지 255번, 253번 내지 256번, 253번 내지 257번, 253번 내지 258번, 253번 내지 259번, 253번 내지 260번 또는 253번 내지 261번 위치의 아미노산 결실인 것일 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 양태에 있어서, 본 발명의 M3 돌연변이 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 413번 위치의 아스파르트산(Aspartic acid)부터 967번 위치의 세린(Serine)까지의 결실을 추가적으로 포함하는 펩타이드인 것일 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 양태에 있어서, 본 발명의 M3 돌연변이 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 223 내지 251번 위치의 결실 및 413 내지 967번 위치의 결실을 포함하는 펩타이드인 것일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드인 것일 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태는 M3 돌연변이 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 근육질환 완화, 억제 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서 M3 돌연변이 펩타이드는 기 설명한 바와 동일하다.

본 발명에 있어서 근육질환은 근감소증(Sarcopenia), 근위축증(Amyotrophy), 암악액질(Cancer cachexia), 근손상, 근육퇴행위축증, 심위축증, 긴장감퇴증(atony), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육 퇴화증 및 근무력증으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 근육감소와 관련된 근육질환을 모두 포함하는 것이다.

근감소증(sarcopenia)라는 이름은 1989년에 로젠 보그에 의해 최초로 명명되었으며, 근감소증의 어원은 그리스에서 기원한 근육을 뜻하는 "sarco"와 감소되어 있다는 뜻의 "penia"가 합성된 단어이다. 2017년 초 세계보건기구(WHO)는 근감소증에 질병분류 코드를 부여하여, 정상보다 근육량이 적은 것을 정식 질환으로 인정하였다. 주로 사지에 분포한 골격근의 감소(loss of skeletal musclemass)를 의미하며, 노화와 연관되어 나타나는 점진적인 골격근 감소의 결과이다.

근위축증(amyotrophy)은 근육의 중량이 감소하는 것으로 정의된다. 환자가 병원에 입원했을 때와 같이 안정을 취하는 것이나, 움직임이 제한되는 경우 흔히 나타난다. 즉, 활동적이지 않거나, 암, AIDS, 울혈성 심부전, 만성페쇄성폐질환, 신부전, 극심한 화상 등과 같은 질환을 동시에 2개 이상 앓는 상태인 악액질(cachexia)에서 흔히 근위축증이 발생한다. 이는 넘어짐과 낙상의 위험을 증가시키고, 에너지 소비를 감소시켜 그 결과로 비만과 대사질환의 위험도를 증가시키는 것과 연관 있다고 알려져 있다. 근위축증의 원인 중 대사질환인 암과 같은 심각한 질환들의 결과가 근위축증의 원인이 되기도 하는데, 이는 염증성 사이토카인의 증가와 염증 신호경로의 활성화로 인해 유도되는 것으로 증명되었다. 비만한 환경에서도 이와 유사하게 산화스트레스를 유도하는 활성산소증(reactive oxygen species)의 생성이 증가하고, 근육조직 내 지방산의 유입 증가 및 지방산 산화의 감소 등 대사적 변화가 발생하며, 미토콘드리아 생합성, 구조 및 기능에 장애가 발생한다. 이러한 근육 내 산화스트레스, 지방산의 유입 또한 염증을 유발하여 근위축증을 유발할 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태는 M3 돌연변이 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물을 대상(subject)에 투여하는 단계를 포함하는 근육질환 완화, 억제 또는 치료 방법에 관한 것이다.

본 발명의 다른 일 양태는 M3 돌연변이 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 비만 완화, 억제, 예방, 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서 M3 돌연변이 펩타이드는 기 설명한 바와 동일하다.

본 발명의 다른 일 양태는 M3 돌연변이 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물을 대상(subject)에 투여하는 단계를 포함하는 비만 완화, 억제 또는 치료 방법 에 관한 것이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "비만"은 건강에 이상을 초래할 정도로 지방 조직이 체내에 과잉으로 축적된 상태를 의미한다.

본 발명의 다른 일 양태는 M3 돌연변이 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 완화, 억제, 예방, 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서 M3 돌연변이 펩타이드는 기 설명한 바와 동일하다.

본 명세서에서 사용되는 용어 '당뇨'는 포도당-비관용(intolerance)을 초래하는 인슐린의 상대적 또는 절대적 부족으로 특징되는 만성질환을 의미한다. 본 발명의 용어 당뇨는 모든 종류의 당뇨병을 포함하며, 예를 들어, 제1형 당뇨, 제2형 당뇨 및 유전성 당뇨를 포함한다. 제1형 당뇨는 인슐린 의존성 당뇨병으로서, β-세포의 파괴에 의해 주로 초래된다. 제2형 당뇨는 인슐린 비의존성 당뇨병으로서, 식사 후 불충분한 인슐린 분비에 의해 초래되거나 또는 인슐린 내성에 의해 초래된다.

본 발명의 다른 일 양태는 M3 돌연변이 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물을 대상(subject)에 투여하는 단계를 포함하는 당뇨병 완화, 억제 또는 치료 방법 에 관한 것이다.

본 명세서에서 용어 '유효성분으로 포함하는'이란 본 발명의 M3 돌연변이 펩타이드의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다.

본 발명에 따른 조성물 내의 유효성분으로서의 펩타이드의 함량은 사용 형태 및 목적, 환자 상태, 증상의 종류 및 경중 등에 의하여 적절하게 조절할 수 있으며, 고형분 중량 기준으로 0.001 내지 99.9 중량%, 0.1 내지 99.9 중량%, 1 내지 90.9 중량%, 0.001 내지 99 중량%, 0.1 내지 99 중량%, 1 내지 99 중량%, 0.001 내지 90 중량%, 0.1 내지 90 중량%, 1 내지 90 중량%, 0.001 내지 80 중량%, 0.1 내지 80 중량%, 1 내지 80 중량%, 0.001 내지 70 중량% 또는 0.1 내지 70 중량%, 예를 들어, 1 내지 70 중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 인간을 포함하는 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여 방식은 통상적으로 사용되는 모든 방식일 수 있으며, 예를 들어, 경구, 피부, 정맥, 근육, 피하 등의 경로로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 정맥으로 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 연고제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 또는 경피제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태의 비경구 제형 등으로 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기 혼합 추출물 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 및 희석제 등의 보조제를 추가로 함유하는 것일 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 덱스트린, 결정셀룰로오스, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.

경구를 위한 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 연고제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제, 경피제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

좌제의 제제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물을 인간에게 적용하는 구체예에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물은 단독으로 투여될 수 있으나, 일반적으로 투여방식과 표준 약제학적 관행(standard phamaceutical practice)을 고려하여 선택된 약제학적 담체와 혼합되어 투여될 수 있다.

예를 들면, 본 발명의 약제학적 조성물은 전분 또는 락토오즈를 함유하는 정제 형태로, 또는 단독 또는 부형제를 함유하는 캡슐 형태로, 또는 맛을 내거나 색을 띄게 하는 화학 약품을 함유하는 엘릭시르 또는 현탁제 형태로 경구, 구강 내 또는 혀 밑 투여될 수 있다.

이러한 액체 제제는 현탁제(예를 들어, 메틸셀룰로오즈, 위텝솔(witepsol)과 같은 반합성 글리세라이드 또는 행인유(apricot kernel oil)와 PEG-6 에스테르의 혼합물 또는 PEG-8과 카프릴릭/카프릭 글리세라이드의 혼합물과 같은 글리세라이드 혼합물)와 같은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제와 함께 제형화 될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 투여 용량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간간격으로 분할 투여할 수도 있다.

예를 들어, 유효성분 함량을 기준으로 1일 투여량이 0.1 내지 1000 ㎎/kg, 0.1 내지 900 ㎎/kg, 0.1 내지 800 ㎎/kg, 0.1 내지 700 ㎎/kg, 0.1 내지 600 ㎎/kg, 예를 들어, 0.5 내지 500 ㎎/kg일 수 있다. 상기한 투여량은 평균적인 경우를 예시한 것으로서 개인적인 차이에 따라 그 투여량이 높거나 낮을 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량이 상기 투여 용량 미만이면 유의성 있는 효과를 얻을 수 없으며, 그 이상을 초과하는 경우 비경제적일 뿐만 아니라 상용량의 범위를 벗어나므로 바람직하지 않은 부작용이 나타날 우려가 발생할 수 있으므로, 상기 범위로 하는 것이 좋다.

본 발명은 M3 돌연변이 펩타이드 및 이를 유효성분으로 포함하는 근육질환, 비만 또는 당뇨병 완화, 억제, 예방, 또는 치료용 조성물, M3 돌연변이 펩타이드를 이용한 근육질환, 비만 또는 당뇨병 완화, 억제, 예방, 또는 치료 방법, 및 M3 돌연변이 펩타이드의 근육질환, 비만 또는 당뇨병의 완화, 억제, 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다.

도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따라 웨스턴블랏을 통해 돌연변이 펩타이드의 발현을 확인한 결과를 보여주는 사진이다.
도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른 돌연변이 펩타이드의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 재너염색법을 통해 대조군의 분화 유도된 마이오튜브의 길이를 확인한 결과를 보여주는 사진이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 재너염색법을 통해 야생형의 분화 유도된 마이오튜브의 길이를 확인한 결과를 보여주는 사진이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 재너염색법을 통해 M3 돌연변이의 분화 유도된 마이오튜브의 길이를 확인한 결과를 보여주는 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 재너염색법을 통해 분화 유도된 마이오튜브의 길이를 확인한 결과 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 면역형광염색법을 통해 대조군의 분화 유도된 마이오튜브의 길이를 확인한 결과를 보여주는 사진이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 면역형광염색법을 통해 야생형의 분화 유도된 마이오튜브의 길이를 확인한 결과를 보여주는 사진이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 면역형광염색법을 통해 M3 돌연변이의 분화 유도된 마이오튜브의 길이를 확인한 결과를 보여주는 사진이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 면역형광염색법을 통해 M4 돌연변이의 분화 유도된 마이오튜브의 길이를 확인한 결과를 보여주는 사진이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 면역형광염색법을 통해 M5 돌연변이의 분화 유도된 마이오튜브의 길이를 확인한 결과를 보여주는 사진이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라 면역형광염색법을 통해 M6 돌연변이의 분화 유도된 마이오튜브의 길이를 확인한 결과를 보여주는 사진이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따라 면역형광염색법을 통해 분화 유도된 마이오튜브의 길이를 확인한 결과 그래프이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따라 지방유래 중간엽 줄기세포의 지방세포로의 분화 결과를 보여주는 그림이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따라 지방생성 정도를 확인한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따라 세포 내 글루코오스의 업테이크 측정 결과를 보여주는 그래프이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따라 근감소 동물 모델에서의 체중 변화를 보여주는 그래프이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따라 근감소 동물 모델에서의 GA 근육 및 TA 근육 조직의 무게 변화를 보여주는 그래프이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따라 근감소 동물 모델에서의 지방 및 근육의 무게 변화를 보여주는 그래프이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따라 근육 분화 연관 유전자인 MyoD, MyoG, Pax7, 및 MRF4의 유전자 발현량을 확인한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에 따라 근육 분화 억제 연관 유전자인 MuRF1, Atrogin1, Hes1 유전자의 발현량을 확인한 결과를 그래프이다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에 따라 제너 염색을 통해 분화 유도된 마이오튜브의 길이를 확인한 결과 그래프이다.
도 22는 본 발명의 일 실시예에 따라 근육 세포의 활성 정도를 확인한 결과 그래프이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: C2C12 세포주의 배양 및 분화 유도

근세포 분화 연구에 주로 사용되고 있는 근원세포주 C2C12 세포주(ATCC, CRL-1772)를 10% 우태아혈청 (FBS; Fetal bovine serum), 페니실린 100U/ml 및 스트렙토마이신 100 ug/ml이 첨가된 DMEM을 배양용 배지로 사용하여 5% CO₂가 공급되는 37℃ 세포 배양기에서 배양하였다.

C2C12 세포주는 24웰 세포 배양 플레이트에 5 X 10⁴ 개/well 로 접종하여 배양용 배지에서 배양하였다. 세포 배양 플레이트에 세포가 90% 수준의 밀도에 도달하였을 때, 분화용 배지인 2% 말혈청이 포함된 DMEM 배지로 교체하여 분화를 유도하였다. 분화용 배지는 3일 간격으로 새로 교체해 주었고 총 8일간 5% CO₂가 공급되는 37℃ 세포 배양기에서 분화를 유도하였다.

CHO-K1 세포주에서 생산한 ADAMTS1과 돌연변이 ADAMTS1 재조합 단백질은 하기 실시예 2의 방법으로 분리, 정제 과정을 거쳐 C2C12 세포주의 분화 유도시작과 함께 처리하였고 분화 유도가 종료되는 시점까지 0.01, 0.1, 1, 10, 100ng/ml의 농도로 매일 1회씩 처리하였다.

실시예 2: 재조합 단백질의 생산

세포에서 생산한 재조합 단백질의 분리, 정제를 위해 재조합 단백질의 C-말단에 6x His가 달리도록 ADAMTS1 과발현 벡터를 제작하였다. 구체적으로, pEF6/V5-His A 벡터(Invitrogen, V96120)를 KpnI과 XhoI 제한효소를 이용하여 절단하였다. 여기에 ADAMTS1 서열(NM_006988.5)중 CDS부분의 5'말단에 KpnI으로 인식되는 서열을 삽입하고 3'말단에 XhoI으로 인식되는 서열을 삽입한 뒤, 앞서 절단한 벡터에 T4 DNA 라이게이즈를 이용하여 접착시켜 제작하였다. M1, M2, M3, M4, M5, M6 돌연변이 ADAMTS1은 야생형 ADAMTS1을 주형으로 하고 664번 뉴클레오타이드를 기점으로 하여 각각 M1은 693번, M2는 723번, M3는 753번, M4는 783번, M5는 813번, M6는 843번 뉴클레오타이드까지 절단하였고 추가로 모든 돌연변이는 1237번 뉴클레오타이드 이후 서열을 모두 제거하여 제작하였다.

CHO-K1 세포주는 10% 우태아혈청 (FBS; Fetal bovine serum), 페니실린 100U/ml, 스트렙토마이신 100ug/ml 및 25mM 헤페스가 첨가된 RPMI1640 배지를 배양배지로 하여 6웰 세포 배양 플레이트에 접종하고, 5% CO₂가 공급되는 37℃ 세포 배양기에서 배양하였다. 다음날 Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668019)과 제작한 ADAMTS1 또는 ADAMTS1 돌연변이 발현 벡터를 섞어 CHO-K1세포에 처리하는 방식으로 벡터를 세포 내 도입시켰다. 24시간 동안 배양한 뒤 세포를 10배 희석하여 100mm 세포배양 디쉬로 옮겨준 다음 블라스티시딘에스를 10ug/ml의 농도가 되도록 1차 처리하였다. 이후 4일 간격으로 총 3회에 걸쳐 새로운 배양배지에 블라스티시딘에스를 10ug/ml의 농도가 되도록 섞어 교체해주었다. 블라스티시딘에스에 의해 독립된 콜로니가 형성된 후, 각 콜로니를 새로운 세포 배양용 플레이트에 접종하여 배양하였다. 각 콜로니를 웨스턴블랏을 통해 ADAMTS1 또는 ADAMTS1 돌연변이 단백질을 발현하는지 확인한 뒤 안정화 세포주로 사용하였다. CHO-K1 안정화 세포주를 100mm 디쉬에 접종한 다음 세포의 밀도가 100% 수준에 도달하면 RPMI1640 배지로 교환하여 2일간 배양하였다. 2일 뒤 배양하던 디쉬에서 상부 배양액 부분만을 취하여 Ni-NTA 아가로오스 (Qiagen, 30210)로 정제하여 회수한 뒤, C2C12 세포주의 분화 유도 실험에 사용하였다. 구체적으로는, 세포 배양액을 Ni-NTA 아가로오스를 장착한 중력 크로마토그래피 컬럼(Qiagen, 34964)에 통과시킨 뒤 10mM 이미다졸 버퍼로 세척하였다. 3회 세척을 반복한 다음 250mM 이미다졸 버퍼로 용출하여 단백질을 정제하였다.

실시예 3: 재조합 단백질 발현 확인

실시예 2의 방법으로 제작한 ADAMTS1 돌연변이 과발현 CHO-K1 안정화 세포주의 배양액을 취하여 6x-His를 인지하는 항체를 사용한 웨스턴블랏을 통해 생성된 재조합 단백질의 발현을 확인하여, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에서 확인할 수 있듯이, M1, M2 돌연변이는 전구영역(Prodomain)이 포함된 부분과 성숙영역(Mature domain)만 발현된 두 가지 형태의 단백질이 모두 발현되는 양상을 보이지만 M3, M4, M5, M6 돌연변이의 경우 전구영역이 포함된 단백질만이 발현되는 것을 확인하였다. 한편 전구영역이 포함된 단백질만을 발현하는 돌연변이 중에서 M3 돌연변이를 제외한 나머지는 발현이 감소해 있는 것을 확인하였다.

실시예 4: 제너염색법 (Jenner's staining)

24웰 세포 배양 플레이트에서 C2C12 세포주를 8일간 분화 유도하면서 ADAMTS1 또는 ADAMTS1 돌연변이 재조합 단백질을 처리하였다. 분화가 유도된 세포는 메탄올로 10분간 고정하였다. PBS로 3차례 충분히 세척해 준 뒤 2.5mg/ml 농도로 메탄올에 용해되어 있는 제너 염색시약을 증류수와 1:1로 섞어 10분간 염색하였다. 염색이 끝난 플레이트는 증류수로 세척을 해 준 뒤 건조시켜 현미경으로 관찰하여, 그 결과를 도 2 내지 도 5 및 표 1에 나타내었다.

	ng/ml	평균 (um)	SD
Ctrl	-	840.5593	122.843
WT	0.01	1187.7	209.7841
	0.1	1279.783	270.5997
	1	1110.381	122.6237
	10	1361.083	238.143
	100	1276.93	279.3668
M3 돌연변이	0.01	1698.274	133.7239
	0.1	1618.237	230.9828
	0	1545.182	174.167
	10	1669.126	169.7136
	100	1718.463	94.99775

도 2 내지 도 5 및 표 1에서 확인할 수 있듯이, C2C12세포주를 분화 유도할 때 ADAMTS1을 함께 처리하면 마이오튜브의 길이가 길어지는 것을 확인하였고 특히 M3 돌연변이를 처리한 경우 야생형을 처리하여 분화 유도한 세포주보다 마이오튜브의 길이가 길어지는 것을 확인하였다.

실시예 5: 면역형광염색법 (Immunofluorescence staining)

24웰 세포 배양 플레이트에서 C2C12 세포주를 8일간 분화 유도하면서 ADAMTS1 또는 ADAMTS1 돌연변이 재조합 단백질을 처리하였다. 분화가 유도된 세포는 4% 파라포름알데히드로 10분간 고정한 후, 0.25% Triton X-100을 이용하여 10분간 세포막 투과화를 진행하였다.

그 다음, 2% BSA로 30분간 블로킹을 해준 뒤 마이오신 중사슬(MHC) 항체를 1:500으로 2% BSA 버퍼에 섞어 1시간 동안 처리하였다. 그 다음, Alexa Fluor® 555 형광항체를 1:200으로 2% BSA 버퍼에 섞어 1시간 동안 처리하였고 DAPI 염색법을 통해 핵을 염색하였다.

염색 과정이 끝난 플레이트는 형광현미경(Nikon Ts2-FL)을 이용하여 사진을 촬영하였고 마이오튜브의 길이는 제조사에서 제공한 분석 프로그램 (Nikon, NIS Elements)을 이용하여 측정하고 통계처리 하였다. 분석이 종료된 플레이트는 차광하여 냉장보관 하였다. 결과는 도 6 내지 도 12 및 표 2에 나타내었다.

-	ng/ml	평균 (um)	Sd
Ctrl	-	833.5567	58.78009
WT	0.01	1237.543	64.14704
	1	1286.943	59.92032
	100	1304.363	76.3394
M3 돌연변이	0.01	1739.657	122.5517
	1	1759.083	120.1073
	100	1809.76	141.1934
M4 돌연변이	0.01	1444.973	70.61137
	1	1573.837	27.24489
	100	1550.97	46.41372
M5 돌연변이	0.01	1365.46	48.78922
	1	1483.112	130.69
	100	1483.837	82.66543
M6 돌연변이	0.01	1455.1	52.42397
	1	1531.107	72.92847
	100	1418.417	88.17606

도 6 내지 12 및 표 2에서 확인할 수 있듯이, 분화배지를 처리하여 분화를 유도한 C2C12세포주 대비 ADAMTS1 야생형이나 돌연변이를 처리하면서 분화를 유도한 C2C12 세포주가 더욱 두께와 길이가 긴 마이오튜브로 분화됨을 확인하였다.

또한, 마이오튜브의 길이는 야생형에 비해 ADAMTS1 돌연변이를 처리한 세포주에서 더욱 길어지는 것을 확인하였고 특히 M3 돌연변이에서 가장 길이가 긴 마이오튜브로 분화가 유도되는 것을 확인하였다.

실시예 6: 지방생성 정도 확인

지방유래 중간엽 줄기세포주(ATCC, PCS-500-011)는 ATCC에서 판매하는 2%의 우태아혈청, 5ng/ml의 재조합 인간 상피세포인자 및 5ng/ml의 재조합 인간 섬유아세포 성장인자가 포함된 중간엽 줄기세포주 전용 배지(ATCC, PCS-500-030)에서 배양하였다. 세포의 분화 시에는 StemPro 배지(Gibco, A10410-01)와 제조사가 제공하는 첨가물(Gibco, A10065-01)을 혼합한 배지로 갈아주었고 3일 간격으로 새로운 StemPro배지로 갈아주면서 총 14일간 지방세포로의 분화를 유도하였다. 분화를 유도하면서 ADAMTS1 야생형 또는 M3 돌연변이 재조합 단백질은 1ng/ml 또는 100ng/ml의 농도로 매일 1회씩 처리하였다.

분화 유도된 지방유래 중간엽 줄기세포의 지방생성 정도를 확인하기 위하여 오일 레드 오 염색 방법을 이용하였다. 구체적으로, 분화가 완료된 세포를 10% 포르말린으로 고정하고, 오일 레드 오 염색 용액을 처리하여 염색하였다. 염색이 완료된 세포는 현미경으로 관찰한 후 100% 이소프로판올을 이용하여 침착된 염료를 추출하였다. 추출한 염료는 520nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 정량하여, 그 결과를 도 13 및 도 14 및 표 3에 나타내었다.

Diff. -	Diff. +	WT 1	WT 100	M3 1	M3 100
0.120542	1	0.720773	0.731024	0.659033	0.67393
0.039364	0	0.032979	0.059734	0.086981	0.03776

도 13 및 도 14 및 표 3에서 확인할 수 있듯이, ADAMTS1의 야생형과 M3 돌연변이 모두 지방유래 중간엽 줄기세포의 지방세포로의 분화를 억제함을 확인하였다.

실시예 7: 세포 내 글루코오스의 업테이크 측정

형광 글루코오스 유사체인 2-NBDG (2-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino- 2-deoxygluocose)를 이용하여 근육 분화 증가 활성에 따라 변화하는 세포 내 글루코오스 업테이크를 측정하였다. C2C12 세포주를 8일간 분화 유도하면서 ADAMTS1 또는 M3 돌연변이 재조합 단백질을 각각 100ng/ml의 농도로 매일 1회씩 처리하였다. 분화가 유도된 세포는 글루코오스가 없는 DMEM 배지로 2시간동안 처리하였고, 이후 100nM의 인슐린을 15분간 처리한 뒤 2-NBDG를 최종 100μg/ml의 농도가 되도록 첨가하였다. 글루코오스 업테이크는 익사이테이션(excitation) 485nm, 에미션(emission) 535nm에서 측정하여, 그 결과를 도 15 및 표 4에 나타내었다.

-	Ins-			Ins+
-	-	WT	M3	-	WT	M3
#1	1	1.297038	1.531155	1.246397	1.897571	2.269298
#2	0.843478	1.31864	1.53383	1.508469	1.81309	2.228877
#3	0.687519	1.33964	1.507814	1.60218	1.956826	2.177554
#4	0.851029	0.92594	1.538645	1.544263	1.895672	2.009495
Mean	0.845506	1.220315	1.527861	1.475328	1.89079	2.171306
SD	0.127623	0.197019	0.013719	0.157428	0.05907	0.11422

도 15 및 표 4에서 확인할 수 있듯이, 분화 유도된 C2C12 세포주의 글루코오스 업테이크 정도는 인슐린 처리 하에서 증가하는데 특히 M3 돌연변이 ADAMTS1을 처리하여 근육세포 분화를 유도한 C2C12세포주가 야생형을 처리하여 분화 유도한 세포주에 비해 글루코오스 업테이크가 더욱 증가함을 확인하였다.

실시예 8: 근감소 동물 모델에서의 체중 회복 관찰

12주령의 C57BL/6 마우스에 12일간 매일 덱사메타손을 50mg/kg의 농도로 복강주사를 통해 투여하였다. 동시에 M3 돌연변이 ADAMTS1을 각 0.02μg/μl(Low), 0.2μg/μl(Mid), 2μg/μl(High)의 농도로 100μl씩 복강주사를 통해 투여하였다. 총 12일간 투여하며 동물 모델에서 체중 회복 정도를 관찰하였다.

도 16에서 확인할 수 있듯이, 덱사메타손 투여로 근감소를 유도한 동물 모델의 경우, 정상 대조군에 비해 뚜렷한 체중 감소가 확인되었고, 동물 모델에 M3 돌연변이 ADAMTS1을 처리한 경우, Low, Mid 및 High 용량 군에서 모두 유의하게 체중이 회복되는 것을 확인하였다. 특히 High 용량 군의 경우에는 정상 수준을 상회하는 정도로 체중이 회복되는 것이 관찰되었다.

실시예 9: 근감소 동물 모델에서의 TA, GA 근육 조직 무게 회복 관찰

12주령의 C57BL/6 마우스에 12일간 덱사메타손을 투여한 근감소 동물모델에서 근육조직의 무게 변화를 확인하기 위하여 투여 종료 후 부검을 진행하여 TA와 GA 근육조직을 적출하였다. 적출한 근육 조직은 무게를 측정하여 비교하였다.

도 17에서 확인할 수 있듯이, 덱사메타손 투여로 근감소를 유도한 동물 모델의 경우, TA 근육 및 GA 근육 모두에서 정상 대조군에 비해 뚜렷한 조직 무게 감소가 확인되었고, 근 감소 유도 동물 모델에 M3 돌연변이 ADAMTS1을 처리한 경우, Mid 용량 군에서 유의하게 TA 근육 조직의 무게가 회복되는 것을 확인하였으며, High 용량 군에서 유의하게 TA 근육 및 GA 근육 조직의 무게가 회복되는 것을 확인하였다.

실시예 10: 근감소 동물 모델에서의 지방과 근육의 회복 관찰

12주령의 C57BL/6 마우스에 12일간 매일 덱사메타손을 50mg/kg의 농도로 복강주사를 통해 투여하였고 동시에 M3 돌연변이 ADAMTS1을 2μg/μl의 농도로 100μl씩 복강주사를 통해 투여하였다. 투여 종료 후 흡입마취를 통해 마우스를 마취시킨 다음 이중 에너지 X선 흡수 (DXA; Dual-energy X-ray Absorptiometry) 장치를 이용한 근육량 및 체지방량 분석을 시행하였다.

도 18에서 확인할 수 있듯이, 덱사메타손 투여로 근감소를 유도한 동물 모델의 경우, 지방과 근육이 모두 크게 감소되었다. 근 감소 유도 동물 모델에 M3 돌연변이 ADAMTS1을 처리한 경우, 지방과 근육이 모두 정상 수준으로 회복되는 것을 확인하였다.

실시예 11: 근감소 동물 모델에서의 근육 분화 연관 유전자 발현 증가 확인

12주령의 C57BL/6 마우스에 12일간 매일 덱사메타손을 50mg/kg의 농도로 복강주사를 통해 투여하였고 동시에 M3 돌연변이 ADAMTS1을 각 0.02μg/μl(Low), 0.2μg/μl(Mid), 2μg/μl(High)의 농도로 100μl씩 복강주사를 통해 투여하였다. 덱사메타손과 M3 돌연변이 ADAMTS1의 투여가 종료된 후 부검하여 GA 근육조직을 적출하였다. GA 근육조직은 동결상태로 페슬을 이용하여 균질화 과정을 거친 뒤 RNA를 추출하였다 (Qiagen, 74104). 추출한 RNA는 cDNA 합성 시약 (Promega, A5000)을 이용하여 cDNA로 제작하였다. 합성된 cDNA는 실시간 중합효소 연쇄반응 장비(Applied Biosystems, Quantstudio3)를 이용하여 근육의 분화와 연관된 유전자인 MyoD, MyoG, Pax7, MRF4의 상대적인 mRNA 발현양을 비교하였다.

도 19에서 확인할 수 있듯이, 덱사메타손 처리에 의한 근 감소 유도 동물 모델에 대해 M3 돌연변이 ADAMTS1을 처리한 경우, Low 용량군 및 High 용량군 모두에서 정상 대조군 및 덱사메타손 처리군에 비해 유의하게 MyoD 유전자 발현이 증가되는 것을 확인하였다.

또한 정상 대조군에 비해 덱사메타손 처리군의 경우, MyoG, Pax7, MRF4 유전자의 발현량이 모두 감소되었으나, 이에 M3 돌연변이 ADAMTS1을 처리한 경우, MyoG, Pax7, MRF4 유전자의 발현량이 모두 유의하게 증가된 것을 확인하였다. 이는 M3 돌연변이 ADAMTS1이 근육 분화 연관 유전자의 발현을 증가시킴으로써, 근육 분화를 증가시킨다는 것을 보여준다.

실시예 12: 근감소 동물 모델에서의 근육 분화 억제 연관 유전자 발현 감소 확인

12주령의 C57BL/6 마우스에 12일간 매일 덱사메타손을 50mg/kg의 농도로 복강주사를 통해 투여하였고 동시에 M3 돌연변이 ADAMTS1을 각 0.02μg/μl(Low), 0.2μg/μl(Mid), 2μg/μl(High)의 농도로 100μl씩 복강주사를 통해 투여하였다. 덱사메타손과 M3 돌연변이 ADAMTS1의 투여가 종료된 후 부검하여 GA 근육조직을 적출하였다. GA 근육조직은 동결상태로 페슬을 이용하여 균질화 과정을 거친 뒤 RNA를 추출하였다 (Qiagen, 74104). 추출한 RNA는 cDNA 합성 시약 (Promega, A5000)을 이용하여 cDNA로 제작하였다. 합성된 cDNA는 실시간 중합효소 연쇄반응 장비(Applied Biosystems, Quantstudio3)를 이용하여 근육 분화 억제 연관 유전자인 MuRF1, Atrogin1, Hes1의 상대적인 mRNA 발현양을 비교하였다.

도 20에서 확인할 수 있듯이, 덱사메타손 처리에 의한 근 감소 유도 동물 모델에 대해 M3 돌연변이 ADAMTS1을 처리한 경우, Low 용량군 및 High 용량군 모두에서 MuRF1, Atrogin1, Hes1 유전자의 발현이 유의하게 감소된 것을 확인하였다. 이는 M3 돌연변이 ADAMTS1이 근육 분화 억제 연관 유전자를 억제함으로써, 근육 분화를 증가시킬 수 있음을 보여준다.

실시예 13: 항암제에 의한 근육 분화 억제 유도 세포(암 악액질(Cancer cachexia) 모델)에서의 근육 분화 증가 확인

24웰 세포 배양 플레이트에서 근아세포 세포주인 C2C12 세포주를 8일간 분화 유도하면서 50μM 농도의 시스플라틴 항암제와 M3 ADAMTS1 돌연변이 재조합 단백질을 각각 0.1, 1, 10 ng/ml의 농도로 함께 처리하였다. 분화가 유도된 세포는 메탄올로 10분간 고정하였다. PBS로 3차례 충분히 세척해 준 뒤 2.5mg/ml 농도로 메탄올에 용해되어 있는 제너 염색시약을 증류수와 1:1로 섞어 10분간 염색하였다. 염색이 끝난 플레이트는 증류수로 세척을 해 준 뒤 건조시켜 현미경으로 관찰하였다.

도 21에서 확인할 수 있듯이, 시스플라틴을 처리하여 근육분화를 억제시킨 암 악액질(Cancer cachexia) 세포 모델에 대해서, M3 돌연변이 ADAMTS1을 처리한 경우, 감소되었던 마이오튜브의 길이는 용량 의존적으로 유의하게 증가하였다.

실시예 14: 프라이머리(primary) 근육 세포의 활성 증가 확인

96웰 플레이트에서 프라이머리 근육 세포를 24시간 배양한 뒤 혈청이 함유되어 있지 않은 배지로 교환하여 24시간을 추가 배양하였다. 그 다음 10μM의 BrdU와함께 M3 ADAMTS1 돌연변이 단백질을 각각 0.01, 0.1, 1, 10, 100 ng/ml의 농도로 처리하여 24시간 반응시켜주었다. 그 다음 BrdU 형광 측정 ELISA 키트 (Cell signaling technology, 6813S)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 근육 세포 내에서 새롭게 합성되는 DNA의 양이 증가하면 측정되는 흡광도가 증가하고, 이는 근육 세포의 활성이 증가한 것으로 볼 수 있다.

도 22에서 확인할 수 있듯이, M3 돌연변이 ADAMTS1을 처리한 경우 프라이머리 근육세포의 활성이 용량 의존적으로 유의하게 증가됨을 확인하였다.

<110> NUON BIO Co.,Ltd. <120> Compositions for treating or preventing muscle diseases, obesity or diabetes <130> PN190240 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 967 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ADAMTS1 <400> 1 Met Gln Arg Ala Val Pro Glu Gly Phe Gly Arg Arg Lys Leu Gly Ser 1 5 10 15 Asp Met Gly Asn Ala Glu Arg Ala Pro Gly Ser Arg Ser Phe Gly Pro 20 25 30 Val Pro Thr Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Leu Leu Ala Val Ser Asp 35 40 45 Ala Leu Gly Arg Pro Ser Glu Glu Asp Glu Glu Leu Val Val Pro Glu 50 55 60 Leu Glu Arg Ala Pro Gly His Gly Thr Thr Arg Leu Arg Leu His Ala 65 70 75 80 Phe Asp Gln Gln Leu Asp Leu Glu Leu Arg Pro Asp Ser Ser Phe Leu 85 90 95 Ala Pro Gly Phe Thr Leu Gln Asn Val Gly Arg Lys Ser Gly Ser Glu 100 105 110 Thr Pro Leu Pro Glu Thr Asp Leu Ala His Cys Phe Tyr Ser Gly Thr 115 120 125 Val Asn Gly Asp Pro Ser Ser Ala Ala Ala Leu Ser Leu Cys Glu Gly 130 135 140 Val Arg Gly Ala Phe Tyr Leu Leu Gly Glu Ala Tyr Phe Ile Gln Pro 145 150 155 160 Leu Pro Ala Ala Ser Glu Arg Leu Ala Thr Ala Ala Pro Gly Glu Lys 165 170 175 Pro Pro Ala Pro Leu Gln Phe His Leu Leu Arg Arg Asn Arg Gln Gly 180 185 190 Asp Val Gly Gly Thr Cys Gly Val Val Asp Asp Glu Pro Arg Pro Thr 195 200 205 Gly Lys Ala Glu Thr Glu Asp Glu Asp Glu Gly Thr Glu Gly Glu Asp 210 215 220 Glu Gly Ala Gln Trp Ser Pro Gln Asp Pro Ala Leu Gln Gly Val Gly 225 230 235 240 Gln Pro Thr Gly Thr Gly Ser Ile Arg Lys Lys Arg Phe Val Ser Ser 245 250 255 His Arg Tyr Val Glu Thr Met Leu Val Ala Asp Gln Ser Met Ala Glu 260 265 270 Phe His Gly Ser Gly Leu Lys His Tyr Leu Leu Thr Leu Phe Ser Val 275 280 285 Ala Ala Arg Leu Tyr Lys His Pro Ser Ile Arg Asn Ser Val Ser Leu 290 295 300 Val Val Val Lys Ile Leu Val Ile His Asp Glu Gln Lys Gly Pro Glu 305 310 315 320 Val Thr Ser Asn Ala Ala Leu Thr Leu Arg Asn Phe Cys Asn Trp Gln 325 330 335 Lys Gln His Asn Pro Pro Ser Asp Arg Asp Ala Glu His Tyr Asp Thr 340 345 350 Ala Ile Leu Phe Thr Arg Gln Asp Leu Cys Gly Ser Gln Thr Cys Asp 355 360 365 Thr Leu Gly Met Ala Asp Val Gly Thr Val Cys Asp Pro Ser Arg Ser 370 375 380 Cys Ser Val Ile Glu Asp Asp Gly Leu Gln Ala Ala Phe Thr Thr Ala 385 390 395 400 His Glu Leu Gly His Val Phe Asn Met Pro His Asp Asp Ala Lys Gln 405 410 415 Cys Ala Ser Leu Asn Gly Val Asn Gln Asp Ser His Met Met Ala Ser 420 425 430 Met Leu Ser Asn Leu Asp His Ser Gln Pro Trp Ser Pro Cys Ser Ala 435 440 445 Tyr Met Ile Thr Ser Phe Leu Asp Asn Gly His Gly Glu Cys Leu Met 450 455 460 Asp Lys Pro Gln Asn Pro Ile Gln Leu Pro Gly Asp Leu Pro Gly Thr 465 470 475 480 Ser Tyr Asp Ala Asn Arg Gln Cys Gln Phe Thr Phe Gly Glu Asp Ser 485 490 495 Lys His Cys Pro Asp Ala Ala Ser Thr Cys Ser Thr Leu Trp Cys Thr 500 505 510 Gly Thr Ser Gly Gly Val Leu Val Cys Gln Thr Lys His Phe Pro Trp 515 520 525 Ala Asp Gly Thr Ser Cys Gly Glu Gly Lys Trp Cys Ile Asn Gly Lys 530 535 540 Cys Val Asn Lys Thr Asp Arg Lys His Phe Asp Thr Pro Phe His Gly 545 550 555 560 Ser Trp Gly Met Trp Gly Pro Trp Gly Asp Cys Ser Arg Thr Cys Gly 565 570 575 Gly Gly Val Gln Tyr Thr Met Arg Glu Cys Asp Asn Pro Val Pro Lys 580 585 590 Asn Gly Gly Lys Tyr Cys Glu Gly Lys Arg Val Arg Tyr Arg Ser Cys 595 600 605 Asn Leu Glu Asp Cys Pro Asp Asn Asn Gly Lys Thr Phe Arg Glu Glu 610 615 620 Gln Cys Glu Ala His Asn Glu Phe Ser Lys Ala Ser Phe Gly Ser Gly 625 630 635 640 Pro Ala Val Glu Trp Ile Pro Lys Tyr Ala Gly Val Ser Pro Lys Asp 645 650 655 Arg Cys Lys Leu Ile Cys Gln Ala Lys Gly Ile Gly Tyr Phe Phe Val 660 665 670 Leu Gln Pro Lys Val Val Asp Gly Thr Pro Cys Ser Pro Asp Ser Thr 675 680 685 Ser Val Cys Val Gln Gly Gln Cys Val Lys Ala Gly Cys Asp Arg Ile 690 695 700 Ile Asp Ser Lys Lys Lys Phe Asp Lys Cys Gly Val Cys Gly Gly Asn 705 710 715 720 Gly Ser Thr Cys Lys Lys Ile Ser Gly Ser Val Thr Ser Ala Lys Pro 725 730 735 Gly Tyr His Asp Ile Ile Thr Ile Pro Thr Gly Ala Thr Asn Ile Glu 740 745 750 Val Lys Gln Arg Asn Gln Arg Gly Ser Arg Asn Asn Gly Ser Phe Leu 755 760 765 Ala Ile Lys Ala Ala Asp Gly Thr Tyr Ile Leu Asn Gly Asp Tyr Thr 770 775 780 Leu Ser Thr Leu Glu Gln Asp Ile Met Tyr Lys Gly Val Val Leu Arg 785 790 795 800 Tyr Ser Gly Ser Ser Ala Ala Leu Glu Arg Ile Arg Ser Phe Ser Pro 805 810 815 Leu Lys Glu Pro Leu Thr Ile Gln Val Leu Thr Val Gly Asn Ala Leu 820 825 830 Arg Pro Lys Ile Lys Tyr Thr Tyr Phe Val Lys Lys Lys Lys Glu Ser 835 840 845 Phe Asn Ala Ile Pro Thr Phe Ser Ala Trp Val Ile Glu Glu Trp Gly 850 855 860 Glu Cys Ser Lys Ser Cys Glu Leu Gly Trp Gln Arg Arg Leu Val Glu 865 870 875 880 Cys Arg Asp Ile Asn Gly Gln Pro Ala Ser Glu Cys Ala Lys Glu Val 885 890 895 Lys Pro Ala Ser Thr Arg Pro Cys Ala Asp His Pro Cys Pro Gln Trp 900 905 910 Gln Leu Gly Glu Trp Ser Ser Cys Ser Lys Thr Cys Gly Lys Gly Tyr 915 920 925 Lys Lys Arg Ser Leu Lys Cys Leu Ser His Asp Gly Gly Val Leu Ser 930 935 940 His Glu Ser Cys Asp Pro Leu Lys Lys Pro Lys His Phe Ile Asp Phe 945 950 955 960 Cys Thr Met Ala Glu Cys Ser 965 <210> 2 <211> 382 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> M3 <400> 2 Met Gln Arg Ala Val Pro Glu Gly Phe Gly Arg Arg Lys Leu Gly Ser 1 5 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Arg Tyr Val Glu Thr Met Leu Val Ala Asp Gln Ser Met 225 230 235 240 Ala Glu Phe His Gly Ser Gly Leu Lys His Tyr Leu Leu Thr Leu Phe 245 250 255 Ser Val Ala Ala Arg Leu Tyr Lys His Pro Ser Ile Arg Asn Ser Val 260 265 270 Ser Leu Val Val Val Lys Ile Leu Val Ile His Asp Glu Gln Lys Gly 275 280 285 Pro Glu Val Thr Ser Asn Ala Ala Leu Thr Leu Arg Asn Phe Cys Asn 290 295 300 Trp Gln Lys Gln His Asn Pro Pro Ser Asp Arg Asp Ala Glu His Tyr 305 310 315 320 Asp Thr Ala Ile Leu Phe Thr Arg Gln Asp Leu Cys Gly Ser Gln Thr 325 330 335 Cys Asp Thr Leu Gly Met Ala Asp Val Gly Thr Val Cys Asp Pro Ser 340 345 350 Arg Ser Cys Ser Val Ile Glu Asp Asp Gly Leu Gln Ala Ala Phe Thr 355 360 365 Thr Ala His Glu Leu Gly His Val Phe Asn Met Pro His Asp 370 375 380 <210> 3 <211> 2904 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADAMTS1 <400> 3 atgcagcgag ctgtgcccga ggggttcgga aggcgcaagc tgggcagcga catggggaac 60 gcggagcggg ctccggggtc tcggagcttt gggccagtac ccacgctgct gctgctcgcc 120 gcggcgctac tggccgtgtc ggacgcactc gggcgcccct ccgaggagga cgaggagcta 180 gtggtgccgg agctggagcg cgccccggga cacgggacca cgcgcctccg cctgcacgcc 240 tttgaccagc agctggatct ggagctgcgg cccgacagca gctttttggc gcccggcttc 300 acgctccaga acgtggggcg caaatccggg tccgagacgc cgcttccgga aaccgacctg 360 gcgcactgct tctactccgg caccgtgaat ggcgatccca gctcggctgc cgccctcagc 420 ctctgcgagg gcgtgcgcgg cgccttctac ctgctggggg aggcgtattt catccagccg 480 ctgcccgccg ccagcgagcg cctcgccacc gccgccccag gggagaagcc gccggcacca 540 ctacagttcc acctcctgcg gcggaatcgg cagggcgacg tcggcggcac gtgcggggtc 600 gtggacgacg agccccggcc gactgggaaa gcggagaccg aagacgagga cgaagggact 660 gagggcgagg acgaaggggc tcagtggtcg ccgcaggacc cggcactgca aggcgtagga 720 cagcccacag gaactggaag cataagaaag aagcgatttg tgtccagtca ccgctatgtg 780 gaaaccatgc ttgtggcaga ccagtcgatg gcagaattcc acggcagtgg tctaaagcat 840 taccttctca cgttgttttc ggtggcagcc agattgtaca aacaccccag cattcgtaat 900 tcagttagcc tggtggtggt gaagatcttg gtcatccacg atgaacagaa ggggccggaa 960 gtgacctcca atgctgccct cactctgcgg aacttttgca actggcagaa gcagcacaac 1020 ccacccagtg accgggatgc agagcactat gacacagcaa ttcttttcac cagacaggac 1080 ttgtgtgggt cccagacatg tgatactctt gggatggctg atgttggaac tgtgtgtgat 1140 ccgagcagaa gctgctccgt catagaagat gatggtttac aagctgcctt caccacagcc 1200 catgaattag gccacgtgtt taacatgcca catgatgatg caaagcagtg tgccagcctt 1260 aatggtgtga accaggattc ccacatgatg gcgtcaatgc tttccaacct ggaccacagc 1320 cagccttggt ctccttgcag tgcctacatg attacatcat ttctggataa tggtcatggg 1380 gaatgtttga tggacaagcc tcagaatccc atacagctcc caggcgatct ccctggcacc 1440 tcgtacgatg ccaaccggca gtgccagttt acatttgggg aggactccaa acactgcccc 1500 gatgcagcca gcacatgtag caccttgtgg tgtaccggca cctctggtgg ggtgctggtg 1560 tgtcaaacca aacacttccc gtgggcggat ggcaccagct gtggagaagg gaaatggtgt 1620 atcaacggca agtgtgtgaa caaaaccgac agaaagcatt ttgatacgcc ttttcatgga 1680 agctggggaa tgtgggggcc ttggggagac tgttcgagaa cgtgcggtgg aggagtccag 1740 tacacgatga gggaatgtga caacccagtc ccaaagaatg gagggaagta ctgtgaaggc 1800 aaacgagtgc gctacagatc ctgtaacctt gaggactgtc cagacaataa tggaaaaacc 1860 tttagagagg aacaatgtga agcacacaac gagttttcaa aagcttcctt tgggagtggg 1920 cctgcggtgg aatggattcc caagtacgct ggcgtctcac caaaggacag gtgcaagctc 1980 atctgccaag ccaaaggcat tggctacttc ttcgttttgc agcccaaggt tgtagatggt 2040 actccatgta gcccagattc cacctctgtc tgtgtgcaag gacagtgtgt aaaagctggt 2100 tgtgatcgca tcatagactc caaaaagaag tttgataaat gtggtgtttg cgggggaaat 2160 ggatctactt gtaaaaaaat atcaggatca gttactagtg caaaacctgg atatcatgat 2220 atcatcacaa ttccaactgg agccaccaac atcgaagtga aacagcggaa ccagagggga 2280 tccaggaaca atggcagctt tcttgccatc aaagctgctg atggcacata tattcttaat 2340 ggtgactaca ctttgtccac cttagagcaa gacattatgt acaaaggtgt tgtcttgagg 2400 tacagcggct cctctgcggc attggaaaga attcgcagct ttagccctct caaagagccc 2460 ttgaccatcc aggttcttac tgtgggcaat gcccttcgac ctaaaattaa atacacctac 2520 ttcgtaaaga agaagaagga atctttcaat gctatcccca ctttttcagc atgggtcatt 2580 gaagagtggg gcgaatgttc taagtcatgt gaattgggtt ggcagagaag actggtagaa 2640 tgccgagaca ttaatggaca gcctgcttcc gagtgtgcaa aggaagtgaa gccagccagc 2700 accagacctt gtgcagacca tccctgcccc cagtggcagc tgggggagtg gtcatcatgt 2760 tctaagacct gtgggaaggg ttacaaaaaa agaagcttga agtgtctgtc ccatgatgga 2820 ggggtgttat ctcatgagag ctgtgatcct ttaaagaaac ctaaacattt catagacttt 2880 tgcacaatgg cagaatgcag ttaa 2904 <210> 4 <211> 1146 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M3 <400> 4 atgcagcgag ctgtgcccga ggggttcgga aggcgcaagc tgggcagcga catggggaac 60 gcggagcggg ctccggggtc tcggagcttt gggccagtac ccacgctgct gctgctcgcc 120 gcggcgctac tggccgtgtc ggacgcactc gggcgcccct ccgaggagga cgaggagcta 180 gtggtgccgg agctggagcg cgccccggga cacgggacca cgcgcctccg cctgcacgcc 240 tttgaccagc agctggatct ggagctgcgg cccgacagca gctttttggc gcccggcttc 300 acgctccaga acgtggggcg caaatccggg tccgagacgc cgcttccgga aaccgacctg 360 gcgcactgct tctactccgg caccgtgaat ggcgatccca gctcggctgc cgccctcagc 420 ctctgcgagg gcgtgcgcgg cgccttctac ctgctggggg aggcgtattt catccagccg 480 ctgcccgccg ccagcgagcg cctcgccacc gccgccccag gggagaagcc gccggcacca 540 ctacagttcc acctcctgcg gcggaatcgg cagggcgacg tcggcggcac gtgcggggtc 600 gtggacgacg agccccggcc gactgggaaa gcggagaccg aagacgagga cgaagggact 660 gagcgatttg tgtccagtca ccgctatgtg gaaaccatgc ttgtggcaga ccagtcgatg 720 gcagaattcc acggcagtgg tctaaagcat taccttctca cgttgttttc ggtggcagcc 780 agattgtaca aacaccccag cattcgtaat tcagttagcc tggtggtggt gaagatcttg 840 gtcatccacg atgaacagaa ggggccggaa gtgacctcca atgctgccct cactctgcgg 900 aacttttgca actggcagaa gcagcacaac ccacccagtg accgggatgc agagcactat 960 gacacagcaa ttcttttcac cagacaggac ttgtgtgggt cccagacatg tgatactctt 1020 gggatggctg atgttggaac tgtgtgtgat ccgagcagaa gctgctccgt catagaagat 1080 gatggtttac aagctgcctt caccacagcc catgaattag gccacgtgtt taacatgcca 1140 catgat 1146

Claims (11)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 222번 내지 251번 및 413번 내지 967번 위치의 아미노산이 결실된 아미노산 서열을 포함하는 M3 돌연변이 ADAMTS1 펩타이드.
   
2. 제1항의 펩타이드를 포함하는 근육질환 완화, 억제, 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 근육질환은 근감소증(Sarcopenia), 근위축증(Amyotrophy), 암악액질(Cancer cachexia), 근손상, 근육퇴행위축증, 심위축증, 긴장감퇴증(atony), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육 퇴화증 및 근무력증으로 이루어진 군에서 선택된 것인, 근육질환 완화, 억제, 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
   
4. 제1항의 펩타이드를 포함하는 비만 완화, 억제, 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
   
5. 제1항의 펩타이드를 포함하는 당뇨병 완화, 억제, 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
   
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