KR102042084B1

KR102042084B1 - 에스트라디올 전처리에 의해 생존율이 향상된 줄기세포와 그 제조방법, 및 이를 포함하는 당뇨병 및 이와 관련된 질병의 예방 또는 치료를 위한 세포치료제 조성물

Info

Publication number: KR102042084B1
Application number: KR1020180059010A
Authority: KR
Inventors: 한호재; 오지영
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2018-05-24
Filing date: 2018-05-24
Publication date: 2019-11-07

Abstract

본 발명은 에스트라디올, 이의 아날로그, 또는 이의 유도체가 전처리된 것을 특징으로 하는 생존율이 향상된 줄기세포와 그 제조방법, 및 상기 줄기세포 또는 상기 줄기세포로부터 분화된 세포를 포함하는 당뇨병 및 이와 관련된 질병의 예방 또는 치료를 위한 세포치료제 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 줄기세포 및 이를 포함하는 세포치료제 조성물에 따르면, 줄기세포에 에스트라디올을 전처리함으로써 고농도 포도당에 의해 축적되는 미토콘드리아 활성산소종을 감소시켜, 궁극적으로 자가소화 및 세포 사멸을 막아, 줄기세포의 생존율을 높이고, 이를 고농도 포도당에 의해 발생하는 당뇨병 및 이와 관련된 질병에 걸린 환자에 적용할 때, 그 치료 효과를 현저히 향상시킬 수 있는바, 의학, 제약학, 수의학 등 다양한 산업 분야에 있어서 널리 활용될 수 있다.

Description

에스트라디올 전처리에 의해 생존율이 향상된 줄기세포와 그 제조방법, 및 이를 포함하는 당뇨병 및 이와 관련된 질병의 예방 또는 치료를 위한 세포치료제 조성물{STEM CELL HAVING ENHANCED VIABILITY BY ESTRADIOL PRETREATMENT AND METHOD FOR PREPARING THE SAME, AND CELL THERAPEUTIC AGENT COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING DIABETES AND RELATED DISEASES COMPRISING THEREOF}

본 발명은 에스트라디올 전처리에 의해 생존율이 향상된 줄기세포와 그 제조방법, 및 이를 포함하는 당뇨병 및 이와 관련된 질병의 예방 또는 치료를 위한 세포치료제 조성물에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 에스트라디올, 이의 아날로그, 또는 이의 유도체가 전처리된 것을 특징으로 하는 생존율이 향상된 줄기세포와 그 제조방법, 및 상기 줄기세포 또는 상기 줄기세포로부터 분화된 세포를 포함하는 당뇨병 및 이와 관련된 질병의 예방 또는 치료를 위한 세포치료제 조성물에 관한 것이다.

잘 알려진 여성 스테로이드 호르몬인, 17β-에스트라디올(E2)은 재생적 생식, 심혈관, 골격 및 중추 신경계에 관여하는 많은 조직들의 과정을 조절하는데 중요한 역할을 한다. 폐경후 여성에게 있어서, 당뇨병을 일으키는 내장 비만 및 인슐린 내성이 증가된다. 따라서, 폐경기 여성에서 당뇨병 위험은 남성이나 폐경 전 여성에 비해 크게 증가한다. 당뇨병 폐경후 여성의 공복혈당 및 전체 콜레스테롤을 감소시키는 E2의 용도가 보고된바 있다(Crespo, C.J., et al., Hormone replacement therapy and its relationship to lipid and glucose metabolism in diabetic and nondiabetic postmenopausal women: results from the Third National Health and Nutrition Examination Survey (NHANES III). Diabetes Care, 2002. 25(10): p. 1675-80). 또한 E2의 결핍이 길어지는 조기 폐경은 당뇨의 위험이 더 높다고 보고되고 있다(Brand, J.S., et al., Age at menopause, reproductive life span, and type 2 diabetes risk: results from the EPIC-InterAct study. Diabetes Care, 2013. 36(4): p. 1012-9). 특히 폐경기 여성에서 발생하는 내분비 변화는 혈당 조절 능력이 떨어지며 이는 산화 스트레스와 밀접한 관련이 있다(Carr, M.C., The emergence of the metabolic syndrome with menopause. J Clin Endocrinol Metab, 2003. 88(6): p. 2404-11; Park, S.H., et al., Elevated oxidized low-density lipoprotein concentrations in postmenopausal women with the metabolic syndrome. Clin Chim Acta, 2011. 412(5-6): p. 435-40). 그러나, 당뇨병 폐경후 여성에 있어서 E2가 어떻게 고포도당으로 인한 산화스트레스를 막는 정확한 기전은 알려져 있지 않다.

자가소화는 단백질 및 세포소기관 전환 시 세포내 항상성을 유지하기 위하여 과도한 ROS와 같은 다양한 스트레스 조건 하에서 세포내 성분을 분해 및 재사용하게 한다(Shingu, T., et al., Stage-specific effect of inhibition of autophagy on chemotherapy-induced cytotoxicity. Autophagy, 2009. 5(4): p. 537-9). 게다가, 최근, 과도한 ROS가 세포 사멸을 일으키는 자가소화의 후기에 손상을 일으킨다는 것이 보고된바 있다. 손상된 자가소화는 당뇨병에서 고포도당에 의해 유발될 수 있는데, 이는 세포 내 접히지 않은 단백질 및 기능 장애 세포소기관의 축적을 일으킬 수 있다. 이는 자가소화가 당뇨병 합병증의 병리 및 생리에서 역할을 한다는 것을 암시한다(Volpe, C.M.O., et al., Cellular death, reactive oxygen species (ROS) and diabetic complications. Cell Death Dis, 2018. 9(2): p. 119). 다수의 연구들이 미토콘드리아가 자가소화 유도에 대한 ROS의 원칙적인 근원이라고 제안하였다(Scherz-Shouval, R. and Z. Elazar, ROS, mitochondria and the regulation of autophagy. Trends Cell Biol, 2007. 17(9): p. 422-7; Scherz-Shouval, R., et al., Reactive oxygen species are essential for autophagy and specifically regulate the activity of Atg4. EMBO J, 2007. 26(7): p. 1749-60). 게다가, 산화적 스트레스 및 미토콘트리아 기능 장애와 같은 세포내 변화는 자가소화 세포 손상을 일으킬 수 있다. 최근 연구는 ROS-유도 자가소화가 다양한 세포에서 고포도당 조건하에서 증가된다고 주장한바 있다(Kim, K.A., et al., High glucose condition induces autophagy in endothelial progenitor cells contributing to angiogenic impairment. Biol Pharm Bull, 2014. 37(7): p. 1248-52; Wang, X., et al., High glucose induces autophagy of MC3T3-E1 cells via ROS-AKT-mTOR axis. Mol Cell Endocrinol, 2016. 429: p. 62-72).

에스트로겐 수용체(ER)은 포도당 흡수 및 인슐린 민감성에 관련된 유전자 발현을 조절하는, 핵 수용체 상과에 속한다. 최근 E2 및 ER은 여성과 남성 모두의 생리학 및 병리학에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. ER은 포도당 섭취와 인슐린 감수성에 관여하는 유전자 발현을 조절한다는 보고가 있다(Bryzgalova, G., et al., Evidence that oestrogen receptor-alpha plays an important role in the regulation of glucose homeostasis in mice: insulin sensitivity in the liver. Diabetologia, 2006. 49(3): p. 588-97). 또한 ER의 발현은 포도당 독성에 의해 하향 조절되고, β-cell의 생존율을 향상시키기 때문에 당뇨병에 대한 내성을 변화시킬 수 있다(Kilic, G., et al., The islet estrogen receptor-alpha is induced by hyperglycemia and protects against oxidative stress-induced insulin-deficient diabetes. PLoS One, 2014. 9(2): p. e87941). 그러나, 내인성 에스트로겐의 수준의 감소로 인해, ERα 감소가 폐경후 여성에게서 관찰되며, ERα^-/-쥐에서 포도당 및 에너지 대사가 불규칙한 것이 관찰되었다(Manrique, C., et al., Loss of Estrogen Receptor alpha Signaling Leads to Insulin Resistance and Obesity in Young and Adult Female Mice. Cardiorenal Med, 2012. 2(3): p. 200-210). 종합해보면, ERα의 조절은 당뇨병에 의해 유발되는 다양한 합병증을 예방하는데 있어서 중요한 역할을 할 것이라고 판단된다. 당뇨병은 사망을 유발하는, 손상된 상처 치료를 포함하는, 다양한 합병증의 발생에 관련되어 있다. 그러나, 당뇨병 폐경후 여성에 있어서 어떻게 E2-유도 ER 조절이 당뇨병의 유해한 결과를 조절하는지 분명하지 않다.

고포도당은 다양한 세포내 사건을 조절하는 세포내 메신저로 작용하는, ROS(활성산소종)의 세포내 신호 캐스캐이드를 조절한다. 과도한 ROS는 막 지질 및 단백질 산화를 통해 세포자멸을 일으킬 수 있다. Nrf2는 산화제로부터 보호하는 중요한 전사 인자로, 많은 조직에서 세포 생존을 증가시킨다. 게다가, Nrf2는 NADPH 산화효소에 의한 ROS 생성을 조절함으로써 세포내 산화환원 항상성 유지에 있어서 중요한 역할을 한다. 산화적 스트레스 수준이 Nrf2-결핍 당뇨병 쥐에서 증가된다는 것이 보고된바 있다(He, X. and Q. Ma, Disruption of Nrf2 Synergizes with High Glucose to Cause Heightened Myocardial Oxidative Stress and Severe Cardiomyopathy in Diabetic Mice. J Diabetes Metab, 2012. Suppl 7; Yoh, K., et al., Hyperglycemia induces oxidative and nitrosative stress and increases renal functional impairment in Nrf2-deficient mice. Genes Cells, 2008. 13(11): p. 1159-70). Nrf2 발현은 당뇨병/인슐린 내성 모델에서 감소된다는 것이 확인된바 있다(Tan, Y., et al., Diabetic downregulation of Nrf2 activity via ERK contributes to oxidative stress-induced insulin resistance in cardiac cells in vitro and in vivo. Diabetes, 2011. 60(2): p. 625-33). Nrf2는 항산화 효소로, Keap1이 정상 조건 하에서 Nrf2에 결합함으로써 분해된다. 산화적 스트레스는 Nrf2의 핵으로의 전좌를 유도한다. 전좌된 Nrf2는 항산화-관련 성분에 결합하고, MnSOD 및 카탈라아제와 같은 항산화 유전자를 발현시켜, ROS 억제에 의해 세포를 보호한다. 시르투인은 아세틸화 수준 및 산화적 스트레스로부터 미토콘드리아를 보호하는 항산화 효소의 활성을 조절한다. 따라서, 시르투인은 당뇨병 및 신장 질환과 같은 연령-관련 질병에 있어서 보호적 역할을 한다. Sirt3 (NAD⁺-의존적 미토콘드리아 탈아세틸화효소)의 과발현이 mtROS (미토콘드리아 활성산소종)를 축적시키고, 미토콘드리아 손상을 완화시킨다는 것이 보고된바 있다. 최근 Sirt3 과발현이 고포도당-유도 세포독성 및 세포 노화를 감소시킨다는 것이 확인된바 있다(Liu, G., et al., SIRT3 protects endothelial cells from high glucose-induced cytotoxicity. Int J Clin Exp Pathol, 2015. 8(1): p. 353-60; Zhang, B., et al., SIRT3 overexpression antagonizes high glucose accelerated cellular senescence in human diploid fibroblasts via the SIRT3-FOXO1 signaling pathway. Age (Dordr), 2013. 35(6): p. 2237-53). 게다가, Sirt3는 인슐린 민감성을 조절하며 Sirt3 감소는 mtROS를 증가시켜 비만에서 혈관 기능 장애에 기여한다(Lantier, L., et al., SIRT3 Is Crucial for Maintaining Skeletal Muscle Insulin Action and Protects Against Severe Insulin Resistance in High-Fat-Fed Mice. Diabetes, 2015. 64(9): p. 3081-92; Jing, E., et al., Sirtuin-3 (Sirt3) regulates skeletal muscle metabolism and insulin signaling via altered mitochondrial oxidation and reactive oxygen species production. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011. 108(35): p. 14608-13). 그러나, Nrf2 및 Sirt3 가 산화적 스트레스를 감소시키기 위한 고포도당 조건하에서 활성화되는 메커니즘은 알아내기 어려운 상황이다.

줄기세포 적용은 당뇨병 환자에게 있어서 상처 치료를 위한 매우 흥미로운 치료법이다. 당뇨병 환자는 보통 사람들과 비교할 때 상처 치료 속도가 훨씬 느리다. 고혈당증은 신경에 영향을 미치고 혈관 신생 및 신 혈관 형성을 손상시켜 혈액이 상처에 도달하기 어렵게 만든다(Guo, S. and L.A. Dipietro, Factors affecting wound healing. J Dent Res, 2010. 89(3): p. 219-29). 중간엽 줄기세포는 병적 변화를 예방하는 세포 이식 치료제로 당뇨병에 걸린 동물에 널리 사용되고 있다(Volarevic, V., et al., Concise review: Mesenchymal stem cell treatment of the complications of diabetes mellitus. Stem Cells, 2011. 29(1): p. 5-10; Jackson, W.M., L.J. Nesti, and R.S. Tuan, Concise review: clinical translation of wound healing therapies based on mesenchymal stem cells. Stem Cells Transl Med, 2012. 1(1): p. 44-50). 그러나 고혈당에서 세포 사멸로 인한 세포 손실이 줄기세포를 이식 효율을 감소시킬 수 있다. 반면 중간엽 줄기세포에서의 E2 처리는 활성산소종 및 산화 스트레스 감소에 의해 세포 생존력, 증식, 및 분화를 효과적으로 향상시킬 수 있다.

이에, 본 발명자들은 고농도 포도당에 의해 유도된 미토콘드리아 활성산소종에 있어서의 에스트라디올의 보호적 역할 및 그와 관련된 경로를 밝히고자 예의 노력한 결과, 고포도당에 의해 발생하는 미토콘드리아 활성산소종이 자가소화 및 세포 사멸을 유도하는데, 이를 에스트라디올이 억제한다는 것을 확인하고, 구체적으로 에스트라디올 전처리한 중간엽 줄기세포에서 에스트로겐 수용체 활성에 의하여 증가된 Nrf2가 Sirt3를 증가시키고, 증가된 Sirt3가 MnSOD의 활성을 증가시켜 미토콘드리아 내에 축적되는 활성산소종을 감소시키고, 중간엽 줄기세포의 생존율을 향상시키는다는 것을 확인하였다. 또한 폐경기 당뇨 마우스 모델에서 E2에 의한 피부 상처 치유에 대한 중간엽 줄기세포 이식의 효과를 평가함으로써, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 목적은 에스트라디올, 이의 아날로그, 또는 이의 유도체가 전처리된 것을 특징으로 하는 생존율이 향상된 줄기세포와 그 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 생존율이 향상된 줄기세포 또는 상기 줄기세포로부터 분화된 세포를 포함하는 당뇨병 및 이와 관련된 질병의 예방 또는 치료를 위한 세포치료제 조성물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 에스트라디올, 이의 아날로그, 또는 이의 유도체가 전처리된 것을 특징으로 하는 생존율이 향상된 줄기세포와 그 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 생존율이 향상된 줄기세포 또는 상기 줄기세포로부터 분화된 세포를 포함하는 당뇨병 및 이와 관련된 질병의 예방 또는 치료를 위한 세포치료제 조성물을 제공한다.

본 발명의 줄기세포 및 이를 포함하는 세포치료제 조성물에 따르면, 줄기세포에 에스트라디올을 전처리함으로써 고농도 포도당에 의해 축적되는 미토콘드리아 활성산소종을 감소시켜, 궁극적으로 자가소화 및 세포 사멸을 막아, 줄기세포의 생존율을 높이고, 이를 고농도 포도당에 의해 발생하는 당뇨병 및 이와 관련된 질병에 걸린 환자에 적용할 때, 그 치료 효과를 현저히 향상시킬 수 있는바, 의학, 제약학, 수의학 등 다양한 산업 분야에 있어서 널리 활용될 수 있다.

도 1은 고포도당에 처리에 의한 미토콘드리아 활성산소종 증가에 따른 자가소화 및 세포 사멸 증가에 대한 에스트라디올 처리에 의한 보호기전의 효과를 나타낸 것이다. 에스트라디올은 에스트로겐 수용체 알파를 통한 Nrf2와 Sirt3 발현 증가시키며, 증가한 Sirt3에 의해 MnSOD가 활성화 되어 미토콘드리아 활성산소종을 감소시켜 자가소화 및 세포 사멸을 감소시킴으로써 세포를 보호할 수 있다.
도 2의 왼쪽 이미지는 시간 별로 (0 내지 72 시간) 처리한 고포도당 상태에서 자가소화 관련 단백질을 확인한 결과를 나타낸 것이고, 도 2의 오른쪽 이미지는 왼쪽 이미지에서 확인한 자가소화 관련 단백질에 대한 ROD(relative optical density)를 나타낸 그래프로서, 각각의 단백질을 ImageJ 프로그램을 이용하여 분석한 결과이다(^*p<0.05 vs 0h).
도 3은 고포도당 조건 하에서 시간에 따른 세포 생존능을 나타낸 것이다.
도 4는 고포도당 조건 하에서 Atg5에 대한 siRNA의 형질주입에 따른 세포 생존능을 나타낸 것이다.
도 5의 왼쪽 이미지는 hUCB-MSC 내 자가소화에 대한 에스트라디올의 효과를 조사하기 위하여, 자가소화 관련 단백질에 대하여 수행한 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 것이고, 도 5의 오른쪽 이미지는 상기 웨스턴 블롯 결과를 분석한 그래프이다(^*p<0.05 vs 대조군, ^#p<0.05 vs 고포도당 단독).
도 6의 왼쪽 이미지는 면역형광 염색 결과를 나타낸 것이고, 도 6의 오른쪽 이미지는 상기 면역형광 염색 결과를 Fiji 프로그램으로 분석한 그래프이다(^*p<0.05 vs 대조군, ^#p<0.05 vs 고포도당 단독).
도 7은 고포도당 조건 하에서 세포 생존능에 대한 에스트라디올의 영향을 나타낸 것이다.
도 8은 DCF-DA(10μM)를 이용하여 hUCB-MSC 내 ROS 축적에 대한 시간에 따른 고포도당의 영향을 나타낸 것이다.
도 9는 고포도당 단독처리와 비교하여, 에스트라디올이 전처리된 경우의 ROS 축적을 나타낸 것이다.
도 10은 hUCB-MSC 내 고포도당 처리 전에, NAC, mitoTempo 및 Vas2870의 전처리에 따른 ROS의 축적에 대한 고포도당의 영향을 DCF-DA로 나타낸 것이다.
도 11의 왼쪽 이미지는 mtROS에 의한 자가소화 관련 유전자의 발현 변화를 웨스턴 블롯으로 분석한 결과를 나타낸 것이고, 도 11의 오른쪽 이미지는 상기 웨스턴 블롯 결과를 ImageJ 프로그램으로 분석한 그래프이다(^*p<0.05 vs 대조군, ^#p<0.05 vs 고포도당 단독).
도 12는 고포도당에 의해 유도된 미토콘드리아 활성산소종에 대한 에스트라디올의 영향을 확인하기 위하여, hUCB-MSC를 미토트래커 그린 및 미토삭스 레드로 염색한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 미토삭스에 의해 에스트라디올 전처리를 한 고포도당 군과 고포도당 단독처리군의 변화를 FACS로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 14의 위쪽 이미지는 고포도당 조건 하에서 에스트로겐 수용체에 대한 에스트라디올의 영향을 확인하기 위하여, 세포 기질 및 핵 분획을 분리한 후에 수행한 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 것이고, 도 14의 아래쪽 이미지는 상기 웨스턴 블롯 결과를 ImageJ 프로그램으로 분석한 그래프이다(^*p<0.05 vs 대조군).
도 15는 에스트로겐 수용체 조절에 의한 핵 내 고포도당에 의해 감소된 Nrf2의 역할을 확인하기 위한, 에스트로겐 수용체 siRNA 형질주입 결과를 나타낸 것이다.
도 16의 왼쪽 이미지는 Sirt3 발현에 대한 에스트로겐 수용체의 영향을 확인하기 위한, 에스트로겐 수용체 siRNA 형질주입 결과를 나타낸 것이고, 도 16의 오른쪽 이미지는 상기 결과를 ImageJ 프로그램으로 분석한 그래프이다(^*p<0.05 vs NT siRNA-형질주입 대조군, ^#p<0.05 vs NT siRNA-형질주입 고포도당 단독).
도 17은 고포도당에 의해 증가된 ROS가 Nrf2의 영향을 받는지 확인하기 위하여, Nrf2 siRNA 형질주입을 한 후 고포도당을 처리하여 ROS 수준을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 18의 왼쪽 이미지는 시간 별로 처리한 고포도당에 대한 핵 Nrf2의 영향을 확인하기 위하여, 핵 분획을 수행한 결과를 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸 것이고, 도 18의 오른쪽 이미지는 상기 웨스턴 블롯 결과를 분석한 그래프이다(^*p<0.05 vs 0h).
도 19의 위쪽 이미지는 고포도당 처리에 의해 억제된 Nrf2의 핵 전좌를 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸 것이고, 도 19의 아래쪽 이미지는 상기 웨스턴 블롯 결과를 ImageJ 프로그램으로 분석한 그래프이다(^*p<0.05 vs 대조군).
도 20의 위쪽 이미지는 고포도당 조건 하에서 핵 Nrf2에 대한 에스트라디올의 영향을 확인하기 위하여 핵 분획을 수행한 결과를 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸 것이고, 도 20의 아래쪽 이미지는 ImageJ 프로그램으로 분석한 그래프이다(^*p<0.05 vs 대조군, ^#p<0.05 vs 고포도당 단독).
도 21의 왼쪽 이미지는 고포도당 조건 하에서 에스트라디올 전처리에 의한 Nrf2의 변화를 확인하기 위한 면역형광 염색 결과를 나타낸 것이고, 도 21의 오른쪽 이미지는 상기 면역형광 염색 결과를 Fiji 프로그램으로 분석한 그래프이다(^*p<0.05 vs 대조군, ^#p<0.05 vs 고포도당 단독).
도 22의 왼쪽 이미지는 시간 별로 (0 내지 72 시간) 처리한 고포도당 상태에서 MnSOD 아세틸화가 일어나는지 확인하기 위하여 Ac-K68-MnSOD와 MnSOD를 gghkr인하기 위한 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 것이고, 도 22의 오른쪽 이미지는 상기 웨스턴 블롯 결과를 분석한 그래프이다(^*p<0.05 vs 0h).
도 23의 왼쪽 이미지는 고포도당 처리에 의해 감소된 Sirt3의 발현 수준을 확인한 결과를 웨스턴 블롯을 시간 별로 확인한 결과를 나타낸 것이고, 도 23의 오른쪽 이미지는 상기 웨스턴 블롯 결과를 분석한 그래프이다(^*p<0.05 vs 0h).
도 24의 왼쪽 이미지는 MnSOD 활성에 대한 Sirt3의 영향을 확인하기 위한 Sirt3 siRNA 형질주입 수행 결과를 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸 것이고, 도 24의 오른쪽 이미지는 상기 웨스턴 블롯 결과를 ImageJ 프로그램으로 분석한 그래프이다(^*p<0.05 vs NT siRNA-형질주입 대조군, ^#p<0.05 vs Sirt3 siRNA-형질주입 대조군).
도 25는 고포도당에 의해 증가된 ROS가 MnSOD의 영향을 받는지 확인하기 위하여, MnSOD siRNA 형질주입한 후 고포도당을 처리하여 ROS 수준을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 26의 위쪽 이미지는 고포도당 조건 하에서 Sirt3 발현에 대한 에스트라디올의 영향을 확인하기 위하여 웨스턴 블롯을 수행한 결과를 나타낸 것이고, 도 26의 아래쪽 이미지는 상기 웨스턴 블롯 결과를 ImageJ 프로그램으로 분석한 그래프이다(^*p<0.05 vs 대조군, ^#p<0.05 vs 고포도당 단독).
도 27의 왼쪽 이미지는 고포도당 처리에 의한 Sirt3 감소 효과가 에스트라디올 전처리에 의해 역전되는 것을 확인하기 위한 면역형광 염색 결과를 나타낸 것이고, 도 27의 오른쪽 이미지는 상기 면역형광 염색 결과를 Fiji 프로그램으로 분석한 결과를 나타낸 것이다(^*p<0.05 vs 대조군, ^#p<0.05 vs 고포도당 단독).
도 28은 고포도당 처리에 의한 SOD 활성 효과가 에스트라디올 전처리에 의해 역전되는 것을 확인하기 위한 SOD 활성화를 분석한 결과를 나타낸 것이다(^*p<0.05 vs 대조군, ^#p<0.05 vs 고포도당 단독).
도 29는 쥐에 STZ를 처리하여 당뇨를 유발한 후 혈당의 변화를 나타낸 것이다.
도 30은 에스트라디올 순환의 효과를 확인하기 위하여 자궁 무게를 측정한 결과를 나타낸 것이다(^*p<0.05 vs 허위 대조군, ^#p<0.05 vs 난소 적출군).
도 31은 에스트라디올 순환의 효과를 확인하기 위하여 혈청 에스트라디올을 측정한 결과를 나타낸 것이다(^*p<0.05 vs 허위 대조군, ^#p<0.05 vs 난소 적출군).
도 32는 난소 적출된 당뇨병 쥐 모델에서 hUCB-MSC에 대한 에스트로겐 수용체의 영향을 확인하기 위하여, ERαsiRNA를 형질주입한 hUCB-MSCs를 쥐의 피부 상처에 주사한 후 상처 치유 효과를 관찰한 것이다.
도 33은 상처 조직의 조직학적 검사 결과를 나타낸 것이다.
도 34의 왼쪽 이미지는 이식된 hUCB-MSC를 추적하기 위하여, 상처 조직을 항-인간 핵 항원(HNA) 항체로 염색한 결과를 나타낸 것이고, 도 34의 오른쪽 이미지는 HNA-양성 세포를 Fiji 소프트웨어를 이용해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 35는 혈관 사진을 관찰한 결과를 나타낸 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명의 실시예에서 제시되는 특정한 구조 내지 기능적 설명들은 단지 본 발명의 개념에 따른 실시예를 설명하기 위한 목적으로 예시된 것으로, 본 발명의 개념에 따른 실시예들은 다양한 형태로 실시될 수 있다. 또한 본 명세서에 설명된 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 아니 되며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경물, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명은 인간 제대혈 중간엽 줄기세포(hUCB-MSC) 내 Nrf2 및 Sirt3-의존적 미토콘드리아 활성산소종(mtROS) 감소 수준을 통해 에스트라디올(E2)이 고포도당 조건 하에서 자가소화 및 세포 사멸에 대한 보호적 효과가 있다는 것을 확인하였다. 다시 말해서, 본 발명은 E2가 고포도당에 의해 유도된 mtROS 생성에 대해 보호적 효과를 가지며, hUCB-MSC 내 에스트로겐 수용체(ERα)에 의해 유도된 Nrf2 및 Sirt3 발현을 통해 자가소화 및 세포 사멸의 감소를 유도한다는 것을 확인하였다(도 1).

구체적으로, 본 발명은 E2에 의해 자가소화 관련 유전자의 발현이 증가되며, 세포 생존능이 고포도당 조건 하에서 시간에 의존적으로 감소한다는 것을 확인하였다. 아울러, 고포도당에 의해 유도된 mtROS 생성은 미토템포에 의해 억제되며, hUCB-MSC의 세포 생존능은 고포도당 조건 하에서 Atg5 siRNA에 의해 증가하였는데, 이로써 고포도당이 hUCB-MSC 내 mtROS-유도 자가소화 세포 사멸을 증가시킨다는 것을 확인하였다. 또한 본 발명은 E2가 ERα에 의해 유도된 Nrf2 및 Sirt3 발현을 유도하는 항산화 효소 활성을 증가시킨다는 것을 확인하였다. 게다가, 본 발명은 폐경기 당뇨병 모델에서 hUCB-MSC의 치료적 효과가 E2 처리에 의해 향상된다는 것을 확인하였고, 이러한 치료적 효과를 난소가 적출된 당뇨병 쥐의 피부 상처 치료 모델로 확인하였다.

본 발명은 일 관점에서, 에스트라디올, 이의 아날로그, 또는 이의 유도체가 전처리된 것을 특징으로 하는, 생존율이 향상된 줄기세포에 관한 것이다.

본 발명은 다른 관점에서, 줄기세포에 에스트라디올, 이의 아날로그, 또는 이의 유도체를 전처리하는 단계를 포함하는, 생존율이 향상된 줄기세포의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, "줄기세포"란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 서로 다른 종류의 세포로 분화하는 능력을 가지는 세포를 의미한다.

본 발명에 있어서, "아날로그"란 에스트라디올과 동일한 생체 내의 조절 기능을 보유한 물질을 말한다.

본 발명에 있어서, "유도체"란 에스트라디올의 일부를 화학적으로 변화시켜 얻어지는 유사한 화합물을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 에스트라디올, 이의 아날로그, 또는 이의 유도체가 에스트로겐 수용체를 활성화하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 활성화된 에스트로겐 수용체가 Nrf2(nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2)를 과발현시키는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 활성화된 에스트로겐 수용체가 Sirt3(NAD⁺-dependent mitochondrial deacetylase)를 과발현시키는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, Nrf2가 MnSOD(manganese superoxide dismutase)의 활성을 증가시키는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, Sirt3가 MnSOD의 활성을 증가시키는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 미토콘드리아 활성산소종이 감소된 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 줄기세포가 중간엽 줄기세포, 더욱 구체적으로 제대혈 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, "중간엽 줄기세포"란 골, 연골, 지방, 골수간질, 근육, 신경 등으로 분화될 수 있는 미분화된 줄기세포를 의미하는데, 성인에서는 일반적으로 골수에 머물러 있지만 제대혈, 말초혈액, 기타 조직 등에도 존재하는 것을 의미한다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 줄기세포 또는 상기 줄기세포로부터 분화된 세포를 포함하는 당뇨병 및 이와 관련된 질병의 예방 또는 치료를 위한 세포치료제 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, "세포치료제"란 개체로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로, 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종 또는 이종세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 이러한 세포가 질병의 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 질병은 당뇨병 외에 고농도 포도당에 의해서 발생하는 질병으로, 고혈압, 고혈당증, 고인슐린혈증, 심혈관 질환, 심장 질환, 동맥경화증, 비만, 대사증후군, 인슐린 내성, 다낭성 난소증, 당뇨성 신장병, 사구체 신염, 사구체 경화증 및 당뇨 합병증으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 세포치료제 조성물은 폐경기 여성을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 세포치료제 조성물은 총 중량에 대하여 상기 줄기세포 또는 상기 줄기세포로부터 분화된 세포를 바람직하게는 0.01 내지 99.9 중량%, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 99 중량%로 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 세포치료제 조성물은 세포치료제 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 추가로 포함할 수 있다

상기 세포치료제 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 이에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 미정질셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

상기 세포치료제 조성물을 제제화할 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 적어도 면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 상기 약학적 조성물의 경구투여를 위한, 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 세포치료제 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 조성물은 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 1 mg/kg 내지 1 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다.

상기 세포치료제 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 통상의 방법에 의할 수 있고, 일 예로 경구 및 직장 또는 정맥등의 방법을 통하여 투여 할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 줄기세포 또는 상기 세포치료제 조성물을 당뇨병 및 이와 관련된 질병에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 당뇨병 및 이와 관련된 질병의 치료방법에 관한 것이다.

[실시예]

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

실시예 1: E2가 인간 제대혈 중간엽 줄기세포 내 고포도당에 의해 유도되는 자가소화 및 세포 사멸에 미치는 영향의 확인

인간 제대혈 중간엽 줄기세포(hUCB-MSC) 내 자기소화 및 세포 사멸에 대한 고포도당 효과를 확인하기 위하여, 세포를 0 내지 72 시간의 다양한 범위의 시간 동안 고포도당 조건 하에서 배양하였다. 고포도당은 48시간에 Beclin1 및 LC3-II를 현저히 향상시킨 반면, p62 발현은 48시간 이후 점차 감소하였다(도 2). 또한, 세포 생존능은 고포도당 조건 하에서 시간에 의존적으로 감소하였다(도 3). H₂O₂-유도 세포 사멸과 관련된, Atg5는 자가포식소체를 형성하는 자가소화-관련 유전자이다(Chen, Y., et al., Oxidative stress induces autophagic cell death independent of apoptosis in transformed and cancer cells. Cell Death Differ, 2008. 15(1): p. 171-82). 고포도당은 Atg5에 대한 siRNA의 형질주입에 따라 증가되는, UCB-MSC 생존능을 감소시켰다(도 4). 또한, hUCB-MSC 내 자가소화에 대한 E2의 효과를 확인하기 위하여, 자가소화-관련 단백질을 웨스턴 블롯으로 확인하였다. 고포도당은 Beclin1 및 LC3-II/LC3-I 비율을 증가시킨 반면, p62는 감소하였는데, 이는 E2-전처리 (10 nM)된 고포도당에 의해 회복되었다(도 5). 이러한 결과에 일관되게, 면역형광 염색 결과는 고포도당-유도 LC3 반점이 E2-전처리된 고포도당에 의해 감소된다는 것을 확인하였다. 게다가, 고포도당-감소 p62는 E2-전처리된 고포도당에 의해 회복되었다(도 6). 고포도당 조건 하에서 세포 생존능에 대한 E2의 역할을 평가하기 위하여, 세포 생존능 분석을 수행하였다. 고포도당은 hUCB-MSC 생존능 감소를 유도하였다. 반대로, 고포도당-감소 세포 생존능은 E2-전처리된 고포도당에 의해 현저히 증가하였다 (도7). 종합하면, 이러한 결과는 E2가 고포도당-매개 자가소화 및 세포 생존능에 보호적인 영향을 미친다는 것을 나타낸다.

실시예 2: E2가 포도당 조건 하에서 인간 제대혈 중간엽 줄기세포 내 미토콘드리아 활성산소종 생성에 미치는 영향의 확인

hUCB-MSC 내 활성산소종(ROS) 생성에 대한 고포도당의 효과를 조사하기 위하여, ROS 생성을 DCF-DA (10 μM, ThermoFisher Scienctific, cat# D399)를 이용하여 조사하였다. ROS 생성은 시간에 의존적으로 증가하였다(도 8). hUCB-MSC 내 ROS 생성에 대한 E2 효과를 조사하기 위하여, E2를 전처리 한 후 ROS 생성을 확인하였다. 고포도당에 의해 증가한 ROS는 E2-전처리 된 고포도당에 의해 유의적으로 감소하였다 (도 9). 세포질, 미토콘드리아 및 세포막에 대한 고포도당 조건에서 ROS의 효과를 조사하기 위하여, hUCB-MSC에 NAC (1 mM, Sigma-Aldrich, cat# A9165), 미토템포 (MitoTempo, 20 μM, Enzo, cat# ALX-430-150-M005) 및 Vas2870 (10 μM, Sigma-Aldrich, cat# SML0273)을 30분간 전처리하였다. 고포도당-유도 ROS는 NAC 및 미토템포에 의해 차단되었다. 그러나, Vas2870은 고포도당 조건 하에서 ROS 생성에 영향을 미치지 않았다(도 10). 이는 고포도당-유도 ROS 생성은 주로 hUCB-MSC 내 세포질 및 미토콘드리아에서 일어난다는 것을 의미한다. mtROS(미토콘드리아 활성산소종)에 의한 자가소화 유도를 확인하기 위하여, Beclin1, LC3 및 p62의 발현을 확인하였다. Beclin1 및 LC3-II의 단백질 수준은 고포도당 조건 하에서 미토템포 전처리에 의해 감소하였다. 반대로, 고포도당에 의해 감소된 p62는 미토템포 전처리에 의해 증가하였다(도 11). 고포도당-유도 mtROS 생성에 대한 E2의 효과를 확인하기 위하여, hUCB-MSC를 미토트래커 그린(MitoTracker Green, Invitrogen, cat# M7514) 및 미토삭스 레드(MitoSox Red, Invitrogen, cat# M36008)로 염색하였다. E2는 hUCB-MSC 내에서 고포당에 의해 생성된 미토삭스 레드를 효율적으로 감소시켰다(도 12 및 13). 이러한 결과는 고포도당에 의해 유도된 mtROS를 통한 자가소화 세포 사멸이 E2 처리에 의해 감소한다는 것을 의미한다.

실시예 3: 인간 제대혈 중간엽 줄기세포에서 Nrf2 및 Sirt3의 발현에 대한 에스트로겐 수용체(ERα)의 관여 확인

고포도당 조건 하에서 에스트라디올(E2)에 의한 에스트로겐 수용체(ER)의 효과를 평가하기 위하여, 고포도당과 함께 E2를 전처리한 후, 핵 분획(fractionation)을 수행하였다. ERα는 아무것도 처리하지 않은 중간엽 줄기세포 (대조군) 또는 고포도당만 단독으로 처리한 중간엽 줄기세포와 비교할 때 E2-전처리된 고포도당 핵 내에 매우 풍부하였다(도 14). ERα 조절에 의한 핵 내 고포도당-감소 Nrf2의 역할을 확인하기 위하여, ERα siRNA 형질주입을 수행하였다. 핵 내의 Nrf2의 수준은 고포도당에 의해 감소하였고, ERα siRNA-형질주입 hUCB-MSC는 고포도당 조건 하에서 핵 내의 Nrf2 수준이 감소하였다(도 15). 또한 ERα 조절에 의한 Sirt3의 역할을 확인하기 위하여, ERα siRNA 형질주입 후 Sirt3 발현을 확인하였다. NT siRNA-형질주입 hUCB-MSC는 NT siRNA-형질주입 세포와 비교할 때 고포도당 조건에서 Sirt3 발현을 감소시켰다. 게다가, ERα siRNA 형질주입은 고포도당 NT siRNA-형질주입 hUCB-MSC 보다 많이 Sirt3 발현을 감소시켰다(도 16).

실시예 4: 고포도당 조건 하에서 인간 제대혈 중간엽 줄기세포 내 Sirt3 및 Nrf2 발현에 대한 에스트로겐 수용체(ERα)에 의한 에스트라디올의 영향의 확인

고포도당 조건 하에서, Nrf2 siRNA 형질전환 된 hUCB-MSC에서 NT siRNA-형질주입 세포와 비교할 때, ROS levels이 유의적으로 증가하였다(도 17). 따라서 고포도당에 의한 Keap1과 핵 내의 Nrf2 발현을 0 시간에서 72 시간까지 다양한 범위의 시간 동안 고포도당 조건 하에서 배양하였다. 72시간 동안의 고포도당 처리는 핵 Nrf2의 발현을 감소시킨 반면, 전체 세포 용해물 내 Keap1의 발현 수준을 증가시켰다(도 18). 또한, Nrf2의 핵 전좌는 72시간 동안의 고포도당 처리에 의해 억제되었다(도 19). 그러나, E2 전처리된 고포도당은 고포도당 단독 처리 된 세포와 비교했을 때 핵 Nrf2 수준을 회복시켰다(도 20). 이러한 결과에 일관되게, 면역형광 염색 결과는 세포질에 존재하는 Nrf2가 E2-전처리 고포도당 조건에서 핵 주위에 축적되고 핵으로 전좌되나, 고포도당 단독 처리시 핵 내 Nrf2 손실이 나타났다(도 21).

실시예 5: 고포도당 조건 하에서 인간 제대혈 중간엽 줄기세포 내 Sirt3 의존 MnSOD에 대한 에스트라디올의 영향의 확인

MnSOD가 MnSOD의 라이신-68 잔기가 아세틸화될 때 활성화되므로, MnSOD 아세틸화 수준을 확인하기 위하여 라이신 69에서 아세틸화된 MnSOD(Ac-K68-MnSOD)를 검출하였다. 고포도당은 시간에 의존적으로 MnSOD 아세틸화를 증가시키는 반면, MnSOD 발현 수준은 고포도당 조건 하에서 감소하였다(도 22). Sirt3, 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드 (NAD+)-의존적 미토콘드리아 탈아세틸화효소는 고포도당/당뇨병-유도 ROS 생성의 조절에 필수적인 역할을 한다(Zhang, B., et al., SIRT3 overexpression antagonizes high glucose accelerated cellular senescence in human diploid fibroblasts via the SIRT3-FOXO1 signaling pathway. Age (Dordr), 2013. 35(6): p. 2237-53; Jing, E., et al., Sirtuin-3 (Sirt3) regulates skeletal muscle metabolism and insulin signaling via altered mitochondrial oxidation and reactive oxygen species production. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011. 108(35): p. 14608-13). Sirt3가 고포도당 조건 하에서 hUCB-MSC에 관여하는지 확인하기 위하여, Sirt3 단백질 특이적 항체로 웨스턴 블롯을 수행하였다. Sirt3의 발현 수준은 72시간에 고포도당 처리에 의해 감소하였다(도 23). 또한, Sirt3는 MnSOD를 직접 탈아세틸화하는데, 이는 그 항산화 활성을 촉진한다는 것을 나타낸다(Qiu, X., et al., Calorie restriction reduces oxidative stress by SIRT3-mediated SOD2 activation. Cell Metab, 2010. 12(6): p. 662-7). 따라서, hUCB-MSC에 Sirt3 siRNA 형질주입을 수행하여 MnSOD의 아세틸화를 확인하였다. Sirt3 녹아웃은 고포도당 조건 하에서 MnSOD 아세틸화를 유도하였는데(도 24), 이는 Sirt3에 의하여 MnSOD가 활성화 되었다는 것을 의미한다. 또한, 고포도당 조건 하에서, MnSOD 녹아웃은 NT siRNA-형질주입한 hUCB-MSC와 비교할 때 ROS 수준이 현저히 증가하였다(도 25). Sirt3 발현에 대한 E2의 효과를 증명하기 위하여, 웨스턴 블롯을 수행하였다. 고포도당에 의해 유도된 Sirt3 억제는 E2 전처리된 고포도당에 의해 역전되었다 (도 26). 또한, 면역형광 염색 결과는 hUCB-MSC가 고포도당 처리되었을 때 Sirt3가 감소하며, 이러한 효과는 E2 전처리된 고포도당에 의해 역전된다는 것을 나타낸다(도 27). SOD(superoxide dismutase) 활성에 대한 E2의 보호적 역할을 증명하기 위하여, SOD 활성 분석을 수행하였다. SOD 활성 수준은 아무것도 처리되지 않은 hUCB-MSC와 비교할 때 고포도당-처리된 hUCB-MSC에서 현저히 감소하였고, E2-전처리된 고포도당은 고포도당 단독과 비교할 때 SOD 활성이 회복되었다(도 28).

실시예 6: 쥐 피부 상처 치료 모델에서 에스트로겐 수용체(ERα) 침묵 인간 제대혈 중간엽 줄기세포 내 에스트라디올의 역할

고포도당 조건 하에서 hUCB-MSC 내 mtROS-유도 자가소화 세포 사멸에 대한 E2의 보호적 효과를 발견하였다. 따라서, E2 처리가 생체 내 난소 적출된 당뇨병 쥐 모델의 상처 치료에 영향을 미치는 E2의 기능적 역할을 조사하였다. E2 처리가 생체 내 난소 적출 된 (OVX) 당뇨병 마우스 모델에서 상처 치유에 영향을 줄 수 있는지 조사하였다. 7주된 암컷 마우스에 당뇨병을 유발하기 위하여 Streptozotocin (STZ; 180 mg/kg)를 주사하였다. STZ 주사 후 4일 이내에 212.2 mg/dL의 평균 혈당을 나타냈다. STZ 주사 후 8일째의 평균 혈당은 316 mg/dL 이었다 (도 29). 순환하는 E2의 효과를 확인하기 위해 모든 생쥐에서 자궁 무게와 혈청 E2를 측정하였다. 자궁의 무게는 난소를 적출한 모든 그룹에서 유의적으로 감소하였고, (도 30). 혈청 E2 수치는 모든 OVX 마우스에 E2 를 주사 한 그룹과 비교할 때 OVX 그룹에서 더 낮았다 (도 31).

난소 적출 된 당뇨 마우스의 상처 부위에 hUCB-MSC, hUCB-MSC + E2, ERα siRNA로 형질주입된 hUCB-MSC + E2, ERα siRNA로 형질주입된 hUCB-MSC를 이식하였다. OVX+STZ 군에서 E2로 처리하였을 때 상처 치료 효과가 더 좋을 것이라고 예상하였으나, 9일 차에 OVX + STZ 군과 비교했을 때 유효한 차이를 나타내지 않았다 (P>0.05). 흥미롭게도, OVX + STZ + hMSC + E2 내 상처 크기는 9일 차에 OVX + STZ + hMSC 군 보다 현저히 줄어들었다. 반면, 상처 치료 효과는 OVX + STZ + hMSC + E2 군과 비교할 때, OVX + STZ + ERα siRNA + MSC + E2에서 현저히 감소하였다. OVX+STZ 군은 상처를 낸 후 9일 차에 OVX + STZ 군에서 상처 크기가 가장 큰 것을 확인할 수 있었다(도 32). 10일 차에 상처 조직의 조직학적 시험은 OVX + STZ + NT siRNA + MSC 군의 상처와 비교할 때, 상처 부위가 OVX + STZ + E2 + NT siRNA + MSC에 의해 육아 조직으로 거의 채워졌음을 나타내었다(도 33). 10일 차에 생체 내 이식된 hUCB-MSC를 추적하기 위하여, 상처 조직을 항-인간 핵 항원(HNA) 항체로 염색하였다. 조직을 면역 염색한 결과 OVX + STZ + NT siRNA + MSC + E2 군에서 많은 HNA-양성 세포를 나타낸 반면, Sham(난소 절제술 전 단계까지 시행한 군) / OVX / OVX+STZ / OVX + STZ + E2 군에서는 HNA-양성 세포가 발견되지 않았다(도 34). OVX + STZ + NT siRNA + MSC 군과 비교할 때, OVX + STZ + NT siRNA + MSC + E2 군에서, 두꺼운 혈관과 혈관 가지가 생성된 것이 관찰되었다. 대조적으로, OVX + STZ + NT siRNA + MSC + E2 군과 비교할 때, OVX + STZ + ERα siRNA + E2 군에서 혈관 생성이 감소된 것이 관찰되었다(도 35).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

에스트라디올, 이의 아날로그, 또는 이의 유도체를 포함하는 줄기세포의 생존율 증가용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 에스트라디올, 이의 아날로그, 또는 이의 유도체가 에스트로겐 수용체를 활성화하는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 생존율 증가용 조성물.
제2항에 있어서, 활성화된 에스트로겐 수용체가 Nrf2(nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2)를 과발현시키는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 생존율 증가용 조성물.
제2항에 있어서, 활성화된 에스트로겐 수용체가 Sirt3(NAD⁺-dependent mitochondrial deacetylase)를 과발현시키는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 생존율 증가용 조성물.
제3항에 있어서, Nrf2가 MnSOD(manganese superoxide dismutase)의 활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 생존율 증가용 조성물.
제4항에 있어서, Sirt3가 MnSOD의 활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 생존율 증가용 조성물.
제1항에 있어서, 미토콘드리아 활성산소종이 감소된 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 생존율 증가용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 줄기세포가 제대혈 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 생존율 증가용 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 줄기세포의 생존율 증가용 조성물; 및
줄기세포 또는 상기 줄기세포로부터 분화된 세포:를 포함하는 당뇨병 및 이와 관련된 질병의 예방 또는 치료를 위한 세포치료제 조성물.
제9항에 있어서, 상기 질병은 고혈압, 고혈당증, 고인슐린혈증, 심혈관 질환, 심장 질환, 동맥경화증, 비만, 대사증후군, 인슐린 내성, 다낭성 난소증, 당뇨성 신장병, 사구체 신염, 사구체 경화증 및 당뇨 합병증으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 세포치료제 조성물.
제9항에 있어서, 상기 세포치료제는 폐경기 여성을 대상으로 하는 것을 특징으로 하는, 세포치료제 조성물.
줄기세포에 에스트라디올, 이의 아날로그, 또는 이의 유도체를 전처리하는 단계를 포함하는, 줄기세포의 생존율을 증가시키는 방법.
제12항에 있어서, 상기 에스트라디올, 이의 아날로그, 또는 이의 유도체가 에스트로겐 수용체를 활성화하는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 생존율을 증가시키는 방법.
제13항에 있어서, 활성화된 에스트로겐 수용체가 Nrf2(nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2)를 과발현시키는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 생존율을 증가시키는 방법.
제13항에 있어서, 활성화된 에스트로겐 수용체가 Sirt3(NAD⁺-dependent mitochondrial deacetylase)를 과발현시키는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 생존율을 증가시키는 방법.
제14항에 있어서, Nrf2가 MnSOD(manganese superoxide dismutase)의 활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 생존율을 증가시키는 방법.
제15항에 있어서, Sirt3가 MnSOD의 활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 생존율을 증가시키는 방법.
제12항에 있어서, 미토콘드리아 활성산소종을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 생존율을 증가시키는 방법.
제12항에 있어서, 상기 줄기세포가 제대혈 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 생존율을 증가시키는 방법.