KR20010093825A - 신규의 핵수용체 리간드 - Google Patents

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KR20010093825A
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타무라가쿠조
안도쿠니오
마가에준지
우치다타카후미
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추후기재
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Abstract

지용성 항생제로 널리 알려진 아스코클로린과 그의 유사체가 레티노이드 X 수용체의 리간드로서 작용하여, 생체내에서 레티노이드의 다른 부작용 없이 혈청 단백질의 아미노기와 반응하여 시프 염기를 형성한다는 것이 새로이 밝혀졌다. 아스코클로린과 그의 유사체는 레티노이드 X 수용체 리간드-의존적 유전자 전사 조절에 의해 완화될 수 있는 질병 또는 상태(예를 들어, 인슐린 내성의 발현에 의해 발생하는 질병들, 고혈압증, 뇌혈관계 질병들, 류마티스성 관절염, 자가면역질병, 칼슘대사장애, 당뇨병 합병증, 동맥경화 등)를 치료 및/또는 예방하는데에 사용될 수 있다. 또한, 이들 화합물은 췌장의 랑게르한스섬 β-세포의 변성 및/또는 괴사를 억제하여 이들 세포가 인슐린 생산능을 유지할 수 있게 하는데에도 사용될 수 있다.

Description

신규의 핵수용체 리간드{NOVEL LIGANDS OF NUCLEAR RECEPTOR}
본 발명에 따른 약제조성물의 사용에 의하여 치료 및/또는 예방될 수 있는 질병들은 생활양식에 관련된 질병이다. 생활양식에 관련된 질병의 치료의 관점에서 보면, 생활양식에 관련된 질병들의 발병의 병인이 되는 여러 가지 맥관성 병변(vascular lesions)의 치료를 위한 약품개발이 시급하다. 맥관성 병변이 있을 때 자주 발생하는 국소빈혈성 심장병(ischemic heart disease)은 관상경화증(coronary sclerosis)으로도 불린다. 전세계 전체 사망원인 중 거의 50%가 이 병에 기인되는 것으로 생각된다. 국소빈혈성 심장병은 대부분의 선진국에서 주요 사망 원인이며, 일본에서도 두번째로 큰 사망원인이다. 더욱이, 국소빈혈성 심장병은 개발국가들에서도 상당히 빠르게 증가할 것으로 예상된다. 국소빈혈성 심장병의 주원인들에는 유전적 요인들, 식습관, 스트레스, 당뇨병과 고혈압이 포함되는 것으로 보인다. 국소빈혈성 심장병은 식습관을 포함한 생활양식에 아주 밀접하게 관련된 것으로 알려져 있다. 고칼리 식품의 과도한 섭취에 의하여 유발된 과지방혈증(hyperlipemia)과 과인슐린증(hyperinulinemia)은 동맥 벽상에 콜레스테롤이 풍부한 저밀도의 지방단백질(low density lipoproteins)의 침전을 촉진한다. 첨전된 저밀도 지방단백질의 변성(degeneration)은 동맥벽의 손상을 야기한다. 그러면 백혈구들은 동맥벽의 손상된 부분에 작용하여 병변을 치료하기 위하여 침투하게 되고, 결과적으로 만성염증을 야기시킨다. 따라서, 동맥경화증의 매카니즘은 다음과 같을 것으로 생각된다: 동맥벽의 손상에 대응하여, 손상를 치료하고자 하는 백혈구들이 동맥벽을 두껍게 하는 효과를 갖는 과도한 염증을 야기시킴으로써, 결과적으로 경화 병변으로 되는 것이다.
국소빈혈성 심장병을 예방하기 위한 공지된 약제들 중 일반적인 예들에는 히드록시메틸 글루타릴-CoA(HMG-CoA) 환원효소 억제제들이 있다. 콜레스테롤의 생합성에서 속도결정단계로서 메바론산의 생합성을 억제시키는 이 HMG-CoA 환원효소 억제제들은, 간에서 합성되는 콜레스테롤의 양을 감소시켜 간에서 합성되는 저밀도 지방단백질내의 콜레스테롤 함량을 낮게 하여, 혈청내로 방출된다. 다시말하면, 이 약품들의 주기능은 콜레스테롤의 생합성을 억제시키고 혈청내에서 콜레스테롤의 함량을 낮추는데 있으며, 이에 따라서 농도 의존적으로 혈청으로부터 동맥벽에 결착되는 저밀도 지방단백질을 감소시킨다. 즉, 이 약제들은 단순히 간접적이고 예방적 효과만을 미친다. 이 HMG-CoA 환원효소 억제제들은 동맥벽내에서 마아크로파아지와 림프구들이 참여하여 동맥벽을 두텁게 하는 만성염증과 연관된 경화 병변에는 아무런 영향을 미치지 않는다. 따라서 동맥의 만성염증을 치료하기 위한 어떤 직접적 치료 효과를 가져올 수는 없다. 동맥경화증을 위한 이상적인 치료제와/또는 예방적치료제는 혈청 콜레스테롤 수준을 낮추는 효과를 보여주는 동시에, 동맥벽상에 콜레스테롤의 침전에 의해 유발된 만성염증에 대한 치료 및/또는 예방적 효과를 보여주는 약품이다. 이런 약품이 만약 존재한다면 국소빈혈성 심장병을 위하여 이상적인 치료제 및/또는 예방적 치료제로서 역할을 할 수 있으리라고 기대 된다.
관상동맥과 비슷하게, 뇌동맥에도 자주 병변이 발생한다. 뇌혈관 병변이 진행될 때, 뇌내출혈 또는 뇌경색증과 같은 뇌혈관 병변이 유발된다. 일단 뇌혈관 병변이 발생하면, 사망을 피할 수 있다하더라도 운동장애 또는 지능장애와 같은 심각한 결과를 자주 초래한다. 인구가 노령화되가고 있는 사회에서, 병든 사람들 또는 노인성 치매를 앓는 사람들의 증가는 심각한 사회적 문제를 야기시키고, 따라서 의학적 비용의 사회적 부담을 경감시키는 견지에서도 또한 이 문제들을 예방하는 것이 시급하다. 일본에서 뇌혈관 치매(즉, 뇌혈관 병변에 기인된 뇌의 부분적 퇴화 및/또는 괴사)에 의해 야기된 치매을 앓는 사람들의 숫자는 전체 치매를 앓는 사람들 수의 거의 50%에 이른다.
관상동맥과는 상이하게, 뇌동맥의 표면은 접촉면상에서 서로 밀접히 겹쳐진 내피 세포들로서 코팅되어 있다. 이 코팅된 상태는 밀착접합(tight junction)으로 불리워진다. 뇌동맥의 내피에서, 내피 세포들은 어떠한 공소없이 밀접하게 배열된다. 따라서, 저밀도 지방단백질은 심장에서 처럼 동맥벽에 결착되지 않는다. 바꿔말하면, 콜레스테롤은 뇌동맥내에서는 동맥경화증을 유발시키지 않는다. 그러나, 동맥이 고혈압 때문에 확장되고, 뇌동맥에 손상이 야기될 때에는 혈장 성분들이 동맥벽을 침투할 수 있다. 이러한 손상에 대응하여, 백혈구가 동맥벽을 침투하고, 심장내의 관상동맥의 경우에서와 같이 치료반응은 과도하게 된다. 결과적으로, 뇌동맥벽은 두터워지고, 그에 따라 혈액순환 장애가 야기된다; 또는, 동맥벽은 만성염증의 결과로서 연약하게 되고, 혈압을 지탱하지 못하므로 동맥류(aneurysm)가 생긴다. 동맥류가 파손될 때, 출혈 즉, 뇌일혈(cerebral stroke)이 발생한다. 따라서, 뇌혈관 병변은, 관상 동맥경화증과 비슷하게 동맥내의 작은 상처를 치료하기 위해 대응하는 백혈구의 침투에 의하여 유발된 만성염증으로부터 유래하는 것으로 볼 수 있다.
뇌혈관 병변을 예방하기 위해서는 저혈압 약들이 배타적으로 사용되어 왔다. 이 저혈압 약들의 효과는 과도한 혈압으로부터 혈관을 보호하기 위하여 혈압을 강하므로써 혈관의 손상을 막는 데 있다. 바꿔 말하면, 저혈압 약들은 뇌혈관의 (자연적) 치료의 결과로서 생기는 부정적 효과들을 회피하기 위한 예방적 처치로서 사용된다. 일본에서는 뇌혈관 이완약으로 알려진 뇌혈관 치매증을 위한 치료제로서의 카테고리가 있으며, idebenone, bifemelane hydrochloride, indeloxazine hydrochloride, nicergoline 및 propentofylline과 같은 뇌혈관 이완약을 사용하는 시술이 있었다. 그러나, 임상적 재평가 테스트 결과, 이 약제들은 위약이 뇌혈관 병변의 부정적인 결과에 미치는 치료효과와 별다른 차이를 보여주지 못한다는 것이 분명해졌다. 따라서, 이 약제들은 더 이상 뇌혈관 병변의 부정적 결과의 치료를 위한 치료용으로 제시되지 않는다. 따라서, 현재는 뇌혈관 병변의 부정적인 결과에 대한 치료제는 존재하지 않는다고 할 수 있다. 뇌동맥의 만성 염증에 대하여 치료효과 뿐만 아니라 저혈압효과를 갖는 약제가, 만약 존재한다면 뇌혈관 병변을 위한이상적인 치료제로서 역할을 할 것으로 기대된다.
위에서 논의한 바와 같이, 동맥경화증과 동맥류와 같은 혈관 병변들은 동맥 손상의 치료에 의해 유발된다는 것이 알려졌다. 동맥경화증은 좁혀진 동맥이 여기에 기구(balloon) 또는 스텐트를 삽입시켜서 확대가 되는 경우에, 또는 숙주의 T림프구가 이식된 기관의 동맥내에서 존재하는 이소티겐(isoantigen)에 대한 거부반응을 일으키는 경우에 동맥벽의 손상에 의하여 야기된다.; 이외에도, 퇴화된 저밀도 지방단백질과 같은 해로운 퇴화된 약제들에 의한 화학적 자극 또는 고혈압의 물리적 자극하에서 동맥벽의 손상에 의해 야기된다.
동맥경화증의 원인이 되는 물리적인 요인들의 예로서는, 관상동맥의 좁혀진 부분(예, 경피 엔지오플라스티(angioplasty))을 확대시키기 위해 관상동맥의 좁혀진 부분으로 기구 또는 스텐트를 삽입하는 치료법이 있다. 그 편리성과 직접적인 효과 때문에, 관상동맥의 좁혀진 내부 공동을 물리적으로 확장하는 이같은 치료법은 1996년 이래로 전세계적으로 매년 1,000,000건의 빈도로 실시되어 왔다. 동맥의 좁혀진 부분의 내부공동은 물리적인 힘을 사용하므로서 직접적으로 확대되기 때문에, 동맥은 손상을 당하며, 결과적으로 이러한 손상에 반응을 잘 일으키는 백혈구이 과도한 치료반응으로 그 부위로 침투하게 된다. 확대된 부분에서의 동맥벽의 비대화(thickening)는 기구 케테터(balloon catheter)로 확대하는 경우에 약 40%의 환자들에게서 6개월내에 일어나는 것으로 알려진 반면에, 스텐트로 확대하는 경우약 20%∼40%의 환자들에게서 6개월내에 재수축이 일어나는 것으로 알려졌다. 재수축이 일어나는 경우에는, 한 차례 더 경피엔지오 플라스티를 실시하거나 생명을 구하기 위하여 관상동맥 바이패스(bypass)를 실시할 필요가 있다. 다시 말하면, 경피 엔지오플라스티가 동맥내 공동을 신속히 확대시키는 데에는 아주 효과적이지만, 아직까지 동맥내 공동의 확대로 인한 혈관손상으로부터 야기되는 동맥경화증를 예방하는 아무런 적절한 방법도 알려지지 않았다.
면역학적 메카니즘에 의하여 야기된 동맥경화증은 장기이식과 연관된 동맥경화증이 대표적이다. 상대적으로 최근에, 시클로스포린(cyclosporin)과 타크로리무스(tacrolimus)와 같은 T 림프구 특이적 면역 억제제들이 개발되었으며, 그에 의하여 장기 이식 후 일년내에 이식된 장기의 급성 거부반응은 거의 완전히 억제될 수 있다. 그러나, 심장, 간, 공팥 또는 심폐의 이식에서는, 이식된 기관들 중 약 60%가 5년 이상 거부반응이 일어나지 않았다. 반대로, 이들 중 약 40%는 만성거부반응(chronic rejection) 현상이 일어난다. 이 현상은 이식 후 1년내에 일어나는 급성 거부반응과 식별될 수 있다. 비록 "만성거부반응"이라는 명칭은 이식된 기관이 면역학적으로 거부된다는 것을 나타내지만, 실제적으로는 동맥경화증에 의해 야기된 순환장애의 결과로서 이식된 장기의 괴사 또는 쇠퇴(drop-off)가 일어나는 조건을 나타내는 것이다. 만성거부반응은 숙주의 림파구에 의해 이식된 기관의 동맥내의 이소안티겐을 인식한 다음 면역학적 공격의 결과로서 발생하는 손상에 의해 유발된다. 그후에, 면역학적 공격에 의해 야기되는 손상에 대응하여 숙주의 백혈구가 손상치료를 위해 반응을 하고, 그에 따라 동맥경화증이 유발된다. 만성거부반응은 최초의 금성거부반응의 강도와 상관관계가 있음이 분명하다. 즉, 급성거부반응이 강하면 뒤이은 5년내에 이식된 기관을 잃게될 위험은 높게 되며, 결과적으로 이식된 기관의 동맥이 더 심한 면역학적 손상을 당하게 될 위험도 증가한다. 그 이유는 동맥경화증이 과도한 치료반응에 의해 유발된다는 점이다. 동맥내의 과도한 만성염증을 조절하는 수단이 개발될 수 있다면, 만성거부반응은 기관이식의 경우에 반으로 줄어들 수 있다. 따라서, 동맥경화증의 발생배경을 지금까지 예시하였다.
본 발명에 따른 약제조성물은 전형적인 대사성 질병인 타잎 I 당뇨병과 타잎 Ⅱ 당뇨병을 치료하는데 목표를 두고 있다. 타잎 Ⅱ 당뇨병은 생활 양식에 관련된 질병이고, 이들은 식습관과 유전적 요인들에 의존하는 비만증에 밀접한 관계가 있다. 대조적으로, 타입 Ⅰ 당뇨병은 인슐린을 생성하는 β세포들이 이자의 랑게르한스섬(Langerhans'islet) β-세포들에 대한 자가면역 반응에 의해 파괴될 때 발생되는, 가용 인슐린의 전체량에 부족이 있을 때 일어나는 질병이다. 따라서, 규칙적인 인슐린 주사제의 투여는 이 질병을 지닌 환자들의 생존을 보장하는데 필요하다. 비록 위에서 설명한 이 질병들이 원인에 있어 서로 다르지만, 이 질병이 장기간 존재시 일어나는 당뇨병의 합병증은 양쪽 타잎 모두에서 공통적이다. 식이요법과 운동치료법은 말초성 인슐린 내성에 의해 야기되는 타잎 Ⅱ 당뇨병이 치료되는 주요한 치료방법이며, 약물치료는 단지 보조적으로 사용된다. 약물 치료로서, 췌장의 랑게프한스섬으로부터 인슐린 분비를 촉진하는 설포닐우레아 제제들과, 말초조직내에서 글루코오스 이용을 촉진시키는 비구아니이드(biguanide) 제제들이 사용된다. 그러나, 질병 발생의 원인이 되는 말초성 인슐린 내성을 활성화할 수 있는 약제는 아직까지 없다. 최근에 개발된 티아졸리딘디디이앤(thiazolidinedionediene: TZD) 화합물이 말초성 인슈린 내성을 활성화시키는 능력을 갖는 약제로서 주목을 끌었다.
지용성 호르몬 및 비타민의 수용체로 알려진 집합적으로 핵수용체 수퍼패밀리(nuclear receptor superfamily)로 불리워지는 수십개의 수용체들이 핵에서 발견되었다. 합성 유기 TZD 화합물의 메케니즘의 기능을 연구하는 과정에서 다음과 같은 사실이 발견되었다.: (1) 이 화합물의 목표조직은 지방 조직이며, (2) 이들은 핵수용체 수퍼패밀리의 일원인 PPARγ를 특이적으로 활성화시키는 아고니스트(agonist)이고, (3) 이들은 세포배양 수준에서 특정전처리된(conditioned) 어떤 섬유아세포를 지방세포로 분화시킨다. TZD에 의하여 활성화된 다음에, PPARγ는 역시 핵수용체인 레티노이드 X수용체(RXR)와 함께 이량체(헤테로다이머)를 만들고, 염색체의 특정부위(호르몬 인지부위)에 결합하고, 그에 따라 특정 유전자의 전사를 조절한다. 세포 및 조직 수준에서의 실험에 기초하여, 이 헤테로다이머에 의한 전사조절은 말초성 인슐린 민감도의 강화에 기여하는 것으로 알려졌다. 다시 말하면, TZD는 지방 조직 도우즈(dose) 의존적으로 PPARγ를 활성화시켜 당뇨병에서 대사장애를 개선시킨다. 유전자상에서 작용하고, 유전자 시그널의 발현을 조절하는 약제가 알려지지 않았으므로, TZD는 아주 높이 평가될 것으로 기대가 된다.
여러 가지의 리간드(예를 들면, 지방산, 프로스타글란딘, 비스테로이드성 진통제/소염제)가 PPARγ수용체에 결합하기 때문에, TZD의 PPARγ수용체에 대한 특이성은 반드시 높은 것은 아니다. 기존의 TZD 화합물은 PPARα를 또한 활성화시키는 특징적 기능을 갖져 포유류 간세포성 퍼옥시솜(peroxisone)을 증식시키므로써 간이상비대(hepatic hypertrophy)를 야기시키기 때문에, 이들 TZd 화합물은 간질환(hepatopathy)에 연관이 있을 것으로 여겨졌다. 이들 중에서, TZD 화합물들 중에서 처음으로 실제 용도로 사용되었던 트로글리타존(troglitazone)은 정상적인 복용량으로도 약 2%의 환자에서 간질환을 야기시키고 최악의 경우에 사망을 야기할 수도 있다. 그러므로, 안전의 관점에 이러한 화합물들의 사용에는 상당한 주의를 요한다. PPARγ아고니스트가 널리 말초성 인슐린 내성을 광범위하게 활성화한다면, 이들 아고니스트들은 당뇨병의 대사장애를 개선시킬 뿐만 아니라 당뇨병의 합병증을 치료 및/또는 예방하는 데에도 유용하다는 것이 고려되야만 한다. 그러나, TZD 화합물들에 대한 동물실험과 치료데이타의 결과에 근거해 보면, 인슐린 내성 증후군의 증상과 당뇨병의 합병증은 상당히 개선시킬 것으로 결론지울 수는 없다. 그러므로, 기능의 특이성, 안전 및 유용성을 고려한 TZD 화합물의 개선을 위한 여지가 남아 있다.
반면에, RXR 리간드가 PPARγ와 함께 헤테로다이머를 이루는 것이 타잎 Ⅱ 당뇨병의 대사장애에 어떤 영향을 미칠 것인가 주목을 끌고 있다. 이는 PPARγ가 R XR과 함께 헤테로다이머를 만들어 당뇨병의 발생에 관련된 유전자 시그널의 발현을 조절하기 때문이다. 이 문제에 대한 새로운 방향을 암시하는 첫째 연구는 미국의 리간드 연구자들(Nature 386: 407∼410, 1997)에 의해 보고되었다. 그들 보고서에 따르면, 레티노이드 유도체 LG100268 및 LGD1069는 프로미엘로시스성(promyelocystic) 백혈병과 카포시 육종용 치료제로서 개발 중에 있는 이들은 세포배양과 동물실험들에서 다음과 같은 효과를 보여준다.: (1) 이 유도체들은 RXR 리간드로서 PPARγ와 헤테로다이머를 만들어 유전자 전사를 조절하고, (2) 유전적 비만성 당뇨병에 걸린 쥐 ob/ob 및 db/db에 경구투여되었을 때에, 이들은 인슐린 민감도를 증진시키고, 혈액 글루코오스 농도, 혈청 중성 지방 수준 및 혈청 인슐린 수준을 급격하게 저하시킨다. 또한, 상기 연구자들은 레티노이드 유도체를 각각으로는 어떠한 약제 효과도 보이지 않을 정도의 소량인 TZD 화합물과 조합하여 투여하므로써 상당한 대사 개선 효과를 달성할 수 있어, RXR의 리간드와 PPARγ의 리간드가 생체내에서 상승효과를 보일수 있다는 것을 보고하였다.
상기 연구자들에 의해 보고된 레티노이드 유도체들은 올-트랜스(all-trans)레티노익산(ATRA)의 효과를 증가시키고 부작용을 완화시키기 위하여 합성되었다. 이 유도체들은 카포시 육종과 같은 피부암 및 프로미엘로시스성 백혈병에 대해 효과적인 것으로 알려져 있다. 즉, 이 유도체들은 ATRA 수용체(RAR)에도 결합되고, 레티노이드 활성을 발휘하므로써 기능의 특이면은 적다. 더욱이, 이들 레티노이드 유도체들은 당뇨병을 위한 평행치료제로서 이들을 사용할 수 없게 하는 ATRA에 내재적인 현저한 독성을 갖고 있다. 이러한 문제들이 전혀 없는 RXR-특이적 리간드는 높은 안전성을 가지며, 인슐린 민감도를 증가시키는 상당한 효과를 발휘하므로, 당뇨병과 당뇨병의 합병증을 위한 치료제로서 큰 가능성을 보여주는 약제일 수 있다.
PPARγ 수용체는 타잎 Ⅱ 당뇨병을 위한 치료의 목표인 지방 조직 내에서 뿐만 아니라 비장, 장관 및 부신에서도 다량으로 발현되는 것으로 알려져 있다. 따라서, 이제 연구는 이 기관들에서 발현된 PPARγ의 역할을 결정하는 단계에 있다. 이들 중에서, 림프 세포내에서 발현된 PPARγ의 역할에 관한 두가지의 주목할만한 보고가 최근에 발간되었다(M. Ricote 등, The Peroxisome Proliferator-activated receptor-g is a negative requlator of macrophage activation. Nature 391: 79∼82, 1998: 및 C. Jiang, A.T. Tiang 및 B. Seed. PPARγ agonists inhibit production of monocyte inflammatory cytokines. Nature 391: 82∼86, 1998). 이 연구들은 만성염증의 유발을 시작케하는 활성화된 마크로파아지 내에서 발현된 PPARγ에 초점을 두고 있다. 마크로파아지가 염증 부위로 침투하여 활성화를 시킬 때, 염증성 시토킨이 활발하게 합성된다. 그러나, 그러한 만성염증에 연관된 유전자들의 전사는 활성화된 마크로파아지의 배양액에, PPARγ의 리간드인 비스테로이드성 진통제/소염제를 첨가하므로써 도우즈 의존적으로 억제될 수 있다. 또한, PPARγ의 리간드는 전사촉진 인자 AP-1, STAT와 NF-KB와 부분적으로 경쟁을 하여, 염증성 시토킨 유전자들의 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다. 다시 말하면, 비스테로이드성 진통제/소염제들과 같은 PPARγ의 리간드들은 마크로파아지의 활성화와 연관되어 활발하게 전사된 염증성 시토킨 mRNA(IL-1, TNFα, IL-6 등)의 생산를 감소시키고, 차례로, 이 염증성 시토킨의 제조를 조절한다. 불행하게도 주로 지방에 작용하는 기존의 TZD 화합물은 활성화된 마크로파아지에 의한 염증성 시토킨의 생산은 거의 조절하지 않는다. 따라서, 현단계에서는 이들 TZD 화합물들을 사용한 만성염증의 치료는 불가능하다. 그러나, PPARγ의 리간드에 의한 염증성 시토킨의 조절은 동맥경화증, 당뇨병 합병증 및 류마티스성 관절염과 같은 만성염증의 치료에는 기여할 것으로 여겨진다. 그러나, PPARγ와 함께 헤테로다이머를 만들 수 있으며, 그에 의해 만성염증의 발생에 관련된 유전자 시그널의 발현을 조절할 수 있는 RXR 리간드들에 관련된 연구들은 이루어진 바가 없다.
비스테로이드성 진통제/소염제들의 메카니즘의 기능은 염증부위에서 통증과 팽창을 유발하는 프로스타글란딘의 생산을 억제시키는데 있다고 여겨진다. 그러나, 상기 보고서의 저자들은 염증성 시토킨을 암호화하는 유전자들의 전사 억제는 프로스타글란딘 생합성의 억제뿐만 아니라 매카니즘의 기능과도 관련됨을 암시하고 있다. 비스테로이드성 진통제/소염제들은 류마티스성 관절염에 대하여 효과적이다는 것은 잘 알려져 있다. 비스테로이드성 진통제/소염제들과 비슷하게 만성염증의 치료에 자주 사용되는 당 코르티코이드는 동맥경화증과 류마티스성 관절염의 실험적 모델인 쥐 보조 관절염(rat adjuvant arthritis)에 대하여 치료 및/또는 예방효과를 발휘한다. 그러나, 이 약제들은 소화관 궤양을 높은 빈도로 발생하게 하는 소화관 점액에서의 프로스타글란딘의 생합성을 억제하기 때문에, 연속적으로 장기간 투여될 수 없다. 프로스타글란딘 생합성을 억제하지 않고서, PPARγ의 리간드에 의하여 염증부위에 축적된 활성화된 마이크로파아지에 의한 염증성 시토킨 생산을 억제시키는 것이 가능하다면, 의심할 여지없이 동맥경화증, 당뇨합병증 및 류마티스성 관절염과 같은 만성염증 상황의 치료에 상당한 기여를 할 것이다. 그러나, 현 단계에서는 이러한 가정은 가상적인 것이므로 이의 유용성은 실험적 및 임상적으로 확인될 필요가 있다. PPARγ의 리간드로서 합성된 TZD 화합물들은 염증성 시토킨 생산을 억제하는 데에 약한 억제효과만을 나타내므로, 실질적인 용도가 적다. 비록 TZD가 백색 지방 조직내에서 PPARγ에 강하게 작용하지만, 활성화된 마이크로파아지상에서는 약한 효과만을 보여준다. 그러므로, 기존의 TZD 화합물들은 염증성 시토킨의 생산을 거의 억제할 수 없는 것으로 여겨진다. 더욱이, PPARγ와 함께 헤테로다이머를 형성하는 RXR 리간드가 활성화된 마크로파아지에 어떠한 효과를 미치는지에 대하여는 알려진 바가 전혀 없다. 또한, 지방조직에서 처럼 마크로파아지 내에서도 PPARγ이 RXR과 함께 헤테로다이머를 형성하는지 여부 및 특이적으로 유전자 전사를 조절하는지도 불분명하다. 상기한 바와 같이, 비스테로이드성 진통제/소염제들은 PPARγ의 리간드로서 역할을 하고, 세포배양 수준에서 만성염증의 원인이 되는 시토킨의 생산을 억제하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 염증성 시토킨들의 생산에 미치는 RXR 리간드들의 영향은 공공의 주목을 끌어왔다. 만성염증에 대한 소염제로서 PPARγ와 RXR의 리간드에 초점을 맞추어 집중적인 연구들이 실시될 것이 예측된다.
류마티스성 관절염, 자가면역 질환과 같은 만성 염증을 치료하기 위해서, 급성 염증을 치료하는데 일반적으로 사용되는 비스테로이드성 진통/소염제 또는 슈가 코르티코이드(sugar corticoids)를 사용하고자 하는 시도가 있었다. 즉, 만성 염증에 특효인 치료법은 현재까지 존재하지 않았다고 말할 수 있다. 비스테로이드성 진통/소염제는, 이들 약물이 프로스타글랜딘(prostaglandin)의 생합성을 억제하기 때문에, 장기적으로 사용할 경우에 종종 소화기 계통에 궤양과 같은 바람직하지 못한 부작용을 일으키는 문제가 생기게 된다. 한편으로, 슈가 코르티코이드는, 면역 억제에 따른 감염 질환의 빈발, 당뇨와 같은 신진 대사 장애의 유발 및 약물 투여를 중단하면 투약 개시 이전의 상태에 비해 치료된 상태가 악화되는 현상인 리바운드 현상을 포함한 많은 부작용이 있다. 따라서, 만성 염증에 대한 치료법이 존재함으로 인해 환자들의 삶의 질(QOL)이 현저히 향상되었다고는 말할 수 없다. 이들 약물 요법의 문제와 더불어, 미세혈관의 염증에 의해 발생하는 당뇨병의 합병증도 유의하여야 한다. 당뇨병 합병증은 만성 염증의 범주에 포함되기 때문에, 만성적인 염증을 개선하는데 특효인 약물의 투여에 의해 그러한 합병증이 예방 및/또는 치료될 가능성이 높다. 류머티스성 관절염, 동맥 경화증, 당뇨병 미세혈관내층장애(microangiopathy), 결절성동맥주위염 (periarteritis nodosa) 및 동맥류와 같은 만성 염증질환을 치료하기 위해서는, 바람직하지 못한 부작용이 빈발로 인해 QOL을 악화시키지 않으면서, 만성 염증을 치료할 수 있는 약품을 개발할 필요가 있다.
폐경기 이후의 여성에 있어서는, 칼슘대사 장애가 자주 일어나며, 이 집단군에 있어서는 골다공증이 심각한 문제가 된다. 골다공증은 형태학적으로, 뼈의 어떠한 형태적 변화를 수반하지 않는, 지주(trabecula)의 감소, 하버 튜브(Harbor tube)의 확장 및 피질골(cortical bone)의 희박화를 수반한 골수강(medullary cavity)의 확장을 특징으로 한다. 이러한 병리학적 상태들은 골 흡수(resorption) 및 골 부가(addition)간의 관계의 이상과 관계가 있다. 폐경기 이후의 여성에게서 볼 수 있는 골다공증이 하나의 전형적인 예이다. 일단 골다공증에 걸리게 되면, 골 강도의 현저한 감소로 인하여, 환자들은 약간의 힘에 의해서도 골절을 당할 수 있다. 골다공증의 치료법에는 여성 호르몬, 활성 비타민 D3또는 바이포스파이트 (biphosphite) 약물의 경구 투여 및 칼시토닌(calcitionin)의 주사가 포함된다. 내인성의(endogenous) 활성 비타민 D3의 효율을 강화하는 것이, 골다공증을 예방 및/또는 치료하기 위한 하나의 바람직한 처치가 될 것이다. 그러나, 가능성있는 실마리가 없었기 때문에, 이러한 관점에서 출발한 연구는 아직 없는 상태이다.
발명의 개요
본 발명은, 이미 본 발명자들에 의해 균류(菌類)가 생성하는 지용성 항생물질로서 보고된 바 있는 아스코클로린(ascochlorin) 및 그의 동족체(모두 오르실알데히드 (orcylaldehyde)의 3-위치에 (바람직하게는 약 20개의 탄소원자를 가지는) 터페노이드(terpenoid) 측쇄를 가짐)가 레티노이드 X 수용체의 리간드라는 사실을 새롭게 발견한 것에 의거한 것이다. 특히, 본 발명은 아스코클로린 및 그의 동족체가, 알데히드기를 가짐으로 인해, 시험관 내에서 혈청 단백질의 아미노기와 반응하여 시프 베이스(Schiff base)를 형성하며, 그로 인해 레티노이드류의 부작용을 나타내지 않는다는 사실을 우연히 발견함에 따라 이루어진 것이다.
아스코클로린 및 그의 동족체들은 레티노이드 X 수용체의 리간드이며, 레티노이드 X 수용체 리간드-의존성의 유전자 신호 전사의 제어에 의해 경감될 수 있는 질병이나 질환(예컨대, 인슐린 내성의 발현에 의해 야기되는 질병, 고혈압, 뇌혈관내층장애, 류마티스성 관절염, 자가면역 질환, 칼슘대사 장애, 당뇨병 합병증, 경피 경관강 관상혈관성형술(percutaneous transluminal coronary angioplastry)에 따른 동맥성 재발협착증, 장기 이식 후의 세동맥경화증)을 치료 및/또는 예방하는데 유용하다. 또, 이들 화합물들은 췌장의 랑게르한스섬의 β-세포(Langerhans'islet β-cell)의 변성 및/또는 괴사를 막아, 이들 세포가 인슐린 생성을 지속하도록 하는데 유용하다. 따라서, 본 발명은 이들 화합물을 포함하는 의약 조성물, 이들 화합물을 이용한 치료 및/또는 예방법, 그리고 이들 화합물들의 상기 질병을 치료 및/또는 예방에의 이용을 제공한다.
도면의 간단한 설명
도 1은, 본 발명에 따른 화합물과 혈청 단백질간에 시프 베이스를 형성하는 반응을 설명한 것이다.
도 2는, 화합물-14를 40주간 경구 투여받은 유전적으로 비만인 당뇨병 마우스 C57BL/ksj db/db의 체중, 혈당치, 혈중 인슐린치 및 요당을 나타낸 것이다.
도 3은, 고지방 식사를 공급받은 화이트 래빗의 대동맥의 세동맥경화증을 육안으로 관찰한 것을 나타낸 것이다.
도 4는, 화합물-6의 제1상 임상 시험에 있어서의 공복상태의 혈당치의 변화를 나타낸 것이다.
도 5는, 화합물-6의 제1상 임상 시험에 있어서의 혈청에서의 총콜레스테롤치의 감소를 나타낸 것이다.
도 6은, 화합물-6의 제1상 임상 시험에 있어서의 경계선 고혈압을 가진 환자에의 혈압강하 효과를 나타낸 것이다.
도 7은, 화합물-6의 제1상 임상 시험에 있어서의 고혈압 환자에 대한 혈압강하 효과를 나타낸 것이다.
도 8은, 화합물-6의 제2상 임상 시험에 있어서의 시간의 경과에 따른구갈(hydrodipsia)의 개선을 나타낸 것이다.
도 9는, 래트에 경구 투여된 화합물-1의 혈중 농도를 나타낸 것이다.
도 10은, 소의 혈청에 첨가된 본 발명에 따른 화합물의 유리 형태 화합물의 감소를 나타낸 것이며, 여기서, 채워진 원, 빈 원 및 별표는 각각 화합물-14, 5 및 6을 의미한다.
발명의 개시
본 발명자들은 종래의 기술에 의해 해결할 수 없었던 상기 만성 질병의 치료 및/또는 예방을 위한 효과적인 수단을 찾아내기 위해 연구한 결과, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 아스코클로린 및 그의 동족체 중에서 선택되는 레티노이드 X 수용체의 리간드에 관한 것이다. 나아가, 본 발명은, 아스코클로린 및 그 유사체(즉, 사상균(filamentous fungi)에 의해 생산되는 시클린드로클로린(cyclindrochlorin), 4'-히드록시-5'-히드로아스코클로린, 4'-아세톡시-5'-히드로아스코클로린, 디히드로아스코클로린 및 클로르넥틴(chlornectin)), 오르실알데히드 성분의 2- 및/또는 4-위치의 히드록시기의 수소가 치환된 그들의 유사체 및 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 레티노이드 X 수용체 리간드(RXRLs)에 관한 것이다. 더 나아가 본 발명은, α 레티노이드 X 수용체 리간드와 약제학적으로 허용되는 첨가물을 포함하여 이루어지는, 유전자 신호 전사의 레티노이드 X 수용체 리간드-의존성 조절을 통해 경감될 수 있는 질병 또는 상태의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 조성물에 관한 것이다.
Ⅰ. 아스코클로린(ascochlorin) 및 그의 동족체
여기에서, "아스코클로린 및 그의 동족체"라는 표현에서 사용된 "동족체"라는 용어는, 오르실알데히드의 3-위치에 터페노이드 측쇄가 붙어 있는, 아스코클로린과 유사한 구조를 가지며, 레티노이드 X 수용체의 리간드로서 작용할 수 있는 것을 의미한다. 아스코클로린 및 그의 동족체(이하에서는 간혹 본 발명에 있어서의 화합물들이라고 부른다)의 전형적인 예에는 하기 화합물들이 포함된다:
아스코클로린 및 그 유사체 및 유도체
본 발명자들은 X-선 회절법을 이용하여, 아스코클로린의 완전한 구조가 3-[5-[1(R),2(S),6(S)-트리메틸-3-옥소시클로헥실]-3-메틸-2,4-펜타디에닐]-2,4-디히드록시-5-클로로-6-메틸벤즈알데히드인 것으로 확인하였다.
화학식 (1)의 화합물들에는 하기 화합물들이 포함된다.
표 1: 아스코클로린 및 그 유사체 및 유도체
디히드로아스코클로린 및 그 유사체 및 유도체
화학식 (2)의 화합물들은 하기 화합물들을 포함한다.
표 2: 디히드로아스코클로린 및 그 유사체 및 유도체
실린드로클로린 (화합물 #26)
화합물 #27
6-클로로-5-히드록시-7-메틸-2-[2-(1,2,6-트리메틸-3-옥소시클로헥실)에테닐-8-크로만카르발데히드
화합물 #28
8-클로로-5-히드록시-2,7-디메틸-2-[2-(1,2,6-트리메틸-3-옥소시클로헥실)에테닐-6-크로만카르발데히드
아스코클로린 유사체 및 유도체 (1)
화학식 (6)의 화합물들은 하기 화합물들을 포함한다.
표 3: 아스코클로린 유사체 및 유도체 (1)
* 알킬기: 메틸
** 아실기: 아세틸
아스코클로린 유사체 및 유도체 (2)
화학식 (7)의 화합물들은 하기 화합물들을 포함한다.
표 4: 아스코클로린 유사체 및 유도체 (2)
* 알킬기: 메틸
** 아실기: 아세틸
이들 화합물들의 화학적 구조는, 오르실알데히드 성분에 터페노이드 측쇄가 붙어 있어, 하기와 같이 레티노이드류와 유사한 구조를 형성하는 것을 특징으로 한다.
아스코클로린 all-trans 레티노익산
본 발명의 화합물들은 사상균(fungifilamentous)에 의한 발효를 통해 생성되는 대사 산물 또는 유기합성을 통해 개량된 그들의 유도체들로서 얻을 수 있다.
1960년대 중반 이래, 본 발명자들은 부화된 병아리 배로부터 얻은 초대 섬유아세포 배양균들을 동물성 바이러스로 감염시키고, 그렇게 하여 형성된 플라크의형성을 억제하는 시험 화합물들의 활성을 표지로 사용하여, 지용성의 항바이러스성 항생물질을 스크린한 바 있다. 이 과정에서,Ascochyta viciae균에 의해 생산되는 지용성 항생물질인 아스코클로린이라고 명명된 새로운 항생물질을 발견하였다(J. Antibiotics 21:539-544, 1968). X-선 회절법에 의해 결정된 아스코클로린의 화학적 구조는, 이 물질이 오르실알데히드 성분 및 거기에 붙은 탄소원자 15개를 가진 이소프레노이드(isoprenoid) 사슬로 압축되어 나타났다(Bull. Chem. Soc. Japan 44:2652-2660, 1971). 지금은, 아스코클로린 및 그의 동족체가Ascochyta viciae외의 다른 균들, 예컨대,Nectria coccinea,Fusarium sp.,Cylindocarpon lucidium및Verticillium sp.에 의해서도 생산되는 것으로 보고되어 있다. 실린드로클로린, 4'-히드록시-5'-히드로마스코클로린, 4'-아세톡시-5'-히드로아스코클로린, 디히드로아스코클로린 등은 아스코클로린 생산의 발효에 있어서의 부산물로서 얻어지는 유사체들이다.
본 발명자들은 나아가, 식욕에 대한 아스코클로린의 강한 억제작용이 이들 화합물의 오르실알데히드 성분의 2- 및/또는 4-위치의 히드록시기(들)의 수소를 치환하여 얻어지는 화합물에서 경감된다는 사실을 밝혀 내었다. 이들 유도체들이 본 발명을 수행하기 위한 바람직한 형태에 해당한다. 오르실알데히드 성분의 2- 및/또는 4-위치의 히드록시기(들)는 알킬화 및/또는 아실화되는 것이 바람직하다. 여기서, "알킬화"라는 용어는 다른 언급이 없는 한, 히드록시기의 수소의 알킬기로의 치환을 의미하며, 알킬기라는 용어는, 직쇄상, 환상 또는 분지상의, 포화 일가 탄화수소기를 의미한다. 상기 알킬기에 있어서의 탄소원자의 수는, 치환에 의해 의욕한 효과가 얻어지며, 화합물 본래의 기능이 심각하게 훼손되지 않는 한은 특별히 제한되지는 않지만, 알킬기의 탄소원자수는 1∼10인 것이 바람직하고, 1∼5인 것이 더욱 바람직하다. 여기서, "아실화"라는 용어는, 다른 언급이 없는 한은 히드록시기의 수소를 RCO-기로 치환하는 것을 의미한다. 여기서, R은 지방족 또는 방향족 탄화수소기를 나타낸다. 또, 상기 R에 있어서의 탄소원자의 수는, 치환에 의해 의욕한 효과를 얻을 수 있고, 화합물 본래의 기능이 심각하게 훼손되지 않는 한은 특별히 제한되지는 않지만, R의 탄소원자수는 1∼20인 것이 바람직하고, 1∼10인 것이 더욱 바람직하다.
예컨대, 유기 용매내에서 가열하면서, 아스코클로린을 탄산칼륨 및 요오드화 알킬과 반응시키면, 먼저 4-위치의 히드록시기가 알킬화되고, 요오드화 알킬이 과량으로 존재하는 경우에는, 다시 2-위치의 히드록시기도 알킬화된다. 반면에, 아스코클로린 및 그의 동족체의 오르실알데히드 성분에 있어서는, 4-위치의 히드록시에서만 선택적으로 아실화가 이루어지는 한편, 2-위치의 히드록시기는 알데히드기의 카르보닐기와 분자내 수소결합을 형성하며, 따라서 아실화되지 않는다. 말하자면, 4-O-아세틸아스코클로린으로부터 출발하여, 이를 탄산칼륨의 존재하에서 요오드화 알킬과 반응시킴으로써, 4-O-아세틸-2-O-알킬아스코클로린을 얻을 수 있다는 것이다. 이 생성물을 가성알칼리로 가수분해하여, 2-O-알킬아스코클로린을 얻을 수 있다. 아스코클로린에 비해, 4-O-알킬아스코클로린 및 2-O-알킬아스코클로린은 모두 경구 투약에 의한 낮은 독성과, PXR에 대한 향상된 결합 선택성을 나타낸다. 따라서, 이들 유도체들은 심지어 저농도에서도 효과가 있는 뛰어난 리간드이다.
Ⅱ. 본 발명에 따른 화합물의 작용 및 효과
본 발명에 따른 각 화합물은 레티노이드 X 수용체에 선택적을 결합하여, 유전자 신호 전사를 제어하는 활성을 나타낸다. 즉, 본 발명에 따른 화합물을 가진 레티노이드 X 수용체는, 세포내에서 결합된 후, DNA상의 호르몬감응인자(HRE)에 결합하여 특정 유전자의 전사를 조절하는 각각의 리간드를 가진 핵 수용체와 이량체(다이머)를 형성하는 활성을 나타낸다. 게다가, 본 발명에 따른 화합물은, 하기 실시예에 기재된 방법에 의해, 유전자 신호 전사를 조절하는 활성을 용이하게 분석할 수 있게 해준다. 본 발명에 따른 화합물의 RAR에의 결합능력을 그들의 RXR에의 결합능력과 비교함에 있어, 몇몇 화합물들은 천연 RXR 리간드인 9-cis-레티노익산(9-CRA)보다 RXR에 대해 높은 특이성을 나타낸다는 것은 매우 특징적이다. 리포터로서 작용하는 루시페라제 유전자의 발현과 관련하여, 본 발명에 따른 화합물(즉, 아스코클로린, 4-O-메틸아스코클로린, 2-O-메틸아스코클로린, 4-O-아세틸아스코클로린 등)은, 9-CRA의 피크 농도 농도(10-7)보다 낮지만, 농도범위 5 ×10-7M∼1×10-5M에서 최고 활성을 나타낸다. 본 발명에 따른 화합물은 RAR보다는 RXR에 높은 선택성을 나타낸다.
표 5: 본 발명에 따른 화합물에 의한 유전자 신호 발현 향상
각 수치는, 대조군의 루시페라아제 활성을 1로 하여 나타낸, 당해 화합물의 첨가에 의해 이루어지는 루시페라아제 활성의 향상정도를 의미한다.
다음으로, 병리학적인 상태와 관련하여, 본 발명에 따른 화합물에 의한 유전자 전사의 조절이 어떻게 이루어지는가를 설명한다. 본 발명은 주변 인슐린 내성, 심장 동맥 및 뇌동맥에서 발생하는 다양한 만성 염증, 당뇨병의 합병증 유래의 미세혈관내층장애, 결합 및 주변 조직에서의 만성 염증, 칼슘대사 장애 등을 치료 및/또는 예방하기 위한 신규한 의약 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 화합물은 표적 세포내의 레티노이드 X 수용체에 결합하여, 레티노이드 X 수용체의 파트너로 작용하는 다른 수용체와 함께 헤테로다이머를 형성한 후, 염색체의 호르몬감응인자에 결합한다. 유전자 신호의 전사가 이들 헤테로다이머의 결합에 의해 조절되는 경우, 표적 세포, 조직 및 동물 개체에서의 유전자 신호의 발현이 변화하여, 유전자가 관여하는 병리학적 징후가 억제됨으로써, 병리학적 상태가 개선된다. RXR은 다양한 핵 수용체와 헤테로다이머를 형성하여, 유전자 신호의 발현을 조절한다. 그 중에서도, RXR과 PPARγ, LXR 및 VDR에 의해 형성되는 헤테로다이머가 특히 중요하다. 왜냐하면, 이들 헤테로다이머에 의한 특이적 유전자 신호의 발현의 조절은 다양한 병리학적 상태의 개선 효과와 관련되어 있기 때문이다.
표 6: 한 쪽 파트너로서 RXR을 함유하는 핵 수용체 헤테로다이머의 효과
이하에서는, 본 발명자들에 의한 새로운 발견에 대해 기술한다. 첫째, 아디포사이트(adipocyte)에서 발현된 PPARγ가 RXR과 결합하여 헤테로다이머를 형성하여, 아디포사이트-유래의 시토킨(주로 TNFα)의 생성을 억제하여, 주변 인슐린 감응성을 회복시킨다. 이 효과는 개별 동물 수준에서도 복용량에 의존적이다. 심지어는 인슐린의 투여에 의해 혈당치의 어떠한 감소도 거의 나타내지 않는 제Ⅱ형 당뇨병의 모델인 선천성 비만의 당뇨병 마우스(db/db 마우스)에서도, 본 발명에 따른 화합물은 인슐린 내성을 경감함으로써, 대사 장애를 상당히 개선하는 효과를 나타낸다. 림프 세포에서 RXR 수용체와 결합한 후, 본 발명에 따른 화합물은 리간드에도 결합하는 PPARγ수용체와 결합하여 헤테로다이머를 형성하여, 만성 염증을 일으키는 염증성 시토킨의 생성을 억제한다. 그 결과, 혈관, 관절 및 주변 조직에서의 만성 염증을 억제할 수 있다. 다른 한편, 간세포에서 발현된 LXR 및 RXR에 의해 형성된 헤테로다이머는, 간내에서의 콜레스테롤-7α히드록실라아제 유전자의 전사를 증진시킴으로써 콜레스테롤의 담즙산(bile acid)으로의 산화를 가속화하여 담즙산의 배출을 촉진한다. 본 발명에 따른 화합물이 인간 혈청의 총콜레스테롤치를 낮추는 효과는, 담즙산 배출을 촉진하는 기능에서 유래한다. 골아세포에서의 VDR의 RXR과의 헤테로다이머는 칼슘대사 장애를 정상화하여 골다공증을 개선한다.
상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 의약 조성물은 순환계 질환(허혈성 심장질환, 저밀도 리포단백질의 증가를 특징으로 하는 고리포단백혈증, 고혈압 등)이나, 대사성 질환(제Ⅰ형 당뇨병, 제Ⅱ형 당뇨병 등), 만성 염증(류마티스성 관절염 등), 자가면역 질환 및 다양한 장기의 내강의 협착 및 폐색증을 포함한 동맥내의 만성 염증(즉,동맥경화증), 동맥 취약을 일으키는 결절성동맥주위염, 국소성 만성 염증(동맥류 등), 경피 경관강 관상 혈관성형술(percutaneous transluminal coronary angioplastry)에 따른 동맥성 재발협착증 및 당뇨병 합병증, 즉 미세혈관에서의 만성 염증(당뇨병성 신증, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 망막증)을 포함한 광범위한 질병을 치료 및/또는 예방하는 것을 목적으로 한다. 나아가, 본 발명의 화합물들은 칼슘대사 장애를 특징으로 하는 골다공증을 치료/예방하는데 유용하다. 상기 질병들은 치료 및/또는 예방하기 위하여, 본 발명에 따른 화합물들을 인간을 포함하는 동물에 투여할 수 있다.
다음으로, RXR의 리간드로서 작용하여, 많은 형태의 만성 염증의 치료 및/또는 예방 효과를 발휘하는 아스코클로린 및 그 유도체를 제조하는 과정에 관해 설명한다. 아스코클로린 및 그 유도체들은 동물 및 임상 시험에서 다양한 생물 활성을 나타낸다. 이들 각 생물 활성들은 서로 연관이 없는 듯 하기 때문에, 오랜 기간동안 그들의 기초를 형성하는 작용 기전은 밝혀지지 않고 있었다. 1985년의 글루코코르티코이드(glucocorticoid) 핵 수용체의 발견과, 1990년의 RXR 수용체의 발견에 의해 아스코클로린 및 그의 유도체의 작용 기전을 밝힐 수 있게 한 실마리가 처음으로 제공되었다. 핵 수용체 상과(superfamily)에 속하는 PPARγ은, 아디포사이트에서 발현되며, 리간드에 결합한다. 이것이 다시 RXR과 결합하여 헤테로다이머를 형성하여, 아디포사이트의 전구 세포의 분화를 촉진하는 유전자의 전사를 촉진한다. 주변 인슐린 감응성의 향상이 이 헤테로다이머에 의한 유전자 전사의 조절에 의해 이루어진다는 사실이 밝혀져 있다. 1982년부터 1985년까지에 걸쳐, 본 발명자들은 아스코클로린의 유도체인 화합물-14가 선천성 비만의 당뇨병 마우스 및 정상 마우스에서 인슐린의 효과를 향상시킨다는 사실을 보고한 바 있다(T. Hosokawa 등,Agr. Biol. Chem. 34: 2865-2869, 1982; 및 DIABETES vol. 34:267∼274, 1985). 그로부터 6년 뒤에, PPARγ의 리간드의 하나인 트로글리타존(troglitazone)이 본 발명의 화합물과 비슷하게 당뇨병을 앓는 동물에 대한 인슐린-증진 효과를 나타낸다는 사실이 보고되었다(T. Fujiwara 등, Diabetes 37: 1549-1558, 1988). 이들 화합물의 효과가 서로 유사하다는 사실로 인해, 본 발명자들은 처음으로 그들이 동일한 작용 기전을 가질 것으로 생각하였다.
아스코클로린 및 그의 유도체들이 PPARγ의 리간드에 기인하는 것임을 증명할 수 없는 다양한 효과를 나타내기 때문에, 이들 화합물들이 PPARγ의 리간드가 아님은 명백하다. 따라서, 본 발명자들은 본 발명에 따른 화합물들이 핵 수용체 상과에서 헤테로다이머의 캐리어 중의 하나로 작용하여, PPARγ와 함께 헤테로다이머를 형성할 것이라고 추정하였다. 이러한 관점에서부터, 그들은 세포 배양과 동물 실험을 통해 아스코클로린 및 그의 유도체들인 RXR의 리간드임을 증명하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
RXR 유전자 벡터 및 호르몬감응인자가 리포터 유전자에 묶인 플라스미드로 형질 감염된 동물 세포를, 본 발명에 따른 화합물들로 처리함으로써, 리포터 유전자의 전사는 RXR의 천연 리간드인 9-cis 레티노익산(9-cRA)의 경우와 마찬가지로, 농도-의존적으로 증진된다. 비록 본 발명에 따른 화합물들이 아디포사이트 전구체의 아디포사이트에로의 분화를 유도하지는 않지만, 분화를 유도하는 효과를 전혀나타내지 않을 정도의 낮은 농도의 PPARγ와 이들의 혼용에 의해서, 아디포사이트에로의 분화가 현저히 증진된다. 따라서, RXR의 리간드가 PPARγ의 리간드와 시너지 효과를 나타낸다는 것이 또한 분명해졌다. 말하자면, 본 발명에 따른 화합물들이 생체내에서 핵 수용체 상과의 다른 요소들과 헤테로다이머를 형성하여, 파트너로 작용하는 핵 수용체와 함께 특정 유전자의 전사를 조절한다는 사실이 명백하게 밝혀졌다는 것이다.
다른 한편, 1970년에 본 발명자들은, 마우스나 래트와 같은 설치류에 대한 아스코클로린 경구 투여가, 혈당치, 혈청 지질치 및 혈청 인슐린치를 낮추는 효과 뿐만 아니라, 식욕감퇴효과를 나타낸다는 사실을 확인하였다. 마취시킨 래트 및 고혈압 래트들에 경구 투여하였을 경우, 아스코클로린 혈압을 낮추는 강력한 효과를 나타내었다. 이들 효과로 인해 아스코클로린은 인슐린 내성 신드럼의 치료제로서 적합하게 된다. 그러나, 동물실험에서는 식욕감퇴효과가 인슐린의 작용을 향상시키는 효과와 비슷하여, 인슐린 향상제로서의 약물 효과를 평가하는 것은 매우 어렵게 된다. 따라서, 아스코클로린의 분자구조를 개량하여 다양한 유도체를 합성함으로써, 상대적으로 식욕감퇴효과가 약한 유도체를 합성하려는 시도가 이루어졌다. 그 결과, 아스코클로린 분자의 오르실알데히드의 4 및/또는 2-위치에 있는 히드록시기에 붙어있는 수소원자를 다양한 치환기로 치환함으로써 식욕감퇴효과가 약화된다는 사실이 밝혀지게 되었다.
방향족 고리의 2- 또는 4-위치의 히드록시기를 저급 알킬, 아실, 카르보메틸등으로 치환한 아스코클로린 유도체들을 정상 마우스, 래트 및 비글과 같은 실험 동물에 경구 투여하였을 때, 이들 유도체들은 혈당치와 혈청 총콜레스테롤치를 낮추는 효과를 나타내었다. 이들 유도체들은 정상 설치류들 및 병적인 당뇨병 모델들에 있어 인슐린의 효력을 강화시키는 효과를 나타내었다. 예를 들면, 이들 유도체 중의 하나인 화합물-14는, 대조군과 비교하여 정상 및 당뇨병에 걸린 마우스에 있어서의 혈청 인슐린치를 낮추었지만, 혈당치를 낮추고 혈액으로부터 포도당의 방출을 촉진시켰다(Hosokawa 등, Agriculture and Biological Chemistry 34:2865-2869, 1982). 본 발명에 따른 화합물들은 선천성 비만성 당뇨병에 걸린 마우스(db/db 마우스)의 물질대사를 개선하는 현저한 효과를 나타낸다. 이들 마우스는, 포만시에 아디포사이트 조직에서 합성 및 분비되는 식욕감퇴 단백질인 렙틴(leptin)의 수용체가 선천적으로 결핍되어 있기 때문에, 포만시에도 식욕을 조절하지 못한다. 그 결과, 이들 마우스는 과식으로 인해 과인슐린증에 걸려, 주변 인슐린 감응성이 크게 저하된다. 따라서, 이들 db/db 마우스들은, 심지어 정상적인 동물에 있어서는 저혈당성 혼수를 일으키기에 충분한 양의 인슐린의 투여 후에도, 조금도 혈당치의 감소를 나타내지 않으며, 또한 이들 마우스는 심각한 비만, 과인슐린증 및 과지방혈증을 보인다. db/db 마우스에게 투여할 경우, 화합물-14는 인슐린 내성을 완화시켜, 혈당치, 혈청 지방치 및 혈청 인슐린치를 현저히 저하시킨다(T. Hosokawa 등 DIABETETS vol. 34:267-274, 1985). 본 발명자들에 의한 일련의 연구는, 피오글리타존(pioglitazon)의 선구자에 해당하는 가장 오래된 TZD인 시글리타존 (ciglitazone)보다 앞선 것이다. 그러나, 이들 연구에서는, 본 발명에 따른 화합물은 db/db 마우스의 비만이 최고에 달하기 전에 비교적 단기간내에 투여되어, 결과적으로 본 발명에 따른 화합물의 효과가 인간에 있어서의 장기간의 병리적 상태에 대한 효과를 정확하게 나타내지 않을 염려가 있다.
(췌장 랑게르한스섬 β세포를 보호하는 효과)
본 발명에 따른 화합물들의 경구 투여가 주변 인슐린 감음성을 향상시켜 db/db 마우스에 있어서의 대사 장애를 개선한다는 사실은 이미 여러 실험의 결과에 의해 뒷받침되고 있다. 그러나, 본 발명에 따른 화합물은, 당뇨병에서 결핍되는 췌장의 인슐린 합성작용을 장기간에 걸쳐 유지시키는 효과를 나타낸다는 사실은 주목할 만하다. 이러한 효과는 약 1년동안 화합물-14를 투여한 db/db 마우스의 혈청 인슐린치 및 췌장에 대한 병리학적 관찰에 의해 명백하게 나타난다. 화합물-14는 db/db 마우스의 혈당치를 정상인 한배 새끼에 거의 필적할 수준까지 낮추었으며, 당뇨병의 특징인 폴리디프시아(polydipsia) 및 폴리우레아(polyurea)를 억제하였으며, 요당을 대조군에 비해 1/100 내지 그 미만으로 현격하게 감소시켰다. 나아가, 화합물-14는 실험기간을 통해 소변의 단백질을 개선하였다. 대조군 마우스에 있어서는, 췌장 β-세포는 인슐린의 과다생산으로 인해 피로해져서, 체중이 최대가 되었을 때(즉, 생후 약 20주)의 인슐린 생산성은 현저히 저하되었다. 생후 약 40주에, 이들 마우스는 키톤증에 걸리게 되고, 혈당치가 70㎎/㎗를 초과하게 된다. 즉, 인간의 제Ⅱ형 당뇨병과 유사하게, 비인슐린-의존성 당뇨병(diabetes mellitus)의 인슐린-의존성 당뇨병으로의 전환이 일어나게 된다. 40째주 후에, 비록 체중이 정상적인 한배 새끼와 유사한 수준으로 감소한다고 해도, 렙틴 수용체가 결핍된db/db 마우스는 과식을 하게 되고, 인슐린의 결핍으로 인해 동화시키지 못한 음식의 에너지가 대량으로 체외로 배설되었다. 이 실험에 있어서는, 화합물-14를 투여한 군에서는 과식으로 인한 인슐린의 지속적인 과다생산에도 불구하고, 췌장의 β-세포의 작용은 1년에 걸쳐 완벽하게 유지되었다는 사실이 강조되어야 한다. 화합물-6도 비슷한 효과를 나타내기 때문에, 당뇨병에서 췌장의 β-세포가 그 유효성을 유지할 수 있게 하는 효과는 본 발명에 따른 화합물의 중요한 특성 중의 하나라 할 것이다.
본 발명에 따른 화합물의 췌장 랑게르한스섬의 β-세포의 기능을 보호하는 효과는 또한, 알록산(aloxan) 또는 스트렙토조토신(streptozotocin)을 래트에 투여하여 인슐린-의존성 당뇨병을 급성으로 유발시킨 실험에서도 관찰되었다. 동물들에 투여한 경우, 알록산 및 스트렙토조토신과 같은 당뇨병-유발제는 췌장 랑게르한스섬의 β-세포를 선택적으로 변성시킨다. 한 때는, 이러한 효과는 췌장 랑게르한스섬의 β-세포를 죽인 결과, 인슐린 생성을 종료시킴으로써, 인슐린-의존성 당뇨병의 발병에 이르는 것으로 생각되었다. 그러나, 당뇨병-유발제에 의해 발생되는 인슐린-의존성 당뇨병의 발병 과정을 관찰한 결과, 이 과정이 훨씬 복잡하다는 것이 밝혀졌다. 즉, 이들 당뇨병-유발제들은 단지 그 과정을 개시시킬 뿐이고, 당뇨병-유발제에 의해 변성되어 염증을 일으키는 췌장 랑게르한스섬의 β-세포는, 당뇨병-유발제를 투여하고 1∼2주가 걸려 완결되는 면역학적 과정의 결과로 죽게 된다는 것이다. 세포 면역을 제아하는 T 림프구가, 변성되어 만성 염증을 앓는 췌장 랑게르한스섬의 β-세포를 외래물질로 인식하여, 면역적으로 제거하고자 하여 이들 세포들을 죽임으로써 인슐린-의존성 당뇨병의 개시가 유도되는 것이다. 따라서, 인슐린-의존성 당뇨병의 개시는, 당뇨병-유발제의 투여 후에라도, 췌장 랑게르한스섬의 β-세포의 면역적 파괴가 완결되기 전에 T 림프구의 작용을 방해할 수 있는 시클로스포린(cyclosporin)을 투여함으로써 방지할 수 있다.
본 발명에 따른 화합물은 T 림프구의 작용을 억제함에 있어서는 시클로스포린과 같은 효과를 가지지 않는다. 췌장 랑게르한스섬의 β-세포의 파괴가 완결되어 인슐린-의존성 당뇨병이 개시되기 전에 본 발명에 따른 화합물을 경구 투여할 경우, 그들은 당뇨병의 개시 과정을 방해할 수 있어, 결과로서 발생되는 병리적인 상태를 상당히 완화할 수 있게 된다. 이러한 효과는 본 발명에 따른 화합물들에 의해 발휘되는 만성 염증을 개선하는 효과에서 유래하는 것으로 보인다. 말하자면, 먼저 마크로파아지 세포가 당뇨병-유발제에 의해 변성된 췌장 랑게르한스섬의 β-세포를 인지하여, 이를 외래 물질로 간주하여, 림프구에 항원을 제공하여 이들 세포를 제거하는 것이다. 활성 마크로파아지에 있어서, 본 발명에 따른 화합물들은 RXR 및 PPARγ로 이루어지는 헤테로다이머를 형성하여, 변성된 췌장 랑게르한스섬의 β-세포의 림프구에 의한 제거과정을 지연시킴으로써, 췌장 랑게르한스섬의 β-세포의 수복을 위한 시간을 제공한다. 선천성 비만성 당뇨병을 앓는 마우스에서 관찰되는 선천적으로 프로그램화된 인슐린-생성 기능의 감소와, 당뇨병-유발제에 의해 급속하게 유도되는 췌장 랑게르한스섬의 β-세포의 파괴는, 비록 이들 현상이 전파의 속도에 있어서는 서로 다르다고 하더라도, 췌장 랑게르한스섬의 β-세포가 만성 염증으로 인한 면역적인 자기 파괴를 겪는다는 관점에서 공통적이다. 따라서, 본 발명에 따른 화합물들이 췌장 랑게르한스섬의 β-세포에 두 가지 병리학적 모델로 보호 효과를 나타낸다고 가정하는 것이 타당할 것이다. 인슐린을 생산하는 췌장 랑게르한스섬의 β-세포는 당뇨병에 관련된 주세포이다. 당뇨병을 앓는 동물의 췌장 랑게르한스섬의 β-세포를 보호하는 이들 효과는, 당뇨병을 치료함에 있어서 본 발명에 따른 화합물의 결정적인 효과이다.
(화학적 구조의 유사성)
아스코클로린이 레티노이드류와 유사한 화학적 구조를 가진다는 것은 흥미로운 사실이다. 아스코클로린은 레티노이드 전구체인 게라닐게라니올 (geranylgeraniol)보다는 이소프렌 단위 하나가 짧은 파르네솔(farnesol) 측쇄를 가진다. 아스코클로린의 말단 시클로헥사논 고리는 레티노이드의 시클로헥센 고리와 구조적으로 유사하다. 본 발명자들이 X-선 회절법에 의해 밝힌 완전한 구조에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 화합물들은 2,4-디히드록시-5-클로로벤즈알데히드의 5-위치에 붙은 측쇄로서, [1'(R),2'(S),6'(S)-트리메틸-3'-옥시시클로헥실-3-메틸-2,4-펜타디에닐 측쇄, 이중결합 중의 하나가 환원된 3-메틸-2-펜테닐 측쇄, 시클로헥사논 고리의 카르보닐기가 5-위치로 이동한 1'(R),2'(S),5'(S)-트리메틸-5'-옥소시클로헥실, 또는 [1'(R),2'(S),6'(S)-트리메틸-3'-옥소시클로헥세닐]기를 가진다. 나아가, 시클로헥실기로부터 계산한 오르실알데히드의 카르보닐기는 레티노익산의 말단 카르복실레이트와 동일한 위치에 위치한다. 이러한 사실들은, 아스코클로린의 골격이 RXR의 내인성 리간드인 9-cis 레티논산과 구조적으로 유사하다는사실을 의미한다. 따라서, 아스코클로린 및 그 유도체들 역시, 분자 구조의 측면에서 볼 때 RXR의 리간드임에 틀림없다.
본 발명에 따른 화합물은, 고콜레스테롤식을 공급한 화이트 래빗과 일본 메추라기에 있어서의 동맥경화증을 현저히 억제하며, 무기 코르티코이드를 투여하고 음료수로 생리적 염류 용액을 준 래트의 장간막 동맥에서의 동맥류의 형성을 억제한다. 이러한 발견들은 본 발명에 따른 화합물들이 동맥에서의 만성 염증에 대해 치료 및/또는 예방 효과를 나타낸다는 것을 시사한다. 한편, 래트의 아쥬반트(adjuvant) 관절염에 대한 효과는 본 발명에 따른 화합물들이 동맥에서의 만성 염증 뿐만 아니라 관절에서의 만성 염증에 대해서도 효과가 있음을 시사한다. 나아가, 본 발명에 따른 화합물은 미세혈관에서의 만성 염증에 의해 임상적으로 유도된 당뇨병 합병증에 대해 현저한 치료 효과를 나타낸다. 그렇다면, 어떻게 하여 본 발명에 따른 화합물들이 이들 만성 염증에 대한 치료 및/또는 예방 효과를 나타낼 수 있는가에 대해 의문이 생긴다. 이 점에 있어서는, 퍼록시좀-증식제 활성 수용체(peroxisome-proliferator activated receptor) PPARγ에 관한 연구가 유용한 암시를 제공한다. 한 때는 PPARγ가 아디포사이트 조직에 존재하는 핵 수용체이며, 이것이 유전자 신호의 발현을 조절하여 전구체 세포로부터 아디포사이트로의 분화를 유도할 것으로 생각되었으나, 지금은 PPARγ가 아디포사이트 조직 뿐만 아니라, 장관, 림프조직 및 부신에서도 다량으로 발현됨이 분명해졌다. 또한, PPARγ와 가장 높은 친화성을 가지는 것으로 보이는 내인성 리간드인 15-데옥시-Δ12,14-프로스타글랜딘 J2(15d-PGJ2)는 화이트 아디포사이트 조직이 아니라 마크로파아지와 같은 림프 세포에도 존재하는 것으로 확인되었다.
만성 염증을 개시시키는 마크로파아지에 의한 염증성 시토킨의 생산과 배출은, PPARγ와 RXR의 헤테로다이머에 의한 염증성 유전자 전사의 조절이 제대로 이루어지지 않을 경우에 일어난다. 사실, RXR의 리간드인 본 발명에 따른 화합물들은 동물 실험에서, 만성 염증에 대한 치료 및/또는 예방에 투여량-의존적으로 효과가 있음이 입증되었다. 당뇨병 합병증을 가진 피실험자에 대한 임상 시험에 있어서도 역시, 이들 화합물들은 만성 염증에 대한 치료 효과를 나타낸다. 당뇨병에서의 대사 개선 효과, 췌장 랑게르한스섬 β세포의 보호 효과, 간장에서의 담즙산의 합성 촉진 효과 및 칼슘대사 개선 효과 뿐만 아니라, 본 발명에 따른 화합물들의 만성 염증에 대한 항염증 효과의 발견도 본 발명의 주요 포인트 중의 하나이다. 순환계 질병에 있어서, 만성 염증은 심장 관상동맥, 뇌동맥 등에서 일어난다. 당뇨병 합병증에 있어서는, 이는 말초신경, 신장, 망막 등에서 일어나며, 류마티스성 관절염에 있어서는 관절에서, 그리고 자가면역질환에 있어서는 다양한 주변 조직에서 일어난다. 나아가, 만성 염증은 이식된 장기의 동맥 및 벌룬(balloon) 또는 스텐트(stent)의 사용에 의해 확장된 관상 동맥에서 일어난다. 본 발명에 따른 화합물에 의한 염증성 시토킨의 생성 억제는, 광범위한 장기 및 조직에서 발생하는 이들 만성 염증의 억제에 공통적인 작용기전이다.
핵 수용체 상과에 속하는 수십종 가운데는, 리간드가 아직 밝혀지지 않은 몇몇 고아(orphan) 수용체가 존재한다. PPARγ는 RXR하고만 헤테로다이머를 형성하는 반면, RXR은 PPARγ이외에도 수종의 핵 수용체들과 헤테로다이머를 형성한다. 따라서, RXR의 PPARγ이외의 수용체와의 헤테로다이머가 생물학적 작용에 어떻게 영향을 미칠지가 오늘날 생물학의 초점 중의 하나이다. RXR과 갑상선 호르몬 수용체와의 헤테로다이머와 같은 몇몇 헤테로다이머들은 갑상선 호르몬의 작용에 영향을 미치지 않는다는 것은 이미 밝혀진 바이다. 본 발명에 개시된 것과 같이, 콜레스테롤 센서로 불리는 간장 고아 수용체(LXR) 및 활성 비타민 D3수용체(VDR)는 RXR과 헤테로다이머를 형성하여 분명히 유전자 전사에 영향을 미친다. 이들 헤테로다이머가 어떻게 유전자 신호의 발현을 조절하여 생물학적 작용에 영향을 미치는가는 아직 완전히 밝혀져 있지 않다. 말하자면, RXR과 LXR 또는 VDR과의 헤테로다이머가 생물학적 작용에 미치는 효과는 본발명자들이 처음으로 밝혔다는 것이다.
(임상 효과)
병리학적 지표로서의 모델에 대한 효과로 선발되어 인간 피시험자들에게 투여될 경우 안전함이 입증된 신규화합물이라도, 효과가 있을 것으로 기대되었지만, 연구 개발의 노력이 무가치하게 되는 일을 자주 볼 수 있다. 그러나, 본 발명에 따른 몇몇 화합물의 효능과 안전성은 동물실험 뿐만 아니라, 제Ⅰ상 및 제Ⅱ상의 임상 시험에 의해 확인된 것이다. 즉, 화합물-6의 경구 투여에 의해 제Ⅱ형 당뇨병을 앓는 환자들의 혈청 총콜레스테롤치 및 혈당치가 감소되며, 고혈압 또는 경계선 고혈압을 가진 당뇨병 환자들의 혈압이 현저하게 저하된다. 화합물-6은, 당뇨병성 신증 및 신경병증과 관련된 증상을 현저하게 개선할 수 있기 때문에, 이 화합물은 만성 염증의 경우에 항염증 효과를 명확히 발휘한다고 할 수 있는 바, 이러한 사실은 동물 실험과, 임상적 설정에서도 관측된다. 게다가, 화합물-6은 제Ⅱ형 당뇨병에 있어서의 포도당 내성을 개선하여, 주변 인슐린 감응성을 향상시킨다. 다른 한편으로는, 화합물-6을 매일 1㎎/㎏ 내지 16㎎/㎏의 투여량 범위로 투여하면, 어떠한 주관적인 또는 객관적인 부작용이 나타나지 않으며, 생물학적 혈청 검사, 혈액 세포 검사, 소변 검사 등에 있어서 어떠한 비정상적인 데이터도 나타나지 않는다. 따라서, 화합물-6은 상기 특정 투여 범위내에서는 부작용이 없다고 결론지을 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 화합물이 당뇨병 합병증에 뛰어난 효과를 발휘한다는 사실은 임상적인 관점에서 더욱 주목할 만하다. 당뇨병의 합병증은 단기간내에 발생하지 않는다. 즉, 신장, 말초신경 및 망막에서의 미세혈관내층장애에 의해 유발되는 특징적인 당뇨병 합병증은 10년 또는 그 이상 당뇨병을 앓아야 발생한다. 따라서, 당뇨병 합병증에 대한 본 발명에 따른 화합물의 치료 효과는, 단지 인슐린 내성의 완화를 통한 대사의 개선에 의해서 만이 아니라, 만성 염증의 개선에 의해서도 확립되는 것이다. 이러한 당뇨병 합병증에 대한 치료 효과는 본 발명에 따른 화합물의 가장 중요한 효과 중의 하나이다.
(레티노이드류 고유의 부작용의 회피)
전형적인 지용성 비타민인 레티노이드류에 관해서는 방대한 데이터가 축적되어 있으며, 오랜 기간 동안 연구가 이루어져 왔다. 9-cis 레티노익산 뿐만 아니라, RXR과 특이적으로 결합하는 너무나 많은 유도체들이 보고되어 있어, 이들을 일일이열거하기는 어렵다. RXR의 리간드가 만성 질환을 치료하는데 있어서 잠재적이지만 탁월한 효과를 가지고 있다고 가정한다면, 어째서 많은 레티노이드 유도체들 중에서 의약으로서 높은 효율을 가지면서 안전한 화합물이 한번도 단리되지 않았을까 하는 의문이 생긴다. 그 해답은 지금까지 RXR의 리간드로 알려진 모든 레티노이드와 그들의 유사물들이 간 및 신경계에 강한 독성을 가진다는 것이다. 그렇다면, 어째서, 본 발명에 따른 화합물은 레티노이드류에 공통적인 동물 및 인간에 대한 그와 같은 독성을 나타내지 않을까 하는 의문이 생긴다. 이 질문에 대답하기 위해서는, 레티노이드류와 본 발명에 따른 화합물의 흡수, 운반, 분포, 대사, 배출 등에서의 차이점을 설명할 필요가 있다. 소화관을 통해 흡수되었을 때, 고도의 지용성 물질인 비타민 A는 레티노이드와 특이적으로 결합하는 혈청 단백질과 결합한다. 표적 세포에 편입되는 경우, 이것은 세포내에서 레티노이드에 결합하는 단백질에 결합하여, 간 내에 축적된다. 대신에, 이들은 필요할 경우, 표적 조직내에서 그 효과를 발휘한다. 운반된 비타민 A를 표적 세포에 편입시키기 위해서는, 혈액중의 레티노이드-결합 단백질이, 대응 수용체에 세포의 표층상에서 특이적으로 결합할 것이 필요할 것이다. 그러나, 이러한 관점에서 상세한 연구가 이루어진 적은 없다. 어쨌든, 레티노이드의 분포는 특이성과 밀접하게 관련되어 있다. 당뇨병을 치료하는 경우에 있어서, 레티노이드류는 표적 아디포사이트 조직 또는 활성 마크로파아지, 즉 만성 염증의 표적 세포에 선택적으로 분포되지 않는다. 표적 조직 또는 표적 세포에서의 RXR 리간드의 농도를, 동물에 대한 레티노이드의 투여에 의해 유전자 신호의 조절이 가능하게 되는 수준까지 높이고자 한다면, 레티노이드를 과량으로 투여하여야 할 것이다. 레티노이드가 과량 투여되면, 그것이 신경, 간, 피부 등에 허용 상한치 이상의 수준으로 축적되어, 그 결과 부작용을 발생시킨다. 요약하면, 지금까지 알려진 레티노이드 유도체들은 표적 기관에 대해 분포의 특이성을 나타내지 않아, 바람직하지 못한 강한 부작용의 발생을 피할 수 없었다는 것이다.
방사성 동위원소-표지한 본 발명에 따른 화합물을 동물에 경구 투여한 경우, 문맥 혈액에서 소화관을 통해 흡수된 방사능이 관측됨에도 불구하고, 혈장에서는 이들 화합물이 검출되지 않는다. 그것은 본 발명에 따른 화합물이 혈청 단백질에 강하게 결합한다는 말이 된다. 따라서, 이들 화합물들은, 단백질에 결합된 약물을 떼어내기 위해 채용되는 통상의 조건하에서는, 단백질로부터 떨어져 나와 유기 용매 중으로 복귀할 수 없게 된다. 그러한 화합물을 혈장으로부터 유리 상태로 복귀시키기 위해서는, 물과 혼합가능한 유기 용매(메탄올, 에탄올, 아세톤, 아세토니트릴 등)를 다량 혈장에 첨가하고, 혼합물을 산성화(pH 3.0 또는 그 미만)하여, 실온에서 약 1주일간 유지할 것이 요구된다. 이러한 처리 후에 조차도, 유리 화합물들은 기껏해야 방사능으로서 약 90%의 수율로 회복할 수 있다. 즉, 유리 화합물의 100% 회복은 불가능하다. 따라서, 본 발명에 따른 화합물은, 많은 약품들에서 일반적으로 볼 수 있는 단백질 결합을 통해서가 아니라, 공유결합을 통해 단백질에 결합하는 것으로 추측된다. 본 발명에 따른 화합물과 혈청내에 존재하는 혈청 단백질로부터 유도된 이들 신규한 물질들의 구조는 다음 실험을 통해 확인되었다. 아스코클로린, 화합물-6 및 화합물-14를 소량의 유기용매에 용해하여 혈청에 첨가하면, 유리 화합물이 짧은 반감기에 계속적으로 감소되어, 24시간 후에는 유리 화합물은거의 검출되지 않는다. 이 기간 동안에, 혈청은 유리화합물이 감소함에 따라 황색으로 변한다. 이것은 그 화합물에 고유한 알데히드기에 의한 자외선의 최대 흡수 파장이 혈청의 첨가로 인해 가시영역으로 천이되었기 때문이다. 본 발명에 따른 화합물을 포함하는 황색을 띤 혈청에 유기 용매(에탄올, 아세토니트릴 등)를 첨가할 경우, 색소는 용매에 전혀 용해되지 않아, 그 화합물이 단백질에 단단히 결합하고 있음을 명백히 시사한다. 이 결합은 본 발명에 따른 화합물의 알데히드기와 혈청 단백질이 시프 베이스를 형성하는 반응에 의해 형성된 공유결합인 것으로 결정되었다. 본 발명에 따른 화합물과 혈청 단백질 사이의 결합을 통해 형성된 시프 베이스는, 당류가 단백질에 결합하는 경우와는 달리, 아마도리 전위(Amadori rearrangement)를 받지 않는다. 따라서, 그에 따라 비가격성의 진전된 글리케이션(glycation) 말단 생성물이 형성되지는 않는다. 그러한 시프 베이스는 완전히 가역적이며, 산성 조건하의 유기 용매중에서 가수분해되어, 본 발명에 따른 화합물과 혈청 단백질을 재생하게 된다. 따라서, 본 발명에 따른 화합물과 혈청 단백질에 의한 시프 베이스의 형성은, 소화관을 통해 흡수된 유리 화합물의 생물학적 활성이 일시적으로 봉쇄되어, 활성이 없는 화합물이 점진적으로 표적 조직에 공급되게끔 하는 완충 효과를 갖는다.
본 발명에 따른 화합물과 혈청 단백질의 반응에 의해 형성된 시프 베이스는 생물학적 활성이 봉쇄된 불활성화된 화합물이다. 방사선 동위원사-표지된 화합물-6을 1회 경구 투여한 래트의 장기에서의 방사능 분포를 관찰해 보면, 방사능은 대부분의 장기에서 급격히 감소하여 3일 후에는 사라지게 되는 것으로 나타난다. 이 방사능은 대개 배설물을 통해 배설된다. 화이트 아디포사이트 조직(즉, 제Ⅱ형 당뇨병 치료의 표적 조직)에 편입된 방사능은 나날이 증강된다는 사실은 매우 흥미롭다. 아디포사이트 조직에 편입된 방사성 화합물은 세포내의 유적(oil droplet)에 용해된 유리 화합물-6이라는 사실은 더욱 흥미롭다. 방사능이 아디포사이트 조직에 선택적으로 분포하며, 시간의 경과에 따라 축적되는 이유는 밝혀져 있지 않다. 그러나, 이 분포 선택성은 본 발명에 따른 화합물이 당뇨성 대사 장애를 고도의 안전성을 가지고 개선할 수 있음을 충분히 시사해 준다. 즉, 본 발명에 따른 화합물은, 소화관을 통해 흡수되는 과정에서, 생물학적 활성이 봉쇄된, 고도로 안전한 시프 베이스로 전환되는 것이다. 이 시프 베이스는, 표적 세포 표층에 흡수되어, 엔도시토시스를 통해 세포내로 편입된 후, 가수분해되어 유리 화합물-6을 재생하게 된다. 유리 화합물-6은 저장 지방의 유적에 용해된다. 아디포사이트 내에서, 이것이 점진적으로 세포질에 용해되어 효과를 나타내게 된다. 화이트 아디포사이트 내의 저장 지방이 에너지원으로서 다른 조직으로 운반되는 경우, 유리 화합물-6도 지방과 함께 운반된다. 이 말은, 그것도 동시에 보관소로서 작용한다는 것이 된다. 본 발명에 따른 화합물은 다른 조직에는 거의 편입되지 않는다. 또한, 그것은 저장 지방의 유적이 없으면 축적되지도 않고, 어떤 독성을 나타내지도 않는다. 레티노이드류와는 달리, 본 발명에 따른 화합물은 레티노이드 고유의 부작용을 유발하지 않으면서 효과를 발휘할 수 있다. 그 이유는, 분명히 다른 레티노이드류의 그것과는 다른 본 발명에 따른 화합물의 동역학(흡수, 운반, 표적 세포 표층에서의 재생 등)과 관련이 있다. 예를 들면, (1) 본 발명에 따른 화합물은 장 점막의 흡수력 있는 내피 세포를 통과하는 과정에서 활성이 봉쇄된 비독성의 시프 베이스로 전환되며; (2) 레티노이드류와는 달리, 본 발명에 따른 화합물은 공유결합을 통해 혈청 단백질에 결합한 후 생체내에서 운반되며; (3) 엔도시토시스에 의해 표적 세포의 표층을 통해 편입된 후에는, 화합물-6이 가수분해되어 재생된 후, 세포내의 유적내 용해된다. 도 1은 본 발명에 따른 화합물과 혈청 단백질 간에 시프 베이스를 형성하는 반응을 체계적으로 설명한다.
상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 화합물은 RXR 수용체(즉, 핵 수용체 상과의 일원으로서의)의 리간드로서 작용하여, 항온 동물에 있어서 유전자 신호의 발현을 조절한다. RXR 수용체는, 지금까지 알려진 바로는 PPARγ뿐만 아니라, 갑상선 호르몬 수용체(TR), LXR, BXR(안식향산에 결합하는 고아 수용체), VDR 등과도 헤테로다이머를 형성한다. 나아가, 각 헤테로다이머는 기관- 또는 조직-특이적으로 유전자 전사를 조절하여 생물할적 작용에 다양한 효과를 나타낸다. 여기에서 기술한 바와 같이, 본 발명에 따른 화합물의 작용 기전을 밝히는 과정에서,유전자 신호 전사의 RXR 리간드-의존적 조절은, 예기치 않게 넓은 범위에 걸쳐 생물학적 작용에 크게 영향을 준다는 사실이 명백해졌다.
지금까지의 PPARγ에 관한 연구에서, 저장 지방의 증가에 기인하는, 확장된 아디포사이트에서 배출되는 종양 회사 인자(TNFα)가 근육 및 간의 인슐린 감응성을 저하시킨다는 사실과, RXR과 PPARγ의 이량체가 TNFα의 생성을 억제하여 인슐린 감응성을 회복시킨다는 사실이 밝혀졌다. 한편으로는, 본 발명에 따른 화합물은,동맥 벽 및 관절에 유발된 만성 염증 부위에 축적된 활성 파아지에 편입된다. 다음으로, 이들 화합물들은 PPARγ와 헤테로다이머를 형성하는 RXR 리간드로 작용하여, 염색체의 특정 부위에 결합함으로써, 염증과 관련된 유전자 신호의 발현을 조절하게 된다. 따라서, 이들 화합물들은 염증 시토킨 전사의 프로모터를 봉쇄하여 유전자 신호의 전사를 방해함으로써, 항-염증 효과를 달성하게 된다. 본 발명에 따른 화합물들은, 간장에 편입되는 경우, RXR:LXR 헤테로다이머를 형성하여 담즙산 생합성 경로에서 유전자 전사를 촉진한다. 다음에, 이들 화합물들은 콜레스테롤의 담즙산으로의 산화과정을 활성화하여, 과잉의 콜레스테롤을 체외로 배출한다. RXR은, 활성 비타민 D3의 핵 수용체인 VDR과 헤테로다이머를 형성하여, 생체내에서의 칼슘대사를 정상화함으로써 뼈의 무기질 농도 감소를 방지한다. 동물 실험 및 임상 시험에서, 본 발명에 따른 화합물은 서로 관련이 없는 듯이 보여지는 다양한 효과를 나타내는데, 그것은 이들 화합물들이 RXR 수용체의 리간드이기 때문이다. 이것은 생물학 뿐만 아니라, 임상 의학에도 영향을 미치는 발견이다.
발명의 실시 형태
본 발명에 따른 화합물은, 유사한 목적에 사용되는 약물에 허용되는 모든 원하는 투여 경로를 통해, 단독 투여 또는 적당한 조합제의 형태로 투여될 수 있다. 즉, 그들을 고체, 반고체, 동결건조 분말 또는 액체 조합제(정제, 좌약, 환제, 캡슐, 가루약, 액제, 현탁제, 유탁제, 크림, 로우션, 에어로솔, 연고, 겔 등)로 처방할 수 있고, 예컨대, 입을 통해, 코를 통해, 장관외적으로 또는 국부적인 장관외적으로 정확한 투여량으로 투여될 수 있는 적합한 단일 투약의 형태로 투여할 수 있다. 이들 조성물들은, 이 분야에서 통상 사용되는 약제학적 담체 또는 부형제(excipient)와 본 발명에 따른 화합물 및 의약적 효과, 담체, 흡수 조제용의 다른 약물을 임의적으로 함께 포함하여 이루어진다. 일반적으로, 약제학적으로 허용되는 조성물은, 약 1∼99(중량)%의 본 발명에 따른 화합물과 약 99∼1%의 원하는 투여 형태에 따른 적당한 의약적 첨가물을 포함한다. 이들 조성물들은 약 5∼75%의 의약적 효과를 위한 본 발명에 따른 화합물과 나머지의 의약적 효과를 위한 적당한 충전제를 포함한다. 병리학적 상태를 효과적으로 개선하기 위해서는, 본 발명에 따른 화합물은 성인에 대해, 1회 0.1∼20㎎/㎏/일, 바람직하게는 0.2∼5㎎/㎏/일로 투여하여야 한다.
위에서 상술한 질병들을 치료하기 위해서는, 질병의 위중도에 따라 투여량을 조절하도록 조합제를 처방하는 것이 바람직하다. 조합제를 처방함에 있어서 가장 중요한 인자는 본 발명에 따른 화합물은 지방에 용해되어 가공이 제약된다는 사실로 인한 제한에 있다. 핵 수용체 상과의 리간드들은 지용성 호르몬 또는 비타민들이기 때문에, 본 발명에 따른 화합물들도 지용성일 것이다.
경구 투여용으로 약제학적으로 허용되는 첨가제에, 예컨대 만니톨, 포도당, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 사카린 나트륨, 탈크, 셀룰로오스, 포도당, 젤라틴, 수크로오스 또는 마그네슘 카보네이트와 같은 일반적으로 사용되는 임의의 충전제를 첨가하여 제조된다. 이들 조성물들은 액제, 정제, 환제, 캡슐, 가루약 또는 지속-방출형 조합제의 형태일 수 있는데, 정제 또는 환제의 형태인 것이 바람직하다.이들 조성물은, 본 발명에 따른 화합물과 함께, 희석제(락토오스, 수크로오스, 칼슘 포스페이트 등), 분해제(전분 및 그 유도체 등), 윤활제(마그네슘 스테아레이트), 바인더(전분, 아라비아고무, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴, 셀룰로오스 및 이들의 유도체 등), 본 발명에 따른 화합물 입자의 표면을 습윤하는 계면활성제, 지용성 첨가제, 담즙산, 인지질 등을 포함할 수 있다. 상기 조성물은 지방족의 합성 계면활성제 또는 유기 용매 가용성 폴리머 조제를 포함하는 것이 특히 바람직하다. 그 예에는 아라비아고무, 알긴산 나트륨, 메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 벤토나이트, 소듐 라우릴 술페이트, 폴리소르베이트 80, 소르비탄 일지방산 에스테르 및 폴리옥실 40 스테아레이트가 포함된다.
이들 조합제를 처방함에 있어서 가장 중요한 인자는, 본 발명에 따른 화합물이 지용성이며 발수성이라는 사실로 인한 제한에 있다. 일반적으로, 지용성 약물의 소화관을 통한 흡수는 약물 입자에서 떨어져 나오는 개개 분자의 용해 속도에 달려있다. 일단, 지용성 약물이 물에 용해되면 소화기 점막의 흡수 장소에 도달하여, 실제로 무장벽 상태에서 재빨리 흡수된다. 어떤 약물이 물에 용해되기 어렵더라도, 그것이 빨리 물에 용해될 수 있는 한은, 경구 투여에 의해 재빨리 흡수되어 고도의 생물학적 이용 효능을 달성할 수 있다. 본 발명에 따른 화합물은 물에 매우 서서히 용해된다는 사실이 알려져 있다. 따라서, 이들 화합물들을 조합제로 조제하기 위해서는, 이들의 물에의 용해 속도를 증가시키는 첨가제를 공급하고/하거나 조제 과정에 어떠한 처리를 하여야 한다. 본 발명에 따른 화합물과 같이 물에 용해되기 어렵고 물에 용해되는 속도가 매우 늦은 화합물의 경우에, 물에의 용해를 촉진시키는 방법 중의 하나는 약물 입자의 크기를 최소화하는 것이다. 말하자면, 이것은 (1) 입자가 물과 접촉하는 면적이 넓어지도록 화합물을 미세한 입자로 만드는 것이 효과적이라는 것이다. 비록 화합물의 미세한 입자가 형성되더라도, 만일 발수성 표면이 존재하여 이들 입자들이 물과 접촉할 수 없어 수중에 미세한 입자로 분산되지 못한다면, 물에의 용해 속도는 높아질 수 없을 것이다. 따라서, 입자의 표면을 물과 접촉하게 하기 위해서는, (2) 본 발명에 따른 화합물을 계면활성제 또는 지용성과 수용성기의 양자를 모두 가진 고분자 물질과 함께 사용하는 것이 바람직하다. 그것은 또한, (3) 약물 입자로부터 개별 분자의 분리를 가속화하는데도 유용하다. 결정 격자로부터 개별 분자를 분리하는데는 한정된 자유 에너지가 필요하기 때문에, 약물 입자가 결정성인 경우에는 결정 형태를 선택하는 것이 효과적이다. 개별 분자의 분리를 촉지하기 위해서는, 본 발명에 따른 화합물을 무정형으로 만드는 것도 유용하다.
본 발명에 따른 화합물을 포함하는 조합제의 조제에 필요한 조건은 본 발명에 따른 화합물의 발명과 관련된 청구항에서 청구한 것과 같다.
이상에서 논의한 바와 같이, 본 발명에 따른 화합물은, (1) 레티노이드 X 수용체의 천연 리간드인 9-cis 레티노익산과 화학 구조가 매우 유사하며; (2) 레티노이드 X 수용체 리간드의 활성을 조사하기 위한 세포 배양 실험계에서 9-cis 레티노익산보다 고도의 특이성으로 유전자 전사를 촉진하며; (3) 인간을 비롯한 동물에 투여하였을 때, RXR과 함께 헤테로다이머를 형성하는 다양한 핵 수용체에 의해 유전자 신호의 발현을 조절하는 효과를 나타내며; (4) 본 발명에 따른 화합물은 본래 높은 독성을 가지는 RXR의 리간드이기는 하지만, 알데히드기가 혈청 단백질과 반응하여 시프 베이스를 형성함으로써, 레티노이드 고유의 독성이 없어지는 것을 특징으로 한다.
이제, 하기 실시예들을 참조하여 본 발명을 매우 상세하게 설명할 것이다. 하지만, 본 발명의 범위를 거기에 한정되는 것으로 해석하여서는 안된다.
실시예
실시예 1
각각의 정제에 대해서, 63mg의 실린드로클로린, 10mg의 세스퀴올리에이트 소르비탄, 10mg의 분말상 실리카겔, 40mg의 옥수수 전분, 50mg의 L-히드록시프로필셀룰로오스(PO-30), 12mg의 히드록시프로필셀룰로오스-SL, 46mg의 미정질의 셀룰로오스, 10mg의 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨염, 3mg의 칼슘 스테아레이트와 6mg의 탈크를 종래의 방법으로 함께 혼합하여, 과립화시켜서 정제로 만들었다.
실시예 2
63g의 분말 아스코클로린에 50g의 락토오스, 60g의 옥수수 전분, 30g의 L-히드록시프로필셀룰로오스, 12g의 히드록시프로필셀룰로오스-SL, 46g의 미정질의 셀룰로오스, 10g의 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨염, 3g의 칼슘 스테아레이트 및 6g의 탈크를 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 종래의 방법으로 과립화하고, 정제화하여 각각의 무게가 0.25g인 정제로 만들었다.
실시예 3
100g의 4-O-카르복시메틸아스코클로린(화합물-14)에 70g의 미정질의 셀룰로오스, 35g의 락토오스, 70g의 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘염, 70g의 옥수수 전분 및 5g의 마그네슘 스테아레이트를 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 종래의 방법으로 정제화하여 각각의 무게가 0.35g인 정제로 만들었다.
실시예 4
RXR 반응 요소에 의한 발현으로 조절된 리포터 유전자를 포함하는 플라스미드와 RXRα 발현 플라스미드는 COS-1 세포들로 전이되었다. 그 후에 이들 세포들은 아스코클로린과 같은 본 발명의 화합물로 처리되었다. 그 결과 리포터 유전자의 발현 투여량이 이에 따라서 상승하였음을 알 수 있었다. 본 발명의 화합물들의 RXR 트랜스액티베이션 활성(transactivation activities)은 9-CRA보다도 더 낮지만 ATRA와 거의 동등하다. 이러한 결과들은 본 발명의 화합물들은 RXR 촉진제이고, RXR를 통한 유전자 발현을 조절한다는 것을 가리킨다.
RXR(레티노이드 X 수용체) 리포터 유전자 전이
플라스미드들은 COS-1 세포들로 전이되었다. 유전자 전이는 종래의 방법으로 리포펙트 아민 시약(Lipofect AMINE reagent)을 사용하여 실행되었다(생명 기술). 1×105세포들을 10%의 태아 송아지 혈청을 포함하는 2ml의 둘베코의 변형된 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle medium ; DMEM)에 분산시켜, 35mm 페트리 디쉬에 부었다. 17시간 동안 CO2인큐베이터에서 배양을 한 후에, 배지를 제거하였고, 페트리 디쉬에 들러붙은 세포들은 인산염-완층 식염수(PBS)로 씻어 내었다. 그 후 리포펙트 아민 시약을 사용해서 유전자 전이를 실행하였다. 즉, RXR 반응 요소에 의한 발현으로 조절된 루시퍼라아제 유전자를 포함하는 4mg의 플라스미드(pRXRL : RXRE-SV40 루시퍼라아제 ; 리포터 유전자 플라스미드로서, 여기에서 RXRE는 발현으로 조절되므로써 아래 부분에 위치한 SV40 프로모터와 루시퍼라아제 cDNA와 연결되어 있다); 4mg의 RXRα 발현 플라스미드(pRXRα; 플라스미드로서, 인간 RXRα cDNA가 포유류 세포에 있는 인간 RXRα를 발현시키기 위하여 시토메가로바이러스 프로모터의 아래 부분에 연결되어 있다); 유전자 전이 비율(pCH110 ; 파마시아(Pharmacia))을 할당하기 위한 2mg의 β-갈락토시다아제 유전자 플라스미드가 포함된 500ml의 최소 혈청 배지 OptiMEM(생명 기술)가 50ml의 리포펙트 아민을 포함하는 500ml의 OptiMEN과 미리 혼합되어, 생성된 혼합물은 15분 동안 실온에서 방치되었다. 100ml의 이 액체 혼합물은 400ml의 OptiMEN과 혼합되었고, 배지 혼합물을 페트리 디쉬에서 분리하였다. CO2인큐베이트터서 3시간 동안 37℃로 유지한 후에, 유전자 전이 배지를 페트리 디쉬에서 빼내어, 테스트 물질과 10%의 혈청(처리된 활성화 카본)이 포함된 DMEM 배지에 첨가하고 나서, 20시간 동안 37℃에서 배양하였다. 테스트 물질로서 화합물-1, 화합물-5, 화합물-6, 화합물-7, 화합물-10, 화합물-14, 화합물-19, 화합물-26 및 화합물-28(각각 10-8, 10-7및 10-6M)이 사용되었고, 반면에 모든-트랜스 레티노산, 9-시스 레티노산 및 덱사메타손이 대조군로서 사용되었다. 게다가, 디메틸설폭사이드(최종 농도 : 0.1%)가 테스트 물질의 용매로서 첨가되었다.
RAR 또는 GR(글루코코르티코이드) 리포터 유전자 전이
대체로서, RXR 반응 요소에 의한 발현으로 조절되는 루시퍼라아제 유전자를 포함하는 플라스미드(pRXRL:RXRE-SV40 루시퍼라아제), 및 RXRα발현 플라스미드(pRXRα); RXR 반응 요소에 의한 발현으로 조절되는 루시퍼라아제 유전자를 포함하는 플라스미드(pRXRL:RXSE-SV40 루시퍼라아제), 그리고 GR 발현 플라스미드(pRXRα)가 COS-1 세포들로 전이되었다. 이러한 플라스미드의 전이체 및 본 발명의 화합물(농도: 10-4∼10-7M)은 배지에 첨가되었다. 대조 화합물로서, all-트랜스 레티노산(10-8, 10-7및 10-6M), 9-시스 레티논산(10-8, 10-7및 10-6M) 덱사메타손(10-8, 10-7및 10-6M) 등이 첨가되었다.
페트리 디쉬로부터 배지를 뽑아낸 후에, 250ml의 배양된 세포 라이싱 용액(25mM 트리스 인산염 완충액(pH 7.8), 2mM 1,2-디아미노시클로헥산-N, N,N,N'-테트라아세테이트, 10% 글리세롤, 1% 트리톤 X-100)을 첨가하였고, 세포들을 고무 폴리스맨으로 잘라서 모았다. 응고와 용융에 의해 세포들을 완전히 붕괴시킨 후에, 세포들을 4℃(15,000rpm, 2분)에서 원심분리 하였고, 그 결과 얻어진 상청액은 측정 샘플로서 적용되었다. 20ml의 상청액에 100ml의 루시퍼라아제 기질 용액(2.14mg의 Co-A, 100ml의 470mM D-루시페린, 200ml의 530mM ATP, 2ml의 DTT-트리신 완충액(pH 7.8))을 첨가하였고, 루미노미터(ATTO Luminosensor AB-2000)로 형광강도를 측정하였다. Luminescent β-갈락토시다아제 검출 키트 Ⅱ(클론테크)를 사용하여, 유전자 전이 효율 결정에 필요한 β-갈락토시다아제를 측정하기 위하여, 루미노미터에 의해 형광 강도를 측정하였다. 표 2에서 이미 본 바와 같이, 본 발명의화합물들은 그들의 활성이 9-시스 레티노산보다 다소 낮음에도 불구하고, RXR에 대한 특정 리간드인 것이 발견되었다. 이러한 화합물들이 RXR에 대해서 약 25∼40%에 상응하는 RAR에 대한 활성을 나타냄에도 불구하고, 그들은 GR을 전혀 활성화시키지 못했다. 따라서, 본 발명의 화합물들이 RXR에 대해서 특정의 리간드라는 것을 명확하게 나타낸다.
실시예 5
유전성의 비만형 당뇨병성 마이스에 대한 췌장 기능 보호 효과
db/db 마이스는 유전적으로 렙틴 리포터가 부족하기 때문에, 배가 부르더라도 식욕 조절이 되지 않는다. 그 결과, 그들은 과식과 지나친 비만으로 인한 과잉인슐린혈증에 걸려서, 당뇨병이 발병한다. 본 발명의 화합물들은 40주 동안 db/db 마이스에 경구로 투여되었다(출생후 11∼51주)(도 2).
마이스가 심각한 비만을 겪는 기간 동안(출생 후 20번째 주까지), 말초 조직의 인슐린 저항성은 점차로 향상하였고, 그 결과 혈중 인슐린치는 점차 높아졌다. 비만이 최대치에 도달했기 때문에, 인슐린 필요성은 인슐린 생산 수준을 넘어섰다. 그 결과, 인슐린 축적 과립이 있는 췌장의 랑게르한스 섬 β-세포들은 대부분 과립이 감소하여, 인슐린 축적 결핍이 생겼다. 지나치게 일을 해서 과도한 인슐린을 생성하는, 췌장의 랑게르한스 섬 β-세포들은 점차로 피곤해졌다. 비만이 최대 수준에 이른 점에서부터, 췌장의 랑게르한스섬 β-세포의 쇠퇴 및/또는 괴사는 민감하게 되는 동시에 혈중 인슐린치는 빠르게 낮아졌다. 출생후 23번째 주부터, 인슐린의 충분하지 못한 기능 때문에, 과도하게 섭취한 모든 음식 에너지를 동화하는 것이 불가능하게 되므로써 체중이 줄어들게 된다. 동화될 수 없었던 음식 에너지는 요당으로서 배출되었다, 결과적으로, 요당은 혈중 인슐린치의 감소와 함께 증가하였다. 출생후 약 50주에, 유전적인 비만형 당뇨병의 마이스는 정상적인 동산군(同産群; 같은 모체에서 나온 새끼의 군)(즉, 최대 체중의 1/2∼1/3)과 동등한 수준까지 감소된 체중와 혈당이 700mg/dl을 넘는 상당히 높은 레벨을 나타내었으며, 많은 양의 당이 요로 배출되었다. 이 점에 있어서, 혈중 인슐린치는 정상적인 동상군에 거의 동등할 만한 수준까지 낮아졌다. 즉, 인슐린에 의존하지 않는 당뇨병 멜리터스(melitus)가 인간의 임상학적인 경우에 있어서 인슐린에 의존하는 당뇨병 멜리터스로의 전환이 일어났다. 0.1%의 화합물-14를 포함하는 사료로 사육된 db/db 마이스의 경우에, 투여의 초기 직후로부터 당은 요로 거의 배출되지 않았고, 혈당치는 정상 수준까지 점차로 낮아졌다. 출생후 약 40주에, db/db 마이스는 정상적인 동산군과 거의 동등한 혈당치를 나타내었다. 그러나 화합물-14는 렙틴 수용체를 회복시키는 기능을 갖고 있지 않으므로, 과식에 기인한 과잉인슐린혈증에 의한 비만의 유도 과정에서 어떠한 효과도 발휘하지 못한다.
화합물 14의 효과에 관해서, 화합물의 투여로 췌장의 랑게르한섬 β-세포들이 f 과잉인슐린혈증의 점까지 기능을 하게 만들고, 게다가 혈당치를 정상화시키면서, 요소 글루코오스를 상당히 감소시킴에도 불구하고, 화합물-14의 투여량은 췌장의 랑게르한섬 β-세포들의 피로에 기인한 인슐린 생성을 크게 감소시키지 못하다는 것을 지적하는 것은 중요하다. 췌장의 랑게르한섬 β-세포들이 당뇨병의 다양한 측면에서 중요한 열쇠중의 하나이므로, 오랜 시간동안 이러한 세포들의 기능을 유지하는, 본 발명의 화합물의 능력은 치료와 당뇨병의 방지의 면에서 매우 중요하다.
실시예 6
약 200g의 무게인 18마리 수컷 위스타 래트들은 무작위로 3그룹으로 나누어졌다. 2그룹의 동물들에 대해서, 45mg/kg의 스트렙토조톡신이 정맥내로 투여되었다. 이들 그룹들 중의 하나는 대조군으로 간주되고, 반면에 다른 그룹은 화합물-6 투여 그룹으로 간주되었다. 정상적인 대조군으로 간주되는 나머지 1 그룹에 대해서, 여기에 용해된 스트렙토조톡신을 포함하는 1/10M 시트레이트 완충액(pH 3.5)이 정맥 내로 투여되었다. 스트렙토조톡신의 투여 직후에, 아라비아 고무에 있는 화합물-6의 현탁액이 10일 동안 계속, 하루에 한번, 20mg/kg/day 양으로 경구로 투여되었다. 다른 그룹에 대해서, 아라비아 고무 용매 단독으로 투여되었다. 최종 투여 후에 6시간이 지난 다음, 각 동물의 심장으로부터 혈액을 모아서, 혈당치과 혈중 인슐린치를 측정하였다. 표 7a에 주어진 데이터가 나타내는 바와 같이, 화합물-6의 경구투여는 혈당치의 증가와 혈중 인슐린치의 감소를 억제시켰다.
약 250g의 무게인 18마리의 수컷 SD 래트를 무작위로 3그룹으로 나누었다. 이들 그룹들 중의 하나는 정상적인 대조군으로서 간주되었고, 반면에 나머지 2그룹들은 스트렙토조톡신 투여그룹으로서 간주되었다. 50mg/kg의 스트렙토조톡신을 정맥내에 투여한 후 24시간이 흐른 후로부터, 아라비아 고무 용액에 현탁된 10mg/kg/day의 화합물-5가 14일 동안 계속, 하루에 한번(이른 아침) 경구로 투여되었다. 정상적인 대조군과 스트렙토조톡신 대조군에, 아라비아 고무 용액만이 경구로 투여되었다. 최종 투여 후 6시간이 흐른 후에, 각각의 동물들의 심장으로부터 혈액을 모아서, 혈당치과 혈중 인슐린치를 측정하였다. 표 7b에 주어진 데이터가 나타내는 것과 같이, 화합물-5의 경구 투여는 혈당치의 증가와 혈중 인슐린치의 감소를 억제시켰다.
표 7 : 본 발명의 화합물에 의한 스트렙토조톡신-유도 당뇨병의 발병의 경감
a. 화합물-6에 의한 발병의 경감(평균치±SE)
*P<0.05(당뇨의 대조군과의 큰 차이점)
b. 화합물-5에 의한 발병의 경감(Mean±SE)
*P<0.05(당뇨의 대조군과의 큰 차이점)
실시예 7
흰 래트에서 동맥경화증 억제 효과
흰 래트는 지방이 풍부한 사료로 사육될 때, 상대적으로 짧은 기간 이내에동맥경화증에 걸려서 순환성 질환을 겪는다고 알려져 있다. 따라서, 높은 지방성 식품은 10% 경화된 코코넛 오일, 2%의 콜레스테롤, 0.5%의 소의 담즙 분말 및 0.04% 또는 0.01%의 아스코클로린을 분말인 마케티드 표준 흰 래트 사료에 첨가하고, 혼합물로 성형하여 과립제로 제조하였다. 별도로, 대조군을 위한 다른 높은 지방 사료가 아스코클로린을 사용하지 않고 제조되었다. 게다가 0.2%의 클로피브레이트(즉, PPARα 리간드)가 대조 약품으로 사료에 첨가되어 지방성이 높은 사료로 제조되었다.
약 2kg의 무게인 24마리 흰 래트들을 무작위로 4그룹으로 나누었다. 이들 그룹들 중의 하나는 대조군으로 간주되었고, 반면에 나머지 3그룹들은 무작위로 각각 클로피브레이트 그룹, 아스코클로린 0.01% 그룹과 아스코클로린 0.04% 그룹으로 간주되었다. 그 후 실험을 14주 동안 실행하였다. 결과를 도 3에 나타낸다. 실험을 하고 약 6번째 주부터, 대조군과 클로피브레이트군의 동물들은 식욕을 잃었고, 각 그룹의 6마리 중에서 2마리 동물들이 실험 과정중에서 관상동맥의 폐색에 기인한 불충분한 순환 때문에 죽었다. 아스코클로린 0.01% 그룹과 아스코클로린 0.04% 그룹의 동물들 중에서, 상대적으로, 관상동맥의 폐색으로 인한 장애는 상당히 경감되었고, 모든 개체들이 실험이 완료될때까지 생존하였다. 아스코클로린과 클로피브레이트는 혈청의 전체적인 콜레스테롤치의 증가를 억제할 수 없다는 것을 강조하고 있다. 흰 래트들의 혈청의 총콜레스테롤치(실험의 초기 직전에 약 50mg/dl)는 각각의 그룹에서 빠른 증가를 나타내고, 1달 후에 1g/dl을 넘었다. 따라서, 혈장은 점점 소의 우유처럼 뿌옇게 되었다. 모든 그룹들의 혈청의 총콜레스테롤치가 거의 같다는 사실은 낮은 밀도의 리포 단백질이 이러한 그룹들에서 거의 같은 비율로 동맥의 벽으로 통합된다는 것을 가리킨다. 아스코클로린에 의한 동맥경화증의 억제는 손상된 동맥으로 백혈구가 침투하므로써 만성염증에서 동맥경화증이 생기는 과정이 이로써 억제되었다는 것을 강하게 암시한다.
실시예 8
일본산 메추라기에서의 동맥경화증 억제 효과
새들이 높은 지방성 사료로 사육되었을 때, 또한 짧은 시간 이내에 동맥경화증의 발병을 나타낸다. 그리고 나서 약 30일이 지난 32마리의 다 자란 일본산 메추라기들을 무작위로 4그룹으로 나누었다. 이들 그룹들 중의 하나는 표준 사료군으로 간주되었고, 다른 하나는 높은 지방성 사료 대조군으로 간주되었으며, 나머지 2 그룹들은 각각 지방이 높은 사료를 먹인 높은 투여량의 화합물-6 그룹과 낮은 투여량의 화합물-6 그룹으로 간주되었다. 1%의 콜레스테롤을 분말상의 단백질이 풍부한 표준 사료에 첨가하여 혼합물을 성형하므로써 과립제로 사료를 제조하였다. 화합물-6을 분말상 사료에 0.16% 또는 0.0025% 첨가하였고, 그 후에 혼합물을 성형하여 과립제로 만들었다. 실험은 9달 동안 실행되었다. 이 기간 동안 새들은 임의량의 사료와 마실 물이 허용되었다. 이 실험에 적용된 사료는 흰 래트의 실험에 적용된 사료와 비교하여 저지방을 포함하고 있고, 소화기로부터 콜레스테롤의 흡수를 촉진시키는 담즙산이 없었다. 결과적으로, 일본산 메추라기들은 심각한 순환성 질병에 걸리지 않았으며, 실험을 한 그룹들 중에서 사료 섭취량은 차이점을 나타내지 않았다.
9달이 지난 후에, 혈액들을 모아서, 혈청의 총콜레스테롤치과 중성의 지방 수준을 측정하였다. 표준 사료를 먹인 대조군과 비교하여, 콜레스테롤이 높은 사료를 먹인 대조군은 혈청의 총콜레스테롤치가 13배 더 높고, 혈청의 중성 지방치는 4배 더 높았다. 콜레스테롤치와 중성 지방치는 높은 투여량의 화합물-6 그룹에서 각각 40% 감소되었고, 낮은 투여량의 화합물-6 그룹에서 25.5% 및 121.6%씩 감소되었다. 각각의 새를 해부하여, 대동맥을 꺼내었다. 그 후 전체의 엔도스포리엄(endosporium) 영역에 대해서 죽종의 비율을 기초로 하여 피해도가 5등급으로 점수가 매겨졌고, 관동맥이 두꺼워졌다. 결과적으로 높은 콜레스테롤의 사료군은 7/8의 죽종장애를 나타내고, 죽종 피해도는 평균 2.21이었다. 반대로, 높은 투여량의 화합물-6군은 죽종를 나타내지 않고, 반면에 낮은 투여량의 화합물-6군은 새의 1/2로 죽종를 나타났으며, 피해도 스코어가 0.50으로 상당히 경감되었다.
이들 실험 데이터는, 모계 화합물 아스코클로린 뿐만 아니라 4-위치에 있는 히드록실기가 변형된 이것의 유도체도 동맥경화증을 억제하는 효과를 가지며, 동맥경화증을 억제하는 효과는 본 실험에 있어서 혈청의 저밀도 리포 단백질에서 증가를 억제하는 것과 병행하여 더 중요하게 된다는 것을 가리킨다.
표 8 : 화합물-6 및 1%의 콜레스테롤을 포함하는 표준 닭사료로 9달 동안 사육된 일본산 메추라기의 혈청 지질 수준
(표준치±SE)*P<0.05 및**P<0.01 학생 t-테스트
표 9 : 1%의 콜레스테롤을 포함하는 표준 닭사료로 9달 동안 사육된 일본산 메추라기의 궁형 대동맥에서의 죽종 형성
궁형 대동맥에서의 죽종의 발병 :
O : 죽종 없음.
I : 전체 면적의 1∼10%의 비율로 죽종를 코팅
Ⅱ : 전체 면적의 11∼40%의 비율로 죽종를 코팅
Ⅲ : 전체 면적의 41∼70%의 비율로 죽종를 코팅
Ⅳ : 전체 면적의 71∼100%의 비율로 죽종를 코팅
실시예 9
동맥류 억제 효과
본 발명의 화합물들은 악성 고혈압증 모델 래트의 결절성 동맥주위염을 억제하는 효과를 나타내는데, 여기에서 결절성 동맥주위염은 장간막의 동맥에서 일어나고 동맥류로 진행되어 간다. 동맥류 중에서, 장간막의 동맥을 형성하는 것들은 양적으로 처리될 수 있다. 따라서 장간막의 동맥을 꺼내어 포르말린으로 고정시켰다. 다음에, 지방-얼룩과 세동맥 및 동맥류들을 몇번이고 세어서, 세동맥 당 평균 동맥류 수를 계산하였다. 신장의 절제술로 인해 신장기능 저하된 래트들에게 혈장보다 다소 높은 삼투압을 갖는 0.9% 식염수가 마실 물로서 주어졌고, 10mk/kg의 디옥시코르티코스테론 아세테이트(DOCA)(광물 코르티코이드)가 1주일 간격으로 피하로 투여되었다. 24마리 수컷 위스타 래트들을 무작위로 4그룹으로 나누었다. 왼쪽 신장을 꺼낸 후에, 각각의 동물들을 방치하고, 수술 상처를 유합하였다. 그로부터 일주일 후에, 이들 그룹들중 하나는 대조군으로 간주되었고, 반면에 10mg/kg/day의 화합물-6과 40mg/kg/day의 화합물-6이 남은 두그룹에 계속 투여되었다. 실험은 7주일 동안 실행되었다. 실험의 초기로부터 각각의 그룹의 사료 섭취량, 물 섭취량, 요(尿), 체중 및 혈압을 3일마다 한번씩 측정하였다.
대조군은 혈압이 빨리 상승함을 나타내었다. 평균 혈압은 3번째 주에180mmHg를 넘었고, 4주째에는 200mmHg에 이르렀다. 대조군과 비교할 때, 그 후로부터 상당한 차이가 관찰되지 않았음에도 불구하고, 본 발명의 화합물이 투여된 그룹들은 2번째와 3번째 주에 혈압의 상승을 억제하는 상당한 효과를 나타내었다. 투여 그룹들은 물 섭취량이 감소하고, 요가 감소하고, 요의 전해질을 농축시키는 능력을 유지하고, 체중의 증가가 빠르게 개선되는 등의 상당한 효과를 나타내었다. 7번째 주에, 각각의 동물은 해부하여, 장간막의 동맥을 꺼내었다. 포르말린으로 처리한 후에, 동맥은 지방으로 오염되었고, 동맥류가 세어졌다. 정상 대조군의 개체들은 동맥류가 나타나지 않았다. 반면에, 고혈압증 대조군에서의 모든 개체들은 동맥류를 나타내었으며, 장간막의 동맥 당 평균 동맥류 수는 1.67±0.68이었고, 이는 고혈압증의 동맥의 병변이 진행중이라는 사실을 가리킨다. 낮은 투여량의 화합물-6 그룹은 세동맥당 평균 동맥류 수가 0.66±0.41인 것을 나타낸다. 높은 투여량의 화합물-6 그룹에서, 세동맥 당 평균 동맥류의 수는 0.27±0.05로 낮아졌다.
즉, 본 발명에 따른 화합물은 주로 고혈압증으로 야기된 가지난 사이트에서 혈관 병변에 의해서 유도된 동맥류의 발병을 강하게 억제한다는 것이 명확해졌다.
표 10 : DOCA 고혈압 래트의 장간막 동맥에서 동맥류 형성을 억제하는 화합물-6의 효과
장간막의 동맥에서 세동막과 결절은 각각 몇번 세어져서, 평균이 계산되었다.
a) 출현 빈도 = 결절수/세동맥 수×100(%)
b) 병변 색인 : 다음과 같이 평가 :
0 : 장간막의 동맥에서의 결절 수 ; 0.
Ⅰ: 결절수; 1∼50%.
Ⅱ : 결절수; 51∼100%.
Ⅲ : 결절수; 101∼200%.
Ⅳ : 결절수; 201% 이상.
실시예 10
래트의 보조 관절염에 대한 치료효과
본 발명의 화합물이 동맥의 만성 염증뿐만 아니라, 일반적인 만성 염증에 대해서도 효과적인가 여부를 논의하기 위하여, 전형적인 만성 염증의 형태인 보조 관절염에 대한 효과가 조사되었다.
실험 1에 적용된 관절염이 있는 래트들은 45일 동안 보조약을 투여하므로써 야기된 심한 관절염에 걸린 개체들이고, 따라서 뒷다리를 구부릴 수 없기 때문에 앞다리로 기어다녔다. 약효는 걸어다니는 것을 뒷다리의 염증의 심한 정도와 다리가 부어 오른 부피를 육안으로 관찰하므로써 평가되었다. 19마리 SD 수컷 래트(약 300g의 무게)에게, 죽은 결핵균 Aoyama B 균주가 포함되어 있는 프로인트 보조약을, 뒷다리에 관절염을 유도하기 위하여 꼬리근에 피하주사로 주입시켰다. 화합물-6은 트라가칸트 고무 용액에 현탁되었고, 체중의 0.5ml/100g 비율로 경구 투여되었다. 높은 투여량 모델(HM; 50mg/kg), 중간 투여량 모델(MM; 25mg/kg) 및 낮은 투여량 모델(LM; 10mg/kg)을 포함하는 3그룹들에게 화합물-6을 투여하였다. 하루에 한번, 오전에, 연속적으로 7회 투여하였다. 이 기간 동안에, 뒷다리의 부피가 실험의 초기에 측정되었으며, 그 후로 2, 4 및 7일에 측정되었다. 부피 변화는 실험의 초기의 부피를 100%로 하여 계산하였다. 7일째, 뒷다리의 염증 상태는 육안으로 보아5등급으로 평가되었다.
1주일 후, 대조군은 실험의 시작 직전에서의 염증의 정도와 다리 부피에 큰 차이가 없었다. 그러나, 관절이 부었기 때문에 뒷다리를 구부릴 수 없게 된 무력한 화합물-6 그룹들의 모든 래트들이 화합물-6의 효과 때문에 다시 걸을 수 있게 되었다는 사실은 놀라운 일이다. 그 과정중에 있어서, 다리의 부어오른 부피가 크게 감소된 것은 물론이다. 화합물-14와 같은 아스코클로린과 이것의 유도체들은 유사한 효과를 나타내었다. 이러한 결과들을 기초로 하여, 본 발명의 화합물들은 동맥 염증 뿐만 아니라 관절의 만성 염증을 개선하는 효과를 발휘한다는 것이 증명되었다. 투여 직후, 세개의 화합물-6 그룹들을 합하여, 관절염의 발생에 따라 다시 나누었다(즉, 양성그룹 및 음성 그룹). 그 후 데이터는 대조군의 데이터와 비교되었다. 대조군에 있는 모든 개체들이 관절염에 걸렸다. 출현 빈도가 화합물-6 그룹과 대조군 사이에서 측정되었을때, 상당한 차이가 위험율 5%에서 관찰되었다. 이러한 사실은 화합물-6이 절단된 관절염을 치료하는데 분명히 효과적이라는 것을 가리킨다.
표 11 : 7일에 각 그룹의 체중 증가와 뒷다리의 염증
*:(투여의 시작 직전 체중)-(투여 완성 직후 체중).
**; 염증 스코어: 뒷다리에서의 염증 정도는 다음과 같이 평가되었다;
5: 두개의 뒷다리가 부었기 때문에 정상적으로 걸을 수 없음.
4: 하나의 뒷다리가 부었기 때문에 정상적으로 걸을 수 없음.
3: 두개의 뒷다리가 부었음에도 불구하고 걸을 수 있음.
2: 하나의 뒷다리가 부었음에 불구하고 걸을 수 있음.
1: 두개의 뒷다리가 정상.
치-스퀘어(Chi-square) 테스트
1=3.84의 자유도에 따라 상당한 차이가 있는 5%에서의 이론치
측정치 = 3.96. 따라서, P<0.05.
실시예 11
마이스에서 혈청의 총콜레스테롤치를 낮추는 효과
혈청의 콜레스테롤을 낮추는 약품의 효과는 동물들 사이에서 다양하다. 즉, 특정한 동물들에게 효과적인 어떤 약제들은 다른 동물들에게 다른 효과를 발휘한다. 예컨대, 컴팩틴(compactin), HMG CoA 리덕타제 방지제는 래트 또는 마우스와 같은 설치류에 투여될 때, 혈청의 총콜레스테롤치를 낮출 수 없다. 이것은 HMG CoA 리덕타제가 설치류의 간에서 억제됨에도 불구하고, 효소는 억제를 보상할 만큼의과량이 생합성되고, 그 결과 억제의 효과가 부정되기 때문이다. 따라서, 가능한 한 많은 동물들에서 혈청의 총콜레스테롤치를 낮추는 효과를 측정하는 것이 바람직하다. 혈청의 총콜레스테롤치에 대한 본 발명의 화합물의 효과에 관해서, 마이스를 사용하여 분석을 하였다. 래트와 마우스의 표준 분말형 사료에 이러한 화합물들을 첨가한 후에, 생성된 혼합물을 과립제로 만들어, 8일 동안 5주 된 수컷 ICR과 ddy 마이스에게 주었다. 8일의 오후에, 각 동물의 혈액을 심장으로부터 모아서 혈청에 있는 전체 콜레스테롤을 결정하였다. 투여량은 최대 투여량으로, 여기에서 체중 증가가 1주일 동안의 경구 투여 후에 억제되지 않으면 그것의 1/4 투여량으로 결정되었다. 표 12는 결과를 나타낸다:
표 12 : 마이스에서 본 발명의 화합물의 혈청 전체를 낮추는 효과
각각의 값은 평균치±SE(n=10)으로 나타낸다.
a) 화합물-1의 경우, 대조군은 23마리 동물들로 구성되고, 반면에 0.04% 그룹와 0.01% 그룹들은 각각 12마리 동물들로 이루어진다.
실시예 12
래트에서의 담즙산 배출의 촉진 및 콜레스테롤-7α 하이드록실라아제 전사의 촉진
본 발명의 화합물들이 투여된 래트의 분변에 있는 사료원 콜레스테롤과 중성 스테롤 및 산성 스테롤이 분변에 있는 담즙산 조성물에서의 스테롤 균형과 변화를조사하기 위하여 결정되었다. 결과적으로, 본 발명의 화합물들의 투여는 분변으로 배출되는 스테롤(특히, 담즙)의 증가를 일으킨다는 것은 분명하다. 게다가, 담관개구술을 받기 쉽고, 그로써 담즙이 결정된 래트들로부터의 시간이 지남에 따라 담즙이 샘플로 되었다. 따라서 본 발명의 화합물의 투여는 담즙산의 담즙으로의 배출을 분명히 향상시킨다. 수컷 위스타 래트들의 무게는 약 250g이고, 이들은 각각 6∼8마리의 동물들이 있는 그룹들로 분리되었다. 그 후에 래트들은 10일 동안 2%의 콜레스테롤을 포함하는 래트의 표준 사료로 사육되었다(CE-2; Nippon Crea Co., Ltd.). 이 기간 동안 아라비아 고무 용액에 현탁된 10mg/kg의 화합물-6 또는 10mg/kg의 화합물-5가 하루에 한번, 강제로 경구 투여되었다. 6일과 10일에 분변을 모았다. 그 후 스테롤을 종래의 방법으로 추출하였고, 산성 스테롤과 중성 스테롤을 결정하였다. 반면에, 사료에 있는 콜레스테롤은 또한 사료원 스테롤의 양을 측정하기 위하여 결정되었다.
표 13: 래트의 스테롤 균형에 대한 화합물-6의 효과
*학생 t-테스트에서의 P<0.05(n=6)
표 14a: 표준 사료
표 14b: 콜레스테롤이 높은 사료
담즙산 배출을 촉진시키기 위한, 본 발명의 화합물의 기능 메카니즘을 조사하기 위하여, 핵의 수용체 LXR에 대한 효과를 연구하기 위하여 실험이 수행되었다. 간에서의 특별한 핵의 수용체인 LXR은 리간드로서 22-히드록시콜레스테롤과 함께 콜레스테롤 센서 작용을 할 것으로 예상되었다(Bethany A. Janowski at al., Nature 383:728∼731, 1996). 콜레스테롤이 기관에 대해서 과량 축적되었을때, 리간드에 대한 LXR 결합은 RXR과 헤테로다이머(heterodimer)를 형성하고, 그 후 호르몬 반응 요소와 결합을 한다. 이러한 결합은 몸밖으로 배출시키기 위하여 콜레스테롤의 담즙산으로의 산화를 촉진시키는 신호로서의 역할을 하고, 이것에 의해서 축적된 콜레스테롤이 감소한다. 따라서, 간은 많은 양의 콜레스테롤을 축적시키는 기관인 동시에, 많은 양의 담즙산으로서 콜레스테롤을 감소시킨다. 분변으로 담즙산의 배출을 촉진시키기 위한 본 발명의 화합물의 능력은 다음과 같다고 예상된다. 간에서, 상응하는 리간드와의 RXR 및 LXR 결합은 서로 헤테로다이머를 연속적으로 형성하고, 따라서 콜레스테롤-7α-히드록실라아제의 발현을 촉진시키며, 이는 담즙산의 생합성 경로에서의 제한율 효소이다. 즉, 본 발명의 화합물들, RXR의 리간드들은 콜레스테롤-7α-히드록실라아제의 전사를 촉진시키고(즉, 간에서의 담즙산 생합성에서 속도 상태의 효소), 그 결과 콜레스테롤-7α-히드록실라아제의 발현을 높인다고 예상된다. 본 발명에 따른 화합물-6이 경구 투여된 래트의 간에서의 콜레스테롤-7α-히드록실라아제 활성이 측정되었을때, 효소학적 활성과 단백질 무게 당 콜레스테롤-7α-히드록실라아제의 수율이 투여량에 따라 향상되었다. 따라서, 콜레스테롤의 대사에 대한 클로피브레이트(clofibrate)와 본 발명의 화합물들의 효과 사이에서의 차이는, 전자는 LXR과 헤테로다이머를 형성할 수 없는 PPARα의 리간드이고, 후자는 콜레스테롤 산화제 유전자 RXR 리간드-의존적 전사를 향상시키고, 따라서 신체로부터 담즙산으로서의 배출을 촉진시키는데 있다고 결론 내릴 수 있다. 이러한 발견들은 본 발명의 하나의 중요한 측면으로 여겨질 수 있다.
실험은 다음과 같이 실행되었다. 각각의 화합물에 대해서, 무게가 약 200g인 10마리 수컷 스프라크 돌리 래트들이 무작위로 2그룹으로 나누어져, 임의량의 1%의 콜레스테롤이 포함된 분말로 된 래트 사료(CE-; Nippom Crea Co., Ltd)와 마시는 물로 1주일 동안 사육되었다. 본 발명의 화합물들은 2% 아라비아 고무 용액에 현탁되었고, 연속적으로 5mg/kg(화합물-1 및 화합물-26) 또는 20mg/kg(화합물-6 및 화합물-14)이 하루에 한번, 7회 강제로 투여되었다. 8일째 되는날 이른 아침에, 각 동물은 혈액 부족으로 죽었다. 생리 식염수로 환류시킨 후에, 즉시 간을 꺼내었다. 250mM 슈크로오스 용액(75mM의 니코틴아미드, 1mM의 EDTA 및 0.5mM의 MgCl2가 포함된)의 4배의 양을 간에 첨가하였고, 혼합물을 테프론 균등기를 사용하여 갈았다. 그 후 액체 분말 물질을 4℃에서 15분 동안 9500G로 원심분리시켜서 얻어진 미토콘드리아-유리 상청액을 60분 동안 105000G으로 더 원심분리시키고, 이것에 의해 미크로좀 파편이 분리되었다. 분리된 미크로좀을 사용하므로써 7α-콜레스테롤의 수율이 종래의 방법으로 측정되었고, 전환율이 계산되었다.
표 15: 간의 미크로좀에 있는 7α-콜레스테롤의 형성에 있어서 본 발명의 화합물의 효과
평균 5마리 래트들에서 나타난 (n=5).
실시예 13
상승작용을 하는 비타민 D 3 활성에 대한 화합물-14의 효과
RXR은 또한 핵의 수용체인 VDR과 헤테로다이머를 형성하고, 리간드로서 활성 비타민 D3(la, 25-디히드로사이비타민 D3)와 함께 작용을 한다. 그러나 지금까지 어떠한 연구도 이 헤테로다이머가 생체내에서 어떻게 형성되는지 되어 있지 않다. 따라서, 유전자 전사에 대한 이 헤테로다이머의 효과는, 이것의 생리학적인 의미가 여전히 알려지지 않고 남아있다. 활성화된 비타민 D3는 뼈성장과, 어린이의 발육에 필수적이다. 또한, 늙은 사람과 병이 있는 사람들에게 골다공증과 뼈 골절을 방지하기 위해서 필수적이다. 이와 같이 의미 있는 효과에도 불구하고, VDR과 RXR의 헤테로다이머의 기능을 명확하게 하기 위한 연구가 수행되지 않았었다. 본 발명자들은 db/db 마이스에서 칼슘 대사를 연구하였고, 칼슘 대사에서의 화합물-14의 효과를 연구하였다. 이러한 연구는 부분적으로 1992년에 보고되었다(Tomoyoshi Hosokawa, Nogei Kagaku Kai-shi)(J. Agr. Chem.), 66:1221∼1226, 1992). 같은 연령의 정상적인 동산군과 비교할 때, db/db 마이스는 요의 칼슘, 혈액 칼슘, 혈액 칼시토닌 및 부갑상성 호르몬이 비정상적으로 높은 수준인 것으로 나타났다. 아스코클로린 유도체, 화합물-14를 1주일 투여하므로써, 요의 칼슘, 혈액의 칼슘 및 칼시토닌 수준을 상당히 낮추었다. 오랜 기간(4주) 동안 db/db 마이스를 사육하므로써, 이러한 동물들은 같은 연령의 정상적인 동산군과 비교하여 뼈의 광물 밀도가 감소하여 고통을 겪는다는 것을 발견하였다. 뼈의 광물 밀도의 감소는 오랜 기간 동안 본 발명에 따른 화합물을 투여하므로써 상당히 방지할 수 있다는 것은 주목할만하다. 환언하면, 아스코클로린 유도체, RXR의 리간드는 골다공증과 같은 칼슘 대사 질병을 방지하기 위하여 투여량에 의존하는 활성 비타민 D3내생(內生))의 기능을 상승작용시킨다. RXR 리간드의 이러한 효과는 지금까지 알려지지 않은 새로운 발견이다.
실시예 14
화합물-6의 상 Ⅰ의 임상적인 실험
본 발명의 화합물중의 하나인 화합물-6의 상 Ⅰ의 임상적인 실험은 과콜레스테롤혈증에 걸린 40∼82세의 17명의 여자 및 남자 환자들로 실행되었다. 실험은 12주 동안 계속되었으며, 화합물-6은 처음 8주에 투여되었다. 투여량은 다음과 같이 프로그램되었다: 2번째주까지 1mg/kg, 3번째주까지 2mg/kg, 4번째주까지 4mg/kg, 6번째주까지 8mg/kg, 8번째주까지 16mg/kg. 8주∼12주까지(위약 투여기간) 환자에게 알리지 않고 위약을 주었다. 매일 투여되는 약은 3부분으로 나누어서 식후에 복용시켰다. 각 환자들은 일주일에 한번 병원을 방문하여 진찰을 받고, 혈청을 분석하기 위하여 혈액을 채취하였다.
이 실험에서, 주관적이거나 객관적인 부작용이 관찰되지 않았다. 또한 약물 투여에 의해 야기된 기형도 생화학적인 혈청 실험, 혈액 퍼센트, 요 실험 등의 데이터에서 관찰되지 않았다. 한 환자에게 어지러움증이 일어났지만, 이것은 약투여를 중단할 만큼 심각한 것은 아니었다. 이 환자는 또한 고혈압이었으므로 어지러움을 일으킨 화합물-6의 투여 때문에 혈압이 표준화된 것으로 보여진다. 약물 투여의효과는 심전도묘화법과 안저경법으로도 관찰되지 않았다.
약물투여에 의한 가장 큰 변화는 혈청의 총콜레스테롤치가 상당히 감소한 것이다. 이러한 감소는 약물투여후 1주부터 시작되었고, 약물 투여량이 증가함에 따라 감소율이 증가하였다. 즉, 투여량-의존성을 나타내었다. 환자들의 혈청의 총콜레스테롤치는 약물 투여를 멈춘 후인 2∼4주에서조차 투여 전 수준보다 낮은 상태인 것은 또한 흥미로운 일이다. 즉, 약물은 확실하게 캐리-오버(carry-over) 효과를 나타낸다. 일부 환자들은 WHO에 의해 특정되는 표준에 따라 고혈압이나 경계선 고혈압을 앓지만, 둘의 수축성 혈압과 확장성 혈압은 각 그룹에서 화합물-6을 투여하므로써 낮아졌다. 환자들에게 있는 5 당뇨병성의 혈당치는 100mg/dl 즉, 정상적인 범위의 최대 한계까지 각각 낮아졌다. 반면에, 혈청의 중성 지방치은 혈청의 총콜레스테롤치만큼 눈에 뛸만큼 낮아지지 않았다. 중성의 지방/전체 콜레스테롤 비율이 1.5 이하인 환자들의 그룹에서 상당한 감소가 예외적으로 관찰되었지만, 1.5 이상의 비율인 환자들은 중성 지방이 감소하지 않았음을 나타낸다(도 4 및 5).
이러한 사실들은 기능성 메카니즘에 따른 것으로서, 본 발명의 화합물들은 RXR:LXR 헤테로다이머들을 형성하고, 따라서 신체로부터 담즙산으로서 콜레스테롤의 배출 경로를 활성한다.
표 16: 인간에게 있어서 화합물-6의 혈청의 콜레스테롤 저하효과(평균치±SE)
대상: 48∼70세의 11명의 남성과 6명의 여성(n=17)
위약-투여 기간: 10∼12주
실시예 15
화합물-6의 상 Ⅱ의 임상적인 실험
인슐린에 의존하지 않는 당뇨병(타입Ⅱ)으로 고통을 받는 30명의 환자들을 포함하는 화합물-6의 상 Ⅱ의 임상적인 실험이 실행되었다. 화합물-6은 매일 6mg/kg의 투여량으로 투여되었다(즉, 매 식후 60mg 무게의 2개의 정제를 투여). 투여는 12주 동안 계속되었다.
이 실험으로 명확해진 사실들은 다음과 같다. 화합물-6은 혈당치과 혈청의 총콜레스테롤치를 상당히 낮추지만, 혈청의 중성 지방치를 낮추는데는 거의 효과가 없다는 것을 나타내었다. 50g의 글루코오스가 이른 아침에 공복 상태에서 경구투여된 글루코오스의 내성 실험에 있어서, 투여 전의 데이터와 비교할때 화합물-6은 글루코오스 내성을 상당히 개선시켰고, 요당을 감소시켰다(도 6 및 7).
따라서, 본 발명의 화합물이 타입 Ⅱ 당뇨병에서 대사와 인슐린 민감성을 개선시키는 효과를 갖는다는 것이 입증되었다. 타입 Ⅱ의 당뇨병은 종종 고혈압증과 연결될 것이다. 이 실험에서, 7명의 환자들은 고혈압으로 고통을 받는 반면, 17명들은 WHO의 표준에 따라서 경계선 고혈압으로 고통을 받는다. 그러나, 이러한 그룹들에서 혈압은 화합물-6의 투여로 인하여 상당히 낮아진다. 트로글리타존, PPARγ 리간드는 타입 Ⅱ의 당뇨병에서 인슐린 민감성, 대사 파라미터 및 글루코오스 내성을 개선시킨다. 그러나, 이것은 나트륨을 신체내에 방치시키므로써 고혈압증 효과를 일으킨다, 트로글리타존은 이점에 있어서 본 발명의 화합물들과 분명히 다르다(도 8).
표 17: 상 Ⅱ의 임상적인 실험에서 공복 혈당치과 혈청의 총콜레스테롤치를 낮추는 화합물-6의 효과(화합물-6의 투여량 : 360mg/day)
a. 혈당치의 변화(평균치±SE)
(n=30),**P<0.01 그리고***P<0.001 학생의 짝지워진 t-테스트
b. 혈청의 총콜레스테롤치의 변화(평균치±SE)
(n=30),**P<0.01 그리고***P<0.001 학생의 짝지워진 t-테스트
상기 기술한 바와 같이, 화합물-6의 임상 실험에서, 가장 두드러진 것은 당뇨병의 신장병증과 당뇨병의 신경병으로 생긴 당뇨병의 합병증의 임상적인 증상이 상당히 개선되었다는 것이다. 대부분의 당뇨병 환자들은 예컨대, 갈증을 경험하는데, 이는 당뇨병의 신경병으로 인한 것이고, 또한 다뇨증의 증상을 호소하는데, 이는 물의 과잉 섭취량 때문이다. 화합물-6은 환자들의 그룹에서 이러한 증상들을 개선시켰다.
타입 Ⅱ의 당뇨병에 걸린 30명의 환자들은 갈증을 문의하여 4등급으로 평가하였다. 즉 (++++) 매우 심한 갈증; (++) 심한 갈증; (+) 갈증; 그리고 (-) 갈증 없음. 표 8에 명확하게 나타난 바와 같이, 상태들은 화합물-6으로 처리하므로써 개선되었다(처리 초기단계 이전의 데이터와 비교할때 두번째 주:P,0.005, 네번째 주:P<0.005, 8번째 주:P<0.001, 12번째 주:P<0.001 ). 치료 비율은 합이 100%로 되도록 하였다.
타입 Ⅱ의 당뇨병은 전형적인 만성 질병이므로, 이는 15∼20년 동안 이 질병으로 고통을 받는 환자들에게 일반적인 것이다. 오랜 기간의 전력을 지닌 이러한 환자들은 대부분의 약에 반응하지 않을 것이다. 이 실험에 참여한 환자들 중에서 8명은 15∼20년 동안 질병으로 고통을 받았다. 갈증과 다뇨증의 증상들은 이러한 사실에도 불구하고 모든 경우에 있어서 개선되었다는 것은 주목할 만한 일이다. 즉 24시간 동안 요를 모아서 측정한 요당치 또한 화합물-6의 투여에 의해서 상당히 감소되었다. 게다가 당뇨병의 신경병(예컨대, "부진", "약함" "권태", "다리 근육 고통")은 상당히 개선되었다. 당뇨병의 합병증은 만성 염증의 범주로 떨어지는 것으로 여겨질 수 있다. 당뇨병의 합병증을 개선하는 본 발명의 화합물의 효과는 대사를 개선시키는 작용이 아니라 만성 염증의 항-염증 약효의 기능성 메카니즘에 의존하는 것이라고 여겨진다.
표 18a : 화합물-6의 투여에 의한 타입 Ⅱ 당뇨병 환자들의 지루함의 개선
표 18b: 화합물-6의 투여에 의한 타입 Ⅱ 당뇨병 환자들의 약함의 개선
표 18c: 화합물-6의 투여에 의한 타입 Ⅱ 당뇨병 환자들의 신경통의 개선
실시예 16
혈청 단백질과 본 발명의 화합물의 시프 베이스(Schiff bases)의 형성
본 발명의 화합물들은 혈청 단백질의 유리 아미노기와 빠르게 반응하여, 생체 내와 시험관 내에서 가역적인 시프 베이스를 형성한다. 본 발명의 화합물은 망막 모양의 효과를 나타내지만, 그들은 레티노이드와 같은 강한 독성을 나타내지는 않는다. 이는 본 발명의 화합물들이 혈청 단백질과 반응을 하여, 장기를 통한 흡수의 경로를 거쳐 시프 베이스로 전환하여, 그 결과 생화학성 활성이 은폐되기 때문이다. 반면에, 본 발명의 화합물들과 단백질의 아미노기의 화합물들 사이에 있는 시프 베이스들을 형성하는 반응 또한 생체 내에서 중성의 수용성 용액 또는 약알칼리성 수용성 용액에서 빨리 진행된다. 본 발명의 화합물들 중에 있는 화합물-1 및화합물-26은 혈액에서 유리상태로 존재할 때 강한 독성을 나타낸다고 알려져 있다. 예컨대, 화합물-1의 아세틸화 유도체(4-아세틸아스코클로린: 화합물-5)는 물에 불용성이지만, 계면활성제 HCO-60을 사용하여 물에 용해될 수 있으므로 투명한 액체를 제공한다. 이러한 상태에서, 화합물-5 분자들은 물에 용해되지 않지만, 가시광선 파장보다도 더 작은 미세 미포로서 분산된다. 따라서, 액체는 투명하게 된다. 이러한 상태로 동물에 경구 투여되었을 때, 화합물-5는 소화기를 통해서 빨리 흡수된다. 화합물-2가 래트에게 소량만(2mg/kg) 투여되었을때, 혈압이 낮아지고, 심장은 1∼2시간 이내에 멈추었다. 시간이 지남에 따라 혈액을 모아서 흡수 운동학이 모니터되었을때, 화합물-5가 아니라 화합물-1이 혈청 내에 존재하였다. 그 이유는 소화기를 통하여 흡수된 화합물-5가 혈액에 있는 아실라아제에 의해 즉시 분해되기 때문이다. 즉, 생체내에 존재하는 유리 아스코클로린은 순환 시스템에서 강하게 독성인 것으로 이해되어진다. 그러나, 래트는 2% 아라비아 고무 용액에 현탁된 화합물-5를 100배 더 많이 투여(즉, 200mg/kg)한 것 만으로는 죽지 않았다. 시간이 경과함에 따라 래트의 혈액을 모았을 때, 어떠한 유리 화합물-1도 혈액에서 검출되지 않았다. 그러나, 유리 화합물-1이 혈액에서 검출되지 않았다는 사실이, 화합물-1이 혈액에 존재하지 않는다는 사실을 가리키는 것은 아니다. 반면에, 화합물-1이 화합물-5가 투여된 래트의 혈액에, 유리 화합물의 경우에 있어서 치사량을 넘을 만큼의 높을 수준까지 존재한다는 것이 증명될 수 있었다.
화합물-5가 현탁액으로서 투여된 래트의 혈청에, 1%의 아세트산이 포함된 아세토니트릴보다 10배 많은 양이 첨가되었고, 혼합물을 1주일 동안 실온에서 방치하였다. 단백질에 결합한 약물 분자의 경우에, 약물 분자는 일반적으로 비공유결합(예컨대, 소수성 결합, 수소결합, 반데르발스 결합, 이온쌍극자 모멘트 결합 등.)을 통하여 단백질에 약하게 연결되어 있을 뿐이다. 따라서, 약물은 유기용매를 첨가하고, 약 1시간 동안 방치시키므로써 단백질로부터 분리될 수 있다. 그러나, 화합물-5가 투여된, 래트의 혈청에 존재하는 아스코클로린은 1시간 후에 단백질로부터 방출될 수 없을 것이다. 단백질에 결합하는 아스코클로린을 거의 완벽하게 회수하기 위해서, 혼합물을 1주일 동안 실온에 방치할 필요가 있다. 게다가, 아스코클로린은 화합물-5가 투여된 래트의 혈청에 유기용매(아세토니트릴, 에탄올, 아세톤 등.)를 첨가하는 것 만으로는 분리되지 않았다. 즉, 혼합물이 아세트산을 첨가하므로써 산화될때까지 배출되지 않았다. 이러한 사실들을 기초로 하여, 혈액에 존재하는 아스코클로린은 혈청 단백질의 아미노기에 대한 공유결합을 통하여 시프 베이스를 형성할 수 있다고 예상되었다. 알데히드기와 아미노기 사이에서의 반응에 의한 시프 베이스의 형성에 있어서, 알칼리 조건하에서의 염기 형성으로, 그리고 산성 조건하에서의 분리로 평형이 이동한다. 공유결합으로 혈청 단백질에 대한 아스코클로린 결합을 배출시키기 위하여, 평형은 산화에 의해서 왼쪽 사이드로 이동하는 것이 필요하다.
결과적으로, 화합물-6은 생체내에서 시프 베이스의 형성을 조사하기 위하여 혈청에 첨가되었다. 화합물-6은 물에 거의 용해되지 않고, 인산염 완충 식염수(PBS)에서 0.8㎍/ml의 용해도를 나타낸다. 높은 농도로 디메틸 설폭사이드에 용해된 화합물-6은 소의 혈청에 대해서 일부분에 첨가될때, 화합물-6은 800mg/ml의비율(즉, 1000배)로 혈청에 용해되었고, 혈청은 화합물-6의 농도에 따라서 노란색으로 변하였다. 유기 용매(에탄올, 아세토니트릴 등)가 노란색 혈청에 첨가되었을때, 컬러화된 물질이 유기 용매에 용해된 것이 아니라, 노란색 혈청 단백질로서 침전되었다. 유기용매층은 화합물-6을 포함하고 있지 않다. 그러나, 화합물-6은 이 노란색 침전물에 1%의 아세트산을 포함하는 아세토니트릴을 첨가하고, 1주일 동안 혼합물을 방치하므로써 아세토니트릴 용액으로서 양적으로 회수되었다. 단백질과 약물 분자 사이의 반응에서, 약물과 생체내에서의 혈청 단백질 사이의 공유 결합의 형성을 통한 신규의 화합물로의 전환은 전혀 고려되지 않았다. 그러나, 본 발명의 화합물에 있는 벤젠 고리의 알데히드기와 혈청 단백질의 아미노기가 다음의 사실을 기초로 하여 시프 베이스를 형성하다는 것은 분명하다. (1) 본 발명의 화합물들은 화합물들이 투여된 동물들의 혈청으로부터 일반적인 방법으로 검출될 수 없었다. (2) 본 발명의 화합물들은 혈청에 많은 양의 산화된 유기 용매를 첨가하여 약 1주일 동안 실온에서 방치시키므로써 방출된다. (3) 본 발명의 화합물들이 생체내에 있는 혈청에 첨가되었을때, 1000-배만큼의 높은 비율로 용해되었고, 동물의 혈청으로부터 본 발명의 화합물들을 회수하는데 사용되는 것과 같은 방법으로 회수할 수 있다. (4) 화합물들이 첨가된, 동물의 혈청 또는 본 발명의 화합물들이 포함된 혈청은 노란색으로 변한다(즉, 알데히드기에 할당된 흡수는 사라지지만, 시프 베이스에 대한 다른 할당된 흡수가 나타난다.) 다시 말해서, 본 발명의 화합물들은 본 발명의 필수 성분으로서 혈청 단백질의 아미노기와 함께 시프 베이스를 형성하는 특징이 있다.
본 발명의 화합물과 혈청 단백질로 생체 내에서 형성된 시프 베이스는 세포에 직접 통합되지 않은 은폐된 화합물로서, 생물학적인 활성을 빠르게 나타내지 않는다(약효 또는 독성). 생물학적인 활성을 확립하기 위하여, 그러한 시프 베이스는 엔도시토시스(endocytosis)를 통하여 세포내에 있는 소포로 통합되어야만 하고, 유리 상태로 본 발명에 존재하는 화합물을 다시 생성하기 위하여 단백질 분자로 가수분해되어야만 한다. 따라서, 본 발명의 화합물들의 투여는 생물학적인 활성이 은폐되고, 느린 작용과, 부작용을 나타내지 않는 화합물의 투여와 동등하다.
래트를 사용한 실험
약 200g 무게의 수컷 위스타 래트들(n=4)이 적용되었고, 혈청에 포함된 화합물-1의 농도가 평균치±SE로 나타났다(도 9).
도 9에 있어서, 열린 써클은 화합물-5가 HCO-60로 용해되었고, 2mg/kg 경구 투여된 경우를 나타낸다. 도 9에 나타난 바와 같이, 화합물-5는 소화기를 통해서 빨리 흡수되었고, 혈액에 있는 아실라아제에 의해서 가수분해 되어서 화합물-1이 제공되었다. 그러나 유리된 화합물-1이 도 9에 표시된 농도로 나타났을때, 모든 래트들이 이후의 투여로 1시간 이내에 죽었다.
고체 써클은 화합물-5가 아라비아 고무 용액에 현탁되어, 30mg/kg가 경구투여된 경우를 나타낸다. 시간이 경과함에 따라 수집된 혈청의 부(part) 당, 1%의 아세트산을 포함하는 에탄올이 첨가되었고, 혼합물은 7일 동안 실온에서 어두운 상태로 방치되었다. 그 후, 화합물-1은 고성능 액체 크로마토그래피에 의해서 결정되었다.
열린 사각형은 화합물-5가 아라비아 고무 용액에 현탁되어, 경구투여된 경우를 나타낸다. 그 후, 혈액을 일정한 지점에서 모아서, 화합물-1이 그 후 바로 고기능 액체 크로마토그래피에 의해 결정되었다. 화합물-1은 이 경우에 검출되지 않았다. 별도로, 아라비아 고무 용액에 현탁된 화합물-5가 문맥으로 카뉼레화된 래트에게 경구 투여되었다. 그 후, 문맥 혈액이 시간이 지남에 따라 모아졌고, 화합물-1이 결정되었다. 도 8에 나타난 바과 같은 경우와 유사하게, 유리된 화합물-1이 혈청에 존재하지 않았다. 즉, 화합물-1은 1주일 동안 아세트산을 포함하는 에탄올에서 방치시킨 후에 방출된 시프 베이스 타입 화합물로 형성되었다.
혈청과 본 발명의 화합물과의 반응
화합물-14, 화합물-5 및 화합물-6은 폴리에틸렌 글리콜-400에 각각 용해되었고, 그런 후에 소의 혈청에 첨가되어 500㎍/ml의 농도로 되어, 실온에서 방치되었다. 일정한 점에 있어서, 혈청이 샘플화되어 2부분으로 나누어졌다. 아세토니트릴의 열배가 이 부분들 중의 하나에 첨가되었고, 혼합물이 원심분리되었다. 그 후에 혈청에 있는 유리 화합물이 결정되었다. 다른 부분에 대해서, 1%의 아세트산을 포함하는 아세토니트릴의 10배가 첨가되었다. 1주일 동안 실온에서 방치시킨 후에, 혼합물을 원심분리하여, 유리된 화합물을 결정하였다(도 10)
도 10에 명확하게 나타난 바와 같이, 아세토니트릴의 첨가에 의해서 단백질이 분리된 혈청에 남아 있는 각각의 화합물이 시간이 경과함에 따라 감소하였다. 그러나, 이러한 감소는 분명게 하나일 뿐이었다. 이 경우에 있어서, 1%의 아세트산이 포함된 아세토니트릴이 혈청에 첨가되었고, 결정에 의하여 혼합물이 1주일 동안실온에 방치되었고, 각각의 화합물은 98∼102%의 수율로 회수되었다. 화합물-5의 경우에 있어서, 아실화된 유도체는 실온에 방치되어 화합물-1을 제공하는 기간에 가수분해되었다. 각각의 두개의 화합물들은 얻는데 기초가 되는 화합물-5의 전환 수준을 측정하므로써 레벨이 결정되었다. 반면에, 화합물-6과 화합물-14는 1%의 아세트산을 포함하는 아세토니트릴을 첨가한 후에 1주일 동안 실온에서 방치하므로써 원심분리된 상청액에서 양적으로 거의 모든 양을 회수할 수 있었다.
본 발명은 레티노이드 X수용체의 리간드와 어떤 유전정보의 레티노이드 X수용체 리간드(RXRL) 의존성 전사조절에 의하여 경감될 수 있는 질병의 치료 및/또는 예방을 위한 약제조성물에 관한 것이다.

Claims (21)

  1. 오르실알데히드 성분과 이 오르실알데히드 성분의 3-위치에 부착된 터페노이드 성분을 갖는 아스코클로린 및 그 유사체들로부터 선택되는 레티노이드 X 수용체 리간드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 아스코클로린 및 그 유사체들은 아스코클로린, 실린드로클로린, 4'-히드록시-5'-히드로아스코클로린, 4'-아세톡시-5'-히드로아스코클로린(클로르넥틴), 4',5'-디히드로아스코클로린 및 그 유사체들, 및 상기 오르실알데히드 성분의 2- 및/또는 4-위치(들)에 있는 히드록실기(들)의 알킬화 및/또는 아실화에 의해 얻어진 그의 유사체들로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 레티노이드 X 수용체 리간드.
  3. 제2항에 기재된 화합물들로 이루어진 군에서 선택되는 화합물의 레티노이드 X 수용체 리간드로서의 사용.
  4. 유전자 전사의 레티노이드 X 수용체 리간드(RXRL)-의존적 조절에 의해 완화될 수 있는 질병 또는 상태를 치료 및/또는 예방하기 위한 유효량의 제2항에 기재된 화합물들로 이루어진 군에서 선택되는 화합물과 약제학적으로 허용가능한 첨가제를 포함하는 것을 특징으로 하는, 유전자 전사의 레티노이드 X 수용체 리간드(RXRL)-의존적 조절에 의해 완화될 수 있는 질병 또는 상태를 치료 및/또는 예방하기 위한 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 질병 또는 상태는 인슐린 내성의 발현에 의해 발생하는 질병들, 고혈압증, 뇌혈관내층장애, 류마티스성 관절염, 자가면역질병, 칼슘대사장애, 당뇨병 합병증, 경피 경관강 관상혈관성형술에 따른 동맥성 재발협착증 및 이식조직에서의 동맥경화증으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 조성물.
  6. 췌장의 랑게르한스섬 β-세포의 변성 및/또는 괴사를 방지하기 위한 유효량의 제2항에 기재된 화합물들로 이루어진 군에서 선택된 화합물과 약제학적으로 허용가능한 첨가제를 포함하는 것을 특징으로 하는, 췌장의 랑게르한스섬 β-세포의 인슐린 생산능을 유지하기 위해 상기 세포의 변성 및/또는 괴사를 방지하기 위한 조성물.
  7. 제4항 내지 제6항중 어느 한항에 있어서, 상기 첨가제는 합성 지방족 계면활성제 또는 유기 용매에 가용성인 폴리머 물질인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 포유류에 있어서 유전자 전사의 RXRL-의존적 조절에 의해 완화될 수 있는 질병 또는 상태를 치료 및/또는 예방하기 위한 유효량의 제2항에 기재된 화합물들로 이루어진 군에서 선택되는 화합물을 임의로 약제학적으로 허용가능한 첨가제와 함께 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서의 유전자 전사의 RXRL-의존적 조절에 의해 완화될 수 있는 질병 또는 상태의 치료 및/또는 예방방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 질병 또는 상태는 인슐린 내성에 의해 특징지워지는 질병들, 고혈압증, 뇌혈관내층장애, 류마티스성 관절염, 자가면역질병, 칼슘대사장애, 당뇨병 합병증, 경피 경관강 관상혈관성형술에 따른 동맥성 재발협착증 및 이식조직에서의 동맥경화증으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 방법.
  10. 췌장의 랑게르한스섬 β-세포의 변성 및/또는 괴사를 방지하기 위한 유효량의 제2항에 기재된 화합물들로 이루어진 군에서 선택된 화합물과 약제학적으로 허용가능한 첨가제를 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서의 췌장의 랑게르한스섬 β-세포의 인슐린 생산능을 유지하기 위해 상기 세포의 변성 및/또는 괴사를 방지하는 방법.
  11. 제8항 내지 제10항중 어느 한항에 있어서, 상기 첨가제는 합성 지방족 계면활성제 또는 유기 용매에 가용성인 폴리머 물질인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 포유류에 있어서 유전자 전사의 RXRL-의존적 조절에 의해 완화될 수 있는 질병 또는 상태를 치료 및/또는 예방하기 위해, 임의로 약제학적으로 허용가능한 첨가제와 조합하여 사용되는 것을 특징으로 하는, 유효량의 제2항에 기재된 화합물들로 이루어진 군에서 선택되는 화합물의 사용.
  13. 제12항에 있어서, 상기 질병 또는 상태는 인슐린 내성에 의해 특징지워지는 질병들, 고혈압증, 뇌혈관내층장애, 류마티스성 관절염, 자가면역질병, 칼슘대사장애, 당뇨병 합병증, 경피 경관강 관상혈관성형술에 따른 동맥성 재발협착증 및 이식조직에서의 동맥경화증으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 사용.
  14. 포유류에서의 췌장의 랑게르한스섬 β-세포의 인슐린 생산능을 유지하기 위해 상기 세포의 변성 및/또는 괴사를 방지하기 위해, 임의로 약제학적으로 허용가능한 첨가제와 조합하여 사용되는 것을 특징으로 하는, 유효량의 제2항에 기재된 화합물들로 이루어진 군에서 선택된 화합물의 사용.
  15. 제12항 내지 제14항중 어느 한항에 있어서, 상기 첨가제는 합성 지방족 계면활성제 또는 유기 용매에 가용성인 폴리머 물질인 것을 특징으로 하는 사용.
  16. 포유류에 있어서 유전자 전사의 RXRL-의존적 조절에 의해 완화될 수 있는 질병 또는 상태를 치료 및/또는 예방하기 위한 약제의 제조를 위해, 임의로 약제학적으로 허용가능한 첨가제와 조합하여 사용되는 것을 특징으로 하는, 제2항에 기재된 화합물들로 이루어진 군에서 선택되는 화합물의 사용.
  17. 제16항에 있어서, 상기 질병 또는 상태는 인슐린 내성에 의해 특징지워지는 질병들, 고혈압증, 뇌혈관내층장애, 류마티스성 관절염, 자가면역질병, 칼슘대사장애, 당뇨병 합병증, 경피 경관강 관상혈관성형술에 따른 동맥성 재발협착증 및 이식조직에서의 동맥경화증으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 사용.
  18. 포유류에서의 췌장의 랑게르한스섬 β-세포의 인슐린 생산능을 유지하기 위해 상기 세포의 변성 및/또는 괴사를 방지하기 위한 약제의 제조를 위해, 임의로 약제학적으로 허용가능한 첨가제와 조합하여 사용되는 것을 특징으로 하는, 제2항에 기재된 화합물들로 이루어진 군에서 선택된 화합물의 사용.
  19. 제16항 내지 제18항중 어느 한항에 있어서, 상기 첨가제는 합성 지방족 계면활성제 또는 유기 용매에 가용성인 폴리머 물질인 것을 특징으로 하는 사용.
  20. 레티노이드 X 수용체 리간드로서 작용할 수 있는 화합물과 혈청 단백질의 아미노기로부터 형성된 시프 염기.
  21. 제20항에 있어서, 상기 화합물은 제2항에 기재된 화합물들로 이루어진 군에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 염기.
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