KR101865404B1

KR101865404B1 - 혈관내피성장인자를 과발현한 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR101865404B1
Application number: KR1020170015676A
Authority: KR
Inventors: 배재성; 진희경; 박민희
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2016-02-05
Filing date: 2017-02-03
Publication date: 2018-06-07
Also published as: US11007228B2; EP3412296A1; US20190030082A1; KR20170093737A; EP3412296A4; WO2017135753A1

Abstract

본 발명은 혈관내피성장인자를 과발현한 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 혈관내피성장인자 (Vascular endothelial growth factor, VEGF)가 과발현된 줄기세포는 퇴행성 신경질환에 의하여 발생한 SVZ 내 신경줄기세포에서의 VEGF 감소를 효과적으로 회복시켜, 신경줄기세포의 비정상적인 이동을 저해하고 염증반응을 억제하며, 대뇌 피질의 콜레스테롤 및 스핑고지질의 축적을 억제하여 동물모델의 행동 및 운동능력의 회복을 야기하는 바, 효과적인 퇴행성 신경질환의 치료제로 활용될 수 있다.

Description

혈관내피성장인자를 과발현한 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 {Composition for preventing or treating neurodegenerative disease comprising stem cell overexpressing VEGF}

본 발명은 혈관내피성장인자를 과발현한 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

세계적으로 노년인구의 증가로 퇴행성 신경질환(NDDs)은 심장혈관계 질환에 이어 두 번째 사망원인인 암을 따라잡을 것으로 전망된다. 이에 따라 퇴행성 신경질환 치료제 시장도 2000년 이후 20% 정도의 고성장을 하고 있는 것으로 나타났다. 이와 같이 퇴행성 신경질환에 대한 관심은 날로 높아지고 있는 실정이다.

퇴행성 신경질환은 점차적으로 신경세포가 소멸됨으로써 인지능력 상실, 운동기능 상실 등을 초래하여 사망에 이르게 하는 질환이다. 니만픽병(Niemann-pick disease), 알츠하이머병(Alzheimers disease, AD), 파킨슨병(Parkinson's disease, PD) 등이 대표적이며 노화의 과정에 따라 그 발병빈도가 증가하는 특징이 있다. 뇌의 노화와 퇴행성 신경질환과의 상관관계에 대해서는 아직 완전하게 밝혀져 있지 않으나 두 가지 과정 간에는 뇌세포의 소멸과 뇌 용량감소 등 공통된 특성들이 많이 나타나고 있다.

이들 퇴행성 신경질환 중 니만픽병은 스핑고지질(sphingolipid)의 대사 장애로 인해 여러 장기에 스핑고리피드와 콜레스테롤이 축적되어 다양한 임상 증상을 보이는 드문 상염색체 열성 유전질환이다. 원인 유전자와 임상 양상에 따라 A, B, C, D의 아형으로 분류되어 A, B 형은 스핑고미엘린분해효소(sphingomyelinase)의 결핍으로 인해 발생함이 먼저 알려졌고, 이후에 C, D형은 콜레스테롤의 수송장애로 인해 발생함이 밝혀졌다. 임상적으로 아급성의 다양한 만성 경과를 보이는 C형은 보고에 따라 10만명 당 0.6 내지 0.8 명 정도의 유병률을 보이는 것으로 알려져 있고, NPC1 유전자의 변이에 의한 C1형이 전체의 95% 가량을 차지한다. C형 니만픽병에서 콜레스테롤은 내장기관과 신경계에 특징적으로 축적되는 양상을 보이는데, 축적되는 장기에 따른 증상이 발현되며 치명률은 주로 중추신경계 침착의 진행에 따라 결정된다. 최근의 연구에 따르면 스핑고신(sphingosine)이 C형 니만픽병의 주요한 침착 물질임이 밝혀졌다. C형 니만픽병은 임상적으로 매우 다양한 경과를 보일 수 있어서 발병시기가 신생아부터 70대까지 다양하게 보고되어 있고, 유병기간이 짧게는 수일에서 길게는 60여년에 이른다. 간비종대, 보행장애, 안구운동장애 및 인지장애 등이 비교적 특징적으로 나타나는데, 중추신경계에서는 소뇌와 뇌간을 선택적으로 잘 침범하여 신경세포의 수초형성장애(dysmyelination)와 소뇌 퍼킨제세포(Purkinje cell)의 변성을 초래하여 관련한 증상을 유발한다. 그러나, 아직까지 이에 대한 적절한 치료제가 존재하지 않는 바, 니만픽병의 예방 및 치료제의 개발이 절실한 실정이다.

한편, 혈관내피성장인자(VEGF, vascular endothelial growth factor)는 혈관신생(angiogenesis)과 관련된 가장 중요한 성장 인자 중 하나이다. VEGF는 PKC를 통해 내피 세포를 자극하고 이어서 ERK1/2의 활성화를 유도하나, 이의 정확한 기전에 대해서는 알려진 바가 없다. 또한 VEGF 수용체가 다양한 암 조직에서 발견되며, 암세포에서의 VEGF의 세포 분열 촉진 효과가 보고된 바 있으며, 최근에는 VEGF와 퇴행성 신경질환과의 상관관계에 대한 보고도 증가하고 있는 추세이다.

또한, 본 발명자도 종래 연구 및 특허에서 (KR 출원번호 10-2014-0149347)에서 VEGF의 투여가 니만픽병의 치료 및 예방에 이용될 수 있음을 확인한 바 있으나, 이러한 VEGF의 적합한 전달 및 투여에 대한 연구는 아직 보고된 바 없다.

이에 본 발명자는 혈관내피성장인자 (VEGF)의 효과적인 전달 및 투여 부위를 특정하기 위하여 예의 노력한 결과, 혈관내피성장인자가 과발현된 줄기세포를 니만픽병 동물모델의 뇌실하영역 (SVZ)에 직접 주입하는 경우, VEGF가 감소된 SVZ영역으로 VEGF가 효과적으로 전달되는 것을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

이에, 본 발명의 목적은 혈관내피성장인자 (Vascular endothelial growth factor, VEGF)가 과발현된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 혈관내피성장인자 (Vascular endothelial growth factor, VEGF)가 과발현된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

이하 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.

본 발명은 혈관내피성장인자 (Vascular endothelial growth factor, VEGF)가 과발현된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 “혈관내피성장인자 (Vascular endothelial growth factor, VEGF)”는 혈관내피세포에 선택적으로 작용하는 성장인자로 34-42kDa의 당단백질로 이루어져있으며, 세포막에 있는 수용체인 VEGFR-1 에 작용하여 인지질효소 C(phospholipase C)를 활성화 시켜 혈관내피 세포를 증식시키고, 혈관의 투과성을 증가시켜 혈장 단백을 배출시키고 섬유소를 침착시킴으로 신생혈관생성을 유발하는 것으로 알려져 있다(Shibuya, 1995).

상기 혈관내피성장인자(VEGF)를 코딩하는 염기서열은 GenBank ID :NM_001025366.2의 염기서열이다.

상기 혈관내피성장인자(VEGF)는 상기 염기서열로 코딩한 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 상기 염기서열로 코딩된 VEGF와 실질적으로 동일한 활성을 나타내는 단백질을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 “줄기세포”는, 다양한 신체 조직으로 분화할 수 있는 능력을 갖는 미분화 세포로서, 이는 만능 줄기 세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포 (pluripotent stem cell), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)로 분류될 수 있다.

본 발명에서 줄기세포는 그 유래 또는 유형에 따라, 성체줄기세포, 배아줄기세포, 중간옆 줄기세포, 종양줄기세포 또는 유도만능줄기세포일 수 있다.

또한, 상기 성체줄기세포는 신경줄기세포 또는 신경전구세포일 수 있다. 신경줄기세포 (Neural stem cell, NSC)는 자기 재생산 (self-renewal)이 가능하고, 신경계통 세포로의 분화능을 가진 세포로서, 신경줄기세포는 신경 세포 (neuron), 성상교세포 (astrocyte), 희소돌기아교세포 (oligodendrocyte)로 분화될 수 있는 세포이다.

또한, 본 명세서에서 사용된 용어 “중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)”는 뼈, 연골, 지방, 근육세포를 포함한 여러 가지 중배엽성 세포 또는 신경세포와 같은 외배엽성 세포로도 분화하는 능력을 가진 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)이다. 상기 중간엽 줄기세포는 바람직하게는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막, 융모막, 탈락막, 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 것으로부터 유래될 수 있다. 또한, 상기 중간엽 줄기세포는 인간, 태아, 또는 인간을 제외한 포유동물로부터 유래될 수 있다. 상기 인간을 제외한 포유동물은 보다 바람직하게는 개과 동물, 고양이과 동물, 원숭이과 동물, 소, 양, 돼지, 말, 랫트, 마우스 또는 기니피그 등일 수 있으며, 그 유래를 제한하지 않는다.

상기 유효성분은 상기 줄기세포를 포함하는 줄기세포 배양액, 상기 배양물의 농축물 등을 포함하는 개념이다.

본 발명의 혈관내피성장인자 (Vascular endothelial growth factor, VEGF)가 과발현된 줄기세포는 혈관내피성장인자를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 의한 것일 수 있다. 상기 재조합 벡터는 줄기세포내 VEGF 유전자를 과발현시킬 수 있어야 하므로, 재조합 발현 벡터 형태인 것이 바람직하다. 상기 재조합 발현 벡터는 상업적으로 입수 가능한 기본 벡터 (즉, 백본 벡터)에 APP 코딩 핵산과 개과의 신경계 세포에서 기능을 발휘할 수 있는 조절 서열 (예, 프로모터, 분비 서열, 인핸서, 업스트림 활성화 서열, 전사종결인자 등)을 작동 가능하게 연결하여 제조할 수 있다. 상기 재조합 발현 벡터는 선택 마커를 포함할 수 있으며, 상기 선택 마커에는 카나마이신 저항성 유전자, 네오마이신 저항성 유전자와 같은 항생제 저항성 유전자 및 녹색 형광 단백질, 적색 형광 단백질과 같은 형광 단백질 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.

상기 형질전환은 공지된 방법에 따라 진행할 수 있는데, 예를 들면 칼슘 포스페이트 형질전환 (calcium phosphate transfection), 전기천공(electrophoresis), 형질도입(transduction), DEAE-덱스트란 매개 형질전환 (DEAE-dextran mediated transfection), 미세주입(microinjection), 양이온 지질-매개 형질전환(cationic lipid-transfection), 총알식 도입(ballistic introduction) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

특히, 본 발명의 상기 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 대상의 뇌실하 영역 (Subventricular zone, SVZ)으로 직접 주입되는 것을 특징으로 한다.

발생 초기 신경판(neural plate)에서 신경관(neural tube)이 만들어지고 신경관의 강(cavity)이 발생 과정을 거치면서 뇌실(ventricle)을 형성한다. 뇌실의 가장 가까이 위치한 세포층을 뇌실 영역(ventricular zone)이라 하고 신경발생 과정을 거치면서 뇌실 영역 위로 추가의 증식 가능한 세포층이 형성되는 데 이를 뇌실하 영역(subventricular zone)이라고 부른다. 뇌실 영역과 뇌실하 영역에 존재하는 전구세포들은 신경줄기세포(neural stem cell)의 특성을 가지고 있으며 복잡한 제어방법을 거쳐 중추신경계를 구성하는 신경세포(neuron), 성상세포(astrocyte), 희돌기세포(oligodendrocyte)로 분화할 수 있다[Dehay and Kennedy, Nat RevNeurosci8:438-450,2007; Molyneaux etal., NatRevNeurosci8:427-437,2007; Angevine and Sidman, Nature192:766-768,1961; Caviness and Takahashi, BrainDev17:159-163,1995].

정상적인 SVZ 환경에서의 신경줄기세포들은 부리쪽 이동 줄기(rostal migratory stream, RMS)를 통해 후각구(olfactory bulb, OB)로 이동하여 뉴런으로 분화하게 된다. 다양한 신호 전달체계가 이러한 신경줄기세포들의 이동 패턴을 조절하게 되는데 종래 보고에 따르면 VEGF가 이러한 조절 신호들 중 하나이다(Neuron. 70, 687-702 (2011), J Neurosci. 29, 8704-8714 (2009), J Neurosci Res. 88, 248-257 (2010).)

본 발명의 일실시예에 따르면, 니만픽병 마우스의 SVZ 영역에 존재하는 신경줄기세포들은 정상 마우스와 비교해 VEGF의 발현이 현저하게 저하되어 있는 것으로 확인이 되었으며, 이러한 신경줄기세포들은 상기한 정상적인 이동경로가 아닌 thalamus로 이동하는 비정상적인 양상을 나타내었다. 결과적으로, 니만픽병 마우스의 thalamus와 cortex에 염증반응이 증가하고 뇌에 콜레스테롤 및 스핑고지질이 축적되어 동물의 감각기능, 운동기능이 실조되는 현상이 나타났다.

한편, 본 발명자가 니만픽병 마우스의 SVZ 영역에 VEGF가 과발현된 신경줄기세포를 직접적으로 투여한 결과, 신경줄기세포들의 비정상적인 이동이 감소하고 thalamus와 cortex에서의 염증반응이 억제되었으며, 동물의 감각기능, 운동기능이 회복되고, 생존율까지 향상되는 효과가 나타났다.

본 발명자는 니만픽병 마우스의 SVZ 영역에 VEGF가 과발현된 신경줄기세포뿐만 아니라, 정상적인 신경줄기세포 또는 VEGF를 과발현시킬 수 있는 벡터를 각각 투여해 보았는데 아무런 개선효과가 나타나지 않았다. 즉, 손상된 SVZ 환경을 개선하는 것은 정상신경줄기세포 또는 VEGF 중 어느 하나만으로는 가능하지 않고, VEGF가 과발현된 신경줄기세포의 형태로 투여가 되었을 때에만 그 효과가 발휘된다는 것을 확인한 것이다.

SVZ 영역의 손상이 니만픽병의 발병 과정에서 매우 중추적인 역할을 담당한다는 것과, 손상된 SVZ 환경을 개선함으로써 니만픽병을 비롯한 다양한 퇴행성 신경질환을 예방 또는 치료할 수 있다는 것은 종래 보고된 바 없는 것으로 본 발명자가 본 발명을 통해 최초로 공개하는 바이다.

상기 “손상된 SVZ 환경”이라는 것은 SVZ에 존재하는 신경줄기세포의 VEGF 발현이 저하되어 thalamus로의 비정상적인 이동양상을 나타내는 것을 의미하며, 이를 “개선”한다는 것은 SVZ에 VEGF를 과발현하는 신경줄기세포를 투여하여 신경줄기세포의 비정상적인 이동을 억제하고, 정상적인 뇌의 기능을 회복시키는 것을 의미한다.

본 발명의 다른 일실시예에 따르면 SVZ 환경이 손상되면 SVZ 환경 내에 존재하는 신경줄기세포들의 생존률이 감소하고, 대뇌 피질에 스핑고지질, 콜레스테롤 등이 축적되는 것을 확인할 수 있었다. 한편, 이렇게 손상된 SVZ 환경에 VEGF가 과발현된 신경줄기세포를 직접 투여한 결과 신경줄기세포들의 생존률이 증가하고, 스핑고지질, 콜레스테롤의 축적이 감소하는 결과가 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명의 약학적 조성물은 니만픽병 뿐만 아니라, SVZ 환경 내 신경줄기세포들의 감소, 콜레스테롤 또는 스핑고지질의 뇌 축적에 의해 나타나는 퇴행성 신경질환을 예방 또는 치료하는 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명에서 상기 퇴행성 신경질환은 니만픽병, 알츠하이머, 파킨슨병, 루게릭병, 조현병(schizophrenia), 고셔(Gaucher)병, 파브리(Fabry)병, 테이색스(Tay-Sachs)병, 샌드호프(Sandhoff)병 및 소뇌실조증으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다. 바람직하게는 니만픽병 또는 소뇌실조증일 수 있으며, 가장 바람직하게는 니만픽병일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 니만픽(Niemann-Pick)병은 세망내피 세포에 지질이 축적되는 질환으로 유전질환에 해당한다. 본 발명의 니만픽병은 그 유형을 제한하지 않으며, 예를 들어, A형, B형, C형, D형, E형 또는 F형 니만픽병일 수 있다.

특히, 본 발명의 니만픽 병은 C형 니만픽 병일 수 있다. C형 니만피크병은 단백질·당질과 더불어 생체를 구성하는 주요 유기물질인 지질의 대사 장애 때문에 세포에 스핑고지질과 콜레스테롤이 쌓여 기억·지능장애 등의 각종 신경장애를 일으키는 유전질환이다.

본 발명의 일실시예에 따르면, SVZ 환경이 손상되면 소뇌 신경세포가 손상되어 그 수가 감소하고 염증반응이 증가하였으나, VEGF가 과발현된 신경줄기세포를 SVZ에 투여한 결과 소뇌 신경세포의 손상이 예방되고 염증반응이 완화되는 결과가 나타났다. 따라서, VEGF가 과발현된 신경줄기세포를 SVZ에 투여함으로써 소뇌실조증(cerebellar ataxia)을 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명에서 상기 소뇌실조증이란 소뇌의 기능이상으로 인해 동작이 서투르고 동작간의 협조가 되지 않는 증상이 나타나는 신경질환을 의미하는 것으로, 다양한 내과적, 신경과적 질환 또는 유전적 소인에 의해 유발되는 소뇌실조증을 모두 포함한다.

알츠하이머, 파킨슨병, 루게릭병 및 조현병은 니만픽병과 마찬가지로 SVZ 환경 내 존재하는 신경줄기세포의 수 및 증식이 감소되어 있다고 보고된 질환들이다(Nat Rev Neurosci. 2007 Sep;8(9):712-23. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 2017 Jan;174(1):93-112). 본 발명의 일실시예에 따르면, SVZ 영역에 VEGF가 과발현된 신경줄기세포를 투여하면 SVZ 환경의 신경줄기세포 생존율이 증가하고 뇌의 염증반응이 감소하는 결과를 나타냈기 때문에 본 발명의 약학적 조성물을 이용하여 상기 퇴행성 신경질환들을 예방 또는 치료할 수 있다.

한편, 고셔(Gaucher)병, 파브리(Fabry)병, 테이색스(Tay-Sachs)병 및 샌드호프(Sandhoff)병은 지질대사의 장애로 인해 니만픽경과 같이 뇌에 리피드가 축적이 되어 발생한다고 보고가 되어 있는 질환들이다(Nature. 2014 Jun 5;510(7503):68-75, Trends Cell Biol. 2003 Apr;13(4):195-203., FEBS Lett. 2010 May 3;584(9):1748-59.). 본 발명의 일실시예에 따르면, SVZ 영역에 VEGF가 과발현된 신경줄기세포를 투여하면 콜레스테롤, 스핑고지질의 뇌 축적이 감소하는 결과를 나타났기 때문에 본 발명의 약학적 조성물을 이용하여 상기 퇴행성 신경질환들을 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명에서 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 상기 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 비경구용 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제 또는 동결건조제제, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽 또는 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 치료용 조성물은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있다.

예를 들어, 경구 투여시에는 결합체, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 또는 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물을 이용하여 퇴행성 신경질환을 치료하는 방법은 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질이 도입되는 일반적인 경로를 통하여 투여하는 것을 포함할 수 있다. 상기 투여방법으로는 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장 내 투여가 있으나, 이에 제한되지 않으며, 가장 바람직하게는 뇌실하 영역으로 직접 투여된다.

또한, 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 바람직한 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제 또는 점적 주사제 등이다. 주사제는 생리식염액 또는 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스테르 (예로, 올레인산에칠 등), 알코올류(예로, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜 또는 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제 (예로, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제 (예로, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약제학적 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물을 이용하여 퇴행성 신경질환을 치료 또는 예방하는 방법은, 본 발명의 치료용 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 상기 약학적 유효량은 질환의 종류, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법, 투여 횟수, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명은 또한 혈관내피성장인자 (Vascular endothelial growth factor, VEGF)가 과발현된 줄기세포를 포함하는 식품 조성물을 제공할 수 있다. 상기 식품 조성물은 건강기능성 식품일 수 있다. ‘건강기능식품’이란 질병의 예방 및 개선, 생체방어, 면역, 병후의 회복, 노화 억제 등 생체조절 기능을 가지는 식품을 말하는 것으로, 장기적으로 복용하였을 때 인체에 무해하여야 한다.

본 발명의 유효성분은 퇴행성 신경질환의 예방 또는 개선을 목적으로 건강기능식품에 첨가될 수 있다. 본 발명의 혈관내피성장인자 (Vascular endothelial growth factor, VEGF)가 과발현된 줄기세포를 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 혈관내피성장인자 (Vascular endothelial growth factor, VEGF)가 과발현된 줄기세포를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합 양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 유효성분은 원료에 대하여 15중량 % 이하, 바람직하게는 10 중량 % 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ml 당 일반적으로 약 0.01 내지 10g, 바람직하게는 약 0.01 내지 0.1 g 이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 상기 ‘치료’는 퇴행성 신경질환 또는 퇴행성 신경질환과 관련된 질환의 증상을 개선시키는 것을 포괄적으로 지칭하고, 이는 이러한 질환을 치유하거나, 실질적으로 예방하거나, 또는 상태를 개선시키는 것을 포함할 수 있으며, 퇴행성 신경질환 또는 퇴행성 신경질환과 관련된 질환으로부터 비롯된 한 가지 증상 또는 대부분의 증상을 완화시키거나, 치유하거나 예방하는 것을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 혈관내피성장인자 (Vascular endothelial growth factor, VEGF)가 과발현된 줄기세포의 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 제제를 제조하기 위한 혈관내피성장인자(VEGF)가 과발현된 줄기세포의 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 혈관내피성장인자(VEGF)가 과발현된 줄기세포의 유효량을 이를 필요로 하는 개체의 뇌실하 영역(Subventricular zone, SVZ)에 투여하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 상기 ‘유효량’이란 개체에게 투여하였을 때, 신경줄기세포의 thalamus로의 비정상적인 이동을 저해하거나, 대뇌 피질에서 콜레스테롤, 스핑고지질의 축적을 억제하거나, thalamus, cortex에서의 염증반응을 완화시키거나 또는 개체의 운동기능 및 감각기능을 회복시킬 수 있는 양을 말하고, 상기‘개체’란 동물, 바람직하게는 포유동물, 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며, 동물에서 유래한 세포, 조직, 기관 등일 수도 있다. 상기 개체는 상기 효과가 필요한 환자(patient) 일 수 있다.

상기 퇴행성 신경질환에 대해서는 전술한 바와 같다.

본 발명에 따른 혈관내피성장인자 (Vascular endothelial growth factor, VEGF)가 과발현된 줄기세포는 퇴행성 신경질환에 의하여 발생한 SVZ 내 신경줄기세포에서의 VEGF 감소를 효과적으로 회복시켜, 신경줄기세포의 비정상적인 이동을 저해하고 염증반응을 억제하며, 대뇌 피질의 콜레스테롤의 축적을 억제하여 동물모델의 행동 및 운동능력의 회복을 야기하는 바, 효과적인 퇴행성 신경질환의 치료제로 활용될 수 있다.

도 1a는 정상(WT) 및 NP-C 마우스의 SVZ 내 존재하는 신경줄기세포들의 비율을 확인한 도이다 (n = 6 per group). * p < 0.05. 데이터는 평균± s.e.m으로 나타내었다.
도 1b는 정상(WT) 및 NP-C 마우스의 SVZ 조직에서 분리한 신경줄기세포의 VEGF의 발현을 확인한 도이다 (n = 4 per group). ** p < 0.01. 데이터는 평균± s.e.m으로 나타내었다.
도 1c는 정상 및 NP-C 마우스 SVZ 면역형광염색을 통해 신경줄기세포 내 발현하는 VEGF를 확인하고(좌) 이를 정량화하여 그래프로 나타낸 것이다(우)(n = 4 per group). *** p < 0.001. 데이터는 평균± s.e.m으로 나타내었다.
도 2a는 정상 및 NP-C 마우스의 SVZ에 신경줄기세포 표지 형광물질인 MPIO를 주입하여 SVZ 신경줄기세포의 이주를 확인하기 위한 실험 디자인 도이다.
도 2b는 정상 및 NP-C 마우스 SVZ에 MPIO 주입 후 7일째와 21일째에 뇌 부위별로 MPIO 형광물질이 표지된 신경줄기세포 존재 여부를 확인하고, 이를 정량화하여 그래프로 나타낸 것이다 (n = 6 per group, ①=LV, ②=RMS, ③=OB, ④=LLV, ⑤=thalamus). * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001. 데이터는 평균± s.e.m으로 나타내었다.
도 3a는 SVZ 환경에 존재하는 신경줄기세포의 손상을 유도하기 위해 NPC^fl ^/fl 또는 VEGF^fl ^/ ^fl마우스의 SVZ에 GFAP/CD133 split-cre를 주입하여 SVZ 신경줄기세포에 특이적으로 NPC 또는 VEGF의 발현을 감소시켜 SVZ의 손상이 전체 뇌에 어떠한 영향을 주는지 확인하기 위한 실험 디자인 도이다.
도 3b는 GFAP/CD133 split-cre를 SVZ에 4주간 주입 받은 NPC^fl ^/ ^fl,VEGF^fl ^/ ^fl마우스의 SVZ내 신경줄기세포들의 비율을 확인한 도이다 (n = 6 per group). ** p < 0.01. 데이터는 평균± s.e.m으로 나타내었다.
도 3c는 GFAP/CD133 split-cre를 SVZ에 4주간 주입 받은 NPC^fl ^/fl 또는VEGF^fl ^/fl 마우스의 SVZ 환경의 염증반응을 확인한 도이다 (GFAP: astrocyte, Iba-1: microglia. n = 6 per group). * p < 0.05, *** p < 0.001. 데이터는 평균± s.e.m으로 나타내었다.
도 3d는 GFAP/CD133 split-cre와 MPIO를 SVZ에 주입 받은 NPC^fl ^/fl 또는 VEGF^fl/fl 마우스의 뇌 부위별로 MPIO 형광물질이 표지된 신경줄기세포 존재 여부를 확인한 도이다 (n = 6 per group). ** p < 0.01, *** p < 0.001. 데이터는 평균± s.e.m으로 나타내었다.
도 3e는 GFAP/CD133 split-cre를 SVZ에 4주간 주입 받은 NPC^fl ^/fl 또는 VEGF^fl/fl 마우스의 SVZ와 Thalamus 조직에서 신경줄기세포의 존재 여부를 Neurosphere(NS) 배양을 통해 확인한 도이다 (n = 6 per group). ** p < 0.01. 데이터는 평균± s.e.m으로 나타내었다.
도 3f는 GFAP/CD133 split-cre를 SVZ에 4주간 주입 받은 NPC^fl ^/fl 또는 VEGF^fl/fl마우스의 thalamus, cortex의 염증반응을 확인한 도이다 (GFAP: astrocyte, Iba-1: microglia. n = 6 per group). * p < 0.05, ** p < 0.01. 데이터는 평균± s.e.m으로 나타내었다.
도 3g는 GFAP/CD133 split-cre를 SVZ에 4주간 주입 받은 NPC^fl ^/fl 또는VEGF^fl ^/fl 마우스의 cortex에서 콜레스테롤과 리피드 축적을 확인한 도이다 (n = 6 per group). * p < 0.05. 데이터는 평균± s.e.m으로 나타내었다.
도 4a 와 4b는 GFAP/CD133 split-cre를 SVZ에 4주간 주입 받은 NPC^fl ^/fl 또는 VEGF^fl/fl마우스의 감각 기능(a) 및 운동 기능(b) 손상 여부를 확인한 도이다 (n = 10-13 per group). * p < 0.05, ** p < 0.01. 데이터는 평균± s.e.m으로 나타내었다.
도 5a는 NP-C마우스의 손상된 SVZ 환경을 개선시키기 위해 정상 신경줄기세포 (WT NSCs), VEGF를 과발현하는 신경줄기세포 (VEGFtg NSCs), VEGF를 과발현하는 벡터 (VEGF OX vector)를 주입하기 위한 실험 디자인에 관한 도이다.
도 5b는 NP-C 마우스의 SVZ에 정상 신경줄기세포, VEGF를 과발현하는 신경줄기세포, VEGF를 과발현하는 벡터를 1주간 두 번씩 총 4주를 주입한 후 SVZ내 신경줄기세포들의 퍼센트를 확인한 도이다 (n = 6 per group). * p < 0.05, *** p < 0.001. 데이터는 평균± s.e.m으로 나타내었다.
도 5c와 5d는 NP-C 마우스의 SVZ에 정상 신경줄기세포, VEGF를 과발현하는 신경줄기세포, VEGF를 과발현하는 벡터를 1주일에 두 번씩 총 4주를 주입한 후 SVZ, Thalamus, Cortex의 염증반응을 확인한 도이다 (GFAP: astrocyte, Iba-1: microglia. n = 6 per group). ** p < 0.01, *** p < 0.001. 데이터는 평균± s.e.m으로 나타내었다.
도 5e는 SVZ에 VEGF를 과발현하는 신경줄기세포를 1주일에 두 번씩 총 4주를 주입 받은 NP-C 마우스의 뇌 부위별로 MPIO 형광물질이 표지된 신경줄기세포 의 존재비율(%)을 확인한 도이다 (n = 6 per group). * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001. 데이터는 평균± s.e.m으로 나타내었다.
도 5f는 SVZ에 VEGF를 과발현하는 신경줄기세포를 1주일에 두 번씩 총 4주를 주입 받은 NP-C 마우스의 SVZ와 Thalamus 조직에서 신경줄기세포의 존재 여부를 Neurosphere(NS) 배양을 통해 확인한 도이다 (n = 6 per group). ** p < 0.01, *** p < 0.001. 데이터는 평균± s.e.m으로 나타내었다.
도 6a는 NP-C 마우스의 SVZ에 정상 신경줄기세포, VEGF를 과발현하는 신경줄기세포, VEGF를 과발현하는 벡터를 1주일에 두 번씩 총 4주를 주입한 후 대뇌에 축적된 콜레스테롤 레벨을 filipin 면역염색을 통해 확인하고 이를 정량화하여 그래프로 나타낸 도이다 (n = 6 per group). * p < 0.05. 데이터는 평균± s.e.m으로 나타내었다.
도 6b는 NPC 마우스의 SVZ에 VEGF를 과발현하는 신경줄기세포를 1주일에 두 번씩 총 4주를 주입한 후 대뇌에 축적된 리피드 레벨을 확인한 도이다 (n = 6 per group). ** p < 0.01, *** p < 0.001. 데이터는 평균± s.e.m으로 나타내었다.
도 7a, 7b 및 7c는 NP-C 마우스의 SVZ에 VEGF를 과발현하는 신경줄기세포를 1주간 두 번씩 총 4주를 주입한 후, 감각 기능(a) 및 운동 기능 개선 여부(b)와 생존률 증가 여부(c)를 확인한 도이다 (n = 10-12 per group). * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001. 데이터는 평균± s.e.m으로 나타내었다.
도 8a는 NP-C 마우스의 SVZ에 VEGF를 과발현하는 신경줄기세포 주입한 후(NP-C/VEGFtg NSCs), 또는 소뇌에 직접적인 VEGF-loaded microsphere를 주입한 후(NP-C/VEGF microsphere), 분자층 (ML: molecular layer), 소뇌신경세포층 (PCL: Purkinje cell layer), 과립상세포층 (GCL: granular cell layer)으로 이루어진 소뇌 조직을 염색(좌)하여 소뇌신경세포층에 존재하는 신경세포의 감소를 확인하고 이를 소뇌의 3번부터 8번까지 각각의 엽(III~VIII)에서 신경세포 감소를 정량한 도이다(우) (n = 3 per group). * p < 0.05. 데이터는 평균± s.e.m으로 나타내었다.
도 8b 내지 8d는 NP-C 마우스의 SVZ에 VEGF를 과발현하는 신경줄기세포 주입한 후(NP-C/VEGFtg NSCs), 또는 소뇌에 직접적인 VEGF-loaded microsphere를 주입한 후(NP-C/VEGF microsphere), 염증반응(b), 리피드 축적(c) 및 운동 기능 개선 여부(d)를 확인한 도이다 (b, c; n = 3 per group, d; n = 7 per group). * p < 0.05. 데이터는 평균± s.e.m으로 나타내었다.

이하 본 발명의 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다.

<실시예 1>

실험재료 및 실험방법

1-1. 마우스의 준비

Balb/C 및 NPC1 유전자가 결손된 NPC mutant마우스(NP-C 마우스; 같은 주령의 정상 마우스에 비해 체중이 적으며, 4~6주령에서부터 심각한 운동기능상실이 나타나 사지의 떨림과 발작이 나타나고 수명이 대략 9~10주이다)는 PCR을 통한 genotyping을 통하여 그 계통이 유지되었으며, NPC^fl/fl,VEGF^fl/fl마우스는 각각의 계통 간 교배를 통해 유지되었다. 구획 무선화 (Block randomization) 방법을 사용하여 마우스를 실험군에 배치시켰다. 편견을 제거하기 위하여, 데이터 수집 및 데이터 분석에는 전혀 관여하지 않았다. 모든 마우스 실험은 경북대학교 동물실험 관련 위원회 (Kyungpook National University Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)를 통하여 승인받았다.

1-2. 약물 및 신경세포 주입

NPC^fl ^/ ^fl,VEGF^fl ^/ ^fl정상 신경줄기세포, VEGF를 과발현하는 신경줄기세포, VEGF를 과발현하는 벡터 또는 GFAP/CD133 spilt-cre를 주입하기 위해 마우스는 100 ㎎/㎏ 케타민(ketamine) 및 10 ㎎/㎏ 자일라진(xylazine) 혼합액으로 마취시키고, 정상 신경줄기세포 (~1x10⁶cell/3ul), VEGF를 과발현하는 신경줄기세포 (~1x10⁶cell/3ul),VEGF를 과발현하는 벡터 (MGC 12075 clone, Thermo Scientific)를 주입 받았고 (3ul), NPC^fl/fl,VEGF^fl/fl매일 GFAP/CD133 spilt-cre (1:1.5비율, 2ul씩)를 주입 받았다.

또한 1.63 um diameter polystyrene/divinylbenzene-coated uorescent iron oxide particles (MPIOs, 3.00 mg Fe/ml, green uorescent dye: 480 nm excitation, 520 nm emission; Bangs Laboratories, Fishers, IN, USA)이 신경줄기세포의 이주를 확인하기 위해 사용되었으며, 0.05mg/ml의 PLL (Sigma)과 혼합한 MPIO (0.67 mg Fe/ml) 총 1.5ul의 용량이 각 마우스의 SVZ에 주입되었다. 세포 및 약물들의 주입 속도는 0.3 ㎕/min 의 유속으로 이식되었다.

VEGF microsphere의 직접적인 소뇌 주입은 유리 모세관 (1.2 mm x 0.6 mm)을 이용하여 소뇌 내에 이식되었다. 주사 좌표는 bregma 앞쪽 5.52 mm, 주사 깊이 2.50 mm 였다. 주입 속도는 0.15 ㎕/min 의 유속으로 3mg 이식되었다.

1-3. VEGF를 포함하는 미소구체( microsphere )의 제조

VEGF를 포함하는 미소구체 (microsphere)를 제조하기 위해, 인간 재조합 혈관내피성장인자(VEGF)를 R&D System 사(社)(Catalog No. 293-VE-010)로부터 구입하여 사용하였다. 수중 유중 수적형 유화(water-in-oil-in-water emulsification) 방법을 이용하여 상기 인간 재조합 혈관내피성장인자(VEGF)가 포함된 PLGA(Poly(lactic-co-glycolic acid)) 미소구체(microsphere)를 제조하였다. 상기 인간 재조합 혈관내피성장인자-A(VEGF-A)를 PLGA 미소구체(PGLA의 lactic acid와 glycolic acid는 1:1 비율이고, 분자량은 40,000 내지 75,000) 내에 캡슐화하였다.

1-4. 면역형광염색

상기 마우스의 뇌조직을 vibratome을 이용하여 50um의 두께로 자른 후, 항-VEGF(토끼, 1:500, abcam), 항-SOX(마우스, 1:100, R&D), 항-GFAP(토끼, 1:500, DAKO), 항-Iba-1(토끼, 1:500, DAKO), 항-Calbindin(토끼, 1:100, milipore)를 함께 배양하였다. 또한 콜레스테롤의 축적 정도를 확인하기 위해 상기 마우스의 조직을 filipin 염색을 실시하였다. SVZ, thalamus, cortex, cerebellum의 부위를 Fluoview SV1000 이미징 소프트웨어 (Olympus FV1000, Japan)를 장착한 레이저 스캐닝 공초점 현미경 또는 Olympus BX51 현미경을 이용하여 분석하였다. Metamorph software(Molecular Devices)를 이용하여 총 조직의 넓이에 대한 염색된 부위의 넓이의 퍼센트를 정량화하였다. 그리고 염색된 부위의 세포 개수는 Stereology를 이용하여 Visiomorph software (VisioMorph)로 정량화하였다.

1-4. 뉴로스피어(Neurosphere)의 배양 및 정상, VEGF 과발혈 신경줄기세포의 배양

SVZ가 손상된 마우스 또는 SVZ에 VEGF를 과발현하는 신경줄기세포를 주입 받은 NP-C 마우스 신경줄기세포의 Thalamus로의 비정상 이주를 확인하기 위해, SVZ와 Thalamus 부위를 마우스 뇌에서 적출하였다. 각각의 조직을 ice-cold Hibernate A/B27/Glutamax medium (HABG) (Invitrogen)에서 적출한 후 papain (Worthington) 용액에 담궈 37℃에 30분 반응시켜 조직을 분해하였다. 그 후, 분해된 조직을 Optiprep (Sigma) density gradient 용액을 이용하여 원심분리하고 신경줄기세포를 포함하는 층을 분리한 후 glutamax (0.5 mM), gentamycin (10 ug/ml, Invitrogen), mouse fibroblast growth factor 2 (mFGF2, 5 ng/ml, Invitrogen) 그리고 mouse platelet-derived growth factor-bb (mPDGFbb, 5 ng/ml, Invitrogen)가 포함된 Neurobasal A (Invitrogen)/B27 배지에 1주일 배양하였다. 배양한 신경줄기세포는 구 형태의 Neurosphere로 성장하며 1주일 후 세포를 모아 분해한 뒤, 1x104 개의 세포로 24 well 플레이트에 배양하였다. 일주일간의 배양 후 생성된 Neurosphere를 현미경상에서 카운트 하였고, Neurosphere 최소 컷오프 사이즈는 50um로 제한하였다. NP-C 마우스의 SVZ내 정상 및 VEGF 과발현 신경줄기세포 주입을 위한 신경줄기세포의 배양은 위의 방법으로 Neurosphere를 배양한 후 주입 시 Triple select (Gibco) 용액으로 세포를 분리하여 단일 세포로 주입하였다.

1-6. 리피드 측정

각 마우스의 대뇌 및 소뇌를 적출하여 50 mM HEPES (Invitrogen), 150 mM 염화나트륨수용액(NaCl) (Sigma), 0.2 % Igepal CA-630 (Sigma)과 protease inhibitor (Milipore)를 포함하는 균질 완충액을 첨가하고 호모게나이저를 이용하여 균질화하여 13,000rpm에서 10분간 원심분리하였다. 10분 후, 13,000rpm에서 추가적인 원심분리를 30분 실시하였다. 30분 후 상층액을 취하여 DCM(dichloromethane, Sigma), DCM:M(dichloromethane:methanol=1:3, Sigma)과 10% 차아염소산나트륨(NaHCl)을 순서대로 첨가하고 13,000rpm에서 1분간 원심분리 후 유기용해층만을 분리하였다. 분리된 시료는 회전진공증발기를 이용하여 건조하였다. 상기와 같이 건조 지질 추출물을 0.2% Igepal CA-630(Sigma) 내에 재현탁한 후, 각 리피드의 농도를 UPLC 시스템을 이용하여 측정하였다.

1-7. 콜레스테롤 측정

각 마우스의 대뇌를 적출하여 50 mM phosphate buffer, 500 mM 염화나트륨수용액(NaCl), 25 mM cholic acid와 0.5 % Triron X-100을 포함하는 균질완충액을 첨가하고 호모게나이저를 이용하여 균질화하여 13,000rpm에서 10분간 원심분리하였다. 10분 후, 유기용해층만을 분리하여, Amplex Red Cholesterol Assay Kit (Molecular Probes)를 이용하여 콜레스테롤 레벨을 측정하였다.

1-8. 감각능력 테스트

SVZ가 손상된 마우스 또는 SVZ에 VEGF를 과발현하는 신경줄기세포를 주입 받은 NP-C 마우스의 감각 능력을 확인하기 위해, 핫-플레이트 테스트와 꼬리-반응 테스트를 실시하였다. 핫-플레이트 테스트는 heating apparatus (Panlab/Harvard Apparatus, Spain)를 50 ℃로 유지시키고, 마우스 각각을 가열된 표면 끝에 위치시켜, 제1의 통증수용 (nociception) 즉 점프 또는 발 핥기까지의 시간을 측정하였다. 컷오프 시간은 60초로 하였다. 측정 사이에는, 가열된 표면을 세제 및 에탄올로 닦고, 50 ℃로 온도가 유지되도록 하였다. 꼬리-반응 테스트는 마우스를 암막 천으로 감싼 뒤, 꼬리를 가열된 기기 표면 (Panlab/Harvard Apparatus, Spain)에 올린 뒤 꼬리가 반응하는데 걸리는 시간을 측정하였다.

1-9. 운동능력 테스트(Beam walking test)

SVZ가 손상된 마우스 또는 SVZ에 VEGF를 과발현하는 신경줄기세포를 주입 받은 NP-C 마우스의 운동 능력이 개선되는지 확인하기 위해, Open field, Rota-rod, Beam 테스트를 실시하였다. 소뇌에 VEGF microsphere를 직접 주입 받은 마우스는 Rota-rod 테스트를 실시하였다. Open field 테스트는 마우스를 10분 동안 사각형의 박스에 넣어 전반적인 활동성과 벽면 및 가운데를 돌아다닌 시간을 측정하였다. Rota-rod 테스트 (Ugo Basile, Comerio, VA,Italy)는 그립을 제공하기 위해 적절하게 가공된 직경 3cm의 막대가 설치되어 있는 기계를 4 rpm의 회전속도로, 3회 이상 Rota-rod 운동을 실시하여 실험 동물의 유지시간(endurance time)을 초단위로 측정하고, 그 평균값을 기록하였다. 상기 각 Rota-rod 운동시험은 회당 5분을 초과하지 않도록 하였다. Beam 테스트는 6mm 또는 12mm 너비의 막대의 시작지점에 마우스를 올려놓은 후 끝 지점까지 이동하는 데에 걸리는 시간을 측정하였다.

1-10. 실시간 정량 PCR (Real-time quantitative PCR )

NP-C 마우스의 SVZ 신경세포에서 VEGF의 발현량을 확인하기 위해 마우스의 SVZ를 분리한 후 신경줄기세포를 분리하였다. 분리한 신경줄기세포에서 VEGF의 발현량은 실시간 정량 PCR법을 사용하여 측정되었다. 총 RNA를 RNeasy Plus 미니 키트 (Qiagen, Korea, Ltd)를 사용하여 신경세포로부터 추출하고, Clontech (Mountain View, CA)사의 키트를 사용하여 5 ㎍ 총 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 또한, Corbett research RG-6000 real-time PCR 기기를 사용하여, 95℃, 10분; 95℃, 10초; 58℃, 15초; 72℃, 20초;를 1 사이클로 하여 40 사이클을 반복하는 실시간 정량 PCR을 수행하였다.

1-11. 통계적 분석

각 군과의 비교는 Student’s t-test를 이용하여 수행하였다. 다른 군과 2개 이상의 군을 비교할 경우, 일원화분산분석 (one way ANOVA) 및 Tukey’s HSD test를 수행하였다. 전체 생존의 비교는 Log-rank test를 이용하여 수행하였다. 모든 통계학적 분석은 SPSS 통계 소프트웨어를 이용하였다. p < 0.05, p < 0.01, p < 0.001의 경우 유의적인 것으로 간주하였다.

<실시예 2>

NPC 마우스의 SVZ에서의 신경줄기세포들의 비율 및 VEGF 발현량 확인

6주령의 NP-C 마우스의 SVZ내 존재하는 신경줄기세포들의 비율을 확인하기 위해, 정상 및 NP-C 마우스의 SVZ를 상기 실시예 1-3에 기재된 방법으로 면역형광염색하였다. 그 결과 도 1a에서 신경줄기세포들의 (SOX2+/GFAP+, Mash1+, DCX+ cells)의 감소를 확인하였다 (*p < 0.05. n= 6 per group)

또한, 6주령의 NP-C 마우스의 SVZ에서의 VEGF의 발현량을 확인하기 위해, 정상 마우스(WT)와 NP-C 마우스의 뇌에서 SVZ 부위를 적출한 후 신경줄기세포를 분리하였다. 분리한 신경줄기세포에서 상기 실시예 1-9에 기재된 방법으로 총 RNA를 추출 후 cDNA를 합성하여 신경세포 내에 발현하는 VEGF의 발현량을 실시간 정량 PCR로 분석하였다. 결과는 도 1b에 나타내었다 (**p < 0.01. n= 4 per group).

신경줄기세포 표지 항체와 VEGF 항체를 이용하여 상기 실시예 1-3에 기재된 방법으로 각 마우스의 SVZ를 면역형광염색하였다. 결과는 도 1c에 나타내었다 (***p<0.001. n= 4 per group).

도 1에 나타난 바와 같이, 정상 마우스(WT)에 비해 NP-C 마우스의 SVZ 환경에 존재하는 신경줄기세포들은 생존률이 감소되어 있었으며, 신경줄기세포 내 VEGF의 발현이 감소되어 있는 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 3>

SVZ 환경 내 신경줄기세포의 비정상적인 이주 현상 확인

정상 SVZ 환경에 존재하는 신경줄기세포는 Rostral migratory stream (RMS)를 통해 Olfactory bulb (OB)로 이동할 수 있으며, 특히 신경줄기세포 내 발현하는 VEGF는 이러한 이주에 관여한다고 알려져 있다 (Neuron. 70, 687-702, 2011; J Neurosci. 29, 8704-8714, 2009; J Neurosci Res. 88, 248-257, 2010).

NP-C 마우스의 SVZ 내 VEGF가 발현이 감소된 신경줄기세포의 이주 패턴을 확인해 보기 위해, 정상 및 NP-C 마우스의 SVZ에 신경줄기세포 표지 형광 물질인 MPIO를 주입하였다 (도 2a). 7일 후, 정상 마우스의 MPIO 표지된 신경줄기세포는 RMS와 OB에 많이 존재하는 반면, NP-C 마우스의 신경줄기세포는 Thalamus에 많이 존재하는 것을 확인하였으며, 21일 후 NP-C 마우스의 신경줄기세포는 Thalamus에 더 많이 증가하는 것을 확인하였다 (도 2b, *p<0.05, **p < 0.01, ***p<0.001. n= 6 per group).

즉, 정상적인 상태에서는 SVZ 내 신경줄기세포가 RMS와 OB로 많이 이주하고 thalamus로는 거의 이주를 하지 않는 것에 반해, NP-C 마우스의 SVZ 내 VEGF 발현이 감소된 신경줄기세포는 RMS와 OB로는 많이 이주하지 않고, thalamus로의 비정상적인 이주를 한다는 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 4>

SVZ 환경의 손상이 뇌 전체의 염증반응 및 콜레스테롤, 리피드 축적에 미치는 영향

SVZ 환경에 존재하는 신경줄기세포의 손상이 뇌 전체의 염증반응에 미치는 영향을 확인하기 위해 4주령의 NPC^fl/fl, VEGF^fl/fl 마우스의 SVZ에 캐뉼라를 장착하여 도 3a 에서와 같이 매일 총 4주간 GFAP/CD133 split-cre를 SVZ에 주입하였다. 즉, (i) NPC^fl/fl 마우스의 SVZ에 GFAP/CD133 split-cre를 주입함으로써, SVZ에 존재하는 신경줄기세포에서 NPC1이 발현하지 못하도록 하였고, 또는 (ii) VEGF^fl/fl 마우스의 SVZ에 GFAP/CD133 split-cre를 주입함으로써, SVZ에 존재하는 신경줄기세포에서 VEGF가 발현하지 못하도록 한 후 나타나는 병리학적 변화를 관찰해 보았다.

그 결과 도 3b와 3c에서 나타난 바와 같이, SVZ에 존재하는 신경줄기세포에서 NPC1 또는 VEGF의 발현을 저해한 마우스의 SVZ 환경 내 존재하는 신경줄기세포들의 생존률이 감소하고 염증반응이 현저히 증가한 것을 확인하였다 (GFAP: astrocyte, Iba-1: microglia. *p < 0.05, ***p<0.001, n = 6 per group).

이러한 SVZ의 문제로 인한 NPC 또는 VEGF 발현이 감소된 신경줄기세포는 Thalamus로의 비정상적인 이주를 보였다 (도 3d와 3e, **p < 0.01, ***p<0.001, n = 6 per group).

NPC 또는 VEGF 발현이 감소된 신경줄기세포의 비정상적인 Thalamus로의 이주는 Thalamus와 cortex의 염증반응도 증가시켰으며(도 3e), NP-C 마우스의 주요한 병인학적인 패턴인 콜레스테롤, 리피드 축적 또한 증가시킨다는 것을 확인하였다 (도 3f와 3g, GFAP: astrocyte, Iba-1: microglia. *p < 0.05, **p < 0.01. n = 6 per group).

상기 결과로부터, SVZ 환경이 손상되면 SVZ 환경 내에 존재하는 신경줄기세포들의 생존률이 감소하고, NPC 또는 VEGF의 발현이 감소된 신경줄기세포의 thalamus로의 비정상적인 이주를 야기하며, 이로 인해 Thalamus의 염증반응이 증가하고 더 나아가 cortex의 염증반응과 콜레스테롤, 리피드 축적이 유도 된다는 것을 알 수 있었다. 따라서, 이는 SVZ환경의 손상이 뇌 전체에 영향을 미칠 수 있음을 보여준다.

<실시예 5>

SVZ 환경의 손상이 감각 및 운동 능력에 미치는 영향

SVZ 환경 손상으로 인한 뇌 전체의 염증반응 및 콜레스테롤, 리피드 축적이 감각 및 운동 능력에 영향을 주는지 확인하기 위해, SVZ에 GFAP/CD133 split-cre를 총 4주간 주입 받은 NPC^fl/fl, VEGF^fl/fl 마우스를 감각 능력 테스트인 Hot-plate, Tail-flick 테스트와 운동 능력 테스트인 Open field, Rota-rod, Beam 테스트를 실시하였다.

그 결과, SVZ 환경이 손상된 마우스들은 감소된 감각 기능과 운동 능력을 보였다 (도 4a와 4b, *p < 0.05, **p < 0.01. n = 10-13 per group).

상기 결과로부터, SVZ 환경 손상으로 인한 뇌 전체의 염증반응 및 콜레스테롤, 리피드 축적은 감각 및 운동 능력을 감소시킨다는 것을 알 수 있었다.

<실시예 6>

NP-C 마우스의 손상된 SVZ 환경의 개선을 통한 염증반응 완화

NP-C 마우스의 경우 SVZ에 존재하는 신경줄기세포에서 VEGF의 발현이 감소되어 있었기 때문에, 손상된 SVZ 환경에서 VEGF 증가를 통하여 뇌 전체의 염증반응을 완화 시켜줄 수 있는지 여부를 확인하고자 하였다. 구체적으로, 도 5a에 나타난 바와 같이 정상 신경줄기세포, VEGF를 과발현하는 신경줄세포, VEGF를 과발현하는 벡터를 주 2회, 총 4주간 NP-C 마우스의 SVZ에 주입하였다.

도 5b의 결과에서 NP-C 마우스의 SVZ에 VEGF를 과발현하는 신경줄기세포를 주입하였을 경우에만 감소된 신경줄기세포들의 생존률이 상승하는 것을 확인하였다 (*p < 0.05, ***p < 0.001. n = 6 per group).

도 5c와 5d의 결과에서 NP-C 마우스의 SVZ환경과 thalamus, cortex의 염증반응이 VEGF를 과발현하는 신경줄기세포를 주입하였을 경우에만 감소하는 것을 확인하였다 (GFAP: astrocyte, Iba-1: microglia. **n=6pergroup).이는 정상 신경줄기세포를 주입한 경우 NP-C 마우스의 SVZ에 감소된 VEGF를 높여주기에 불충분 하다는 것을 알 수 있으며, 또한 VEGF를 과발현 하는 벡터의 경우 신경줄기세포 특이적으로 VEGF를 높여주지 못하기 때문에 염증반응을 완화시키기 불충분 하다는 것을 알 수 있다.

뿐만 아니라, VEGF를 과발현하는 신경줄기세포는 NP-C 마우스의 SVZ 내 신경줄기세포의 Thalamus로의 비정상적인 이주를 완화시켰다 (도 5e와 5f, ***n=6pergroup).

따라서 NP-C 마우스의 SVZ 환경을 개선시키기 위해서는, 감소된 VEGF를 충분히 개선 시켜줄 수 있는 VEGF를 과발현하는 신경줄기세포를 SVZ에 주입하였을 때에 신경줄기세포의 비정상적인 이주를 개선시켜줄 수 있으며, 동시에 뇌 전체의 염증반응을 개선시킬 수 있다는 것을 알 수 있었다.

<실시예 7>

NP-C 마우스의 손상된 SVZ 환경의 개선을 통한 콜레스테롤 축적 완화

NP-C 마우스의 VEGF를 과발현하는 신경줄기세포 주입에 따른 SVZ환경의 개선이 NPC 마우스의 주요한 병인학적인 패턴인 콜레스테롤, 리피드 축적을 개선시켜줄 수 있는지 확인하기 위해, 정상 신경줄기세포, VEGF를 과발현하는 신경줄기세포, VEGF를 과발현하는 벡터를 주입받은 NP-C 마우스의 cortex 부위를 filipin 염색하여 콜레스테롤 축적 정도를 확인하였다.

도 6a와 6b에 나타난 바와 같이 SVZ환경에 VEGF를 과발현하는 신경줄기세포를 주입 받은 NP-C 마우스의 cortex에 축적된 콜레스테롤이 감소하였으며, 리피드 축적 또한 감소하는 것을 확인하였다 (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p<0.001, n = 6 per group).

상기 결과로부터, VEGF를 과발현하는 신경줄기세포 주입에 따른 SVZ환경의 개선이 뇌 전체의 콜레스테롤, 리피드 축적을 감소시켜줄 수 있다는 것을 알 수 있었다.

<실시예 8>

NP-C 마우스의 손상된 SVZ 환경의 개선을 통한 감각 및 운동 능력 개선

NP-C 마우스의 VEGF를 과발현하는 신경줄기세포 주입에 따른 SVZ환경의 개선이 NP-C 마우스의 감소된 감각 및 운동 능력을 개선시켜줄 수 있는지 확인하였다.

도 7a와 7b의 감각 능력 테스트인 Hot-plate, Tail-flick 테스트와 운동 능력 테스트인 Open field, Rota-rod, Beam 테스트를 통해 SVZ환경에 VEGF를 과발현하는 신경줄기세포를 주입 받은 NP-C 마우스의 감각 및 운동 능력이 개선된 것을 알 수 있었다 (*p < 0.05. **p < 0.01, ***p<0.001, n = 10-12 per group). 뿐만 아니라, NP-C 마우스의 생존률 또한 증가하는 것을 확인하였다 (도 7c, **p < 0.01, n = 10-12 per group).

상기 결과로부터, VEGF를 과발현하는 신경줄기세포 주입에 따른 SVZ환경의 개선이 뇌 전체의 콜레스테롤, 리피드 축적을 감소시켜 감각 및 운동 능력 개선과 생존률을 증가시키는 것을 알 수 있었다.

따라서 상기 결과들로부터, SVZ환경의 개선이 뇌 전체에 영향을 줄 수 있다는 것을 알 수 있으며, 특히 NP-C 마우스의 SVZ에서 감소된 VEGF는 신경줄기세포에 특이적으로 VEGF를 높여 주었을 때에만 SVZ 환경을 개선시킬 수 있었으며, 이는 뇌 전체의 염증 반응과 콜레스테롤 및 리피드 축적, 감각, 운동능력을 개선시켜 줄 수 있다는 것을 알 수 있었다.

<실시예 9>

NP-C 마우스의 손상된 SVZ 환경의 개선을 통한 소뇌 환경 개선

NP-C 마우스의 VEGF를 과발현하는 신경줄기세포 주입에 따른 SVZ환경의 개선이 NP-C 마우스의 소뇌 환경 또한 개선시켜 줄 수 있는지 확인하였다. 또한 이러한 SVZ교정에 의한 소뇌 환경 개선 효과를 VEGF microsphere의 직접적인 소뇌 이식의 효과와 비교하였다.

도 8a에서 SVZ환경에 VEGF를 과발현하는 신경줄기세포를 주입 받은 NP-C 마우스는 소뇌 신경세포 (Purkinje neuron, PNs)의 감소가 완화되는 것을 확인하였다. 이는 VEGF microsphere의 직접적인 소뇌 이식보다 더 많은 소뇌 부위에서 우수한 완화 효과를 보였다. 도 8b에서 소뇌 염증반응 또한 VEGF를 과발현하는 신경줄기세포를 주입 받은 NP-C 마우스에서 더 효과적으로 개선되었으며, 도 8c에서 소뇌 리피드 축적 감소에도 더 우수한 효과를 보였다 (*p < 0.05. n = 3 per group).

도 8d에서 VEGF를 과발현하는 신경줄기세포 주입에 의한 SVZ교정은 VEGF microsphere의 직접적인 소뇌 이식보다 더 효과적으로 운동 기능을 향상시켰다 (*p < 0.05. n = 7 per group).

따라서, NP-C 마우스의 SVZ 내 신경줄기세포 특이적인 VEGF를 증가시킴으로써 SVZ 환경 개선을 통해 소뇌 환경 또한 개선시켜 줄 수 있으며, 이는 SVZ 환경의 개선이 NP-C 마우스의 병인을 완화 시키는데 중요하다는 것을 나타낸다. 특히, 직접적인 소뇌의 VEGF 증가보다 SVZ 환경개선이 더 효과적으로 병인을 완화시켜줄 수 있음을 확인할 수 있었다.

본 발명에 따른 혈관내피성장인자 (Vascular endothelial growth factor, VEGF)가 과발현된 줄기세포는 퇴행성 신경질환에 의하여 발생한 SVZ 내 신경줄기세포에서의 VEGF 감소를 효과적으로 회복시켜, 신경줄기세포의 비정상적인 이동을 저해하고 염증반응을 억제하며, 대뇌 피질의 콜레스테롤의 축적을 억제하여 동물모델의 행동 및 운동능력의 회복을 야기하는 바, 효과적인 퇴행성 신경질환의 치료제로 활용될 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 우수하다.

Claims

혈관내피성장인자 (Vascular endothelial growth factor, VEGF)가 과발현된 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 니만픽병, 고셔(Gaucher)병, 파브리(Fabry)병, 테이색스(Tay-Sachs)병, 및 샌드호프(Sandhoff)병으로 이루어진 군에서 선택된 대사질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 성체줄기세포, 배아줄기세포, 중간엽 줄기세포, 종양 줄기세포 및 유도만능줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제2항에 있어서, 상기 성체줄기세포는 신경줄기세포 또는 신경전구세포인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 비경구투여 제제로 제제화된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제4항에 있어서, 상기 비경구투여 제제는 주사제 또는 주입제인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제5항에 있어서, 상기 주사제 또는 주입제는 뇌실하 영역 (Subventricular zone, SVZ)으로 상기 조성물을 주입하기 위한 것인 약학적 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 니만픽 병은 A형, B형, C형, D형, E형 또는 F형 니만픽병인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 혈관내피성장인자 (Vascular endothelial growth factor, VEGF)가 과발현된 줄기세포는 뇌의 염증을 감소시키고, 콜레스테롤 또는 스핑고지질의 축적을 억제하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.