KR102064588B1 - 부갑상선 세포로의 분화 확인용 바이오마커 및 이의 용도 - Google Patents

부갑상선 세포로의 분화 확인용 바이오마커 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 SLC7A14 (solute carrier family 7, member 14), AMOT (angiomotin), FLG2 (fibrinogen-like 2), JUNB (jun B proto-oncogene), HAPLN1 (hyaluronan and proteoglycan link protein 1) 및 INHBA (inhibin beta A)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 mRNA 또는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 중간엽 줄기세포로부터 부갑상선 조직 세포로의 분화를 탐지하기 위한 바이오마커 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 바이오마커들이 미분화된 줄기세포들 뿐만 아니라 Passage 증가, 단순 배양에 따른 유전자 발현 변화를 나타내는 특성이 변화된 세포들과 구별되어 부갑상선 조직 세포로의 분화를 확인할 수 있게 하고 이를 통해 분화의 유도 뿐만 아니라 부갑상선 호르몬을 생산하고 제어 가능한 줄기 세포 치료제를 개발하는데 활용될 수 있다.

Description

부갑상선 세포로의 분화 확인용 바이오마커 및 이의 용도{BIOMARKERS FOR DETECTING OF DIFFRENTIATION TO PARATHYROID CELL AND USE THEREOF}
본 발명은 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 중간엽줄기세포로부터 부갑상선 조직 세포의 분화 여부를 탐지하기 위한 바이오마커 검출용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트, 상기 바이오마커 유전자를 이용하여 부갑상선 조직 세포로의 분화를 탐지하는 방법에 관한 것이다.
기관 재생과 면역반응 조절 능력을 가지는 성체 줄기세포에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 그러나, 종래의 성체 줄기세포는 사용에 몇 가지 제한점이 있는데, 조직을 채취하는 과정이 침습적이고, 충분한 양을 얻기 어려우며, 대부분이 중배엽 기원의 조직이여서 외배엽과 내배엽 기원의 조직으로 분화가 용이하지 않다. 이러한 제한점을 극복하기 위하여 줄기세포의 공급원을 다양화 하는 연구가 필요하다.
인간 중간엽 줄기세포(human mesenchymal stem cell)는 성체줄기세포로, 배아줄기세포에 일반적으로 문제가 되는 윤리적인 문제에서 자유로울 뿐 아니라 지방세포, 조골세포, 연골세포, 심장세포, 근육세포 및 신경세포 등 다양한 세포로의 분화가 가능하다고 보고되고 있다.
하지만, 중간엽 줄기세포는 특정 세포로의 효율적인 대량 분화 기술이 아직 확립되어 있지 않아 실제 임상, 산업적 이용에 큰 제약이 있다. 따라서 특정단계로의 분화를 대량으로 및 효율적으로 유도 시키는 기술의 확립이 절실하며, 이를 위해서는 특정 단계로의 분화 유도 신호전달 기작을 밝히고 분화를 확인하기 위한 적절한 바이오마커들에 대한 발굴이 필요하다. 특히, 중간엽 줄기세포의 경우, 분화 환경, 계대 증가 등에 따라 그 자체의 특성이 달라질 수 있으며, 이로 인해 원하는 세포로의 분화가 잘 이루어졌는지 확인하기 어려울 때가 종종 존재한다. 따라서, 분화 후 사용될 세포들의 안정성을 확보하고 특정 세포로의 분화가 잘 이루어졌는지 확인하기 위한 바이오마커들의 발굴이 줄기세포로부터 분화된 세포들을 이용할 때 반드시 수반되어야 한다.
한편, 부갑상선은 갑상선(thyroid) 후면에 부착되어 있는 부갑상선호르몬(Parathyroid hormone, 이하 PTH)을 분비하는 내분비기관으로 체내 칼슘대사 항상성을 유지하는 주요기관이다. 대표적 증상인 저칼슘혈증(hypocalcemia)으로 근육수축성 경련, 호흡장애. 전신 경련 및 발작, 사망에 이르는 다양한 증상이 동반된다. 근본적인 치료는 부갑상선호르몬를 생산 분비하는 조직을 생체 내에 이식하여 생체내의 자율적인 항상성 조절 기능에 따라 호르몬을 분비하도록 하는 것이나, 이에 사용되는 조직의 확보가 쉽지 않다. 또한 현재 주요 치료법로 사용되고 있는 칼슘제제 및 호르몬 요법이 시행되고 있다. 결국 현재까지 부갑상선 기능 저하증의 치료는 갑상선암 제거 수술 시 탈락할 것으로 추정되는 부갑상선 조직을 생체 밖에서 잘게 으깨어 근육에 재이식한 후, 매일 고용량의 칼슘제제와 비타민D를 평생 동안 복용하는 방법이 사용되어 왔다. 이외에도 일일주사제인 나트파라 등이 개발되었는데 나트파라의 동물실험 시 골육종이 관찰되어 이에 대한 주의 및 위험성을 제시하고 있어, 여러 가지 부작용들로 인해 임상 적용 범위가 매우 제한적인 문제점을 가진다. 또한 부갑상선 호르몬(PTH)을 치료제로서 사용될 수 있어 부갑상선 호르몬에 대한 수요는 증가하고 있으나, 아직까지 부갑상선 호르몬을 효과적으로 생산할 수 있는 방법은 개발되지 않은 상태이다.
국제공개특허 WO2017/135753
위와 같은 배경 하에, 본 발명자들은 줄기세포로부터 부갑상선 조직세포를 분화시키고 효과적으로 부갑상선 호르몬을 생산하거나 세포 이식에 이용하기 위해 세포 분화를 예측하는데 부족하였던 신규 바이오마커들을 발굴함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 SLC7A14 (solute carrier family 7, member 14), AMOT (angiomotin), FLG2 (fibrinogen-like 2), JUNB (jun B proto-oncogene), HAPLN1 (hyaluronan and proteoglycan link protein 1) 및 INHBA (inhibin beta A)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 mRNA 또는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 중간엽 줄기세포로부터 부갑상선 조직 세포로의 분화를 탐지하기 위한 바이오마커 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 SLC7A14 (solute carrier family 7, member 14), AMOT (angiomotin), FLG2 (fibrinogen-like 2), JUNB (jun B proto-oncogene), HAPLN1 (hyaluronan and proteoglycan link protein 1) 및 INHBA (inhibin beta A)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 mRNA 또는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 중간엽 줄기세포로부터 부갑상선 조직 세포로의 분화를 탐지하기 위한 바이오마커 검출용 조성물을 포함하는 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 SLC7A14 (solute carrier family 7, member 14), AMOT (angiomotin), FLG2 (fibrinogen-like 2), JUNB (jun B proto-oncogene), HAPLN1 (hyaluronan and proteoglycan link protein 1) 및 INHBA (inhibin beta A)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 mRNA 또는 단백질의 수준을 확인하여 중간엽 줄기세포로부터 부갑상선 조직 세포로의 분화를 탐지하는 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, SLC7A14 (solute carrier family 7, member 14), AMOT (angiomotin), FLG2 (fibrinogen-like 2), JUNB (jun B proto-oncogene), HAPLN1 (hyaluronan and proteoglycan link protein 1) 및 INHBA (inhibin beta A)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 mRNA 또는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 중간엽 줄기세포로부터 부갑상선 조직 세포로의 분화를 탐지하기 위한 바이오마커 검출용 조성물을 제공한다.
SLC7A14 (solute carrier family 7, member 14, (RefSeq : NM_020949, NM_175917, NP_066000))은 피부 섬유아세포와 신경조직과 내피세포에서 발현되며 14개의 transmembrane domains을 가지고 아미노산의 공급에 관련된 유전자 주로 아르기닌 수송에 관여하는 것으로 알려진 유전자이다.
AMOT (angiomotin, (RefSeq : NM_001113490, NM_133265, NP_001106962, NP_573572))는 내피세포의 migration과 혈관 형성에 관여하며 내피세포의 세포간 결합에 작용하는 것으로 알려진 유전자이다.
FLG2 (fibrinogen-like 2, (RefSeq : NM_006682, NP_006673))는 베타와 감마 체인의 fibrinogen과 비슷하게 분비되는 단백질로 점막에서 림프세포의 생리학적 기능을 하는 것으로 알려진 유전자이다.
JUNB (jun B proto-oncogene, (RefSeq : NM_002229, NP_002220))는 Transcription factor 로 5-TGA[CG]TCA-3에 결합하면서 유전자 발현을 조절하는 proto oncogene으로 알려진 유전자이다.
HAPLN1 (hyaluronan and proteoglycan link protein 1, (RefSeq : NM_001884, NP_001875))은 연골의 세포외 물질인 hyaluronic acid 와 proteogycan결합을 유지하고 연골형성에 관여하는 중요한 유전자로 보고 된 바 있으며, 또한 PTH은 hyaluronan 합성에 관여하며 골형성과도 연관성이 있고, 골형성과 골유지에 매우 중요한 역할을 한다고 알려진 유전자이다.
INHBA (inhibin beta A, (RefSeq : NM_002192, NP_002183))는 TGF beta surperfamily 의 단백질로 activin과 inhibin 단백질의 복합체를 생성하는 데 관여하고, 이 복합체는 복합체와의 결합에 따라 뇌하수체 호르몬, 시상하부 호르몬, 성 호르몬 등의 분비와 같은 다양한 기능을 가지고 있음이 알려진 유전자이다.
본 발명에서 용어, "중간엽줄기세포"는 미분화 상태에서 무한 증식능력(self-renewal capacity)과 더불어 특정한 분화유도자극에 의해 다양한 조직의 세포로 분화될 수 있는 능력(multi-differentiation potency)을 가진 세포를 말한다. 본 발명의 중간엽줄기세포는 분화능 및 증식능을 갖는 모든 세포일 수 있으며, 인간(human), 원숭이(monkeys), 돼지(pigs), 말(horses), 소(cows), 양(sheeps), 개(dogs), 고양이(cats), 생쥐(mice), 토끼(rabbits) 등의 모든 동물로부터 유래할 수 있으며, 바람직하게는 인간 유래이며, 더욱 바람직하게는 인간의 편도, 지방조직, 골수, 말초혈액, 또는 제대혈 등에서 분리된 것일 수 있으며, 가장 바람직하게 인간의 편도로부터 분리되거나 유래된 것일 수 있다.
본 발명에서 용어 "편도"란, 목의 안쪽과 코의 뒷부분에 위치하여, 외부에서 침입하는 세균 등의 물질로부터 일차적으로 우리 몸을 방어함과 동시에 림프상피 면역조직으로 작용을 수행하는 조직을 의미한다. 상기 편도는 인두편도, 귀인두관편도, 구개편도, 혀편도 등을 포함한다. 본 발명에 있어서 상기 편도는 편도유래 중간엽 줄기세포를 제공하는 원천조직으로 사용된다. 본 발명의 용어 "편도 유래 중간엽 줄기세포"는 편도에서 유래한 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells; MSCs)를 의미한다.
본 발명의 용어 "부갑상선 조직세포"란, 갑상선에 부착하여 있는 내분비기관인 부갑상선을 구성하는 세포를 의미하며, 부갑상선 호르몬(PTH)을 분비하며, 체액의 칼슘과 인의 대사를 조절한다. 본 발명에서는 부갑상선 호르몬을 분비하는 한, 부갑상선 조직 세포에 포함될 수 있다.
본 발명에서 용어, "중간엽 줄기세포로부터 부갑상선 조직 세포로의 분화를 탐지하기 위한 바이오마커 "란 부갑상선 조직 세포로 분화를 유도시키지 않은 대조군 또는 계대배양 유지중인 대조군 등과 비교했을 때 분화를 유도시킨 실험군에서 그 발현여부에 유의한 차이를 보이는 유전자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 바이오마커는 부갑상선 조직 세포로 분화된 세포에서만 증가 또는 감소함으로써 분화 여부를 탐지할 수 있는 바이오마커를 의미한다.
중간엽 줄기세포로부터 부갑상선 조직 세포로의 분화는 통상의 알려진 중간엽 줄기세포로부터 부갑상선 조직 세포로의 분화방법을 모두 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시양태에 따르면, 액티빈(Activin) A 및 소닉 헤지호그(Sonic hedgehog)(Shh)를 포함하는 배지에서 중간엽 줄기 세포를 배양하는 단계를 통해 부갑상선 조직 세포로의 분화를 진행할 수 있다.
본 발명의 부갑상선 조직세포 분화 방법은 액티빈 A와 소닉 헤지호그(Shh)를 각각 50 ng/ml ~ 300 ng/ml의 농도로 포함하는 배지에서 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하며, 중간엽 줄기세포의 배양 기간은 바람직하게는 4일 이상이며, 보다 바람직하게는 7일 이상이다.
분화유도제로서 사용되는 액티빈 A는 TGF-베타 수퍼패밀리의 구성원으로서, FSH 방출을 촉진하는 단백질로서 처음 알려졌으나, 중배엽 유도, 신경세포 분화, 골 리모델링, 조혈작용 등의 광범위한 생물학적 활성을 갖는 것으로 알려져 있다.
한편, 소닉 헤지호그 단백질은 헤지호그로 불리는 포유류 시그널링 경로 패밀리 내의 3가지 단백질 중 하나로서, 사지에서 손가락의 성장 및 뇌의 조직화 등과 같은 척추동물 기관형성 조절에서 핵심 역할을 한다. 소닉 헤지호그는 그 농도에 따라 발생중인 배(embryo)의 세포에 상이한 영향을 미치는 몰포젠(morphogen)의 일종이며, 또한 성체 줄기세포의 세포 분열을 제어하며 일부 암의 발생에도 관여하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 액티빈 A 및 소닉 헤지호그는 시판되는 임의의 액티빈 A 및 소닉 헤지호그를 구입하여 이용할 수 있다.
본 발명의 방법에서 액티빈 A와 소닉 헤지호그의 농도가 50 ng/ml 미만일 경우, 편도줄기세포로부터 부갑상선 조직세포가 분화되기 위하여 필요한 기간이 수 개월로 길어지거나 분화 효율이 떨어지는 단점이 있으며, 이들 분화유도제의 농도가 300 ng/ml을 초과할 경우, 분화유도 효율에 있어서 개선이 없어 이와 같이 고농도의 화학물질을 사용하는 것은 비효율적이다.
바람직하게는, 액티빈 A와 소닉 헤지호그의 농도는 각각 80 ng/ml 내지 200 ng/ml이며, 가장 바람직하게는 각각 100 ng/ml이다.
또한 알려진 통상의 알려진 중간엽 줄기세포로부터 부갑상선 조직 세포로의 분화방법으로 예컨대, Activin A 및 glutamax를 처리하고 무혈청 배지로부터 혈청을 첨가하면서 배양하여 분화를 시키고, 마지막으로 Activin A를 제외하여 배양함으로써 분화를 완료할 수 있다 (Stem cells and development 18, no7 , 2009, Differentiation of human embryonic stem cells to a Parathyroid-like phenotype, 참조).
또한 위 방법을 변형하여 배지의 혈청 농도를 증가시키고, 그 후 Activin A와 Sonic hedgehog를 같이 처리하여 분화 시킬 수도 있다 (Surgery Volume 148, Issue 6, December 2010, Pages 1186-1190, Differentiation of precursor’s into parathyroid-like cells for treatment of hypoparathyroidism 참조).
바람직하게 상기 중간엽 줄기세포는 편도 유래 중간엽 줄기세포이고, 편도선 절제수술을 받은 환자에서 분리한 편도선 조직으로부터 채취하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 환자에서 분리한 편도선 조직으로부터 채취할 경우, 채취한 편도조직을 완충액으로 세척한 후, 효소혼합액을 처리하여 결합조직을 분해하고, 이때 부유된 조직을 원심분리하고, 잘라진 조직 내의 세포 혼합액을 Ficol을 이용한 세포분획법과 원심분리법으로 하층의 침전된 부분만을 배양하고, 세포바닥에의 부착능을 보이는 세포부분만을 분리한 후, 배양접시 바닥에의 부착능을 보이는 세포 중 세포표면 표지자를 이용한 면역화학방법을 이용하여 편도 유래 중간엽 줄기세포를 분리할 수 있다.
바람직하게는, 4일 내지 25일 동안 편도줄기세포를 액티빈 A와 소닉 헤지호그를 각각 100 ng/ml의 농도로 포함하는 배지에서 배양함으로써 부갑상선 조직세포의 분화를 유도할 수 있으며, 배양 기간이 4일을 초과할 경우, 4-5일 마다 액티빈 A와 소닉 헤지호그를 포함하는 신선한 배지로 배지를 교체하여 줄 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 분화 유도시 사용되는 배지는 줄기세포의 배양을 위해 이용될 수 있는 통상적인 배지를 사용할 수 있는데, 예를 들면, DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium), Keratinocyte-SFM (Keratinocyte serum free medium), RPMI-1640 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 DMEM-high glucose 배지를 사용할 수 있다.
상기 줄기세포 배지는 첨가제로 보충될 수 있다. 일반적으로, 등장액 중의 중성 완충제(예컨대 인산염 및/또는 고농도 중탄산염) 및 단백질 영양분(예를 들면 혈청, 예컨대 FBS, 혈청 대체물, 알부민, 또는 필수 아미노산 및 비필수 아미노산, 예컨대 글루타민)을 함유할 수 있다. 나아가, 지질(지방산, 콜레스테롤, 혈청의 HDL 또는 LDL 추출물) 및 이 종류의 대부분의 보존액 배지에서 발견되는 기타 성분(예컨대 인슐린 또는 트랜스페린, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드, 피루빈산염, 임의의 이온화 형태 또는 염인 당원, 예컨대 글루코스, 셀레늄, 글루코코르티코이드, 예컨대 히드로코르티존 및/또는 환원제, 예컨대 β-메르캅토에탄올)을 함유할 수 있다.
본 발명의 일실시양태에 따르면, SLC7A14 (solute carrier family 7, member 14), AMOT (angiomotin), FLG2 (fibrinogen-like 2), JUNB (jun B proto-oncogene)의 경우 분화를 수행한 세포들에서 그 발현 수준이 감소되는 것을 확인할 수 있다
본 발명의 다른 실시양태에 따르면, HAPLN1 (hyaluronan and proteoglycan link protein 1), INHBA (inhibin beta A)의 경우 분화를 수행한 세포들에서 그 발현 수준이 증가되는 것을 확인할 수 있다.
위 결과들로부터 부갑상선 조직 세포로 분화 예측 또는 탐지에 위 SLC7A14 (solute carrier family 7, member 14), AMOT (angiomotin), FLG2 (fibrinogen-like 2), JUNB (jun B proto-oncogene), HAPLN1 (hyaluronan and proteoglycan link protein 1), 또는 INHBA (inhibin beta A)가 이용될 수 있다.
본 발명의 기술분야에서 상기 바이오마커의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 프라이머 또는 프로브이나, 이로 제한되지 않는다.
프라이머는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다.
프로브는 mRNA와 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있으며 라벨링 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있는 RNA 또는 DNA 등의 자연 또는 변형된 핵산 단편을 의미한다. 혼성화에 사용되는 프로브는 올리고뉴클로타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 혼성화에 적합한 조건은 온도, 이온세기(완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 다르게 결정될 수 있다.
통상의 기술자는, 공지된 본 발명의 바이오마커 유전자 핵산 서열로부터 상기 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 쌍 또는 상기 유전자의 특정 영역을 특이적으로 인지하는 프로브를 디자인할 수 있고, 이 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 또한, 검출 가능한 시그널을 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있도록 방사성 동위원소, 형광성 분자, 바이오틴 등의 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다.
본 발명 일실시양태에 있어서, 상기 프라이머 쌍은 바이오마커 각각에 대하여 HAPLN1 (서열번호 9 및 10), INHBA (서열번호 11 및 12), SLC7A14 (서열번호 13 및 14), AMOT (서열번호 15 및 16), FLG2 (서열번호 17 및 18), JUNB (서열번호 19 및 20) 일 수 있다.
본 기술분야에서 바이오마커 단백질 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 항체로, SLC7A14 (solute carrier family 7, member 14), AMOT (angiomotin), FLG2 (fibrinogen-like 2), JUNB (jun B proto-oncogene), HAPLN1 (hyaluronan and proteoglycan link protein 1) 또는 INHBA (inhibin beta A)에 대하여 각각 특이적으로 결합하는 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 또한, 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태 및 항체 분자의 기능적인 단편, 예를 들어, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv의 형태도 포함한다.
SLC7A14 (solute carrier family 7, member 14), AMOT (angiomotin), FLG2 (fibrinogen-like 2), JUNB (jun B proto-oncogene), HAPLN1 (hyaluronan and proteoglycan link protein 1) 및 INHBA (inhibin beta A)에 특이적인 각각의 항체는 기존의 항체뿐만 아니라 공지된 방법으로 제조될 수 있는 항체를 모두 포함한다.
이를 이용하여, 면역분석(immunoassay, 예컨대, 방사능 면역분석 방법, 방사능 면역-침전 방법, 효소-결합 면역흡착 방법 (ELISA), 도트 블롯 분석, 웨스턴 블롯, 억제 또는 경쟁 분석 및 샌드위치 분석)를 통하여 정량적으로 또는 정성적으로 실시될 수 있다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, SLC7A14 (solute carrier family 7, member 14), AMOT (angiomotin), FLG2 (fibrinogen-like 2), JUNB (jun B proto-oncogene), HAPLN1 (hyaluronan and proteoglycan link protein 1) 및 INHBA (inhibin beta A)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 mRNA 또는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 중간엽 줄기세포로부터 부갑상선 조직 세포로의 분화를 탐지하기 위한 바이오마커 검출용 조성물을 포함하는 중간엽 줄기세포로부터 부갑상선 조직 세포로의 분화 바이오마커 검출용 키트를 제공한다.
상기 키트에는 부갑상선 조직 세포 분화에 있어서 발현이 증가 또는 감소하는 바이오마커 유전자 또는 이들의 단백질을 선택적으로 인지할 수 있는 프라이머 또는 항체뿐만 아니라 면역학적 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함된다. 이러한 도구나 시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함하나 이로 제한되지 않는다. 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.
키트는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR) 디바이스, 실시간 중합효소연쇄반응(Real time PCR) 디바이스, ELISA 플레이트, 딥-스틱 디바이스, 면역크로마토그래피 시험 스트립 및 방사 분할 면역검정 디바이스, 및 플로우-쓰로우(flow-through) 디바이스 등의 형태를 가질 수 있으며, 바람직하게는 마이크로어레이로 구성되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 항체가 다수의 단백질이 고정될 수 있는 단백질 칩에 제공되는 경우에는, 2개 이상의 항체에 대한 항원-항체 복합체 형성을 관측할 수 있어 부갑상선 분화 세포로의 분화 탐지에 보다 유리하다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, SLC7A14 (solute carrier family 7, member 14), AMOT (angiomotin), FLG2 (fibrinogen-like 2), JUNB (jun B proto-oncogene), HAPLN1 (hyaluronan and proteoglycan link protein 1) 및 INHBA (inhibin beta A)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 mRNA 또는 단백질의 수준을 확인하여 중간엽 줄기세포로부터 부갑상선 조직 세포로의 분화를 탐지하는 방법을 제공한다.
mRNA 또는 단백질의 수준을 확인하여 중간엽 줄기세포로부터 부갑상선 조직 세포로의 분화를 탐지하는 방법은 특정 유전자의 발현 정도를 측정하는 공지의 방법들을 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR) 또는 실시간 중합효소연쇄반응(Real time PCR)을 이용하여 유전자 수준의 발현 정도를 측정하거나, 웨스턴 블럿팅 방법을 이용하여 단백질 수준의 발현 정도를 측정할 수 있다.
구체적 양태로서, 중간엽 줄기세포로부터 부갑상선 조직 세포로의 분화를 탐지하는 방법은, (a) 중간엽 줄기세포로부터 핵산 시료를 얻는 단계; (b) 상기 핵산 시료 중, SLC7A14 (solute carrier family 7, member 14), AMOT (angiomotin), FLG2 (fibrinogen-like 2), JUNB (jun B proto-oncogene), HAPLN1 (hyaluronan and proteoglycan link protein 1) 및 INHBA (inhibin beta A)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 발현량을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)의 SLC7A14 (solute carrier family 7, member 14), AMOT (angiomotin), FLG2 (fibrinogen-like 2) 및 JUNB (jun B proto-oncogene)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현량이 감소하거나, HAPLN1 (hyaluronan and proteoglycan link protein 1) 또는 INHBA (inhibin beta A) 유전자의 발현량이 증가할 때, 중간엽 줄기세포가 부갑상선 조직 세포로 분화된 것으로 판정하는 단계를 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 단계 (b)에서 유전자 발현량 측정은 상기 바이오마커 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하여 부갑상선 조직 세포로 분화시킨 중간엽 줄기세포로부터 얻은 핵산 시료와 반응시켜 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR) 또는 실시간 중합효소연쇄반응(Real time PCR)을 수행하고, 전기영동하여 바이오마커 유전자들의 mRNA 발현량을 측정함으로써 유전자 발현 정도에 따라 분화 여부를 탐지할 수 있게 된다. 본 발명의 구체적 실시예에서는 본 발명의 바이오마커 유전자의 발현 수준을 확인하기 위하여, 중합효소연쇄반응(PCR), 실시간 중합효소연쇄반응 (Real timePCR)을 수행하였으며, 그 결과 본 발명의 바이오마커 유전자는 부갑상선 조직 세포로 분화된 세포에서만 특이적으로 증가 또는 감소함을 알 수 있다.
본 발명의 바이오마커들이 미분화된 줄기세포들 뿐만 아니라 Passage 증가, 단순 배양에 따른 유전자 발현 변화를 나타내는 특성이 변화된 세포들과 구별되어 부갑상선 조직 세포로의 분화를 확인할 수 있게 하고 분화를 위한 주요 인자(Key factor)로 개발할 수 있을 뿐만 아니라 이를 통해 분화의 유도 및 부갑상선 호르몬을 생산하고 제어 가능한 줄기 세포 치료제를 개발하는데 활용될 수 있다.
도 1은 줄기세포로부터 부갑상선 조직 세포로의 분화 과정을 나타내는 도이다.
도 2는 부갑상선 조직 세포로의 분화를 확인하여 주는 알려진 바이오마커인 PTH, CHGA, CASR의 발현을 RT-PCR을 통해 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 3은 부갑상선 조직 세포로의 분화에 의해 제조된 분화 세포의 mRNA발현을 마이크로어레이로 분석한 Heatmap 결과를 나타내는 도이다.
도 4는 마이크로 어레이를 통해 확인된 부갑상선 조직 세포로의 분화에서 발현이 감소된 유전자 SLC7A14, AMOT, FGL2, JUNB의 발현 수준(Fold change)을 나타내는 도이다.
도 5는 마이크로 어레이를 통해 확인된 부갑상선 조직 세포로의 분화에서 발현이 증가된 유전자 HAPLN1, INHBA의 발현 수준(Fold change)을 나타내는 도이다.
도 6은 부갑상선 조직 세포로의 분화에서 발현이 감소된 유전자 SLC7A14, AMOT, FGL2, JUNB들에 대한 RT-PCR을 수행한 결과를 나타내는 도이다.
도 7은 부갑상선 조직 세포로의 분화에서 발현이 증가된 유전자 HAPLN1, INHBA들에 대한 RT-PCR을 수행한 결과를 나타내는 도이다.
본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 제시한다. 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 중간엽 줄기세포로부터 부갑상선 조직 세포로의 분화
편도 유래 중간엽 줄기세포(tonsil-derived mesenchymal stem cell, T-MSC)는 이대목동병원 이비인후-두경부외과에서 편도적출술을 시행하는 환자로부터 적출된 편도조직(4-20세의 저연령층 조직, 임상윤리위원회 심의 통과: ECT 11-53-02)을 얻어, 이로부터 줄기세포를 분리하여 10% FBS (Hyclone), 1%페니실린/스트렙토마이신 (GIBCO), 0.1 mM β-머캅토에탄올(Sigma), 1% 비필수아미노산(GIBCO)이 보충된 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium, GIBCO)에서 배양하였다.
부갑상선 조직 세포로의 분화 과정의 모식도는 도 1에 나타내었다.
부갑상선 조직 세포로의 분화를 위하여, 100 ng/ml의 Activin A (R&D systems)와 100 ng/ml의 Shh (R&D systems)가 들어간 DMEM-high glucose /10% FBS 배양액에 6 cm 배양접시에서 5×105개로 7일 동안 배양하였다(D7). 이 배양 과정에서 4일째에 배양액을 교환해주었다.
이와 별도로 Activin A 및 Sonic hedgehog(Shh)가 없는 DMEM-high glucose /10% FBS 배양액에 6 cm 배양접시에서 5×105개 편도 유래 중간엽 줄기세포를 7일 동안 배양하였다(C7).
대조군으로는 미분화된 편도 유래 중간엽 줄기세포를 사용하였다(C0).
< 실시예 2> 알려진 부갑상선 조직 세포로의 분화 바이오마커를 이용한 분화 확인
중간엽 줄기세포로부터 부갑상선 조직 세포로의 분화가 잘 이루어졌는지 확인하기 위하여, 알려진 바이오마커인 CHGA (chromogranin A), CASR (calcium-sensing receptor), PTH (parathyroid hormone)를 이용하여 분화가 이루어졌음을 확인하였다.
구체적으로, 하기 표 1의 프라이머 서열을 이용하여 Real-time PCR을 수행하였다.
[표 1]
Figure 112018036481892-pat00001
구체적으로, 실험군별로 세포를 수집하여 RNeasy mini kit (Qiagen Inc.)을 이용하여 총 RNA를 추출하였고 Superscript Ⅳ(Invitrogen)와 oligo-dT primer를 이용하여 55℃ 10분, 80℃ 10분간 반응하여 cDNA를 합성하였다. 상기 cDNA에 대한 Quantitative real-time PCR은 SYBR® Premix Ex Taq™ kits (TaKaRa Bio Inc., Shiga, Japan)를 이용하여, ABI 7500 Fast Real-Time PCR system (Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA)에서 수행하였다. 해당 유전자의 상대적 발현량은 comparative Ct method (2-ΔCt) 방법으로 계산하였으며, 모든 측정값은 삼중(triplicate)으로 수행하였다.
그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에서 확인되는 바와 같이, Activin A 및 Sonic hedgehog(Shh)를 이용하여 분화를 진행한 그룹(D7)에서 CHGA (chromogranin A), CASR (calcium-sensing receptor), PTH (parathyroid hormone)의 부갑상선 조직 세포로의 분화를 표지하는 바이오마커의 발현이 크게 증가하는 것을 확인하였다.
이를 통하여 실시예 1의 방법에 따른 분화에 의하여 부갑상선 조직 세포로의 분화가 이루어졌음을 확인하였다.
<실시예 3> 발현 변화 확인을 위한 마이크로어레이 분석
위 실시예 1에서 제조된 C0, C7 및 D7 세포들에 대하여 마이크로어레이 분석을 통해 유전자들의 발현 변화를 확인하였다.
각각의 세포에서 분리한 RNA를 c-DNA로 합성하여 genechip (Affymetrix Whole transcript Expression array)를 이용하여 유전자 분석을 실행하였고, 그 결과를 도 3에 Heatmap으로 나타내었다.
도 3에서 확인되는 바와 같이, 부갑상선 조직세포로의 분화방법에 따라 분화된 실험군에서 다른 세포들과 다른 heatmap 양상이 확인되었다.
위 Heatmap을 기초로 하여, 미분화 줄기세포와 비교할 때 fold change 값의 변화가 Activin A 및 Sonic hedgehog(Shh)가 없는 DMEM-high glucose /10% FBS 배양액에서 배양된 세포들에서 증가하고, 반면 분화과정을 수행한 세포들에서 감소하는 유전자들을 선별하여 이를 표 2 및 도 4에 나타내었다.
[표 2]
Figure 112018036481892-pat00002
위 표 2 및 도 4에서 확인되는 바와 같이, 미분화 줄기세포(C0)를 기초로 발현 수준을 fold change로 검토할 때 SLC7A14 (solute carrier family 7, member 14), AMOT (angiomotin), FLG2 (fibrinogen-like 2), JUNB (jun B proto-oncogene)의 경우 분화를 수행한 세포들에서 fold change가 감소하지만 분화 과정을 수행하지 않은 것들에 대해서는 크게 증가되는 것을 확인하였다.
또한, 위 Heatmap을 기초로 하여, 미분화 줄기세포와 비교할 때 fold change 값의 변화가 Activin A 및 Sonic hedgehog(Shh)가 없는 DMEM-high glucose /10% FBS 배양액에서 배양된 세포들에서 감소하고, 반면 분화과정을 수행한 세포들에서 증가하는 유전자들을 선별하여 이를 표 3 및 도 5에 나타내었다.
[표 3]
Figure 112018036481892-pat00003
표 3 및 도 5에서 확인되는 바와 같이, 미분화 줄기세포(C0)를 기초로 발현 수준을 fold change로 검토할 때 HAPLN1 (hyaluronan and proteoglycan link protein 1), INHBA (inhibin beta A)의 경우 분화를 수행한 세포들에서 fold change가 증가하지만 분화 과정을 수행하지 않은 것들에서 크게 감소되는 것을 확인하였다.
위 결과들로부터 부갑상선 조직 세포로 분화 예측에 위 SLC7A14 (solute carrier family 7, member 14), AMOT (angiomotin), FLG2 (fibrinogen-like 2), JUNB (jun B proto-oncogene), HAPLN1 (hyaluronan and proteoglycan link protein 1), 또는 INHBA (inhibin beta A)가 이용될 수 있음을 확인하였다.
< 실시예 4> RT- PCR을 통한 바이오마커의 발현 변화 확인
위 실시예 3에서 microarray결과 분석 후 fold 값이 유의적인 변화가 있는 선발된 유전자들의 기능분석을 위해 NCBI 사이트에서 mRNA sequence를 찾아서 primer를 제작하여 이를 표 4에 나타내었다.
[표 4]
Figure 112018036481892-pat00004
그리고 나서, 상기 실시예 2에서와 동일한 방법으로 RT-PCR을 수행하였고, 그 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다.
도 6은 줄기세포로부터 부갑상선 분비세포로 분화시 Fold change가 감소하였던 SLC7A14 (solute carrier family 7, member 14), AMOT (angiomotin), FLG2 (fibrinogen-like 2), JUNB (jun B proto-oncogene)의 발현 변화를 확인한 결과를 나타낸다. 도 6의 RT-PCR 결과에서도 확인되는 바와 같이, 이들 바이오마커들 모두 위 Microarray와 동일한 발현 변화 결과를 확인하였고 Activin A 및 Sonic hedgehog(Shh)가 없는 DMEM-high glucose /10% FBS 배양액에서 배양된 세포들에 비해 유전자 발현 수준이 매우 낮음을 확인하였다.
도 7은 줄기세포로부터 부갑상선 분비세포로 분화시 Fold change가 증가하였던 HAPLN1 (hyaluronan and proteoglycan link protein 1), INHBA (inhibin beta A)의 발현 변화를 확인한 결과를 나타낸다. 도 7의 RT-PCR 결과에서도 확인되는 바와 같이, 이들 바이오마커들 모두 위 Microarray와 동일한 발현 변화 결과를 확인하였고 Activin A 및 Sonic hedgehog(Shh)가 없는 DMEM-high glucose /10% FBS 배양액에서 배양된 세포들에 비해 유전자 발현 수준이 매우 높음을 확인하였다.
위 결과들로부터 본원 발명에 따른 바이오마커들이 미분화된 줄기세포들 뿐만 아니라 Passage 증가, 단순 배양에 따른 유전자 발현 변화를 나타내는 특성이 변화된 세포들과 구별될 수 있는 특성을 제공하는 것을 확인하였고, 이를 통해 분화의 유도 뿐만 아니라 부갑상선 호르몬을 생산하고 제어 가능한 줄기 세포 치료제를 개발하는데 활용될 수 있다.
본 명세서는 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 내용은 그 상세한 기재를 생략하였으며, 본 명세서에 기재된 구체적인 예시들 이외에 본 발명의 기술적 사상이나 필수적 구성을 변경하지 않는 범위 내에서 보다 다양한 변형이 가능하다. 따라서 본 발명은 본 명세서에서 구체적으로 설명하고 예시한 것과 다른 방식으로도 실시될 수 있으며, 이는 본 발명의 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자이면 이해할 수 있는 사항이다.
<110> EWHA UNIVERSITY - INDUSTRY COLLABORATION FOUNDATION <120> BIOMARKERS FOR DETECTING OF DIFFRENTIATION TO PARATHYROID CELL AND USE THEREOF <130> P18-062-EWHA <160> 20 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CASR Forward Primer <400> 1 agcccctcat caaggagatt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CASR Reverse Primer <400> 2 gacagacttc ctgggatgga 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHGA Forward Primer <400> 3 ctacgcgcct tgtctcctac 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHGA Reverse Primer <400> 4 agttgtgccc agtggatagg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTH Forward Primer <400> 5 aatggctgcg taagaagctg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PTH Reverse Primer <400> 6 agctttgtct gcctctccaa 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH Forward Primer <400> 7 tgctgtagcc aaattcgttg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH Reverse Primer <400> 8 acacccactc ctccaccttt 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HAPLN1 Forward Primer <400> 9 tgctcagatt gcaaaagtgg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HAPLN1 Reverse Primer <400> 10 tatctgggaa acccacgaag 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INHBA Forward Primer <400> 11 tttctgttgg caagttgctg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INHBA Reverse Primer <400> 12 cgggtctctt cttcaagtgc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC7A14 Forward Primer <400> 13 gatgacccct tctcagtgga 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC7A14 Reverse Primer <400> 14 tcagggcctc tgagttctgt 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AMOT Forward Primer <400> 15 attttgctct ggatgctgct 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AMOT Reverse Primer <400> 16 tggccatcaa gatttcttcc 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FGL2 Forward Primer <400> 17 gcacagctgg agatgcatta 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FGL2 Reverse Primer <400> 18 atcaaaccac cagcctgaac 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JunB Forward Primer <400> 19 ccccaagatc ctgaaacaga 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JunB Reverse Primer <400> 20 ccgttgctgg actggattat 20

Claims (11)

  1. SLC7A14 (solute carrier family 7, member 14), AMOT (angiomotin), FLG2 (fibrinogen-like 2), JUNB (jun B proto-oncogene), HAPLN1 (hyaluronan and proteoglycan link protein 1) 및 INHBA (inhibin beta A)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 mRNA 또는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 중간엽 줄기세포로부터 부갑상선 조직 세포로의 분화를 탐지하기 위한 바이오마커 검출용 조성물로서,
    상기 mRNA 수준을 측정하는 제제가 상기 유전자의 mRNA에 특이적인 프라이머 쌍 또는 프로브인 검출용 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 인간 유래인 것을 특징으로 하는 검출용 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 인간의 편도 유래 중간엽 줄기세포인 검출용 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포로부터 부갑상선 조직 세포로의 분화는 액티빈(Activin) A 및 소닉 헤지호그(Sonic hedgehog)(Shh)를 포함하는 배지에서 배양을 포함하는 것인 검출용 조성물.
  6. 제1항, 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 중간엽 줄기세포로부터 부갑상선 조직 세포로의 분화 바이오마커 검출용 키트.
  7. 제6항에 있어서, 상기 키트는 바이오마커 유전자 또는 이들의 단백질을 선택적으로 인지할 수 있는 프라이머 또는 항체를 포함하는 것인 검출용 키트.
  8. 제7항에 있어서, 상기 키트는 마이크로어레이인 검출용 키트.
  9. SLC7A14 (solute carrier family 7, member 14), AMOT (angiomotin), FLG2 (fibrinogen-like 2), JUNB (jun B proto-oncogene), HAPLN1 (hyaluronan and proteoglycan link protein 1) 및 INHBA (inhibin beta A)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 mRNA 또는 단백질의 수준을 확인하여 중간엽 줄기세포로부터 부갑상선 조직 세포로의 분화를 탐지하는 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    (a) 중간엽줄기세포로부터 핵산 시료를 얻는 단계;
    (b) 상기 핵산 시료 중, SLC7A14 (solute carrier family 7, member 14), AMOT (angiomotin), FLG2 (fibrinogen-like 2), JUNB (jun B proto-oncogene), HAPLN1 (hyaluronan and proteoglycan link protein 1) 및 INHBA (inhibin beta A)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 발현량을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)의 SLC7A14 (solute carrier family 7, member 14), AMOT (angiomotin), FLG2 (fibrinogen-like 2) 및 JUNB (jun B proto-oncogene)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현량이 감소하거나, HAPLN1 (hyaluronan and proteoglycan link protein 1) 또는 INHBA (inhibin beta A) 유전자의 발현량이 증가할 때, 중간엽 줄기세포가 부갑상선 조직 세포로 분화된 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 중간엽 줄기세포로부터 부갑상선 조직 세포로의 분화를 탐지하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 단계 (b)에서 유전자 발현량 측정은 상기 마커 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하여 부갑상선 조직 세포로 분화시킨 중간엽 줄기세포로부터 얻은 핵산 시료와 반응시켜 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR) 또는 실시간 중합효소연쇄반응(Real time PCR)을 수행하는 것인, 중간엽 줄기세포로부터 부갑상선 조직 세포로의 분화를 탐지하는 방법.
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