WO2020246774A1 - 편도 유래 중간엽 줄기세포의 골분화능 예측을 위한 ｗｎｔ16 마커의 용도 - Google Patents

편도 유래 중간엽 줄기세포의 골분화능 예측을 위한 ｗｎｔ16 마커의 용도 Download PDF

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mesenchymal stem
tonsil
cells
derived mesenchymal
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유경하
우소연
김유희
김한수
박주원
조경아
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이화여자대학교 산학협력단
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
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    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses

Definitions

  • the present invention is a composition for detecting a biomarker for predicting the osteodifferentiation ability of tonsil-derived mesenchymal stem cells comprising an agent for measuring the expression level of WNT16 mRNA or protein, a kit comprising the composition, the WNT16 biomarker gene It relates to a method of determining tonsil-derived mesenchymal stem cells to differentiate into osteogenic cells or osteoblasts by using.
  • Human mesenchymal stem cells are adult stem cells, which are free from ethical issues that are generally problematic for embryonic stem cells, as well as adipocytes, osteoblasts, cartilage cells, heart cells, muscle cells, and nerve cells. It is reported that it is possible to differentiate into various cells such as.
  • mesenchymal stem cells have a great limitation in actual clinical and industrial use as the technology for efficient mass differentiation into specific cells has not yet been established. Therefore, it is imperative to establish a technology that induces differentiation to a specific stage in a large amount and efficiently, and for this, it is necessary to discover the mechanism of signal transduction inducing differentiation to a specific stage and to discover appropriate biomarkers to confirm differentiation.
  • their characteristics may vary depending on the differentiation environment and passage increase, and thus, it is often difficult to confirm whether the differentiation into a desired cell is well performed. Therefore, the discovery of biomarkers to ensure the stability of cells to be used after differentiation and to confirm whether differentiation into specific cells can be performed well must be accompanied from the stage of using stem cells.
  • Mesenchymal stem cells can be derived from various types of tissue. However, it is known that mesenchymal stem cells from various sources may have heterogeneity depending on differences in methods of culturing in vitro proliferation culture conditions, differences in donor sources of stem cells, or differences in extraction sites for stem cells. have. Due to this problem, the stability problem of stem cells continues to emerge, and research and development of a new method for collecting stem cell sources having homogeneous characteristics is required.
  • osteogenic cells are cells associated with undifferentiated bone formation and later develop into osteoblasts. Osteoblasts are involved in the creation of new bones and are distributed in the growth cells of bones, including the epiosteal and endometrium. Osteoblasts do not differentiate, and they synthesize and secrete collagen and calcium, which are the basis of bone, and adhere to each other, thereby establishing their place in the bone. As a result, osteoblasts change their shape and structure into bone cells (Osteocytes). In the production of such, osteogenic cells or osteoblasts, stem cells are widely used as a source thereof. However, research and development related to a method for classifying stem cells suitable for differentiation into osteogenic cells or osteoblasts has not been made yet.
  • the present inventors have tried to find a method for effectively obtaining bone-related cells such as osteogenic cells and osteoblasts from stem cells.
  • cells having diversity were classified according to the donors of tonsil-derived stem cells, and the present invention was completed by confirming that WNT16 is a biomarker having a high relevance for determining osteodifferentiation ability of tonsil-derived stem cells.
  • One object of the present invention is to provide a composition for detecting a biomarker for predicting the osteodifferentiation ability of tonsil-derived mesenchymal stem cells, including an agent for measuring the expression level of WNT16 mRNA or protein.
  • Another object of the present invention is to provide a kit comprising a composition for detecting a biomarker for predicting the osteodifferentiation ability of tonsil-derived mesenchymal stem cells, including an agent for measuring the expression level of WNT16 mRNA or protein.
  • Another object of the present invention is to determine the level of a composition for detecting a biomarker for predicting the osteodifferentiation ability of tonsil-derived mesenchymal stem cells, including an agent for measuring the expression level of WNT16 mRNA or protein, to determine osteogenic cells or It is to provide a method of determining tonsil-derived mesenchymal stem cells to differentiate into osteoblasts.
  • WNT16 a biomarker according to the present invention, provides information on the osteodifferentiation ability of stem cells themselves so as to solve the problem of heterogeneity due to undifferentiated stem cells, particularly a combination of various precursor cells. Through this, it is possible to determine the induction of bone differentiation of mesenchymal stem cells derived from tonsils, and can be used to develop stem cell-based therapeutics using bone-related cells.
  • OB osteoblasts
  • AD adipocytes
  • Figure 3 is to secure 6 clones with high osteoblast differentiation ability (osteoblast prone clone, OP clone) and 6 clones that do not differentiate well into osteoblasts (non-differentiating clone, ND clone), their differentiation ability into osteoblasts Shows the result of checking.
  • Figure 6 is a clone with high osteoblast differentiation ability (osteoblast prone clone, OP clone, 14, 16) by differentiating each isolated monoclonal tonsil-derived mesenchymal stem cells into osteoblasts (OB), chondrocytes (ChD), or adipocytes (AD). , 22) shows the result of confirming that it exhibits excellent osteoblast differentiation ability.
  • OB osteoblast prone clone
  • ChoD chondrocytes
  • AD adipocytes
  • Figure 8 shows the results of the gene set enrichment analysis of DEG based on the gene ontology (GO; http://geneontology.org/).
  • FIG. 10 is a diagram showing RT-PCR results for WNT16, DPP4, DCLK1, IGFBP5, FBLN2, and HIGD1A.
  • FIG. 11 shows the degree of osteoblast differentiation measured at absorbance 540 nm by eluting the cells that induced WNT16 expression and differentiation into osteoblasts in undifferentiated state of tonsil-derived mesenchymal stem cells for 3 weeks after staining with Alizarin Red S and eluting with 10% cetylpyridinium chloride. Shows correlation.
  • composition for detecting a biomarker for predicting the osteodifferentiation ability of tonsil-derived mesenchymal stem cells including an agent for measuring the expression level of WNT16 mRNA or protein.
  • WNT16 (Wnt family member 16) (RefSeq (mRNA): NM_057168, NM_016087. NM_053116, RefSeq (Protein): NP_057171, NP_476509, NP_444346) is a gene belonging to the 19 WNT gene family. WNT16 has been identified as a molecule that maintains cortical bone thinkness and femur strength in experimental animal models.
  • the term "mesenchymal stem cell” has a self-renewal capacity in an undifferentiated state and a multi-differentiation potency capable of being differentiated into cells of various tissues by specific differentiation-inducing stimulation. Says the cell.
  • the mesenchymal stem cells of the present invention may be any cell having differentiation and proliferation ability, and human, monkeys, pigs, horses, cows, sheep, and dogs (dogs), cats (cats), mice (mice), rabbits (rabbits) can be derived from all animals, preferably human origin, more preferably human tonsils, adipose tissue, bone marrow, peripheral blood , Or may be isolated from umbilical cord blood, and most preferably may be isolated from or derived from human tonsils.
  • Mesenchymal stem cells may be combined with various precursor cells depending on the extraction site to have heterogeneity in cell composition. Since this diversity of cells can lead to variation in non-clinical and clinical trials, it is necessary to classify mesenchymal stem cells having homogeneous characteristics.
  • the composition classifies stem cells having excellent bone differentiation ability with the same characteristics as described above, so that they can be used for differentiation from stem cells into bone-related cells.
  • mesenchymal stem cells extracted from the same extraction site may have different characteristics depending on the donor providing the same, and excellent mesenchymal stem cells are classified among the mesenchymal stem cells derived from the same source tissue. Make it available for differentiation into related cells.
  • the term “tonsil” refers to a tissue that is located on the inside of the neck and at the back of the nose and serves as a lymphepithelial immune tissue while primarily defending our body from substances such as bacteria invading from the outside. do.
  • the tonsils include pharyngeal tonsils, ear pharyngeal tonsils, palatal tonsils, tongue tonsils, and the like.
  • the tonsil is used as a source tissue for providing mesenchymal stem cells derived from tonsils.
  • the term “tonsil-derived mesenchymal stem cells” as used herein refers to mesenchymal stem cells (MSCs) derived from tonsils.
  • osteoogenic cell refers to a cell that is associated with undifferentiated bone formation and later develops into an osteoblast.
  • Osteoblast of the present invention is a cell that has the ability to calcify bone tissue by synthesizing and secreting bone matrix, and depositing inorganic salts such as Ca and Mg ions on the matrix, and is also called osteoblast.
  • the "biomarker for predicting osteodifferentiation” is a biomarker that provides information on whether the cell is suitable for differentiation into bone-related cells such as osteoblasts, osteoblasts, and osteoblasts, as well as osteogenic cells. It is a marker. Specifically, it is a biomarker showing a significant difference in expression or not in mesenchymal stem cells for differentiation into bone-related cells.
  • Differentiation of tonsil-derived mesenchymal stem cells into bone-related cells may include all methods of differentiation from conventionally known mesenchymal stem cells into bone-related cells.
  • dexamethasone, glycerol 2-phosphate ( ⁇ -glycerophosphate), and ascorbic acid (ascorbic acid) can be cultured in a conventional medium containing any one or more selected from the group consisting of. More preferably, it can be cultured in a conventional medium containing dexamethasone, glycerol 2-phosphate ( ⁇ -glycerophosphate) and ascorbic acid.
  • DMEM Dulbeco's Modified Eagle's Medium
  • MEM Minimal Essential Medium
  • ⁇ -MEM BME (Basal Medium Eagle)
  • RPMI1640 F-10
  • F-12 F-12
  • MEM Minimal Essential Medium
  • GMEM Glasgow's Minimal Essential Medium
  • IMDM Iscove's Modified Dulbecco's Medium
  • a composition for differentiation into a commercially available bone-related cell may be used.
  • bone differentiation was performed using a StemPro osteogenesis differentiation kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) for 3 weeks.
  • the present invention includes a method for differentiation into osteogenic and/or osteoblasts according to the manufacturer's instructions provided in a commercially sold kit as described above.
  • the method of differentiation from tonsil-derived mesenchymal stem cells to bone-related cells of the present invention is, for example, cultured in a medium containing an antibiotic agent, a serum component, dexamethasone, glycerol 2-phosphate, and ascorbic acid. This may be to induce bone differentiation.
  • containing 10% FBS, 100 IU / ml penicillin, 100 ⁇ g / ml streptomycin, 50 ⁇ M ascorbate-2-phosphate, 10 mM ⁇ -glycerophosphate and 0.1 ⁇ M dexamethasone Induction of bone formation can be performed in ⁇ -MEM medium.
  • the culture period of the tonsil-derived mesenchymal stem cells is preferably 4 days or more, more preferably 7 days or more, and even more preferably 7 to 30 days or less.
  • the tonsil-derived mesenchymal stem cells may be collected and used from a tonsil tissue isolated from a patient undergoing a tonsillectomy, but is not limited thereto.
  • the collected tonsil tissue is washed with a buffer solution, and then the connective tissue is decomposed by treating the enzyme mixture.
  • the suspended tissue is centrifuged, and the cell mixture in the cut tissue is added to Ficoll.
  • Immunochemical method using cell surface markers among cells showing adhesion to the bottom of the culture dish after culturing only the precipitated part of the lower layer by using the cell fractionation method and centrifugation method, and separating only the part of the cell that shows adhesion to the cell floor. Tonsil-derived mesenchymal stem cells can be isolated using.
  • tonsil stem cells for 4 to 25 days contain 10% FBS, 100 IU/ml penicillin, 100 ⁇ g/ml streptomycin, 50 ⁇ M ascorbate-2-phosphate, 10 mM ⁇ -glycerophosphate and 0.1 ⁇ M dexamethasone.
  • Differentiation into bone-related cells can be induced by culturing in a medium, and when the culture period exceeds 4 days, the medium can be replaced with fresh medium every 4-5 days.
  • the stem cell medium may be supplemented with an additive.
  • neutral buffers such as phosphate and/or high concentration bicarbonate
  • protein nutrients such as serum such as FBS, serum substitutes, albumin, or essential and non-essential amino acids such as glutamine
  • isotonic solution may be contained.
  • lipids fatty acids, cholesterol, HDL or LDL extracts of serum
  • other components found in most preservative media of this kind such as insulin or transferrin, nucleoside or nucleotide, pyruvate, any ionized form or salt
  • Sugar sources such as glucose, selenium, glucocorticoids such as hydrocortisone and/or reducing agents such as ⁇ -mercaptoethanol).
  • the composition according to the present invention can be used to classify tonsil-derived mesenchymal stem cells suitable for differentiation into osteoblasts and osteogenic cells.
  • the agent for measuring the mRNA level of the biomarker in the technical field of the present invention is preferably a primer or a probe, but is not limited thereto.
  • a primer is a nucleic acid sequence having a short free 3'hydroxyl group, which can form a base pair with a complementary template and refers to a short nucleic acid sequence that functions as a starting point for template strand copying.
  • a probe refers to a natural or modified nucleic acid fragment such as RNA or DNA that can be hybridized to an mRNA and a specific nucleotide sequence and is labeled to confirm the presence or absence of a specific mRNA.
  • Probes used for hybridization may be manufactured in the form of an oligonucleotide probe, a single stranded DNA probe, a double stranded DNA probe, or an RNA probe.
  • Conditions suitable for hybridization can be determined by controlling the temperature, ionic strength (buffer concentration), and the presence of a compound such as an organic solvent. These stringent conditions can be determined differently depending on the sequence being hybridized.
  • a person of ordinary skill in the art can design a primer pair that specifically amplifies a specific region of the gene or a probe that specifically recognizes a specific region of the gene from the known biomarker gene nucleic acid sequence of the present invention. It can be chemically synthesized using methods known in the art. In addition, it may be modified using a label such as a radioactive isotope, a fluorescent molecule, or biotin so as to directly or indirectly provide a detectable signal.
  • the primer pair may be SEQ ID NO: 1 and 2 for the biomarker.
  • the agent for measuring the level of the biomarker protein in the art is preferably an antibody, and includes all of a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, and a recombinant antibody that each specifically binds to WNT16.
  • the antibody of the present invention is a complete form having two full-length light chains and two full-length heavy chains and functional fragments of antibody molecules, for example, Fab, F(ab'), F(ab') 2 And the form of Fv.
  • Each antibody specific for WNT16 includes all antibodies that can be prepared not only by conventional antibodies but also by known methods.
  • immunoassays e.g., radioactive immunoassay method, radioactive immuno-precipitation method, enzyme-linked immunosorbent method (ELISA), dot blot analysis, western blot, inhibition or competition analysis and sandwich analysis
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent method
  • kits comprising a composition for detecting a biomarker for predicting the osteodifferentiation ability of tonsil-derived mesenchymal stem cells comprising an agent for measuring the expression level of WNT16 mRNA or protein to provide.
  • the kit includes a primer or antibody capable of selectively recognizing a biomarker gene or protein thereof for increasing or decreasing the expression of WNT16 in bone differentiation from stem cells, as well as commonly used in the art for immunological analysis.
  • tools and reagents include, but are not limited to, suitable carriers, labeling substances capable of generating detectable signals, solubilizers, detergents, buffers, stabilizers, and the like.
  • the labeling substance is an enzyme
  • a substrate capable of measuring enzyme activity and a reaction terminator may be included.
  • Suitable carriers include, but are not limited to, soluble carriers such as physiologically acceptable buffers known in the art, such as PBS, insoluble carriers such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyester, Polyacrylonitrile, fluororesin, crosslinked dextran, polysaccharide, polymers such as magnetic fine particles plated with metal on latex, other paper, glass, metal, agarose, and combinations thereof.
  • physiologically acceptable buffers known in the art, such as PBS, insoluble carriers such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyester, Polyacrylonitrile, fluororesin, crosslinked dextran, polysaccharide, polymers such as magnetic fine particles plated with metal on latex, other paper, glass, metal, agarose, and combinations thereof.
  • the kit includes a reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) device, a real time PCR device, an ELISA plate, a dip-stick device, an immunochromatographic test strip and a radiation split immunoassay device, and a flow-write device. It may have a form such as a flow-through device, and is preferably composed of a microarray, but is not limited thereto.
  • RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction
  • kit may further include a user's manual describing the optimum reaction performance conditions.
  • Instructions include brochures in the form of brochures or flyers, labels affixed to the kit, and instructions on the surface of the package containing the kit.
  • the manual includes information disclosed or provided through an electronic medium such as the Internet.
  • the level of the biomarker detection composition for predicting the osteodifferentiation ability of tonsil-derived mesenchymal stem cells comprising an agent for measuring the expression level of WNT16 mRNA or protein, It provides a method of determining tonsil-derived mesenchymal stem cells to differentiate into osteogenic cells or osteoblasts.
  • the method of determining the tonsil-derived mesenchymal stem cells to differentiate into osteogenic cells or osteoblasts by checking the level of mRNA or protein can use known methods for measuring the expression level of a specific gene without limitation, but preferably reverse transcription.
  • the expression level of the gene level may be measured using a polymerase chain reaction (RT-PCR) or a real time PCR reaction, or the expression level of a protein level may be measured using a western blotting method.
  • a method of determining tonsil-derived mesenchymal stem cells to differentiate into osteogenic cells or osteoblasts comprises the steps of: (a) obtaining a nucleic acid sample from tonsil-derived mesenchymal stem cells; (b) measuring the expression level of the WNT16 gene in the nucleic acid sample; And (c) determining the tonsil-derived mesenchymal stem cells to differentiate into osteogenic cells or osteoblasts when the expression level of WNT16 in step (b) increases compared to the reference value.
  • This method can be done in vitro.
  • the measurement of the gene expression level in step (b) is performed by reacting with a nucleic acid sample obtained from tonsil-derived mesenchymal stem cells by using a primer specific for the biomarker gene to perform reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) or in real time.
  • RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction
  • Real time PCR polymerase chain reaction
  • PCR polymerase chain reaction
  • Real timePCR real time polymerase chain reaction
  • the biomarker gene of the present invention Represents the expression level of WNT16 that increases or decreases differently depending on the type of tonsil-derived mesenchymal stem cells (i.e., tonsil-derived mesenchymal stem cells obtained from different donors or donors), and based on the results, It provides information on whether it is a suitable tonsil-derived mesenchymal stem cell.
  • the reference value or reference level may be the expression level of WNT16 expressed in conventional stem cells. Alternatively, it may be the expression level of WNT16 measured in tonsil-derived stem cells having a low level of differentiation into bone-related cells. This reference value or reference level may be slightly different depending on the purpose of differentiation in differentiation into bone-related cells, but it clearly provides a level that is an appropriate criterion for classifying into osteogenic cells or cells suitable for differentiation into osteoblasts.
  • the present invention provides a method for producing osteogenic cells or osteoblasts from tonsil-derived mesenchymal stem cells.
  • a method of preparing osteogenic cells or osteoblasts from tonsil-derived mesenchymal stem cells comprises the steps of: (a) obtaining a sample from tonsil-derived mesenchymal stem cells; (b) measuring the expression level of the gene or protein of WNT16 in the sample; (c) selecting tonsil-derived mesenchymal stem cells to differentiate into osteogenic cells or osteoblasts; (d) culturing the selected mesenchymal stem cells in a medium containing dexamethasone, glycerol 2-phosphate, and ascorbic acid.
  • the contents of the method for differentiating into bone-related cells may be applied.
  • Tonsil-derived mesenchymal stem cell is a tonsil tissue extracted from a patient undergoing tonsillectomy at the Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery at Ewha Womens University Mokdong Hospital (Clinical Ethics Committee review passed: EUMC2018-01 -011-002) and incubated in low-glucose DMEM supplemented with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin.
  • Fig. 1 shows the results of confirming the differentiation of tonsil stem cells from four donors into osteoblasts and adipocytes. As can be seen in Fig. 1, it was found that the degree of differentiation was different for each cell.
  • donor cells having high osteoblast differentiation ability and low adipocyte differentiation ability were selected (donor #2) to confirm the mesenchymal stem cell phenotype by flow cytometry, and the results are shown in FIG. 2. As can be seen in Figure 2, it was confirmed that the expression of CD73 and CD90 was high, but not CD34 or CD45.
  • the obtained 12 monoclonal cells were identified as mesenchymal stem cells.
  • 1 ⁇ 10 5 cells were cultured in a 60-mm culture dish for 96 hours, harvested, stained with trypan blue, and the number of cells was measured with a hemocytometer to determine the cell doubling time.
  • doubling time (h) [ ⁇ (T-T0)(log2) ⁇ /(log N-log N0)]
  • T time (h)
  • N is the number of cells
  • each isolated monoclonal tonsil-derived mesenchymal stem cells were differentiated into osteoblasts (OB), chondrocytes (ChD), or adipocytes (AD), and three clones with high osteoblast differentiation ability (osteoblast prone clone, OP clone, 14, 16, 22) showed excellent osteoblast differentiation ability.
  • RNA from clonal cells was extracted and DNA contamination was confirmed using a PicoGreen dsDNA assay kit. After RNA quantification and qualitative analysis were performed, a cDNA library was prepared using the TruSeq Stranded mRNA sample prep kit. Transcript sequencing was performed using TruSeq 3000/4000 SBS kit and HiSeq 4000 sequencer.
  • the differentially expressed gene (DEG) analysis between the ND clone and the OP clone group was performed in the following manner.
  • the sequenced cDNA fragments were mapped to human genomic DNA reference using HISAT2, and transcript assembly and FPKM (fragments per kilobase of transcript per million mapped reads) values were derived using StringTie.
  • Fig. 8 shows the results of the gene set enrichment analysis of DEG based on gene ontology (GO; http://geneontology.org/). It was confirmed that genes with increased expression in the OP clone exist inside and outside the cell, and can act as a catalyst by binding to proteins and ions.
  • FIG. 9 Five genes with high gene expression volume and increased expression in OP clone insulin-like growth factor binding protein 5 (IGFBP5), fibulin 2 (FBLN2), hypoxia-inducible domain family member 1A (HIGD1A), DNA damage Volume plot of -regulated autophagy modulator 1 (DRAM1), fucosyltransferase 8 (FUT8) and three other genes with significantly increased expression, Wnt family member 16 (WNT16), dipeptidyl peptidase 4 (DPP4), and doublecortin-like kinase 1 (DCLK1). Expressed on. In addition, a list of genes with a transcript expression change of 2 times or more and a p-value of less than 0.05 is shown in Table 1.
  • the expression of WNT16 and DCLK1 reproduced the result of transcript sequencing, and in mesenchymal stem cells in which several types of progenitor cells were mixed, the expression was intermediate between the expression levels of ND clones and OP clones. It was confirmed that it was about.
  • WNT16 a biomarker according to the present invention, provided information on bone cell differentiation ability to solve the problem of heterogeneity according to undifferentiated stem cells, particularly a combination of cells of various precursor cells. That is, it may be provided as a biomarker capable of providing information on cells suitable for differentiation into bone-related cells among tonsil-derived mesenchymal stem cells. Through this, as well as induction of differentiation, a therapeutic agent based on tonsil-derived mesenchymal stem cells can be developed using differentiated osteogenic-related cells.

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Abstract

본 발명은 본 WNT16의 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 편도 유래 중간엽 줄기세포의 골분화능을 예측하기 위한 바이오마커 검출용 조성물을 제공한다. 본원 발명에 따른 바이오마커인 WNT16은 미분화된 줄기세포들, 특히 다양한 precursor cell들의 조합 세포들에 따른 heterogeneity의 문제점을 해결할 수 있도록, 줄기세포 자체의 골분화능에 관한 정보를 제공한다. 이를 통해 적합한 줄기세포의 골분화 유도를 결정할 수 있고, 골 관련 세포들을 이용하여 편도 유래 중간엽 줄기 세포 기반 치료제를 개발하는데 활용 가능하다.

Description

편도 유래 중간엽 줄기세포의 골분화능 예측을 위한 ＷＮＴ16 마커의 용도
본 발명은 WNT16의 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 편도 유래 중간엽 줄기세포의 골분화능을 예측하기 위한 바이오마커 검출용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트, 상기 WNT16 바이오마커 유전자를 이용하여 골원성 세포 또는 골아세포로 분화시킬 편도 유래 중간엽 줄기세포를 결정하는 방법에 관한 것이다.
기관 재생과 면역반응 조절 능력을 가지는 성체 줄기세포에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 그러나, 종래의 성체 줄기세포는 사용에 몇 가지 제한점이 있는데, 조직을 채취하는 과정이 침습적이고, 충분한 양을 얻기 어려우며, 대부분이 중배엽 기원의 조직이여서 외배엽과 내배엽 기원의 조직으로 분화가 용이하지 않다. 이러한 제한점을 극복하기 위하여 줄기세포의 공급원을 다양화하는 연구가 필요하다.
인간 중간엽 줄기세포(human mesenchymal stem cell)는 성체줄기세포로, 배아줄기세포에 일반적으로 문제가 되는 윤리적인 문제에서 자유로울 뿐 아니라 지방세포, 골아세포, 연골세포, 심장세포, 근육세포 및 신경세포 등 다양한 세포로의 분화가 가능하다고 보고되고 있다.
하지만, 중간엽 줄기세포는 특정 세포로의 효율적인 대량 분화 기술이 아직 확립되어 있지 않아 실제 임상, 산업적 이용에 큰 제약이 있다. 따라서 특정 단계로의 분화를 대량으로 및 효율적으로 유도 시키는 기술의 확립이 절실하며, 이를 위해서는 특정 단계로의 분화 유도 신호전달 기작을 밝히고 분화를 확인하기 위한 적절한 바이오마커들에 대한 발굴이 필요하다. 특히, 중간엽 줄기세포의 경우, 분화 환경, 계대 증가 등에 따라 그 자체의 특성이 달라질 수 있으며, 이로 인해 원하는 세포로의 분화가 잘 이루어졌는지 확인하기 어려울 때가 종종 존재한다. 따라서, 분화 후 사용될 세포들의 안정성을 확보하고 특정 세포로의 분화가 잘 이루어질 수 있는지 확인하기 위한 바이오마커들의 발굴이 줄기세포의 이용 단계부터 반드시 수반되어야 한다.
중간엽 줄기세포는 다양한 타입의 조직으로부터 유도될 수 있다. 그러나, 다양한 공급원으로부터 중간엽 줄기세포가 인비트로 증식 배양 조건에서 배양하는 방법의 차이, 줄기세포의 공여원의 차이 또는, 줄기세포의 추출 부위의 차이 등에 따라 다양성(heterogeneity)을 가질 수 있음이 알려져 있다. 이러한 문제점으로 줄기세포의 안정성 문제가 지속적으로 대두되고 있고, 동질의 특성을 가지는 줄기세포원들을 모을 수 있는 새로운 방법에 대한 연구 개발이 요구되고 있다.
한편, 골원성 세포 (Osteogenic cell)는 미분화된 골 형성과 관련된 세포로 추후 골아 세포로 발달한다. 골아세포는 새로운 뼈의 생성에 관여하며 골외막, 골내막을 포함하는 뼈의 성장 세포에 분포한다. 골아세포는 분화되지 않으며 뼈의 기본이 되는 콜라겐과 칼슘 등을 합성, 분비하면서 서로 밀착하게 되고 이를 통해 뼈 내에서 자리를 잡게된다. 그 결과, 골아세포는 골세포(Osteocyte)로 모양과 구조가 변하게 된다. 이러한, 골원성 세포 (Osteogenic cell) 또는 골아 세포의 제조에 있어서 줄기세포가 이의 공급원으로 많이 이용되고 있다. 그러나, 이러한 골원성 세포 또는 골아 세포로 분화에 적합한 줄기세포를 분류하는 방법과 관련된 연구개발이 아직까지 이루어진 바가 없다.
위와 같은 배경 하에, 본 발명자들은 줄기세포로부터 효과적으로 골원성 세포, 골아 세포 등의 골 관련 세포들을 얻기 위한 방법을 찾기 위해 노력하였다. 그 과정에서 편도 유래 줄기세포의 공여체에 따라 다양성을 가지는 세포들을 분류하고, WNT16이 편도 유래 줄기세포의 골분화능 결정에 관련성이 높은 바이오마커임을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 WNT16의 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 편도 유래 중간엽 줄기세포의 골분화능을 예측하기 위한 바이오마커 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 WNT16의 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 편도 유래 중간엽 줄기세포의 골분화능을 예측하기 위한 바이오마커 검출용 조성물을 포함하는 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 WNT16의 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 편도 유래 중간엽 줄기세포의 골분화능을 예측하기 위한 바이오마커 검출용 조성물의 수준을 확인하여 골원성 세포 또는 골아세포로 분화시킬 편도 유래 중간엽 줄기세포를 결정하는 방법을 제공하는 것이다.
본원 발명에 따른 바이오마커인 WNT16은 미분화된 줄기세포들, 특히 다양한 precursor cell들의 조합 세포들에 따른 heterogeneity의 문제점을 해결할 수 있도록, 줄기세포 자체의 골분화능에 관한 정보를 제공한다. 이를 통해 적합한 편도 유래 중간엽 줄기세포의 골분화 유도를 결정할 수 있고, 골 관련 세포들을 이용하여 줄기 세포 기반 치료제를 개발하는데 활용 가능하다.
도 1은 공여자 1 내지 4에 따른 골아세포(OB) 또는 지방세포(AD)로의 분화를 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는 골아세포로의 분화능이 높은 공여세포의 중간엽 줄기세포 표현형을 분석한 결과를 나타낸다.
도 3은 골아세포 분화능이 높은 클론 6개(osteoblast prone clone, OP clone)와 골아세포로 분화가 잘 되지 않는 클론 6개(non-differentiating clone, ND clone)를 확보하여, 이의 골아세포로의 분화능을 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 확보된 단일클론 세포들의 세포 배가 시간을 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 C14(#14), C37(#37) 중간엽 줄기세포 표현형을 유세포분석으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 각 분리된 단일 클론 편도 유래 중간엽 줄기세포를 osteoblasts(OB), chondrocytes(ChD), 또는 adipocytes(AD)로 분화 시켜 골아세포 분화능이 높은 클론(osteoblast prone clone, OP clone, 14, 16, 22)에서 우수한 골아세포 분화능을 나타내는 것을 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 전사체 발현 변화 (fold change)가 1.5배 이상이며, t-test 분석에서 0.05 미만의 p-value를 갖는 유전자 27개를 DEG로 선정하였고 heat map를 이용해 표현한 결과를 나타낸다.
도 8은 유전자 온톨로지 (GO; http://geneontology.org/)에 기반하여 DEG의 gene set enrichment 분석을 수행한 결과를 나타낸다.
도 9는 유전자 발현량에 큰 차이를 나타내는 유전자들을 volume plot을 통해 나타낸 결과이다.
도 10은 WNT16, DPP4, DCLK1, IGFBP5, FBLN2, HIGD1A에 대한 RT-PCR 결과를 나타내는 도면이다.
도 11은 미분화 상태의 편도 유래 중간엽 줄기세포에서 WNT16 발현과 골아세포로 분화를 3주간 유도한 세포를 알리자린 레드 S 염색 후 10% cetylpyridinium chloride에 용출하여 흡광도 540 nm에서 측정한 골아세포 분화 정도의 상관관계를 나타낸다.
도 12는 WNT16 발현이 높은 공여자 세포가 골아세포 분화능도 높은 것을 골아세포 분화를 통해 확인한 결과를 나타낸다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, WNT16의 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 편도 유래 중간엽 줄기세포의 골분화능을 예측하기 위한 바이오마커 검출용 조성물을 제공한다.
WNT16 (Wnt family member 16) (RefSeq (mRNA): NM_057168, NM_016087. NM_053116, RefSeq (Protein): NP_057171, NP_476509, NP_444346)은 19개로 구성되는 WNT 유전자 패밀리에 속하는 유전자이다. WNT16은 실험동물 모델에서 겉질뼈 두께(cortical bone thinkness) 및 대퇴골 강도(femur strength)를 유지하는 분자로 규명된 바 있다.
본 발명에서 용어, "중간엽 줄기세포"는 미분화 상태에서 무한 증식능력(self-renewal capacity)과 더불어 특정한 분화유도자극에 의해 다양한 조직의 세포로 분화될 수 있는 능력(multi-differentiation potency)을 가진 세포를 말한다. 본 발명의 중간엽 줄기세포는 분화능 및 증식능을 갖는 모든 세포일 수 있으며, 인간(human), 원숭이(monkeys), 돼지(pigs), 말(horses), 소(cows), 양(sheeps), 개(dogs), 고양이(cats), 생쥐(mice), 토끼(rabbits) 등의 모든 동물로부터 유래할 수 있으며, 바람직하게는 인간 유래이며, 더욱 바람직하게는 인간의 편도, 지방조직, 골수, 말초혈액, 또는 제대혈 등에서 분리된 것일 수 있으며, 가장 바람직하게 인간의 편도로부터 분리되거나 유래된 것일 수 있다.
중간엽 줄기세포는 그 추출 부위에 따라 여러가지 precursor cell들로 조합되어 세포 구성상 다양성(heterogeneity)를 가질 수 있다. 이러한 세포의 다양성은 비임상 및 임상 시험 등에서 variation을 가져올 수 있기 때문에, 동질의 특성을 가지는 중간엽 줄기세포를 분류할 필요성이 있다. 본 발명에 있어서 조성물은 위와 같은 동질의 특성으로 골분화능이 우수한 줄기세포들을 분류하여 줄기세포로부터 골 관련 세포로의 분화에 이용할 수 있게 한다. 또한 본 발명에 있어서 동일한 추출 부위에서 추출된 중간엽 줄기세포라도 이를 제공하는 공여체에 따라 특성이 상이할 수 있는 바, 동일한 원천조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포 중에서 우수한 중간엽 줄기세포를 분류하여 골 관련 세포로의 분화에 이용할 수 있게 한다.
본 발명에서 용어 "편도"란, 목의 안쪽과 코의 뒷부분에 위치하여, 외부에서 침입하는 세균 등의 물질로부터 일차적으로 우리 몸을 방어함과 동시에 림프상피 면역조직으로 작용을 수행하는 조직을 의미한다. 상기 편도는 인두편도, 귀인두관편도, 구개편도, 혀편도 등을 포함한다. 본 발명에 있어서 상기 편도는 편도 유래 중간엽 줄기세포를 제공하는 원천조직으로 사용된다. 본 발명의 용어 "편도 유래 중간엽 줄기세포"는 편도에서 유래한 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells; MSCs)를 의미한다.
본 발명의 용어 "골원성 세포(Osteogenic cell)"란, 미분화된 골 형성과 관련된 세포로 추후 골아 세포로 발달하는 세포를 말한다.
본 발명의 용어 "골아 세포(Osteoblast)"란, 골기질을 합성, 분비하고, 기질에 Ca, Mg이온 등의 무기염을 침착시킴으로써 골조직을 석회화시키는 능력을 갖고 있는 세포로 조골 세포라고도 불리운다.
본 발명에서 "골분화능을 예측하기 위한 바이오마커"는 골원성 세포 뿐만 아니라 조골세포, 골아세포, 골세포(Osteocyte) 등의 골관련 세포로의 분화에 적합한 세포인지 여부에 관한 정보를 제공하는 바이오마커이다. 구체적으로, 골 관련 세포로 분화를 목적하는 중간엽 줄기세포에서 그 발현여부에 유의한 차이를 보이는 바이오마커이다. 본 발명의 목적상 유전자의 발현 수준이 높아 골관련 세포로의 분화능이 높은 줄기세포인지, 또는 유전자의 발현 수준이 낮아 골관련 세포로의 분화능이 낮은 줄기세포인지 여부를 탐지할 수 있는 바이오마커를 의미한다.
편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 골관련 세포(예컨대, 골원성 세포 및/또는 골아 세포)로의 분화는 통상의 알려진 중간엽 줄기세포로부터 골관련 세포로의 분화방법을 모두 포함할 수 있다.
예컨대, 덱사메타손(dexamethasone), 글리세롤 2-포스페이트 (β-glycerophosphate), 및 아스코브산(ascorbic acid)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 통상의 배지에서 배양될 수 있다. 보다 바람직하게, 덱사메타손(dexamethasone), 글리세롤 2-포스페이트 (β-glycerophosphate) 및 아스코브산(ascorbic acid)을 포함하는 통상의 배지에서 배양될 수 있다.
줄기세포의 배양에 통상적으로 이용되는 모든 배지를 포함하고, 예를 들어 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), α-MEM, BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, MEM(Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)등과 같은 기본 배지일 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
또한 상업적으로 판매되는 골관련 세포(예컨대, 골원성 세포 및/또는 골아 세포)로의 분화배지 조성물을 이용할 수도 있다. 본 발명의 일 실시 양태에 따르면, StemPro osteogenesis differentiation kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)를 3주간 사용하여 골분화를 수행하였다. 따라서, 본 발명에서는 위와 같은 상업적으로 판매하는 키트에 제공되는 제조사의 지침서에 따른 골원성 및/또는 골아세포로의 분화 방법을 포함한다.
본 발명의 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 골 관련 세포로의 분화 방법은 예컨대, 항셍제, 혈청 성분, 덱사메타손(dexamethasone), 글리세롤 2-포스페이트 (β-glycerophosphate) 및 아스코브산을 포함하는 배지에서 배양하여 골분화를 유도하는 것일 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 일 실시 양태에 따르면, 10% FBS, 100 IU/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신, 50 μM ascorbate-2-phosphate, 10 mM β-glycerophosphate 및 0.1 μM 덱사메타손을 함유하는 α-MEM 배지에서 골형성 유도를 수행할 수 있다.
편도 유래 중간엽 줄기세포의 배양 기간은 바람직하게는 4일 이상이며, 보다 바람직하게는 7일 이상이며, 보다 더 바람직하게 7 내지 30일 이내의 배양 기간을 가질 수 있다.
바람직하게 상기 편도 유래 중간엽 줄기세포는, 편도선 절제 수술을 받은 환자에서 분리한 편도선 조직으로부터 채취하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 환자에서 분리한 편도선 조직으로부터 채취할 경우, 채취한 편도조직을 완충액으로 세척한 후, 효소혼합액을 처리하여 결합조직을 분해하고, 이때 부유된 조직을 원심분리하고, 잘라진 조직 내의 세포 혼합액을 Ficoll을 이용한 세포분획법과 원심분리법으로 하층의 침전된 부분만을 배양하고, 세포바닥에의 부착능을 보이는 세포부분만을 분리한 후, 배양접시 바닥에의 부착능을 보이는 세포 중 세포표면 표지자를 이용한 면역화학방법을 이용하여 편도 유래 중간엽 줄기세포를 분리할 수 있다.
바람직하게는, 4일 내지 25일 동안 편도줄기세포를, 10% FBS, 100 IU/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신, 50 μM ascorbate-2-phosphate, 10 mM β-glycerophosphate 및 0.1 μM 덱사메타손를 포함하는 배지에서 배양함으로써 골 관련 세포로의 분화를 유도할 수 있으며, 배양 기간이 4일을 초과할 경우, 4-5일 마다 신선한 배지로 배지를 교체하여 줄 수 있다.
상기 줄기세포 배지는 첨가제로 보충될 수 있다. 일반적으로, 등장액 중의 중성 완충제(예컨대 인산염 및/또는 고농도 중탄산염) 및 단백질 영양분(예를 들면 혈청, 예컨대 FBS, 혈청 대체물, 알부민, 또는 필수 아미노산 및 비필수 아미노산, 예컨대 글루타민)을 함유할 수 있다. 나아가, 지질(지방산, 콜레스테롤, 혈청의 HDL 또는 LDL 추출물) 및 이 종류의 대부분의 보존액 배지에서 발견되는 기타 성분(예컨대 인슐린 또는 트랜스페린, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드, 피루빈산염, 임의의 이온화 형태 또는 염인 당원, 예컨대 글루코스, 셀레늄, 글루코코르티코이드, 예컨대 히드로코르티존 및/또는 환원제, 예컨대 β-메르캅토에탄올)을 함유할 수 있다.
본 발명의 일 실시 양태에 따르면, WNT16이 높게 발현하는 편도 유래 중간엽 줄기세포를 골 관련 세포 분화 배양 배지에서 배양하는 경우, 골 관련 세포로의 분화가 잘 일어난다. 반면, WNT16이 낮게 발현하는 편도 유래 중간엽 줄기세포를 골 관련 세포 분화 배양 배지에서 배양하는 경우, 골 관련 세포로의 분화가 잘 일어나지 않는다. 이러한 정보를 통하여, 본 발명에 따른 조성물을 이용하여 골아, 골원성 세포로의 분화에 적합한 편도 유래 중간엽 줄기세포를 분류할 수 있다.
따라서, 본원 발명에서는 위 WNT16을 이용하여 편도 유래 중간엽 줄기세포의 골분화능을 측정함으로써 골분화에 적합한 편도 유래 줄기세포원을 선정할 수 있도록 정보를 제공할 수 있다.
본 발명의 기술분야에서 상기 바이오마커의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 프라이머 또는 프로브이나, 이로 제한되지 않는다.
프라이머는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다.
프로브는 mRNA와 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있으며 라벨링 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있는 RNA 또는 DNA 등의 자연 또는 변형된 핵산 단편을 의미한다. 혼성화에 사용되는 프로브는 올리고뉴클로타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 혼성화에 적합한 조건은 온도, 이온세기(완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 다르게 결정될 수 있다.
통상의 기술자는, 공지된 본 발명의 바이오마커 유전자 핵산 서열로부터 상기 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 쌍 또는 상기 유전자의 특정 영역을 특이적으로 인지하는 프로브를 디자인할 수 있고, 이 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 또한, 검출 가능한 시그널을 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있도록 방사성 동위원소, 형광성 분자, 바이오틴 등의 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다.
본 발명 일 실시 양태에 있어서, 상기 프라이머 쌍은 바이오마커에 대하여 서열번호 1 및 2일 수 있다.
본 기술분야에서 바이오마커 단백질 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 항체로, WNT16에 대하여 각각 특이적으로 결합하는 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 또한, 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태 및 항체 분자의 기능적인 단편, 예를 들어, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv의 형태도 포함한다.
WNT16에 특이적인 각각의 항체는 기존의 항체뿐만 아니라 공지된 방법으로 제조될 수 있는 항체를 모두 포함한다.
이를 이용하여, 면역분석(immunoassay, 예컨대, 방사능 면역분석 방법, 방사능 면역-침전 방법, 효소-결합 면역흡착 방법 (ELISA), 도트 블롯 분석, 웨스턴 블롯, 억제 또는 경쟁 분석 및 샌드위치 분석)를 통하여 정량적으로 또는 정성적으로 실시될 수 있다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, WNT16의 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 편도 유래 중간엽 줄기세포의 골분화능을 예측하기 위한 바이오마커 검출용 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.
상기 키트에는 줄기세포로부터 골분화에 있어서 WNT16의 발현 증가 또는 감소에 관한 바이오마커 유전자 또는 이들의 단백질을 선택적으로 인지할 수 있는 프라이머 또는 항체뿐만 아니라 면역학적 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함된다. 이러한 도구나 시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함하나 이로 제한되지 않는다. 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.
키트는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR) 디바이스, 실시간 중합효소연쇄반응(Real time PCR) 디바이스, ELISA 플레이트, 딥-스틱 디바이스, 면역크로마토그래피 시험 스트립 및 방사 분할 면역검정 디바이스, 및 플로우-쓰로우(flow-through) 디바이스 등의 형태를 가질 수 있으며, 바람직하게는 마이크로어레이로 구성되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 항체가 다수의 단백질이 고정될 수 있는 단백질 칩에 제공되는 경우에는, 2개 이상의 항체에 대한 항원-항체 복합체 형성을 관측할 수 있다.
또한, 상기 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 설명서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다.
또한, 설명서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, WNT16의 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 편도 유래 중간엽 줄기세포의 골분화능을 예측하기 위한 바이오마커 검출용 조성물의 수준을 확인하여 골원성 세포 또는 골아세포로 분화시킬 편도 유래 중간엽 줄기세포를 결정하는 방법을 제공한다.
mRNA 또는 단백질의 수준을 확인하여 골원성 세포 또는 골아세포로 분화시킬 편도 유래 중간엽 줄기세포를 결정하는 방법은 특정 유전자의 발현 정도를 측정하는 공지의 방법들을 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR) 또는 실시간 중합효소연쇄반응(Real time PCR)을 이용하여 유전자 수준의 발현 정도를 측정하거나, 웨스턴 블럿팅 방법을 이용하여 단백질 수준의 발현 정도를 측정할 수 있다.
구체적 양태로서, 골원성 세포 또는 골아세포로 분화시킬 편도 유래 중간엽 줄기세포를 결정하는 방법은, (a) 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 핵산 시료를 얻는 단계; (b) 상기 핵산 시료 중, WNT16의 유전자의 발현량을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)의 WNT16의 발현량이 기준치와 대비하여 증가할 때 골원성 세포 또는 골아세포로 분화시킬 편도 유래 중간엽 줄기세포로 판정하는 단계;를 포함할 수 있다. 이러한 방법은 시험관 내에서 이루어질 수 있다.
구체적으로, 상기 단계 (b)에서 유전자 발현량 측정은 상기 바이오마커 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하여 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 얻은 핵산 시료와 반응시켜 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR) 또는 실시간 중합효소연쇄반응(Real time PCR)을 수행하고, 전기영동하여 바이오마커 유전자들의 mRNA 발현량을 측정함으로써 유전자 발현 정도에 따라 골분화능 정도를 탐지할 수 있게 한다. 본 발명의 구체적 실시예에서는 본 발명의 바이오마커 유전자의 발현 수준을 확인하기 위하여, 중합효소연쇄반응(PCR), 실시간 중합효소연쇄반응 (Real timePCR)을 수행하였으며, 그 결과 본 발명의 바이오마커 유전자는 편도 유래 중간엽 줄기세포의 종류(즉, 상이한 공여체 또는 공여자로부터 수득된 편도 유래 중간엽 줄기세포)에 따라 상이하게 증가하거나 감소하는 WNT16의 발현량을 나타내고, 그 결과를 기초로 하여 골분화에 적합한 편도 유래 중간엽 줄기세포인지 여부에 관한 정보를 제공한다.
여기서 기준치 또는 기준 수준이라 함은 통상의 줄기세포들에서 발현되는 WNT16의 발현 수준일 수 있다. 또는 골관련 세포로의 분화 수준이 낮은 편도 유래 줄기세포들에서 측정된 WNT16의 발현 수준일 수 있다. 이러한 기준치 또는 기준 수준은 골관련 세포로의 분화에서의 분화 목적에 따라 조금씩 상이해 질 수 있으나, 골원성 세포 또는 골아세포로 분화에 적합한 세포로 분류하기 위한 적절한 기준이 되는 수준을 명확히 제공한다.
본 발명은 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 골원성 세포 또는 골아세포를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에서, 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 골원성 세포 또는 골아세포를 제조하는 방법은 (a) 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 시료를 얻는 단계; (b) 상기 시료 중, WNT16의 유전자 또는 단백질의 발현량을 측정하는 단계; (c) 골원성 세포 또는 골아세포로 분화시킬 편도 유래 중간엽 줄기세포를 선정하는 단계; (d) 선정된 중간엽 줄기세포를 덱사메타손(dexamethasone), 글리세롤 2-포스페이트 (β-glycerophosphate) 및 아스코브산(ascorbic acid)를 포함하는 배지에서 배양하는 단계;를 포함한다.
상기 배양하는 단계는 상기 골관련 세포로의 분화방법의 내용이 적용될 수 있다.
본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 제시한다. 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 단일 클론 편도 유래 중간엽 줄기세포의 수립
편도 유래 중간엽 줄기세포(Tonsil-derived mesenchymal stem cell, T-MSC) 는 이대목동병원 이비인후-두경부외과에서 편도적출술을 시행하는 환자로부터 적출된 편도조직 (임상윤리위원회 심의 통과: EUMC2018-01-011-002)으로부터 얻어 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 low-glucose DMEM 하에 배양되었다.
골아세포 또는 지방세포로의 분화는 StemPro osteogenesis 또는 StemPro adipogenesis 분화 배양배지(Thermo Fisher Scientific) 에 3주간 배양으로 유도되었고, 골아세포에서의 matrix mineralization은 알리자린 레드 S 염색, 지방세포에서의 지방구 축적은 오일 레드 O 염색법으로 확인되었다.
네 명의 공여자로부터 유래한 편도줄기세포의 골아세포 및 지방세포로의 분화를 확인한 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 각 세포들마다 분화 정도가 다른 것을 알 수 있었다.
이 중 골아세포 분화능은 높으면서 지방세포 분화능은 낮은 공여 세포를 선택(donor #2)하여 중간엽 줄기세포 표현형을 유세포분석으로 확인하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, CD73 및 CD90의 발현이 높았으나, CD34 또는 CD45는 그렇지 않음을 확인하였다.
그리고 나서, 한계 희석(limiting dilution) 방법으로 단일 세포 클로닝(singe cell cloning)을 실시하였다. 세포를 96-well plate에 well 당 한 개의 세포가 배양되도록 희석하여 배양한 후 2-3주 후 확인하여 클론확장된 세포를 24-well plate에 계대배양하였고, 4-8일 후 100-mm 배양접시에 한 차례 더 계대배양 후 1주일 동안 증식시켜 단일클론 세포(monoclonal T-MSC subpopulation)를 수립하였다. 이러한 한계 희석 방법을 두 차례 반복하여 62개의 단일클론 세포를 확보하였고, 골아세포로 분화를 측정하여 골아세포 분화능이 높은 클론 6개(osteoblast prone clone, OP clone)와 골아세포로 분화가 잘 되지 않는 클론 6개(non-differentiating clone, ND clone)를 확보하였다. 이러한 확보된 세포를 이용하여 분화를 수행한 결과는 도 3에 나타내었다.
확보한 12개 단일클론 세포의 중간엽 줄기세포로서의 특성을 확인하였다. 첫 번째로 자기 재생능 확인하기 위하여 1 × 10 5개 세포를 60-mm 배양 접시에 96시간 배양 후 수확하여 트리판블루 염색하여 혈구계(hemocytometer)로 세포 수를 측정하여 세포 배가 시간(doubling time)을 Patterson formula (배가시간 (h) = [{(T - T0)(log2)}/(log N - log N0)], T는 시간 (h), N은 세포수)로 계산하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에서 확인할 수 있는바와 같이, 분리된 세포의 분화능에 일부 차이가 있었는데, 이는 동결 보존 및 해동에 의한 영향이 있는 것으로 예상되었다.
그리고 나서, 모든 샘플에 대하여 줄기세포로의 특성이 유지되고 있는지를 확인하기 위하여 유세포 분석을 수행하였고, 대표적인 샘플로 C14(#14), C37(#37) 중간엽 줄기세포 표현형을 도 5에 나타내었다. 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, C37(#37)와 같은 일부 단일 클론에서 중간엽 줄기세포의 마커인 CD90의 일부 발현이 감소되는 것을 확인하였다. 그러나, C14(#14) 등의 샘플에서는 줄기세포능이 잘 유지되고 있음을 확인하였다.
다음으로, 골아세포, 지방세포, 연골세포로 분화를 확인하여 그 결과를 도 6에 나타내었다. 대표적으로 3개의 ND 클론 세포(2, 17 및 36)와 3개의 OP 클론 세포(14, 16 및 22)에 대하여 실험을 수행한 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 각 분리된 단일 클론 편도 유래 중간엽 줄기세포는 osteoblasts(OB), chondrocytes(ChD), 또는 adipocytes(AD)로 분화가 이루어졌고, 골아세포 분화능이 높은 클론 3개(osteoblast prone clone, OP clone, 14, 16, 22)에서 우수한 골아세포 분화능을 확인할 수 있었다.
다음으로, 단일클론 세포 중 배가시간이 100시간 이상이거나 CD90의 발현이 감소한 단일클론 세포는 제외한 후, 3개의 ND 클론 세포(2, 17 및 36)와 3개의 OP 클론 세포(14, 16 및 22)를 선택하여 전사체 염기서열 분석을 수행하였다.
<실시예 2> 전사체 염기서열 분석 (Transcriptome sequencing)
전사체 염기서열 분석을 위하여 클론 세포의 RNA를 추출하여 PicoGreen dsDNA assay kit를 이용해 DNA 오염을 확인하였고, RNA 정량 및 정성 분석을 수행한 후 TruSeq Stranded mRNA sample prep kit를 사용하여 cDNA library를 제작하였다. TruSeq 3000/4000 SBS kit와 HiSeq 4000 sequencer를 이용하여 전사체 염기서열 분석을 수행하였다.
ND 클론과 OP 클론 그룹 간 차별발현유전자 (differentially expressed gene, DEG) 분석은 다음과 같은 방법으로 수행되었다. 염기서열이 분석된 cDNA 조각들은 인간 genomic DNA reference에 HISAT2를 이용해 맵핑되었고, StringTie를 이용해 전사체 어셈블리 및 FPKM (fragments per kilobase of transcript per million mapped reads) 값이 도출되었다. DEG 분석은 FPKM 값 0을 갖는 유전자(27,685개 중 7,985개)를 제외한 후, log 2 (FPKM+1) 값을 계산하여 preprocessCore R library를 이용한 quantile normalization을 수행하였고, 전사체 발현 변화 (fold change)가 1.5배 이상이며, t-test 분석에서 0.05 미만의 p-value를 갖는 유전자 27개를 DEG로 선정하였고 heat map를 이용해 표현하여, 그 결과를 도 7에 나타내었다. 그 결과 골아세포 분화능이 높은 클론과 골아세포로 분화가 잘 되지 않는 클론은 매우 다른 히트맵양상을 나타내었다.
DEG의 gene set enrichment 분석을 유전자 온톨로지 (GO; http://geneontology.org/)에 기반하여 수행한 결과를 도 8에 나타내었다. OP 클론에서 발현이 증가한 유전자 들은 세포 내외에 존재하며, 단백질 및 이온과 결합하여 촉매 작용을 할 수 있음을 확인할 수 있었다.
위 내용들을 기초로 하여, volume plot을 도 9에 기재하였다. 유전자 발현 양(expression volume)이 많으면서 OP 클론에서 발현이 증가한 5개 유전자 insulin-like growth factor binding protein 5 (IGFBP5), fibulin 2 (FBLN2), hypoxia-inducible domain family member 1A (HIGD1A), DNA damage-regulated autophagy modulator 1 (DRAM1), fucosyltransferase 8 (FUT8)와 이 외에도 발현이 크게 증가한 3개의 유전자 Wnt family member 16 (WNT16), dipeptidyl peptidase 4 (DPP4), doublecortin-like kinase 1 (DCLK1)를 volume plot 상에 표현하였다. 또한 전사체 발현 변화가 2배 이상이며, p-value 0.05 미만인 유전자의 리스트를 표 1에 나타내었다.
[표 1] ND 클론과 비교하여 OP 클론에서 상향 또는 하향조절되는 transcripts
Figure PCTKR2020007150-appb-img-000001
<실시예 3> 편도 중간엽 줄기세포의 OP 클론 마커 발현
발현이 증가한 6개 유전자(WNT16, DPP4, DCLK1, IGFBP5, FBLN2, HIGD1A)의 골아세포 분화 예측 마커로 이용 가능성을 검증하고자 하였다. 전사체 염기서열 분석을 통해 도출된 6개 유전자의 발현을 ND 클론, OP 클론 및 공여자가 다른 편도 유래 중간엽 줄기세포에서 real-time PCR을 통하여 확인하였고, real-time PCR 위해 사용한 서열은 표 2에 나타내었다.
[표 2] real-time PCR에 사용된 프라이머 서열
Figure PCTKR2020007150-appb-img-000002
위 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에서 확인할 수 있는 바와 같이, WNT16과 DCLK1 발현이 전사체 염기서열 분석 결과를 재현하였고, 여러 종류의 전구세포가 혼합되어있는 중간엽줄기세포에서는 그 발현이 ND 클론과 OP 클론 발현 수준의 중간 정도인 것이 확인되었다.
다음으로 편도 유래 중간엽 줄기세포에서 WNT16 발현과 골아세포 분화능의 상관관계를 확인하고자 하였다. 미분화 상태의 편도 유래 중간엽 줄기세포에서 WNT16 발현과 골아세포로 분화를 3주간 유도한 세포를 알리자린 레드 S 염색 후 10% cetylpyridinium chloride에 용출하여 흡광도 540 nm에서 측정한 골아세포 분화 정도의 상관관계를 그래프로 나타내어 그 결과를 도 11에 나타내었고, 그 결과 WNT16 발현이 골아세포 분화와 양의 상관관계가 있음이 확인되었다. 또한, WNT16 발현이 높은 공여자 세포가 골아세포 분화능도 높은 것을 도 12를 통해 확인할 수 있었다.
위 결과들로부터 본원 발명에 따른 바이오마커인 WNT16은 미분화된 줄기세포들, 특히 다양한 precursor cell들의 조합 세포들에 따른 heterogeneity의 문제점을 해결할 수 있도록, 골세포 분화능에 관한 정보를 제공하였다. 즉, 편도 유래 중간엽 줄기세포 중 골 관련 세포로의 분화에 적합한 세포에 대한 정보를 제공할 수 있는 바이오마커로 제공될 수 있다. 이를 통해 분화의 유도 뿐만 아니라 분화된 골형성 관련 세포들을 이용하여 편도 유래 중간엽 줄기 세포 기반 치료제를 개발할 수 있다.
본 명세서는 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 내용은 그 상세한 기재를 생략하였으며, 본 명세서에 기재된 구체적인 예시들 이외에 본 발명의 기술적 사상이나 필수적 구성을 변경하지 않는 범위 내에서 보다 다양한 변형이 가능하다. 따라서 본 발명은 본 명세서에서 구체적으로 설명하고 예시한 것과 다른 방식으로도 실시될 수 있으며, 이는 본 발명의 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자이면 이해할 수 있는 사항이다.

Claims (15)

  1. WNT16의 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 편도 유래 중간엽 줄기세포의 골분화능을 예측하기 위한 바이오마커 검출용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, mRNA 수준을 측정하는 제제가 상기 유전자의 mRNA에 특이적인 프라이머 쌍 또는 프로브인 검출용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 편도 유래 중간엽 줄기세포는 인간 유래인 것을 특징으로 하는 검출용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, WNT16의 발현량이 높을 때 편도 유래 중간엽 줄기세포의 골분화능이 높은 것인 검출용 조성물.
  5. 제1항에 있어서, mRNA 수준을 측정하는 제제는 서열번호 1 및 2의 프라이머 서열 쌍을 포함하는 것인 검출용 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 WNT16의 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 편도 유래 중간엽 줄기세포의 골분화능을 예측하기 위한 바이오마커 검출용 조성물을 포함하는 키트.
  7. 제6항에 있어서, 상기 키트는 바이오마커 유전자 또는 이들의 단백질을 선택적으로 인지할 수 있는 프라이머 또는 항체를 포함하는 것인 키트.
  8. 제6항에 있어서, 상기 키트는 마이크로어레이인 키트.
  9. WNT16의 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 편도 유래 중간엽 줄기세포의 골분화능을 예측하기 위한 바이오마커 검출용 조성물의 수준을 확인하여 골원성 세포 또는 골아세포로 분화시킬 편도 유래 중간엽 줄기세포를 결정하는 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    (a) 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 핵산 시료를 얻는 단계;
    (b) 상기 핵산 시료 중, WNT16의 유전자의 발현량을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)의 WNT16의 발현량이 기준치와 대비하여 증가할 때 골원성 세포 또는 골아세포로 분화시킬 편도 유래 중간엽 줄기세포로 판정하는 단계를 포함하는, 골원성 세포 또는 골아세포로 분화시킬 편도 유래 중간엽 줄기세포를 결정하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 단계 (b)에서 유전자 발현량 측정은 상기 바이오마커 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하여 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 얻은 핵산 시료와 반응시켜 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR) 또는 실시간 중합효소연쇄반응(Real time PCR)을 수행하는 것인, 골원성 세포 또는 골아세포로 분화시킬 편도 유래 중간엽 줄기세포를 결정하는 방법.
  12. (a) 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 시료를 얻는 단계; (b) 상기 시료 중, WNT16의 유전자 또는 단백질의 발현량을 측정하는 단계; (c) 골원성 세포 또는 골아세포로 분화시킬 편도 유래 중간엽 줄기세포를 선정하는 단계; (d) 선정된 중간엽 줄기세포를 덱사메타손(dexamethasone), 글리세롤 2-포스페이트 (β-glycerophosphate) 및 아스코브산(ascorbic acid)를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 골원성 세포 또는 골아세포를 제조하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 단계 (b)에서 유전자 발현량의 측정은 상기 바이오마커 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하여 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 얻은 핵산 시료와 반응시켜 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR) 또는 실시간 중합효소연쇄반응(Real time PCR)을 수행하는 것인, 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 골원성 세포 또는 골아세포를 제조하는 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 단계 (b)에서 유전자 발현의 측정은 mRNA의 발현 측정이며, mRNA 수준을 측정하는 제제는 서열번호 1 및 2의 프라이머 서열 쌍을 포함하는 것인, 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 골원성 세포 또는 골아세포를 제조하는 방법.
  15. 제12항에 있어서, 상기 단계 (c)에서 골원성 세포 또는 골아세포로 분화시킬 편도 유래 중간엽 줄기세포의 선정은 WNT16의 발현량이 기준치와 대비하여 증가한 시료를 선정하는 것인, 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 골원성 세포 또는 골아세포를 제조하는 방법.
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