WO2010131315A1 - 誘導性間葉系幹細胞およびその作製方法 - Google Patents

誘導性間葉系幹細胞およびその作製方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2010131315A1
WO2010131315A1 PCT/JP2009/007260 JP2009007260W WO2010131315A1 WO 2010131315 A1 WO2010131315 A1 WO 2010131315A1 JP 2009007260 W JP2009007260 W JP 2009007260W WO 2010131315 A1 WO2010131315 A1 WO 2010131315A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
mesenchymal stem
cells
stem cells
gene
cell
Prior art date
Application number
PCT/JP2009/007260
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
加藤幸夫
河本健
西村正宏
辻紘一郎
Original Assignee
国立大学法人広島大学
株式会社ツーセル
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人広島大学, 株式会社ツーセル filed Critical 国立大学法人広島大学
Publication of WO2010131315A1 publication Critical patent/WO2010131315A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Definitions

  • the present invention relates to inducible mesenchymal stem cells derived from human cells and a method for producing the same.
  • a mesenchymal stem cell (hereinafter referred to as “MSC” where appropriate) is one of somatic stem cells that exist in tissues such as the bone marrow of a mammal, and has multipotency to differentiate into adipocytes, chondrocytes, and bone cells. And stem cells having self-proliferating ability. MSC has attracted attention as a transplant material for regenerative medicine for many tissues because of its pluripotency. That is, “regenerative medicine by cell transplantation” that uses MSC to regenerate a tissue that has not been regenerated by a conventional treatment method and restores the function due to a disease or disorder.
  • transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells to patients with lower limb ischemia (Burger's disease)
  • transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells to the affected area of periodontal disease transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells to patients with osteoarthritis
  • therapies such as transplantation, cerebral infarction, transplantation of mesenchymal stem cells to myocardial infarction have been started or planned.
  • stem cells are collected from a living tissue, proliferated without being differentiated, and further induced to differentiate the proliferated undifferentiated stem cells into desired cells. It is necessary to prepare tissue for regenerative treatment.
  • Patent Document 1 a method for separating and collecting MSCs from oral tissues in order to perform separation and collection that is safe and easy to collect when collecting MSCs.
  • Patent Document 2 it was found that MSC can be proliferated extremely rapidly and its differentiation ability can be maintained by culturing MSC in the presence of a basement membrane extracellular matrix or in a medium containing fibroblast growth factor (FGF) or the like.
  • FGF fibroblast growth factor
  • the present inventors have developed a method for identifying mesenchymal stem cells from the cultured cells and separating the mesenchymal stem cells in order to put regenerative medicine using mesenchymal stem cells into practical use. More specifically, the present inventors used mesenchymal stem cells and fibroblasts that are morphologically similar and difficult to distinguish from each other as a genetic marker for detecting mesenchymal stem cells and / or mesenchyme. A method of effectively identifying and separating using a protein marker for detecting stem cell was developed (see Patent Document 3).
  • the present inventors also used molecular markers to accurately distinguish undifferentiated mesenchymal stem cells from other connective tissue cells such as fibroblasts, osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. And developed a method for isolating undifferentiated mesenchymal stem cells (see Patent Document 4).
  • Japanese Patent Publication “Japanese Patent Laid-Open No. 2003-52365 (Publication Date: February 25, 2003)” Japanese Patent Publication “Japanese Patent Laid-Open No. 2003-52360 (Publication Date: February 25, 2003)” Japanese Patent Publication “Japanese Patent Laid-Open No. 2008-092919 (Date of Publication: April 24, 2008)” International publication "WO 2006/106823 pamphlet (International publication date: October 12, 2006)"
  • Native MSCs derived from bone marrow, fat or synovium are new treatments for incurable diseases (such as osteochondral disease, myocardial infarction, cerebral infarction, periodontal disease, etc.) affecting many people (about 30 million people) Can provide a law. Differentiation of MSC into bone, cartilage or fat is relatively easy, but the efficiency of differentiation into myocardium, liver, nerve, etc. is low. In addition, individual MSCs have large individual differences, and the number of MSCs significantly decreases with age. Thus, there is a limit to using native MSC as a starting material when preparing the number of cells necessary for regenerative medicine from MSC that is difficult to culture. Furthermore, it is difficult to separate bone marrow or adipose tissue from critically ill patients suffering from hepatitis, heart disease and the like.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and its purpose is to provide cells having the same self-renewal ability and differentiation ability as mesenchymal stem cells without using human embryos or ES cells. It is to provide a technique for manufacturing.
  • ES cell embryonic stem cell
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • the present inventors have identified a number of genes characteristic of human MSC using DNA microarray and real-time PCR analysis, and among them, nine genes have the ability of self-replication and differentiation of MSC. It was found that it is important for maintenance, and the present invention has been completed.
  • the present invention provides a method for producing inducible mesenchymal stem cells.
  • the production method according to the present invention includes a step of introducing at least one of the genes listed in Table 2 into cells, and the step of culturing using a mesenchymal stem cell selective serum-free medium is provided. Further inclusion is preferred.
  • the genes listed in Table 2 are highly expressed in MSC, and the use of siRNA against the genes listed in Table 2 suppresses the self-replication ability and differentiation ability of MSC.
  • inducible mesenchymal stem cells can be prepared by introducing the genes listed in Table 2 into the cells.
  • genes listed in Table 2 those skilled in the art can obtain gene sequences necessary for the present invention by referring to the accession numbers listed in Table 2.
  • Table 2 shows only human genes, but corresponding animal genes may be used.
  • the present invention also provides a kit for producing inducible mesenchymal stem cells.
  • the kit according to the present invention includes (a) a polynucleotide having the base sequence shown in any one of the accession numbers listed in Table 2 or a complementary sequence thereof; (b) a polynucleotide which is a fragment of (a) above And (c) one or more polynucleotides selected from the group consisting of the polynucleotide (a) or (b), which hybridizes under stringent conditions, Yes.
  • the present invention provides a further method of producing inducible mesenchymal stem cells.
  • the production method according to the present invention includes a step of culturing cells for a long time under dedifferentiation conditions, and a step of further culturing the cultured cells on an artificial matrix using a mesenchymal stem cell selective serum-free medium. It is characterized by including.
  • the above-described method for producing inducible mesenchymal stem cells preferably further includes a step of adding a factor suitable for inducing inductive mesenchymal stem cells to the medium. Even if the said factor is a factor of Table 5, the factor which induces the cell to the mesenchymal stem cell like cell obtained by the screening method mentioned later may be sufficient.
  • the present invention provides a method for detecting inducible mesenchymal stem cells.
  • the method according to the present invention includes a step of detecting the expression of at least one of the genes listed in Table 2 in a target cell.
  • genes listed in Table 2 are transcription factor genes whose expression is enhanced in MSC. Therefore, the above gene can be used as a detection marker for inducible mesenchymal stem cells. Moreover, the said gene or its fragment can be utilized for the probe and microarray for detecting an inductive mesenchymal stem cell.
  • the present invention provides a kit for detecting inducible mesenchymal stem cells.
  • the kit according to the present invention comprises one or more polynucleotides selected from the group consisting of the following (a) to (c): (a) the accession numbers listed in Table 2 (B) a polynucleotide that is a fragment of (a); and (c) a polynucleotide and a string of (a) or (b) above; A polynucleotide that hybridizes under mild conditions.
  • the present invention also provides a microarray for detecting inducible mesenchymal stem cells.
  • the microarray according to the present invention is characterized in that one or more polynucleotides selected from the group consisting of the following (a) to (c) are immobilized: (a) the accession described in Table 2 (B) a polynucleotide that is a fragment of (a); and (c) a polynucleotide of (a) or (b) above; And a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions.
  • the present invention provides a further kit for detecting inducible mesenchymal stem cells.
  • the kit according to the present invention is characterized by comprising an antibody that specifically binds to a polypeptide encoded by a gene listed in Table 2.
  • the genes listed in Table 2 are enhanced in MSC. Therefore, an antibody against the protein (polypeptide) encoded by the gene can successfully detect inducible mesenchymal stem cells.
  • the present invention provides a method of screening for a factor that induces cells into inducible mesenchymal stem cells.
  • the screening method according to the present invention includes a step of detecting the expression of at least one of the genes listed in Table 2 in cells cultured in the presence of a candidate substance.
  • the genes listed in Table 2 are enhanced in MSC. Therefore, the gene can be an index for knowing whether or not cells cultured in the presence of a candidate substance are induced by inducible mesenchymal stem cells.
  • the present invention provides a method of screening for a factor that controls the self-renewal ability of mesenchymal stem cells.
  • the screening method according to the present invention includes a step of detecting the expression of at least one of the genes listed in Table 2 in a target cell cultured in the presence of a candidate substance.
  • the self-renewal ability of mesenchymal stem cells can be suppressed by using siRNAs for the genes listed in Table 2. Therefore, if a normal mesenchymal stem cell-like cell is used, a factor that suppresses the self-renewal ability of the mesenchymal stem cell can be screened, and if a mesenchymal stem cell that suppresses the self-replication ability is used, it is suppressed. Factors that can complement the self-replicating ability (ie, factors that activate self-replicating ability) can be screened.
  • the present invention provides a method of screening for a factor that controls the differentiation ability of mesenchymal stem cells.
  • the screening method according to the present invention includes a step of detecting the expression of at least one of the genes listed in Table 2 in a target cell cultured in the presence of a candidate substance.
  • the differentiation ability of mesenchymal stem cells can be suppressed by using siRNAs for the genes listed in Table 2. Therefore, if normal mesenchymal stem cell-like cells were used, it was possible to screen for factors that suppress the differentiation ability of mesenchymal stem cells, and if mesenchymal stem cells with suppressed differentiation ability were used, they were suppressed. Factors that can complement differentiation ability (that is, factors that activate differentiation ability) can be screened.
  • MSC bone differentiation induction medium
  • OP bone differentiation induction medium
  • CP cartilage differentiation induction medium
  • AP adipose differentiation induction medium
  • M medium without differentiation factor
  • M represents MSC
  • OP represents osteoprogenitor cells
  • CP represents cartilage progenitor cells
  • AP represents adipose precursor cells
  • O represents osteoblasts
  • C represents chondrocytes
  • A represents adipocytes.
  • FIG. 6 shows the results of double staining of intramedullary MSC-like cells in the humerus of mature mice using various combinations of antibodies to molecules characteristic of MSC.
  • STEMNESS embryonic stem cells
  • iPS cells mesenchymal stem cells
  • the factors that control the MSC STEMNESS identified by the present inventors are the nine transcription factors shown in Table 2. These transcription factors were selectively expressed in MSC, and siRNA against these transcription factors reduced the self-renewal ability and pluripotency of MSC. In addition, it has been found that these nine types of transcription factors are essential in order to maintain the gene expression pattern unique to MSC.
  • polypeptide is used interchangeably with “peptide” or “protein”.
  • the polypeptides according to the invention may also be isolated from natural sources, recombinantly produced, or chemically synthesized.
  • polynucleotide is used interchangeably with “gene”, “nucleic acid” or “nucleic acid molecule” and is intended to be a polymer of nucleotides.
  • gene means not only DNA but also RNA (for example, mRNA).
  • base sequence is used interchangeably with “gene sequence”, “nucleic acid sequence” or “nucleotide sequence” and is abbreviated as deoxyribonucleotides (A, G, C and T). )).
  • the present invention provides a method for producing inducible mesenchymal stem cells.
  • the production method according to the present invention is a method including a step of introducing the above-mentioned nine types of transcription factor genes into cells. Information on the above transcription factors is shown in Table 2. By referring to the accession numbers described in Table 2, those skilled in the art can obtain the gene sequences necessary for the present invention. Any one of the genes shown in Table 2 may be introduced, but it is preferably 3 or more, more preferably 5 or less.
  • inducible mesenchymal stem cell is intended to be a cell derived from a cell using a factor that induces reprogramming of the mesenchymal stem cell to the STEMNESS state. , Induced progenitor of mesenchyme (iPM) cells.
  • the factor found by the present inventors that controls STEMNESS of mesenchymal stem cells may be a factor that induces reprogramming of mesenchymal stem cells to the STEMNESS state.
  • the cells used for induction into mesenchymal stem cells are not particularly limited, and any cells including ES cells and somatic stem cells can be used.
  • fibroblasts, reticulum cells, adipocytes, macrophages (histosphere or macrophages), mast cells, plasma cells, lymphocytes, epithelial cells, chondrocytes, osteoblasts, bone cells are used in the present invention.
  • examples of possible cells include fibroblasts, osteoblasts, chondrocytes and adipocytes.
  • primary cultured cells prepared from a living body may be established cell lines, or cells derived from tissues such as nerve cells and hepatocytes.
  • iPM cells are advantageous over native MSCs in the following respects: (1) Very high proliferation and differentiation potential; (2) Various diseases (myocardial infarction, cerebral infarction, hepatitis, pulmonary fibrosis, etc.) (3) Even severely ill patients can be prepared from oral mucosal cells, etc. (4) Since patients' cells are used, mesenchymal diseased tissue can be reconstructed in vitro Easy.
  • iPM cells are advantageous over ES cells in the following ways: (1) immune rejection can be avoided because they can be made from autologous cells; (2) because human embryos are not used Has no ethical issues.
  • iPM cells have advantages over iPS cells in the following points: (1) It is difficult to become cancerous (the reprogramming initialization process uses a mechanism in common with the canceration process. (2) High efficiency of cell preparation; (3) Induction by drug method is possible; (4) High differentiation efficiency and easy and simple preparation of final target cells. .
  • the production of iPM cells is advantageous in comparison with the production of iPS cells in the following points: (1) Oncogene is not essential; (2) Directly promotes transcription of the target gene; (3) minimal chromosomal structural alteration; (4) a short period of induction; (5) high induction efficiency; (6) a cell population is less likely to be heterogeneous.
  • the transcription factor gene is introduced into fibroblasts (for example, Tet-on Gene Expression System; uses Clontech).
  • fibroblasts for example, Tet-on Gene Expression System; uses Clontech.
  • a technique known in the art for example, Gateway (registered trademark) multi-site system (Invitrogen)
  • the introduction of the gene-transferred cell is confirmed using, for example, a drug resistance marker.
  • the culture after the introduction is preferably performed under conditions that selectively promote iPM growth. Thereby, the proliferation of fibroblasts is suppressed.
  • a mesenchymal stem cell selective serum-free medium for example, STK2; Two-Cells
  • the above transcription factor is preferable, but is not limited thereto, and for example, the gene described in Patent Document 3 may be used.
  • the iPM cells obtained in this way have acquired self-renewal ability and differentiation ability, but it is preferable to confirm that they are differentiated into the target cells using various induction media for differentiation. Moreover, you may use the method of introduce
  • the production method according to the present invention preferably further includes a step of adding a factor suitable for induction of inducible mesenchymal stem cells to the medium.
  • a factor suitable for induction of inducible mesenchymal stem cells is added to the culture medium.
  • the factors obtained by the screening method described later are induced into mesenchymal stem cell-like cells. Factor).
  • the present invention provides a kit that can be used for the above production method.
  • the kit according to the present invention includes (a) a polynucleotide having the base sequence shown in any one of the accession numbers listed in Table 2 or a complementary sequence thereof; (b) a polynucleotide which is a fragment of (a) above And (c) one or more polynucleotides selected from the group consisting of the polynucleotide (a) or (b), which hybridizes under stringent conditions, It is said.
  • kits comprising the polynucleotide thus identified in combination with a well-known gene transfer technique in the art
  • a person skilled in the art can introduce the polynucleotide into the gene of the target cell to induce inducible mesenchyme.
  • Stem cells can be produced.
  • the present invention also provides a further method for producing inducible mesenchymal stem cells.
  • the production method according to the present invention includes a step of culturing cells for a long time under dedifferentiation conditions, and a step of further culturing the cultured cells on an artificial matrix using a mesenchymal stem cell selective serum-free medium. It is a method including.
  • dedifferentiation conditions are conditions for dedifferentiating differentiated cells in a culture system, specifically, extracellular matrix, proliferation necessary for maintaining differentiation. It is contemplated that the cells are cultured under conditions in which factors, cytokines, etc. have been removed from the medium and culture dish.
  • the combinations of extracellular matrix, growth factors, cytokines, and the like to be removed vary depending on the cell line used. Therefore, it is desirable not to use serum whose components are unknown, and survival factors and growth factors should be added to the serum-free medium, and factors involved in maintaining differentiation should be removed.
  • factors that promote MSC STEMNESS growth factors, cytokines, extracellular matrix, etc.
  • the period of culturing the cells under dedifferentiation conditions varies depending on the cells and drugs, and is preferably 1 week to 3 weeks, but may be within 1 week.
  • Cells cultured for a long time under dedifferentiation conditions are induced into MSC-like cells.
  • Inducible mesenchymal stem cells can be successfully produced by culturing such cells under conditions that selectively promote the proliferation of mesenchymal stem cells.
  • the conditions for selectively promoting the proliferation of mesenchymal stem cells are as described above, and in order to suppress the proliferation of somatic cells (for example, fibroblasts), a mesenchymal stem cell selective serum-free medium is used, It is preferable to culture on an artificial matrix.
  • the production method according to the present invention preferably further includes a step of adding a factor suitable for induction of inducible mesenchymal stem cells to the medium.
  • a factor suitable for induction of inducible mesenchymal stem cells is added to the culture medium.
  • the factors obtained by the screening method described later are induced into mesenchymal stem cell-like cells. Factor).
  • the present inventors produced inducible mesenchymal stem cells.
  • the cells produced are indeed inducible mesenchymal stem cells.
  • inducible mesenchymal stem cells Using inducible mesenchymal stem cells, a disease analysis system (disease model) can be developed. For example, inducible mesenchymal stem cells prepared from fibroblasts of patients with inherited diseases can be used for analysis of disease onset mechanisms and screening of therapeutic agents by inducing differentiation in vitro. Based on the existing knowledge about mesenchymal stem cells, diseases such as osteochondral muscular diseases, heart diseases, kidney diseases, vascular diseases, liver / pulmonary fibrosis, nervous system diseases and the like can be targeted.
  • diseases such as osteochondral muscular diseases, heart diseases, kidney diseases, vascular diseases, liver / pulmonary fibrosis, nervous system diseases and the like can be targeted.
  • the present invention provides a method for detecting inducible mesenchymal stem cells.
  • the detection method according to the present invention is a method including a step of detecting the expression of at least one of the nine types of transcription factor genes described above. As described above, information on the above transcription factors is shown in Table 2.
  • Table 2 information on the above transcription factors is shown in Table 2.
  • Any one of the genes shown in Table 2 may be introduced, but it is preferably 3 or more, and most preferably all.
  • the above gene can be used as a detection marker for inducible mesenchymal stem cells.
  • the said gene or its fragment can be utilized for the probe and microarray for detecting an inductive mesenchymal stem cell.
  • the inductive mesenchymal stem cell detection method according to the present invention uses at least one of the genes listed in Table 2 as a detection marker, It can be said that the method includes a step of detecting the expression of the marker.
  • the detection method of the present invention is not particularly limited as long as it includes the above-described steps, and other specific steps, conditions, materials used, equipment used, and the like are not particularly limited.
  • test cell used in the detection method of the present invention is not particularly limited as long as it is a cell to which the detection method of the present invention can be applied.
  • examples include somatic cell-derived cell populations that contain inducible mesenchymal stem cells or that may contain inducible mesenchymal stem cells.
  • genes listed in Table 2 are genes whose expression is selectively enhanced in MSC. That is, the gene has a relatively low expression level in somatic cells (eg, fibroblasts (FB), osteoblasts (OS), chondrocytes (CH), and adipocytes (AD)), and in MSCs. It can be said that it is a gene whose expression level is relatively high.
  • somatic cells eg, fibroblasts (FB), osteoblasts (OS), chondrocytes (CH), and adipocytes (AD)
  • the expression of the genes listed in Table 2 was detected in the somatic cell-derived cell population that had undergone induction treatment to produce inductive mesenchymal stem cells, and the expression level increased before and after the induction treatment If is detected, it can be determined that the test cell is a cell containing an inducible mesenchymal stem cell. Therefore, it is not possible to identify whether or not the test cell is an inducible mesenchymal stem cell only by confirming the variation in the expression level of the genes listed in Table 2, but at least the test cell is inducible. It can be determined that it contains mesenchymal stem cells. That is, the genes described in Table 2 can be used as detection markers for detecting inducible mesenchymal stem cells.
  • the object of the present invention can be achieved by detecting one or more of the genes listed in Table 2, but it is preferable to detect by appropriately combining two or more genes. . Detection accuracy can be improved by detecting two or more genes.
  • the localization of the cells having the transcription factor can be confirmed using a conventionally known immunohistochemical technique, for example, a fluorescent antibody method such as dual immunofluorescence labeling or an enzyme antibody method.
  • the genes listed in Table 2 can be used as detection markers for inducible mesenchymal stem cells.
  • a conventionally known method used for detecting the expression of the gene can be suitably used.
  • Northern blotting can be used to detect the expression of the detection marker gene.
  • the full length of the gene listed in Table 2 or a fragment thereof is hybridized under stringent conditions to detect the full length of the gene or a part thereof.
  • a detection probe having a possible base sequence can be used.
  • Detection of gene expression in inducible mesenchymal stem cells using the above detection probe can be appropriately performed using a known method.
  • a DNA probe having an appropriate length as a DNA probe is prepared from a known base sequence of the gene of the detection marker in the present invention, and a label such as a fluorescent label is appropriately given, and this is hybridized with a test cell. By doing so, inducible mesenchymal stem cells can be detected.
  • a detection probe comprising the full-length sequence or partial sequence of the antisense strand of the gene of the detection marker in the present invention can also be employed.
  • the present invention provides a kit that can be used in the detection method.
  • the detection kit according to the present invention is (a) a polynucleotide having the base sequence shown in any one of the accession numbers listed in Table 2 or a complementary sequence thereof; (b) the fragment of (a) above.
  • conditions for hybridization with the detection marker gene under stringent conditions include, for example, hybridization at 42 ° C. and 1 ⁇ SSC (0.15 M NaCl, 0.015 M citric acid). Sodium), and a washing treatment at 42 ° C. with a buffer containing 0.1% SDS (Sodium dodecyl sulfate), more preferably hybridization at 65 ° C. and 0.1 ⁇ SSC, A washing treatment at 65 ° C. with a buffer containing 0.1% SDS can be mentioned.
  • quantitative or semi-quantitative PCR can be used to amplify the gene of the test cell.
  • quantitative or semi-quantitative PCR for example, RT-PCR (reverse transcription PCR) can be used.
  • RT-PCR reverse transcription PCR
  • a pair of primer sets consisting of a sense primer and an antisense primer for amplifying the gene of the detection marker in the present invention is used.
  • the detection method of the present invention can be simply performed using an Invader (registered trademark) method.
  • a signal probe having a base sequence that specifically hybridizes to the above-described detection marker gene and an enzyme cleavage site is designed, and total RNA extracted from a test cell (may be cDNA), invader oligo (Invader ( (Registered Trademark) (Oligo), Chrybase Enzyme (Cleavase (Registered Trademark) Enzyme), and Fret Probe (FRET Probe) can be performed by reacting at a predetermined temperature for a predetermined time (for example, 63 ° C., 2 hours, etc.) .
  • a predetermined temperature for example, 63 ° C., 2 hours, etc.
  • invader method As described above, if the invader method is used, gene amplification may not be necessary, and it can be performed quickly and at low cost. In addition, if a commercially available invader method kit is utilized, this invention can be implemented still more easily.
  • the detection method of the present invention can also be performed using in situ hybridization.
  • the detection marker or the partial sequence labeled as described above is used as a detection probe, and a molecular hybrid is directly formed on a specimen of a test cell on a slide glass, and this is easily performed by detecting the part. Can do.
  • a thin section (paraffin section, frozen section, etc.) of a test cell is prepared on a slide glass, and a labeled detection probe is hybridized to it for detection as in the Northern hybridization method. Wash off probe, apply photographic emulsion and expose. After development, the hybridized location is identified from the silver particle distribution.
  • radioisotope mainly 35 S
  • the locus is detected by autoradiography, and the fluorescence signal of the labeled detection probe is detected under a fluorescence microscope.
  • any method may be used.
  • the detection method of the present invention can be executed by means other than the above detection kit.
  • the expression of a detection marker gene can be detected using a microarray for detecting inducible mesenchymal stem cells.
  • the present invention provides a microarray that can be used in the above detection method.
  • the microarray for detection according to the present invention is (a) a polynucleotide having the base sequence shown in any one of the accession numbers listed in Table 2 or a complementary sequence thereof; (b) the fragment of (a) above. And (c) one or more polynucleotides selected from the group consisting of: (c) a polynucleotide that hybridizes with the polynucleotide (a) or (b) above under stringent conditions; It is characterized by being.
  • the size of the polynucleotide comprising the partial base sequence of the gene of the detection marker is not particularly limited as long as the gene of the target detection marker can be detected when a microarray is constructed using the polynucleotide.
  • microarray examples include a DNA microarray for chemically synthesizing oligonucleotides directly on a silica substrate using a microfabrication technique used in semiconductor manufacturing, such as a DNA microarray of Affymetrix in the United States and a Stanford type DNA microarray. Any conventionally known microarray including the above can be suitably used, and the specific size, shape, system and the like are not particularly limited.
  • the detection microarray is used for carrying out the detection method of the present invention, and is included in the scope of the present invention.
  • the above-described detection microarray can achieve the object of the present invention as long as it is configured to detect at least one gene.
  • the expression of a large number of detection marker genes is comprehensive and systematic. It is preferable that the constitution is such that two or more genes, more preferably as many genes as possible can be detected. This is because whether or not it is an inducible mesenchymal stem cell can be identified very simply and accurately.
  • the gene molecular marker for MSC detection disclosed in Patent Document 3 “Ishii, M., Koike, C., Igarashi, A., Yamanaka, K., Pan, H., Higashi, Y., Kawaguchi, H., Sugiyama, M., Kamata, N., Iwata, T., Matsubara, T., Nakamura, K., Kurihara, H., Tsuji, K., And Kato, Y.
  • Molecular Markers Distinguish Bone Marrow Mesenchymal Stem Molecular markers disclosed in “Cells from Fibroblasts. Biochem Biophys Res Commun. 332 (1), 297-303, 2005”, and the like.
  • the genes listed in Table 2 can be used as detection markers for inducible mesenchymal stem cells. Those skilled in the art who read this specification will easily understand that this can detect the expression of the gene of the detection marker using the expression of the protein encoded by the gene as an index. That is, the polypeptides encoded by the genes listed in Table 2 can also be detection markers in the present invention.
  • the target protein is produced by, for example, recombination, an antibody that specifically binds to the protein is prepared, and the expression level of the protein is detected using the antibody according to a known method described later. .
  • the present invention provides a further kit that can be used in the detection method.
  • the detection kit according to the present invention comprises an antibody that specifically binds to a polypeptide encoded by a gene listed in Table 2.
  • the antibody can also be said to be an antibody raised by the polypeptide.
  • the genes listed in Table 2 are enhanced in MSC. Therefore, an antibody against the polypeptide encoded by the gene can successfully detect inducible mesenchymal stem cells.
  • the above antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • the above antibody can be prepared, for example, by a conventionally known conventional method using the full-length polypeptide encoded by the genes listed in Table 2 or a partial fragment thereof as an antigen.
  • the partial fragment of the said polypeptide should just have immunogenicity.
  • a method for producing a monoclonal antibody is not particularly limited.
  • a monoclonal antibody is produced by an antibody-producing hybridoma obtained by immunizing a mouse with an antigen and then fusing the mouse spleen lymphocyte with a mouse-derived myeloma cell.
  • Hybridoma production methods include conventionally known methods such as the hybridoma method (Kohler, G. and Milstein, C., Nature 256, 495-497 (1975)), the trioma method, the human B-cell hybridoma method (Kozbor, unImmunology). Today 4, 72 (1983)) and EBV-hybridoma method (Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss, Inc., 77-96 (1985)) can be used, and is not particularly limited.
  • the antigen is not particularly limited as long as it is a polypeptide, but an antigen protein obtained by binding a substance serving as an antigen determinant to a carrier protein may be used.
  • the antigen is a hapten
  • the carrier is made of a biopolymer such as a protein derived from a different species.
  • Antibody production can be induced by obtaining an antigenic protein and immunizing with the protein.
  • the carrier is not particularly limited, and various proteins conventionally known in this field such as ovalbumin, ⁇ globulin, and hemocyanin can be suitably used.
  • Monoclonal antibodies can also be produced by gene recombination techniques.
  • a method for producing a polyclonal antibody there can be mentioned a method in which an experimental animal is inoculated and sensitized with an antigen, and antibody components are purified and obtained from the body fluid.
  • an animal to be immunized conventionally known experimental animals such as mice, rats, rabbits, monkeys and horses can be used, and are not particularly limited.
  • the interval and amount thereof can be appropriately determined according to a conventional method.
  • detection of protein expression of a detection marker in a test cell using the antibody of the present invention can be performed using an immunological assay using a known antibody.
  • the immunological measurement method include known immunological measurement methods such as RIA method, ELISA method, and fluorescent antibody method.
  • Western blotting method, enzyme immunoassay method, method for observing agglutination, sedimentation and hemolysis reaction by antibody, morphological detection method such as tissue immunostaining and cell immunostaining are also required. Can be used.
  • the present invention provides a method of screening for factors that induce cells into inducible mesenchymal stem cells.
  • the genes listed in Table 2 are factors that control STEMNESS of MSCs found by the present inventors, and are genes whose expression is selectively enhanced in MSCs. Therefore, when the expression level of the gene described in Table 2 in cells cultured in the presence of the candidate substance is increased as compared to the absence of the candidate substance, or when it is comparable to the expression level in MSC, the candidate The factor can be a factor that induces cells into inducible mesenchymal stem cells.
  • the screening method according to the present invention is characterized by including a step of detecting the expression of at least one of the genes listed in Table 2 in cells cultured in the presence of a candidate substance.
  • the screening method according to the present invention preferably further includes a step of detecting the expression of the gene detected in the cells in cells cultured in the absence of a candidate substance.
  • the screening method according to the present invention preferably further includes a step of detecting the expression of the gene detected in the cells in MSC.
  • the expression in MSC of each gene may be accumulate
  • the candidate substance applied to this method may be any of nucleic acid, peptide, protein, organic compound, and inorganic compound.
  • nucleic acid When nucleic acid is present as a candidate substance, it is introduced into cells to be used, and changes in the expression levels of the genes listed in Table 2 before and after introduction may be confirmed. Moreover, what is necessary is just to compare the expression level of the gene of Table 2 between the cell after introduction
  • a peptide or compound is present as a candidate substance, a candidate factor may be added to the medium, and the change in the expression level of the genes listed in Table 2 before and after the addition may be confirmed. Moreover, what is necessary is just to compare the expression level of the gene of Table 2 between the cell and MSC after addition.
  • the present invention provides a method of screening for factors that control the self-renewal ability of mesenchymal stem cells.
  • the screening method according to the present invention includes a step of detecting the expression of at least one of the genes listed in Table 2 in a target cell cultured in the presence of a candidate substance.
  • a factor that activates or suppresses the self-renewal ability of MSC can be screened.
  • the self-replication ability of MSC can be suppressed by knocking down the gene of Table 2 in MSC. Therefore, if MSCs with suppressed self-replicating ability are used, a factor that can complement the suppressed self-replicating ability (that is, a factor that activates self-replicating ability) can be screened.
  • siRNA short interference RNA, small interfering RNA
  • various known techniques in the field can be employed.
  • siRNA can suppress the expression of the target gene by the principle of RNAi
  • its base sequence is not particularly limited.
  • siRNA is meant to include stRNA (small temporal RNA) and shRNA (short hairpin RNA).
  • the siRNA base sequence can be designed by a known method based on the base sequence information of the gene whose expression is desired to be suppressed.
  • software used in designing siRNA is commercially available, and it is preferable to design using the software from the viewpoint of efficiency. Examples of commercially available software include siDirect TM manufactured by RNAi (http://www.rnai.co.jp/).
  • siRNA designed as described above can be performed by a known automatic nucleotide synthesizer.
  • Outsourcing companies include Ambion, Invitrogen, QIAGEN, Dharmacon, and others.
  • the base sequence of siRNA used in Examples described later is as follows.
  • the base sequence of the sense strand of siRNA against ETV5 is shown in SEQ ID NO: 1, and the base sequence of the antisense strand is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the base sequence of the sense strand of siRNA against HMGA2 is shown in SEQ ID NO: 3, and the base sequence of the antisense strand is shown in SEQ ID NO: 4.
  • the base sequence of the sense strand of siRNA for KLF12 is shown in SEQ ID NO: 5, and the base sequence of the antisense strand is shown in SEQ ID NO: 6.
  • the base sequence of the sense strand of siRNA for SIM2 is shown in SEQ ID NO: 7, and the base sequence of the antisense strand is shown in SEQ ID NO: 8.
  • the base sequence of the sense strand of siRNA for SOX11 is shown in SEQ ID NO: 9, and the base sequence of the antisense strand is shown in SEQ ID NO: 10.
  • the base sequence of the sense strand of siRNA for ETV1 is shown in SEQ ID NO: 11, and the base sequence of the antisense strand is shown in SEQ ID NO: 12.
  • the base sequence of the sense strand of siRNA for FOXP1 is shown in SEQ ID NO: 13, and the base sequence of the antisense strand is shown in SEQ ID NO: 14.
  • the base sequence of the sense strand of siRNA for PRDM16 is shown in SEQ ID NO: 15, and the base sequence of the antisense strand is shown in SEQ ID NO: 16.
  • the base sequence of the sense strand of siRNA for GATA6 is shown in SEQ ID NO: 17, and the base sequence of the antisense strand is shown in SEQ ID NO: 18.
  • the candidate substance applied to this method may be any of nucleic acid, peptide, protein, organic compound, and inorganic compound.
  • nucleic acid When nucleic acid is present as a candidate substance, it is introduced into cells to be used, and changes in the expression levels of the genes listed in Table 2 before and after introduction may be confirmed. Moreover, what is necessary is just to compare the expression level of the gene of Table 2 between the cell after introduction
  • a peptide or compound is present as a candidate substance, a candidate factor may be added to the medium, and the change in the expression level of the genes listed in Table 2 before and after the addition may be confirmed. Moreover, what is necessary is just to compare the expression level of the gene of Table 2 between the cell after addition, and untreated normal MSC.
  • the present invention provides a method of screening for a factor that controls the differentiation ability of mesenchymal stem cells.
  • the screening method according to the present invention includes a step of detecting the expression of at least one of the genes listed in Table 2 in a target cell cultured in the presence of a candidate substance.
  • a factor that activates or suppresses the differentiation ability of MSC can be screened.
  • the differentiation ability of MSC can be suppressed by knocking down the gene of Table 2 in MSC. Therefore, if MSC with suppressed differentiation ability is used, a factor that can complement the suppressed differentiation ability (that is, a factor that activates differentiation ability) can be screened.
  • siRNA is suitably used for gene knockdown, but is not limited thereto, and various known techniques in the field can be employed.
  • the candidate substance applied to this method may also be any of nucleic acids, peptides, proteins, organic compounds, and inorganic compounds.
  • nucleic acid When nucleic acid is present as a candidate substance, it is introduced into cells to be used, and changes in the expression levels of the genes listed in Table 2 before and after introduction may be confirmed. Moreover, what is necessary is just to compare the expression level of the gene of Table 2 between the cell after introduction
  • a peptide or compound is present as a candidate substance, a candidate factor may be added to the medium, and the change in the expression level of the genes listed in Table 2 before and after the addition may be confirmed. Moreover, what is necessary is just to compare the expression level of the gene of Table 2 between the cell after addition, and untreated normal MSC.
  • Real-time reverse transcription PCR analysis was performed using the ABI prism 7900HT Sequence Detection System instrument and software (Applied Biosystems Inc, Foster City, Calif.). Primers and probes were purchased from Applied Biosystems Inc. Data was normalized to 18S rRNA.
  • siRNA oligonucleotides for ETV1, ETV5, FOXP1, GATA6, HMGA2, KLF12, PRDM16, SIM2, and SOX11 were designed targeting each nucleotide sequence and synthesized at RNAi Co., Ltd. (Tokyo, Japan).
  • Mesenchymal stem cells, synovial fibroblasts, or dermal fibroblasts are cultured on 24-well tissue culture plates and at 40% confluence, each siRNA or control siRNA using Lipofectamin 2000. Transfected. Transformed cells were transferred to DMEM medium containing 10% fetal calf serum and incubated for 2-6 days. Cell numbers were counted using WST-8 reagent (Seikagaku, Tokyo, Japan).
  • Lipofectamin 2000 was added to each siRNA or control siRNA at 80% confluence on cells cultured in a 48-well multi-well tissue culture plate. Used to transfect. Two days after transfection, the medium was replaced with osteogenic and adipogenic induction medium. Alkaline phosphatase activity and GPDH activity were measured.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • GATA6, TRPC4, HTR7, IGFBP3, FLG 10 mM citrate buffer
  • 10 mM citrate buffer pH 6, 0
  • Microwave treatment H2800, Energy BeaMSCiences, Inc., USA
  • Immunoreactivity was determined with Alexa Flour567 (568 nm, red) and Alexa Flour647 (647 nm, green). Were visualized together. Cell nuclei were stained with DAPI (blue, S24535, Molecular Probe, USA).
  • MSC MSC
  • differentiated cells any of O, C, A
  • fibroblasts F
  • Real-time RT-PCR was performed using 6 strains for MSC (M), osteoblast (O), chondrocyte (C) and adipocyte (A), and 4 strains for fibroblast (F). It was.
  • Real-time RT-PCR confirmed 71 differentially expressed genes among 148 MSC characteristic genes.
  • LIF leukemia inhibitory factor
  • DNA microarray and real-time RT-PCR analysis showed similar expression patterns in these genes, indicating reproducibility.
  • DNA microarray and real-time RT-PCR showed that LIF as a positive control was highly expressed in both MSC and chondrocytes (FIG. 1).
  • genes characteristic of MSC are involved in pluripotency, these genes may be expressed in other MSC-like cells.
  • genes characteristic of MSC in bold in Table 1 are actually synovial fibroblasts of osteoarthritis than in dermal fibroblasts, osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. It was found that the expression was 1.5 times or more high. This is probably because synovial fibroblasts of osteoarthritis have pluripotency unlike skin fibroblasts. Furthermore, it was confirmed that synovial fibroblasts of osteoarthritis have bone differentiation and adipose differentiation ability (data not shown).
  • HGF hepatocyte growth factor
  • MET hepatocyte growth factor
  • HGF-MET autocrine loop and the high keratin cytoskeleton are characteristic of bone marrow MSCs.
  • OP osteoprogenitor cells
  • CP cartilage progenitor cells within 24 hours after culturing with differentiation-inducing medium for bone differentiation, cartilage differentiation and adipose differentiation.
  • AP preadipocytes
  • FIG. 2 (a) shows mRNA expression levels determined by real-time RT-PCR using three MSC strains
  • FIG. 2 (b) shows bone differentiation induction medium, cartilage differentiation induction medium, and fat differentiation induction.
  • the expression decrease of a gene characteristic of 71 MSCs after 24 hours of culture using a medium is shown. Of the 71 genes examined, the proportion of genes whose expression was significantly reduced after 24 hours of culture was classified.
  • FIG. 2 (c) shows that MSCs are cultured for 24 hours or 28 days using a bone differentiation induction medium (OP), a cartilage differentiation induction medium (CP), a fat differentiation induction medium (AP), or a medium without differentiation factor (M). Tissue-specific gene expression was confirmed.
  • MRNA levels were determined by real-time RT-PCR using three strains. Values are mean values of 3 wells ⁇ standard error.
  • siRNA oligonucleotides designed with these genes as targets were used. Most of the genes characteristic of MSC (53 out of 71; 75%) within 48-72 hours (time when siRNA reduced target mRNA level to 50-80%) by addition of siRNA oligonucleotides. mRNA levels were significantly reduced (Table 3).
  • the mRNA levels of genes characteristic of MSC were evaluated by real-time RT-PCR.
  • the value in parentheses in the table indicates the mRNA level when the control is 1.
  • Genes showing a significant decrease in expression are shown (* p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01, *** p ⁇ 0.005, ⁇ p ⁇ 0.0005).
  • siRNA reduced the expression of a different set of genes characteristic of MSC. This suggests that these decreased expression is not a general toxic effect of siRNA. These also suggest that nine transcription factors are essential for the molecular characteristics of MSC.
  • siRNA did not affect dermal fibroblast proliferation, but decreased the number of bone marrow MSCs and stopped synovial fibroblast proliferation (FIG. 3). The number of cells was calculated using the evaluation method based on the ratio of OD 490 and OD 630 using WST-8 reagent. Values represent mean values ⁇ standard error of 3 cultures. Comparison with negative control siRNA using Student T test (* p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01, *** p ⁇ 0.005).
  • Table 4 shows the effect of knockdown of nine transcription factors on the proliferation of MSC (4 types), synovial fibroblasts (4 types), and skin fibroblasts (3 types).
  • the indicated values show the ratio (day 6) of the increase in the number of cells cultured after transfection with siRNA to the increase in cells cultured after transfection with control siRNA.
  • siRNA was transferred at the 40% confluent stage, and cultured with 10% fetal bovine serum for 6 days. Using WST-8 reagent, the increase in the number of cells from day 0 to day 6 was measured. Values indicate the percentage increase in cell number when compared to cells transfected with control siRNA (shown as mean ⁇ standard error of 3 cultures).
  • ETV5 and SOX11 stopped both MSC and synovial fibroblast proliferation. And knockdown of ETV1, FOXP1, GATA6, HMGA2, PRDM16, and SIM2 moderately or significantly suppressed the proliferation of these cells.
  • siRNA nucleotides had little effect on dermal fibroblast proliferation. From this, suppression of growth suggests that siRNA is functioning normally.
  • the effect of knockdown varies depending on the cell or line type, but the cell line did not affect knockdown as much as the cell type. It is unclear if knockdown induced more significant inhibition of synovial fibroblast proliferation than bone marrow MSC, but synovial fibroblasts showed active proliferation in osteoarthritic joints in vivo .
  • siRNA oligonucleotides were added two days before culturing in differentiation induction medium. Alkaline phosphatase activity started to increase after 8 days of culture in bone differentiation-inducing medium. While knockdown of SIM2 and SOX11 in MSC moderately suppressed the increase in enzyme activity, knockdown of HMGA2 and PRDM16 had little effect on enzyme activity, and other siRNA nucleotides showed no inhibitory effect. It was. In further experiments, substrate calcification was delayed with SIM2, SOX11, FOXP1 knockdown (as confirmed by alizarin red staining), but none of the siRNA nucleotides reduced the maximum level of calcification (not shown) ).
  • siRNA a marker of a bone cell
  • FIG. 4 ALPase activity which is a marker of a bone cell.
  • the cells are transfected with siRNA or control siRNA, left in the presence of 10% fetal bovine serum for 24 hours, and then added with 10% fetal bovine serum Incubated with DMEM for 2 days. Furthermore, these cells were transferred to DMEM (dotted line) supplemented with 10% fetal bovine serum or bone differentiation induction medium (solid line) and cultured for the indicated number of days. Values are mean ⁇ standard error for 3 cultures.
  • siRNA adipogenic differentiation medium
  • siRNAs of ETV1, FOXP1, PRDM16, and SOX11 suppressed the induction of GPDH.
  • siRNA oligo introduction efficiency into various cells is almost equal. Therefore, it can be said that the suppression efficiency of gene expression between the compared cells is equivalent.
  • GATA6 was present in the cytoplasm of several bone marrow cells. There were relatively many cells positive for GATA6 immunity in the bone marrow. The GATA6 immunopositive cells on the bone surface have an osteoblast-like shape. Moreover, GATA6 immunopositive cells were also scattered in the periosteum (not shown). LIF was present in the cytoplasm of some bone marrow cells. And LIF immunopositive cells were scattered outside the periosteum (not shown).
  • GATA6-positive cells panel B in FIG. 6
  • LIF-positive cells panel C in FIG. 6
  • Nonspecific serum and secondary antibody alone showed no specific staining. Therefore, it is considered that double-stained cells are not pluripotent hematopoietic cells or fibroblasts. This is because mRNA levels of GATA6 and LIF are very low or undetectable among all fractions of bone marrow cells, nonadherent bone marrow cells, and skin fibroblasts (FIG. 7).
  • FIG. 7 also shows that FLG, TGM2, and HTR7 were expressed in MSC but not in other cells, and MET, TRPC4, and IGFBP were expressed at higher levels in MSC than in fibroblasts. However, it was not expressed in non-adherent bone marrow cells, indicating that ADD3 and VEGF were expressed at lower levels in non-adherent bone marrow cells and fibroblasts than MSCs. These molecular antibodies characteristic of MSC also reacted with some bone marrow cells in vivo.
  • FIG. 8 shows the identification of double immunopositive cells in mouse bone marrow using various antibodies. Determine the combination of antibodies to be tested for double immunostaining considering the species of animals used for antibody production (rabbit, goat, mouse) and preservation of immunoreactivity after antigen repair by pepsin and microwave treatment did.
  • MSC-like cells in the bone marrow of 56-day-old mice were double-stained with various antibodies and evaluated using a confocal fluorescence microscope. Relatively many TRPC4 positive / FLG positive double-stained cells were present in the bone marrow and in the vicinity of the endosteum (panel A in FIG. 8). In addition, relatively many LIF-positive / ADD3-positive double-stained cells were present in the bone marrow, and some LIF-positive / ADD3-positive double-stained cells were present in the vicinity of the endosteum, but were not present in the periosteum. (Panel B in FIG. 8).
  • GATA6 positive / FLG positive double stained cells were present in the bone marrow and some GATA6 positive / FLG positive double stained cells were present near the endosteum but not in the periosteum (Panel C in FIG. 8).
  • Relatively many TMG2-positive / LIF-positive double-stained cells were present in the bone marrow, and some TMG2-positive / LIF-positive double-stained cells were present near the endosteum (FIG. 8, panel D).
  • Some TRPC4-positive / IGFBP3-positive double-stained cells were present in the bone marrow but not in the periosteum (Panel E in FIG. 8).
  • TGM2-positive / MET-positive double-stained cells were present in the bone marrow and near the endosteum, but MET positivity was not present in the periosteum (panel F in FIG. 8).
  • Relatively many LIF positive / MET positive double stained cells were detected in the bone marrow.
  • Some LIF-positive / MET-positive double-stained cells were present near the endosteum but not in the periosteum (panel G in FIG. 8).
  • One ADD3-positive / MET-positive double-stained cell was present in the vicinity of the endosteum, but ADD3-positive / MET-positive was not present in the periosteum (panel H in FIG. 8).
  • TRPC4-positive / VEGF-positive double-stained cells were present in the bone marrow and near the endosteum, but not in the periosteum (Panel I in FIG. 8).
  • GATA6-positive / VEGF-positive cells were present near the endosteal membrane but not on the endosteal surface, whereas GATA6-positive / VEGF-negative cells were present on the bone surface.
  • One GATA6-positive / IGFBP3-positive cell was present in the vicinity of the endosteal membrane (panel K in FIG. 8).
  • the number of GATA6-positive / MET-positive cells was small in the bone marrow and was present in the vicinity of the endosteum, but not on the bone surface or on the periosteum (panel L in FIG. 8).
  • the number of FLG-positive / VEGF-positive cells was small and a small number was present near the endosteum but not on the bone surface or periosteum (panel M in FIG. 8).
  • the number of FLG positive / IGFBP3 positive cells in the bone marrow was small and was not detected on the bone surface or periosteum (panel N in FIG. 8). It was not stained with the secondary antibody alone or the control IgG as a negative control (panel O in FIG. 8).
  • the expression rate of double immunity positive cells is high in TRC4 / FLG (panel A) and moderate in LIF / ADD3 (panel B), GATA6 / FLG (panel C), and TGM2 / LIF (panel D).
  • the other combinations were low.
  • GATA6 / FLG and TGM2 / LIF, together with GATA6 / LIF (FIG. 6) help identify MSC-like cells. They are not expressed in nonadherent bone marrow cells or dermal fibroblasts (FIG. 7). Since fibroblasts are not normally present in the bone marrow, TRPC4 / FLG may also help.
  • the low staining rate of single or double immunopositive cells by MET, IGFBP3, and VEGF antibodies means that the antibody quality, specimen processing, or mRNA levels of these markers are always translated into protein levels. It may be due to not doing. Nevertheless, all of the antibody combinations revealed the presence of double immunopositive cells. This indicates that each part of bone marrow cells simultaneously synthesizes several MSC marker proteins in vivo.
  • the adhesive bone marrow cells that simultaneously express these molecules can be said to be MSCs.
  • LIF is not a marker for MSC alone, it can be said that anti-LIF antibody is useful for examining immunohistochemistry of MSC in bone marrow other than cartilage tissue.
  • the perichondrium and periosteum also contain MSC-like cells that differentiate into chondrocytes and osteoblasts after culture or after transplantation, so the expression of molecules characteristic of MSC in the perichondrium of the humerus was examined. .
  • Some of the molecules characteristic of MSC (GATA6 (panels C and D in FIG. 9), LIF (panels A and B in FIG. 9), ADD3 (panels A and B in FIG. 9), FLG (panel C in FIG. 9) And D), antibodies to HTR7 (not shown) reacted to the cell population within the perichondrium, while no double immunopositive cells were detected in the tissue shown in Figure 9. Similar results were observed in the periosteum.
  • FGF, EGF, HGF, PDGF, TGF- ⁇ , insulin, dexamethasone (Dex), fatty acid, vitamin C (VC), and fetal bovine serum were used.
  • three human bone marrow-derived cells MSC-R14-P6, MSC-R17-P5, MSC-R60-P5 were used.
  • MSC-R14-P6, MSC-R17-P5, MSC-R60-P5 were used for the culture dish.
  • MSC-R17-P5 MSC-R17-P5, MSC-R60-P5
  • Each cell cultured using a medium containing 10% FBS + FGF in a 10 cm dish was collected, and the number of cells was counted. These cells were seeded in 6-well plates at 2 ⁇ 10 5 / well (ie 2 ⁇ 10 5 / cm 2 ).
  • the concentrations of the added factors are as follows: PA: 10 ⁇ g / ml, FGF: 3 ng / ml, TGF: 10 ng / ml, 5 ng / ml, PDGF: 10 ng / ml, EGF: 20 ng / ml, Dexamethasone ( Dex): 10 ⁇ 8 M, insulin: 10 ⁇ g / ml, chemically defined lipid concentrate (CD): diluted stock solution 100-200 fold, VC: 50 ⁇ g / ml.
  • inducible mesenchymal stem cells can be induced in vivo by injecting various drugs into various tissues (including cartilage) to promote the expression of transcription factors related to STEMNESS of MSC.
  • various drugs including cartilage
  • the number of inducible mesenchymal stem cells can be increased in vivo by administering the growth factors shown in Table 5 to the disease site.
  • inducible mesenchymal stem cells were able to be produced from fibroblasts derived from various tissues by using a serum-free medium supplemented with a factor promoting MSC STEMNESS. These inducible mesenchymal stem cells are useful for regenerative medicine.
  • another drug is further added to the above-mentioned serum-free medium, inducible mesenchymal stem cells with higher bone differentiation ability can be produced, so this system is very useful as a drug screening system.
  • inducible mesenchymal stem cells could be prepared by using a serum-free medium supplemented with a factor that promotes MSC STEMNESS.
  • another drug is further added to the serum-free medium, inductive mesenchymal stem cells with higher differentiation ability can be produced. This system is useful as a drug screening system.
  • cells having the same self-replication ability and differentiation ability as in mesenchymal stem cells can be easily produced without using human embryos or ES cells. .
  • an inductive mesenchymal stem cell can be detected.
  • screening for a factor that induces cells into inducible mesenchymal stem cells, a factor that controls the self-renewal ability of mesenchymal stem cells, and a factor that controls the differentiation potential of mesenchymal stem cells Can do.
  • the present invention can provide cells having the same self-renewal ability and differentiation ability as mesenchymal stem cells without using human embryos or ES cells, the present invention greatly contributes to the field of medicine, particularly in fields related to regenerative medicine. Can contribute.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

　表２に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子の少なくとも１つを細胞に導入する工程を包含する方法によって、誘導性間葉系幹細胞を作製する。これにより、ヒトの胚またはＥＳ細胞を利用することなく、間葉系幹細胞と同様の自己複製能および分化能を有する細胞を提供することができる。

Description

誘導性間葉系幹細胞およびその作製方法
　本発明は、ヒト細胞から誘導した誘導性間葉系幹細胞、およびその作製方法に関するものである。
　間葉系幹細胞（以下、適宜「ＭＳＣ」と称する。）は、哺乳類の骨髄等の組織中に存在する体性幹細胞の一つであり、脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞に分化する多分化能、及び自己増殖能を有する幹細胞として知られている。ＭＳＣは、その分化多能性の故に、多くの組織についての再生医療のための移植材料として注目されている。すなわち、ＭＳＣを用いて、従来の治療方法では再生しなかった、疾病や障害により失った組織を再生し、機能を回復させる「細胞移植による再生医療」である。具体的には、例えば、下肢虚血（ビュルガー病）患者に対する骨髄間葉系幹細胞の移植、歯周病患部への骨髄間葉系幹細胞の移植、変形性関節症患者に対する骨髄間葉系幹細胞の移植、脳梗塞、心筋梗塞への間葉系幹細胞の移植等の治療が開始または計画されている。
　このように、ＭＳＣを再生医療に利用するためには、まず、幹細胞を生体組織から採取し、それを未分化のままで増殖させ、さらに増殖させた未分化幹細胞を所望の細胞へ分化誘導し、再生治療用の組織を調製することが必要となる。
　本発明者らはこれまでに、ＭＳＣの採取に際して、採取母体に安全で、且つ採取が容易な分離採取を行うために、口腔組織からＭＳＣを分離採取する方法を報告している（特許文献１参照）。また、基底膜細胞外基質の存在下において、または線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）等の含有培地でＭＳＣを培養することによって、ＭＳＣを著しく速く増殖させ、かつ、その分化能を維持できることを見出して、従来の培養方法と比較して顕著に多くのＭＳＣを得る培養方法を報告している（特許文献２参照）。
　さらに、本発明者らは間葉系幹細胞を用いた再生医療を実用化するために、培養した細胞から間葉系幹細胞を識別し、当該間葉系幹細胞を分離する方法を開発した。より具体的には、本発明者らは、形態的に類似しているためにその識別が困難な間葉系幹細胞と線維芽細胞とを、間葉系幹細胞検出用遺伝子マーカーおよび／または間葉系幹細胞検出用タンパク質マーカーを用いて効果的に識別し、分離する方法を開発した（特許文献３参照）。また本発明者らは、分子マーカーを用いて、未分化の間葉系幹細胞と、線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、および脂肪細胞等の他の結合組織系の細胞とを精度よく識別し、未分化の間葉系幹細胞を分離する方法を開発した（特許文献４参照）。
日本国公開特許公報「特開２００３－５２３６５号公報（公開日：平成１５年２月２５日）」 日本国公開特許公報「特開２００３－５２３６０号公報（公開日：平成１５年２月２５日）」 日本国公開特許公報「特開２００８－０９２９１９号公報（公開日：平成２０年４月２４日）」 国際公開「ＷＯ２００６／１０６８２３パンフレット（国際公開日：２００６（平成１８）年１０月１２日）」
　骨髄、脂肪または滑膜に由来するネイティブなＭＳＣは、多くの国民（約３０００万人）が罹患する不治の疾患（骨軟骨疾患、心筋梗塞、脳梗塞、歯周病など）に対して新しい治療法を提供し得る。ＭＳＣを骨、軟骨または脂肪へ分化させることは比較的容易であるが、心筋、肝臓、神経などへの分化効率は低い。また、自家のＭＳＣは個体差が大きく、ＭＳＣの数は加齢とともに著しく減少する。このように、培養が困難であるＭＳＣから再生医療に必要な数の細胞を調製する際にネイティブなＭＳＣを出発材料とすることには限界がある。さらに、肝炎、心臓疾患などに罹患した重症患者からの骨髄または脂肪組織の分離は困難である。
　本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、ヒトの胚またはＥＳ細胞を利用することなく、間葉系幹細胞と同様の自己複製能および分化能を有する細胞を作製する技術を提供することにある。
　近年、体細胞の核を初期化して胚性幹細胞（ＥＳ細胞）様の誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を取得する技術が開発された。ｉＰＳ細胞は、ヒト受精卵を用いないので倫理的な問題がなく、臨床応用が大いに期待されている。なお、ｉＰＳ細胞の作製に必要とされる因子は、ＥＳ細胞に特異的に発現する遺伝子を指標にスクリーニングされた。また、このような遺伝子は、ＥＳＴデータベースを利用したコンピューター解析およびノザンブロット解析に基づいて見出されている。
　これまでに、ＤＮＡマイクロアレイ分析を用いて、ＭＳＣと線維芽細胞または分化細胞との間で遺伝子発現プロファイルが比較されている。しかし、これまでになされた報告は具体的な結論を導いておらず、ＭＳＣを人為的に調製する技術を示唆すらしていない。
　本発明者らは、独自の観点に基づいて、ＤＮＡマイクロアレイおよびリアルタイムＰＣＲ分析を用いて、ヒトＭＳＣに特徴的な遺伝子を多数同定し、中でも、９つの遺伝子がＭＳＣの自己複製能および分化能の維持に重要であることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、誘導性間葉系幹細胞を作製する方法を提供する。本発明にかかる作製方法は、表２に記載の遺伝子の少なくとも１つを細胞に導入する工程を包含することを特徴としており、間葉系幹細胞選択的な無血清培地を用いて培養する工程をさらに包含することが好ましい。
　後述する実施例に示すように、表２に記載の遺伝子は、ＭＳＣにおいてその発現が亢進しており、表２に記載の遺伝子に対するｓｉＲＮＡを用いることによってＭＳＣの自己複製能や分化能が抑制される。すなわち、表２に記載の遺伝子を細胞に導入することによって、誘導性間葉系幹細胞を作製することができる。なお、表２に記載の遺伝子は、表２に記載のアクセッション番号を参照することによって、当業者は本発明に必要な遺伝子配列を入手し得る。なお、表２にはヒト遺伝子のみを示しているが、対応する動物遺伝子を使用してもよい。
　また、本発明は、誘導性間葉系幹細胞を作製するためのキットを提供する。本発明にかかるキットは、（ａ）表２に記載のアクセッション番号のいずれか１つに示される塩基配列またはその相補配列を有するポリヌクレオチド；（ｂ）上記（ａ）のフラグメントであるポリヌクレオチド；および（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、からなる群より選択されるポリヌクレオチドの１つ以上を備えていることを特徴としている。
　本発明は、誘導性間葉系幹細胞を作製するさらなる方法を提供する。本発明にかかる作製方法は、細胞を脱分化条件下にて長期間培養する工程、および培養後の細胞を、間葉系幹細胞選択的な無血清培地を用いて人工マトリックス上でさらに培養する工程を包含することを特徴としている。
　上述した誘導性間葉系幹細胞を作製する方法は、誘導性間葉系幹細胞の誘導に好適な因子を培地に添加する工程をさらに包含することが好ましい。上記因子は、表５に記載の因子であっても、後述するスクリーニング方法によって得られた、細胞を間葉系幹細胞様の細胞に誘導する因子であってもよい。
　本発明は、誘導性間葉系幹細胞を検出する方法を提供する。本発明にかかる方法は、目的の細胞において、表２に記載の遺伝子の少なくとも１つの発現を検出する工程を包含することを特徴としている。
　表２に記載の遺伝子は、ＭＳＣにおいて発現が亢進している転写因子の遺伝子である。よって、上記遺伝子は、誘導性間葉系幹細胞の検出マーカーとして利用可能である。また、上記遺伝子またはそのフラグメントは、誘導性間葉系幹細胞を検出するためのプローブやマイクロアレイに利用可能である。
　すなわち、本発明は、誘導性間葉系幹細胞を検出するためのキットを提供する。本発明にかかるキットは、下記（ａ）～（ｃ）からなる群より選択されるポリヌクレオチドの１つ以上を備えていることを特徴としている：（ａ）表２に記載のアクセッション番号のいずれか１つに示される塩基配列またはその相補配列を有するポリヌクレオチド；（ｂ）上記（ａ）のフラグメントであるポリヌクレオチド；および、（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
　また、本発明は、誘導性間葉系幹細胞を検出するためのマイクロアレイを提供する。本発明にかかるマイクロアレイは、下記（ａ）～（ｃ）からなる群より選択されるポリヌクレオチドの１つ以上が固定化されていることを特徴としている：（ａ）表２に記載のアクセッション番号のいずれか１つに示される塩基配列またはその相補配列を有するポリヌクレオチド；（ｂ）上記（ａ）のフラグメントであるポリヌクレオチド；および、（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
　本発明は、誘導性間葉系幹細胞を検出するためのさらなるキットを提供する。本発明にかかるキットは、表２に記載の遺伝子にコードされるポリペプチドと特異的に結合する抗体を備えていることを特徴としている。
　上述したように、表２に記載の遺伝子は、ＭＳＣにおいてその発現が亢進している。よって、上記遺伝子にコードされるタンパク質（ポリペプチド）に対する抗体は、誘導性間葉系幹細胞を首尾よく検出し得る。
　本発明は、細胞を誘導性間葉系幹細胞に誘導する因子をスクリーニングする方法を提供する。本発明にかかるスクリーニング方法は、候補物質の存在下にて培養した細胞において、表２に記載の遺伝子の少なくとも１つの発現を検出する工程を包含することを特徴としている。
　上述したように、表２に記載の遺伝子は、ＭＳＣにおいてその発現が亢進している。よって、上記遺伝子は、候補物質の存在下にて培養した細胞が誘導性間葉系幹細胞に誘導されたか否かを知る指標となり得る。
　本発明は、間葉系幹細胞の自己複製能を制御する因子をスクリーニングする方法を提供する。本発明にかかるスクリーニング方法は、候補物質の存在下にて培養した目的の細胞において、表２に記載の遺伝子の少なくとも１つの発現を検出する工程を包含することを特徴としている。
　後述する実施例に示すように、表２に記載の遺伝子に対するｓｉＲＮＡを用いることによって間葉系幹細胞の自己複製能を抑制することができる。よって、正常な間葉系幹細胞様の細胞を用いれば、間葉系幹細胞の自己複製能を抑制する因子をスクリーニングし得、また、自己複製能を抑制させた間葉系幹細胞を用いれば、抑制された自己複製能を補完し得る因子（すなわち、自己複製能を活性化する因子）をスクリーニングし得る。
　本発明は、間葉系幹細胞の分化能を制御する因子をスクリーニングする方法を提供する。本発明にかかるスクリーニング方法は、候補物質の存在下にて培養した目的の細胞において、表２に記載の遺伝子の少なくとも１つの発現を検出する工程を包含することを特徴としている。
　後述する実施例にて示すように、表２に記載の遺伝子に対するｓｉＲＮＡを用いることによって間葉系幹細胞の分化能を抑制することができる。よって、正常な間葉系幹細胞様の細胞を用いれば、間葉系幹細胞の分化能を抑制する因子をスクリーニングし得、また、分化能を抑制させた間葉系幹細胞を用いれば、抑制された分化能を補完し得る因子（すなわち、分化能を活性化する因子）をスクリーニングし得る。
　本発明の他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分分かるであろう。また、本発明の利点は、添付図面を参照した次の説明によって明白になるであろう。
ＭＳＣに特徴的な遺伝子についての、ＤＮＡマイクロアレイ分析およびリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ分析の結果の比較を示す図である。 骨分化誘導培地（ＯＰ）、軟骨分化誘導培地（ＣＰ）、脂肪分化誘導培地（ＡＰ）、または分化因子を含まない培地（Ｍ）中での培養２４時間後の、３つのＭＳＣ株を用いたリアルタイムＲＴ－ＰＣＲによって決定されたｍＲＮＡ発現レベルを示す図である。図中、ＭはＭＳＣ、ＯＰは骨前駆細胞、ＣＰは軟骨前駆細胞、ＡＰは脂肪前駆細胞、Ｏは骨芽細胞、Ｃは軟骨細胞、Ａは脂肪細胞を示す。 骨分化誘導培地（ＯＰ）、軟骨分化誘導培地（ＣＰ）、脂肪分化誘導培地（ＡＰ）、または分化因子を含まない培地（Ｍ）中での培養２４時間後の、ＭＳＣに特徴的な遺伝子の発現低下を示す図であり、２４時間培養後に有意に発現低下した遺伝子の割合を分類している。 骨分化誘導培地（ＯＰ）、軟骨分化誘導培地（ＣＰ）、脂肪分化誘導培地（ＡＰ）、または分化因子を含まない培地（Ｍ）中での培養２４時間または２８日間後の、骨芽細胞に特徴的な遺伝子（アルカリファオスファターゼおよびＰＴＨレセプター）、軟骨細胞に特徴的な遺伝子（アグリカンおよびタイプ２コラーゲン）、脂肪細胞に特徴的な遺伝子（ＰＰＡＲγおよびＣ／ＥＢＰα）の組織特異的な遺伝子発現を、３つの株を用いたリアルタイムＲＴ－ＰＣＲによって決定したｍＲＮＡレベルを示す図である。図中、ＭはＭＳＣ、ＯＰは骨前駆細胞、ＣＰは軟骨前駆細胞、ＡＰは脂肪前駆細胞、Ｏは骨芽細胞、Ｃは軟骨細胞、Ａは脂肪細胞を示す。 骨髄ＭＳＣ、滑膜線維芽細胞および皮膚線維芽細胞の増殖に対するＧＡＴＡ６　ｓｉＲＮＡの影響を調べた結果を示す図である。 骨髄ＭＳＣの骨分化中におけるアルカリホスファターゼ活性の上昇に対するＭＳＣに特徴的な転写因子のｓｉＲＮＡの影響を調べた結果を示す図である。 骨髄ＭＳＣの脂肪分化中におけるＧＰＤＨ活性の上昇に対するＭＳＣに特徴的な転写因子のｓｉＲＮＡが与える影響を調べた結果を示す図である。 抗ＧＡＴＡ６抗体および抗ＬＩＦ抗体を用いた、成熟マウスの上腕骨内ＭＳＣに対する免疫組織化学の結果を示す図である。 非接着性の骨髄細胞内には、存在するＭＳＣに特徴的な遺伝子転写物が欠損していることを調べた結果を示す図である。 ＭＳＣに特徴的な分子に対する抗体の種々の組合せを用いた、成熟マウスの上腕骨の骨髄内ＭＳＣ様細胞の二重染色の結果を示す図である。 上腕骨の軟骨膜に存在するＭＳＣに特徴的な分子の発現を示す図である。 上腕骨の骨膜に存在するＭＳＣに特徴的な分子の発現を示す図である。 ヨード酢酸の投与による関節症の発症およびＭＳＣのＳＴＥＭＮＥＳＳに関わる遺伝子の誘導を示す図である。 ヒト歯肉に由来する線維芽細胞から作製された誘導性間葉系幹細胞を示す図である。 ヒト歯髄に由来する線維芽細胞から作製された誘導性間葉系幹細胞を示す図である。 ヒト歯髄に由来する線維芽細胞から誘導した誘導性間葉系幹細胞の骨分化能を示す図である。
　幹細胞は、自己複製能（self-renewal）および多分化能（multi-potency）という２つの際立った特徴（ＳＴＥＭＮＥＳＳ）を有している。近年、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）のＳＴＥＭＮＥＳＳを制御する、あるいはＳＴＥＭＮＥＳＳ状態へのリプログラミングを誘導する転写因子が同定されて、これに基づいてｉＰＳ細胞が作製された。本発明者らは、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）のＳＴＥＭＮＥＳＳを制御する因子を同定し、本発明を完成するに至った。
　本発明者らによって同定された、ＭＳＣのＳＴＥＭＮＥＳＳを制御する因子は、表２に示される９種類の転写因子である。これらの転写因子は、ＭＳＣにおいて選択的に発現しており、これらの転写因子に対するｓｉＲＮＡは、ＭＳＣの自己複製能および多分化能を低下させた。また、ＭＳＣ独自の遺伝子発現パターンを維持するためにも、これら９種類の転写因子が必須であることを見出した。
　なお、本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。本発明にかかるポリペプチドはまた、天然供給源より単離されても、組換え生成されても、化学合成されてもよい。また、本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。また、「遺伝子」には、ＤＮＡのみならず、ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）をも含む意味である。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「遺伝子配列」、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。
　〔１．誘導性間葉系幹細胞およびその作製方法〕
　本発明は、誘導性間葉系幹細胞を作製する方法を提供する。本発明にかかる作製方法は、上述した９種類の転写因子の遺伝子を細胞に導入する工程を包含する方法である。上記転写因子に関する情報は、表２に示されており、表２に記載のアクセッション番号を参照することによって、当業者は本発明に必要な遺伝子配列を入手し得る。導入される遺伝子は、表２に記載のいずれか１つであってもよいが、３つ以上であることが好ましく、５つ以下であることがより好ましい。
　本明細書中にて使用される場合、用語「誘導性間葉系幹細胞」は、間葉系幹細胞のＳＴＥＭＮＥＳＳ状態へのリプログラミングを誘導する因子を用いて、細胞から誘導された細胞が意図され、Induced progenitor of mesenchyme （ｉＰＭ）細胞ともいう。本発明者らによって見出された、間葉系幹細胞のＳＴＥＭＮＥＳＳを制御する因子は、間葉系幹細胞のＳＴＥＭＮＥＳＳ状態へのリプログラミングを誘導する因子でもあり得る。
　間葉系幹細胞への誘導に用いられる細胞としては、特に限定されず、ＥＳ細胞および体性幹細胞を含む、あらゆる細胞が利用可能である。例えば、線維芽細胞、細網細胞、脂肪細胞、マクロファージ（組織球または大食細胞）、肥満細胞、形質細胞、リンパ球、上皮細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞が、本発明に利用可能な細胞として挙げられ、特に、線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞および脂肪細胞が好ましい。また、生体から調製された初代培養細胞でも、樹立された細胞株であってもよく、神経細胞、肝細胞等の組織由来の細胞であってもよい。
　ｉＰＭ細胞は、以下の点でネイティブなＭＳＣよりも有利である：（１）増殖能および分化能が非常に高い；（２）種々の疾患（心筋梗塞、脳梗塞、肝炎、肺繊維症など）に適用可能である；（３）重症患者であっても口腔粘膜細胞などから調製可能である；（４）患者の細胞を用いるので、間葉系の罹患組織を試験管内で再構築することが容易である。
　ｉＰＳ細胞と同様に、ｉＰＭ細胞は、以下の点でＥＳ細胞よりも有利である：（１）自家細胞から作製し得るので免疫拒絶反応が回避可能である；（２）ヒト胚を利用しないので倫理的問題を有していない。
　また、ｉＰＭ細胞は、以下の点でｉＰＳ細胞よりも有利である：（１）癌化しにくい（リプログラミングによる初期化過程は癌化過程と一部共通するメカニズムを使用する。また、初期化は不完全になりやすい。）；（２）細胞作製の効率が高い；（３）薬剤法での誘導が可能である；（４）分化効率が高く、最終目的細胞の調製が容易かつ単純である。
　さらに、本発明者らによって得られた知見に基づけば、ｉＰＭ細胞の作製は、ｉＰＳ細胞の作製と比較して以下の点で有利である：（１）癌遺伝子を必須としない；（２）目的遺伝子の転写を直接促進する；（３）染色体構造改変が最少である；（４）誘導に要する期間が短い；（５）誘導効率が高い；（６）細胞集団が不均質になりにくい。
　例えば、上記転写因子の遺伝子を線維芽細胞に導入する（例えばTet-on Gene Expression System; Clontechを用いる）。複数の遺伝子を導入する際には、別々に導入してもよいが、当該分野で公知の手法（例えばGateway（登録商標）マルチサイトシステム（Invitrogen））を用いて同時に導入することが好ましい。遺伝子導入された細胞は、例えば薬剤耐性マーカーを用いて導入を確認する。導入後の培養は、ｉＰＭの増殖を選択的に促進する条件下で行われることが好ましい。これにより、線維芽細胞の増殖が抑制される。なお、間葉系幹細胞選択的な無血清培地（例えばSTK2; Two-Cells）を用いることが好ましいが、これに限定されない。また、人工マトリックス上で培養することが好ましいが、これに限定されない。培養後の細胞コロニーを回収し、ＭＳＣマーカーが誘導されていること、および線維芽細胞のマーカーが抑制されていることを、確認する。用いるＭＳＣマーカーとしては、上記転写因子が好ましいが、これらに限定されず、例えば、特許文献３に記載の遺伝子であってもよい。このように取得されたｉＰＭ細胞は自己複製能および分化能を獲得しているが、分化用の各種誘導培地を用いて目的の細胞に分化することを確認することが好ましい。また、遺伝子ではなく目的タンパク質を細胞に導入する方法を用いてもよい。
　本発明にかかる作製方法は、誘導性間葉系幹細胞の誘導に好適な因子を培地に添加する工程をさらに包含することが好ましい。上記因子は、培養培地に添加される種々の増殖因子等（例えば表５に記載の因子）であっても、後述するスクリーニング方法によって得られる因子（細胞を間葉系幹細胞様の細胞に誘導する因子）であってもよい。
　また、本発明は、上記作製方法に利用可能なキットを提供する。本発明にかかるキットは、（ａ）表２に記載のアクセッション番号のいずれか１つに示される塩基配列またはその相補配列を有するポリヌクレオチド；（ｂ）上記（ａ）のフラグメントであるポリヌクレオチド；および、（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、からなる群より選択されるポリヌクレオチドの１つ以上を備えていることを特徴としている。このように特定されたポリヌクレオチドを備えているキットを、当該分野における周知の遺伝子導入技術と組み合わせて用いることにより、当業者は、上記ポリヌクレオチドを標的細胞の遺伝子に導入して誘導性間葉系幹細胞を作製することができる。
　本発明はまた、誘導性間葉系幹細胞を作製するさらなる方法を提供する。本発明にかかる作製方法は、細胞を脱分化条件下にて長期間培養する工程、および培養後の細胞を、間葉系幹細胞選択的な無血清培地を用いて人工マトリックス上でさらに培養する工程を包含する方法である。本明細書中にて使用される場合、「脱分化条件」は、培養系にて分化細胞を脱分化させるための条件であり、具体的には、分化の維持に必要な細胞外マトリックス、増殖因子、サイトカインなどを、培地および培養皿から除去した条件下にて細胞を培養することが意図される。なお、除去されるべき細胞外マトリックス、増殖因子、サイトカインなどは、用いられる細胞の系統ごとによってその組合せが異なる。したがって、成分が未知である血清を使用しないことが望ましく、無血清培地に生存因子および増殖因子を添加し、かつ分化維持に関わる因子を除くべきである。脱分化した細胞を幹細胞へと積極的に変化させるには、ＭＳＣのＳＴＥＭＮＥＳＳを促進する因子（増殖因子、サイトカイン、細胞外マトリックスなど）を、上記の無血清培地に添加する。細胞を脱分化条件下にて培養する期間は細胞や薬剤によって異なり、１週間～３週間が好ましいが、１週間以内であってもよい。
　脱分化条件下にて長期間培養された細胞（例えば、体細胞）はＭＳＣ様細胞に誘導される。このような細胞を間葉系幹細胞の増殖を選択的に促進する条件下で培養することによって、誘導性間葉系幹細胞を首尾よく作製し得る。間葉系幹細胞の増殖を選択的に促進する条件については上述したとおりであり、体細胞（例えば線維芽細胞）の増殖を抑制するために、間葉系幹細胞選択的な無血清培地を用い、人工マトリックス上で培養することが好ましい。
　本発明にかかる作製方法もまた、誘導性間葉系幹細胞の誘導に好適な因子を培地に添加する工程をさらに包含することが好ましい。上記因子は、培養培地に添加される種々の増殖因子等（例えば表５に記載の因子）であっても、後述するスクリーニング方法によって得られる因子（細胞を間葉系幹細胞様の細胞に誘導する因子）であってもよい。
　後述する実施例にて示すように、本発明者らは誘導性間葉系幹細胞を作製した。この作製された細胞が確かに誘導性間葉系幹細胞であることを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。
　誘導性間葉系幹細胞を用いれば、疾患解析系（疾患モデル）を開発することができる。例えば、遺伝性疾患の患者の線維芽細胞から作製した誘導性間葉系幹細胞を、試験管内で分化を誘導することによって、疾患発症メカニズムの解析および治療薬のスクリーニングに利用することができる。間葉系幹細胞に関するこれまでの知見に基づけば、骨軟骨筋肉系疾患、心臓病、腎臓疾患、血管病、肝臓・肺繊維症、神経系疾患などの疾患を対象とし得る。
　〔２．誘導性間葉系幹細胞の検出〕
　本発明は、誘導性間葉系幹細胞を検出する方法を提供する。本発明にかかる検出方法は、上述した９種類の転写因子の遺伝子の少なくとも１つの発現を検出する工程を包含する方法である。上述したように、上記転写因子に関する情報は、表２に示されており、表２に記載のアクセッション番号を参照することによって、当業者は本発明に必要な遺伝子配列を入手し得る。導入される遺伝子は、表２に記載のいずれか１つであってもよいが、３つ以上であることが好ましく、全てであることが最も好ましい。上記遺伝子は、誘導性間葉系幹細胞の検出マーカーとして利用可能である。また、上記遺伝子またはそのフラグメントは、誘導性間葉系幹細胞を検出するためのプローブやマイクロアレイに利用可能である。
　本発明にかかる誘導性間葉系幹細胞の検出方法（以下、「本発明の検出方法」という）は、表２に記載の遺伝子の少なくとも１つを検出マーカーとして用い、被検細胞において、当該検出マーカーの発現を検出する工程を含む方法といえる。本発明の検出方法は、上記の工程が含まれていればよく、その他の工程、条件、使用材料、使用機器等の具体的な構成については特に限定されない。
　本発明の検出方法において使用する「被検細胞」は、本発明の検出方法が適用され得る細胞であれば特に限定されない。例えば、誘導性間葉系幹細胞が含まれている、または誘導性間葉系幹細胞が含まれている可能性がある、体細胞由来の細胞集団が挙げられる。
　表２に記載の遺伝子は、ＭＳＣにおいて選択的に発現が亢進されている遺伝子である。すなわち、当該遺伝子は、体細胞（例えば、線維芽細胞（ＦＢ）、骨芽細胞（ＯＳ）、軟骨細胞（ＣＨ）および脂肪細胞（ＡＤ））におけるその発現量が相対的に低く、かつＭＳＣにおけるその発現量が相対的に高い遺伝子であるといえる。
　したがって、誘導性間葉系幹細胞を作製すべく誘導処理を行った体細胞由来の細胞集団において、表２に記載された遺伝子の発現を検出し、誘導処理の前後でその発現量が増加したことが検出されれば、当該被検細胞は誘導性間葉系幹細胞を含む細胞であるということが判断できる。よって、表２に記載された遺伝子の発現量の変動を確認するのみでは、被検細胞が誘導性間葉系幹細胞であるか否かを識別することはできないが、少なくとも被検細胞が誘導性間葉系幹細胞を含んでいることを判断することができる。つまり、表２に記載された遺伝子は誘導性間葉系幹細胞を検出するための検出マーカーとして利用され得るということである。
　すなわち、表２に記載された遺伝子は、ＦＢ、ＯＳ、ＣＨ、ＡＤなどの細胞以外にＭＳＣが含まれている細胞集団であっても、誘導処理によって誘導性間葉系幹細胞が誘導されたか否かを識別する際に用いられ得る。
　本発明の検出方法においては、表２に記載されている遺伝子のうち１つ以上を検出することにより本発明の目的を達成し得るが、２つ以上の遺伝子を適宜組み合わせて検出することが好ましい。２つ以上の遺伝子を検出することによって、検出精度を向上させることができる。
　なお、上記転写因子を有する細胞の局在については、従来公知の免疫組織化学の手法、例えばデュアル免疫蛍光ラベリング等の蛍光抗体法や酵素抗体法を用いて確認することができる。
　上述したように、表２に記載された遺伝子は、誘導性間葉系幹細胞の検出マーカーとして利用可能である。上記検出マーカーの遺伝子の発現を検出する際には、遺伝子の発現の検出に用いられる従来公知の方法を好適に用いることができる。例えば、上記検出マーカーの遺伝子の発現を検出するために、ノーザンブロッティング法を用いることができる。また、上記検出マーカーの遺伝子の発現を検出するために、表２に記載された遺伝子の全長またはその断片（フラグメント）とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、上記遺伝子全長またはその一部を検出し得る塩基配列を有する検出用プローブを用いることができる。
　上記検出用プローブを用いる誘導性間葉系幹細胞における遺伝子の発現検出は、公知の方法を用いて適宜実施することができる。例えば、本発明における検出マーカーの遺伝子の公知の塩基配列から、ＤＮＡプローブとして適当な長さのＤＮＡプローブを作製し、蛍光標識等の標識を適宜付与しておき、これを被検細胞とハイブリダイズさせることにより、誘導性間葉系幹細胞の検出を行い得る。また上記検出用プローブとしては、本発明における検出マーカーの遺伝子のアンチセンス鎖の全長配列または部分配列からなる検出用のプローブも採用し得る。
　すなわち、本発明は、上記検出方法に利用可能なキットを提供する。本発明にかかる検出用キットは、（ａ）表２に記載のアクセッション番号のいずれか１つに示される塩基配列またはその相補配列を有するポリヌクレオチド；（ｂ）上記（ａ）のフラグメントであるポリヌクレオチド；および、（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、からなる群より選択されるポリヌクレオチドの１つ以上を備えていることを特徴としている。
　上記検出用プローブの作製に際して、検出マーカーの遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、および１×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム）、０．１％のＳＤＳ（Sodium dodecyl sulfate）を含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、より好適には、６５℃でのハイブリダイゼーション、および０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理を挙げることができる。
　なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば種々の要素を組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
　また、被検細胞における検出マーカーの遺伝子の発現を検出するに際しては、被検細胞の遺伝子を増幅するために、定量的または半定量的ＰＣＲを用いることができる。上記定量的または半定量的ＰＣＲとしては、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）を用いることができる。上記定量的または半定量的ＰＣＲを行うに際しては、本発明における検出マーカーの遺伝子を増幅するためのセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーからなる１対のプライマーセットを用いる。
　また、本発明の検出方法は、インベーダ（Invader（登録商標））法を利用して簡便に行うこともできる。例えば、上述の検出マーカーの遺伝子に特異的にハイブリダイズする塩基配列と酵素切断部位とを有するシグナルプローブを設計し、被検細胞から抽出したトータルＲＮＡ（ｃＤＮＡでも構わない）、インベーダオリゴ（Invader（登録商標） Oligo）、クリベース酵素（Cleavase（登録商標） Enzyme）、およびフレットプローブ（FRET Probe）とともに所定の温度、所定の時間（例えば、６３℃、２時間等）反応させることにより行うことができる。なお、具体的な実験手法や条件については、下記参考文献を参照して適宜行うことができる（参考文献：(i) T. J. Griffin et al., Proc Natl Acad Sci U S A 96, 6301-6 (1999) 、(ii) M. W. Kaiser et al., J Biol Chem 274, 21387-94 (1999) 、(iii) V. Lyamichev et al., Nat Biotechnol 17, 292-6 (1999) 、(iv) R. W. Kwiatkowski et al., Mol Diagn 4, 353-64 (1999) 、(v) J. G. Hall et al., Proc Natl Acad Sci U S A 97, 8272-7 (2000) 、(vi) M. Nagano et al., J Lipid Res 43, 1011-8 (2002) 等参照）。
　上記のように、インベーダ法を利用すれば、遺伝子増幅の必要がない場合もあり、迅速かつ低コストで行うことができる。なお、市販のインベーダ法キットを利用すれば、より一層簡便に本発明を実施できる。
　また、in situハイブリダイゼーションを用いて、本発明の検出方法を行うこともできる。例えば、上述の検出マーカーまたはその部分配列を標識したものを検出用プローブとして用い、スライドグラス上の被検細胞の標本に直接分子雑種を形成させて、その部分を検出することにより簡易に行うことができる。具体的には、スライドグラス上に被検細胞の薄切片（パラフィン切片、凍結切片など）を調製し、これに標識した検出用プローブをハイブリダイズさせ、ノーザンハイブリダイゼーション法と同じように、検出用プローブを洗い落とし、写真用エマルジョンを塗布し、露光する。現像後、銀粒子の分布から、ハイブリダイズした場所を特定する。より具体的な実験手法や条件については、下記参考文献を用いて適宜行うことができる（参考文献：(i)「in situハイブリダイゼーション法」、（1995年７月）、古庄敏行、井村裕夫監修、金原出版（株）発行、932頁～937頁、(ii)「in situハイブリダイゼーションによる遺伝子発現の解析」、「遺伝子工学実験」、（1991年５月）、野村慎太郎著、（社）日本アイソトープ協会発行、221頁～232頁等参照）。
　in situハイブリダイゼーション法には、ラジオアイソトープ（主として35S）標識したＤＮＡを検出用プローブとして、その座位をオートラジオグラフィーで検出する方法と、標識された検出用プローブの蛍光シグナルを蛍光顕微鏡下で検出する方法があるが、いずれの方法を用いてもよい。
　他方、上記検出用キット以外によっても、本発明の検出方法を実行し得る。例えば、誘導性間葉系幹細胞の検出用マイクロアレイを用いて検出マーカーの遺伝子の発現を検出することができる。
　すなわち、本発明は、上記検出方法に利用可能なマイクロアレイを提供する。本発明にかかる検出用マイクロアレイは、（ａ）表２に記載のアクセッション番号のいずれか１つに示される塩基配列またはその相補配列を有するポリヌクレオチド；（ｂ）上記（ａ）のフラグメントであるポリヌクレオチド；および、（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、からなる群より選択されるポリヌクレオチドの１つ以上が固定化されていることを特徴としている。
　上記検出マーカーの遺伝子の部分塩基配列からなるポリヌクレオチドのサイズは、当該ポリヌクレオチドも用いてマイクロアレイを構成した場合に、目的とする検出マーカーの遺伝子が検出し得るサイズであれば特に限定されない。
　上記マイクロアレイとしては、例えば、米国Affymetrix社のＤＮＡマイクロアレイやスタンフォード（Stanford）型のＤＮＡマイクロアレイ等、その他半導体製造で用いられる微細加工技術を用いてシリカ基板上に直接オリゴヌクレオチドを化学合成するＤＮＡマイクロアレイを含む従来公知のあらゆるタイプのマイクロアレイを好適に用いることができ、その具体的な大きさ、形状、システム等については特に限定されない。上記検出用マイクロアレイは、本発明の検出方法の実施に利用されるものであり、本発明が意図する範囲に含まれる。
　上述した検出用マイクロアレイは、少なくとも一つの遺伝子を検出することができるように構成されていれば、本発明の目的を達成し得るが、多数の検出マーカーの遺伝子群の発現を網羅的かつ体系的に解析できるとの理由により、２つ以上の遺伝子、より好ましくはできるだけ多数の遺伝子を検出し得るように構成されていることが好ましい。誘導性間葉系幹細胞であるか否かを非常に簡便かつ精度よく識別できるようになるからである。
　また、誘導性間葉系幹細胞の検出用マイクロアレイには、表２に記載された誘導性間葉系幹細胞のマーカーのみならず、その他の分子マーカーが固定化されていてもよい。例えば、特許文献３に開示されているＭＳＣ検出用遺伝子分子マーカー、「Ishii,M., Koike,C., Igarashi,A., Yamanaka,K., Pan,H., Higashi,Y., Kawaguchi,H., Sugiyama,M., Kamata,N., Iwata,T., Matsubara,T., Nakamura,K., Kurihara, H., Tsuji,K., and Kato,Y. Molecular Markers Distinguish Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells from Fibroblasts. Biochem Biophys Res Commun.332(1),297-303,2005.」に開示されている分子マーカー、等が挙げられる。
　上述したように、表２に記載された遺伝子は、誘導性間葉系幹細胞の検出マーカーとして利用可能である。このことは、当該遺伝子がコードするタンパク質の発現を指標にして検出マーカーの遺伝子の発現を検出し得ることを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。すなわち、表２に記載された遺伝子にコードされるポリペプチドもまた、本発明における検出マーカーであり得る。この場合、目的のタンパク質を、例えば組換えによって生成し、このタンパク質と特異的に結合する抗体を作製し、当該抗体を用いて、後述する公知の方法に従って当該タンパク質の発現量を検出すればよい。
　すなわち、本発明は、上記検出方法に利用可能なさらなるキットを提供する。本発明にかかる検出用キットは、表２に記載の遺伝子にコードされるポリペプチドと特異的に結合する抗体を備えていることを特徴としている。なお、上記抗体は、上記ポリペプチドによって惹起される抗体ともいえる。
　上述したように、表２に記載の遺伝子は、ＭＳＣにおいてその発現が亢進している。よって、上記遺伝子にコードされるポリペプチドに対する抗体は、誘導性間葉系幹細胞を首尾よく検出し得る。
　上記抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体であってもよい。上記抗体の作製は、例えば、表２に記載された遺伝子がコードするポリペプチドの全長またはその部分断片を抗原として、従来公知の常法により作製することができる。上記ポリペプチドの部分断片は、免疫原性を有するものであればよい。
　例えば、モノクローナル抗体を生産する方法としては、特に限定されず、例えば、抗原でマウスを免疫した後、そのマウス脾臓リンパ球とマウス由来のミエローマ細胞とを融合させてなる抗体産生ハイブリドーマにより、モノクローナル抗体を得ればよい。ハイブリドーマの生産方法は、従来公知の方法、例えば、ハイブリドーマ法（Kohler, G. and Milstein, C., Nature 256, 495-497(1975)）、トリオーマ法、ヒトＢ－細胞ハイブリドーマ法（Kozbor, Immunology Today 4, 72(1983)）、およびＥＢＶ－ハイブリドーマ法（Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss, Inc., 77-96(1985)）等を利用することが可能であり、特に限定されない。
　また、上記抗原としては、ポリペプチドであれば特に限定されないが、抗原決定基とする物質をキャリアタンパク質に結合してなる抗原タンパク質が用いられてもよい。具体的には、上記抗原がハプテンであれば、抗体の産生等を誘導する能力をもたないため、抗体を産生することができないが、抗原を異種由来のタンパク質などの生体高分子からなる担体と共有結合させて抗原タンパク質を得て、これで免疫すれば、抗体産生を誘導することができる。上記担体としては、特に限定されず、オボアルブミン、γグロブリン、ヘモシアニン等、この分野で従来公知の各種タンパク質を好適に用いることができる。また、モノクローナル抗体は遺伝子組換え技術等によっても生産できる。
　また、ポリクローナル抗体を生産する方法としては、実験動物に抗原を接種・感作させ、その体液から抗体成分を精製して取得する方法を挙げることができる。なお、免疫させる動物としては、マウス、ラット、ウサギ、サル、ウマ等の従来公知の実験動物を用いることができ、特に限定されない。また、抗原を接種し感作させる場合、その間隔や量についても常法にしたがって適宜行うことができる。
　さらに、本発明の抗体を用いて、被検細胞における検出マーカーのタンパク質の発現を検出するには、公知の抗体を用いた免疫学的測定法を用いて実施することができる。上記免疫学的測定法としては、例えばＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法等の公知の免疫学的測定法を挙げることができる。また、上述した以外にも、例えば、ウェスタンブロッティング法、酵素免疫測定法、抗体による凝集や沈降や溶血反応を観察する方法、組織免疫染色や細胞免疫染色などの形態学的検出法も必要に応じて利用することができる。
　〔３．細胞を誘導性間葉系幹細胞に誘導する因子のスクリーニング〕
　本発明は、細胞を誘導性間葉系幹細胞に誘導する因子をスクリーニングする方法を提供する。上述したように、表２に記載の遺伝子は、本発明者らによって見出されたＭＳＣのＳＴＥＭＮＥＳＳを制御する因子であり、ＭＳＣにおいて選択的に発現が亢進されている遺伝子である。よって、候補物質の存在下にて培養した細胞における表２に記載の遺伝子の発現量が、候補物質の非存在下と比較して増加した場合、またはＭＳＣにおける発現量に匹敵する場合、その候補因子は、細胞を誘導性間葉系幹細胞に誘導する因子であり得る。
　すなわち、本発明にかかるスクリーニング方法は、候補物質の存在下にて培養した細胞において、表２に記載の遺伝子の少なくとも１つの発現を検出する工程を包含することを特徴としている。一実施形態において、本発明にかかるスクリーニング方法は、上記細胞にて検出した遺伝子の、候補物質の非存在下にて培養した細胞における発現を検出する工程をさらに包含することが好ましい。別の実施形態において、本発明にかかるスクリーニング方法は、上記細胞にて検出した遺伝子の、ＭＳＣにおける発現を検出する工程をさらに包含することが好ましい。なお、各遺伝子のＭＳＣにおける発現はデータとして予め蓄積されていてもよい。上述したように、表２に記載の遺伝子は、ＭＳＣにおいてその発現が亢進している。よって、上記遺伝子は、候補物質の存在下にて培養した細胞が誘導性間葉系幹細胞に誘導されたか否かを知る指標となり得る。
　本方法に適用される候補物質は、核酸、ペプチド、タンパク質、有機化合物、無機化合物のいずれであってもよい。核酸を候補物質として存在させる場合には、用いる細胞に導入し、導入前後における、表２に記載の遺伝子の発現量の変動を確認すればよい。また、導入後の細胞とＭＳＣとの間で表２に記載の遺伝子の発現量を比較すればよい。ペプチドや化合物を候補物質として存在させる場合には、候補因子を培地に添加し、添加の前後における、表２に記載の遺伝子の発現量の変動を確認すればよい。また、添加後の細胞とＭＳＣとの間で表２に記載の遺伝子の発現量を比較すればよい。
　なお、遺伝子の検出には、上述した検出方法、検出用キット、検出用マイクロアレイを用いればよい。また、遺伝子の発現量を調べるには、当該分野における種々の公知の手法を用いればよく、例えば、後述する実施例に示すようなリアルタイム逆転写ＰＣＲが好適に利用される。
　〔４．間葉系幹細胞の自己複製能を制御する因子のスクリーニング〕
　本発明は、間葉系幹細胞の自己複製能を制御する因子をスクリーニングする方法を提供する。本発明にかかるスクリーニング方法は、候補物質の存在下にて培養した目的の細胞において、表２に記載の遺伝子の少なくとも１つの発現を検出する工程を包含することを特徴としている。
　正常なＭＳＣまたはＭＳＣ様の細胞を用いれば、ＭＳＣの自己複製能を活性化または抑制する因子をスクリーニングし得る。また、後述する実施例に示すように、ＭＳＣにおいて表２に記載の遺伝子をノックダウンすることによってＭＳＣの自己複製能を抑制することができる。よって、自己複製能を抑制させたＭＳＣを用いれば、抑制された自己複製能を補完し得る因子（すなわち、自己複製能を活性化する因子）をスクリーニングし得る。遺伝子のノックダウンには、ｓｉＲＮＡ（short interference RNA, small interfering RNA）が好適に用いられるが、これに限定されず、当該分野における種々の公知の手法が採用され得る。
　ｓｉＲＮＡは、目的の遺伝子の発現をＲＮＡｉの原理によって抑制することができるものであれば、その塩基配列は特に限定されない。本明細書において「ｓｉＲＮＡ」とは、ｓｔＲＮＡ（small temporal RNA）、およびｓｈＲＮＡ（short hairpin RNA）をも含む意味である。またｓｉＲＮＡの塩基配列の設計は発現抑制を所望する遺伝子の塩基配列情報をもとにして、公知の方法によって行われ得る。現在、ｓｉＲＮＡを設計する際に用いられるソフトウェアが市販されており、効率の観点から当該ソフトウェアを用いて設計することが好ましい。市販のソフトウェアとしては、例えばＲＮＡｉ社製（http://www.rnai.co.jp/）のsiDirectＴＭ等が挙げられる。
　上記のようにして設計されたｓｉＲＮＡの合成は、公知の自動ヌクレオチド合成器によって行われ得る。なお現在、ｓｉＲＮＡの設計から合成までを、企業に委託することが可能である。委託先としては、Ambion社、Invitrogen社、QIAGEN社、Dharmacon社等が挙げられる。
　後述する実施例において使用したｓｉＲＮＡの塩基配列は以下の通りである。ＥＴＶ５に対するｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列を配列番号１に示し、アンチセンス鎖の塩基配列を配列番号２に示した。ＨＭＧＡ２に対するｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列を配列番号３に示し、アンチセンス鎖の塩基配列を配列番号４に示した。ＫＬＦ１２に対するｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列を配列番号５に示し、アンチセンス鎖の塩基配列を配列番号６に示した。ＳＩＭ２に対するｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列を配列番号７に示し、アンチセンス鎖の塩基配列を配列番号８に示した。ＳＯＸ１１に対するｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列を配列番号９に示し、アンチセンス鎖の塩基配列を配列番号１０に示した。ＥＴＶ１に対するｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列を配列番号１１に示し、アンチセンス鎖の塩基配列を配列番号１２に示した。ＦＯＸＰ１に対するｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列を配列番号１３に示し、アンチセンス鎖の塩基配列を配列番号１４に示した。ＰＲＤＭ１６に対するｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列を配列番号１５に示し、アンチセンス鎖の塩基配列を配列番号１６に示した。ＧＡＴＡ６に対するｓｉＲＮＡのセンス鎖の塩基配列を配列番号１７に示し、アンチセンス鎖の塩基配列を配列番号１８に示した。
　本方法に適用される候補物質は、核酸、ペプチド、タンパク質、有機化合物、無機化合物のいずれであってもよい。核酸を候補物質として存在させる場合には、用いる細胞に導入し、導入前後における、表２に記載の遺伝子の発現量の変動を確認すればよい。また、導入後の細胞と無処置の正常ＭＳＣとの間で表２に記載の遺伝子の発現量を比較すればよい。ペプチドや化合物を候補物質として存在させる場合には、候補因子を培地に添加し、添加の前後における、表２に記載の遺伝子の発現量の変動を確認すればよい。また、添加後の細胞と無処置の正常ＭＳＣとの間で表２に記載の遺伝子の発現量を比較すればよい。
　なお、遺伝子の検出には、上述した検出方法、検出用キット、検出用マイクロアレイを用いればよい。また、遺伝子の発現量を調べるには、当該分野における種々の公知の手法を用いればよく、例えば、後述する実施例に示すようなリアルタイム逆転写ＰＣＲが好適に利用される。
　〔５．間葉系幹細胞の分化能を制御する因子のスクリーニング〕
　本発明は、間葉系幹細胞の分化能を制御する因子をスクリーニングする方法を提供する。本発明にかかるスクリーニング方法は、候補物質の存在下にて培養した目的の細胞において、表２に記載の遺伝子の少なくとも１つの発現を検出する工程を包含することを特徴としている。
　正常なＭＳＣまたはＭＳＣ様の細胞を用いれば、ＭＳＣの分化能を活性化または抑制する因子をスクリーニングし得る。また、後述する実施例に示すように、ＭＳＣにおいて表２に記載の遺伝子をノックダウンすることによってＭＳＣの分化能を抑制することができる。よって、分化能を抑制させたＭＳＣを用いれば、抑制された分化能を補完し得る因子（すなわち、分化能を活性化する因子）をスクリーニングし得る。上述したように、遺伝子のノックダウンには、ｓｉＲＮＡが好適に用いられるが、これに限定されず、当該分野における種々の公知の手法が採用され得る。
　本方法に適用される候補物質もまた、核酸、ペプチド、タンパク質、有機化合物、無機化合物のいずれであってもよい。核酸を候補物質として存在させる場合には、用いる細胞に導入し、導入前後における、表２に記載の遺伝子の発現量の変動を確認すればよい。また、導入後の細胞と無処置の正常ＭＳＣとの間で表２に記載の遺伝子の発現量を比較すればよい。ペプチドや化合物を候補物質として存在させる場合には、候補因子を培地に添加し、添加の前後における、表２に記載の遺伝子の発現量の変動を確認すればよい。また、添加後の細胞と無処置の正常ＭＳＣとの間で表２に記載の遺伝子の発現量を比較すればよい。
　なお、遺伝子の検出には、上述した検出方法、検出用キット、検出用マイクロアレイを用いればよい。また、遺伝子の発現量を調べるには、当該分野における種々の公知の手法を用いればよく、例えば、後述する実施例に示すようなリアルタイム逆転写ＰＣＲが好適に利用される。
　本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
　本発明について、以下の実施例に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されない。
　〔１：手順〕
　〔１－１：細胞培養〕
　ヒト腸骨由来のＭＳＣを、BioWhittaker Inc（Walkersville, MD）から購入した。あるいは、広島大学での倫理的委員会によって認可されたプロトコールに従って腸骨稜から調製した。ヒトの皮膚の線維芽細胞を、クラボウ（Osaka, Japan）から購入し、ヒトの歯肉の線維芽細胞を、公知の手順に従って単離した。ヒトの変形性関節炎の滑膜線維芽細胞を、Cell Applications Inc（SanDiego, California）から購入した。ＭＳＣ培養液の調製および骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞への分化を、公知の手順に従った。間葉系幹細胞を増幅させるためにＦＧＦ－２を１ｎｇ／ｍＬで使用した。遺伝子発現上でのＦＧＦの直接的な作用を避けるため、ＦＧＦをＲＮＡ分離の７２時間前に間葉系幹細胞および線維芽細胞の培養液から除去した。
　〔１－２：ＤＮＡマイクロアレイ分析〕
　全ＲＮＡを、３株の間葉系幹細胞（６～９継代）、３株の線維芽細胞（７～１４継代）、２８日間分化誘導培養液で培養した３株の間葉系幹細胞、変形性関節炎の滑膜に由来する３株のＭＳＣの、コンフルエントの培養物から、RNeasy Miniキット（Qiagen, Chatsworth, CA）を使用して単離した。ＤＮＡマイクロアレイ分析を、３８５００遺伝子、４７０００転写物変異体、５４０００プローブ（Affymetrix Inc.）を含むヒトゲノムU133 plus 2.0チップを用いたクラボウ遺伝子チップ分析サービスによって行った。生データ（マイクロアレイスイートversion 5.0, SF = 1; Affymetrix Inc.）を、GeneSpring（Silicon Genetics,Rodwood City ,LA）を使用してglobal median normalization法に従って標準化した。標準化は、フラッグ値によって制限され、中央値はpresentまたはmarginalの範囲以上の遺伝子を使って算出された。２倍以上の増減で基準化された強度での遺伝子のふるい分けを、分化前後の発現プロファイル遺伝子リストを作成するために使用した。生データをGEO（GSE9451）に登録した。
　〔１－３：リアルタイム逆転写ＰＣＲ〕
　リアルタイム逆転写ＰＣＲ分析を、ABI prism 7900HT Sequence Detection System装置、およびソフトウェア（Applied Biosystems Inc、Foster City ,CA）を使用して行った。プライマーおよびプローブを、Applied Biosystems Incから購入した。データを、１８Ｓ　ｒＲＮＡに対して標準化した。
　〔１－４：間葉系幹細胞に特徴的な多数の遺伝子の発現に対する、間葉系幹細胞に特徴的な転写因子のｓｉＲＮＡの効果〕
　ＥＴＶ１、ＥＴＶ５、ＦＯＸＰ１、ＧＡＴＡ６、ＨＭＧＡ２、ＫＬＦ１２、ＰＲＤＭ１６、ＳＩＭ２、およびＳＯＸ１１についてのｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを、それぞれのヌクレオチド配列を標的として設計し、RNAi Co., Ltd.（Tokyo, Japan）にて合成した。ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを、Lipofectamin 2000（Invitrogen）を使用して１０％ウシ胎仔血清存在下で１２ウエルプレート（直径２２ｍｍ）中にて培養した間葉系幹細胞に、製造者の手順に従って形質移入した。形質移入後に、４８時間（ｎ＝２）および７２時間（ｎ＝２）のノックダウンの効果を、リアルタイム逆転写ＰＣＲによって調査した。
　〔１－５：細胞増殖、アルカリホスファターゼ、ＧＰＤＨ、アリザリンレッド染色、オイルレッドＯ染色〕
　間葉系幹細胞、滑膜線維芽細胞、または皮膚線維芽細胞を、２４ウエルの組織培養プレート上で培養し、４０％コンフルエントの段階で、各ｓｉＲＮＡ、またはコントロールｓｉＲＮＡを、Lipofectamin 2000を使用して形質移入した。形質転換細胞を、１０％ウシ胎仔血清含有ＤＭＥＭ培地へ移し、２～６日間インキュベートした。細胞数を、WST-8試薬（生化学工業，Tokyo, Japan）を使用して計数した。分化の際の潜在的なノックダウンの効果を検証するために、４８ウエルの多穴組織培養プレートにて培養した細胞に対して、８０％コンフルエントの段階で、各ｓｉＲＮＡ又はコントロールｓｉＲＮＡをLipofectamin 2000を使用して形質移入した。形質移入の2日後に、培地を、骨形成および脂肪生成の誘導培地に交換した。アルカリホスファターゼ活性およびＧＰＤＨ活性を測定した。
　〔１－６：免疫組織化学的検査〕
　Ｃ５７／ＢＬ／６Ｊマウス(生後０．５～５６日齢)および胎齢１５．５日の妊娠したマウスを用いた。動物を、ペントバルビタールを使用して麻酔し、４％パラホルムアルデヒドを経心的に灌流した後に、複数の臓器および組織を採取した。肢標本を、１０％ＥＤＴＡを用いて４℃で脱灰した。標本をパラフィン包埋し、回転ミクロトーム（HM355,MICROM,ドイツ）を用いて連続切片（厚さ４μｍ）を作製した。免疫組織化学に用いた抗体は以下の通りである：ポリクローナルヤギ抗ヒトＦＬＧ（1:100, sc-25896, Santa Cruz Biotech. USA），モノクローナルマウス抗ヒトＩＧＦＢＰ３（1:500, I4527, Sigma），モノクローナルマウス抗ヒトＶＥＧＦ（1:1000, 05443, Upstate Inc., USA），ポリクローナルウサギ抗ヒトＧＡＴＡ６（1:500, sc-9055, Santa Cruz Biotech），ポリクローナルウサギ抗マウスＴＲＰＣ４（1:2000, ACC018, Alomone Labs Ltd., イスラエル），ポリクローナルウサギ抗ヒトＴＧＭ２（1:10, AB15536, Abcam Ltd., USA），ポリクローナルウサギ抗ヒトＨＴＲ７（1:300, AB5661, Chemicon Int. Inc., USA），ポリクローナルウサギ抗ヒトＡＤＤ３（1:500, sc-25733, Santa Cruz Biotech），モノクローナルマウス抗マウスＭＥＴ（1:500, sc-8057, Santa Cruz Biotech），ポリクローナルヤギ抗ヒトＬＩＦ（1:500, sc-1336, Santa Cruz Biotech）。抗原修復を、１０ｍＭ　ＨＣｌ混和０，１％ペプシン３７℃１０分処理－ＶＥＧＦ、ＧＡＴＡ６，ＴＲＰＣ４，ＨＴＲ７，ＩＧＦＢＰ３，ＦＬＧ，あるいは１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６，０）を用いた９０℃で１０分間のマイクロ波処理（H2800, Energy BeaMSCiences, Inc., USA）－ＴＧＭ２，ＭＥＴ，ＡＤＤ３，ＬＩＦのいずれかで行った。免疫反応性を、Alexa Flour567（５６８ｎｍ，赤）およびAlexa Flour647（６４７ｎｍ，緑）．を併用して可視化した。細胞核を、ＤＡＰＩ（青，S24535, Molecular Probe, USA）を用いて染色した。共焦点の蛍光像を記録した後に、同じ検体をＨＥ染色し、対応した二重免疫陽性細胞の局在を、対応した免疫蛍光およびＨＥ染色された細胞像の重なりによって検証した。二重染色された細胞の発生頻度は３，４画像内にて二重免疫陽性細胞および単陽性細胞を計数して推定した。全ての陽性細胞中における二重免疫陽性細胞の発生頻度を、３段階（高（＞７０％），中（３０－７０％），低（＜３０％））に分類した。同一研究において、免疫反応性を、ＡＢＣ法（ABC Elite kit, Vector, USA）によって発色する3,3′-diaminobenzidine（DAB; SK-4100, Funakoshi, Japan）を用いて可視化した。
　〔２：結果〕
　〔２－１：ＭＳＣに特徴的な遺伝子の同定〕
　ＤＮＡマイクロアレイ分析のために、線維芽細胞が混入していないＭＳＣ株を用いた。全ての調べられた、単一細胞に由来するコロニーの遺伝子発現プロファイルは、親のＭＳＣ集団のプロファイルに類似した。このことは、発生上の不均一性がなかったことを示している。さらに、適切な分化誘導培地にて分化させた骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞を用いた。これらの細胞のほとんどが２１～２８日間以内に分化した。５４６７５個のＤＮＡマイクロアレイプローブ（Affymetrix Inc.）を用いて、ＭＳＣ（Ｍ）、骨芽細胞（Ｏ）、軟骨細胞（Ｃ）、脂肪細胞（Ａ）、および線維芽細胞（Ｆ）における遺伝子発現レベルを比較した。クラスター分析は、３つのＭＳＣ株の遺伝子発現プロファイルが、他の株の一つのプロファイルと互いに似ているが、他の全ての細胞のプロファイルと異なっていることを示した。このことは、ＭＳＣ株の中に、調製物ごとのいくらかの小さな変動を示唆している。これらの条件下で、１４８の遺伝子の発現レベルは、分化した細胞および線維芽細胞よりもＭＳＣにおいて２倍以上高かった（表１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１には、線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞と比較してMSCにおいて選択的に発現される遺伝子群（発現量が２倍以上のもの）を示している（ｎ＝３）。表中に示したMSCに特徴的な遺伝子のいくつかが、変形性関節炎の滑膜線維芽細胞において、線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞の１．５倍以上高い発現レベルを示した（該当する遺伝子を太字で示した。）。また、ケラチン関連遺伝子に下線を付した。
　リアルタイムＲＴ－ＰＣＲを用いて、調べた７１個全ての遺伝子の発現が、様々な分化細胞（Ｏ，Ｃ，Ａのいずれか）および線維芽細胞（Ｆ）と比べてＭＳＣ（Ｍ）では選択的に増強されていることを決定した（図１）。
　ＭＳＣに特徴的な遺伝子のＤＮＡマイクロアレイ分析を、それぞれの細胞種（線維芽細胞（Ｆ）、ＭＳＣ（Ｍ）、骨芽細胞（Ｏ）、軟骨細胞（Ｃ）、脂肪細胞（Ａ））について３株ずつ用いて行った。リアルタイムＲＴ－ＰＣＲを、ＭＳＣ（Ｍ）、骨芽細胞（Ｏ）、軟骨細胞（Ｃ）、脂肪細胞（Ａ）についてはそれぞれ６株、線維芽細胞（Ｆ）については４株を使用して行った。リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによって、１４８個のＭＳＣに特徴的な遺伝子のうち、７１の異なる発現をする遺伝子が確認された。リアルタイムＲＴ－ＰＣＲで決定されたプロファイルを元にしたＭＳＣに特徴的な遺伝子の中に含まれているＶＥＧＦ、およびＭＳＣ／軟骨形成マーカーである白血病抑制因子（ＬＩＦ）についても、併せて示した。値を、３～６ウエルの平均値±標準誤差を示している（一部２ウエルにて評価した。）。
　図１に示すように、ＤＮＡマイクロアレイおよびリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ分析は、これらの遺伝子における類似した発現パターンを示し、再現性があることを示した。また、ＤＮＡマイクロアレイおよびリアルタイムＲＴ－ＰＣＲによって、ポジティブコントロールとしてのＬＩＦがＭＳＣおよび軟骨細胞の両方に高発現していることを示した（図１）。
　ＭＳＣに特徴的な遺伝子が多分化能に関与しているのであれば、それらの遺伝子は他のＭＳＣ様の細胞にも発現している可能性がある。調べた結果、ＭＳＣに特徴的な遺伝子の約５０％（表１における太字）が、実際に皮膚線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞においてよりも変形性関節炎の滑膜線維芽細胞において１．５倍以上高発現していることがわかった。このことは、おそらく変形性関節炎の滑膜線維芽細胞が皮膚線維芽細胞と異なって多分化能を有しているからと考えられる。さらに、変形性関節炎の滑膜線維芽細胞が骨分化や脂肪分化能を有していることを確認した（データは示さず）。ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）およびＭＥＴは、８個のケラチン関連遺伝子（表１における下線）およびケラチン結合タンパク質をコードするＦＬＧとともに、骨髄ＭＳＣにて高発現が示されたが、変形性関節炎の滑膜線維芽細胞では高発現されていなかった。このことは、ＨＧＦ－ＭＥＴ自己分泌ループおよび高ケラチン細胞骨格が骨髄ＭＳＣの特徴であることを示している。
　ＭＳＣに特徴的な遺伝子のいくつかが実際に未分化状態に関連しているのであれば、それらの遺伝子の発現は分化の開始直後に抑制されると考えられる。しかし、実際には、これらの遺伝子（転写因子を含む）の９３％が、骨分化、軟骨分化、脂肪分化の分化誘導培地による培養後２４時間以内に、骨前駆細胞（ＯＰ）、軟骨前駆細胞（ＣＰ）、脂肪前駆細胞（ＡＰ）において発現が低下した（図２（ａ）および図２（ｂ））。同じ２４時間の間に、骨芽細胞に特徴的な遺伝子（アルカリファオスファターゼおよびＰＴＨレセプター）、軟骨細胞に特徴的な遺伝子（アグリカンおよびタイプ２コラーゲン）、脂肪細胞に特徴的な遺伝子（ＰＰＡＲγおよびＣ／ＥＢＰα）のいずれも、その発現が上昇していなかった（図２（ｃ））。これらのことは、ＭＳＣに特徴的な分子のほとんどが前駆細胞において発現しないことを示している。
　なお、図２（ａ）は、３つのＭＳＣ株を用いたリアルタイムＲＴ－ＰＣＲによって決定されたｍＲＮＡ発現レベルを示し、図２（ｂ）は、骨分化誘導培地、軟骨分化誘導培地、脂肪分化誘導培地を用いた培養２４時間後の、７１個のＭＳＣに特徴的な遺伝子の発現低下を示す。調べられた７１個の遺伝子のうち、２４時間培養後に有意に発現低下した遺伝子の割合を分類した。図２（ｃ）は、骨分化誘導培地（ＯＰ）、軟骨分化誘導培地（ＣＰ）、脂肪分化誘導培地（ＡＰ）、分化因子なし培地（Ｍ）を用いて、ＭＳＣを２４時間または２８日間培養し、組織特異的な遺伝子発現を確認した。３つの株を用いたリアルタイムＲＴ－ＰＣＲによってｍＲＮＡレベルを決定した。値は３ウエルの平均値±標準誤差である。
　〔２－２：ＭＳＣに特徴的な転写因子のノックダウンの影響〕
　興味深いことに、ＭＳＣに特徴的な遺伝子は９つの転写因子（ＥＴＶ１、ＥＴＶ５、ＦＯＸＰ１、ＧＡＴＡ６、ＨＭＧＡ２、ＫＬＦ１２、ＰＲＤＭ１６、ＳＩＭ２、ＳＯＸ１１）を含むことがわかった。表１に示すように、ＳＯＸ１１を除くほとんどの遺伝子が滑膜線維芽細胞において高発現していた。表２に、９つの転写因子に関する情報を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　これらの転写因子が担っているであろう役割を調べるために、これらの遺伝子を標的として設計したｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを用いた。ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの添加によって、４８～７２時間（ｓｉＲＮＡにより標的のｍＲＮＡレベルが５０～８０％に減少した時間）以内に、ＭＳＣに特徴的な遺伝子のほとんど（７１個中５３個；７５％）のｍＲＮＡレベルを有意に発現低下させた（表３）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　ＭＳＣに特徴的な遺伝子のｍＲＮＡレベルをリアルタイムＲＴ－ＰＣＲによって評価した。表中の括弧の値は、コントロールを１としたときのｍＲＮＡレベルを示している。有意な発現低下を示している遺伝子を示す（＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００５，†ｐ＜０．０００５）。
　各ｓｉＲＮＡは、ＭＳＣに特徴的な遺伝子の異なるセットを発現低下させた。このことは、これらの発現低下がｓｉＲＮＡの一般的な毒性の影響ではないことを示唆している。また、これらのことは、９つの転写因子がＭＳＣの分子的な特徴に必須であることを示唆している。
　転写因子の機能的な役割を評価するために、ＭＳＣの増殖におけるｓｉＲＮＡの影響を調べた。また、これらの実験において変形性関節炎の関節から単離された滑膜線維芽細胞、骨髄ＭＳＣ、および皮膚線維芽細胞を用いた。ネガティブコントロールｓｉＲＮＡを形質移入したこれらの細胞は、分化後少なくとも６日間まで増殖し続けた。ＧＡＴＡ６のｓｉＲＮＡは、皮膚線維芽細胞の増殖に影響しなかったが、骨髄ＭＳＣの数を減少させ、滑膜線維芽細胞の増殖を停止させた（図３）。細胞数はＷＳＴ－８試薬を用いてＯＤ４９０とＯＤ６３０との比による評価法を用いて算出した。値は３つの培養での平均値±標準誤差を示す。ステューデントＴ検定を用いてネガティブコントロールｓｉＲＮＡと比較している（＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００５）。
　表４は、ＭＳＣ（４種類）、滑膜線維芽細胞（４種類）、皮膚線維芽細胞（３種類）の増殖に対する、９つの転写因子のノックダウンの影響を示している。示した値は、ｓｉＲＮＡを形質移入した後に培養した細胞数増加の、コントロールｓｉＲＮＡを形質移入した後に培養した細胞増加に対する割合（６日目）を示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　９６ウエルプレートにて培養し４０％コンフルエントの段階でｓｉＲＮＡを移入し、１０％ウシ胎児血清とともに６日間培養した。ＷＳＴ－８試薬を用いて０日目から６日目の間の細胞数増加を計測した。値は、コントロールｓｉＲＮＡを形質移入された細胞と比べたときの、細胞数の増加のパーセンテージを示している（３培養系の平均値±標準誤差で示す。）。
　ＥＴＶ５およびＳＯＸ１１のノックダウンは、ＭＳＣおよび滑膜線維芽細胞の両方の増殖を停止させた。そして、ＥＴＶ１、ＦＯＸＰ１、ＧＡＴＡ６、ＨＭＧＡ２、ＰＲＤＭ１６、ＳＩＭ２のノックダウンは、これらの細胞の増殖を中程度、あるいは顕著に抑制した。しかし、ｓｉＲＮＡヌクレオチドは皮膚線維芽細胞の増殖にほとんど影響しなかった。このことから、増殖の抑制はｓｉＲＮＡが正常に機能していることを示唆する。ノックダウンの影響は、細胞または株の種類に依存して変動するが、細胞株は細胞種ほどノックダウンに影響しなかった。ノックダウンが骨髄ＭＳＣよりも滑膜線維芽細胞の増殖に顕著な抑制を誘発したのかは不明であるが、滑膜線維芽細胞は生体内で変形性関節炎の関節において活動的な増殖を示した。
　また、ＭＳＣの骨分化能および脂肪分化能に対するノックダウンの効果を調べた。ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを、分化誘導培地で培養する二日前に加えた。アルカリファオスファターゼ活性は、骨分化誘導培地での培養８日後に上昇し始めた。ＭＳＣにおけるＳＩＭ２およびＳＯＸ１１のノックダウンは、酵素活性の上昇を中程度抑制したが、ＨＭＧＡ２およびＰＲＤＭ１６のノックダウンは、酵素活性に対してほとんど影響せず、他のｓｉＲＮＡヌクレオチドでは抑制効果が認められなかった。さらなる実験において、ＳＩＭ２、ＳＯＸ１１、ＦＯＸＰ１のノックダウンにともなって基質石灰化を遅らせた（アリザリンレッド染色で確認）が、いずれのｓｉＲＮＡヌクレオチドも石灰化の最大レベルを低下させることはなかった（示さず）。
　また、骨分化に対するｓｉＲＮＡの影響を調べた。ここでは、骨細胞のマーカーであるＡＬＰａｓｅ活性を用いて評価した（図４）。４８ウエルの組織培養用プレートにて８０％コンフルエントに達した際に、ｓｉＲＮＡまたはコントロールｓｉＲＮＡを細胞に形質移入し、１０％ウシ胎児血清存在下で２４時間静置し、その後１０％ウシ胎児血清添加ＤＭＥＭにより２日間培養した。さらに、これらの細胞を、１０％ウシ胎児血清添加ＤＭＥＭ（点線）、または骨分化誘導培地（実線）に移し、示す日数にわたって培養した。値は３つの培養で平均値±標準誤差を示す。ステューデントＴ検定を用いてネガティブコントロールｓｉＲＮＡと比較している（＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００５）。いくつかの転写因子について、ｓｉＲＮＡを前処置することによってＡＬＰａｓｅ活性の誘導を抑制することがわかった。具体的には、ＡＬＰａｓｅ活性は分化誘導後４日目に上昇し始め、８日目以降にはＨＭＧＡ２、ＰＲＤＭ１６、ＳＩＭ２、ＳＯＸ１１のｓｉＲＮＡがＡＬＰａｓｅの誘導を抑制した。
　さらに、脂肪分化に対するｓｉＲＮＡの影響を調べた。ここでは、脂肪細胞のマーカーであるＧＰＤＨ活性を用いて評価した（図５）。４８ウエルの組織培養用プレートにて８０％コンフルエントに達した際に、ｓｉＲＮＡまたはコントロールｓｉＲＮＡを細胞に形質移入し、１０％ウシ胎児血清存在下で２４時間静置し、その後１０％ウシ胎児血清添加ＤＭＥＭにより２日間培養した。さらに、これらの細胞を、１０％ウシ胎児血清添加ＤＭＥＭ（点線）、または脂肪分化誘導培地（実線）に移し、示す日数にわたって培養した。値は３つの培養で平均値±標準誤差を示す。ステューデントＴ検定を用いてネガティブコントロールｓｉＲＮＡと比較している（＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００５）。いくつかの転写因子について、ｓｉＲＮＡを前処置することによってＧＰＤＨ活性の誘導を抑制することがわかった。具体的には、ＧＰＤＨ活性は分化誘導後８日目に上昇し始め、１２日目にはＥＴＶ１、ＦＯＸＰ１、ＰＲＤＭ１６、ＳＯＸ１１のｓｉＲＮＡがＧＰＤＨの誘導を抑制した。
　なお、各種細胞へのｓｉＲＮＡオリゴの導入効率はほぼ等しいことを確認している。よって、比較した細胞間での遺伝子発現の抑制効率も同等であるといえる。
　〔２－３：ＭＳＣの免疫組織化学〕
　同定したＭＳＣマーカー（転写因子ではないものも含む。）について、ＭＳＣに特徴的な分子に対する市販の抗体のうち、どの分化細胞よりもＭＳＣにおいてそのｍＲＮＡレベルが高発現しているＧＡＴＡ６、ＡＤＤ３、ＦＬＧ、ＨＴＲ７、ＩＧＦＢＰ３，ＭＥＴ、ＴＧＭ２、ＴＲＰＣ４、ＶＥＧＦに対する抗体を選択した（図１）。また、ＭＳＣおよび軟骨細胞において、骨芽細胞、脂肪細胞、線維芽細胞においてよりも高いレベルで発現されていたＬＩＦの抗体を選択した（図１）。ＭＳＣ集団に対する一連の二重免疫蛍光染色を行った。そして、共焦点蛍光顕微鏡によって、単一のまたは二重の、免疫陽性の存在を示す証拠を見出した（図６）。
　生後５６日齢の上腕骨の骨髄および骨を、抗ＧＡＴＡ６（パネルＢ、パネルＤ、パネルＥ）、抗ＬＩＦ抗体（パネルＣ、パネルＤ、パネルＥ）あるいは非特異的な血清（パネルＦ）とインキュベーションした後、蛍光二次抗体を用いて染色した。ＧＡＴＡ６はいくつかの骨髄細胞の細胞質に存在した。骨髄内にはＧＡＴＡ６免疫陽性の細胞が比較的多く存在した。そして、骨表面のＧＡＴＡ６免疫陽性細胞は骨芽細胞様の形状を有している。また、ＧＡＴＡ６免疫陽性細胞はまた骨膜にも散らばっていた（示さず）。ＬＩＦはいくつかの骨髄細胞の細胞質に存在した。そして、ＬＩＦ免疫陽性細胞は骨膜外に散らばっていた（示さず）。共焦点蛍光顕微鏡と光学顕微鏡にて得られた画像が互いに重ね合わせると、比較的多くの、ＧＡＴＡ６およびＬＩＦの二重免疫陽性細胞が、骨髄内および骨内膜付近に存在し、そしてわずかに骨表面に存在した。二重免疫陽性細胞の割合は高かった（７０％以上）。しかし、骨膜内には二重免疫陽性細胞が認められなかった（示さず）。
　このように、ＧＡＴＡ６陽性細胞（図６のパネルＢ）、ＬＩＦ陽性細胞（図６のパネルＣ）は、成熟したマウス上腕骨の骨髄内部、および骨内膜付近に存在した。そして、それらのほとんどが二重に陽性の細胞であった（図６のパネルＤおよびパネルＥ）。非特異的血清および二次抗体単独は特異的な染色は示さなかった。よって、二重染色細胞は多分化能のない造血細胞や線維芽細胞ではないと考えられる。なぜなら、ＧＡＴＡ６およびＬＩＦのｍＲＮＡレベルは骨髄細胞全画分、非接着性骨髄細胞、皮膚線維芽細胞のすべてのうちで非常に低いか、あるいは検出不可能であるからである（図７）。
　ＲＮＡを、ドナーの骨髄液から直接回収した（Ｗｈｏｌｅ　ＢＭＣ）。さらに、他のドナーからの骨髄細胞を播種し、培養液内の非接着性細胞からＲＮＡを回収した。次いで、ドナーの骨髄細胞を２４時間または９６時間培養し、接着細胞からＲＮＡを抽出した。さらに、細胞がコンフルエントに達した際にも、ＭＳＣの接着細胞層からＲＮＡを採取した。コントロールに皮膚線維芽細胞を用いて、ＭＳＣに特徴的な遺伝子のｍＲＮＡレベルを、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによって決定した。これらのＭＳＣにおけるｍＲＮＡレベルは、他のＭＳＣ株と類似した値であった。値は、二つの培養物における値の平均を示している。
　図７はまた、ＦＬＧ、ＴＧＭ２、ＨＴＲ７が、ＭＳＣにおいて発現しているが他の細胞では発現しなかったこと、ＭＥＴ、ＴＲＰＣ４、ＩＧＦＢＰが、線維芽細胞よりもＭＳＣにおいて高いレベルで発現していたが、非接着性の骨髄細胞では発現していなかったこと、ＡＤＤ３およびＶＥＧＦが、ＭＳＣよりも非接着性の骨髄細胞および線維芽細胞において低レベルで発現していたことを示している。これらのＭＳＣに特徴的な分子の抗体はまた、生体内である程度の骨髄細胞とも反応した。図８は、種々の抗体を用いてマウス骨髄内の二重免疫陽性細胞の同定を示している。抗体産生に用いられた動物種（ウサギ、ヤギ、マウス）とペプシンおよびマイクロ波処置とによって抗原修復した後の免疫反応性の保存を考慮して、二重免疫染色を試験する抗体の組合せを決定した。
　５６日齢のマウス骨髄内のＭＳＣ様細胞を種々の抗体で二重染色し、そして共焦点蛍光顕微鏡を使って評価した。比較的多くのＴＲＰＣ４陽性／ＦＬＧ陽性二重染色細胞が骨髄内と骨内膜付近に存在していた（図８のパネルＡ）。また、比較的多くのＬＩＦ陽性／ＡＤＤ３陽性二重染色細胞が骨髄内に存在し、いくつかのＬＩＦ陽性／ＡＤＤ３陽性二重染色細胞が骨内膜付近に存在したが、骨膜には存在しなかった（図８のパネルＢ）。多くのＧＡＴＡ６陽性／ＦＬＧ陽性二重染色細胞が骨髄内に存在し、そしていくつかのＧＡＴＡ６陽性／ＦＬＧ陽性二重染色細胞が骨内膜付近に存在していたが、骨膜には存在しなかった（図８のパネルＣ）。比較的多くのＴＭＧ２陽性／ＬＩＦ陽性二重染色細胞が骨髄内に存在し、そしていくつかのＴＭＧ２陽性／ＬＩＦ陽性二重染色細胞が骨内膜付近に存在していた（図８のパネルＤ）。いくつかのＴＲＰＣ４陽性／ＩＧＦＢＰ３陽性二重染色細胞が骨髄内に存在していたが、骨膜には存在しなかった（図８のパネルＥ）。いくつかのＴＧＭ２陽性／ＭＥＴ陽性二重染色細胞が骨髄内と骨内膜付近に存在したが、ＭＥＴ陽性は骨膜には存在しなかった（図８のパネルＦ）。比較的多くのＬＩＦ陽性／ＭＥＴ陽性二重染色細胞が骨髄内に検出された。そしていくつかのＬＩＦ陽性／ＭＥＴ陽性二重染色細胞が骨内膜付近に存在したが、骨膜には存在しなかった（図８のパネルＧ）。ひとつのＡＤＤ３陽性／ＭＥＴ陽性二重染色細胞が骨内膜付近に存在したが、ＡＤＤ３陽性／ＭＥＴ陽性は骨膜には存在しなかった（図８のパネルＨ）。わずかな数のＴＲＰＣ４陽性／ＶＥＧＦ陽性二重染色細胞が骨髄内と骨内膜付近に存在したが、骨膜には存在しなかった（図８のパネルＩ）。ＧＡＴＡ６陽性／ＶＥＧＦ陽性細胞は骨内膜付近に存在したが、骨内膜表面には存在しなかったが、ＧＡＴＡ６陽性／ＶＥＧＦ陰性は骨表面に存在した。ＧＡＴＡ６陽性あるいはＶＥＧＦ陽性細胞の毛細血管への結合は観察されなかった（図８のパネルＪ）。ひとつのＧＡＴＡ６陽性／ＩＧＦＢＰ３陽性細胞が骨内膜付近に存在した（図８のパネルＫ）。ＧＡＴＡ６陽性／ＭＥＴ陽性細胞の数は骨髄内で少なく、また骨内膜付近には存在したが、骨表面にはなく、骨膜にもなかった（図８のパネルＬ）。ＦＬＧ陽性／ＶＥＧＦ陽性細胞の数は少なく、骨内膜付近に少数存在したが、骨表面や骨膜には存在しなかった（図８のパネルＭ）。骨髄内のＦＬＧ陽性／ＩＧＦＢＰ３陽性細胞の数は少なく、骨表面や骨膜には検出されなかった（図８のパネルＮ）。ネガティブコントロールとしての二次抗体単独あるいはコントロールＩｇＧによっては染色されなかった（図８のパネルＯ）。
　このように、二重免疫陽性細胞の発現率は、ＴＲＣ４／ＦＬＧ（パネルＡ）において高く、ＬＩＦ／ＡＤＤ３（パネルＢ）、ＧＡＴＡ６／ＦＬＧ（パネルＣ）、ＴＧＭ２／ＬＩＦ（パネルＤ）において中程度、その他の組合せでは低かった。さまざまな組合せの中で、ＧＡＴＡ６／ＦＬＧおよびＴＧＭ２／ＬＩＦが、ＧＡＴＡ６／ＬＩＦ（図６）とともに、ＭＳＣ様細胞の同定に役立つことが判明した。これらは、非接着性の骨髄細胞や皮膚線維芽細胞では発現していない（図７）。線維芽細胞は通常骨髄内に存在ないのでＴＲＰＣ４／ＦＬＧもまた役立つ可能性がある。ＭＥＴ、ＩＧＦＢＰ３、ＶＥＧＦの抗体による、単一または二重の免疫陽性細胞の染色率が低いことは、抗体の質、検体の処理、あるいはこれらのマーカーのｍＲＮＡレベルが常にタンパク質レベルに翻訳して変化する訳ではないことに起因するかもしれない。にもかかわらず、抗体の組合せの全てが、二重免疫陽性細胞の存在を明らかにした。このことは、骨髄細胞各部が生体内で同時にいくつかのＭＳＣマーカータンパクを合成することを示している。
　また、ＧＡＴＡ６、ＬＩＦ、ＦＬＧおよびＴＧＭ２は非接着性の骨髄細胞、造血細胞、線維芽細胞で発現していなかったので、これらの分子を同時に発現する接着性の骨髄細胞はＭＳＣといえる。なお、ＬＩＦはＭＳＣ単独のマーカーではないものの、抗ＬＩＦ抗体が軟骨組織以外の骨髄においてＭＳＣの免疫組織化学を調べる際に有用であるといえる。
　軟骨膜、骨膜もまた、培養によってかあるいは移植後に、軟骨細胞、骨芽細胞に分化するＭＳＣ様細胞を含んでいるので、上腕骨の軟骨膜にあるＭＳＣに特徴的な分子の発現を調べた。ＭＳＣに特徴的な分子のいくつか（ＧＡＴＡ６（図９のパネルＣおよびＤ）、ＬＩＦ（図９のパネルＡおよびＢ）、ＡＤＤ３（図９のパネルＡおよびＢ）、ＦＬＧ（図９のパネルＣおよびＤ）、ＨＴＲ７（示さず）に対する抗体は、軟骨膜内で細胞集団に反応した。一方で、図９に示す組織内に二重免疫陽性細胞は検出されなかった。同様の結果が骨膜においても得られた（図１０）。さらに、軟骨細胞（図９のパネルＡおよびＣ）も骨細胞（示さず）も、ＧＡＴＡ６、ＦＬＧ、ＡＤＤ３、ＶＥＧＦ（示さず）の抗体に反応しないが、一方で抗ＬＩＦ抗体は軟骨細胞（図９のパネルＡ）に反応し、骨細胞（示さず）に反応しないことを確認した。従って、ＤＮＡマイクロアレイデータは少なくとも部分的には生体内状態に関連しているようである。
　〔２－４：誘導性間葉系幹細胞の誘導に好適な因子〕
　表２に示す遺伝子の発現量が、増殖因子等によって影響を受けるかどうかを調べた。
　実験には、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ－β、インスリン、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）、脂肪酸、ビタミンＣ（ＶＣ）、ウシ胎児血清を用いた。具体的には、３株のヒト骨髄由来細胞（ＭＳＣ－Ｒ１４－Ｐ６、ＭＳＣ－Ｒ１７－Ｐ５、ＭＳＣ－Ｒ６０－Ｐ５）を用いた。培養ディッシュには、ファルコン６ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅを用いた。１０ｃｍディッシュにて１０％ＦＢＳ＋ＦＧＦを含む培地を用いて培養した各細胞を回収し、細胞数を計数した。これらの細胞を２×１０５／ｗｅｌｌ（すなわち、２×１０５／ｃｍ２）にて６ウエルプレートに播種した。１０％ＦＢＳを含む培地、および１０％ＦＢＳ＋ＦＧＦを含む培地をコントロールとし、これら以外の全てについてＡ＋Ｂ１＋Ｃ＋ＥＧＦ＋ＶＣ＋ＰＡを含む無血清培地を用いて細胞を培養し、２４時間後（細胞がほぼサブコンフルエントになった後）に、コントロール以外の培地を、以下を含む培地に交換した。
（１）Ａ＋Ｂ１＋Ｃ＋ＥＧＦ＋ＶＣ＋ＰＡ
（２）Ａ＋Ｂ１＋Ｃ＋ＥＧＦ＋ＶＣ＋ＰＡ－ＦＧＦ
（３）Ａ＋Ｂ１＋Ｃ＋ＥＧＦ＋ＶＣ＋ＰＡ－ＴＧＦ
（４）Ａ＋Ｂ１＋Ｃ＋ＥＧＦ＋ＶＣ＋ＰＡ－ＨＧＦ
（５）Ａ＋Ｂ１＋Ｃ＋ＥＧＦ＋ＶＣ＋ＰＡ－ＰＤＧＦ
（６）Ａ＋Ｂ１＋Ｃ＋ＥＧＦ＋ＶＣ＋ＰＡ－ＥＧＦ
（７）Ａ＋Ｂ１＋Ｃ＋ＥＧＦ＋ＶＣ＋ＰＡ－インスリン
（８）Ａ＋Ｂ１＋Ｃ＋ＥＧＦ＋ＶＣ＋ＰＡ－ＶＣ
（９）Ａ＋Ｂ１＋Ｃ＋ＥＧＦ＋ＶＣ＋ＰＡ－Ｂ１
（１０）Ａ＋Ｂ１＋Ｃ＋ＥＧＦ＋ＶＣ＋ＰＡ－Ｄｅｘ
　このような培地中にて細胞をさらに３日間で培養し、トリアゾールを用いて回収した細胞からＲＮＡを抽出した。なお、添加した因子の濃度は以下の通りである：ＰＡ：１０μｇ／ｍｌ、ＦＧＦ：３ｎｇ／ｍｌ、ＴＧＦ：１０ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、ＰＤＧＦ：１０ｎｇ／ｍｌ、ＥＧＦ：２０ｎｇ／ｍｌ、Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ（Ｄｅｘ）：１０－８Ｍ、インスリン：１０μｇ／ｍｌ、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｌｉｐｉｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（ＣＤ）：原液を１００～２００倍希釈、ＶＣ：５０μｇ／ｍｌ。
　結果を表５に示す。ＭＳＣに特徴的な転写因子の発現量を異なる組合せにて促進または抑制する因子が見出された。すなわち、表５の増殖因子は、それぞれ異なる組合せの、ＭＳＣのＳＴＥＭＮＥＳＳに関わる遺伝子（転写因子を含む。）を誘導し得た。このように、これらの因子は、誘導性間葉系幹細胞の誘導に好適な因子といえる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　〔２－５：関節症の発症およびＭＳＣのＳＴＥＭＮＥＳＳに関わる遺伝子の誘導〕
　６週齢のＳＤ系ラットの大腿骨膝関節腔に、モノヨード酢酸（０．０３，０．０６または１．５ｍｇ／ｊｏｉｎｔ）を投与した２週間後に、同関節の軟骨からＲＮＡを抽出した。そして、ＭＳＣのＳＴＥＭＮＥＳＳに関わる転写因子（表２に記載の遺伝子についての対応ラット遺伝子）の発現レベルを検討した。その結果、関節炎を発症したラットの軟骨では、分化マーカーであるアグリカンおよびＩＩ型コラーゲンの発現が低下している一方で、ＭＳＣのＳＴＥＭＮＥＳＳに関わる転写因子の数種類がその発現レベルを亢進していた（図１１）。つまり、炎症によって軟骨細胞が脱分化するとともに、少なくとも一部の脱分化細胞がＭＳＣ様細胞へ変化したと推察される。したがって、各種の組織（軟骨を含む。）に各種の薬物を注射して、ＭＳＣのＳＴＥＭＮＥＳＳに関わる転写因子の発現を促進すれば、誘導性間葉系幹細胞を生体内で誘導することができる。また、表５の増殖因子を疾患部位へ投与することにより、生体内にて誘導性間葉系幹細胞の数を増加させることができると考えられる。そして、これらの実験モデルは、幹細胞を誘導する薬物をスクリーニングする際に有用である。
　〔２－６：種々の組織に由来する線維芽細胞からの誘導性間葉系幹細胞の作製〕
　ヒト歯肉由来の線維芽細胞を分離した。次いで、これらの細胞を、ＭＳＣのＳＴＥＭＮＥＳＳを促進する因子（表５）を添加した無血清培地ＳＴＫ２（ＤＳファーマバイオメデイカル社製）を用いて７日間培養した。その後、骨分化誘導培地を用いて１５～２０日間培養した（図１２）。高レベルのアルカリホスファターゼ活性および石灰化（アリザリン赤染色）が誘導された（それぞれ図１２のパネルＡおよびＢ）。なお、通常の培養法を用いて同じ細胞を培養した場合は、アルカリホスファターゼ活性および石灰化レベルが低かった（結果は示さず）。
　同様の実験を、分離培養したヒト歯髄由来の線維芽細胞を用いて行った。具体的には、ヒト歯髄由来の線維芽細胞を分離し、次いで、これらの細胞を、ＭＳＣのＳＴＥＭＮＥＳＳを促進する因子（表５）を添加した無血清培地ＳＴＫ２（ＤＳファーマバイオメデイカル社製）を用いて７日間培養した。その後、骨分化誘導培地を用いて２～３週間培養した。結果を図１３に示す。ヒト歯肉由来の線維芽細胞の場合と同様に、ヒト歯髄由来の線維芽細胞においても、高レベルのアルカリホスファターゼ活性および石灰化（アリザリン赤染色）が誘導された（それぞれ図１３のパネルＡおよびＢ）。
　このように、ＭＳＣのＳＴＥＭＮＥＳＳを促進する因子を添加した無血清培地を用いることにより、種々の組織に由来する線維芽細胞から誘導性間葉系幹細胞を作製することができた。これらの誘導性間葉系幹細胞は再生医療に有用である。また、上述した無血清培地に別の薬剤をさらに追加すれば、骨分化能がより高い誘導性間葉系幹細胞を作製し得るので、本系は薬剤スクリーニング系として非常に有用である。
　〔２－７：歯髄由来の線維芽細胞から誘導した誘導性間葉系幹細胞の骨分化能〕
　ヒト歯髄由来の線維芽細胞を５×１０３個／ｃｍ２の密度にて培養皿に播種して、コンフルエントになるまで培養した。培養条件は、ＭＳＣのＳＴＥＭＮＥＳＳを促進する因子（表５）を添加した無血清培地ＳＴＫ２を用いて５日間培養（図１４のパネルＡ）、または通常の増殖培地（抗生物質および１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ）を用いて１３日間培養（図１４のパネルＢ）である。その後、培地を骨分化誘導培地に交換して骨分化誘導を開始した。Ａは１４日間、Ｂは２０日間骨分化誘導培地を用いて培養した後に、アリザリン赤染色によって骨分化能を評価した。骨分化の方法をTutsumiらの方法に従って行った（Retention of multilineage differentiation potential of mesenchymal cells during proliferation in response to FGF. Tsutsumi S, Shimazu A, Miyazaki K, Pan H, Koike C, Yoshida E, Takagishi K, Kato Y. Biochem Biophys Res Commun. 2001 Oct 26;288(2):413-9.）。
　このように、ＭＳＣのＳＴＥＭＮＥＳＳを促進する因子を添加した無血清培地を用いることにより、誘導性間葉系幹細胞を作製し得た。また、上記無血清培地に別の薬剤をさらに追加すれば、分化能がより高い誘導性間葉系幹細胞を作製し得るので。本系は薬剤スクリーニング系として有用である。
　以上のように、骨髄ＭＳＣの特徴となる分子の発現が、これらの細胞において選択的に発現している転写因子によって決定されることを見出した。そして、これらの転写因子のいくつかは、明らかにＭＳＣのＳＴＥＭＮＥＳＳの調節に関与していた。特に、ＥＴＶ１、ＥＴＶ５、ＦＯＸＰ１、ＧＡＴＡ６、ＨＭＧＡ２、ＳＩＭ２、ＳＯＸ１１のノックダウンはＭＳＣの自己複製能を抑制した。また、ＦＯＸＰ１、ＳＯＸ１１、ＥＴＶ１、ＳＩＭ２、ＰＲＤＭ１６のノックダウンは骨分化や脂肪分化のポテンシャルを低下させた。さらに、滑膜線維芽細胞が生体内に存在するＭＳＣ様細胞であることを同定した。そして、骨髄内のＭＳＣ様細胞の局在は幹細胞が骨の発生、成長に生理学的に関与することを示し、成熟した骨髄はＭＳＣの供給源であることが示された。これらの知見は、再生医療における成人骨髄ＭＳＣの使用を大いに促進し得る。
　本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
　発明の詳細な説明の項においてなされた具体的な実施形態または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する請求の範囲内において、いろいろと変更して実施することができるものである。
　本発明を用いれば、ヒトの胚またはＥＳ細胞を利用することなく、間葉系幹細胞と同様の自己複製能および分化能を有する細胞（誘導性間葉系幹細胞）を簡便に作製することができる。また、本発明を用いれば、誘導性間葉系幹細胞を検出することができる。さらに、本発明を用いれば、細胞を誘導性間葉系幹細胞に誘導する因子、間葉系幹細胞の自己複製能を制御する因子、および間葉系幹細胞の分化能を制御する因子をスクリーニングすることができる。
　本発明は、ヒトの胚またはＥＳ細胞を利用することなく、間葉系幹細胞と同様の自己複製能および分化能を有する細胞を提供し得るので、医薬分野、特に再生医療に関連する分野に大いに貢献し得る。

Claims (20)

  1. 　表２に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子の少なくとも１つを細胞に導入する工程を包含する、誘導性間葉系幹細胞の作製方法。
  2. 　間葉系幹細胞選択的な無血清培地を用いて培養する工程をさらに包含する、請求項１に記載の作製方法。
  3. 　細胞を脱分化条件下にて長期間培養する工程、および培養後の細胞を、間葉系幹細胞選択的な無血清培地を用いて人工マトリックス上でさらに培養する工程を包含する、誘導性間葉系幹細胞の作製方法。
  4. 　誘導性間葉系幹細胞の誘導に好適な因子を培地に添加する工程をさらに包含する、請求項１～３のいずれか１項に記載の作製方法。
  5. 　下記（ａ）～（ｃ）からなる群より選択されるポリヌクレオチドの１つ以上を備えている、誘導性間葉系幹細胞を作製するためのキット：
    　　（ａ）表２に記載のアクセッション番号のいずれか１つに示される塩基配列またはその相補配列を有するポリヌクレオチド；
    　　（ｂ）上記（ａ）のフラグメントであるポリヌクレオチド；および
    　　（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
  6. 　目的の細胞において、表２に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子の少なくとも１つの発現を検出する工程を包含する、誘導性間葉系幹細胞を検出する方法。
  7. 　下記（ａ）～（ｃ）からなる群より選択されるポリヌクレオチドの１つ以上を備えている、誘導性間葉系幹細胞を検出するためのキット：
    　　（ａ）表２に記載のアクセッション番号のいずれか１つに示される塩基配列またはその相補配列を有するポリヌクレオチド；
    　　（ｂ）上記（ａ）のフラグメントであるポリヌクレオチド；および
    　　（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
  8. 　下記（ａ）～（ｃ）からなる群より選択されるポリヌクレオチドの１つ以上が固定化されている、誘導性間葉系幹細胞を検出するためのマイクロアレイ：
    　　（ａ）表２に記載のアクセッション番号のいずれか１つに示される塩基配列またはその相補配列を有するポリヌクレオチド；
    　　（ｂ）上記（ａ）のフラグメントであるポリヌクレオチド；および
    　　（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
  9. 　表２に記載のアクセッション番号のいずれか１つに示される塩基配列を有するポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドと特異的に結合する抗体を備えている、誘導性間葉系幹細胞を検出するためのキット。
  10. 　候補物質の存在下にて培養した細胞において、表２に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子の少なくとも１つの発現を検出する工程を包含する、細胞を誘導性間葉系幹細胞に誘導する因子をスクリーニングする方法。
  11. 　候補物質の非存在下にて培養した細胞における上記遺伝子の発現を検出する工程をさらに包含する、請求項１０に記載の方法。
  12. 　間葉系幹細胞における上記遺伝子の発現を検出する工程をさらに包含する、請求項１０に記載の方法。
  13. 　候補物質の存在下にて培養した目的の細胞において、表２に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子の少なくとも１つの発現を検出する工程を包含する、間葉系幹細胞の自己複製能を制御する因子をスクリーニングする方法。
  14. 　上記細胞が、自己複製能を抑制された間葉系幹細胞である、請求項１３に記載の方法。
  15. 　候補物質の非存在下にて培養した、自己複製能を抑制された間葉系幹細胞における上記遺伝子の発現を検出する工程をさらに包含する、請求項１４に記載の方法。
  16. 　間葉系幹細胞における上記遺伝子の発現を検出する工程をさらに包含する、請求項１５に記載の方法。
  17. 　候補物質の存在下にて培養した目的の細胞において、表２に記載のアクセッション番号に示される塩基配列を有する遺伝子の少なくとも１つの発現を検出する工程を包含する、間葉系幹細胞の分化能を制御する因子をスクリーニングする方法。
  18. 　上記細胞が、分化能を抑制された間葉系幹細胞である、請求項１７に記載の方法。
  19. 　候補物質の非存在下にて培養した、分化能を抑制された間葉系幹細胞における上記遺伝子の発現を検出する工程をさらに包含する、請求項１８に記載の方法。
  20. 　間葉系幹細胞における上記遺伝子の発現を検出する工程をさらに包含する、請求項１８に記載の方法。
PCT/JP2009/007260 2009-05-12 2009-12-25 誘導性間葉系幹細胞およびその作製方法 WO2010131315A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2009115378A JP2012143158A (ja) 2009-05-12 2009-05-12 誘導性間葉系幹細胞およびその作製方法
JP2009-115378 2009-05-12

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2010131315A1 true WO2010131315A1 (ja) 2010-11-18

Family

ID=43084706

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2009/007260 WO2010131315A1 (ja) 2009-05-12 2009-12-25 誘導性間葉系幹細胞およびその作製方法

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP2012143158A (ja)
WO (1) WO2010131315A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2018502556A (ja) * 2014-12-05 2018-02-01 メリディジェン・バイオテック・カンパニー・リミテッドＭｅｒｉｄｉｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．， Ｌｔｄ． 間葉系幹細胞を区別する方法

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110423721B (zh) * 2018-05-01 2024-02-27 云南济慈再生医学研究院有限公司 一种年轻化的修复型成纤维细胞的制备方法及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006106823A1 (ja) * 2005-03-31 2006-10-12 Japan Science And Technology Agency 分子マーカーを用いた間葉系幹細胞の識別方法及びその利用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006106823A1 (ja) * 2005-03-31 2006-10-12 Japan Science And Technology Agency 分子マーカーを用いた間葉系幹細胞の識別方法及びその利用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"US-Japan Symposium: Network for International Education and Research in Advanced Dental Sciences, Program", February 2009, article KATO Y: "Identification of mesenchymal stem cell (MSC)-transcription factors by microarray and knockdown analyses, and signature molecule-marked MSC in bone marrow by immunohistochemistry.", pages: 24 *
HENG B C ET AL.: "Induced adult stem (iAS) cells and induced transit amplifying progenitor (iTAP) cells - a possible alternative to induced pluripotent stem (iPS) cells?", J. TISSUE ENG. REG. MED., December 2009 (2009-12-01), Retrieved from the Internet <URL:http://dx.doi.org/10.1002/term.230> *
KATO Y: "Identification of mesenchymal stem cell (MSC)-Transcription factors by microarray and knockdown analysis, and signature molecule-marked MSC in bone marrow by immunohistochemistry.", THE INTERNATIONAL WORKSHOP ON BIODENTAL EDUCATION & RESEARCH 2009, PROGRAM AND ABSTRACTS, February 2009 (2009-02-01), pages 30 *
KUBO H ET AL.: "Identification of mesenchymal stem cells (MSC)-transcription factors by microarray and knockdown analyses, and signature molecule-marked MSC in bone marrow by immunohistochemistry.", GENES TO CELLS, vol. 14, March 2009 (2009-03-01), pages 407 - 424, XP055104674, DOI: doi:10.1111/j.1365-2443.2009.01281.x *
YUKIO KATO: "Kan'yokei Kansaibo no STEMNESS o Seigyo suru Tensha Inshi to Seicho Inshi Oyobi Saisei Iryo ni Okeru Mukessei Baichi no Yuyosei", REGENERATIVE MEDICINE, vol. 8, February 2009 (2009-02-01), pages 93 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2018502556A (ja) * 2014-12-05 2018-02-01 メリディジェン・バイオテック・カンパニー・リミテッドＭｅｒｉｄｉｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．， Ｌｔｄ． 間葉系幹細胞を区別する方法

Also Published As

Publication number Publication date
JP2012143158A (ja) 2012-08-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5190654B2 (ja) 分子マーカーを用いた間葉系幹細胞の識別方法及びその利用
Aldahmash et al. Human serum is as efficient as fetal bovine serum in supporting proliferation and differentiation of human multipotent stromal (mesenchymal) stem cells in vitro and in vivo
AU2004278634A1 (en) Method of inducing the differentiation of stem cells into cardiomyocytes
Chen et al. Mineralization effect of hyaluronan on dental pulp cells via CD44
JP2006519015A (ja) 幹細胞を単離または生成するためのマーカーとしてのＩｓｌｅｔ１の使用
Bai et al. Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from chicken bone marrow
Duan et al. MicroRNA-15a-5p regulates the development of osteoarthritis by targeting PTHrP in chondrocytes
Jia et al. YAP balances the osteogenic and adipogenic differentiation of hPDLSCs in vitro partly through the Wnt/β-catenin signaling pathway
Rad et al. The role of dentin matrix protein 1 (DMP1) in regulation of osteogenic differentiation of rat dental follicle stem cells (DFSCs)
Wu et al. Dentin sialophosphoprotein-promoted mineralization and expression of odontogenic genes in adipose-derived stromal cells
CN106661552B (zh) 心脏细胞培养材料
Honda et al. Side population cells expressing ABCG2 in human adult dental pulp tissue
Zhang et al. Foxc2 and BMP2 induce osteogenic/odontogenic differentiation and mineralization of human stem cells from apical papilla
Gao et al. Mechanism of exosomal miR-155 derived from bone marrow mesenchymal stem cells on stemness maintenance and drug resistance in myeloma cells
Zhou et al. SENP1/HIF‐1α axis works in angiogenesis of human dental pulp stem cells
Wu et al. Mechanism of cyclic tensile stress in osteogenic differentiation of human periodontal ligament stem cells
He et al. miR-188-3p targets skeletal endothelium coupling of angiogenesis and osteogenesis during ageing
Li et al. Homeobox C10 inhibits the osteogenic differentiation potential of mesenchymal stem cells
Arany et al. Phenotype properties of a novel spontaneously immortalized odontoblast-lineage cell line
WO2010131315A1 (ja) 誘導性間葉系幹細胞およびその作製方法
Gao et al. Roles of L-type calcium channels (CaV1. 2) and the distal C-terminus (DCT) in differentiation and mineralization of rat dental apical papilla stem cells (rSCAPs)
WO2011145722A1 (ja) Aimの機能を制御する化合物のスクリーニング方法
Temme et al. Genetic profiling and surface proteome analysis of human atrial stromal cells and rat ventricular epicardium-derived cells reveals novel insights into their cardiogenic potential
JP2010189302A (ja) 病変間葉系幹細胞が関連する疾患の治療剤および間葉系幹細胞の検出マーカーの利用
Huang et al. Role of N6-adenosine-methyltransferase subunits METTL3 and METTL14 in the biological properties of periodontal ligament cells

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 09844589

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

DPE1 Request for preliminary examination filed after expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 09844589

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP