WO2014200256A1 - Egf 또는 bfgf를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 증식 및 치료능력 탐지 마커 및 이의 용도 - Google Patents

Egf 또는 bfgf를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 증식 및 치료능력 탐지 마커 및 이의 용도 Download PDF

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정경숙
김미형
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한국생명공학연구원
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Definitions

  • the present invention relates to a composition and a method for detecting a marker for detecting the therapeutic or proliferative capacity of adipose derived stem cells, cultured in a medium containing EGF (Epidermal growth factor) or bFGF (basic fibroblast growth factor).
  • EGF Epidermal growth factor
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • Adipose tissue contains more than 1,000 times more stem cells than stem cells capable of separating from the same amount of bone marrow. For this reason, adipose tissue-derived stem cells (ASC) are used as biotransplant materials. There is a lot of research going on. Adipose-derived stem cells also have the same differentiation potential as bone marrow-derived stem cells and can differentiate into cartilage, bone, fat or muscle cells. In addition, adipose derived stem cells have similar expression patterns of bone marrow-derived stem cells and cell surface markers, and do not induce an immune response in autologous or allogeneic transplantation both in vivo and in vitro , but rather have a function of regulating the immune response. It has been reported to be spotlighted as an effective means of cell therapy.
  • AGPAT9 (1-acylglycerol-3-phosphate) was developed as a result of the effort to develop markers showing the difference in expression between adipose derived stem cells cultured in basal medium and adipose derived stem cells cultured in proliferating medium.
  • O-acyltransferase 9 ANXA10 (annexin A10), IGF2BP3 (insulin-like growth factor 2 binding protein 3) and PTGER2 (prostaglandin E receptor 2) genes are increased in adipose derived stem cells cultured in proliferation medium
  • Adipose-derived stem cells cultured in proliferation medium with expression of ITGA11 (integrin, alpha 11), PAWR (PRKC, apoptosis, WT1, regulator) and SFRP2 (secreted frizzled-related protein 2) genes It confirmed that this is reduced by standing, the genes that can be used or the like, including a therapeutically active measuring proliferation of adipose derived stem cell ability, immune inhibitory ability, and differentiation ability, such as cultured in growth medium was confirmed and completed the present invention.
  • One object of the present invention is AGPAT9 (1-acylglycerol-3-phosphate O-acyltransferase 9), ANXA10 (annexin A10), IGF2BP3 (insulin-like growth factor 2 binding protein 3), PTGER2 (prostaglandin E receptor 2), ITGA11 (integrin, alpha 11), PAWR (PRKC, apoptosis, WT1, regulator) and one or more gene mRNAs selected from the group consisting of secreted frizzled-related protein 2 (SFRP2) or agents for measuring protein levels thereof, It is to provide a marker detection composition for detecting the therapeutic capacity of adipose derived stem cells cultured in a medium containing EGF (Epidermal growth factor) or bFGF (basic fibroblast growth factor).
  • EGF Epidermal growth factor
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • Another object of the present invention is a medium comprising EGF or bFGF, comprising an agent for measuring at least one gene mRNA or protein level thereof selected from the group consisting of AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3, PTGER2, ITGA11, PAWR and SFRP2. It is to provide a marker detection composition for detecting the proliferative capacity of the adipose derived stem cells cultured in.
  • Another object of the present invention is to provide a marker detection kit for detecting the therapeutic and proliferative capacity of adipose derived stem cells cultured in a medium containing EGF or bFGF, including the marker detection composition.
  • Another object of the present invention is at least one gene mRNA or protein level thereof selected from the group consisting of AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3, PTGER2, ITGA11, PAWR and SFRP2 of adipose derived stem cells cultured in a medium comprising EGF or bFGF
  • AGPAT9 AGPAT9
  • the present invention can provide more useful data in verifying the efficacy of adipose derived stem cells by providing markers that can determine adipose derived stem cells with increased clinical efficacy in cultured medium.
  • it can be usefully used as a marker for detecting therapeutic agent activity represented by the proliferation ability, differentiation capacity, and the like of adipose derived stem cells cultured using the improved culture method.
  • FIG. 1 is a diagram showing the cell shape of adipose derived stem cells in basal medium and proliferation medium.
  • Figure 2 is a diagram showing the difference in cell growth of adipose derived stem cells in basal medium and proliferation medium.
  • Figure 3 shows the microarray results of the cells cultured in three sets of basal medium and adipose derived stem cells cultured in proliferation medium using Illumina 24K chip.
  • Figure 4 shows the change in the expression level of the genes increased in the growth medium selected in Figure 3 in adipose derived stem cells collected from 17 donors by RT-PCR and real-time PCR, RPL13A is a control gene.
  • Figure 4a shows the results of the increase APPAT9 in the growth medium
  • Figure 4b shows the results of ANXA10
  • Figure 4c IGF2BP3 shows the results of ANXA10
  • Figure 4d PTGER2 Figure 4d PTGER2.
  • FIG. 5 shows the change in the expression level of the genes decreased in the growth medium selected in Figure 3 in adipose derived stem cells collected from 17 donors by RT-PCR and real-time PCR
  • RPL13A is a control gene.
  • FIG. 5A shows the result of ITGA11 decreasing in growth medium
  • FIG. 5B shows the result of PAWR
  • FIG. 5C shows the result of SFRP2.
  • Figure 6 shows the results of protein changes in the basal medium and proliferation medium of the genes.
  • the invention relates to fats cultured in a medium comprising EGF or bFGF, comprising an agent that measures one or more gene mRNAs or protein levels thereof selected from the group consisting of AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3, PTGER2, ITGA11, PAWR and SFRP2.
  • a composition for detecting a therapeutic capability detection marker of a stem cell comprising EGF or bFGF, comprising an agent that measures one or more gene mRNAs or protein levels thereof selected from the group consisting of AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3, PTGER2, ITGA11, PAWR and SFRP2.
  • adipocyte-derived stem cell refers to stem cells isolated from adipose tissue capable of differentiating into most mesenchymal cells such as adipocytes, osteoblasts, chondrocytes, and myofibroblasts.
  • ASC adipocyte-derived stem cell
  • a progenitor cell a stromal cell, a multipotent adipose-derived cell or adipose derived adult stem cells (adipose derived adult stem cells) means a cell called.
  • the fat-derived stem cells are not particularly limited thereto, but may be fat-derived stem cells derived from mammals including pigs, cattle, primates, and humans that can be transplanted into humans.
  • the term "marker for detecting the therapeutic ability of adipose derived stem cells cultured in a medium containing EGF or bFGF” refers to cells cultured in a basal medium not containing EGF or bFGF and EGF or bFGF. When compared with adipose derived stem cells cultured in proliferation medium, it refers to an organic biomolecule showing a significant difference in the expression or not.
  • the adipose derived stem cells cultured in the proliferation medium are superior to the therapeutic ability, such as immunosuppressive ability or differentiation capacity, compared to the adipose derived stem cells cultured in the basal medium (Korean Patent Publication No. 10-2010-0118491).
  • AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3, PTGER2, ITGA11, PAWR and SFRP2 As one or more genes selected from the group, AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3 and PTGER2 have increased expression in adipose derived stem cells cultured in proliferation medium compared to adipose derived stem cells cultured in primary medium, and ITGA11, PAWR and SFRP2 It is a gene whose expression is reduced.
  • genes used in the present invention can be obtained from a known database such as GenBank of the National Institutes of Health, such as AGPAT9 (NM_032717.3, NP_001243351.1), ANXA10 (NM_007193.3, NP_009124.2), IGF2BP3 ( NM_006547.2, NP_006538.2), PTGER2 (NM_000956.2, NP_000947.2), ITGA11 (NM_001004439.1, NP_001004439.1), PAWR (NM_002583.2, NP_002574.2) or SFRP2 (NM_003013.2, NP_003004. 1), but is not limited thereto.
  • GenBank GenBank of the National Institutes of Health
  • the genes show differences in expression in both media. It can be used as a marker for detecting the therapeutic ability of a cell.
  • EGF epidermal growth factor
  • the EGF has an activity of promoting the proliferation of various epithelial cells and can also proliferate mouse T cells or human fibroblasts.
  • EGF refers to a protein that is included in the culture medium of adipose derived stem cells and plays a role in increasing therapeutic activity such as its proliferation and differentiation ability.
  • basic fibroblast growth factor refers to growth factors involved in biological processes such as angiogenesis or wound healing.
  • bFGF refers to a protein that is included in the medium of adipose derived stem cells, such as EGF, and serves to increase therapeutic activity such as its proliferation and differentiation ability.
  • the term "basal medium” is a medium for culturing adipose derived stem cells, in particular the stromal-vascular fraction comprising the same.
  • the basal medium may be a medium containing serum in culture of adipose derived stem cells such as DMEM medium or DMEM / F12, and the serum may be FBS (Fetal bovine serum) commonly used for cell culture. It may be included in about 10%, that is, about 8 to 12%, but if the fat-derived stem cell culture medium commonly used in the art is not particularly limited thereto. In one embodiment of the present invention was used as a basal medium DMEM medium containing 10% FBS. In the present invention, the "base medium” may be mixed with the "basic medium”.
  • the term "proliferation medium” is a medium used for improving the proliferation or differentiation capacity of adipose derived stem cells, and a medium which adds a basic fibroblast growth factor (BFGF) or an epidermal growth factor (EGF) to the basal medium.
  • the growth medium may contain EGF or bFGF at a concentration of 0.1 ng / ml to 100 ng / ml, respectively.
  • the "proliferation medium” may be mixed with "medium containing EGF or bFGF”.
  • the term "therapeutic capacity” means the therapeutic activity of the stem cells (therapeutic activity), and when using the stem cells of the present invention as a cell therapy, it is also referred to as "titer”.
  • tumor a cell therapy
  • proliferative capacity a cell proliferation
  • differentiation capacity a cell proliferation factor
  • immunomodulatory capacity a cell proliferation factor
  • differentiation capacity refers to the ability of the adipose derived stem cells to be differentiated into adipocytes, osteoblasts, chondrocytes, myofibroblasts, osteoblasts, muscle cells or neurons.
  • adipose derived stem cells having high differentiation capacity are meant to be cells which easily induce differentiation into adipocytes, osteoblasts, chondrocytes, myofibroblasts, osteoblasts, muscle cells or neurons, but are not limited thereto.
  • immunosuppressive ability preferably refers to immunosuppressive ability
  • the immunosuppressive ability means that adipose derived stem cells cultured in a medium containing bFGF or EGF can inhibit the activity of immune cells.
  • mesenchymal stem cells are known to be involved in the immunosuppressive effect by inhibiting APC (antigen presenting cell). Therefore, the adipose derived stem cells of the present invention can be used as an immunosuppressive agent to treat immune diseases.
  • therapeutic adipose derived stem cells has a higher expression level of one or more genes selected from the group consisting of AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3 and PTGER2 compared to adipose derived stem cells cultured in basal medium, ITGA11 Fat-derived stem cells with reduced expression of one or more selected from the group consisting of PAWR and SFRP2, and have faster cell proliferation, better immunosuppressive activity, and differentiation efficiency than fat-derived stem cells cultured in basal medium.
  • the expression level of such genes can be confirmed by measuring the amount of mRNA or protein.
  • mRNA level measurement refers to a process of confirming the presence and expression level of mRNA of marker genes representing the therapeutic ability of adipose derived stem cells in a biological sample to diagnose the differentiation ability of adipose derived stem cells. Measure the amount of.
  • Analytical methods for this purpose include reverse transcriptase (RT-PCR), competitive reverse transcriptase (RT) PCR, real time reverse transcriptase (Realtime RT-PCR), and RNase protection assay (RPA). , Northern blotting or DNA chips, but is not limited thereto.
  • RT-PCR reverse transcriptase
  • RT competitive reverse transcriptase
  • Realtime RT-PCR real time reverse transcriptase
  • RNase protection assay RNase protection assay
  • the agent for measuring mRNA level of the gene is preferably a primer pair or probe, and the nucleic acid sequences of the AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3, PTGER2, ITGA11, PAWR and SFRP2 genes are NM_032717.3, NM_007193.3, NM_006547.2, NM_000956 As described in .2, NM_001004439.1, NM_002583.2 and NM_003013.2, one of skill in the art can design primers or probes that specifically amplify specific regions of these genes based on the sequences.
  • primer refers to a nucleic acid sequence having a short free 3 'terminal hydroxyl group, which forms a base pair with a complementary template and functions as a starting point for template strand copying. Means.
  • the primer is preferably a primer pair of SEQ ID NOs: 3 and 4 for AGPAT9, a primer pair of SEQ ID NOs: 5 and 6 for ANXA10, a primer pair of SEQ ID NOs: 7 and 8 for IGF2BP3,
  • Primers for PTGER2 are primer pairs SEQ ID NOs: 9 and 10
  • primers for ITGA11 are primer pairs SEQ ID NOs: 11 and 12
  • primers for PAWR are primer pairs SEQ ID NO: 13 and 14
  • primers for SFRP2 are SEQ ID NO: 15 and 16 primer pairs, but is not limited thereto.
  • the term “probe” refers to a nucleic acid fragment such as RNA or DNA corresponding to a short number of bases or hundreds of bases that can form specific binding with mRNA, and is labeled to indicate the presence or absence of a specific mRNA. You can check it.
  • the probe may be manufactured in the form of an oligonucleotide probe, a single stranded DNA probe, a double stranded DNA probe or an RNA probe.
  • hybridization is performed using a probe complementary to AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3, PTGER2, ITGA11, PAWR or SFRP2 polynucleotides, and it is possible to determine the differentiation ability of adipose derived stem cells through hybridization. Selection of suitable probes and hybridization conditions can be modified based on what is known in the art.
  • Primers of the invention can initiate DNA synthesis in the presence of reagents for polymerization (ie, DNA polymerase or reverse transcriptase) and four different nucleoside triphosphates at appropriate buffers and temperatures.
  • the primers of the present invention are sense and antisense nucleic acids having 7 to 50 nucleotide sequences as primers specific for each marker gene. Primers can incorporate additional features that do not change the basic properties of the primers that serve as a starting point for DNA synthesis.
  • Primers or probes of the invention can be synthesized chemically using phosphoramidite solid support methods, or other well known methods. Such nucleic acid sequences can also be modified using many means known in the art.
  • Non-limiting examples of such modifications include methylation, encapsulation, substitution of one or more homologs of natural nucleotides, and modifications between nucleotides, such as uncharged linkages such as methyl phosphonate, phosphoester, phosphoroami Date, carbamate, etc.) or charged linkages such as phosphorothioate, phosphorodithioate and the like.
  • Nucleic acids may be selected from one or more additional covalently linked residues, such as proteins (eg, nucleases, toxins, antibodies, signal peptides, poly-L-lysine, etc.), inserts (eg, acridine, psoralene, etc.).
  • Chelating agents eg, metals, radioactive metals, iron, oxidizing metals, etc.
  • alkylating agents eg, metals, radioactive metals, iron, oxidizing metals, etc.
  • Nucleic acid sequences of the invention can also be modified using a label that can provide a detectable signal directly or indirectly. Examples of labels include radioisotopes, fluorescent molecules and biotin.
  • protein level measurement refers to a process for confirming the presence and degree of expression of a protein expressed from a marker gene representing a therapeutic ability of adipose derived stem cells in a biological sample to detect the differentiation capacity of adipose derived stem cells.
  • the amount of protein can be confirmed using an antibody that specifically binds to the protein of the gene.
  • an antibody refers to a specific protein molecule directed against an antigenic site.
  • an antibody refers to an antibody that specifically binds to a marker protein, specifically for a protein encoded by the marker genes of the present invention, AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3, PTGER2, ITGA11, PAWR or SFRP2. It means an antibody that specifically binds, and includes all polyclonal antibodies, monoclonal antibodies and recombinant antibodies. Since the marker proteins of the present invention have been identified, the production of antibodies using them can be readily prepared using techniques well known in the art.
  • Polyclonal antibodies can be produced by methods well known in the art for injecting the marker protein antigen into an animal and collecting blood from the animal to obtain serum comprising the antibody.
  • Such polyclonal antibodies can be prepared from any animal species host such as goat, rabbit, sheep, monkey, horse, pig, cow and dog.
  • Monoclonal antibodies are known in the art by the hybridoma method (see Kohler and Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6: 511-519), or phage antibody libraries (Clackson et al, Nature, 352: 624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222: 58, 1-597, 1991), and the like.
  • Antibodies prepared by the above method can be isolated and purified using methods such as gel electrophoresis, dialysis, salt precipitation, ion exchange chromatography or affinity chromatography.
  • the antibodies of the present invention also include functional fragments of antibody molecules, as well as complete forms having two full length light chains and two full length heavy chains.
  • a functional fragment of an antibody molecule refers to a fragment having at least antigen binding function, and includes Fab, F (ab '), F (ab') 2 and Fv. Protein levels can be measured by Western blot, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, and Ouchterlony immunodiffusion.
  • Rocket immunoelectrophoresis tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, fluorescence activated cell sorter (FACS), and protein chip.
  • FACS fluorescence activated cell sorter
  • protein chip protein chip.
  • Western blot was used to measure the level of the protein (Example 4).
  • the fat-derived stem cells cultured in a medium containing EGF or bFGF are more proliferative, immunosuppressive, or differentiating than the fat-derived stem cells cultured in a basal medium that does not contain the above factors. Based on the excellent activity (Korean Patent Publication No.
  • high expression levels of AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3 and PTGER2 proteins, or low expression levels of ITGA11, PAWR or SFRP2 proteins may be markers for indicating therapeutic activity of adipose derived stem cells (FIG. 6).
  • the invention comprises an EGF or bFGF comprising an agent that measures one or more gene mRNAs or protein levels thereof selected from the group consisting of AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3, PTGER2, ITGA11, PAWR and SFRP2 It provides a marker detection composition for detecting the proliferation capacity of the adipose derived stem cells cultured in the medium.
  • the measurement and genes of the adipose derived stem cells, EGF, bFGF, mRNA or protein levels thereof are as described above.
  • proliferative capacity refers to the ability of cells to increase the number of cells accompanied by DNA synthesis and cell division by autonomous or exogenous stimulation such as hormones. This includes potential retention.
  • Stem cells have self renewal capacity in vitro culture and have proliferative capacity.
  • the proliferation capacity decreases, resulting in the limitation of obtaining pure and large amount of stem cells. Therefore, in order to effectively use stem cells as a therapeutic agent, a culture method capable of obtaining a large amount of stem cells in a short time is required.
  • the adipose derived stem cells cultured in a medium containing EGF or bFGF are superior to the adipose derived stem cells cultured in the basal medium.
  • Genes showing differences in expression between adipose derived stem cells cultured at were identified.
  • the expression of one or more genes selected from the group consisting of AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3, and PTGER2 is increased compared to the adipose derived stem cells cultured in the basal medium, ITGA11, PAWR
  • expression of one or more genes selected from the group consisting of SFRP2 is reduced compared to adipose derived stem cells cultured in basal medium.
  • Adipose-derived stem cells exhibiting such expression characteristics are reduced in the expression of adipose derived stem cells, especially AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3, or PTGER2 genes cultured in basal medium, or increased expression of ITGA11, PAWR or SFRP2 genes.
  • the cell proliferation is better and the cell yield is high, and the clinical therapeutic effects such as cell proliferation, immunosuppression, and differentiation ability are high.
  • the present invention comprises a fat for culturing in a medium containing EGF or bFGF comprising a marker detection composition for detecting the differentiation capacity of the adipose derived stem cells cultured in the medium containing the EGF or bFGF
  • a marker detection kit for detecting the differentiation capacity of the stem cells.
  • the marker detection composition for detecting the differentiation ability of the adipose derived stem cells cultured in the medium containing the EGF or bFGF is as mentioned above.
  • the marker detection kit of the present invention is used for immunological analysis as well as primers or antibodies capable of selectively recognizing marker genes or proteins thereof whose expression is increased or decreased by culturing in a growth medium containing EGF or bFGF.
  • Tools and reagents commonly used in the art include, but are not limited to, suitable carriers, labeling materials capable of generating detectable signals, solubilizers, detergents, buffers, stabilizers, and the like.
  • the label is an enzyme, it may include a substrate and a reaction terminator that can measure the activity of the enzyme.
  • Suitable carriers include, but are not limited to, soluble carriers such as physiologically acceptable buffers known in the art, such as PBS, insoluble carriers such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyesters, Polyacrylonitrile, fluororesin, crosslinked dextran, polysaccharides, polymers such as magnetic fine particles plated with latex metal, other papers, glass, metals, agarose and combinations thereof.
  • soluble carriers such as physiologically acceptable buffers known in the art, such as PBS, insoluble carriers such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyesters, Polyacrylonitrile, fluororesin, crosslinked dextran, polysaccharides, polymers such as magnetic fine particles plated with latex metal, other papers, glass, metals, agarose and combinations thereof.
  • the kit for detecting a marker of the present invention may preferably be an RT-PCR kit, a DNA kit or a protein chip kit.
  • the protein chip is provided with an antibody against a protein encoded by the gene, antigen-antibody complex formation for two or more antibodies can be observed, which is more advantageous in detecting the differentiation capacity of adipose derived stem cells.
  • the RT-PCR kit may comprise individual primer pairs specific for the marker gene, as well as other test tubes or other suitable containers, reaction buffers (variable pH and magnesium concentrations), deoxynucleotides (dNTPs), Taq Enzymes such as polymerase and reverse transcriptase, DNAse, RNAse inhibitor DEPC-water, sterile water and the like.
  • reaction buffers variable pH and magnesium concentrations
  • dNTPs deoxynucleotides
  • Taq Enzymes such as polymerase and reverse transcriptase, DNAse, RNAse inhibitor DEPC-water, sterile water and the like.
  • the DNA chip kit may include a substrate on which a cDNA or oligonucleotide corresponding to a gene or a fragment thereof is attached, and a reagent, an agent, an enzyme, etc. for preparing a fluorescent probe, and the substrate may be a control gene. Or cDNA or oligonucleotide corresponding to fragments thereof.
  • the protein chip kit may be a kit in which one or more antibodies against a marker are arranged at a predetermined position on a substrate and immobilized at a high density.
  • the protein is separated from the sample, and the separated protein is hybridized with the protein chip to form an antigen-antibody complex, which can be read to confirm the presence or expression level of the protein.
  • the present invention includes a fat cultured in a medium containing EGF or bFGF, including a marker detection composition for detecting the proliferation capacity of the adipose derived stem cells cultured in the medium comprising the EGF or bFGF It provides a marker detection kit for detecting the proliferation capacity of the stem cells derived.
  • the marker detecting composition for detecting the proliferative capacity of the adipose derived stem cells cultured in the medium containing the EGF or bFGF, and the kit for detecting the marker may be used as described above.
  • the present invention is one or more gene mRNA or its selected from the group consisting of AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3, PTGER2, ITGA11, PAWR and SFRP2 of adipose derived stem cells cultured in a medium comprising EGF or bFGF It provides a method for detecting the differentiation capacity of adipose derived stem cells, comprising measuring protein levels.
  • the medium containing the EGF or bFGF, the mRNA level of the gene or its protein level and the differentiation capacity of the adipose derived stem cells are as described above.
  • the method further comprises that if the amount of one or more gene mRNAs or proteins thereof selected from the group consisting of ITGA11, PAWR and SFRP2 is less than the value measured in adipose derived stem cells cultured in basal medium as a control, Determining higher than the control group, or the value of one or more gene mRNAs or proteins thereof selected from the group consisting of AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3, and PTGER2 is measured on adipose derived stem cells cultured in the basal medium control group
  • the method may be a method for detecting the differentiation capacity of the adipose derived stem cells, including the step of determining that the differentiation capacity is lower than that of the control group.
  • the fat-derived stem cells cultured in the basal medium as a control and the fat-derived stem cells cultured in the growth medium are preferably the same passage number or less than one passage.
  • the adipose derived stem cells cultured in a medium containing EGF or bFGF are superior in therapeutic activity such as proliferative capacity and differentiation capacity than adipose derived stem cells cultured in a basal medium not containing the above factors.
  • a gene showing a significant difference in expression between adipose derived stem cells cultured in a medium containing EGF or bFGF and adipose derived stem cells cultured in a basal medium was identified.
  • the present invention is one or more gene mRNA or its selected from the group consisting of AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3, PTGER2, ITGA11, PAWR and SFRP2 of adipose derived stem cells cultured in a medium comprising EGF or bFGF It provides a method for detecting the proliferative capacity of adipose derived stem cells, comprising measuring protein levels.
  • the medium containing the EGF or bFGF, the mRNA level of the gene or its protein level measurement and the proliferation capacity of the adipose derived stem cells are as described above.
  • the proliferative capacity is If the amount of one or more gene mRNA selected from the group consisting of AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3 and PTGER2 or a protein thereof is higher than the value measured in the adipose derived stem cells cultured in the basal medium control group , It may be a method for detecting the proliferation capacity of the adipose derived stem cells further comprising the step of determining that the proliferation capacity is lower than the control group.
  • Example 1 Verification of cell proliferation ability of adipose derived stem cells according to basal medium and proliferation medium
  • Adipose tissue was isolated from the donor (Antrogen, Gyeonggi-do, Korea), and adipose derived stromal stem cells were isolated from the obtained adipose tissue.
  • Adipose tissue was washed 34 times with the same volume of Krbs-Ringer Bicarbonate (KRB) solution to remove blood.
  • KRB Krbs-Ringer Bicarbonate
  • the same volume of collagenase solution as adipose tissue was added and reacted in a 37 ° C. water bath. This was transferred to a centrifuge tube and centrifuged at 20 ° C. and 1200 rpm for 10 minutes. The supernatant fat layer was removed, and the lower collagenase solution was carefully separated so as not to shake.
  • the basal medium was suspended and centrifuged for 5 minutes at 20 °C, 1200 rpm. At this time, since the sinking below is the stromal-vascular fraction, the supernatant was removed.
  • the stromal-vascular fractions were suspended in basal medium and inoculated in culture vessels and incubated in 37 ° C., 5% CO 2 incubator for 24 hours. After removal of the culture solution, the cells were washed with phosphate buffer, and the basal medium or basal medium contained 1 ng / ml of basic fibroblast growth factor (bFGF), or 5 ng of epidermal growth factor (EGF) in basal medium. Proliferation was performed using the medium contained at a / ml concentration.
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • EGF epidermal growth factor
  • adipose derived stromal stem cells When adipose derived stromal stem cells were grown to about 80-90% of the culture vessel, they were obtained by separating into single cells by treating with trypsin. The obtained cells were diluted 1: 31: 4 with proliferation medium to carry out passage culture (Publication No. 10-2010-0118491). To analyze the gene expression differences according to the composition of culture medium, 5 passage cells cultured with basal medium, DMEM containing 10% FBS, and 5 passage cells cultured with growth medium containing 1 ng / ml bFGF in basal medium It was.
  • Figure 1 shows a morphology picture of adipose derived stem cells cultured in basal medium and proliferation medium.
  • Figure 2 shows an example of cell population doubling level (CPDL) of adipose derived stem cells cultured in basal medium and proliferation medium.
  • CPDL cell population doubling level
  • Example 2 Confirmation of gene expression increase and decrease by the medium of adipose derived stem cells by microarray experiment
  • Adipose tissue was isolated from 17 donors (Antrogen, Gyeonggi-do, Korea) and cultured adipose derived stem cells as in Example 1.
  • the cultured adipose derived stem cells were lysed in 15 ml of digestion buffer in a kit to which 150 ⁇ l of beta mercapto ethanol was added. 15 ml of 70% ethanol was added thereto, mixed well, and centrifuged at 3000 g for 5 minutes to attach total RNA to the membrane. After two washes, total RNA was isolated by adding 1.2 ml of RNase-free water.
  • the extracted total RNA was hybridized using an Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit (Ambion). Subjected to T7 Oligo (dT) to synthesize cDNA using a primer, and, in vitro transcription using a biotin-UTP (in vitro transcription) to prepare a biotin-labeled cRNA.
  • the prepared cRNA was quantified using NanoDrop.
  • CRNA prepared from adipose derived stem cells were hybridized to a Human-6 V2 (Illumina) chip. After hybridization, DNA chips were washed using Illumina Gene Expression System Wash (Illumina) to remove nonspecific hybridization, and the washed DNA chips were labeled with streptavidin-Cy3 (Amersham) fluorescent dye.
  • Fluorescently labeled DNA chips were scanned using a confocal laser scanner (Illumina) to obtain data of fluorescence present in each spot and stored as image files in TIFF format.
  • TIFF image files were quantified with BeadStudio version 3 (Illumina) to quantify the fluorescence values of each spot. Quantified results were corrected using the 'quantile' function with Avadis Prophetic version 3.3 (Strand Genomics) program.
  • FIG. Figure 3 shows the difference in expression of the genes measured in passage 5 cells cultured in basal medium and passage 5 cells cultured in proliferation medium.
  • AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3, and PTGER2 genes show a significant increase in proliferation medium compared to basal medium
  • ITGA11, PAWR and SFRP2 are genes whose expression is decreased in growth medium compared to basal medium. From these results, it can be seen that the genes show a large expression difference when comparing the basal medium and the proliferation medium, and thus it can be used to determine the fat stem cells cultured in the proliferation medium having high clinical effectiveness.
  • these results may be different from known markers for distinguishing stem cells from differentiated stem cells, and may be different depending on passage number and differentiation.
  • IGF2BP3 increases with passage in the stem cell state before differentiation, but rapidly decreases when differentiation begins. In the case of ITM2A, it decreases with passage in the stem cell state but increases when differentiation begins.
  • Example 2 The expression levels of the genes identified in Example 2 were analyzed using RT-PCR method using 17 pairs of donor adipose stem cell samples (basal medium and proliferating medium cultured cells). Total RNA was isolated via the method of Example 2.
  • Example 3-1 cDNA Synthesis and Concentration Correction of a Template
  • RNA / primer mixture was stored at 55 ° C.
  • RPL13A was used as a standard gene for quantifying marker genes. RT-PCR reaction was performed using primers of the standard gene, and the concentration of cDNA was corrected so that the expression level of the standard gene RPL13A was the same. First, each cDNA was diluted 20-fold, and then PCR reaction was performed using 2 ⁇ l of the diluted sample.
  • PCR was performed using 15 ⁇ l of 2x PCR premix (Hot start), 2 ⁇ l of PRL13A forward primer, 2 ⁇ l of PRL13A reverse primer, and 11 ⁇ l of distilled water. 20 cycles, 23 cycles, and 25 cycles were performed. At this time, RT-PCR reaction conditions were performed at 94 °C 30 seconds, 50 °C 30 seconds, 72 °C 1 minutes.
  • the RPL13A primers used were forward 5'-CATCGTGGCTAAACAGGTACTG-3 '(SEQ ID NO: 1), reverse 5'-GCACGACCTTGAGGGCAGC-3' (SEQ ID NO: 2).
  • Each product was loaded into a 2% agarose gel, electrophoresed, electrophoresed, and gel images were taken. The images were quantified using the TotalLab v1.0 program (Nonlinear Dynamix), and then corrected for PCR. The concentration of was equally corrected.
  • Example 3-2 Expression level analysis using RT-PCR / Real-Time PCR
  • CDNA diluted to the same amount was subjected to PCR using the sense and antisense primers of the genes.
  • cDNA was mixed into 3 ⁇ l, 2x premix 10 ⁇ l, primer 2 ⁇ l each (20 pmole) and distilled water 2 ⁇ l into 20 ⁇ l total solution.
  • PCR reaction was 94 °C 1min, 54 °C 30sec, 72 °C 1min. Cycles vary by gene.
  • it was electrophoresed using 2% agarose gel and analyzed using an imaging apparatus. Realtime RT-PCR was used with DNASYBRI reagent from Qiagen (CA, USA) and LightCycler (Roche).
  • Example 3 Using donor adipose stem cell samples (cultivated in basal medium and proliferation medium), the expression level of some of the genes identified in Example 3 was analyzed by protein quantification by Western blot analysis.
  • the cells grown in a 60 mm dish was rinsed once with PBS, and then, cold protein lysis buffer (RIPA cell lysis buffer: 50 mM Tris-Cl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 10).
  • % Glycerol, 1 mM PMSF, 1 mM DTT, 20 mM NaF, 1 mM EDTA, protease inhibitors were added to prepare the proteins of the cells.
  • SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
  • an antibody corresponding to each protein was attached.
  • Information on antibodies is as follows. anti-ANXA10 (Santa Cruz, sc-70009), anti-IGF2BP3 (Santa Cruz, sc-100766), anti-PTGER2 (abcam, ab16151), anti-ITGA11 (ab107858), anti-PAWR (Sigma A0545), anti- ACTIN (Sigma, A5316).
  • the amount of each protein was identified by band using Immobilon TM Western Blotting Detection reagents (Millipore).
  • ANXA10, IGF2BP3 and PTGER2 genes whose mRNA levels are increased in the growth medium through RT-PCR of the genes, low protein expression in the basal medium and high protein expression in the growth medium, which is consistent with the results of mRNA experiments
  • ITGA11 and PAWR genes whose mRNA levels decrease with increasing passage in the growth medium, the expression of the protein in the basal medium and the decrease in the expression of the protein in the growth medium were observed. It was confirmed (FIG. 6).

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Abstract

본 발명은 EGF(Epidermal growth factor) 또는 bFGF(basic fibroblast growth factor)를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 증식능력 또는 치료능력을 탐지하기 위한 마커 검출용 조성물 및 탐지방법에 관한 것이다.

Description

EGF 또는 BFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 증식 및 치료능력 탐지 마커 및 이의 용도
본 발명은 EGF(Epidermal growth factor) 또는 bFGF(basic fibroblast growth factor)를 포함하는 배지에서 배양한, 지방유래 줄기세포의 치료능력 또는 증식능력을 탐지하기 위한 마커 검출용 조성물 및 탐지방법에 관한 것이다.
지방조직은 이와 동량의 골수에서 분리할 수 있는 줄기세포에 비하여 1,000배 이상의 줄기세포를 다량 포함하고 있어, 이러한 이유로 지방조직 유래 줄기세포(adipocyte-derived stem cells, ASC)를 생체이식 재료로 이용하고자 하는 연구가 다양하게 진행되고 있다. 지방유래 줄기세포는 또한, 골수유래 줄기세포와 같은 다분화능을 가지고 있어 연골, 뼈, 지방 또는 근육세포 등으로 분화가 가능하다. 또한, 지방유래 줄기세포는 골수유래 줄기세포와 세포 표면 마커의 발현양상이 유사하고 in vivo 및 in vitro 모두에서 자가 또는 동종 이식시에도 면역반응을 유발시키지 않고, 오히려 면역반응을 조절하는 기능을 갖는 것으로 보고되고 있어 세포치료의 효과적인 수단으로서 각광받고 있다.
한편, 기존에 개시된 기저배지를 이용한 표준 세포배양법을 사용하여 지방유래 줄기세포를 체외배양 하는 경우, 세포배양에 장시간이 소요되어 임상적으로 유효한 세포 수를 얻기에 어려웠다. 따라서 표준 세포배양법의 경우, 실제 임상 적용에 있어 실효성이 떨어지는 문제점이 있었다. 이에 본 발명자들은 효과적인 임상적 치료방법을 보일 수 있는 배양법을 개발하고자 하였고, 이에 EGF(Epidermal growth factor) 또는 bFGF(basic fibroblast growth factor)를 포함하는 증식배지에서 배양한 지방유래 줄기세포가 표준 세포배양법에 의한 지방유래 줄기세포에 비해 우수한 임상적 효과를 가짐을 확인하였으나(대한민국 공개특허 제10-2010-0118491호), 상기와 같은 EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 우수한 임상적 효능과 관련된 객관적인 분자생물학적 특성분석은 아직 이루어지지 않은 상태이다.
특히, 기저배지에서 배양된 줄기세포에 비해 증식배지에서 배양된 줄기세포의 우수한 세포증식과 치료효과를 대변하면서, 일정 수준 이상의 치료 효과를 가지는 줄기세포 치료제를 실제 의약품으로서 재현성있게 생산하기 위해서는, 상기와 같은 증식배지를 이용한 개선된 배양법에 의해 획득한 줄기세포의 분화능력, 증식능력 및 역가와 같은 약효를 반영할 수 있는 품질관리 시험법 개발이 필요하다. 특히, 세포치료제 수율 증가 및 치료제 품질을 측정하는 방법을 개발하기 위해서는 이를 대변할 바이오 마커가 필요하다.
본 발명자들은, 지방유래 줄기세포가 기저배지에 비해 증식배지에서 배양하는 경우, 그 증식능이 우수하며, 또한 오랜 계대 배양에도 줄기세포의 특성을 잘 유지하며 분열할 수 있을 뿐만 아니라, 분화능을 비롯한 치료적 효능이 높다는 점에 착안하여, 기저배지에서 배양한 지방유래 줄기세포와 증식배지에서 배양한 지방유래 줄기세포 간의 발현 차이를 보이는 마커를 개발하고자 예의 노력한 결과, AGPAT9(1-acylglycerol-3-phosphate O-acyltransferase 9), ANXA10(annexin A10), IGF2BP3(insulin-like growth factor 2 binding protein 3) 및 PTGER2(prostaglandin E receptor 2) 유전자의 발현이 증식배지에서 배양한 지방유래 줄기세포에서 증가되어 있고, ITGA11(integrin, alpha 11), PAWR(PRKC, apoptosis, WT1, regulator) 및 SFRP2(secreted frizzled-related protein 2) 유전자의 발현이 증식배지에서 배양한 지방유래 줄기세포에서 감소되어 있음을 확인하여, 상기 유전자들은 증식배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 증식능력, 면역억제능, 분화능력 등을 비롯한 치료적 활성 측정 등에 이용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 AGPAT9(1-acylglycerol-3-phosphate O-acyltransferase 9), ANXA10(annexin A10), IGF2BP3(insulin-like growth factor 2 binding protein 3), PTGER2(prostaglandin E receptor 2), ITGA11(integrin, alpha 11), PAWR(PRKC, apoptosis, WT1, regulator) 및 SFRP2(secreted frizzled-related protein 2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, EGF(Epidermal growth factor) 또는 bFGF(basic fibroblast growth factor)를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 치료능력 탐지를 위한 마커 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3, PTGER2, ITGA11, PAWR 및 SFRP2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 증식능력 탐지를 위한 마커 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 마커 검출용 조성물을 포함하는, EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 치료능력 및 증식능력을 탐지하기 위한 마커 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3, PTGER2, ITGA11, PAWR 및 SFRP2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 지방유래 줄기세포의 치료능력 또는 증식능력을 탐지하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 증식배지에서 배양된 임상적 효능이 증가된 지방유래 줄기세포를 판단할 수 있는 마커들을 제공함으로써 지방유래 줄기세포의 효능을 검증하는 것에 있어 보다 유용한 자료를 제공할 수 있다. 또한 개선된 배양법을 이용하여 배양한 지방유래 줄기세포의 증식능력, 분화능력 등으로 대변되는 치료제 활성을 탐지하는 마커로서 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 기저배지와 증식배지에서의 지방유래 줄기세포의 세포형상을 나타낸 그림이다.
도 2는 기저배지와 증식배지에서의 지방유래 줄기세포의 세포성장 차이를 나타낸 그림이다.
도 3은 Illumina 24K chip을 이용한 3 세트의 기저배지에서 배양한 세포와 증식배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 마이크로어레이 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 17명의 공여자로부터 채취한 지방유래 줄기세포에서 도 3에서 선별한 증식배지에서 증가하는 유전자들의 발현양 변화를 RT-PCR과 real-time PCR을 통해 증명한 것으로, RPL13A는 대조 유전자이다. 도 4a는 증식배지에서 증가하는 APPAT9의 결과를 나타낸 것이고, 도 4b는 ANXA10, 도 4c는 IGF2BP3, 도 4d는 PTGER2의 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 17명의 공여자로부터 채취한 지방유래 줄기세포에서 도 3에서 선별한 증식배지에서 감소하는 유전자들의 발현량 변화를 RT-PCR과 real-time PCR 을 통해 증명한 것으로, RPL13A는 대조 유전자이다. 도 5a는 증식배지에서 감소하는 ITGA11의 결과를 나타낸 것이며 도 5b는 PAWR, 도 5c는 SFRP2의 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 상기 유전자들의 기저배지와 증식배지에서의 단백질 변화를 나타낸 결과이다.
본 발명은 AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3, PTGER2, ITGA11, PAWR 및 SFRP2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 치료능력 탐지 마커 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, "지방유래 줄기세포(adipocyte-derived stem cell, ASC)"는 지방세포, 골모세포, 연골모세포, 근섬유모세포 등 대부분의 중간엽 세포로 분화할 수 있는 지방조직으로부터 분리된 줄기세포로서, 지방전구세포, 기질세포, 다분화능 지방유래 세포(multipotent adipose-derived cells) 또는 지방유래 성체줄기세포(adipose derived adult stem cells) 등으로 불려온 세포를 의미한다. 상기 지방유래 줄기세포는 특별히 이에 제한되지는 않으나, 인간에게 이식할 수 있는 돼지, 소, 영장류 및 인간 등을 포함하는 포유류로부터 유래한 지방유래 줄기세포일 수 있다.
본 발명에서 용어, "EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 치료능력을 탐지하기 위한 마커"란 EGF 또는 bFGF를 포함하지 않은 기저배지에서 배양한 세포와 EGF 또는 bFGF를 포함하는 증식배지에서 배양한 지방유래 줄기세포를 비교했을 때, 그 발현 여부에 유의한 차이를 보이는 유기 생체 분자를 의미한다. 또한, 증식배지에서 배양한 지방유래 줄기세포는 기저배지에서 배양한 지방유래 줄기세포에 비하여 면역억제능력 또는 분화능력 등의 치료능력이 우수하다(대한민국 공개특허 제10-2010-0118491호). 따라서, 기저배지와 비교하였을 때 발현량의 차이를 확인함으로써 지방유래 줄기세포의 치료능력을 탐지할 수 있는 마커를 의미하며, 구체적으로는 AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3, PTGER2, ITGA11, PAWR 및 SFRP2로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자로서, 증식배지에서 배양된 지방유래 줄기세포에서 AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3 및 PTGER2는 기본배지에서 배양한 지방유래 줄기세포에 비하여 그 발현이 증가되고, ITGA11, PAWR 및 SFRP2는 그 발현이 감소되는 유전자이다.
또한, 본 발명에서 사용되는 상기 유전자들은 미국국립보건원의 GenBank 등 공지의 데이터베이스로부터 얻을 수 있으며, 그 예로 AGPAT9(NM_032717.3, NP_001243351.1), ANXA10(NM_007193.3, NP_009124.2), IGF2BP3(NM_006547.2, NP_006538.2), PTGER2(NM_000956.2, NP_000947.2), ITGA11(NM_001004439.1, NP_001004439.1), PAWR(NM_002583.2, NP_002574.2) 또는 SFRP2(NM_003013.2, NP_003004.1)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
기저배지에서 배양한 지방유래 줄기세포와 증식배지에서 배양한 지방유래 줄기세포를 서로 비교하였을 때, 상기 유전자들은 양 배지에서 발현의 차이를 보이므로, 이러한 발현 차이에 기초하여 상기 유전자들은 지방유래 줄기세포의 치료능력 탐지를 위한 마커로서 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "EGF(epidermal growth factor)"란 이의 수용체인 EGFR에 결합하여 세포의 증식, 성장 및 분화를 촉진할 수 있는 성장인자를 의미한다. 상기 EGF는 여러 가지 상피세포의 증식을 촉진하는 활성을 가지며 생쥐의 T세포나, 사람의 섬유아세포도 증식시킬 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 EGF는 지방유래 줄기세포의 배양배지에 포함되어 이의 증식 및 분화능력과 같은 치료적 활성을 상승시키는 역할을 하는 단백질을 의미한다.
본 발명에서 용어, "bFGF(basic fibroblast growth factor)"란 혈관신생 또는 상처치료 등과 같은 생물학적 과정에 관여하는 성장인자이다. 본 발명의 목적상 상기 bFGF는 상기 EGF와 같이 지방유래 줄기세포의 배지에 포함되어 이의 증식 및 분화능력과 같은 치료적 활성을 상승시키는 역할을 하는 단백질을 의미한다.
본 발명에서 용어, "기저배지"는 지방유래 줄기세포, 특히 이를 포함하는 스트로마-혈관 분획을 배양하기 위한 배지이다. 상기 기본배지는 DMEM 배지, 또는 DMEM/F12 등의 지방유래 줄기세포의 배양에 혈청을 포함하는 배지일 수 있으며, 상기 혈청은 세포배양에 통상적으로 사용되는 FBS(Fetal bovine serum) 등일 수 있으며, 이는 약 10% 내외, 즉 8 내지 12% 가량으로 포함될 수 있으나, 당업계에 통상적으로 사용되는 지방유래 줄기세포 배양배지라면 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는 기저배지로서 10% FBS가 포함된 DMEM 배지를 이용하였다. 본 발명에서 상기 "기저배지"는 "기본배지"와 혼용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "증식배지"는 지방유래 줄기세포의 증식능 또는 분화능의 향상을 위해 사용되는 배지로서, 상기 기저배지에 bFGF(basic fibroblast growth factor) 또는 EGF(epidermal growth factor)를 추가로 하는 배지를 말한다. 상기 증식배지에는 EGF 또는 bFGF를 각각 0.1 ng/㎖ 내지 100 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다. 본 발명에서 상기 "증식배지"는 "EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지"와 혼용될 수 있다.
상기 기저배지 및 증식배지에 대한 정보 등은 대한민국 공개특허 제10-2010-0118491호에 개시되어 있으며, 상기 제10-2010-0118491호의 명세서 전체는 본 발명의 참고자료로서 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "치료능력"이란 줄기세포의 치료적 활성(therapeutic activity)을 의미하며, 본 발명의 줄기세포를 세포치료제 등으로 사용할 경우 "역가"라고도 한다. 바람직하게는 지방유래 줄기세포의 증식능력, 분화능력, 면역조절능력 또는 이들 능력 모두를 의미하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "분화능력"이란 지방유래 줄기세포가 지방세포, 골모세포, 연골모세포, 근섬유모세포, 골모세포, 근육세포 또는 신경세포 등으로 분화될 수 있는 능력을 의미한다. 본 발명에서 분화능력이 높은 지방유래 줄기세포는 지방세포, 골모세포, 연골모세포, 근섬유모세포, 골모세포, 근육세포 또는 신경세포로의 분화 유도가 용이하게 일어나는 세포를 의미하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 "면역조절능력"은 바람직하게는 면역억제능력을 말하며, 상기 면역억제능력은 bFGF 또는 EGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래줄기세포가 면역 세포의 활성을 억제할 수 있는 것을 의미한다. 특히, 중간엽 줄기세포의 경우 APC(antigen presenting cell)를 억제함으로써 면역억제효과에 관여하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 지방유래 줄기세포를 면역억제제로 사용하여 면역질환을 치료할 수 있다.
본 발명에서 "치료능력이 높은 지방유래 줄기세포"는, 기저배지에서 배양된 지방유래 줄기세포에 비하여 AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3 및 PTGER2로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현 수준이 증가되어 있고, ITGA11, PAWR 및 SFRP2로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현이 감소되어 있는 지방유래 줄기세포로서, 기저배지에서 배양된 지방유래 줄기세포에 비하여 세포증식이 빠르거나 면역 억제능이 좋거나 분화 효율이 높은 등 치료제로서의 활성(역가)이 좋은 지방유래 줄기세포를 의미한다.
이와 같은 유전자의 발현 수준은 mRNA 또는 단백질의 양을 측정함으로써 확인할 수 있다.
본 발명에서 용어, "mRNA 수준 측정"이란 지방유래 줄기세포의 분화능력을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 지방유래 줄기세포의 치료능력을 나타내는 마커 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, mRNA의 양을 측정한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩 등이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 유전자 mRNA의 수준을 RT-PCR 및 Real-time PCR을 통하여 확인하였다(실시예 3).
유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 프라이머 쌍 또는 프로브이며, AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3, PTGER2, ITGA11, PAWR 및 SFRP2 유전자의 핵산 서열은 각각 NM_032717.3, NM_007193.3, NM_006547.2, NM_000956.2, NM_001004439.1, NM_002583.2 및 NM_003013.2에 밝혀져 있으므로, 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.
본 발명에서 용어, "프라이머(primer)"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 본 발명에서 프라이머는 바람직하게는 AGPAT9에 대한 프라이머는 서열번호 3 및 4인 프라이머 쌍, ANXA10에 대한 프라이머는 서열번호 5 및 6인 프라이머 쌍, IGF2BP3에 대한 프라이머는 서열번호 7 및 8인 프라이머 쌍, PTGER2에 대한 프라이머는 서열번호 9 및 10인 프라이머쌍, ITGA11에 대한 프라이머는 서열번호 11 및 12인 프라이머쌍, PAWR에 대한 프라이머는 서열번호 13 및 14인 프라이머쌍, 또는 SFRP2에 대한 프라이머는 서열번호 15 및 16인 프라이머쌍일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수개의 염기 내지는 수백개의 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링이 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브 또는 RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3, PTGER2, ITGA11, PAWR 또는 SFRP2 폴리뉴클레오타이드와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 지방유래 줄기세포의 분화 능력을 알 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명의 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머는, 각 마커 유전자에 특이적인 프라이머로 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산이다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 또한 검출 가능한 시그날을 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소, 형광성 분자 및 바이오틴 등이 있다.
본 발명에서 용어, "단백질 수준측정"이란 지방유래 줄기세포의 분화능력을 탐지하기 위하여 생물학적 시료에서 지방유래 줄기세포의 치료능력을 나타내는 마커 유전자로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 바람직하게는 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다.
본 발명에서 용어, "항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하고, 구체적으로는 본 발명의 마커 유전자인 AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3, PTGER2, ITGA11, PAWR 또는 SFRP2가 코딩하는 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 본 발명의 마커 단백질이 규명되었으므로 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 다클론 항체는 상기 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 및 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다. 단일클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol.,222:58, 1-597, 1991) 기술 등을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피 또는 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다. 또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다. 단백질 수준의 측정 방법으로는 웨스턴 블랏(Western blot), 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) 및 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는 웨스턴 블랏을 이용하여 상기 단백질의 수준을 측정하였다(실시예 4).
본 발명의 일 실시예에서는 EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포가 상기 인자를 포함하지 않은 기저배지에서 배양한 지방유래 줄기세포보다 증식능력, 면역억제, 혹은 분화능력 등의 치료활성이 우수함에 기초하여(대한민국 공개특허 제10-2010-0118491호), EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포와 기저배지에서 배양한 지방유래 줄기세포 간의 발현에 유의한 차이를 보이는 유전자를 확인한 결과, EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포에서는 AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3 및 PTGER2의 발현이 증가되어 있고, ITGA11, PAWR 및 SFRP2의 발현이 감소되어 있음을 확인하였다(도 4 및 도 5). 이에, AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3 및 PTGER2 단백질의 높은 발현 수준이나 ITGA11, PAWR 또는 SFRP2 단백질의 낮은 발현 수준이 지방유래 줄기세포의 치료활성을 나타낼 수 있는 마커가 될 수 있음을 확인하였다(도 6).
또 하나의 양태로서, 본 발명은 AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3, PTGER2, ITGA11, PAWR 및 SFRP2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 증식능력 탐지를 위한 마커 검출용 조성물을 제공한다.
상기 지방유래 줄기세포, EGF, bFGF, mRNA 또는 이의 단백질 수준의 측정 및 유전자들에 대해서는 상기에서 기재한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "증식능력"이란 세포가 자율적, 또는 호르몬 등의 외인적 자극에 의해 DNA합성, 세포분열을 수반하는 세포수의 증가를 할 수 있는 능력을 말하며, 증식하지 않고 있지만 그 능력을 잠재적으로 유지하고 있는 경우도 포함된다. 줄기세포는 in vitro 배양시 자가 복제능(Self renewal capacity)이 있어 증식능을 가지나, 계대배양이 진행될수록 증식능이 감소하여 결과적으로 순수하고 많은 양의 줄기세포를 얻는 데는 한계점이 있다. 따라서, 줄기세포를 치료제로서 효과적으로 이용하기 위해서는 단기간에 많은 양의 줄기세포를 수득할 수 있는 배양법이 필요하다.
본 발명에서는 EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양된 지방유래 줄기세포가 기저배지에서 배양된 지방유래 줄기세포에 비해 증식능력이 우수함을 확인하였고, 이러한 증식능력의 차이를 나타내는, 기저배지 또는 증식배지에서 배양된 지방유래 줄기세포 간의 발현 차이를 보이는 유전자를 규명하였다.
구체적으로, 증식배지에서 배양한 지방유래 줄기세포는 AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3, 및 PTGER2으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현이 기저배지에서 배양된 지방유래 줄기세포에 비하여 증가되어 있고, ITGA11, PAWR 및 SFRP2로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현이 기저배지에서 배양된 지방유래 줄기세포에 비하여 감소되어 있다. 상기와 같은 발현 특징을 보이는 지방유래 줄기세포는, 기저배지에서 배양한 지방유래 줄기세포, 특히 AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3, 또는 PTGER2 유전자의 발현이 감소되어 있거나, ITGA11, PAWR 또는 SFRP2 유전자의 발현이 증가되어 있는 지방유래 줄기세포에 비하여 세포증식이 잘 일어나서 세포수율이 높으며, 또한 세포증식, 면역억제, 분화능력과 같은 임상적 치료효과가 높은 특징을 보인다.
본 발명의 일 실시예에서는 기저배지와 증식배지에서 같은 양의 지방유래 줄기세포를 5계대 동안 키웠을 때 증식배지에서의 세포증식이 평균 2배 이상 증가한 것을 확인하였다(실시예 1 및 도 2).
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 분화능력을 탐지하기 위한 마커 검출용 조성물을 포함하는, EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 분화능력 탐지를 위한 마커 검출용 키트를 제공한다.
상기 EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 분화능력을 탐지하기 위한 마커 검출용 조성물에 대해서는 상기에서 언급한 바와 같다.
본 발명의 마커 검출용 키트에는 EGF 또는 bFGF를 포함하는 증식배지에서 배양함에 따라 발현이 증가 또는 감소하는 마커 유전자 또는 이들의 단백질을 선택적으로 인지할 수 있는 프라이머 또는 항체뿐만 아니라 면역학적 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구 및 시약 등이 포함된다. 이러한 도구나 시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 표지물질이 효소인 경우에는 효소의 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.
본 발명의 마커 검출용 키트는 바람직하게는 RT-PCR 키트, DNA 키트 또는 단백질 칩 키트일 수 있다. 상기 단백질 칩에 상기 유전자가 코딩하는 단백질에 대한 항체가 제공되는 경우에는, 2개 이상의 항체에 대한 항원-항체 복합체 형성을 관측할 수 있어 지방유래 줄기세포의 분화능력 탐지에 있어 보다 유리하다.
상기 RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함할 수 있으며, 그 외 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
상기 DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있으며, 상기 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
상기 단백질 칩 키트는 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 키트일 수 있다. 단백질 칩을 이용하는 방법은 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성하고, 이를 판독하여 단백질의 존재 또는 발현수준을 확인할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 마이크로어레이를 이용하여 기저배지와 증식배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 마커 유전자들의 발현 차이를 확인하였다(실시예 2 및 도 3).
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 증식능력을 탐지하기 위한 마커 검출용 조성물을 포함하는, EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 증식능력을 탐지하기 위한 마커 검출용 키트를 제공한다.
상기 EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 증식능력을 탐지하기 위한 마커 검출용 조성물 및 사용할 수 있는 마커 검출용 키트는 상기에서 설명한 바와 같다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3, PTGER2, ITGA11, PAWR 및 SFRP2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 지방유래 줄기세포의 분화능력을 탐지하는 방법을 제공한다.
상기 EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지, 상기 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준 측정 및 지방유래 줄기세포의 분화능력에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 방법은 추가적으로, ITGA11, PAWR 및 SFRP2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질의 양이 대조군인 기저배지에서 배양한 지방유래 줄기세포에서 측정한 값에 비해 적으면, 분화능력이 대조군에 비하여 높은 것으로 판단하는 단계, 또는 AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3 및 PTGER2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질의 양이 대조군인 기저배지에서 배양한 지방유래 줄기세포에서 측정한 값에 비해 많으면, 분화능력이 대조군에 비하여 낮은 것으로 판단하는 단계를 포함하는 지방유래 줄기세포의 분화능력을 탐지하는 방법일 수 있다. 이 때, 대조군인 기저배지에서 배양한 지방유래 줄기세포와 증식배지에서 배양한 지방유래 줄기세포는 계대수가 동일하거나 1 계대 이하 차이인 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에서는 EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포가 상기 인자를 포함하지 않은 기저배지에서 배양한 지방유래 줄기세포보다 증식능력, 분화능력 등의 치료활성이 우수함에 기초하여(대한민국 공개특허 제10-2010-0118491호), EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포와 기저배지에서 배양한 지방유래 줄기세포 간의 발현에 유의한 차이를 보이는 유전자를 확인한 결과, EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포에서는 AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3 및 PTGER2의 발현이 증가되어 있고, ITGA11, PAWR 및 SFRP2의 발현이 감소되어 있음을 확인하였다(도 4 및 도 5). 따라서 AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3 및 PTGER2의 발현이 증가되어 있거나 ITGA11, PAWR 및 SFRP2의 발현이 감소되어 있는 지방유래 줄기세포는, AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3 및 PTGER2의 발현이 감소되어 있거나 ITGA11, PAWR 및 SFRP2의 발현이 증가되어 있는 지방유래 줄기세포에 비하여 분화능력이 우수함을 시사한다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3, PTGER2, ITGA11, PAWR 및 SFRP2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 지방유래 줄기세포의 증식능력을 탐지하는 방법을 제공한다.
상기 EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지, 상기 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준 측정 및 지방유래 줄기세포의 증식능력에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
바람직하게는 ITGA11, PAWR 및 SFRP2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질의 양이 대조군인 기저배지에서 배양한 지방유래 줄기세포에서 측정한 값에 비해 적으면, 증식능력이 대조군에 비하여 높은 것으로 판단하는 단계, 또는 AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3 및 PTGER2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질의 양이 대조군인 기저배지에서 배양한 지방유래 줄기세포에서 측정한 값에 비해 많으면, 증식능력이 대조군에 비하여 낮은 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는 지방유래 줄기세포의 증식능력을 탐지하는 방법일 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에서 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 이들에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 기저배지와 증식배지에 따른 지방유래 줄기세포의 세포증식 능력 검증
실시예 1-1: 인간 지방 유래 스트로마 줄기세포의 배양
공여자로부터 지방 조직을 분리하였고(안트로젠, 경기도, 대한민국), 얻어진 지방 조직으로부터 지방 유래 스트로마 줄기세포를 분리하였다. 혈액을 제거하기 위해 지방 조직을 같은 부피의 KRB(Krebs-Ringer Bicarbonate) 용액으로 34회 세척하였다. 지방 조직과 같은 부피의 콜라게나제 용액을 넣어 37℃ 수욕에서 반응시켰다. 이를 원심분리용 튜브에 옮겨 넣고 20℃, 1200 rpm에서 10 분 동안 원심분리하였다. 상층액인 지방층을 제거하고, 아래층인 콜라게나제 용액을 흔들리지 않도록 조심해서 분리하였다. 기저배지를 넣어 현탁시킨 후, 20℃, 1200 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 이때, 아래에 가라앉는 것이 스트로마-혈관 분획이므로, 상층액을 제거하였다. 스트로마-혈관 분획을 기저배지에 현탁시켜 배양용기에 접종하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24 시간 동안 배양하였다. 배양액 제거 후 인산염 완충용액으로 세척하고, 기저배지, 또는 기저배지에 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF)가 1 ng/㎖ 농도로 포함된 배지, 또는 기저배지에 표피세포 성장인자(EGF)가 5 ng/㎖ 농도로 포함된 배지를 이용하여 증식시켰다. 지방유래 스트로마 줄기세포가 배양용기의 80-90% 정도로 자라면 트립신을 처리하여 단일 세포로 분리하여 수득하였다. 얻어진 세포를 증식배지로 1:31:4로 희석하여 계대 배양을 수행하였다(공개번호 10-2010-0118491). 배양배지의 조성에 따른 유전자 발현 차이를 분석하기 위하여 10% FBS가 포함된 DMEM인 기저배지로 배양한 5계대 세포와 기저배지에 1ng/㎖ bFGF가 포함된 증식배지로 배양한 5계대 세포를 수집하였다.
총 5개 로트 배양결과 기저배지로 배양할 때보다 증식배지로 배양할 때 증식속도가 높았으며, 섬유아세포 형태를 안정적으로 유지하였다. 도 1에 기저배지와 증식배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 형태사진을 나타내었다. 도 2는 기저배지와 증식배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 CPDL(cell population doubling level)의 예를 나타내었다.
실시예 2: 마이크로 어레이 실험에 의한 지방유래 줄기세포의 배지별 유전자 발현 증감 확인
실시예 2-1: 인간 지방 유래 스트로마 줄기세포의 배양
공여자 17명으로부터 지방 조직을 분리하고 (안트로젠, 경기도, 대한민국) 실시예 1에서와 같이 지방유래 줄기세포를 배양하였다.
실시예 2-2: 총 RNA 분리
총 RNA는 QIAGEN 킷트(RNeasy Maxi kit: cat #75162)를 사용하여 분리하였고, Experion RNA StdSens(Bio-Rad사) 칩을 이용하여 정량하였다. 우선 상기 배양된 지방유래 줄기세포를 150 ㎕의 베타 멀캅토 에탄올을 첨가한 15 ㎖의 키트 내 분해 완충액에 용해시켰다. 여기에 15 ㎖의 70% 에탄올을 넣어 잘 섞은 후, 3000 g에서 5분간 원심분리하여 총 RNA를 막에 부착시켰다. 두 차례의 세척을 한 후, 1.2 ㎖의 RNase가 없는 물을 첨가하여 총 RNA를 분리하였다.
실시예 2-3: 마이크로어레이 실시
상기 추출된 총 RNA를 Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit(Ambion사)를 이용하여 하이브리드화 하였다. T7 Oligo(dT) 프라이머를 이용하여 cDNA를 합성하고, biotin-UTP를 이용하여 in vitro 전사(in vitro transcription)을 실시하여 biotin-labeled cRNA를 제조하였다. 제조된 cRNA는 NanoDrop을 이용하여 정량하였다. 지방유래 줄기세포에서 제조된 cRNA를 Human-6 V2(Illumina사) 칩에 하이브리드화 하였다. 하이브리드화 후, 비특이적 하이브리드화를 제거하기 위하여 Illumina Gene Expression System 세척액 (Illumina사)을 이용하여 DNA 칩을 세척하였고 세척된 DNA 칩은 streptavidin-Cy3(Amersham사) 형광 염색약으로 표지하였다. 형광 표지된 DNA 칩은 공촛점 (confocal) 레이저 스캐너(Illumina사)를 이용하여 스캐닝하여 각 스팟에 존재하는 형광의 데이터를 얻어서 TIFF 형태의 이미지 파일로 저장하였다. TIFF 이미지 파일을 BeadStudio version 3(Illumina 사)으로 정량하여 각 스팟의 형광값을 정량하였다. 정량된 결과는 Avadis Prophetic version 3.3(Strand Genomics사) 프로그램으로 'quantile' 기능을 이용하여 보정하였다.
그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3은 기저배지에서 배양한 계대수 5인 세포와 증식배지에서 배양한 계대수 5 세포에서 측정된 상기 유전자들의 발현 차이를 보여준다. AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3, 및 PTGER2유전자는 기저배지에 비해 증식배지에서 현저한 증가를 보이는 유전자이며, ITGA11, PAWR 및 SFRP2는 기저배지에 비해 증식배지에서 그 발현이 감소한 유전자이다. 이러한 결과로부터 상기 유전자들이 기저배지와 증식배지를 비교할 때 발현차이를 크게 나타내므로, 이를 임상적 유효성이 높은 증식배지에 배양한 지방줄기세포를 판단하는 용도로 사용할 수 있음을 알 수 있다. 단, 이러한 결과는 줄기세포와 분화된 줄기세포를 구별하는 알려진 마커와는 다른 양상을 보일 수 있으며, 계대수 및 분화여부에 따라서도 다른 양상을 보일 수 있다. 예를 들면 IGF2BP3는 분화 전 줄기세포상태에서는 계대에 따라 증가하지만 분화가 시작되면 급격히 줄어들고, ITM2A의 경우 줄기세포상태에서는 계대에 따라 대체로 줄어들지만 분화가 시작되면 늘어난다.
실시예 3: 개별 공여자의 지방유래 줄기세포로부터 기저배지와 증식배지에서 발현 차이를 보이는 유전자 개별적 확인
17쌍의 공여자 지방줄기세포 샘플 (기저배지와 증식배지 배양세포)를 이용하여 실시예 2에서 확인된 유전자들의 발현량을 RT-PCR 방법을 통하여 분석하였다. 실시예 2의 방법을 통하여 총 RNA를 분리하였다.
실시예 3-1: cDNA 합성과 주형의 농도 보정
시료 각각의 총 RNA 2㎍, 프라이머인 50M Oligo(dT) 1 ㎕와 10 mM dNTP 2.5 ㎕,를 넣고 RNase 저해제인 DEPC가 들어 있는 멸균수로 전체가 25㎕ 가 되도록 하여 RNA/primer 혼합용액을 만들었다. 65℃에서 5분간 반응시킨 후 55℃로 옮겨 보관하였다. 다음 10X RT buffer 5㎕, 25 mM MgCl2 10㎕, 0.1 M DTT 5㎕, RNase inhibitor 1㎕, SuperScriptIII RT 효소를 1㎕ 넣고 전체가 25㎕ 가 되도록 한 후 55℃에서 보관 중인 RNA/primer 혼합용액과 섞어준 후, 55℃에서 50분간 반응시켰다. 그 후 85℃에서 5분간 반응시켜 RT 효소를 불활성화한 후 얼음에 넣어 반응을 종결시켰다. 마커 유전자를 정량하기 위한 표준 유전자로서 RPL13A를 사용하였다. 표준 유전자의 프라이머를 이용하여 RT-PCR 반응을 수행하고 표준 유전자 RPL13A의 발현량이 동일해지도록 cDNA의 농도를 보정하였다. 우선 각각의 cDNA를 20배 희석한 후 희석된 샘플 2㎕를 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR은 2x PCR premix (Hot start) 15㎕, 2㎕의 PRL13A 정방향 프라이머, 2㎕ 의 PRL13A 역방향 프라이머, 11㎕의 증류수를 넣어 사용하였고 20 cycle, 23 cycle, 25 cycle을 수행하였다. 이 때 RT-PCR 반응 조건은 94℃ 30초, 50℃ 30초, 72℃ 1분으로 수행하였다. 사용된 RPL13A 프라이머는 정방향 5'-CATCGTGGCTAAACAGGTACTG-3' (서열번호 1), 역방향 5'-GCACGACCTTGAGGGCAGC-3' (서열번호 2)이다. PCR 산물을 2% 아가로스 젤에 로딩하여 전기영동한 후 젤 사진을 찍고, 이미지를 TotalLab v1.0 프로그램(Nonlinear Dynamix사)으로 정량한 후, 다시 보정하여 PCR을 수행하여 정량하는 방식으로 각 시료의 농도를 동일하게 보정하였다.
실시예 3-2: RT-PCR/Real-Time PCR 을 이용한 발현량 분석
동일한 양이 되도록 희석한 cDNA를 상기 유전자들의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. cDNA는 3㎕, 2x premix 10㎕, 프라이머 각 2 ㎕ (20 pmole), 증류수 2㎕를 섞어 총 용액 20㎕로 만들고 PCR 반응은 94℃ 1분, 54℃ 30초, 72℃ 1분으로 하였으며 각 유전자마다 사이클은 달리하였다. PCR 산물을 확인하기 위하여 2% 아가로스 젤을 이용하여 전기영동하고 이미지 장비를 이용하여 분석하였다. Realtime RT-PCR은 Qiagen사 (CA, USA)의 DNASYBRI 시약과 LightCycler(Roche)를 이용하였다. Melt Curve 분석을 이용하여 PCR 산물의 질을 평가하였고 유전자 발현량은 LightCycler version 3.5 software (Roche)를 사용하여 분석하였다. 상기 RT-PCR/Real-Time PCR에서 사용한 유전자들의 특이적 프라이머와 대조 프라이머의 서열 (서열번호 1 내지 16)은 표 1에 명시하였다.
그 결과를 도 4, 5에 나타내었다. 그 결과 상기의 유전자들은 확연히 기저배지에 비례하여 증식배지에서 증가하거나 감소하는 것이 확인되었다. 따라서 AGPAT9 (94.1%, 17개 중 16개 샘플에서 증가) ANXA10 (94.1%, 17개 중 16개 샘플에서 증가), IGF2BP3 (100%, 17개 중 17개 샘플에서 증가), PTGER2 (100%, 17개 중 17개 샘플에서 증가)(도 4 a-d), ITGA11 (94.1%, 17개 중 16개 샘플에서 감소), PAWR (94.1%, 17개 중 16개 샘플에서 감소), SFRP2 (94.1%, 17개 중 16개 샘플에서 감소) (도 5 a-c), 상기 유전자들은 증식배지에서 배양된 임상적 효능이 증가된 지방유래 줄기세포를 판단할 수 있는 마커로서 또는 개선된 배양법을 이용하여 배양한 지방유래 줄기세포의 품질의 일관성을 탐지하는 마커 등으로 사용할 수 있을 것으로 보인다.
표 1
유전자(REF) 프라이머 서열번호
RPL13A(NM_012423.02) F: 5'-catcgtggctaaacaggtactg-3' 서열번호 1
R: 5'-gcacgaccttgagggcagc-3' 서열번호 2
AGPAT9(NM_032717.3) F: 5'-aatcttgacaacggatggat-3' 서열번호 3
R: 5'-caaaccagacatgaggacaa-3' 서열번호 4
ANXA10(NM_007193.3) F: 5'-cgagacaaaccagcctattt-3' 서열번호 5
R: 5'-tggtcagcaggtctatttca-3' 서열번호 6
IGF2BP3(NM_006547.2) F: 5'-cacctgatgagaatgaccaa-3' 서열번호 7
R: 5'-actttgcagagccttctgtt-3' 서열번호 8
PTGER2(NM_000956.2) F: 5'-cacctcattctcctggctat-3' 서열번호 9
R: 5'-gaggtcccatttttcctttc-3' 서열번호 10
ITGA11(NM_001004439.1) F: 5'-tgaggtccctaaaagcactc-3' 서열번호 11
R: 5'-cagtcctcttgcttggagat-3' 서열번호 12
PAWR(NM_002583.2) F: 5'-caggagccacctagaacagt-3' 서열번호 13
R: 5'-tacctgaaacatttgcatcc-3' 서열번호 14
SFRP2(NM_003013.2) F: 5'-aaaatcatcctggagaccaa-3' 서열번호 15
R: 5'-tgtcgttcatctcctcacag-3' 서열번호 16
실시예 4: 선별된 유전자의 계대에 따른 단백질 발현 조사
공여자 지방줄기세포 샘플 (기저배지와 증식배지에서 배양)을 이용하여 실시예 3에서 확인된 유전자 중 일부의 발현량을 웨스턴 블랏 분석법으로 단백질 정량을 통하여 분석하였다.
구체적으로, 60 mm 디쉬에서 키워진 세포를 PBS로 한번 헹구어낸 후, 차가운 단백질용 용해 완충액 (RIPA cell lysis buffer: 50 mM Tris-Cl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 10% 글리세롤, 1 mM PMSF, 1 mM DTT, 20 mM NaF, 1 mM EDTA, 단백질분해효소 저해제)를 첨가하여, 세포의 단백질을 준비하였다. 준비되어진 각 단백질 시료를 30㎍씩 사용하여 10% 혹은 12% SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) 겔(gel)에 걸어 크기별로 단백질을 분리해 낸 후, 이를 PVDF 막에 잘 옮겨주었다.
단백질이 옮겨진 필터를 적당한 크기로 잘라낸 후, 각 단백질에 해당하는 항체를 붙여주었다. 항체에 대한 정보는 다음과 같다. anti-ANXA10 (Santa Cruz, sc-70009), anti-IGF2BP3 (Santa Cruz, sc-100766), anti-PTGER2 (abcam, ab16151), anti-ITGA11 (ab107858), anti-PAWR (Sigma A0545), anti-ACTIN (Sigma, A5316). 각각의 단백질의 양은 ImmobilonTM 웨스턴 블럿팅 검출 시약 (Western Blotting Detection reagents) (Millipore)를 사용하여 밴드(band)로 확인하였다.
그 결과, 상기 유전자 중 RT-PCR을 통하여 증식배지에서 mRNA 수준이 증가하는 유전자인 ANXA10, IGF2BP3, PTGER2의 경우, 기저배지에서 단백질 발현이 낮고 증식배지에서 단백질 발현이 높아, mRNA 실험결과와 부합함을 관찰하였고, 증식배지에서 계대 증가에 따라 mRNA 수준이 감소하는 유전자인 ITGA11, PAWR의 경우 기저배지에서 단백질 발현이 높고 증식배지에서 단백질 발현이 감소함을 관찰하여, 마찬가지로 mRNA 실험결과와 부합하는 것을 확인하였다(도 6).
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (11)

  1. AGPAT9(1-acylglycerol-3-phosphate O-acyltransferase 9), ANXA10(annexin A10), IGF2BP3(insulin-like growth factor 2 binding protein 3), PTGER2(prostaglandin E receptor 2), ITGA11(integrin, alpha 11), PAWR(PRKC, apoptosis, WT1, regulator) 및 SFRP2(secreted frizzled-related protein 2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, EGF(Epidermal growth factor) 또는 bFGF(basic fibroblast growth factor)를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 치료능력 탐지를 위한 마커 검출용 조성물.
  2. AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3, PTGER2, ITGA11, PAWR 및 SFRP2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 증식능력 탐지를 위한 마커 검출용 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 유전자 mRNA의 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍 또는 프로브를 포함하는 것인 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 것인 조성물.
  5. 제1항의 조성물을 포함하는, EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 치료능력을 탐지하기 위한 마커 검출용 키트.
  6. 제2항의 조성물을 포함하는, EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 증식능력을 탐지하기 위한 마커 검출용 키트.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 마커 검출용 키트.
  8. EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3, PTGER2, ITGA11, PAWR 및 SFRP2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 지방유래 줄기세포의 치료능력 탐지 방법.
  9. EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3, PTGER2, ITGA11, PAWR 및 SFRP2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 지방유래 줄기세포의 증식능력 탐지 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 방법은 ITGA11, PAWR 및 SFRP2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질의 양이 대조군인 기저배지에서 배양한 지방유래 줄기세포에서 측정한 값에 비해 적으면, 치료능력이 대조군에 비하여 높은 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는, 지방유래 줄기세포의 치료능력 탐지 방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 방법은 AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3 및 PTGER2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질의 양이 대조군인 기저배지에서 배양한 지방유래 줄기세포에서 측정한 값에 비해 많으면, 치료능력이 대조군에 비하여 높은 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는, 지방유래 줄기세포의 치료능력 탐지 방법.
PCT/KR2014/005110 2013-06-12 2014-06-11 Egf 또는 bfgf를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 증식 및 치료능력 탐지 마커 및 이의 용도 WO2014200256A1 (ko)

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US14/758,710 US9874574B2 (en) 2013-06-12 2014-06-11 Marker for detecting proliferation and treatment capacities of adipose-derived stem cell cultured in medium containing EGF or BFGF, and use thereof
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105368959B (zh) * 2015-12-15 2019-01-04 甘肃中天羊业股份有限公司 Anxa10基因作为绵羊免疫性状的分子标记及其应用

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101667001B1 (ko) * 2013-08-12 2016-10-17 한국생명공학연구원 줄기세포 배양액에서 탐지 가능한 지방유래 줄기세포의 증식 및 치료능력 탐지용 마커 및 이의 용도

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010037134A2 (en) * 2008-09-29 2010-04-01 Stemlifeline, Inc. Multi-stage stem cell carcinogenesis
KR20100118491A (ko) 2009-04-28 2010-11-05 (주)안트로젠 누공 치료를 위한 자가 및 동종의 지방 유래 스트로마 줄기세포 조성물
WO2011072119A2 (en) * 2009-12-10 2011-06-16 The Research Foundation Of State University Of Newyork Stem-cell material and method of use
KR20120126284A (ko) * 2011-05-11 2012-11-21 (주)안트로젠 고농도의 세포성장인자를 포함하는 중간엽 줄기세포 배양액의 제조방법 및 이로부터 얻어진 조성물

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006135733A2 (en) * 2005-06-10 2006-12-21 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Modulation of peripheral clocks in adipose tissue
EP2074422A4 (en) * 2006-11-13 2010-02-17 Life Technologies Corp METHOD AND KITS FOR DETECTING PROSTATE CANCER BIOMARKERS
KR101297829B1 (ko) * 2012-04-24 2013-08-19 (주)안트로젠 지방유래줄기세포 분화능력 탐지 마커 및 이의 용도

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010037134A2 (en) * 2008-09-29 2010-04-01 Stemlifeline, Inc. Multi-stage stem cell carcinogenesis
KR20100118491A (ko) 2009-04-28 2010-11-05 (주)안트로젠 누공 치료를 위한 자가 및 동종의 지방 유래 스트로마 줄기세포 조성물
WO2011072119A2 (en) * 2009-12-10 2011-06-16 The Research Foundation Of State University Of Newyork Stem-cell material and method of use
KR20120126284A (ko) * 2011-05-11 2012-11-21 (주)안트로젠 고농도의 세포성장인자를 포함하는 중간엽 줄기세포 배양액의 제조방법 및 이로부터 얻어진 조성물

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CLACKSON ET AL., NATURE, vol. 352, 1991, pages 624 - 628
GRONTHOS. S ET AL.: "Surface protein characterization of human adipose tissue-derived stromal cells.", JOURNAL OF CELLULAR PHYSIOLOGY, vol. 189, no. 1, 2001, pages 54 - 63, XP055004454 *
KOHLER; MILSTEIN, EUROPEAN JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 6, 1976, pages 511 - 519
MARKS ET AL., J. MOL. BIOL., vol. 222, 1991, pages 58,1 - 597
See also references of EP3009521A4

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105368959B (zh) * 2015-12-15 2019-01-04 甘肃中天羊业股份有限公司 Anxa10基因作为绵羊免疫性状的分子标记及其应用

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