WO2015023078A1 - 줄기세포 배양액에서 탐지 가능한 지방유래 줄기세포의 증식 및 치료능력 탐지용 마커 및 이의 용도 - Google Patents

줄기세포 배양액에서 탐지 가능한 지방유래 줄기세포의 증식 및 치료능력 탐지용 마커 및 이의 용도 Download PDF

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정경숙
김미형
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한국생명공학연구원
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    • G01N2333/503—Fibroblast growth factors [FGF] basic FGF [bFGF]

Definitions

  • the present invention relates to a composition and a method for detecting a marker for detecting the therapeutic or proliferative capacity of adipose derived stem cells, cultured in a medium containing EGF (Epidermal growth factor) or bFGF (basic fibroblast growth factor),
  • EGF Epidermal growth factor
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • Adipose tissue contains more than 1,000 times more stem cells than stem cells capable of separating from the same amount of bone marrow. For this reason, adipose tissue-derived stem cells (ASC) are used as biotransplant materials. There is a lot of research going on. Adipose-derived stem cells also have the same differentiation potential as bone marrow-derived stem cells and can differentiate into cartilage, bone, fat or muscle cells. In addition, adipose derived stem cells have similar expression patterns of bone marrow-derived stem cells and cell surface markers, and do not induce an immune response in autologous or homologous transplantation in both in vivo and in vitro, but rather have a function of regulating the immune response. It has been reported to be spotlighted as an effective means of cell therapy.
  • stem cell therapies having a certain level or more of therapeutic effect are reproducible as actual drugs while representing the excellent cell proliferation and therapeutic effect of stem cells cultured in proliferation medium containing EGF or bFGF compared to stem cells cultured in basal medium.
  • a quality control test method that can reflect the effects such as the differentiation capacity, proliferation capacity and potency of stem cells obtained by the improved culture method using the growth medium containing EGF or bFGF as described above. Do. That is, in order to develop a method for increasing cell product yield and measuring drug quality, a biomarker to represent this is needed.
  • the present inventors when the fat-derived stem cells are cultured in a growth medium containing EGF or bFGF compared to the basal medium, the proliferation ability is excellent, and also can maintain and divide the characteristics of stem cells well even in long passages In view of the high therapeutic efficacy including the differentiation ability, it is polite to develop a marker showing the difference in expression between adipose derived stem cells cultured in basal medium and adipose derived stem cells cultured in proliferation medium containing EGF or bFGF.
  • Kazal-D Serine Peptidase Inhibitor Domain 1 KAZALD1
  • PENK Proenkephalin
  • LBP Lipopolysaccharide Binding Protein
  • LIPG Lipase, Endothelial
  • One object of the present invention is at least one gene mRNA selected from the group consisting of KAZALD1 (Kazal-Type Serine Peptidase Inhibitor Domain 1), PENK (Proenkephalin), LBP (Lipopolysaccharide Binding Protein) and LIPG (Lipase, Endothelial) It is to provide a marker detection composition for detecting the therapeutic capacity of adipose derived stem cells cultured in a medium containing EGF (Epidermal growth factor) or bFGF (basic fibroblast growth factor), including an agent for measuring protein levels.
  • EGF Epidermatitis
  • Another object of the present invention is a fat-derived stem cultured in a medium comprising EGF or bFGF, comprising an agent for measuring the level of one or more gene mRNA or protein thereof selected from the group consisting of KAZALD1, PENK, LBP and LIPG It is to provide a marker detection composition for detecting the proliferation capacity of the cell.
  • Another object of the present invention is to provide a marker detection kit for detecting the therapeutic or proliferative capacity of adipose derived stem cells cultured in a medium containing EGF or bFGF, including the marker detection composition.
  • Another object of the present invention includes measuring at least one gene mRNA or protein level thereof selected from the group consisting of KAZALD1, PENK, LBP and LIPG of adipose derived stem cells cultured in a medium comprising EGF or bFGF. To provide a method for detecting the therapeutic or proliferative capacity of the adipose derived stem cells.
  • the present invention can provide useful data in verifying the efficacy of adipose derived stem cells by providing markers that can determine adipose derived stem cells with increased clinical efficacy in cultured medium.
  • it can be usefully used as a marker for detecting therapeutic agent activity represented by the proliferation ability, differentiation capacity, and the like of adipose derived stem cells cultured using the improved culture method.
  • FIG. 1 is a diagram showing the cell shape of adipose derived stem cells in basal medium and proliferation medium.
  • Figure 2 is a diagram showing the difference in cell growth of adipose derived stem cells in basal medium and proliferation medium.
  • Figure 3 shows the change in the expression level of the genes in the growth medium selected in Example 2-3 in adipose derived stem cells collected from 17 donors by RT-PCR and real-time PCR, RPL13A control It is a gene.
  • Figure 3a shows the results of the increase in growth medium KAZALD1
  • Figure 3b is PENK
  • Figure 3c is the LBP
  • Figure 3d shows the results of LIPG.
  • Figure 4 shows the results of protein changes in the basal medium and proliferation medium of the genes.
  • Figure 4a shows the Western blot results of the protein of the representative gene LBP and LIPG cells
  • Figure 4b is the result of measuring the amount of extracellular secreted proteins of the representative genes LBP and LIPG by ELISA (ELISA).
  • FIG. 5 is a result confirming the proliferation effect of the adipose derived stem cells represented by the secreted paracrine signaling material after the gene overexpression.
  • Figure 5a is a result of examining the cloning method and expression of the cloned gene of PENK and KAZALD1.
  • Figure 5b is a result confirming the effect on the proliferation of fat cells not transformed by the protein secreted from the fat stem cells overexpress the gene.
  • One embodiment of the present invention is one or more gene mRNAs selected from the group consisting of Kazal-Type Serine Peptidase Inhibitor Domain 1 (KAZALD1), Proenkephalin (PENK), Lipopolysaccharide Binding Protein (LPP) and LIPG (Lipase, Endothelial) It is a composition for detecting a marker for detecting the therapeutic ability of adipose derived stem cells cultured in a medium containing an epidermal growth factor (EGF) or a basic fibroblast growth factor (bFGF), including an agent for measuring protein levels.
  • GAF epidermal growth factor
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • adipocyte-derived stem cell refers to stem cells isolated from adipose tissue capable of differentiating into most mesenchymal cells such as adipocytes, osteoblasts, chondrocytes, and myofibroblasts.
  • ASC adipocyte-derived stem cell
  • a progenitor cell a stromal cell, a multipotent adipose-derived cell or adipose derived adult stem cells (adipose derived adult stem cells) means a cell called.
  • the fat-derived stem cells are not particularly limited thereto, but may be fat-derived stem cells derived from mammals including pigs, cattle, primates, and humans that can be transplanted into humans.
  • the term "marker for detecting the therapeutic ability of adipose derived stem cells cultured in a medium containing EGF or bFGF” refers to cells cultured in a basal medium not containing EGF or bFGF and EGF or bFGF. When compared with adipose derived stem cells cultured in proliferation medium, it refers to an organic biomolecule showing a significant difference in the expression or not.
  • the adipose derived stem cells cultured in the proliferation medium are superior to the therapeutic ability, such as immunosuppressive ability or differentiation capacity, compared to the adipose derived stem cells cultured in the basal medium (Korean Patent Publication No. 10-2010-0118491).
  • KAZALD1, PENK, and LBP are increased in adipose derived stem cells cultured in proliferation medium, compared to adipose derived stem cells cultured in basal medium, and LIPG is a gene whose expression is decreased.
  • the expression difference in both media is shown.
  • the genes can be used as markers for detecting the therapeutic capacity of adipose derived stem cells.
  • the genes are expressed in the form of secretory protein, in addition to measuring the expression level by crushing the adipose derived stem cells, there is an advantage that can detect the therapeutic ability by obtaining a culture solution of the adipose derived stem cells by measuring the expression amount .
  • genes used in the present invention can be obtained from a known database such as GenBank of the National Institutes of Health, for example, KAZALD1 (NM_030929.4 / NP_112191.2), PENK (NM_006211.3 / NP_001129162.1), LBP ( NM_203346.2 / NP_004130.2) or LIPG (NM_006033.2 / NP_006024.1), but is not limited thereto.
  • GenBank GenBank of the National Institutes of Health
  • the expression difference in both media is shown.
  • the genes can be used as markers for detecting the therapeutic capacity of adipose derived stem cells.
  • the term "basal medium” is a medium for culturing adipose derived stem cells, in particular the stromal-vascular fraction comprising the same.
  • the basal medium may be a medium containing serum in the culture of adipose derived stem cells, such as DMEM medium, or DMEM / F12, the serum may be FBS (Fetal bovine serum) commonly used for cell culture, etc. It may be included in about 10%, that is, about 8 to 12%, but if the fat-derived stem cell culture medium commonly used in the art is not particularly limited thereto.
  • the basal medium refers to a medium that does not contain a separate EGF or bFGF. In one embodiment of the present invention was used as a basal medium DMEM medium containing 10% FBS.
  • the "base medium” may be mixed with the "basic medium”.
  • EGF epidermal growth factor
  • the EGF has an activity of promoting the proliferation of various epithelial cells and can also proliferate mouse T cells or human fibroblasts.
  • EGF refers to a protein that is included in the culture medium of adipose derived stem cells and plays a role in increasing therapeutic activity such as its proliferation and differentiation ability.
  • basic fibroblast growth factor refers to growth factors involved in biological processes such as angiogenesis or wound healing.
  • bFGF refers to a protein that is included in the medium of adipose derived stem cells, such as EGF, and serves to increase therapeutic activity such as its proliferation and differentiation ability.
  • the term "medium containing EGF or bFGF” is a medium used for improving the proliferative or differentiating ability of adipose derived stem cells, and refers to a medium in which bFGF or EGF is added to the basal medium.
  • the medium may contain EGF or bFGF at a concentration of 0.1 ng / ml to 100 ng / ml, respectively.
  • the "media containing EGF or bFGF” may be used interchangeably with "proliferation medium”.
  • the term "therapeutic capacity” means the therapeutic activity of the stem cells (therapeutic activity), and when using the stem cells of the present invention as a cell therapy, it is also called “titer”.
  • therapeutic capacity means the therapeutic activity of the stem cells (therapeutic activity), and when using the stem cells of the present invention as a cell therapy, it is also called “titer”.
  • tumor Preferably, but not limited to proliferative capacity, differentiation capacity, immunomodulatory capacity or all of these ability of adipose derived stem cells.
  • differentiation capacity refers to the ability of the adipose derived stem cells to be differentiated into adipocytes, osteoblasts, chondrocytes, myofibroblasts, osteoblasts, muscle cells or neurons.
  • adipose derived stem cells having high differentiation capacity are meant to be cells which easily induce differentiation into adipocytes, osteoblasts, chondrocytes, myofibroblasts, osteoblasts, muscle cells or neurons, but are not limited thereto.
  • immunosuppressive ability preferably refers to immunosuppressive ability
  • the immunosuppressive ability means that adipose derived stem cells cultured in a medium containing bFGF or EGF can inhibit the activity of immune cells.
  • mesenchymal stem cells are known to be involved in the immunosuppressive effect by inhibiting APC (antigen presenting cell). Therefore, the adipose derived stem cells of the present invention can be used as an immunosuppressive agent to treat immune diseases.
  • therapeutic adipose derived stem cells has a higher expression level of one or more genes selected from the group consisting of KAZALD1, PENK, and LBP compared to adipose derived stem cells cultured in a basal medium, and expression of LIPG.
  • the reduced fat-derived stem cells are fat-derived stem cells that have good activity (titer) as a therapeutic agent, such as faster cell proliferation, better immune suppression, or differentiation efficiency than fat-derived stem cells cultured in basal medium. do.
  • the expression level of such genes can be confirmed by measuring the amount of mRNA or protein.
  • mRNA level measurement refers to a process of confirming the presence and expression level of mRNA of marker genes representing the therapeutic ability of adipose derived stem cells in a biological sample to diagnose the differentiation ability of adipose derived stem cells. Measure the amount of.
  • Analytical methods for this purpose include reverse transcriptase (RT-PCR), competitive reverse transcriptase (RT) PCR, real time reverse transcriptase (Realtime RT-PCR), and RNase protection assay (RPA). , Northern blotting or DNA chips, but is not limited thereto.
  • RT-PCR reverse transcriptase
  • RT competitive reverse transcriptase
  • Realtime RT-PCR real time reverse transcriptase
  • RNase protection assay RNase protection assay
  • Agents for measuring mRNA levels of genes are preferably primer pairs or probes, and the nucleic acid sequences of the KAZALD1, PENK, LBP and LIPG genes are identified in NM_030929.4, NM_006211.3, NM_203346.2 and NM_006033.2, respectively.
  • primers or probes that specifically amplify specific regions of these genes based on the sequences.
  • the term "primer” refers to a nucleic acid sequence having a short free 3 'terminal hydroxyl group, which forms a base pair with a complementary template and functions as a starting point for template strand copying. Means.
  • the primers are preferably primer pairs for SEQ ID NOS: 3 and 4 for KAZALD1, primer pairs for SEQ ID NOs: 5 and 6 for PENK, primer pairs for SEQ ID NOs: 7 and 8 for LBP,
  • the primer for LIPG may be a primer pair of SEQ ID NOs: 9 and 10, but is not limited thereto.
  • the term "probe” refers to a nucleic acid fragment such as RNA or DNA corresponding to a few bases or hundreds of bases that can achieve specific binding with mRNA and is labeled to indicate the presence or absence of a specific mRNA. You can check it.
  • the probe may be manufactured in the form of an oligonucleotide probe, a single stranded DNA probe, a double stranded DNA probe or an RNA probe.
  • hybridization is performed using a probe complementary to KAZALD1, PENK, LBP, and LIPG polynucleotides, and it is possible to determine the differentiation ability of adipose derived stem cells through hybridization. Selection of suitable probes and hybridization conditions can be modified based on what is known in the art.
  • Primers of the invention can initiate DNA synthesis in the presence of reagents for polymerization (ie, DNA polymerase or reverse transcriptase) and four different nucleoside triphosphates at appropriate buffers and temperatures.
  • the primers of the present invention are sense and antisense nucleic acids having 7 to 50 nucleotide sequences as primers specific for each marker gene. Primers can incorporate additional features that do not change the basic properties of the primers that serve as a starting point for DNA synthesis.
  • Primers or probes of the invention can be synthesized chemically using phosphoramidite solid support methods, or other well known methods. Such nucleic acid sequences can also be modified using many means known in the art.
  • Non-limiting examples of such modifications include methylation, encapsulation, substitution of one or more homologs of natural nucleotides, and modifications between nucleotides, such as uncharged linkages such as methyl phosphonate, phosphoester, phosphoroami Date, carbamate, etc.) or charged linkages such as phosphorothioate, phosphorodithioate and the like.
  • Nucleic acids may be selected from one or more additional covalently linked residues, such as proteins (eg, nucleases, toxins, antibodies, signal peptides, poly-L-lysine, etc.), inserts (eg, acridine, psoralene, etc.).
  • Chelating agents eg, metals, radioactive metals, iron, oxidizing metals, etc.
  • alkylating agents eg, metals, radioactive metals, iron, oxidizing metals, etc.
  • Nucleic acid sequences of the invention can also be modified using a label that can provide a detectable signal directly or indirectly. Examples of labels include radioisotopes, fluorescent molecules and biotin.
  • the term "protein level measurement” refers to a process for confirming the presence and expression level of a protein expressed from a marker gene representing a therapeutic ability of adipose derived stem cells in a biological sample to detect the differentiation ability of adipose derived stem cells.
  • the amount of the protein may be confirmed using an antibody that specifically binds to the protein of the gene, but is not limited thereto.
  • Level measurement of the marker protein of the present invention can be measured using adipose derived stem cells or their media.
  • the KAZALD1, PENK, LBP, and LIPG genes encode secretory proteins secreted out of cells, resulting in fat-derived by confirming protein sensitization using not only the adipose derived stem cells cultured in the medium, but also the culture medium of the stem cells.
  • Therapeutic activity including stem cell proliferation, immunosuppressive ability, and differentiation capacity can be measured.
  • an antibody refers to a specific protein molecule directed against an antigenic site.
  • an antibody means an antibody that specifically binds to a marker protein, and specifically, an antibody that specifically binds to a protein encoded by the marker gene of the present invention, KAZALD1, PENK, LBP or LIPG. It means, and includes all polyclonal antibodies, monoclonal antibodies and recombinant antibodies. Since the marker proteins of the present invention have been identified, the production of antibodies using them can be readily prepared using techniques well known in the art. Polyclonal antibodies can be produced by methods well known in the art for injecting the marker protein antigen into an animal and collecting blood from the animal to obtain serum comprising the antibody.
  • polyclonal antibodies can be prepared from any animal species host such as goat, rabbit, sheep, monkey, horse, pig, cow and dog.
  • Monoclonal antibodies are known in the art by the hybridoma method (see Kohler and Milstein, 1976, European Jounral of Immunology 6: 511-519), or phage antibody libraries (Clackson et al, Nature, 352: 624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222: 58, 1-597, 1991), and the like.
  • Antibodies prepared by the above method can be isolated and purified using methods such as gel electrophoresis, dialysis, salt precipitation, ion exchange chromatography or affinity chromatography.
  • the antibodies of the present invention also include functional fragments of antibody molecules, as well as complete forms having two full length light chains and two full length heavy chains.
  • a functional fragment of an antibody molecule refers to a fragment having at least antigen binding function, and includes Fab, F (ab '), F (ab') 2 and Fv.
  • Protein levels can be measured by Western blot, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, and Ouchterlony immunodiffusion. , Rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, fluorescence activated cell sorter (FACS), and protein chip.
  • the present invention is not limited thereto.
  • the protein level was measured using Western blot and ELISA assay as a representative method for measuring protein levels (Example 4).
  • the adipose derived stem cells cultured in a medium containing EGF or bFGF such as proliferative capacity, immunosuppression, or differentiation capacity than adipose derived stem cells cultured in a basal medium not containing the above factors.
  • a medium containing EGF or bFGF such as proliferative capacity, immunosuppression, or differentiation capacity than adipose derived stem cells cultured in a basal medium not containing the above factors.
  • adipose derived stem cells cultured in a medium containing EGF or bFGF and adipose derived stem cells cultured in basal medium As a result of identifying genes showing significant difference in liver expression, KAZALD1, PENK and LBP expression was increased and LIPG expression was decreased in adipose derived stem cells cultured in medium containing EGF or bFGF. (FIG. 3).
  • LBP and LIPG which are representative markers of the present invention in the culture medium of adipose derived stem cells, the level of LBP protein is higher in the growth medium than the basal medium, and the level of the LIPG protein is higher than the basal medium.
  • the marker protein of the present invention was confirmed to have the advantage that can be detected in the culture as a secreted protein (Fig. 4b). Furthermore, by using adipose derived stem cells transformed with a PENK or KAZALD1 expression vector, PENK or KAZALD1 was secreted out of the cell to show a side molecule factor effect (FIG. 5B), so that the marker proteins could be detected in culture. It was again confirmed that it is a marker.
  • Another embodiment of the present invention is derived from fat cultured in a medium comprising EGF or bFGF comprising an agent for measuring the level of one or more gene mRNA or protein thereof selected from the group consisting of KAZALD1, PENK, LBP and LIPG It is a composition for detecting secreted protein markers for detecting the proliferative capacity of stem cells.
  • the measurement and genes of the adipose derived stem cells, EGF, bFGF, mRNA or protein levels thereof are as described above.
  • the term "proliferative capacity” refers to the ability of cells to increase the number of cells accompanied by DNA synthesis and cell division by autonomous or exogenous stimulation such as hormones. This includes potential retention.
  • Stem cells have self renewal capacity in vitro culture and have proliferative capacity.
  • the proliferation capacity decreases, resulting in the limitation of obtaining pure and large amount of stem cells. Therefore, in order to effectively use stem cells as a therapeutic agent, a culture method capable of obtaining a large amount of stem cells in a short time is required.
  • the adipose derived stem cells cultured in a medium containing EGF or bFGF are superior to the adipose derived stem cells cultured in the basal medium.
  • Genes showing differences in expression between adipose derived stem cells cultured at were identified.
  • the adipose derived stem cells cultured in the proliferation medium has increased expression of one or more genes selected from the group consisting of KAZALD1, PENK, and LBP compared to the adipose derived stem cells cultured in the basal medium, and the expression of LIPG is basal medium.
  • KAZALD1, PENK, and LBP a gene selected from the group consisting of KAZALD1, PENK, and LBP compared to the adipose derived stem cells cultured in the basal medium
  • LIPG is basal medium.
  • adipose derived stem cells cultured in Adipose-derived stem cells exhibiting such expression characteristics are those derived from adipose derived stem cells cultured in basal medium, in particular, those derived from KAZALD1, PENK and LBP genes, or which have increased expression of LIPG genes.
  • the cell yield is high, and the clinical therapeutic effect such as cell proliferation, immunosuppression, and differentiation ability may be high.
  • Another embodiment of the present invention comprises a marker-derived composition for detecting the differentiation capacity of the adipose derived stem cells cultured in the medium containing the EGF or bFGF, derived from fat cultured in a medium containing EGF or bFGF Marker detection kit for detecting the differentiation capacity of stem cells.
  • the marker detection composition for detecting the differentiation ability of the adipose derived stem cells cultured in the medium containing the EGF or bFGF is as mentioned above.
  • the marker detection kit of the present invention is used for immunological analysis as well as primers or antibodies capable of selectively recognizing marker genes or proteins thereof whose expression is increased or decreased by culturing in a growth medium containing EGF or bFGF.
  • Tools and reagents commonly used in the art include, but are not limited to, suitable carriers, labeling materials capable of generating detectable signals, solubilizers, detergents, buffers, stabilizers, and the like.
  • the label is an enzyme, it may include a substrate and a reaction terminator that can measure the activity of the enzyme.
  • Suitable carriers include, but are not limited to, soluble carriers such as physiologically acceptable buffers known in the art, such as PBS, insoluble carriers such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyesters, Polyacrylonitrile, fluororesin, crosslinked dextran, polysaccharides, polymers such as magnetic fine particles plated with latex metal, other papers, glass, metals, agarose and combinations thereof.
  • soluble carriers such as physiologically acceptable buffers known in the art, such as PBS, insoluble carriers such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyesters, Polyacrylonitrile, fluororesin, crosslinked dextran, polysaccharides, polymers such as magnetic fine particles plated with latex metal, other papers, glass, metals, agarose and combinations thereof.
  • the kit for detecting a marker of the present invention may preferably be an RT-PCR kit, a DNA kit, or a protein chip kit.
  • the protein chip is provided with an antibody against a protein encoded by the gene, antigen-antibody complex formation for two or more antibodies can be observed, which is more advantageous in detecting the differentiation capacity of adipose derived stem cells.
  • the RT-PCR kit may comprise individual primer pairs specific for the marker gene, as well as other test tubes or other suitable containers, reaction buffers (variable pH and magnesium concentrations), deoxynucleotides (dNTPs), Taq Enzymes such as polymerase and reverse transcriptase, DNAse, RNAse inhibitor DEPC-water, sterile water and the like.
  • reaction buffers variable pH and magnesium concentrations
  • dNTPs deoxynucleotides
  • Taq Enzymes such as polymerase and reverse transcriptase, DNAse, RNAse inhibitor DEPC-water, sterile water and the like.
  • the DNA chip kit may include a substrate on which a cDNA or oligonucleotide corresponding to a gene or a fragment thereof is attached, and a reagent, an agent, an enzyme, or the like for preparing a fluorescent probe, and the substrate may be a control gene or CDNAs or oligonucleotides corresponding to fragments thereof.
  • the protein chip kit may be a kit in which one or more antibodies against a marker are arranged at a predetermined position on a substrate and immobilized at a high density.
  • the protein is separated from the sample, and the separated protein is hybridized with the protein chip to form an antigen-antibody complex, which can be read to confirm the presence or expression level of the protein.
  • Example 2 In one embodiment of the present invention was confirmed the difference in the expression of marker genes of adipose derived stem cells cultured in basal medium and proliferation medium using a microarray (Example 2).
  • Another aspect of the present invention comprises a marker-derived composition for detecting the proliferation capacity of the adipose derived stem cells cultured in the medium containing the EGF or bFGF, derived from fat cultured in a medium containing EGF or bFGF It is a marker detection kit for detecting the proliferative capacity of stem cells.
  • the marker detecting composition for detecting the proliferative capacity of the adipose derived stem cells cultured in the medium containing the EGF or bFGF, and the kit for detecting the marker may be used as described above.
  • Another aspect of the invention is a step of measuring the level of at least one gene mRNA or protein thereof selected from the group consisting of KAZALD1, PENK, LBP and LIPG of adipose derived stem cells cultured in a medium comprising EGF or bFGF It is a method for detecting the differentiation capacity of adipose derived stem cells, including.
  • the medium containing the EGF or bFGF, the mRNA level of the gene or its protein level and the differentiation capacity of the adipose derived stem cells are as described above.
  • the KAZALD1, PENK, LBP or LIPG gene encodes a secreted protein secreted out of the cell, and preferably increases or decreases the protein using not only the adipose derived stem cells cultured in the medium, but also the culture medium of the stem cells.
  • the method further includes determining that differentiation capacity is higher than that of the control group when the amount of LIPG gene mRNA or protein thereof is less than that measured in the adipose derived stem cells cultured in the basal medium which is the control group, and / or KAZALD1 If the amount of one or more gene mRNA or protein thereof selected from the group consisting of PENK and LBP is higher than the value measured in the adipose derived stem cells cultured in the basal medium which is the control group, it is determined that the differentiation capacity is lower than that of the control group. It may be a method for detecting the differentiation capacity of the adipose derived stem cells comprising the step.
  • the fat-derived stem cells cultured in the basal medium as a control and the fat-derived stem cells cultured in the growth medium are preferably the same passage number or less than one passage.
  • the adipose derived stem cells cultured in a medium containing EGF or bFGF are superior in therapeutic activity such as proliferative capacity and differentiation capacity than adipose derived stem cells cultured in a basal medium not containing the above factors.
  • a gene showing a significant difference in expression between adipose derived stem cells cultured in a medium containing EGF or bFGF and adipose derived stem cells cultured in a basal medium was identified.
  • adipose derived stem cells with increased expression of KAZALD1, PENK and LBP or decreased expression of LIPG are differentiated from adipose derived stem cells with reduced expression of KAZALD1, PENK and LBP or increased expression of LIPG. It suggests superior ability.
  • Another aspect of the invention is a step of measuring the level of at least one gene mRNA or protein thereof selected from the group consisting of KAZALD1, PENK, LBP and LIPG of adipose derived stem cells cultured in a medium comprising EGF or bFGF It includes a method of detecting the proliferation capacity of the adipose derived stem cells.
  • the medium containing the EGF or bFGF, the mRNA level of the gene or its protein level measurement and the proliferation capacity of the adipose derived stem cells are as described above.
  • the amount of the LIPG gene mRNA or its protein is less than the value measured in the adipose derived stem cells cultured in the basal medium that is a control, judging that the proliferative capacity is higher than the control, or KAZALD1, PENK and LBP If the amount of one or more gene mRNA or protein thereof selected from the group consisting of compared to the value measured in adipose derived stem cells cultured in the basal medium that is a control group, further comprising the step of determining that the proliferation capacity is higher than the control group It may be a method for detecting the proliferation capacity of the adipose derived stem cells, including.
  • Example 1 Verification of cell proliferation ability of adipose derived stem cells according to basal medium and proliferation medium
  • Adipose tissue was isolated from the donor (Antrogen, Gyeonggi-do, Korea), and adipose derived stromal stem cells were isolated from the obtained adipose tissue.
  • Adipose tissue was washed 34 times with the same volume of Krbs-Ringer Bicarbonate (KRB) solution to remove blood.
  • KRB Krbs-Ringer Bicarbonate
  • the same volume of collagenase solution as adipose tissue was added and reacted in a 37 ° C water bath. This was transferred to a centrifuge tube and centrifuged at 20 ° C. and 1200 rpm for 10 minutes. The supernatant fat layer was removed, and the lower collagenase solution was carefully separated so as not to shake.
  • the basal medium was suspended and centrifuged for 5 minutes at 20 °C, 1200 rpm. At this time, since the sinking below is the stromal-vascular fraction, the supernatant was removed.
  • the stromal-vascular fractions were suspended in basal medium and inoculated in culture vessels and incubated in 37 ° C., 5% CO 2 incubator for 24 hours. After removal of the culture solution, the cells were washed with phosphate buffer solution and 5 ng / ml of epidermal growth factor (EGF) in basal medium or basal medium containing basal fibroblast growth factor (bFGF) at a concentration of 1 ng / ml. Proliferation was performed using the medium contained in the concentration.
  • EGF epidermal growth factor
  • adipose derived stromal stem cells When adipose derived stromal stem cells were grown to about 80-90% of the culture vessel, they were obtained by separating into single cells by treating with trypsin. The obtained cells were diluted 1: 31: 4 with proliferation medium to carry out subculture (Publication No. 10-2010-0118491). To analyze the difference in gene expression according to the composition of culture medium, 5 passage cells cultured with basal medium, DMEM containing 10% FBS, and 5 passage cells cultured with growth medium containing 1 ng / ml bFGF in basal medium Collected.
  • FIG. 1 shows a morphology picture of the adipose derived stem cells cultured in a growth medium containing basal medium and EGF or bFGF.
  • Figure 2 shows an example of cell population doubling level (CPDL) of adipose derived stem cells cultured in a basal medium and a growth medium containing EGF or bFGF.
  • CPDL cell population doubling level
  • Example 2 Confirmation of gene expression increase and decrease by the medium of adipose derived stem cells by microarray experiment
  • Adipose tissue was isolated from 17 donors (Antrogen, Gyeonggi-do, Korea), and adipose derived stem cells were cultured as in Example 1.
  • the cultured adipose derived stem cells were lysed in 15 ml of digestion buffer in a kit to which 150 ⁇ l of beta mercapto ethanol was added. 15 ml of 70% ethanol was added thereto, mixed well, and centrifuged at 3000 g for 5 minutes to attach total RNA to the membrane. After two washes, total RNA was isolated by adding 1.2 ml of RNase-free water.
  • CRNA prepared from adipose derived stem cells were hybridized to a Human-6 V2 (Illumina) chip. After hybridization, DNA chips were washed using Illumina Gene Expression System Wash (Illumina) to remove nonspecific hybridization, and the washed DNA chips were labeled with streptavidin-Cy3 (Amersham) fluorescent dye.
  • Fluorescently labeled DNA chips were scanned using a confocal laser scanner (Illumina) to obtain data of fluorescence present in each spot and stored as an image file in TIFF form.
  • TIFF image files were quantified with BeadStudio version 3 (Illumina) to quantify the fluorescence values of each spot. Quantified results were corrected using the 'quantile' function with Avadis Prophetic version 3.3 (Strand Genomics) program.
  • KAZALD1, PENK and LBP genes showed a significant increase in growth medium compared to basal medium.
  • the LIPG gene is a gene whose expression is decreased in the growth medium compared to the basal medium. From these results, it can be seen that the genes show a large expression difference when comparing the basal medium and the proliferation medium, and thus it can be used to determine the fat stem cells cultured in the proliferation medium having high clinical effectiveness. However, these results may be different from known markers for distinguishing stem cells from differentiated stem cells, and may be different depending on passage number and differentiation.
  • Example 2 The expression levels of the genes identified in Example 2 were analyzed using RT-PCR method using 17 pairs of donor adipose stem cell samples (basal medium and proliferating medium cultured cells). Total RNA was isolated via the method of Example 2.
  • Example 3-1 cDNA Synthesis and Concentration Correction of a Template
  • RNA / primer solution 2 ⁇ g of total RNA of each sample, 1 ⁇ l of 50M Oligo (dT) primer and 2.5 ⁇ l of 10 mM dNTP were added, and 25 ⁇ l of sterile water containing RNase inhibitor DEPC was added to make 25 ⁇ l total solution. . After reacting at 65 ° C. for 5 minutes, the mixture was transferred to 55 ° C. and stored. Next, add 5 ⁇ l of 10X RT buffer, 10 ⁇ l of 25 mM MgCl2, 5 ⁇ l of 0.1 M DTT, 1 ⁇ l of RNase inhibitor, 1 ⁇ l of SuperScriptIII RT enzyme, and add 25 ⁇ l of the total amount of the RNA / primer solution.
  • RPL13A was used as a standard gene for quantifying marker genes. RT-PCR reaction was performed using primers of the standard gene, and the concentration of cDNA was corrected so that the expression level of the standard gene RPL13A was the same. First, each cDNA was diluted 20-fold, and then PCR reaction was performed using 2 ⁇ l of the diluted sample.
  • PCR was performed using 15 ⁇ l of 2 ⁇ PCR premix (Hot start), 2 ⁇ l of RPL13A forward primer, 2 ⁇ l of RPL13A reverse primer, and 11 ⁇ l of distilled water. 20 cycles, 23 cycles, and 25 cycles were performed. At this time, RT-PCR reaction conditions were performed for 30 seconds at 94 °C, 30 seconds at 50 °C, 1 minute at 72 °C.
  • the RPL13A primers used were forward 5'-CATCGTGGCTAAACAGGTACTG-3 '(SEQ ID NO: 1), reverse 5'-GCACGACCTTGAGGGCAGC-3' (SEQ ID NO: 2).
  • Example 3-2 Expression level analysis using RT-PCR / Real-Time PCR
  • CDNA diluted to the same amount was subjected to PCR using the sense and antisense primers of the genes.
  • cDNA was mixed with 3 ⁇ l, 2 ⁇ premix 10 ⁇ l, 2 ⁇ l each primer (20 pmole) and 2 ⁇ l of distilled water to make 20 ⁇ l of total solution.
  • the PCR reaction was carried out for 1 minute at 94 °C, 30 seconds at 54 °C, and 1minute at 72 °C. The cycle was different for each gene.
  • it was electrophoresed using 2% agarose gel and analyzed using an imaging apparatus. Realtime RT-PCR was used with DNASYBRI reagent from Qiagen (CA, USA) and LightCycler (Roche).
  • Example 4 Investigation of protein expression according to adipose derived stem cells or selected culture medium of the selected gene
  • Example 3 Using donor adipose stem cell samples (cultured in basal medium and proliferation medium), the expression level of some of the genes identified in Example 3 was analyzed by protein quantification by Western blot and ELISA assay.
  • the cold protein lysis buffer (RIPA cell lysis buffer: 50 mM Tris-Cl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 10 % Glycerol, 1 mM PMSF, 1 mM DTT, 20 mM NaF, 1 mM EDTA, protease inhibitors) were added to prepare the proteins of the cells.
  • the 10% or 12% SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) gel (gel) to separate the proteins by size, and transferred them to the PVDF membrane.
  • an antibody corresponding to each protein was attached.
  • Information on antibodies is as follows. anti-LBP (abcam, ab25094), anti-LIPG (abcam, ab24447), anti-ACTIN (Sigma, A5316). The amount of each protein was identified by band using Immobilon TM Western Blotting Detection reagents (Millipore).
  • LBP of the genes showed low protein expression in basal medium and high protein expression in growth medium
  • LIPG showed high protein expression in basal medium and decreased protein expression in growth medium (FIG. 4A).
  • the cells were attached to a 60 mm dish, and after 2 days and 4 days, the medium for culturing the cells was collected, purified by centricon with filter paper, and the amount of protein was measured by ELISA assay.
  • the secreted protein was attached to an ELISA plate for 12 hours using a predetermined amount of purified medium, and then the solution was removed.
  • Blocking solvent PBS solvent + 1% BSA, 0.02% Azide
  • the diluted antibody was treated, stored at room temperature for 1 hour, washed again with PBS solvent containing 0.05% Tween-20, and developed using Santa Cruz's Indirect ELIZA kit, and then absorbed at 405 nm and 490 nm.
  • LBP which is a gene whose mRNA level is increased in the growth medium through RT-PCR
  • LBP has low protein expression in the basal medium and high protein expression in the growth medium, which is consistent with the mRNA test results.
  • LIPG which is a gene whose mRNA level is decreased in the growth medium
  • the protein expression is high in the basal medium and the protein expression is decreased in the growth medium, and it was confirmed that the result is consistent with the mRNA test results (FIG. 4B).
  • Example 5 Investigation of cell proliferation effect of adipose derived stem cells by overexpression of selected genes
  • the preparation of the vector expressing KAZALD1 and PENK is shown in Figure 5a.
  • the KAZALD1 gene was amplified using cDNA of adipose derived stem cells and primer pairs (SEQ ID NOs: 11 and 12) in Table 2, and the PENK gene was amplified using primer pairs (SEQ ID NOs: 13 and 14), followed by restriction enzyme BglII. And HindIII and cleaved pure.
  • PDsRed-N1 (Clontech co.)
  • An expression vector capable of tagging red fluorescence protein (RFP) was cut with restriction enzymes BglII and HindIII and arranged in CIP to 20-50 ng of each fragment.
  • Adipose derived stem cells were instantaneously transfected using the lipofectamine plus method to verify whether the prepared vector normally expressed protein.
  • the adipose derived stem cells were seeded into the basal medium using a 60 mm dish, and for the transfection of one Petri dish, 4 ⁇ l plus reagent of 2 ⁇ g DNA (Life Technologies) was used. ), Mixed and incubated for 15 minutes at room temperature (solution A). 6 ⁇ l of lipofectamine reagent was added to 150 ⁇ l serum free basal medium (solution B). Solutions A and B were combined, mixed gently and incubated at room temperature for 15 minutes to form a complex. After 15 minutes, 900 ⁇ l serum free basal medium was added to the mixture.
  • FIG. 5B the experiment was configured, cultured for 96 hours, and then cultured for 96 hours, and then transformed into cells of the outer well of the trans-well plate to which the non-transformed fat-derived stem cells were attached. The cells were fixed after adding% formalin solution, and after 30 minutes of storage, the cells were washed with PBS and dried for one day.
  • the dried cells were incubated for 1 hour after adding 1% SRB (Sulforhodamine B) solution, and then stained. After discarding the solution, the cells were washed again with distilled water and dried. The stained cells were photographed with an optical microscope to observe the change in cell proliferative force and to show the relative cell proliferation change in a graph (FIG. 5B).
  • SRB Steforhodamine B
  • the adipose derived stem cells overexpressing PENK or KAZALD1 which is a representative marker gene of the present invention, secreted PENK or KAZALD1 into the culture medium, suggesting that it acted as a side secretion factor on untransformed adipose derived stem cells.

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Abstract

본 발명은 EGF(Epidermal growth factor) 또는 bFGF(basic fibroblast growth factor)를 포함하는 배지에서 배양한, 지방유래 줄기세포의 치료능력 또는 증식능력을 탐지하기 위한 마커 검출용 조성물 및 탐지방법에 관한 것이다.

Description

줄기세포 배양액에서 탐지 가능한 지방유래 줄기세포의 증식 및 치료능력 탐지용 마커 및 이의 용도
본 발명은 EGF(Epidermal growth factor) 또는 bFGF(basic fibroblast growth factor)를 포함하는 배지에서 배양한, 지방유래 줄기세포의 치료능력 또는 증식능력을 탐지하기 위한 마커 검출용 조성물 및 탐지방법에 관한 것으로, 상기 마커는 줄기세포 배양액 및 세포 모두에서 측정될 수 있는 특징을 지닌다.
지방조직은 이와 동량의 골수에서 분리할 수 있는 줄기세포에 비하여 1,000배 이상의 줄기세포를 다량 포함하고 있어, 이러한 이유로 지방조직 유래 줄기세포(adipocyte-derived stem cells, ASC)를 생체이식 재료로 이용하고자 하는 연구가 다양하게 진행되고 있다. 지방유래 줄기세포는 또한, 골수유래 줄기세포와 같은 다분화능을 가지고 있어 연골, 뼈, 지방 또는 근육세포 등으로 분화가 가능하다. 또한, 지방유래 줄기세포는 골수유래 줄기세포와 세포 표면 마커의 발현양상이 유사하고 in vivo 및 in vitro 모두에서 자가 또는 동종 이식 시에도 면역반응을 유발시키지 않고, 오히려 면역반응을 조절하는 기능을 갖는 것으로 보고되고 있어 세포치료의 효과적인 수단으로서 각광받고 있다.
한편, 기존에 개시된 기저배지를 이용한 표준 세포배양법을 사용하여 지방유래 줄기세포를 체외배양 하는 경우, 세포배양에 장시간이 소요되어 임상적으로 유효한 세포 수를 얻기에 어려웠다. 따라서 표준 세포배양법의 경우, 실제 임상 적용에 있어 실효성이 떨어지는 문제점이 있었다. 이에 본 발명자들은 효과적인 임상적 치료방법을 보일 수 있는 배양법을 개발하고자 하였고, 이에 EGF(Epidermal growth factor) 또는 bFGF(basic fibroblast growth factor)를 포함하는 증식배지에서 배양한 지방유래 줄기세포가 표준 세포배양법에 의한 지방유래 줄기세포에 비해 우수한 임상적 효과를 가짐을 확인하였으나(대한민국 공개특허 제10-2010-0118491호), 상기와 같은 EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 우수한 임상적 효능과 관련된 객관적인 분자생물학적 특성분석은 아직 이루어지지 않은 상태이다.
특히, 기저배지에서 배양된 줄기세포에 비해 EGF 또는 bFGF를 포함하는 증식배지에서 배양된 줄기세포의 우수한 세포증식과 치료효과를 대변하면서, 일정 수준 이상의 치료 효과를 가지는 줄기세포 치료제를 실제 의약품으로서 재현성있게 생산하기 위해서는, 상기와 같은 EGF 또는 bFGF를 포함하는 증식배지를 이용한 개선된 배양법에 의해 획득한 줄기세포의 분화능력, 증식능력 및 역가와 같은 약효를 반영할 수 있는 품질관리 시험법 개발이 필요하다. 즉, 세포치료제 수율 증가 및 치료제 품질을 측정하는 방법을 개발하기 위해서는 이를 대변할 바이오 마커가 필요하다.
본 발명자들은, 지방유래 줄기세포가 기저배지에 비해 EGF 또는 bFGF를 포함하는 증식배지에서 배양하는 경우, 그 증식능이 우수하며, 또한 오랜 계대 배양에도 줄기세포의 특성을 잘 유지하며 분열할 수 있을 뿐만 아니라, 분화능을 비롯한 치료적 효능이 높다는 점에 착안하여, 기저배지에서 배양한 지방유래 줄기세포와 EGF 또는 bFGF를 포함하는 증식배지에서 배양한 지방유래 줄기세포 간의 발현 차이를 보이는 마커를 개발하고자 예의 노력한 결과, KAZALD1(Kazal-Type Serine Peptidase Inhibitor Domain 1), PENK(Proenkephalin) 및 LBP(Lipopolysaccharide Binding Protein) 유전자의 발현이 EGF 또는 bFGF를 포함하는 증식배지에서 배양한 지방유래 줄기세포에서 증가되어 있고, LIPG(Lipase, Endothelial) 유전자의 발현이 EGF 또는 bFGF를 포함하는 증식배지에서 배양한 지방유래 줄기세포에서 감소되어 있음을 확인하여, 상기 유전자들을 EGF 또는 bFGF를 포함하는 증식배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 증식능력, 면역억제능, 분화능력 등을 비롯한 치료적 활성 측정 등에 이용할 수 있음을 확인하였다. 또한, 상기 유전자는 세포 밖으로 분비되는 단백질을 코딩하고 있어서, 세포를 직접 사용하지 않고도 세포를 배양한 배지를 사용하여 단백질의 증감을 확인할 수 있는 이점을 지녀 지방유래 줄기세포의 증식능력, 면역억제능, 분화능력 등을 비롯한 치료적 활성 측정을 용이하게 할 수 있는 마커임을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 KAZALD1(Kazal-Type Serine Peptidase Inhibitor Domain 1), PENK(Proenkephalin), LBP(Lipopolysaccharide Binding Protein) 및 LIPG(Lipase, Endothelial)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, EGF(Epidermal growth factor) 또는 bFGF(basic fibroblast growth factor)를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 치료능력 탐지를 위한 마커 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 KAZALD1, PENK, LBP 및 LIPG로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 증식능력 탐지를 위한 마커 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 마커 검출용 조성물을 포함하는, EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 치료능력 또는 증식능력을 탐지하기 위한 마커 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 KAZALD1, PENK, LBP 및 LIPG로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 지방유래 줄기세포의 치료능력 또는 증식능력을 탐지하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 증식배지에서 배양된 임상적 효능이 증가된 지방유래 줄기세포를 판단할 수 있는 마커들을 제공함으로써 지방유래 줄기세포의 효능을 검증하는 것에 있어 유용한 자료를 제공할 수 있다. 또한 개선된 배양법을 이용하여 배양한 지방유래 줄기세포의 증식능력, 분화능력 등으로 대변되는 치료제 활성을 탐지하는 마커로서 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 기저배지와 증식배지에서의 지방유래 줄기세포의 세포형상을 나타낸 그림이다.
도 2는 기저배지와 증식배지에서의 지방유래 줄기세포의 세포성장 차이를 나타낸 그림이다.
도 3은 17명의 공여자로부터 채취한 지방유래 줄기세포에서 실시예 2-3에서 선별한 증식배지에서 변화하는 유전자들의 발현양 변화를 RT-PCR과 real-time PCR을 통해 증명한 것으로, RPL13A는 대조 유전자이다. 도 3a는 증식배지에서 증가하는 KAZALD1의 결과를 나타낸 것이고, 도 3b는 PENK, 도 3c는 LBP, 도 3d는 LIPG의 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 상기 유전자들의 기저배지와 증식배지에서의 단백질 변화를 나타낸 결과이다. 도 4a는 대표유전자 LBP와 LIPG 세포내 단백질의 웨스턴 블랏 결과를 나타낸 것이고 도 4b는 대표유전자 LBP와 LIPG의 세포외로 분비된 단백질의 양을 엘라이자(ELISA)로 측정한 결과이다.
도 5는 상기 유전자 과발현 후의 분비된 파라크린 신호전달 물질에 의해 나타나는 지방유래 줄기세포의 증식효과를 확인한 결과이다. 도 5a는 PENK와 KAZALD1의 클로닝 방법과 클로닝된 유전자의 발현을 조사한 결과이다. 도 5b는 유전자를 과발현하는 지방줄기세포에서 분비되는 단백질에 의해 형질전환되지 않은 지방줄기세포의 증식에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
본 발명의 하나의 양태는 KAZALD1(Kazal-Type Serine Peptidase Inhibitor Domain 1), PENK(Proenkephalin), LBP(Lipopolysaccharide Binding Protein) 및 LIPG(Lipase, Endothelial)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, EGF(Epidermal growth factor) 또는 bFGF(basic fibroblast growth factor)를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 치료능력 탐지를 위한 마커 검출용 조성물이다.
본 발명에서 용어, "지방유래 줄기세포(adipocyte-derived stem cell, ASC)"는 지방세포, 골모세포, 연골모세포, 근섬유모세포 등 대부분의 중간엽 세포로 분화할 수 있는 지방조직으로부터 분리된 줄기세포로서, 지방전구세포, 기질세포, 다분화능 지방유래 세포(multipotent adipose-derived cells) 또는 지방유래 성체줄기세포(adipose derived adult stem cells) 등으로 불려온 세포를 의미한다. 상기 지방유래 줄기세포는 특별히 이에 제한되지는 않으나, 인간에게 이식할 수 있는 돼지, 소, 영장류 및 인간 등을 포함하는 포유류로부터 유래한 지방유래 줄기세포일 수 있다.
본 발명에서 용어, "EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 치료능력을 탐지하기 위한 마커"란 EGF 또는 bFGF를 포함하지 않은 기저배지에서 배양한 세포와 EGF 또는 bFGF를 포함하는 증식배지에서 배양한 지방유래 줄기세포를 비교했을 때, 그 발현 여부에 유의한 차이를 보이는 유기 생체 분자를 의미한다. 또한, 증식배지에서 배양한 지방유래 줄기세포는 기저배지에서 배양한 지방유래 줄기세포에 비하여 면역억제능력 또는 분화능력 등의 치료능력이 우수하다(대한민국 공개특허 제10-2010-0118491호). 따라서, 기저배지와 비교하였을 때 발현량의 차이를 확인함으로써 지방유래 줄기세포의 치료능력을 탐지할 수 있는 마커를 의미하며, 구체적으로는 KAZALD1, PENK, LBP 및 LIPG 로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자로서, 증식배지에서 배양된 지방유래 줄기세포에서 KAZALD1, PENK 및 LBP는 기저배지에서 배양한 지방유래 줄기세포에 비하여 그 발현이 증가되고, LIPG는 그 발현이 감소되는 유전자이다.
상기 유전자들을 기저배지에서 배양한 지방유래 줄기세포와 EGF 또는 bFGF를 포함하는 증식배지에서 배양한 지방유래 줄기세포를 서로 비교하였을 때, 양 배지에서 발현차이를 보이므로, 이러한 발현 차이에 기초하여 상기 유전자들을 지방유래 줄기세포의 치료능력 탐지를 위한 마커로서 사용할 수 있다. 특히, 상기 유전자들은 분비단백질 형태로 발현되어, 지방유래 줄기세포를 파쇄하여 발현량을 측정하는 것 외에도 지방유래 줄기세포의 배양액을 수득하여 발현량을 측정하여 치료능력을 탐지할 수 있는 이점이 있다.
또한, 본 발명에서 사용되는 상기 유전자들은 미국국립보건원의 GenBank 등 공지의 데이터베이스로부터 얻을 수 있으며, 그 예로 KAZALD1(NM_030929.4/NP_112191.2), PENK(NM_006211.3/NP_001129162.1), LBP(NM_203346.2/NP_004130.2) 또는 LIPG(NM_006033.2/NP_006024.1)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 유전자들을 기저배지에서 배양한 지방유래 줄기세포와 EGF 또는 bFGF를 포함하는 증식배지에서 배양한 지방유래 줄기세포를 서로 비교하였을 때, 양 배지에서 발현차이를 보이므로, 이러한 발현 차이에 기초하여 상기 유전자들을 지방유래 줄기세포의 치료능력 탐지를 위한 마커로서 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어, "기저배지"는 지방유래 줄기세포, 특히 이를 포함하는 스트로마-혈관 분획을 배양하기 위한 배지이다. 상기 기저배지는 DMEM 배지, 또는 DMEM/F12 등의 지방유래 줄기세포의 배양에 혈청을 포함하는 배지일 수 있으며, 상기 혈청은 세포배양에 통상적으로 사용되는 FBS(Fetal bovine serum) 등일 수 있으며, 이는 약 10% 내외, 즉 8 내지 12% 가량으로 포함될 수 있으나, 당업계에 통상적으로 사용되는 지방유래 줄기세포 배양배지라면 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 이 때, 상기 기저배지는 별도의 EGF 또는 bFGF를 포함하지 않는 배지를 의미한다. 본 발명의 일 실시예에서는 기저배지로서 10% FBS가 포함된 DMEM 배지를 이용하였다. 본 발명에서 상기 "기저배지"는 "기본배지"와 혼용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "EGF(epidermal growth factor)"란 이의 수용체인 EGFR에 결합하여 세포의 증식, 성장 및 분화를 촉진할 수 있는 성장인자를 의미한다. 상기 EGF는 여러 가지 상피세포의 증식을 촉진하는 활성을 가지며 생쥐의 T세포나, 사람의 섬유아세포도 증식시킬 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 EGF는 지방유래 줄기세포의 배양배지에 포함되어 이의 증식 및 분화능력과 같은 치료적 활성을 상승시키는 역할을 하는 단백질을 의미한다.
본 발명에서 용어, "bFGF(basic fibroblast growth factor)"란 혈관신생 또는 상처치료 등과 같은 생물학적 과정에 관여하는 성장인자이다. 본 발명의 목적상 상기 bFGF는 상기 EGF와 같이 지방유래 줄기세포의 배지에 포함되어 이의 증식 및 분화능력과 같은 치료적 활성을 상승시키는 역할을 하는 단백질을 의미한다.
본 발명에서 용어, "EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지"는 지방유래 줄기세포의 증식능 또는 분화능의 향상을 위해 사용되는 배지로서, 상기 기저배지에 bFGF 또는 EGF를 추가로 하는 배지를 말한다. 상기 배지에는 EGF 또는 bFGF를 각각 0.1 ng/㎖ 내지 100 ng/㎖의 농도로 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 "EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지"는 "증식배지"와 혼용될 수 있다.
상기 기저배지 및 증식배지에 대한 정보 등은 대한민국 공개특허 제10-2010-0118491호에 개시되어 있으며, 상기 제10-2010-0118491호의 명세서 전체는 본 발명의 참고자료로서 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "치료능력"이란 줄기세포의 치료적 활성(therapeutic activity)을 의미하며, 본 발명의 줄기세포를 세포치료제 등으로 사용할 경우 "역가"라고도 한다. 바람직하게는 지방유래 줄기세포의 증식능력, 분화능력, 면역조절능력 또는 이들 능력 모두를 의미하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "분화능력"이란 지방유래 줄기세포가 지방세포, 골모세포, 연골모세포, 근섬유모세포, 골모세포, 근육세포 또는 신경세포 등으로 분화될 수 있는 능력을 의미한다. 본 발명에서 분화능력이 높은 지방유래 줄기세포는 지방세포, 골모세포, 연골모세포, 근섬유모세포, 골모세포, 근육세포 또는 신경세포로의 분화 유도가 용이하게 일어나는 세포를 의미하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 "면역조절능력"은 바람직하게는 면역억제능력을 말하며, 상기 면역억제능력은 bFGF 또는 EGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포가 면역세포의 활성을 억제할 수 있는 것을 의미한다. 특히, 중간엽 줄기세포의 경우 APC(antigen presenting cell)를 억제함으로써 면역억제효과에 관여하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 지방유래 줄기세포를 면역억제제로 사용하여 면역질환을 치료할 수 있다.
본 발명에서 "치료능력이 높은 지방유래 줄기세포"는, 기저배지에서 배양된 지방유래 줄기세포에 비하여 KAZALD1, PENK 및 LBP로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현 수준이 증가되어 있고, LIPG의 발현이 감소되어 있는 지방유래 줄기세포로서, 기저배지에서 배양된 지방유래 줄기세포에 비하여 세포증식이 빠르거나 면역 억제능이 좋거나 분화 효율이 높은 등 치료제로서의 활성(역가)이 좋은 지방유래 줄기세포를 의미한다.
이와 같은 유전자의 발현 수준은 mRNA 또는 단백질의 양을 측정함으로써 확인할 수 있다.
본 발명에서 용어, "mRNA 수준 측정"이란 지방유래 줄기세포의 분화능력을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 지방유래 줄기세포의 치료능력을 나타내는 마커 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, mRNA의 양을 측정한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩 등이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 유전자 mRNA의 수준을 RT-PCR 및 Real-time PCR을 통하여 확인하였다(실시예 3).
유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 프라이머 쌍 또는 프로브이며, KAZALD1, PENK, LBP 및 LIPG 유전자의 핵산 서열은 각각 NM_030929.4, NM_006211.3, NM_203346.2 및 NM_006033.2에 밝혀져 있으므로, 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.
본 발명에서 용어, "프라이머(primer)"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 본 발명에서 프라이머는 바람직하게는 KAZALD1에 대한 프라이머는 서열번호 3 및 4인 프라이머 쌍, PENK에 대한 프라이머는 서열번호 5 및 6인 프라이머 쌍, LBP에 대한 프라이머는 서열번호 7 및 8인 프라이머 쌍, 또는 LIPG에 대한 프라이머는 서열번호 9 및 10인 프라이머 쌍일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수개의 염기 내지는 수백 개의 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링이 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브 또는 RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 KAZALD1, PENK, LBP 및 LIPG 폴리뉴클레오타이드와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 지방유래 줄기세포의 분화 능력을 알 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명의 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머는, 각 마커 유전자에 특이적인 프라이머로 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산이다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 또한 검출 가능한 시그날을 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소, 형광성 분자 및 바이오틴 등이 있다.
본 발명에서 용어, "단백질 수준 측정"이란 지방유래 줄기세포의 분화능력을 탐지하기 위하여 생물학적 시료에서 지방유래 줄기세포의 치료능력을 나타내는 마커 유전자로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 바람직하게는 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 마커 단백질의 수준 측정은 지방유래 줄기세포 또는 이의 배지를 이용하여 측정할 수 있다.
상기 KAZALD1, PENK, LBP 및 LIPG 유전자는 세포 밖으로 분비되는 분비단백질을 코딩하고 있어서, 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포 뿐만 아니라, 상기 줄기세포를 배양한 배지를 이용하여 단백질의 증감 확인을 통하여 지방유래 줄기세포의 증식능력, 면역억제능, 분화능력 등을 비롯한 치료적 활성을 측정할 수 있다.
본 발명에서 용어, "항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하고, 구체적으로는 본 발명의 마커 유전자인 KAZALD1, PENK, LBP 또는 LIPG가 코딩하는 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 본 발명의 마커 단백질이 규명되었으므로 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 다클론 항체는 상기 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 및 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다. 단일클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein, 1976, European Jounral of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol.,222:58, 1-597, 1991) 기술 등을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피 또는 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다. 또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다. 단백질 수준의 측정 방법으로는 웨스턴 블랏(Western blot), 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) 및 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는 대표적인 단백질 수준 측정 방법으로 웨스턴 블랏과 엘라이자(ELISA) 분석법을 이용하여 상기 단백질의 수준을 측정하였다(실시예 4).
본 발명의 일 실시예에서는, EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포가 상기 인자를 포함하지 않은 기저배지에서 배양한 지방유래 줄기세포보다 증식능력, 면역억제, 혹은 분화능력 등의 치료활성이 우수함에 기초하여(대한민국 공개특허 제10-2010-0118491호, 도 1 및 도 2), EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포와 기저배지에서 배양한 지방유래 줄기세포 간의 발현에 유의한 차이를 보이는 유전자를 확인한 결과, EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포에서는 KAZALD1, PENK 및 LBP의 발현이 증가되어 있고, LIPG의 발현이 감소되어 있음을 확인하였다(도 3). 또한, 대표적인 본 발명의 마커인 LBP 및 LIPG의 발현을 지방유래 줄기세포의 배양액에서 확인한 결과, LBP 단백질의 수준이 기저배지에 비해 증식배지에서 더 높으며, LIPG 단백질의 수준이 기저배지에 비해 증식배지에서 더 낮음을 확인하여, 본 발명의 마커 단백질은 분비 단백질로서 배양액에서 검출할 수 있는 이점을 가짐을 확인하였다(도 4b). 나아가, PENK 또는 KAZALD1 발현벡터로 형질전환시킨 지방유래 줄기세포를 이용하여, PENK 또는 KAZALD1이 세포 외로 분비되어 측분자인자효과를 나타냄을 확인함으로써(도 5b), 상기 마커 단백질들이 배양액에서 검출될 수 있는 마커임을 재차 확인하였다.
본 발명의 또 하나의 양태는 KAZALD1, PENK, LBP 및 LIPG로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 증식능력 탐지를 위한 분비 단백질 마커 검출용 조성물이다.
상기 지방유래 줄기세포, EGF, bFGF, mRNA 또는 이의 단백질 수준의 측정 및 유전자들에 대해서는 상기에서 기재한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "증식능력"이란 세포가 자율적, 또는 호르몬 등의 외인적 자극에 의해 DNA 합성, 세포분열을 수반하는 세포 수의 증가를 할 수 있는 능력을 말하며, 증식하지 않고 있지만 그 능력을 잠재적으로 유지하고 있는 경우도 포함된다. 줄기세포는 in vitro 배양시 자가 복제능(Self renewal capacity)이 있어 증식능을 가지나, 계대배양이 진행될수록 증식능이 감소하여 결과적으로 순수하고 많은 양의 줄기세포를 얻는 데는 한계점이 있다. 따라서, 줄기세포를 치료제로서 효과적으로 이용하기 위해서는 단기간에 많은 양의 줄기세포를 수득할 수 있는 배양법이 필요하다.
본 발명에서는 EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포가 기저배지에서 배양된 지방유래 줄기세포에 비해 증식능력이 우수함을 확인하였고, 이러한 증식능력의 차이를 나타내는, 기저배지 또는 증식배지에서 배양된 지방유래 줄기세포 간의 발현 차이를 보이는 유전자를 규명하였다.
구체적으로, 증식배지에서 배양한 지방유래 줄기세포는 KAZALD1, PENK 및 LBP으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현이 기저배지에서 배양된 지방유래 줄기세포에 비하여 증가되어 있고, LIPG의 발현이 기저배지에서 배양된 지방유래 줄기세포에 비하여 감소되어 있다. 상기와 같은 발현 특징을 보이는 지방유래 줄기세포는, 기저배지에서 배양한 지방유래 줄기세포, 특히 KAZALD1, PENK 및 LBP 유전자의 발현이 감소되어 있거나, LIPG 유전자의 발현이 증가되어 있는 지방유래 줄기세포에 비하여 세포증식이 잘 일어나서 세포수율이 높으며, 또한 세포증식, 면역억제, 분화능력과 같은 임상적 치료효과가 높은 특징을 보일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 기저배지와 증식배지에서 같은 양의 지방유래 줄기세포를 5계대 동안 키웠을 때 증식배지에서의 세포증식이 평균 2배 이상 증가한 것을 확인하였다(실시예 1 및 도 2).
본 발명의 또 하나의 양태는 상기 EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 분화능력을 탐지하기 위한 마커 검출용 조성물을 포함하는, EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 분화능력 탐지를 위한 마커 검출용 키트이다.
상기 EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 분화능력을 탐지하기 위한 마커 검출용 조성물에 대해서는 상기에서 언급한 바와 같다.
본 발명의 마커 검출용 키트에는 EGF 또는 bFGF를 포함하는 증식배지에서 배양함에 따라 발현이 증가 또는 감소하는 마커 유전자 또는 이들의 단백질을 선택적으로 인지할 수 있는 프라이머 또는 항체뿐만 아니라 면역학적 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구 및 시약 등이 포함된다. 이러한 도구나 시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 표지물질이 효소인 경우에는 효소의 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.
본 발명의 마커 검출용 키트는 바람직하게는 RT-PCR 키트, DNA 키트, 또는 단백질 칩 키트일 수 있다. 상기 단백질 칩에 상기 유전자가 코딩하는 단백질에 대한 항체가 제공되는 경우에는, 2개 이상의 항체에 대한 항원-항체 복합체 형성을 관측할 수 있어 지방유래 줄기세포의 분화능력 탐지에 있어 보다 유리하다.
상기 RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함할 수 있으며, 그 외 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
상기 DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있으며, 상기 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
상기 단백질 칩 키트는 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 키트일 수 있다. 단백질 칩을 이용하는 방법은 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성하고, 이를 판독하여 단백질의 존재 또는 발현수준을 확인할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 마이크로어레이를 이용하여 기저배지와 증식배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 마커 유전자들의 발현 차이를 확인하였다(실시예 2).
본 발명의 또 하나의 양태는 상기 EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 증식능력을 탐지하기 위한 마커 검출용 조성물을 포함하는, EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 증식능력을 탐지하기 위한 마커 검출용 키트이다.
상기 EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 증식능력을 탐지하기 위한 마커 검출용 조성물 및 사용할 수 있는 마커 검출용 키트는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 또 하나의 양태는 EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 KAZALD1, PENK, LBP 및 LIPG로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 지방유래 줄기세포의 분화능력을 탐지하는 방법이다.
상기 EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지, 상기 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준 측정 및 지방유래 줄기세포의 분화능력에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 또한, 상기 KAZALD1, PENK, LBP 또는 LIPG 유전자는 세포 밖으로 분비되는 분비단백질을 코딩하고 있어서, 바람직하게는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포 뿐만 아니라, 상기 줄기세포를 배양한 배지를 이용하여 단백질의 증감을 확인함으로써 지방유래 줄기세포의 증식능력, 면역억제능, 분화능력 등을 비롯한 치료적 활성 측정할 수 있음은 상기에서 언급한 바와 같다.
상기 방법은 추가적으로, LIPG 유전자 mRNA 또는 이의 단백질의 양이 대조군인 기저배지에서 배양한 지방유래 줄기세포에서 측정한 값에 비해 적으면, 분화능력이 대조군에 비하여 높은 것으로 판단하는 단계, 및/또는 KAZALD1, PENK 및 LBP 로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질의 양이 대조군인 기저배지에서 배양한 지방유래 줄기세포에서 측정한 값에 비해 많으면, 분화능력이 대조군에 비하여 낮은 것으로 판단하는 단계를 포함하는 지방유래 줄기세포의 분화능력을 탐지하는 방법일 수 있다.
이 때, 대조군인 기저배지에서 배양한 지방유래 줄기세포와 증식배지에서 배양한 지방유래 줄기세포는 계대수가 동일하거나 1 계대 이하 차이인 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에서는 EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포가 상기 인자를 포함하지 않은 기저배지에서 배양한 지방유래 줄기세포보다 증식능력, 분화능력 등의 치료활성이 우수함에 기초하여(대한민국 공개특허 제10-2010-0118491호), EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포와 기저배지에서 배양한 지방유래 줄기세포 간의 발현에 유의한 차이를 보이는 유전자를 확인한 결과, EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포에서는 KAZALD1, PENK 및 LBP의 발현이 증가되어 있고, LIPG의 발현이 감소되어 있음을 확인하였다(도 3 및 도 4). 따라서 KAZALD1, PENK 및 LBP의 발현이 증가되어 있거나 LIPG의 발현이 감소되어 있는 지방유래 줄기세포는, KAZALD1, PENK 및 LBP의 발현이 감소되어 있거나 LIPG의 발현이 증가되어 있는 지방유래 줄기세포에 비하여 분화능력이 우수함을 시사한다.
본 발명의 또 하나의 양태는 EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 KAZALD1, PENK, LBP 및 LIPG로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 지방유래 줄기세포의 증식능력을 탐지하는 방법이다.
상기 EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지, 상기 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준 측정 및 지방유래 줄기세포의 증식능력에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
바람직하게는 LIPG 유전자 mRNA 또는 이의 단백질의 양이 대조군인 기저배지에서 배양한 지방유래 줄기세포에서 측정한 값에 비해 적으면, 증식능력이 대조군에 비하여 높은 것으로 판단하는 단계, 또는 KAZALD1, PENK 및 LBP로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질의 양이 대조군인 기저배지에서 배양한 지방유래 줄기세포에서 측정한 값에 비해 많으면, 증식능력이 대조군에 비하여 높은 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는 지방유래 줄기세포의 증식능력을 탐지하는 방법일 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에서 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 이들에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 기저배지와 증식배지에 따른 지방유래 줄기세포의 세포증식 능력 검증
실시예 1-1: 인간 지방 유래 스트로마 줄기세포의 배양
공여자로부터 지방조직을 분리하였고(안트로젠, 경기도, 대한민국), 얻어진 지방조직으로부터 지방유래 스트로마 줄기세포를 분리하였다. 혈액을 제거하기 위해 지방조직을 같은 부피의 KRB(Krebs-Ringer Bicarbonate) 용액으로 34회 세척하였다. 지방조직과 같은 부피의 콜라게나제 용액을 넣어 37℃ 수욕에서 반응시켰다. 이를 원심분리용 튜브에 옮겨 넣고 20℃, 1200 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 상층액인 지방층을 제거하고, 아래층인 콜라게나제 용액을 흔들리지 않도록 조심해서 분리하였다. 기저배지를 넣어 현탁시킨 후, 20℃, 1200 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 이때, 아래에 가라앉는 것이 스트로마-혈관 분획이므로, 상층액을 제거하였다. 스트로마-혈관 분획을 기저배지에 현탁시켜 배양용기에 접종하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24 시간 동안 배양하였다. 배양액 제거 후 인산염 완충용액으로 세척하고, 기저배지, 기저배지에 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF)가 1 ng/㎖ 농도로 포함된 배지 또는 기저배지에 표피세포 성장인자(EGF)가 5 ng/㎖ 농도로 포함된 배지를 이용하여 증식시켰다. 지방유래 스트로마 줄기세포가 배양용기의 80-90% 정도로 자라면 트립신을 처리하여 단일 세포로 분리하여 수득하였다. 얻어진 세포를 증식배지로 1:31:4로 희석하여 계대배양을 수행하였다(공개번호 10-2010-0118491). 배양배지의 조성에 따른 유전자 발현 차이를 분석하기 위하여 10% FBS가 포함된 DMEM인 기저배지로 배양한 5계대 세포와 기저배지에 1 ng/㎖ bFGF가 포함된 증식배지로 배양한 5계대 세포를 수집하였다.
총 5개 로트 배양결과 기저배지로 배양할 때보다 EGF 또는 bFGF를 포함하는 증식배지로 배양할 때 증식속도가 높았으며, 섬유아세포 형태를 안정적으로 유지하였다. 도 1에 기저배지와 EGF 또는 bFGF를 포함하는 증식배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 형태사진을 나타내었다. 도 2는 기저배지와 EGF 또는 bFGF를 포함하는 증식배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 CPDL(cell population doubling level)의 예를 나타내었다.
실시예 2: 마이크로 어레이 실험에 의한 지방유래 줄기세포의 배지별 유전자 발현 증감 확인
실시예 2-1: 인간 지방유래 스트로마 줄기세포의 배양
공여자 17명으로부터 지방 조직을 분리하고(안트로젠, 경기도, 대한민국), 실시예 1에서와 같이 지방유래 줄기세포를 배양하였다.
실시예 2-2: 총 RNA 분리
총 RNA는 QIAGEN 킷트(RNeasy Maxi kit: cat #75162)를 사용하여 분리하였고, Experion RNA StdSens(Bio-Rad사) 칩을 이용하여 정량하였다. 우선 상기 배양된 지방유래 줄기세포를 150 ㎕의 베타 멀캅토 에탄올을 첨가한 15 ㎖의 키트 내 분해 완충액에 용해시켰다. 여기에 15 ㎖의 70% 에탄올을 넣어 잘 섞은 후, 3000 g에서 5분간 원심분리하여 총 RNA를 막에 부착시켰다. 두 차례의 세척을 한 후, 1.2 ㎖의 RNase가 없는 물을 첨가하여 총 RNA를 분리하였다.
실시예 2-3: 마이크로어레이 실시
상기 추출된 총 RNA를 Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit(Ambion사)를 이용하여 하이브리드화 하였다. T7 Oligo(dT) 프라이머를 이용하여 cDNA를 합성하고, biotin-UTP를 이용하여 in vitro 전사(in vitro transcription)을 실시하여 biotin-labeled cRNA를 제조하였다. 제조된 cRNA는 NanoDrop을 이용하여 정량하였다. 지방유래 줄기세포에서 제조된 cRNA를 Human-6 V2(Illumina사) 칩에 하이브리드화 하였다. 하이브리드화 후, 비특이적 하이브리드화를 제거하기 위하여 Illumina Gene Expression System 세척액(Illumina사)을 이용하여 DNA 칩을 세척하였고 세척된 DNA 칩은 streptavidin-Cy3(Amersham사) 형광 염색약으로 표지하였다. 형광 표지된 DNA 칩은 공촛점(confocal) 레이저 스캐너(Illumina사)를 이용하여 스캐닝하여 각 스팟에 존재하는 형광의 데이터를 얻어서 TIFF 형태의 이미지 파일로 저장하였다. TIFF 이미지 파일을 BeadStudio version 3(Illumina 사)으로 정량하여 각 스팟의 형광값을 정량하였다. 정량된 결과는 Avadis Prophetic version 3.3(Strand Genomics사) 프로그램으로 'quantile' 기능을 이용하여 보정하였다.
기저배지에서 배양한 계대수 5인 세포와 증식배지에서 배양한 계대수 5 세포에서 측정된 상기 유전자들의 발현 차이를 확인한 결과, KAZALD1, PENK 및 LBP 유전자는 기저배지에 비해 증식배지에서 현저한 증가를 보이는 유전자이며, LIPG 유전자는 기저배지에 비해 증식배지에서 그 발현이 감소한 유전자이다. 이러한 결과로부터 상기 유전자들이 기저배지와 증식배지를 비교할 때 발현차이를 크게 나타내므로, 이를 임상적 유효성이 높은 증식배지에 배양한 지방줄기세포를 판단하는 용도로 사용할 수 있음을 알 수 있다. 단, 이러한 결과는 줄기세포와 분화된 줄기세포를 구별하는 알려진 마커와는 다른 양상을 보일 수 있으며, 계대수 및 분화여부에 따라서도 다른 양상을 보일 수 있다.
실시예 3: 개별 공여자의 지방유래 줄기세포로부터 기저배지와 증식배지에서 발현 차이를 보이는 유전자 개별적 확인
17쌍의 공여자 지방줄기세포 샘플(기저배지와 증식배지 배양세포)을 이용하여 실시예 2에서 확인된 유전자들의 발현량을 RT-PCR 방법을 통하여 분석하였다. 실시예 2의 방법을 통하여 총 RNA를 분리하였다.
실시예 3-1: cDNA 합성과 주형의 농도 보정
시료 각각의 총 RNA 2 ㎍, 프라이머인 50M Oligo(dT) 1 ㎕와 10 mM dNTP 2.5 ㎕,를 넣고 RNase 저해제인 DEPC가 들어 있는 멸균수로 전체가 25 ㎕가 되도록 하여 RNA/primer 혼합용액을 만들었다. 65℃에서 5분간 반응시킨 후 55℃로 옮겨 보관하였다. 다음 10X RT buffer 5 ㎕, 25 mM MgCl2 10㎕, 0.1 M DTT 5 ㎕, RNase inhibitor 1 ㎕, SuperScriptIII RT 효소를 1 ㎕ 넣고 전체가 25 ㎕ 가 되도록 한 후 55℃에서 보관 중인 RNA/primer 혼합용액과 섞어준 후, 55℃에서 50분간 반응시켰다. 그 후 85℃에서 5분간 반응시켜 RT 효소를 불활성화한 후 얼음에 넣어 반응을 종결시켰다. 마커 유전자를 정량하기 위한 표준 유전자로서 RPL13A를 사용하였다. 표준 유전자의 프라이머를 이용하여 RT-PCR 반응을 수행하고 표준 유전자 RPL13A의 발현량이 동일해지도록 cDNA의 농도를 보정하였다. 우선 각각의 cDNA를 20배 희석한 후 희석된 샘플 2 ㎕를 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR은 2x PCR premix (Hot start) 15 ㎕, 2 ㎕의 RPL13A 정방향 프라이머, 2 ㎕ 의 RPL13A 역방향 프라이머, 11 ㎕의 증류수를 넣어 사용하였고 20 사이클, 23 사이클, 25 사이클을 수행하였다. 이 때 RT-PCR 반응 조건은 94℃에서 30초, 50℃에서 30초, 72℃에서 1분간 수행하였다. 사용된 RPL13A 프라이머는 정방향 5'-CATCGTGGCTAAACAGGTACTG-3'(서열번호 1), 역방향 5'-GCACGACCTTGAGGGCAGC-3'(서열번호 2)이다. PCR 산물을 2% 아가로스 젤에 로딩하여 전기영동한 후 젤 사진을 찍고, 이미지를 TotalLab v1.0 프로그램(Nonlinear Dynamix사)으로 정량한 후, 다시 보정하여 PCR을 수행하여 정량하는 방식으로 각 시료의 농도를 동일하게 보정하였다.
실시예 3-2: RT-PCR/Real-Time PCR 을 이용한 발현량 분석
동일한 양이 되도록 희석한 cDNA를 상기 유전자들의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. cDNA는 3 ㎕, 2x premix 10㎕, 프라이머 각 2 ㎕ (20 pmole), 증류수 2 ㎕를 섞어 총 용액 20 ㎕로 만들고 PCR 반응은 94℃에서 1분, 54℃에서 30초, 72℃에서 1분으로 하였으며 각 유전자마다 사이클은 달리하였다. PCR 산물을 확인하기 위하여 2% 아가로스 젤을 이용하여 전기영동하고 이미지 장비를 이용하여 분석하였다. Realtime RT-PCR은 Qiagen사(CA, USA)의 DNASYBRI 시약과 LightCycler(Roche)를 이용하였다. Melt Curve 분석을 이용하여 PCR 산물의 질을 평가하였고 유전자 발현량은 LightCycler version 3.5 software(Roche)를 사용하여 분석하였다. 상기 RT-PCR/Real-Time PCR에서 사용한 유전자들의 특이적 프라이머와 대조 프라이머의 서열(서열번호 1 내지 10)은 표 1에 명시하였다.
그 결과를 도 3에 나타내었다. 그 결과 상기의 유전자들은 확연히 기저배지에 비례하여 증식배지에서 증가하거나 감소하는 것이 확인되었다. 구체적으로, KAZALD1(76.4%, 17개 중 13개 샘플에서 증가), PENK(82.3%, 17개 중 14개 샘플에서 증가), LBP(94.1%, 17개 중 16개 샘플에서 증가)는 증식배지에서 발현이 증가하였으며, LIPG(88.2%, 17개 중 15개 샘플에서 감소)는 증식배지에서 발현이 감소하였다(도 3).
표 1
유전자(REF) 프라이머 서열번호
RPL13A(NM_012423.02) F: 5'-catcgtggctaaacaggtactg-3' 서열번호 1
R: 5'-gcacgaccttgagggcagc-3' 서열번호 2
KAZALD1(NM_030929.4) F: 5'-gatgtgatctttggctgtga-3' 서열번호 3
R: 5'-acccctaaactgcacagaga-3' 서열번호 4
PENK(NM_006211.3) F: 5'-caggatggcagtgataatga-3' 서열번호 5
R: 5'-atatcgcttctgcagctctt-3' 서열번호 6
LBP(NM_203346.2) F: 5'-aatctgtctgtggaccccta-3' 서열번호 7
R: 5'-ttcaggaacccagtgatctt-3' 서열번호 8
LIPG(NM_006033.2) F: 5'-ccaacaccttcctggtctac-3' 서열번호 9
R: 5'-ctccttccacaggttgtacc-3' 서열번호 10
실시예 4: 선별된 유전자의 지방유래 줄기세포 또는 이를 배양한 배지에 따른 단백질 발현 조사
실시예 4-1: 선별된 유전자의 지방줄기세포에 따른 단백질 발현량 조사
공여자 지방줄기세포 샘플(기저배지와 증식배지에서 배양)을 이용하여 실시예 3에서 확인된 유전자 중 일부의 발현량을 웨스턴 블랏과 ELISA 분석법으로 단백질 정량을 통하여 분석하였다.
구체적으로, 60 mm 디쉬에서 키워진 세포를 PBS로 한번 헹구어낸 후, 차가운 단백질용 용해 완충액(RIPA cell lysis buffer: 50 mM Tris-Cl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 10% 글리세롤, 1 mM PMSF, 1 mM DTT, 20 mM NaF, 1 mM EDTA, 단백질분해효소 저해제)를 첨가하여, 세포의 단백질을 준비하였다. 준비되어진 각 단백질 시료를 30 ㎍씩 사용하여 10% 혹은 12% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) 겔(gel)에 걸어 크기별로 단백질을 분리해 낸 후, 이를 PVDF 막에 잘 옮겨주었다.
단백질이 옮겨진 필터를 적당한 크기로 잘라낸 후, 각 단백질에 해당하는 항체를 붙여주었다. 항체에 대한 정보는 다음과 같다. anti-LBP(abcam, ab25094), anti-LIPG(abcam, ab24447), anti-ACTIN(Sigma, A5316). 각각의 단백질의 양은 ImmobilonTM 웨스턴 블럿팅 검출 시약 (Western Blotting Detection reagents)(Millipore)를 사용하여 밴드(band)로 확인하였다.
그 결과, 상기 유전자 중 LBP의 경우, 기저배지에서 단백질 발현이 낮고 증식배지에서 단백질 발현이 높았던 반면, LIPG의 경우 기저배지에서 단백질 발현이 높고 증식배지에서 단백질 발현이 감소함을 관찰하였다(도 4a).
실시예 4-2: 선별된 유전자의 배지에 따른 단백질 발현량 조사
배지로 분비된 단백질을 분석하기 위해서 60 mm 디쉬에 세포를 붙인 후, 이틀 후 그리고 4일 후 세포를 배양하는 배지를 모아서 여과지가 있는 센트리콘으로 정제 후 ELISA 분석법으로 단백질 양을 측정하였다. 정제된 배지의 일정량을 이용하여 분비된 단백질을 ELISA용 플레이트에 12시간동안 붙인 후 용액은 제거하였다. Blocking 용매(PBS 용매 + 1% BSA, 0.02% Azide)를 넣고 4시간 동안 4℃에서 보관한 후, PBS 용매로 씻어주었다. 희석된 항체를 처리하고 실온에서 1시간 보관하고 다시 0.05% Tween-20 포함된 PBS 용매로 씻어주고 Santa Cruz사의 Indirect ELIZA 키드를 이용하여 발색시킨 다음, 흡광도 405nm와 490nm에서 측정하였다.
그 결과, 상기 유전자 중 RT-PCR을 통하여 증식배지에서 mRNA 수준이 증가하는 유전자인 LBP의 경우, 기저배지에서 단백질 발현이 낮고 증식배지에서 단백질 발현이 높아, mRNA 실험결과와 부합함을 관찰하였고, 증식배지에서 mRNA 수준이 감소하는 유전자인 LIPG의 경우 기저배지에서 단백질 발현이 높고 증식배지에서 단백질 발현이 감소함을 관찰하여, 마찬가지로 mRNA 실험결과와 부합하는 것을 확인하였다(도 4b).
실시예 5: 선별된 유전자의 과발현에 의한 지방유래 줄기세포의 세포증식 효과 조사
실시예 5-1: 유전자 클로닝
KAZALD1와 PENK를 발현하는 벡터의 제조과정을 도 5a에 도시하였다. KAZALD1 유전자는 지방유래 줄기세포의 cDNA와 표 2의 프라이머 쌍(서열번호 11 및 12)를 이용하여 증폭하였고, PENK 유전자는 프라이머 쌍(서열번호 13 및 14)를 이용하여 증폭한 후, 제한효소 BglII 및 HindIII를 이용하여 절단하고 순수 분리하였다. RFP(Red fluorescence protein)를 표지(tagging)할 수 있는 발현벡터인 pDsRed-N1(Clontech co.)을 제한효소 BglII 및 HindIII로 자르고 CIP로 정리하여 만든 각각의 절편 20 내지 50 ng에, 상기의 증폭한 유전자 절편 및 T4 DNA 리가아제 1 unit를 섞어 16℃에서 하루 동안 반응시킨 후 반응액의 2 내지 5 ㎕를 취하여 박테리아균주 DB3.1(RbCl를 이용한 Frozen Stock Method)에 형질전환하였다. 형질전환된 균주를 선별하기 위해 항생제가 포함된 LB 고체배지에 도말하고 37℃ 배양기에 하루 동안 키워 형질 전환되어 생성된 콜로니에서 플라스미드를 플라스미드 정제 Kit(솔젠트사)를 이용하여 순수 분리하였다. 확인 가능한 제한효소로 절단하여 그 구조를 최종 확인하였다. 결과적으로 RFP 표지(Tagging)된 유전자를 발현하는 벡터를 제조하였다.
표 2
유전자(REF) 프라이머 서열번호
KAZALD1(NM_030929.4) F: 5'-ataagcttatgctgccgccgccgcggcccgca-3' 서열번호 11
R: 5'-ataagcttgtagtaatcgtcattctcttcactctca-3' 서열번호 12
PENK(NM_006211.3) F: 5'-gaagatctgatggcgcggttcctgacact-3' 서열번호 13
R: 5'-ataagcttaaatctcataaatcctccgtatc-3' 서열번호 14
실시예 5-2: 유전자 발현 확인
제조된 벡터가 정상적으로 단백질 발현을 하는지 검증하기 위하여 지방유래 줄기세포를 리포펙타민 플러스 방법을 사용하여 순간적으로 트랜스펙션시켰다.
구체적으로 트랜스펙션 하루 전에, 지방유래 줄기세포를 60 mm 디쉬를 이용하여 기저배지에 시딩(seeding)하고, 하나의 페트리 디쉬의 트랜스펙션에 대하여, 2 ㎍ DNA를 4 ㎕ 플러스 시약(Life Technologies)에 첨가하고, 혼합하고 실온에서 15분 동안 배양하였다(용액 A). 6 ㎕의 리포펙타민 시약을 150 ㎕의 혈청이 없는 기저배지에 첨가하였다(용액 B). 용액 A와 B를 배합하고, 살짝 혼합하고 실온에서 15분 동안 배양하여 복합체를 형성시켰다. 15분 후에 900 ㎕의 혈청이 없는 기저배지를 혼합물에 첨가하였다. 세포를 혈청이 없는 기저배지로 한번 세척하고 DNA-리포펙타민 플러스 복합체(최종 부피 1200 ㎕)를 세포에 첨가하고 5% CO2 배양기에서 37℃에서 5시간 동안 배양하였다. 이후, 기저배지를 제거하고 혈청이 있는 기저배지를 세포에 첨가하고 배양기에 배양하였다. 48시간 후 형광현미경을 이용하여 단백질 발현을 RFP 형광을 추적하여 확인하였다(도 5a).
실시예 5-3: 유전자 과발현에 의해 증가돤 분비 단백질의 세포증식에 있어서의 측분비인자(paracrine signal molecule) 효과 확인
트란스웰(Trans-well) 플레이트의 바깥쪽 웰에는 형질전환하지 않은 지방유래 줄기세포를 시딩(seeding) 하여 부착시킨 후, 안쪽 웰에 실시예 5-1에서 클로닝한 발현벡터를 형질전환시킨 지방유래 줄기세포를 넣어준 후, 형질전환된 세포에서 과발현된 분비 단백질의 측분비인자효과를 확인하였다. 도 5b에서 도시한 바와 같이 실험을 구성하고, 96 시간동안 배양한 후 형질전환하지 않은 지방유래 줄기세포가 부착된 트란스웰(Trans-well) 플레이트의 바깥쪽 웰의 세포에 배지와 동일량의 10% 포르말린 용액 (Formalin solution)을 넣어준 후 세포를 고정시켰으며, 30분 동안의 보관 후, PBS를 사용하여 세포를 말끔히 씻어내고 이를 하룻동안 말려주었다. 말려진 세포에는 1% SRB(Sulforhodamine B) 용액을 첨가시킨 후 1시간동안 배양시켜 세포를 염색시켜 주었으며, 이후 용액을 버린 후, 증류수로 세포를 다시 한 번 깨끗이 씻어내었고 이를 말려 주었다. 염색된 세포를 광학현미경으로 촬영하여 세포의 증식력의 변화를 관찰하고 상대적 세포증식변화를 그래프로 나타내었다(도 5b).
그 결과, 본 발명의 대표적인 마커 유전자인 PENK 또는 KAZALD1을 과발현하는 지방유래 줄기세포는, PENK 또는 KAZALD1을 배양배지로 분비하여 형질전환되지 않은 지방유래 줄기세포에 측분비인자로 작용하였음을 시사한다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (12)

  1. KAZALD1(Kazal-Type Serine Peptidase Inhibitor Domain 1), PENK(Proenkephalin), LBP(Lipopolysaccharide Binding Protein) 및 LIPG(Lipase, Endothelial)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, EGF(Epidermal growth factor) 또는 bFGF(basic fibroblast growth factor)를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 치료능력 탐지를 위한 마커 검출용 조성물.
  2. KAZALD1, PENK, LBP 및 LIPG로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 증식능력 탐지를 위한 마커 검출용 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 유전자의 단백질 수준은 지방유래 줄기세포 또는 이의 배양 배지에 존재하는 단백질의 수준을 측정하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 유전자 mRNA의 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍 또는 프로브를 포함하는 것인 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 것인 조성물.
  6. 제1항의 조성물을 포함하는, EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 치료능력을 탐지하기 위한 마커 검출용 키트.
  7. 제2항의 조성물을 포함하는, EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 증식능력을 탐지하기 위한 마커 검출용 키트.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 마커 검출용 키트.
  9. EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 KAZALD1, PENK, LBP 및 LIPG로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 지방유래 줄기세포의 치료능력 탐지 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 방법은 EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 KAZALD1, PENK 및 LBP로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질의 양이 대조군인 기저배지에서 배양한 지방유래 줄기세포에서 측정한 값에 비해 많거나, 또는 지방유래 줄기세포의 LIPG 유전자 mRNA 또는 이의 단백질의 양이 대조군인 기저배지에서 배양한 지방유래 줄기세포에서 측정한 값에 비해 적으면, 치료능력이 대조군에 비하여 높은 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는, 지방유래 줄기세포의 치료능력 탐지 방법.
  11. EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 KAZALD1, PENK, LBP 및 LIPG로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 지방유래 줄기세포의 증식능력 탐지 방법.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자의 단백질 수준은 지방유래 줄기세포 또는 이의 배지에 존재하는 단백질의 수준을 측정하는 것을 특징으로 하는 탐지 방법.
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