WO2017023001A1 - 비알콜성 지방간 조절인자 14-3-3 단백질 - Google Patents

비알콜성 지방간 조절인자 14-3-3 단백질 Download PDF

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fatty liver
pparγ
gene
alcoholic fatty
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고제상
박소담
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고려대학교 산학협력단
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    • G01N2800/085—Liver diseases, e.g. portal hypertension, fibrosis, cirrhosis, bilirubin

Definitions

  • the present invention relates to non-alcoholic fatty liver regulator 14-3-3 protein.
  • Non-Alcoholic Fatty Liver Disease is a representative liver disease that causes liver inflammation and damage.
  • NAS non-alcoholic steatohepatitis
  • PPAR peroxisome proliferator activated receptor
  • the 14-3-3 protein involved in the transcription factor activity exists as seven isoforms ( ⁇ / ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ / ⁇ , ⁇ / ⁇ , and ⁇ ). Proteins of 14-3-3 are known to bind to the phosphorylated portion of the transcription factor and regulate the activity of transcription factors, and are also involved in the regulation of metabolic transcription factors.
  • the present inventors investigated the role of 14-3-3 proteins in the development and regulation of fatty liver, 14-3-3 ⁇ and 14-3-3 ⁇ are proteins that play an important role in the fat metabolism process as a regulatory factor of PPAR ⁇ 2
  • the present invention was completed by identifying that it can be used as a target for treating non-alcoholic fatty liver.
  • the present invention seeks to provide the use of 14-3-3 ⁇ and 14-3-3 ⁇ for the development of a medicament for preventing or treating nonalcoholic fatty liver.
  • the present invention comprises an inhibitor for the 14-3-3 ⁇ gene, wherein the inhibitor is an antisense oligonucleotide, siRNA, shRNA, miRNA, or a vector comprising the same for the 14-3-3 ⁇ gene.
  • the inhibitor is an antisense oligonucleotide, siRNA, shRNA, miRNA, or a vector comprising the same for the 14-3-3 ⁇ gene.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating non-alcoholic fatty liver is provided.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating non-alcoholic fatty liver comprising 14-3-3 ⁇ gene or 14-3-3 ⁇ protein.
  • the present invention also provides a non-alcoholic fatty liver diagnostic composition comprising a probe for measuring the mRNA or protein level of 14-3-3 ⁇ and / or 14-3-3 ⁇ gene from a sample of suspected fatty liver.
  • the invention also includes contacting a cell containing a 14-3-3 ⁇ or 14-3-3 ⁇ gene or protein with a candidate outside the body, and measuring the change in expression level of the gene or protein by the candidate.
  • the present invention relates to 14-3-3 ⁇ protein and / or 14-3-3 ⁇ protein in PPAR ⁇ 2
  • Nonalcoholic fatty liver prophylaxis or treatment comprising contacting a candidate with a protein and measuring the change in binding of 14-3-3 ⁇ protein and / or 14-3-3 ⁇ protein to PPAR ⁇ 2 by the candidate material
  • 14-3-3 ⁇ and 14-3-3 ⁇ modulate the transcriptional activity of PPAR ⁇ 2 as different regulatory factors.
  • 14-3-3 ⁇ while increasing the transcriptional activity of the PPAR ⁇ 2 in combination with a PPAR ⁇ 2, 14-3-3 ⁇ serves to decrease the transcriptional activity of the PPAR ⁇ 2. Therefore, 14-3-3 ⁇ and 14-3-3 ⁇ are proteins that play an important role in the fat metabolism process as regulators of PPAR ⁇ 2 and can be used as targets for the prevention or treatment of non-alcoholic fatty liver.
  • 1A shows the results of confirming the transcriptional activity of PPAR ⁇ 2 according to overexpression of 14-3-3 isoforms.
  • 1B is a result confirming the transcriptional activity of PPAR ⁇ 2 according to the change in the amount of 14-3-3 ⁇ expression.
  • 1C is a result confirming the transcriptional activity of PPAR ⁇ 2 according to the change in the amount of 14-3-3 ⁇ expression.
  • 1D shows the results of confirming the transcriptional activity of PPAR ⁇ 2 according to the inhibition of 14-3-3 ⁇ expression.
  • Figure 1E is the result confirming the transcriptional activity of PPAR ⁇ 2 in accordance with 14-3-3 ⁇ expression inhibition.
  • Figure 2 confirms the binding force of PPAR ⁇ 2 according to the treatment of pioglitazone PPAR ⁇ 2 ligand, A of Figure 2 is the result of confirming the binding force between PPAR ⁇ 2 and 14-3-3 ⁇ ; 2B is a result of confirming the binding force between PPAR ⁇ 2 and 14-3-3 ⁇ .
  • 3A shows the results of confirming domain location and deletion mutations of PPAR ⁇ 2 .
  • Figure 3B is a result of confirming the binding between the deletion mutation of PPAR ⁇ 2 and 14-3-3 ⁇ using the GST-pull down assay.
  • Figure 3C is a result of confirming the binding between the deletion mutation of PPAR ⁇ 2 and 14-3-3 ⁇ using GST-pull down assay.
  • 4A shows the result of confirming binding between S112A and S273A mutants and 14-3-3 ⁇ of PPAR ⁇ 2 .
  • 4B shows the result of confirming binding between S112A and S273A mutations of PPAR ⁇ 2 and 14-3-3 ⁇ .
  • 4C shows the results of confirming the transcriptional activity of PPAR ⁇ 2 according to the binding between the S273A mutation of PPAR ⁇ 2 and 14-3-3 ⁇ .
  • 4D shows the results of confirming the transcriptional activity of PPAR ⁇ 2 according to the binding between the S273A mutation of PPAR ⁇ 2 and 14-3-3 ⁇ .
  • FIG. 5 shows the binding of PPAR ⁇ 2 due to overexpression of 14-3-3 ⁇ or 14-3-3 ⁇
  • a of FIG. 5 shows the binding between 14-3-3 ⁇ and PPAR ⁇ 2 according to overexpression of 14-3-3 ⁇ . Confirming the results; 5B shows the result of confirming the binding between 14-3-3 ⁇ and PPAR ⁇ 2 according to overexpression of 14-3-3 ⁇ .
  • 6A shows PPAR ⁇ 2 in HepG2 cells following oleic acid treatment. 14-3-3 ⁇ , and 14-3-3 ⁇ This is the result of confirming the expression.
  • 6B shows PPAR ⁇ 2 , in primary mouse hepatocytes following oleic acid treatment. 14-3-3 ⁇ , and 14-3-3 ⁇ of It is the result of confirming expression.
  • Figure 6C is the result confirming the target gene expression in HepG2 cells following oleic acid treatment.
  • 6D shows the results of confirming target gene expression in primary rat hepatocytes following oleic acid treatment.
  • Figure 7A is a result confirming the expression of the target gene according to the expression of 14-3-3 ⁇ and 14-3-3 ⁇ in HepG2 cells.
  • Figure 7B is the result of confirming the expression of the target gene according to the expression of 14-3-3 ⁇ and 14-3-3 ⁇ in primary rat hepatocytes.
  • Figure 7C is a result of confirming the binding of the FAT / CD36 promoter according to 14-3-3 ⁇ and 14-3-3 ⁇ expression using the chromatin immunoprecipitation (ChIP assay).
  • 7D shows the results of confirming the expression of SREBP-1c protein according to the expression of 14-3-3 ⁇ and 14-3-3 ⁇ according to the expression of 14-3-3 ⁇ and 14-3-3 ⁇ .
  • FIG. 8 shows the formation of PAR-RXR complexes by binding to PPAR ⁇ 2 and overexpression of 14-3-3 ⁇ and 14-3-3 ⁇ by oleic acid treatment.
  • FIG. 8A shows PPAR ⁇ 2 and 14 according to oleic acid treatment. Confirming binding between -3-3 ⁇ ; 8B is a result confirming the binding between PPAR ⁇ 2 and 14-3-3 ⁇ in accordance with the oleic acid treatment; 8C is a result confirming the formation of PPAR-RXR complex according to the overexpression of 14-3-3 ⁇ and 14-3-3 ⁇ .
  • FIG. 9 shows the changes in fat accumulation according to oleic acid treatment, overexpression or suppression of expression of 14-3-3 ⁇ and 14-3-3 ⁇ in primary rat hepatocytes and HepG2 cells.
  • FIG. 9A shows fat accumulation following oleic acid treatment. Confirming the change; 9B is a result confirming the change of fat accumulation according to the overexpression of 14-3-3 ⁇ and 14-3-3 ⁇ ; 9C shows the results of confirming changes in fat accumulation according to the inhibition of expression of 14-3-3 ⁇ and 14-3-3 ⁇ .
  • FIG. 10 shows triglyceride accumulation changes in primary rat hepatocytes and HepG2 cells due to overexpression or inhibition of expression of 14-3-3 ⁇ and 14-3-3 ⁇ .
  • FIG. 10A shows 14-3-3 ⁇ and 14-3.
  • Triglyceride accumulation change according to overexpression of -3 ⁇ ; 10B is a result of confirming the change of triglyceride accumulation according to the inhibition of the expression of 14-3-3 ⁇ and 14-3-3 ⁇ .
  • the present inventors have found that two isoforms of 14-3-3, 14-3-3 ⁇ and 14-3-3 ⁇ , modulate the transcriptional activity of PPAR ⁇ 2 as different regulatory factors. 14-3-3 ⁇ while increasing the transcriptional activity of the PPAR ⁇ 2 in combination with a PPAR ⁇ 2, 14-3-3 ⁇ was serves to reduce the transcriptional activity of the PPAR ⁇ 2. Because PPAR ⁇ 2 plays an important role in NAFLD, 14-3-3 ⁇ and 14-3-3 ⁇ were overexpressed in hepatocytes to investigate how 14-3-3 ⁇ and 14-3-3 ⁇ affect fat accumulation.
  • 14-3-3 ⁇ and 14-3-3 ⁇ are proteins that play an important role in adipose metabolism as a regulator of PPAR ⁇ 2 and have been found to be used as target proteins for NAFLD treatment.
  • the present invention provides the use of 14-3-3 ⁇ and 14-3-3 ⁇ for the manufacture of a pharmaceutical composition for preventing or treating fatty liver.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating fatty liver comprising an inhibitor against the 14-3-3 ⁇ gene, the use of the inhibitor for the manufacture of a pharmaceutical for preventing or treating fatty liver, and administering the inhibitor to a subject. It provides a fatty liver prevention or treatment comprising.
  • 14-3-3 ⁇ used as a target for regulating the transcriptional activity of PPAR ⁇ 2 involved in fat metabolism means a 14-3-3 ⁇ gene or a 14-3-3 ⁇ protein.
  • inhibitors for 14-3-3 ⁇ are interpreted to include both inhibitors for 14-3-3 ⁇ gene and 14-3-3 ⁇ protein.
  • the 14-3-3 ⁇ protein, the 14-3-3 ⁇ gene, and the like are interpreted to include variants or fragments thereof having substantially the same activity as these.
  • the inhibitor for the 14-3-3 ⁇ gene may be an inhibitor that inhibits the expression of the gene to block binding to PPAR ⁇ 2 by inhibiting 14-3-3 ⁇ protein expression.
  • the 14-3-3 ⁇ gene may be DNA encoding it or mRNA transcribed therefrom.
  • the inhibitor for the gene may be an inhibitor that binds to the gene itself to interfere with transcription or binds to mRNA transcribed from the gene and interferes with the translation of the mRNA.
  • the inhibitor for the 14-3-3 ⁇ gene can be an antisense oligonucleotide, siRNA, shRNA, miRNA, or a vector comprising the 14-3-3 ⁇ gene.
  • antisense oligonucleotides, siRNAs, shRNAs, miRNAs or vectors comprising them can be prepared using methods known in the art.
  • the 'vector' refers to a gene construct comprising an external DNA inserted into the genome encoding the polypeptide.
  • a vector related to the present invention is a vector in which the nucleic acid sequence that inhibits the gene is inserted into the genome, and examples of the vector include a DNA vector, a plasmid vector, a cosmid vector, a bacteriophage vector, a yeast vector, or a viral vector.
  • the inhibitor for 14-3-3 ⁇ protein may be an inhibitor that binds to 14-3-3 ⁇ protein and blocks the binding of 14-3-3 ⁇ protein with PPAR ⁇ 2 .
  • such inhibitors may be peptides or compounds that bind to 14-3-3 ⁇ protein, and the like.
  • Such inhibitors may be selected through screening methods exemplified below, such as protein structure analysis, and may be designed using methods known in the art.
  • the inhibitor may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody against 14-3-3 ⁇ protein. Such polyclonal antibodies or monoclonal antibodies can be prepared using antibody production methods known in the art.
  • the 14-3-3 ⁇ gene or 14-3-3 ⁇ protein may be used as a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of non-alcoholic fatty liver. It can be used as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating nonalcoholic fatty liver, comprising the 14-3-3 ⁇ gene.
  • the gene included as an active ingredient of the pharmaceutical composition may be included in the pharmaceutical composition in the form of the gene itself or a vector containing the gene.
  • Definitions of vectors are as described above, and the types and preparation methods of these vectors are well known in the art.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating non-alcoholic fatty liver, comprising 14-3-3 ⁇ protein.
  • composition for preventing or treating non-alcoholic fatty liver of the present invention may include natural or recombinant 14-3-3 ⁇ , 14-3-3 ⁇ protein having physiological activities substantially equivalent thereto.
  • Proteins having substantially equivalent physiological activity include natural type / recombinant 14-3-3 ⁇ and functional equivalents thereof and functional derivatives.
  • the term “functional equivalent” refers to an amino acid sequence variant in which some or all of the amino acids of a native protein are substituted, or a portion of the amino acid is deleted or added, and has substantially the same physiological activity as the native type 14-3-3 ⁇ .
  • “Functional derivative” means a protein that has been modified to increase or decrease the physicochemical properties of the 14-3-3 ⁇ protein and has a physiological activity substantially equivalent to that of the native type 14-3-3 ⁇ .
  • Derivation of the 14-3-3 ⁇ protein of the present invention is not particularly limited, but may preferably be a protein derived from vertebrates, preferably humans, mice, rats and the like.
  • 14-3-3 ⁇ used in the present invention can be prepared from known sequences by genetic engineering methods known to those skilled in the art.
  • mammalian cells are used more than those of natural type in terms of protein activity or solubility in comparison with E. coli or insect cells. It is believed to be similar.
  • the recombinant 14-3-3 ⁇ protein can be separated using a conventional column chromatography method.
  • the degree of purification of the protein can be confirmed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE).
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared using pharmaceutically acceptable and physiologically acceptable additives in addition to the active ingredients, and the additives include excipients, disintegrants, sweeteners, binders, coatings, swelling agents, lubricants, lubricants Or solubilizers such as flavoring agents can be used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be preferably formulated into a pharmaceutical composition by containing one or more pharmaceutically acceptable carriers in addition to the active ingredient for administration.
  • Acceptable pharmaceutical carriers in compositions formulated in liquid solutions are sterile and physiologically compatible, including saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injectable solutions, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and One or more of these components may be mixed and used, and other conventional additives such as antioxidants, buffers and bacteriostatic agents may be added as necessary. Diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants may also be added in addition to formulate into injectable formulations, pills, capsules, granules or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like. Furthermore, the method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA can be formulated according to each disease or component according to the appropriate method in the art.
  • compositions of the present invention may be granules, powders, coated tablets, tablets, capsules, suppositories, syrups, juices, suspensions, emulsions, drops or injectable solutions and sustained release formulations of the active compounds, and the like. Can be.
  • compositions of the present invention may be administered in a conventional manner via the intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intraperitoneal, sternum, transdermal, nasal, inhalation, topical, rectal, oral, intraocular or intradermal routes.
  • An effective amount of the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention means an amount required to prevent or treat a disease or to achieve a bone growth inducing effect.
  • the type of disease, the severity of the disease, the type and amount of the active and other ingredients contained in the composition, the type of formulation and the age, weight, general health, sex and diet, sex and diet, time of administration, route of administration and composition of the patient It can be adjusted according to various factors including the rate of secretion, the duration of treatment, and the drug used concurrently.
  • the inhibitor of the present invention when administered once or several times a day, is administered once or several times a day, when the compound is 0.1ng / kg to 10g / kg, a polypeptide, In the case of protein or antibody, 0.1ng / kg ⁇ 10g / kg, antisense oligonucleotide, siRNA, shRNAi, miRNA can be administered at a dose of 0.01ng / kg ⁇ 10g / kg.
  • the 'object' includes, but is not limited to, humans, orangutans, chimpanzees, mice, rats, dogs, cattle, chickens, pigs, goats, sheep, and the like.
  • the present invention provides information on the likelihood of developing non-alcoholic fatty liver by measuring mRNA or protein levels of 14-3-3 ⁇ and / or 14-3-3 ⁇ genes from samples of suspected non-alcoholic fatty liver. It is about a method.
  • the present invention provides a non-alcoholic fatty liver diagnostic composition comprising a probe for measuring the mRNA or protein level of 14-3-3 ⁇ gene from a sample of suspected non-alcoholic fatty liver.
  • the present invention also provides a non-alcoholic fatty liver diagnostic composition comprising a probe for measuring the mRNA or protein level of 14-3-3 ⁇ gene from a sample of suspected non-alcoholic fatty liver.
  • the probe for measuring the mRNA level of the gene may be a nucleic acid probe or primer for the mRNA.
  • the nucleic acid probe refers to a linear oligomer of natural or modified monomers or linkages, which includes deoxyribonucleotides and ribonucleotides and which can hybridize specifically to the target nucleotide sequence, which are either naturally present or artificially synthesized. Say what has been done.
  • the probe according to the invention may be single chain, preferably oligodioxyribonucleotides. Probes of the invention may include natural dNMPs (ie, dAMP, dGMP, dCMP and dTMP), nucleotide analogues or derivatives. In addition, the probes of the present invention may also comprise ribonucleotides.
  • primer By primer is meant a single-stranded oligonucleotide capable of acting as a starting point for template-directed DNA synthesis under suitable temperatures and suitable buffers (ie four different nucleoside triphosphates and polymerases). . Suitable lengths of primers can vary depending on various factors, such as temperature and the use of the primer. In addition, the sequence of the primer need not have a sequence that is completely complementary to some sequences of the template, it is sufficient to have sufficient complementarity within the range that can hybridize with the template to perform the primer-specific action.
  • the primer in the present invention does not need to have a sequence that is perfectly complementary to the nucleotide sequence of the gene that is a template, and it is sufficient to have sufficient complementarity within a range capable of hybridizing to the gene sequence and acting as a primer.
  • the primer according to the present invention may be used for gene amplification reactions.
  • the amplification reaction refers to amplification of a nucleic acid molecule, and the amplification reactions of such genes are well known in the art, for example, polymerase chain reaction (PCR), reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR), Riga.
  • PCR polymerase chain reaction
  • RT-PCR reverse transcriptase polymerase chain reaction
  • Riga Riga.
  • TMA electron mediated amplification
  • NASBA nucleic acid sequence substrate amplification
  • the probe for measuring the protein level may be an antibody against the protein.
  • the antibody may use polyclonal antibody, monoclonal antibody, human antibody and humanized antibody, or fragments thereof.
  • antibody fragments include Fab, Fab ', F (ab') 2 and Fv fragments; Diabody; Linear antibodies; Single chain antibody molecules; And multispecific antibodies formed from antibody fragments and the like.
  • Fv is a minimal antibody fragment comprising a complete antigen recognition and binding site. This site consists of a dimer of one heavy chain and one light chain variable region and is tightly coupled non-covalently.
  • Polyclonal antibodies can be prepared by injecting the mammal with one or more immunizing agents, if necessary, with an adjuvant. Typically, the immunizing agent and / or adjuvant are injected into the mammal several times by subcutaneous injection or intraperitoneal injection.
  • the immunizing agent may be a protein of the invention or a fusion protein thereof. Injecting an immunizing agent with a protein known to be immunogenic in the mammal being immunized can be effective.
  • Monoclonal antibodies according to the invention can be prepared by the hybridoma method described in Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), or by recombinant DNA methods (e.g., U.S. Pat. No. 4,816,576). Reference). Monoclonal antibodies are also described, for example, in Clackson et al., Nature , 352: 624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol . Biol ., 222: 581-597 (1991). It can be isolated from phage antibody libraries using the techniques described.
  • Monoclonal antibodies in the present invention are specifically those in which a portion of the heavy and / or light chains is identical to the corresponding sequence of an antibody derived from a particular species or an antibody belonging to a particular antibody class or subclass, if it exerts the desired activity or Although homologous, the remainder of the chain (s) includes "chimeric" antibodies that are identical or homologous to antibodies from other species or antibodies belonging to different antibody classes or subclasses or fragments of such antibodies.
  • “Humanized” forms of non-human (eg murine) antibodies include chimeric immunoglobulins, immunoglobulin chains or fragments thereof, including minimal sequences derived from non-human immunoglobulins (eg, Fv, Fab, Fab ', F (ab') 2 or other antigen binding sequence of the antibody.
  • humanized antibodies are human immunoglobulins in which residues in the complementarity determining regions (CDRs) of the recipient are replaced with CDR residues of species other than the human (donor antibody) such as mouse, rat or rabbit having the desired specificity, affinity and ability. (Receptor antibody).
  • CDRs complementarity determining regions
  • donor antibody such as mouse, rat or rabbit having the desired specificity, affinity and ability.
  • Receptor antibody Receptor antibody
  • Fv framework residues of human immunoglobulins are replaced by corresponding non-human residues.
  • Humanized antibodies may also include residues that are not found in the recipient antibody or in the CDR or framework sequences to be introduced.
  • humanized antibodies comprise substantially all of one or more, generally two or more variable domains, wherein all or substantially all CDR regions correspond to regions of non-human immunoglobulins, and all or substantially all FR regions Corresponds to the region of human immunoglobulin sequence.
  • Humanized antibodies also include at least a portion of an immunoglobulin constant region (Fc), generally a portion of a human immunoglobulin region.
  • Fc immunoglobulin constant region
  • the non-alcoholic fatty liver diagnostic composition of the present invention may be included in the form of a kit.
  • the kit may comprise primers, probes or antibodies capable of measuring the expression level or amount of protein of the 14-3-3 ⁇ or 14-3-3 ⁇ gene, the definitions of which are as described above.
  • kits necessary for PCR amplification such as buffers, DNA polymerases (eg, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis or Thermally stable DNA polymerases obtained from Pyrococcus furiosus (Pfu), DNA polymerase cofactors and dNTPs, and when the kits are subjected to an immunoassay, the kits of the invention may optionally contain secondary antibodies and labels It may include a substrate. Furthermore, the kits according to the invention can be produced in a number of separate packaging or compartments comprising the reagent components described above.
  • DNA polymerases eg, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis or Thermally stable DNA polymerases obtained from Pyrococcus furiosus (Pfu)
  • non-alcoholic fatty liver diagnostic composition of the present invention may be included in the form of a microarray.
  • a primer, probe or antibody capable of measuring the expression level of the 14-3-3 ⁇ or 14-3-3 ⁇ protein or gene encoding the same is used as a hybridizable array element.
  • a substrate may include suitable rigid or semi-rigid supports, such as membranes, filters, chips, slides, wafers, fibers, magnetic beads or nonmagnetic beads, gels, tubing, plates, polymers, microparticles and capillaries.
  • the hybridization array element is arranged and immobilized on the substrate, and such immobilization can be performed by a chemical bonding method or a covalent binding method such as UV.
  • the hybridization array element can be bonded to a glass surface modified to include an epoxy compound or an aldehyde group, and can also be bonded by UV at the polylysine coating surface.
  • the hybridization array element can be coupled to the substrate via a linker (eg, ethylene glycol oligomer and diamine).
  • the sample applied to the microarray of the present invention is a nucleic acid
  • it can be hybridized with the array element on the microarray.
  • Hybridization conditions may vary, and detection and analysis of the degree of hybridization may vary depending on the labeling substance.
  • the present invention provides a method for providing information necessary for diagnosing non-alcoholic fatty liver through a method of measuring the expression level of the 14-3-3 ⁇ or 14-3-3 ⁇ gene or its expression protein level.
  • the method comprises the steps of: (a) measuring the expression level of the 14-3-3 ⁇ or 14-3-3 ⁇ gene or the amount of the expressed protein from a biological sample of a suspected nonalcoholic fatty liver; And (b) measuring the expression level of the gene or the amount of the expressed protein thereof from a normal control sample and comparing the result with the measurement result of step (a).
  • the method of measuring the expression level of the gene or the amount of protein in the above may be carried out including a known process for separating mRNA or protein from a biological sample using a known technique.
  • the biological sample refers to a sample taken from a living body in which the expression level of the gene or the protein level is different from a normal control group according to the generation or progression of non-alcoholic fatty liver, and the sample is not limited thereto. But may include tissue, cells, blood, serum, plasma, saliva, urine, and the like.
  • Determination of the expression level of the gene is preferably to measure the level of mRNA, the method for measuring the level of mRNA reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), real-time reverse transcription polymerase chain reaction, RNase protection assay, Northern Blots and DNA chips, etc., but is not limited thereto.
  • the protein level can be measured using an antibody, in which case the protein in the biological sample and the antibody specific thereto form a conjugate, i.e., an antigen-antibody complex, and the amount of antigen-antibody complex formed is a detection label. It can be measured quantitatively through the magnitude of the signal of the label).
  • the detection label may be selected from the group consisting of enzymes, fluorescent materials, ligands, luminescent materials, microparticles, redox molecules, and radioisotopes, but is not limited thereto.
  • Analytical methods for measuring protein levels include, but are not limited to, Western blot, ELISA, radioimmunoassay, radioimmunoassay, oukteroni immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, Complement fixation assays, FACS, protein chips, and the like.
  • the present invention can determine the amount of mRNA expression or protein in the control group and the amount of mRNA expression or protein in the suspected non-alcoholic fatty liver through the above-described detection methods, and the degree of expression compared with the control group. By doing so, it is possible to diagnose the onset and progression of non-alcoholic fatty liver.
  • the method for providing information for diagnosing non-alcoholic fatty liver according to the present invention is a non-alcohol when the expression level of the 14-3-3 ⁇ gene or the amount of the expressed protein thereof is increased compared to a normal control sample. It can be judged that sexual fatty liver is caused or is more likely to occur. Conversely, when the expression level of the gene of 14-3-3 ⁇ or the amount of the expressed protein is reduced compared to the normal control sample, it can be judged that the non-alcoholic fatty liver is caused or is more likely to develop.
  • the present invention also provides a method of contacting a cell comprising a gene or protein of 14-3-3 ⁇ or 14-3-3 ⁇ with a candidate outside the body,
  • It provides a method for screening a medicament for preventing or treating fatty liver, comprising measuring a change in the expression level of the gene or protein by the candidate.
  • the candidate substance when the candidate substance down-regulates the expression of 14-3-3 ⁇ gene or protein, it may be determined as a drug for preventing or treating fatty liver.
  • the candidate substance when the candidate substance upregulates the expression of 14-3-3 ⁇ gene or protein, it may be determined as a drug for preventing or treating fatty liver.
  • the present invention relates to 14-3-3 ⁇ protein and / or 14-3-3 ⁇ protein in PPAR ⁇ 2 Screening of a medicament for preventing or treating fatty liver, comprising contacting a candidate with a protein and measuring the change in binding of 14-3-3 ⁇ protein and / or 14-3-3 ⁇ protein to PPAR ⁇ 2 by the candidate material Provide a method.
  • the change in binding of 14-3-3 ⁇ protein and / or 14-3-3 ⁇ protein to PPAR ⁇ 2 by the candidate is determined by PPAR ⁇ 2 By measuring the change in binding of 14-3-3 ⁇ protein and / or 14-3-3 ⁇ protein to Ser273 residues of.
  • the candidate substance is a substance that promotes or inhibits transcription or translation of mRNA and protein from 14-3-3 ⁇ and / or 14-3-3 ⁇ gene sequences according to a conventional selection method, or 14-3-3 ⁇ and / or Individual nucleic acids, proteins, peptides, other extracts or natural products, compounds, or the like that are suspected of having the potential as a medicament to enhance or inhibit the function or activity of 14-3-3 ⁇ .
  • the expression level of the gene, the amount of the protein or the activity of the protein can be measured in the cells treated with the candidate, and as a result of the increase, the expression amount, the amount of the protein or the activity of the protein is increased or decreased.
  • the candidate substance may be determined as a substance capable of preventing or treating fatty liver.
  • the method of measuring the expression amount of the gene, the amount of the protein or the activity of the protein in the above may be carried out through a variety of methods known in the art, for example, but not limited to reverse transcriptase polymerase chain reaction (reverse transcriptase-polymerase chain reaction, real time-polymerase chain reaction, western blot, northern blot, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion And immunoprecipitation assays.
  • reverse transcriptase polymerase chain reaction reverse transcriptase-polymerase chain reaction
  • real time-polymerase chain reaction western blot
  • western blot western blot
  • northern blot enzyme linked immunosorbent assay
  • ELISA enzyme linked immunosorbent assay
  • RIA radioimmunoassay
  • radioimmunodiffusion And immunoprecipitation assays radioimmunodiffusion And immunoprecipitation assays
  • a pharmaceutical agent for preventing or treating fatty liver wherein the candidate substance exhibiting the activity of inhibiting / promoting 14-3-3 ⁇ and / or 14-3-3 ⁇ gene expression or inhibiting / promoting protein function obtained through the screening method of the present invention is It can be a candidate for.
  • Such candidate drugs for preventing or treating fatty liver act as leading compounds in the development of fatty liver treatment in the future, and the leading substances are expressed in 14-3-3 ⁇ and / or 14-3-3 ⁇ genes or therefrom.
  • a new fatty liver treatment can be developed.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • M199 Medium 199
  • FBS fetal bovine serum
  • penicillin streptomycin
  • Opti-MEM purchased from Invitrogen (Carlsbad, CA).
  • E-fection plus reagent is based on Lugen Sci. It was purchased from (Seoul, South Korea).
  • Luciferase assay systems are available from Promega Co. (Madison, WI, USA).
  • Pioglitazone and oleic acid were purchased from Sigma (St. Louis, MO, USA).
  • Triglyceride analysis system was purchased from Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, USA).
  • Transcriptional activity of PPAR ⁇ 2 plays an important role in the expression of liver disease related proteins. Therefore, by using the aP2 promoter regulated by PPAR ⁇ 2 was measured transcriptional activity of PPAR ⁇ 2, it was confirmed the role of the seven types of 14-3-3 protein.
  • HEK-293T cells were seeded in 12-well plates with 1 ⁇ 10 5 cells per well, followed by 0.5 ⁇ g of aP2 promoter construct and 14-3-3 isoforms ( ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ ). , ⁇ , ⁇ ) (0.5 ⁇ g) or si-14-3-3 ⁇ and si-14-3-3 ⁇ siRNA (5 nM and 10 nM, Santa Cruz) were transfected with E-fection plus reagent (Lugen) . The ratio of DNA and E-fection plus reagent was 1: 2 and the method was performed according to the manufacturer's manual.
  • pioglitazon (Pio, Santa Cruz) was treated for 24 hours, and the cells were washed with ice-cold PBS and the cells were washed with 80 ⁇ l per well with reporter Lysis buffer (Promega, Madison, WI). After dissolution, the supernatant was collected by centrifugation at 10,000 ° C. at 4 ° C. for 10 minutes and luciferase activity was measured. The instrument used Luminometer 20/20 n (Turner Biosystems, Sunnyvale, Calif.). PSV40- ⁇ -galactosidase was cotransfected together for normalization.
  • the collected supernatants were measured graphically by calibrating luciferase activity by measuring ⁇ -galactosidase activity.
  • the ⁇ -galactosidase enzyme assay system (Promega, Madison, Wis.) was used here and analyzed using a DU530 spectrophotometer (Beckman Instruments, Palo Alto, Calif.).
  • 14-3-3 ⁇ serves to suppress the transcriptional activity of the PPAR ⁇ 2, and is determined to be a gene controlled against each other.
  • GST-pull down assay was performed to determine whether 14-3-3 ⁇ and 14-3-3 ⁇ bind to PPAR ⁇ 2 .
  • pioglitazon (Pio, Santa Cruz) was treated for 24 hours, and the cells were washed with ice-cold PBS and lysed buffer (150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Nonidet P-40, 5%). lysine cells using 500 ⁇ l per well with glycerol, 25 mM tris-HCl, pH 7.5, and protease inhibitor), and centrifuged at 10,000 ⁇ g for 10 min at 4 ° C to extract 1000 ⁇ g of glutathione Sepharose 4B.
  • PPAR ⁇ 2 Proteins include activation function 1 (AF-1, amino acids 1-138), DNA-binding domain (DBD, amino acids 139-203), hinge region (amino acids 204-310), activation function 2 (AF-2, amino acids 311-505 ) Domains (FIG. 3A). Therefore, GST-pull down assay was performed to check whether 14-3-3 ⁇ and 14-3-3 ⁇ bind to any domain of PPAR ⁇ 2 .
  • HEK-293T cells were seeded in 100 mm plates at 2 ⁇ 10 6 cells per well and then Flag-PPAR ⁇ 2 (1-505) DNA (4 ⁇ g), Flag-PPAR ⁇ 2 (1-310) DNA (4 ⁇ g), Flag-PPAR ⁇ 2 (139-505) DNA (4 ⁇ g) and mGST-14-3-3 ⁇ (4 ⁇ g) or mGST-14-3-3 ⁇ (4 ⁇ g) were transfected with E-fection plus reagent (Lugen) .
  • Flag-PPAR ⁇ 2 (1-310) DNA, Flag-PPAR ⁇ 2 (139-505) DNA was cloned into the pCMV-3Tag-1 vector using XhoI and ApaI restriction enzyme DNA fragments amplified by polymerase chain reaction (PCR).
  • the ratio of DNA and E-fection plus reagent was 1: 2 and the method was performed according to the manufacturer's manual. Wash the cells with ice-cold PBS and add 500 ⁇ l per well with Lysis buffer (150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Nonidet P-40, 5% glycerol, 25 mM tris-HCl, pH 7.5, with protease inhibitor). After lysing the cells, centrifuged at 10,000 x g for 10 minutes at 4 ° C, and extracting the protein, reacting 1000 ⁇ g protein with 20 ⁇ l of glutathione Sepharose 4B beads (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) for 6 hours.
  • Lysis buffer 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Nonidet P-40, 5% glycerol, 25 mM tris-HCl, pH 7.5, with protease inhibitor. After lysing the cells, centrifuged at 10,000 x g
  • 14-3-3 proteins are known to bind to phosphorylated residues of target proteins.
  • Phosphorylated residues involved in the activity of PPAR ⁇ 2 are known as serine 112 and serine 273.
  • PPAR ⁇ 2 which does not phosphorylate Serine 112 and Serine 273 residues Mutants (PPAR ⁇ 2 S112A and S273A) were prepared and their binding to 14-3-3 protein was confirmed by GST-pull down assay.
  • HEK-293T cells were seeded in 100 mm plates at 2 ⁇ 10 6 cells per well and then Flag-PPAR ⁇ 2 (WT) DNA (4 ⁇ g), Flag-PPAR ⁇ 2 (S112A) DNA (4 ⁇ g), Flag-PPAR ⁇ 2 (S273A) DNA (4 ⁇ g) and mGST-14-3-3 ⁇ (4 ⁇ g) or mGST-14-3-3 ⁇ (4 ⁇ g) were transfected with E-fection plus reagent (Lugen).
  • Flag-PPAR ⁇ 2 (S112A) DNA, Flag-PPAR ⁇ 2 (S273A) DNA was cloned into a flag-tagged vector DNA fragment amplified by polymerase chain reaction (PCR).
  • the ratio of DNA and E-fection plus reagent was 1: 2 and the method was performed according to the manufacturer's manual. Wash the cells with ice-cold PBS and 500 ⁇ l per well with Lysis buffer (150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Nonidet P-40, 5% glycerol, 25 mM tris-HCl, pH 7.5, with protease inhibitor) After lysing the cells, centrifuged at 10,000 x g for 10 minutes at 4 ° C, and extracting the protein, reacting 1000 ⁇ g protein with 20 ⁇ l of glutathione Sepharose 4B beads (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) for 6 hours.
  • Lysis buffer 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Nonidet P-40, 5% glycerol, 25 mM tris-HCl, pH 7.5, with protease inhibitor
  • HEK-293T cells were seeded in 12-well plates with 1 ⁇ 10 5 cells per well, followed by aP2 promoter construct (0.5 ⁇ g) and Flag-PPAR ⁇ 2.
  • S112A DNA (0.5 ⁇ g) or Flag-PPAR ⁇ 2 (S273A) DNA (0.5 ⁇ g) and mGST-14-3-3 ⁇ DNA (0.5 ⁇ g) or mGST-14-3-3 ⁇ DNA (0.5 ⁇ g) were transfected with E-fection plus reagent (Lugen). .
  • the ratio of DNA and E-fection plus reagent was 1: 2 and the method was performed according to the manufacturer's manual.
  • HEK-293T cells were seeded in 100 mm plates with 2 ⁇ 10 6 cells per well, followed by mGST-PPAR ⁇ 2 DNA (4 ⁇ g) and GFP-14-3-3 ⁇ DNA (4 ⁇ g) or GFP-14-3-3 ⁇ DNA (4 ⁇ g) and HA-14-3-3 ⁇ DNA (2 and 4 ⁇ g) or HA-14-3-3 ⁇ DNA (2 and 4 ⁇ g) were transfected with E-fection plus reagent (Lugen) .
  • E-fection plus reagent Ligen
  • pioglitazon (Pio, Santa Cruz) was treated for 24 hours, and the cells were washed with ice-cold PBS and lysed buffer (150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Nonidet P-40, 5%).
  • PPAR ⁇ 2 It is known that the expression and activity of PPAR ⁇ 2 are increased in the liver of obese mice, and that the expression of the target gene is increased.
  • In vitro experiments were carried out to determine the mRNA expression levels of PPAR ⁇ 2 and 14-3-3 ⁇ and 14-3-3 ⁇ by treating oleic acid (OA), a type of fatty acid, to create such an obese environment.
  • OA oleic acid
  • HepG2 and primary rat hepatocytes were seeded 4 ⁇ 10 5 cells per well in 6-well plates and treated with 200 ⁇ M of oleic acid (OA) for 72 hours.
  • OA oleic acid
  • cells were lysed using Trizol (Invitrogen) using 1 ml per well, 200 ⁇ l of chloroform was added, mixed well, and left at room temperature for 5 minutes, followed by centrifugation at 12,000 ⁇ g for 15 minutes at 4 °C. After separation, the supernatant was mixed with 500 ⁇ l of isopropanol, and placed on ice for 10 minutes, and then centrifuged at 12,000 ⁇ g for 15 minutes at 4 ° C.
  • PCR polymerase chain reaction
  • MRNA expression of PPAR ⁇ 2 was increased depending on oleic acid concentration. However, there was no change in mRNA expression levels of 14-3-3 ⁇ and 14-3-3 ⁇ (Figs. 6A and B). In addition, mRNA expression of fat metabolism-related genes, which are PPAR ⁇ 2 target genes, increased in oleic acid concentration (FIGS. 6C and D). Oleic acid and PPAR ⁇ 2 It increased the expression of PPAR ⁇ 2 target genes and had no effect on 14-3-3 ⁇ and 14-3-3 ⁇ expression. From these results, it was judged that the regulation of transcriptional activity by the binding of 14-3-3 ⁇ and 14-3-3 ⁇ to the phosphorylation residue of activated PPAR ⁇ 2 was more important than the expression of 14-3-3 ⁇ and 14-3-3 ⁇ .
  • HepG2 cells were seeded in 6-well plates with 4 ⁇ 10 5 cells per well, followed by GFP-14-3-3 ⁇ DNA (4 ⁇ g) or GFP-14-3-3 ⁇ DNA (4 ⁇ g). (Lugen) was used to transfect. The ratio of DNA and E-fection plus reagent was 1: 2 and the method was performed according to the manufacturer's manual. After transfection, 200 ⁇ M of oleic acid (OA) was treated for 72 hours, and mRNA extraction was performed by lysing the cells using Trizol (Invitrogen) using 1 ml per well and adding 200 ⁇ l of chloroform.
  • OA oleic acid
  • chromatin immunoprecipitation was performed by seeding 4 ⁇ 10 6 cells per well into 100 mm plates of HepG2 cells, followed by Flag-PPAR ⁇ 2 DNA (4 ⁇ g) and mGST-14-3-3 ⁇ DNA ( 4 ⁇ g) or mGST-14-3-3 ⁇ DNA (4 ⁇ g) and si-14-3-3 ⁇ (20 ⁇ M, Santa Cruz) or si-14-3-3 ⁇ (20 ⁇ M, Santa Cruz) with E-fection plus reagent (Lugen) was used to transfect. The ratio of DNA and E-fection plus reagent was 1: 2 and the method was performed according to the manufacturer's manual.
  • the cells were treated with 0.75% formaldehyde at room temperature for 15 minutes, then glycine was added and the cells were scraped in ice-cold PBS and centrifuged at 1,000 ⁇ g for 3 minutes at 4 ° C. to remove the supernatant.
  • Pellets were dissolved in 400 ⁇ l of FA lysis buffer (50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA pH8.0, 1% Triton-X100, 0.1% NaDeoxycholate), and then pulsated using an ultrasonic sonicator for 30 seconds. Crushing-Repeated crushing twice for 10 minutes with a resting condition of 30 seconds.
  • DNA-protein complexes were immunoprecipitated using anti-Flag antibodies (Santa Cruz) and then amplified by polymerase chain reaction (PCR) using FAT / CD36 promoter specific primers.
  • HepG2 cells were seeded in 6-well plates with 5 ⁇ 10 5 cells per well, followed by E-fection with HA-14-3-3 ⁇ DNA (1 ⁇ g) or HA-14-3-3 ⁇ DNA (1 ⁇ g). Transfection was performed using plus reagent (Lugen). The ratio of DNA and E-fection plus reagent was 1: 2 and the method was performed according to the manufacturer's manual.
  • OA oleic acid
  • lysis buffer 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Nonidet P-40, 5% glycerol
  • Cells were lysed using 80 ⁇ l per well with 25 mM tris-HCl, pH 7.5, and protease inhibitor), followed by centrifugation at 10,000 ⁇ g for 10 minutes at 4 ° C. to extract 30 ⁇ g of protein 10% SDS-PAGE.
  • the gels were separated and the proteins were identified using antibodies of HA (SREBP-1c: Santa Cruz) by Western blot, and all antibodies were used at a 1: 3000 ratio.
  • SREBP-1c sterol regulatory element binding protein-1c
  • FAT Fatty acid translocase
  • HEK-293T cells were seeded in 100 mm plates at 2 ⁇ 10 6 cells per well, followed by mGST-PPAR ⁇ 2 DNA (4 ⁇ g) and HA-14-3-3 ⁇ DNA (4 ⁇ g) or HA-14-3-3 ⁇ DNA. (4 ⁇ g) was transfected with E-fection plus reagent (Lugen). The ratio of DNA and E-fection plus reagent was 1: 2 and the method was performed according to the manufacturer's manual.
  • OA oleic acid
  • lysis buffer 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Nonidet P-40, 5% glycerol
  • the protein was extracted by centrifugation at 10,000 ⁇ g for 10 minutes at 4 ° C., and 1000 ⁇ g of protein was extracted with glutathione Sepharose 4B beads ( GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)
  • glutathione Sepharose 4B beads ( GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)
  • Proteins were identified using antibodies of each (GST, HA: Santa Cruz) by Western blot, and all antibodies were used at a
  • PPAR-RXR complex is known to play an important role in metabolic regulation and metabolic gene expression. Therefore, it was confirmed that overexpression of 14-3-3 ⁇ and 14-3-3 ⁇ affected the formation of PPAR and RXR, and did not affect the formation of PPAR ⁇ 2 -RXR ⁇ complex (FIG. 8C). That is, PPAR ⁇ 2 , whose activity was increased by oleic acid, increased binding to 14-3-3 ⁇ , decreased binding to 14-3-3 ⁇ , and was not involved in complex formation of PPAR ⁇ 2 and RXR ⁇ .
  • HepG2 cells and primary rat hepatocytes were seeded in 6-well plates with 4 ⁇ 10 5 cells per well, followed by GFP-14-3-3 ⁇ DNA (1 ⁇ g) or GFP-14-3-3 ⁇ DNA (1 ⁇ g) and si -14-3-3 ⁇ (10 ⁇ , Santa Cruz) or si-14-3-3 ⁇ (10 ⁇ , Santa Cruz) were transfected using E-fection plus reagent (Lugen).
  • E-fection plus reagent Ligen
  • OA oleic acid
  • Triglyceride is a form of fatty acid that is used as an indicator of fat mass. Triglycerides are measured and biochemical lipid tests are performed.
  • HepG2 cells and primary rat hepatocytes were seeded in 6-well plates with 4 ⁇ 10 5 cells per well, followed by GFP-14-3-3 ⁇ DNA (1 ⁇ g) or GFP-14-3-3 ⁇ DNA (1 ⁇ g) and si -14-3-3 ⁇ (10 ⁇ , Santa Cruz) or si-14-3-3 ⁇ (10 ⁇ , Santa Cruz) were transfected using E-fection plus reagent (Lugen). The ratio of DNA and E-fection plus reagent was 1: 2 and the method was performed according to the manufacturer's manual. After transfection, 200 ⁇ M of oleic acid (OA) was treated for 72 hours and the amount of triglyceride was measured using a triglyceride colorimetric assay kit (Cayman Chemical).
  • OA oleic acid
  • 14-3-3 ⁇ expression inhibition reduced triglyceride accumulation and 14-3-3 ⁇ expression inhibition increased accumulation (FIG. 10B).
  • 14-3-3 ⁇ and 14-3-3 ⁇ are different from each other and coupled to a moiety such as a PPAR ⁇ 2 modulates the activity of PPAR ⁇ 2, and the control is found to be competitively with each other.
  • the basal metabolism is maintained in balance in the PPAR ⁇ 2 residues S273 and the sum 14-3-3 ⁇ 14-3-3 ⁇ resolution and number of the fatty acid conditions 14-3-3 ⁇ binding to PPAR ⁇ 2 S273 residues increase Fat accumulation is expected to increase and thus develop into non-alcoholic fatty liver. Therefore, PPAR ⁇ 2 is regulated through the regulation of 14-3-3 ⁇ and 14-3-3 ⁇ expression. It is expected that by modulating the activity, nonalcoholic fatty liver can be prevented or treated.

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Abstract

본 발명은 비알콜성 지방간 조절인자 14-3-3 단백질에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 14-3-3의 두 동형 단백질인 14-3-3β와 14-3-3γ가 서로 다른 조절 인자로서 PPARγ2의 전사활성을 조절한다. 14-3-3β는 PPARγ2와 결합하여 PPARγ2의 전사활성을 증가시키는 반면, 14-3-3γ는 PPARγ2의 전사활성을 감소시키는 역할을 한다. 따라서, 14-3-3β와 14-3-3γ는 PPARγ2의 조절 인자로 지방 대사 과정에서 중요한 역할을 하는 단백질로서, 지방간 예방 또는 치료를 위한 표적으로 이용될 수 있다.

Description

비알콜성 지방간 조절인자 14-3-3 단백질
본 발명은 비알콜성 지방간 조절인자 14-3-3 단백질에 관한 것이다.
비알콜성 지방간 (Non-Alcoholic Fatty Liver Disease: NAFLD)은 대표적인 간 질환으로 간의 염증과 손상을 유발한다. 비알콜성 지방간이 악화되면 비알콜성 지방간염 (Non-Alcoholic Steatohepatitis: NAS)으로 발전하고 그 증상으론 경변증과 섬유증이 나타난다. 최근 보고에 따르면 지방간 환자의 간에서 peroxisome proliferator activated receptor (PPAR)γ2 라는 전사인자가 과발현 및 활성화 되어 있다고 알려졌다. 또한, PPARγ2의 활성화에 따라 간의 지질대사에 관여하는 다양한 타겟 단백질의 발현이 유도된다. 이러한 전사인자의 활성에 관여하는 14-3-3이라는 단백질은 7가지의 동형 단백질 (α/β, ε, η, γ, τ/θ, δ/ζ, 및 σ)로서 존재한다. 14-3-3의 단백질들은 전사인자의 인산화 부분에 결합하여 전사인사의 활성을 조절한다고 알려져 있으며, 대사관련 전사인자의 조절에도 관여한다. 이에 본 발명자들은 지방간 발병 및 조절에 있어서 14-3-3 단백질들의 역할을 조사한 결과, 14-3-3β와 14-3-3γ는 PPARγ2의 조절 인자로 지방 대사 과정에서 중요한 역할을 하는 단백질들이며, 비알콜성 지방간 치료를 위한 표적으로 이용될 수 있음을 규명하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 비알콜성 지방간 예방 또는 치료용 의약의 개발을 위한 14-3-3β 및 14-3-3γ의 용도를 제공하고자 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 14-3-3β 유전자에 대한 저해제를 포함하며, 상기 저해제는 14-3-3β 유전자에 대한 안티센스올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA, 또는 이를 포함하는 벡터인 비알콜성 지방간 예방 또는 치료용 의약 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 14-3-3γ 유전자 또는 14-3-3γ 단백질을 포함하는 비알콜성 지방간 예방 또는 치료용 의약 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 지방간 의심환자의 시료로부터 14-3-3β 및/또는 14-3-3γ 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하기 위한 프로브를 포함하는 비알콜성 지방간 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 14-3-3β 또는 14-3-3γ 유전자 또는 단백질을 포함하는 세포를 후보물질과 인체 외에서 접촉시키고, 상기 후보물질에 의한 상기 유전자 또는 단백질의 발현량 변화를 측정하는 것을 포함하는 비알콜성 지방간 예방 또는 치료용 의약의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 14-3-3β 단백질 및/또는 14-3-3γ 단백질을 PPARγ2 단백질과 함께 후보물질과 접촉시키고, 상기 후보물질에 의한 PPARγ2에 대한 14-3-3β 단백질 및/또는 14-3-3γ 단백질의 결합 변화를 측정하는 것을 포함하는 비알콜성 지방간 예방 또는 치료용 의약의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 14-3-3의 두 동형 단백질인 14-3-3β와 14-3-3γ가 서로 다른 조절 인자로서 PPARγ2의 전사활성을 조절한다. 14-3-3β는 PPARγ2와 결합하여 PPARγ2의 전사활성을 증가시키는 반면, 14-3-3γ는 PPARγ2의 전사활성을 감소시키는 역할을 한다. 따라서, 14-3-3β와 14-3-3γ는 PPARγ2의 조절 인자로 지방 대사 과정에서 중요한 역할을 하는 단백질로서, 비알콜성 지방간 예방 또는 치료를 위한 표적으로 이용될 수 있다.
도 1A는 14-3-3 동형 단백질의 과발현에 따른 PPARγ2의 전사활성을 확인한 결과이다.
도 1B는 14-3-3β 발현량 변화에 따른 PPARγ2의 전사활성을 확인한 결과이다.
도 1C는 14-3-3γ 발현량 변화에 따른 PPARγ2의 전사활성을 확인한 결과이다.
도 1D는 14-3-3β 발현 억제에 따른 PPARγ2의 전사활성을 확인한 결과이다.
도 1E는 14-3-3γ 발현 억제에 따른 PPARγ2의 전사활성을 확인한 결과이다.
도 2는 PPARγ2 리간드인 pioglitazone 처리에 따른 PPARγ2와의 결합력을 확인한 것으로서, 도 2의 A는 PPARγ2와 14-3-3β간 결합력을 확인한 결과; 도 2의 B는 PPARγ2와 14-3-3γ간 결합력을 확인한 결과이다.
도 3A는 PPARγ2의 도메인 위치 및 결실돌연변이를 확인한 결과이다.
도 3B는 GST-pull down assay를 이용하여 PPARγ2의 결실돌연변이와 14-3-3β간 결합을 확인한 결과이다.
도 3C는 GST-pull down assay를 이용하여 PPARγ2의 결실돌연변이와 14-3-3 γ간 결합을 확인한 결과이다.
도 4A는 PPARγ2의 S112A와 S273A 돌연변이와 14-3-3β간 결합을 확인한 결과이다.
도 4B는 PPARγ2의 S112A와 S273A 돌연변이와 14-3-3γ간 결합을 확인한 결과이다.
도 4C는 PPARγ2의 S273A 돌연변이와 14-3-3β간 결합에 따른 PPARγ2 의 전사활성을 확인한 결과이다.
도 4D는 PPARγ2의 S273A 돌연변이와 14-3-3γ간 결합에 따른 PPARγ2 의 전사활성을 확인한 결과이다.
도 5는 14-3-3γ 또는 14-3-3β의 과발현에 따른 PPARγ2와의 결합을 확인한 것으로서, 도 5의 A는 14-3-3γ의 과발현에 따른 14-3-3β와 PPARγ2간 결합을 확인한 결과; 도 5의 B는 14-3-3β의 과발현에 따른 14-3-3γ와 PPARγ2간 결합을 확인한 결과이다.
도 6A는 올레산 처리에 따른 HepG2 세포에서의 PPARγ2, 14-3-3β, 및 14-3-3γ 의 발현을 확인한 결과이다.
도 6B는 올레산 처리에 따른 일차 쥐 간세포 (primary mouse hepatocytes)에서의 PPARγ2, 14-3-3β, 및 14-3-3γ 의 발현을 확인한 결과이다.
도 6C는 올레산 처리에 따른 HepG2 세포에서의 타겟 유전자 발현을 확인한 결과이다.
도 6D는 올레산 처리에 따른 일차 쥐 간세포에서의 타겟 유전자 발현을 확인한 결과이다.
도 7A는 HepG2 세포에서, 14-3-3β와 14-3-3γ의 발현에 따른 타겟 유전자의 발현을 확인한 결과이다.
도 7B는 일차 쥐 간세포에서, 14-3-3β와 14-3-3γ의 발현에 따른 타겟 유전자의 발현을 확인한 결과이다.
도 7C는 크로마틴 면역침강법 (ChIP assay)을 이용하여 14-3-3β와 14-3-3γ 발현에 따른 FAT/CD36 promoter와의 결합을 확인한 결과이다.
도 7D는 14-3-3β와 14-3-3γ의 발현에 따른 14-3-3β와 14-3-3γ 발현에 따른 SREBP-1c 단백질의 발현을 확인한 결과이다.
도 8은 올레산 처리에 따른 PPARγ2와의 결합 및 14-3-3β와 14-3-3γ의 과발현에 따른 PAR-RXR 복합체 형성 여부를 확인한 것으로서, 도 8의 A는 올레산 처리에 따른 PPARγ2와 14-3-3β간 결합을 확인한 결과; 도 8의 B는 올레산 처리에 따른 PPARγ2와 14-3-3γ간 결합을 확인한 결과; 도 8의 C는 14-3-3β와 14-3-3γ의 과발현에 따른 PPAR-RXR 복합체 형성 여부를 확인한 결과이다.
도 9는 일차 쥐 간세포와 HepG2 세포에서, 올레산 처리, 14-3-3β와 14-3-3γ의 과발현 또는 발현 억제에 따른 지방 축적 변화를 확인한 것으로서, 도 9의 A는 올레산 처리에 따른 지방 축적 변화를 확인한 결과; 도 9의 B는 14-3-3β와 14-3-3γ의 과발현에 따른 지방 축적 변화를 확인한 결과; 도 9의 C는 14-3-3β와 14-3-3γ의 발현 억제에 따른 지방 축적 변화를 확인한 결과이다.
도 10은 일차 쥐 간세포와 HepG2 세포에서, 14-3-3β와 14-3-3γ의 과발현 또는 발현 억제에 따른 트리글리세리드 축적 변화를 확인한 것으로서, 도 10의 A는 14-3-3β와 14-3-3γ의 과발현에 따른 트리글리세리드 축적 변화를 확인한 결과; 도 10의 B는 14-3-3β와 14-3-3γ의 발현 억제에 따른 트리글리세리드 축적 변화를 확인한 결과이다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명자들은 14-3-3의 두 동형 단백질인 14-3-3β와 14-3-3γ가 서로 다른 조절 인자로서 PPARγ2의 전사활성을 조절하는 것을 발견하였다. 14-3-3β는 PPARγ2와 결합하여 PPARγ2의 전사활성을 증가시키는 반면, 14-3-3γ는 PPARγ2의 전사활성을 감소시키는 역할을 하였다. PPARγ2가 NAFLD에서 중요한 역할을 하기 때문에 14-3-3β와 14-3-3γ가 지방 축적에 어떠한 영향을 주는지 조사하기 위하여 14-3-3β와 14-3-3γ를 간세포에 과발현시켰다. 그 결과, 14-3-3β가 과발현 되었을 때는 지방 대사에 관여하는 PPARγ2의 표적 유전자들의 발현이 증가하고 지방 축적을 강화시켰으나, 14-3-3γ가 과발현 되었을 때는 PPARγ2의 표적 유전자들의 발현과 지방 축적이 억제되었다. 즉, 14-3-3β와 14-3-3γ는 PPARγ2의 조절 인자로 지방 대사 과정에서 중요한 역할을 하는 단백질들이며, NAFLD 치료를 위한 표적단백질로 이용될 수 있음을 규명하였다.
이에 본 발명은 지방간 예방 또는 치료용 의약 조성물의 제조를 위한 14-3-3β 와 14-3-3γ의 용도를 제공한다.
보다 구체적으로, 본 발명은 14-3-3β 유전자에 대한 저해제를 포함하는 지방간 예방 또는 치료용 의약 조성물, 지방간 예방 또는 치료용 의약의 제조를 위한 상기 저해제의 용도, 상기 저해제를 대상체에 투여하는 것을 포함하는 지방간 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 지방 대사에 관여하는 PPARγ2의 전사활성을 조절하는 타겟으로 이용되는 14-3-3β는 14-3-3β 유전자를 의미하거나 14-3-3β 단백질을 의미하는 것으로 해석된다. 따라서 14-3-3β 에 대한 저해제는 14-3-3β 유전자 및 14-3-3β 단백질에 대한 저해제를 모두 포함하는 것으로 해석된다.
상기 14-3-3β 단백질, 상기 14-3-3β 유전자 등에는 이들과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 이들의 변이체 또는 단편이 포함되는 것으로 해석된다.
한 구체예에서, 14-3-3β 유전자에 대한 저해제는 상기 유전자의 발현을 저해하여 14-3-3β 단백질 발현 저해에 의한 PPARγ2과의 결합을 차단하는 저해제 일 수 있다. 14-3-3β 유전자는 이를 코딩하는 DNA 또는 이로부터 전사되는 mRNA 일 수 있다. 따라서, 상기 유전자에 대한 저해제는 유전자 자체에 결합하여 전사를 방해하거나 유전자로부터 전사된 mRNA에 결합하여 mRNA의 해독을 방해하는 저해제일 수 있다.
한 구체예에서, 14-3-3β 유전자에 대한 저해제는 14-3-3β 유전자에 대한 안티센스올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA, 또는 이를 포함하는 벡터일 수 있다. 이러한 안티센스올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA 또는 이들을 포함하는 벡터는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제작할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 '벡터'는 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈 내로 삽입된 외부 DNA를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 본 발명과 관련된 벡터는 상기 유전자를 저해하는 핵산 서열이 게놈 내로 삽입된 벡터로서, 이들 벡터는 DNA 벡터, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터, 효모 벡터, 또는 바이러스 벡터를 예로 들 수 있다.
한 구체예에서, 14-3-3β 단백질에 대한 저해제는 14-3-3β 단백질과 결합하여 14-3-3β 단백질과 PPARγ2과의 결합을 차단하는 저해제일 수 있다. 예컨대, 이러한 저해제는 14-3-3β 단백질과 결합하는 펩타이드 또는 화합물 등일 수 있다. 이러한 저해제는 단백질 구조 분석 등의 하기 예시된 스크리닝 방법을 통해 선정될 수 있으며, 당업계에 공지된 방법을 이용하여 설계될 수 있을 것이다. 한 구체예에서, 상기 저해제는 14-3-3β 단백질에 대한 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 이러한 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체는 당업계에 공지된 항체 제작 방법을 이용하여 제작할 수 있다.
14-3-3γ가 과발현되면 PPARγ2의 표적 유전자들의 발현과 지방 축적이 억제되므로 14-3-3γ 유전자 또는 14-3-3γ 단백질은 그 자체로도 비알콜성 지방간 예방 또는 치료용 의약 조성물의 유효성분으로서 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명은 14-3-3γ 유전자를 포함하는 비알콜성 지방간 예방 또는 치료용 의약 조성물을 제공한다.
의약 조성물의 유효성분으로서 포함되는 유전자는 유전자 자체 또는 해당 유전자를 포함하는 벡터의 형태로 의약 조성물 내에 포함될 수 있다. 벡터에 대한 정의는 앞서 설명한 바와 같으며, 이들 벡터의 유형과 제조방법은 당업계에 매우 잘 알려져 있다.
본 발명은 또한 14-3-3γ 단백질을 포함하는 비알콜성 지방간 예방 또는 치료용 의약 조성물을 제공한다.
본 발명의 비알콜성 지방간의 예방 또는 치료용 조성물은 천연형 또는 재조합 14-3-3γ, 이들과 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 14-3-3γ 단백질을 포함할 수 있다. 상기 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 단백질에는 천연형/재조합 14-3-3γ 과 그 기능적 동등물 (functional equivalent) 및 기능적 유도체 (functional derivative)가 포함된다.
상기 "기능적 동등물"에는 천연형 단백질의 아미노산 중 일부 또는 전부가 치환되거나, 아미노산의 일부가 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체로서 천연형 14-3-3γ 와 실질적으로 동등한 생리활성을 갖는 것을 말한다.
"기능적 유도체"는 상기 14-3-3γ 단백질의 물리 화학적 성질을 증가 또는 감소시키기 위한 변형을 가한 단백질로서 천연형 14-3-3γ 와 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 것을 의미한다.
본 발명의 14-3-3γ 단백질의 유래는 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 척추동물, 바람직하게는 인간, 생쥐, 랫트 등으로부터 기원하는 단백질일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 본 발명에 사용된 14-3-3γ은 공지의 서열로부터 당업자에 공지된 유전공학적 방법으로 제조할 수 있다.
천연형의 14-3-3γ를 유전자 재조합 방법에 의하여 단백질을 제조하는 경우 대장균 (E. coli)이나 곤충 세포를 이용하는 것보다 포유동물 세포를 이용하는 경우가 단백질의 활성도나 용해성 측면에서 천연형의 것과 유사할 것으로 여겨진다.
상기 재조합 14-3-3γ 단백질은 통상의 컬럼 크로마토그라피 방법 등을 이용하여 분리할 수 있다. 또한 단백질의 정제 정도는 소듐 도데실 술페이트-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동 (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE))등으로 확인할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 첨가제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 첨가제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은 투여를 위해서 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 의약 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 예방 또는 치료, 또는 뼈 성장 유도 효과를 이루는데 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 예컨대, 성인의 경우, 1일 1회 내지 수회 투여시, 본 발명의 저해제는 1일 1회 내지 수회 투여시, 화합물일 경우 0.1ng/kg~10g/kg, 폴리펩타이드, 단백질 또는 항체일 경우 0.1ng/kg~10g/kg, 안티센스올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNAi, miRNA일 경우 0.01ng/kg~10g/kg의 용량으로 투여할 수 있다.
본 발명에 있어서, '대상체'는 인간, 오랑우탄, 침팬지, 마우스, 랫트, 개, 소, 닭, 돼지, 염소, 양 등을 포함하나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 비알콜성 지방간 의심환자의 시료로부터 14-3-3β 및/또는 14-3-3γ 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정함으로써 비알콜성 지방간의 발병 가능성에 대한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 비알콜성 지방간 의심환자의 시료로부터 14-3-3β 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하기 위한 프로브를 포함하는 비알콜성 지방간 진단용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 비알콜성 지방간 의심환자의 시료로부터 14-3-3γ 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하기 위한 프로브를 포함하는 비알콜성 지방간 진단용 조성물을 제공한다.
일 구체예에서, 상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하기 위한 프로브는 상기 mRNA에 대한 핵산 프로브 또는 프라이머일 수 있다.
상기 핵산 프로브는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄 (linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타켓 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것을 말한다. 본 발명에 따른 프로브는 단일쇄일 수 있으며, 바람직하게는 올리고디옥시리보뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 프로브는 자연 dNMP (즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O- 알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.
상기 프라이머는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건 (즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다. 또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머는 유전자 증폭 반응에 이용될 수 있는 것이 좋다. 상기 증폭 반응은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 말하며, 이러한 유전자의 증폭 반응들에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있고, 예컨대, 중합효소 연쇄반응 (PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응 (RT-PCR), 리가아제 연쇄반응 (LCR), 전자 중재 증폭 (TMA), 핵산 염기서열 기판 증폭 (NASBA) 등이 포함될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 단백질 수준을 측정하기 위한 프로브는 상기 단백질에 대한 항체일 수 있다.
항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인간항체 및 인간화 항체, 또는 이들의 단편을 사용할 수 있다.
상기 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디 (diabody); 선형 항체; 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체 등이 포함된다.
항체를 파파인 (papain)으로 분해하면 2개의 동일한 항원 결합 단편, 즉 단일 항원 결합 부위가 있는 각 "Fab" 단편, 및 그 나머지인 "Fc" 단편이 생성된다. 펩신을 처리하면, 2개의 항원 결합 부위가 있으며 여전히 항원에 교차결합할 수 있는 F(ab') 단편이 생성된다. Fv는 완전한 항원인식 및 결합 부위를 포함하는 최소한의 항체 단편이다. 이 부위는 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 영역의 이합체로 구성되며 비공유결합으로 단단히 결합되어 있다.
폴리클로날 항체의 제조방법은 당업자에게 공지되어 있다. 폴리클로날 항체는 포유동물에 1회 이상 면역화제를 주입, 필요한 경우 면역보강제와 함께 주입하여 제조할 수 있다. 통상, 면역화제 및 (또는) 면역보강제는 포유동물에 피하주사 또는 복강내 주사로 수 회 주입된다. 면역화제는 본 발명의 단백질 또는 이의 융합 단백질일 수 있다. 면역화되는 포유동물에 면역원성이 있는 것으로 공지된 단백질과 함께 면역화제를 주사하는 것이 효과적일 수 있다.
본 발명에 따른 모노클로날 항체는 문헌 (Kohler et al.,Nature, 256:495 (1975))에 기재된 하이브리도마 방법으로 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법(예를 들어, 미국특허 제4,816,576호 참조)으로 제조할 수 있다. 모노클로날 항체는 또한 예를 들어, 문헌 (Clackson et al., Nature,352:624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol . Biol., 222:581-597 (1991))에 기재된 기술을 이용하여 파지항체 라이브러리로부터 단리할 수 있다.
본 발명에서의 모노클로날 항체는 구체적으로, 목적하는 활성을 발휘한다면 중쇄 및 (또는) 경쇄의 일부분이 특정 종으로부터 유래된 항체 또는 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이 있지만, 쇄(들)의 나머지는 다른 종으로부터 유래된 항체 또는 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 또는 그러한 항체의 단편과 동일하거나 상동성이 있는 "키메라" 항체를 포함한다.
비-인간 (예를 들어, 쥐과 동물) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유도된 최소서열을 포함하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 그의 단편 (예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원 결합 서열) 이다. 대부분의 경우 인간화 항체는 수용자의 상보성 결정 영역 (CDR)의 잔기를 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 생쥐, 쥐 또는 토끼와 같은 인간 이외의 종 (공여자 항체)의 CDR 잔기로 치환시킨 인간 면역글로불린 (수용자 항체)을 포함한다. 몇몇 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 치환된다. 또한, 인간화 항체는 수용 항체, 또는 도입되는 CDR 또는 프레임워크 서열에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 하나 이상, 일반적으로 둘 이상의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함하며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 면역글로불린의 영역에 대응하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 서열의 영역에 해당한다. 또한, 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 일반적으로 인간면역글로불린 영역의 일부를 포함한다.
본 발명의 비알콜성 지방간 진단용 조성물은 키트의 형태로 포함될 수 있다.
상기 키트는 14-3-3β 또는 14-3-3γ 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 양을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체를 포함할 수 있고, 이들의 정의는 상술한 바와 같다.
상기 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합효소 보조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으며, 상기 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
또한, 본 발명의 비알콜성 지방간 진단용 조성물은 마이크로어레이의 형태로 포함될 수 있다.
본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기 14-3-3β 또는 14-3-3γ 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체는 혼성화 어레이 요소 (hybridizable array element)로서 이용되며, 기질 (substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기질은 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함할 수 있다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기 기질 상에 배열되고 고정화되며, 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커 (예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기질에 결합될 수 있다.
한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료가 핵산일 경우에는 표지될 수 있고, 마이크로어레이 상의 어레이 요소와 혼성화 될 수 있다. 혼성화 조건은 다양할 수 있으며, 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 14-3-3β 또는 14-3-3γ 유전자의 발현수준 또는 그 발현 단백질 수준을 측정하는 방법을 통해 비알콜성 지방간을 진단하는데 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는데, 보다 구체적으로 상기 방법은, (a) 비알콜성 지방간 의심환자의 생물학적 시료로부터 14-3-3β 또는 14-3-3γ 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 양을 측정하는 단계; 및 (b) 정상 대조군 시료로부터 상기 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 양을 측정하여 상기 (a) 단계의 측정결과와 비교하는 단계를 포함할 수 있다.
상기에서 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 양을 측정하는 방법은 공지의 기술을 이용하여 생물학적 시료로부터 mRNA 또는 단백질을 분리하는 공지의 공정을 포함하여 수행될 수 있다.
상기 생물학적 시료는 비알콜성 지방간의 발생 또는 진행 정도에 따른 상기 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 수준이 정상 대조군과는 다른, 생체로부터 채취된 시료를 말하며, 상기 시료로는 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨 등이 포함될 수 있다.
상기 유전자의 발현 수준 측정은 바람직하게는 mRNA의 수준을 측정하는 것이며, mRNA의 수준을 측정하는 방법으로는 역전사 중합효소연쇄반응 (RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응, RNase 보호 분석법, 노던 블럿 및 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 단백질 수준의 측정은 항체를 이용할 수 있는데, 이러한 경우, 생물학적 시료 내의 상기 단백질과 이에 특이적인 항체는 결합물, 즉, 항원-항체 복합체를 형성하며, 항원-항체 복합체의 형성양은 검출 라벨 (detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물질, 리간드, 발광물질, 미소입자 (microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 웨스턴 블럿, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있다.
따라서 본 발명은 상기와 같은 검출 방법들을 통하여, 대조군의 mRNA 발현 양 또는 단백질의 양과 비알콜성 지방간 의심환자에서의 mRNA 발현 양 또는 단백질의 양을 확인할 수 있고, 상기 발현 양의 정도를 대조군과 비교함으로써 비알콜성 지방간의 발병여부, 진행단계 등을 진단할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 비알콜성 지방간의 진단을 위한 정보 제공방법은 본 발명에 따른 14-3-3β 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 양이 정상 대조군 시료에 비해 증가되었을 경우, 비알콜성 지방간이 유발되거나 발병 가능성이 높은 것으로 판단할 수 있다. 역으로, 14-3-3γ의 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 양이 정상 대조군 시료에 비해 감소되었을 경우, 비알콜성 지방간이 유발되거나 발병 가능성이 높은 것으로 판단할 수 있다.
본 발명은 또한 14-3-3β 또는 14-3-3γ의 유전자 또는 단백질을 포함하는 세포를 후보물질과 인체 외에서 접촉시키고,
상기 후보물질에 의한 상기 유전자 또는 단백질의 발현량 변화를 측정하는 것을 포함하는 지방간 예방 또는 치료용 의약의 스크리닝 방법을 제공한다.
예를 들어, 상기 후보물질이 14-3-3β 유전자 또는 단백질의 발현을 하향조절할 때 지방간 예방 또는 치료용 의약으로 판별할 수 있다. 다르게는 상기 후보물질이 14-3-3γ 유전자 또는 단백질의 발현을 상향조절할 때 지방간 예방 또는 치료용 의약으로 판별할 수 있다.
또한, 본 발명은 14-3-3β 단백질 및/또는 14-3-3γ 단백질을 PPARγ2 단백질과 함께 후보물질과 접촉시키고, 상기 후보물질에 의한 PPARγ2에 대한 14-3-3β 단백질 및/또는 14-3-3γ 단백질의 결합 변화를 측정하는 것을 포함하는 지방간 예방 또는 치료용 의약의 스크리닝 방법을 제공한다.
한 구체예에서, 상기 후보물질에 의한 PPARγ2 에 대한 14-3-3β 단백질 및/또는 14-3-3γ 단백질의 결합 변화 측정은 PPARγ2 의 Ser273 잔기에 대한 14-3-3β 단백질 및/또는 14-3-3γ 단백질의 결합 변화를 측정함으로써 수행될 수 있다.
상기 후보물질은 통상적인 선정방식에 따라 14-3-3β 및/또는 14-3-3γ 유전자 염기서열에서 mRNA, 단백질로의 전사, 번역을 촉진하거나 억제하는 물질 또는 14-3-3β 및/또는 14-3-3γ의 기능 또는 활성을 증진하거나 억제하는 의약으로서의 가능성을 지닌 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 펩타이드, 기타 추출물 또는 천연물, 화합물 등이 될 수 있다.
이후, 후보물질이 처리된 세포에서 상기 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성을 측정할 수 있으며, 측정 결과, 상기 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성이 증가 또는 감소되는 것이 측정되면 상기 후보물질은 지방간을 예방 또는 치료할 수 있는 물질로 판단할 수 있다.
상기에서 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성을 측정하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 수행될 수 있는데, 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 역전사 중합효소 연쇄반응 (reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응 (real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석 (RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법 (radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법 (immunoprecipitation assay) 등을 이용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법을 통해 얻은, 14-3-3β 및/또는 14-3-3γ 유전자 발현을 저해/증진시키거나 단백질의 기능을 저해/증진시키는 활성을 나타내는 후보물질이 지방간 예방 또는 치료용 의약의 후보물질이 될 수 있다.
이와 같은 지방간 예방 또는 치료용 의약의 후보물질은 이후의 지방간 치료제 개발과정에서 선도물질 (leading compound)로서 작용하게 되며, 선도물질이 14-3-3β 및/또는 14-3-3γ 유전자 또는 그로부터 발현되는 단백질의 기능을 촉진 또는 억제효과를 나타낼 수 있도록 그 구조를 변형시키고 최적화함으로써, 새로운 지방간 치료제를 개발할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실험 재료>
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), Medium 199 (M199), 우태아혈청 (fetal bovine serum (FBS)), 페니실린, 스트렙토마이신, Opti-MEM은 Invitrogen (Carlsbad, CA)에서 구입하였다.
si-14-3-3β 및 si-14-3-3γ siRNA, 항-PPARγ, 항-GFP, 항-GST, 항-Flag, 항-p-Cdk5(Tyr15), 항-Cdk5 및 항-HA, 항-SREBP-1c 항체, Roscovitine은 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였고, 항-p-PPARγ2(Ser273) 항체는 Rockland immunochemicals Inc.(Limerick,PA,USA)에서 구입하였다.
E-fection plus reagent는 Lugen Sci. (Seoul, South Korea)에서 구입하였다.
루시퍼라제 분석 시스템은 Promega Co. (Madison, WI, USA)에서 구입하였다.
피오글리타존 (pioglitazone)과 올레산 (oleic acid)은 Sigma (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
트리글리세리드 분석 시스템은 Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, USA)에서 구입하였다.
<실시예 1> PPARγ2의 전사활성을 조절하는 14-3-3β와 14-3-3γ의 확인
PPARγ2의 전사활성은 간질환 관련 단백질들의 발현에 중요한 역할을 한다. 따라서 PPARγ2에 의해 조절되는 aP2 프로모터를 이용하여 PPARγ2의 전사활성을 측정하였으며, 7종류의 14-3-3 단백질들의 역할을 확인하였다.
이를 위해, HEK-293T 세포를 12-웰 플레이트에 각 웰당 1×105 세포를 씨딩한 후 0.5 ㎍의 aP2 프로모터 구조물과 14-3-3 동형 단백질 (α, β, γ, δ, ε, ζ, η, θ) (0.5㎍) 또는 si-14-3-3β 및 si-14-3-3γ siRNA (5nM과 10nM, Santa Cruz)를 E-fection plus reagent (Lugen)를 이용하여 트랜스펙션하였다. DNA와 E-fection plus reagent의 비율은 1:2로 사용하였으며 방법은 제조업체의 매뉴얼에 따라 수행하였다. 트랜스펙션 후 피오글리타존 (pioglitazon; Pio, Santa Cruz) 10 μM을 24시간 처리하였고 해당 세포를 ice-cold PBS로 세척 및 리포터 라이시스 버퍼 (Promega, Madison, WI)로 웰당 80 ㎕를 사용하여 세포를 용해시킨 후 10,000×g에 4℃에서 10분간 원심분리하여 상등액을 수집하고 루시퍼라아제 활성을 측정하였다. 기기는 Luminometer 20/20n (Turner Biosystems, Sunnyvale, CA)를 사용하였다. 표준화 (Normalization)를 위해서 pSV40-β-갈락토시다아제를 함께 트랜스펙션 (cotransfected)하였다. 수집된 상등액은 β-갈락토시다아제 활성을 측정하여 루시퍼라아제 활성을 보정하여 값을 그래프로 나타내었다. 여기에 β-갈락토시다아제 효소 분석 시스템 (Promega, Madison, WI)이 사용되었고, DU530 spectrophotometer (Beckman Instruments, Palo Alto, CA)를 사용하여 분석하였다.
aP2 프로모터 활성 측정결과, 14-3-3β는 PPARγ2의 전사활성을 증가시키며, 14-3-3γ는 PPARγ2의 전사활성을 감소시키는 것을 확인하였다. 그러나 다른 5종류의 동형 단백질에서는 변화가 없었다 (도 1A).
PPARγ2의 전사활성에 14-3-3β와 14-3-3γ가 관여하는지 정확하게 확인하기 위하여 14-3-3β와 14-3-3γ를 농도별로 과발현하여 측정한 결과, 14-3-3β의 농도 의존적으로 PPARγ2의 전사활성이 증가하였다 (도 1B). 그러나 14-3-3γ의 경우 농도 의존적으로 PPARγ2의 전사활성을 감소시켰다 (도 1C).
반면에, si-14-3-3β를 이용하여 14-3-3β의 발현을 억제할 경우 PPARγ2의 전사활성이 감소하고 (도 1D), 14-3-3γ 발현억제 시 PPARγ2의 전사활성이 증가하였다 (도 1E).
따라서, 본 실험결과에 따르면 14-3-3β는 PPARγ2의 전사활성을 증가시키는데 관여하며, 14-3-3γ는 PPARγ2의 전사활성을 억제하는 역할을 하며 서로 반대로 조절하는 유전자로 판단된다.
<실시예 2> 14-3-3β와 14-3-3γ의 PPARγ2와의 결합 확인
전사활성 실험결과 14-3-3β와 14-3-3γ가 PPARγ2의 전사활성을 조절하는 것으로 보아 14-3-3β와 14-3-3γ가 PPARγ2와 결합할 수 있을 것으로 생각되었다.
따라서, GST-pull down assay를 수행하여 14-3-3β와 14-3-3γ가 PPARγ2와 결합을 하는지 확인하고자 하였다.
이를 위해, HEK-293T 세포를 100mm 플레이트에 각 웰당 2×106 세포를 씨딩한 후 Myc-PPARγ2 DNA (4㎍)와 mGST-14-3-3β (4㎍) 또는 mGST-14-3-3γ (4㎍)를 E-fection plus reagent (Lugen)를 이용하여 트랜스펙션하였다. DNA와 E-fection plus reagent의 비율은 1:2로 사용하였으며 방법은 제조업체의 매뉴얼에 따라 수행하였다. 트랜스펙션 후 피오글리타존 (pioglitazon; Pio, Santa Cruz) 10 μM을 24시간 처리하였고 해당 세포를 ice-cold PBS로 세척 및 라이시스 버퍼 (150 mM NaCl, 1mM EDTA, 1% Nonidet P-40, 5% glycerol, 25 mM tris-HCl, pH 7.5, 프로테아제 저해제 첨가)로 웰당 500 ㎕를 사용하여 세포를 용해시킨 후 10,000×g에 4℃에서 10분간 원심분리하여 단백질 추출 후 1000㎍의 단백질을 glutathione Sepharose 4B beads (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) 20㎕와 6시간동안 반응시킨 후 beads를 ice-cold PBS 1㎖로 세척하는 과정을 5번 반복하고 beads를 100℃에서 10분간 끓인 후 10% SDS-PAGE 젤로 분리하여 웨스턴 블랏을 하였다. GST 항체 (Santa Cruz)와 Myc 항체 (자체생산)는 1:3000 비율로 사용하였다. 각 단백질 검출을 위해서 West Pico ECL (Thermo scientific, Rockford, IL)을 사용하여 암실에서 확인하였다.
그 결과, PPARγ2와 14-3-3β의 결합이 PPARγ2 리간드인 pioglitazone 처리시 14-3-3β와의 결합이 더욱 강해졌다 (도 2A). 14-3-3β와는 반대로 PPARγ2와 14-3-3γ와의 결합은 감소하였다 (도 2B). 이러한 결과는 PPARγ2의 활성화가 진행될 경우 14-3-3β와의 결합이 증가되며, 14-3-3γ와의 결합은 감소되어 이러한 두 단백질에 의해 PPARγ2의 전사활성을 조절하여 타겟 유전자의 발현을 조절할 것으로 판단되었다.
<실시예 3> 14-3-3β와 14-3-3γ가 PPARγ2와 결합하는 도메인 확인
PPARγ2 단백질은 activation function 1 (AF-1, 아미노산 1-138), DNA-binding domain (DBD, 아미노산 139-203), hinge region (아미노산 204-310), activation function 2 (AF-2, 아미노산 311-505) 도메인으로 되어 있다고 보고된 바 있다 (도 3A). 따라서, PPARγ2의 어떠한 도메인 부분에 14-3-3β와 14-3-3γ가 결합하는지 확인하기 위해 GST-pull down assay를 진행하였다.
HEK-293T 세포를 100mm 플레이트에 각 웰당 2×106 세포를 씨딩한 후 Flag-PPARγ2 (1-505) DNA (4㎍), Flag-PPARγ2 (1-310) DNA (4㎍), Flag-PPARγ2 (139-505) DNA (4㎍)와 mGST-14-3-3β (4㎍) 또는 mGST-14-3-3γ (4㎍)을 E-fection plus reagent (Lugen)를 이용하여 트랜스펙션하였다. Flag-PPARγ2 (1-310) DNA, Flag-PPARγ2 (139-505) DNA는 중합효소 연쇄반응(PCR)을 통해 증폭한 DNA 단편을 XhoI과 ApaI 제한효소를 이용하여 pCMV-3Tag-1 vector에 클로닝하였다. DNA와 E-fection plus reagent의 비율은 1:2로 사용하였으며 방법은 제조업체의 매뉴얼에 따라 수행하였다. 해당 세포를 ice-cold PBS로 세척 및 라이시스 버퍼 (150 mM NaCl, 1mM EDTA, 1% Nonidet P-40, 5% glycerol, 25 mM tris-HCl, pH 7.5, 프로테아제 저해제 첨가)로 웰당 500 ㎕를 사용하여 세포를 용해시킨 후 10,000×g에 4℃에서 10분간 원심분리하여 단백질 추출 후 1000㎍의 단백질을 glutathione Sepharose 4B beads (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) 20㎕와 6시간동안 반응시킨 후 beads를 ice-cold PBS 1㎖로 세척하는 과정을 5번 반복하고 beads를 100℃에서 10분간 끓인 후 10% SDS-PAGE 젤로 분리하여 웨스턴 블랏을 하였다. GST 항체 (Santa Cruz)와 Flag 항체 (Santa Cruz)는 1:3000 비율로 사용하였다. 각 단백질 검출을 위해서 West Pico ECL (Thermo scientific, Rockford, IL)을 사용하여 암실에서 확인하였다.
PPARγ2 유전자의 야생형 및 2가지의 결실돌연변이와 14-3-3β 또는 14-3-3γ 결합을 확인한 결과, PPARγ2 (1-310) 결실돌연변이와 PPARγ2 (139-505) 결실돌연변이에서 14-3-3β (도 3B)와 14-3-3γ (도 3C)가 결합하였다. 이러한 결과는 14-3-3β와 14-3-3γ는 PPARγ2의 DBD 또는 hinge region과 결합을 의미한다.
<실시예 4> 14-3-3β와 14-3-3γ가 결합하는 PPARγ2의 잔기 확인
14-3-3 단백질은 타겟 단백질의 인산화된 잔기에 결합한다고 알려져 있다. PPARγ2 의 활성에 관련된 인산화 잔기는 serine 112와 serine 273으로 알려져 있다. 이에 Serine 112와 serine 273 잔기가 인산화 되지 않는 PPARγ2 의 돌연변이(PPARγ2 S112A와 S273A)를 제작하여 14-3-3 단백질과의 결합을 GST-pull down assay를 통하여 확인하였다.
HEK-293T 세포를 100mm 플레이트에 각 웰당 2×106 세포를 씨딩한 후 Flag-PPARγ2 (WT) DNA (4㎍), Flag-PPARγ2 (S112A) DNA (4㎍), Flag-PPARγ2 (S273A) DNA (4㎍)와 mGST-14-3-3β (4㎍) 또는 mGST-14-3-3γ (4㎍)을 E-fection plus reagent (Lugen)를 이용하여 트랜스펙션하였다. Flag-PPARγ2 (S112A) DNA, Flag-PPARγ2 (S273A) DNA는 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 통해 증폭한 DNA 단편을 Flag-tagged vector에 클로닝하였다. DNA와 E-fection plus reagent의 비율은 1:2로 사용하였으며 방법은 제조업체의 매뉴얼에 따라 수행하였다. 해당 세포를 ice-cold PBS로 세척 및 라이시스 버퍼 (150 mM NaCl, 1mM EDTA, 1% Nonidet P-40, 5% glycerol, 25 mM tris-HCl, pH 7.5, 프로테아제 저해제 첨가)로 웰당 500㎕를 사용하여 세포를 용해시킨 후 10,000×g에 4℃에서 10분간 원심분리하여 단백질 추출 후 1000㎍의 단백질을 glutathione Sepharose 4B beads (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) 20㎕와 6시간동안 반응시킨 후 beads를 ice-cold PBS 1㎖로 세척하는 과정을 5번 반복하고 beads를 100℃에서 10분간 끓인 후 10% SDS-PAGE 젤로 분리하여 웨스턴 블랏을 하였다. GST 항체 (Santa Cruz)와 Flag 항체 (Santa Cruz)는 1:3000 비율로 사용하였다. 각 단백질 검출을 위해서 West Pico ECL (Thermo scientific, Rockford, IL)을 사용하여 암실에서 확인하였다.
또한, HEK-293T 세포를 12-웰 플레이트에 각 웰당 1×105 세포를 씨딩한 후 aP2 프로모터 구조물 (0.5㎍)과 Flag-PPARγ2 (S112A) DNA (0.5㎍) 또는 Flag-PPARγ2 (S273A) DNA (0.5㎍)와 mGST-14-3-3β DNA (0.5㎍) 또는 mGST-14-3-3γ DNA (0.5㎍)를 E-fection plus reagent (Lugen)를 이용하여 트랜스펙션하였다. DNA와 E-fection plus reagent의 비율은 1:2로 사용하였으며 방법은 제조업체의 매뉴얼에 따라 수행하였다. 해당 세포를 ice-cold PBS로 세척 및 리포터 라이시스 버퍼 (Promega, Madison, WI)로 웰당 80 ㎕를 사용하여 세포를 용해시킨 후 10,000×g에 4℃에서 10분간 원심분리하여 상등액을 수집하고 루시퍼라아제 활성을 측정하였다. 기기는 Luminometer 20/20n (Turner Biosystems, Sunnyvale, CA)를 사용하였다. 표준화(Normalization)를 위해서 pSV40-β-갈락토시다아제를 함께 트랜스펙션(cotransfected)하였다. 수집된 상등액은 β-갈락토시다아제 활성을 측정하여 루시퍼라아제 활성을 보정하여 값을 그래프로 나타내었다. 여기에 β-갈락토시다아제 효소 분석 시스템 (Promega, Madison, WI)이 사용되었고, DU530 spectrophotometer (Beckman Instruments, Palo Alto, CA)를 사용하여 분석하였다.
그 결과, PPARγ2 S273A 돌연변이에서 14-3-3β와 14-3-3γ의 결합이 모두 억제되었다 (도 4A와 4B). 또한 14-3-3β의 과발현에 따라 증가된 PPARγ2의 전사활성이 PPARγ2 S273A 돌연변이의 경우 전사활성에 변화가 없었다 (도 4C). 또한, 14-3-3γ 과발현시 감소된 PPARγ2의 전사활성이 PPARγ2 S273A 돌연변이의 경우 전사활성에 변화가 없었다 (도 4D). 따라서 PPARγ2의 serine 273 잔기에 14-3-3β와 14-3-3γ가 결합하여 PPARγ2의 전사활성을 조절하는 것으로 확인되었다.
<실시예 5> 14-3-3β와 14-3-3γ의 PPARγ2와의 경쟁적 결합 확인
이전 실험결과를 통해 14-3-3β와 14-3-3γ가 인산화된 PPARγ2의 serine 273 잔기에 결합하는 것을 확인하였으며, 동일한 잔기에서의 결합은 두 단백질이 경쟁적으로 결합할 것으로 판단되었다. 따라서, PPARγ2와의 결합에서 14-3-3β와 14-3-3γ가 경쟁적인 결합을 하는지 확인하기 위해 GST-pull down assay를 진행하였다.
HEK-293T 세포를 100mm 플레이트에 각 웰당 2×106 세포를 씨딩한 후 mGST-PPARγ2 DNA (4㎍)와 GFP-14-3-3β DNA (4㎍) 또는 GFP-14-3-3γ DNA (4㎍) 및 HA-14-3-3β DNA (2와 4㎍) 또는 HA-14-3-3γ DNA (2와 4㎍)을 E-fection plus reagent (Lugen)를 이용하여 트랜스펙션하였다. DNA와 E-fection plus reagent의 비율은 1:2로 사용하였으며 방법은 제조업체의 매뉴얼에 따라 수행하였다. 트랜스펙션 후 피오글리타존 (pioglitazon; Pio, Santa Cruz) 10 μM을 24시간 처리하였고 해당 세포를 ice-cold PBS로 세척 및 라이시스 버퍼 (150 mM NaCl, 1mM EDTA, 1% Nonidet P-40, 5% glycerol, 25 mM tris-HCl, pH 7.5, 프로테아제 저해제 첨가)로 웰당 500㎕를 사용하여 세포를 용해시킨 후 10,000×g에 4℃에서 10분간 원심분리하여 단백질 추출 후 1000㎍의 단백질을 glutathione Sepharose 4B beads (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) 20㎕와 6시간동안 반응시킨 후 beads를 ice-cold PBS 1㎖로 세척하는 과정을 5번 반복하고 beads를 100℃에서 10분간 끓인 후 10% SDS-PAGE 젤로 분리하여 웨스턴 블랏으로 각각 (GST, GFP, HA : Santa Cruz)의 항체를 사용해 단백질을 확인하였고, 모든 항체는 1:3000 비율로 사용하였다.
그 결과 14-3-3γ의 발현량이 증가함에 따라 14-3-3β와 PPARγ2의 결합이 감소하고 (도 5A), 14-3-3β의 발현량이 증가함에 따라 14-3-3γ와 PPARγ2의 결합이 감소하였다 (도 5B). 이는 14-3-3β와 14-3-3γ는 인산화 된 PPARγ2의 serine 273 잔기에 경쟁적으로 결합한다는 것을 보여준다.
<실시예 6> 올레산 (Oleic acid)에 의한 PPARγ2의 발현증가 및 PPARγ2 타겟 유전자의 발현 조절
비만 쥐의 간에서 PPARγ2의 발현 및 활성도가 증가되어 있으며, 그 타겟 유전자의 발현이 증가되어 있다고 알려져 있다. In vitro 실험에서 이러한 비만환경을 만들기 위해 지방산의 한 종류인 올레산 (Oleic acid: OA)을 처리하여 PPARγ2 및 14-3-3β와 14-3-3γ의 mRNA 발현량을 확인하였다.
HepG2와 일차 쥐 간세포를 6-웰 플레이트에 각 웰당 4×105 세포를 씨딩한 후 올레산 (oleic acid; OA) 200 μM을 72시간 처리하였다. mRNA추출은 해당 세포를 Trizol (Invitrogen)로 웰당 1㎖를 사용하여 세포를 용해시킨 후 클로로폼 (chloroform) 200 ㎕를 첨가하여 잘 섞은 후 상온에 5분간 두었다가 12,000×g에 4℃에서 15분간 원심분리하여 상층액을 아이소프로판올 (isopropanol) 500㎕와 섞은 후 10분간 얼음에 두었다가 12,000×g에 4℃에서 15분간 원심분리하여 상층액 (supernatant)을 제거하고 펠릿 (pellet)을 디에틸피로카르본산 (DEPC) 처리된 3차 증류수로 녹였다. 2㎍의 mRNA를 Superscript First Strand cDNA Synthesis Kit (Bioneer, Daejeon, South Korea)를 이용하여 cDNA를 합성하고 이것을 주형으로 인간의 PPARγ2, 14-3-3β, 14-3-3γ, SREBP-1c, SCD-1, ACC, FABP, FAT/CD36, β-액틴 특이적인 프라미머를 이용하여 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 통해 증폭하였고, 쥐의 PPARγ2, 14-3-3β, 14-3-3γ, SREBP-1c, FAT/CD36, GAPDH 특이적인 프라이머를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응 (real-time PCR)을 통해 증폭하였다. β-액틴과 GAPDH는 각 세포의 mRNA를 동일량으로 비교한 것인지 알 수 있는 대조군으로서 사용하였다.
올레산 농도 의존적으로 PPARγ2의 mRNA 발현이 증가하였다. 그러나 14-3-3β와 14-3-3γ의 mRNA 발현량에는 변화가 없었다 (도 6A와 B). 또한 올레산 농도 의존적으로 PPARγ2 타겟 유전자인 지방대사 관련 유전자들의 mRNA 발현도 증가하였다 (도 6C와 D). 본 실험결과 올레산은 PPARγ2와 PPARγ2의 타겟 유전자의 발현을 증가시키며, 14-3-3β와 14-3-3γ 발현에는 영향이 없었다. 이 결과로부터 14-3-3β와 14-3-3γ의 발현보다는 활성화된 PPARγ2의 인산화 잔기에 14-3-3β와 14-3-3γ의 결합에 의한 전사활성 조절이 중요한 것으로 판단되었다.
<실시예 7> 올레산에 의한 PPARγ2의 타겟 유전자 발현 조절에서 14-3-3β와 14-3-3γ의 역할
HepG2 세포를 6-웰 플레이트에 각 웰당 4×105 세포를 씨딩한 후 GFP-14-3-3β DNA (4㎍) 또는 GFP-14-3-3γ DNA (4㎍)를 E-fection plus reagent (Lugen)를 이용하여 트랜스펙션하였다. DNA와 E-fection plus reagent의 비율은 1:2로 사용하였으며 방법은 제조업체의 매뉴얼에 따라 수행하였다. 트랜스펙션 후 올레산 (oleic acid; OA) 200 μM을 72시간 처리하였고 mRNA 추출은 해당 세포를 Trizol (Invitrogen)로 웰당 1㎖를 사용하여 세포를 용해시킨 후 클로로폼 (chloroform) 200 ㎕를 첨가하여 잘 섞은 후 상온에 5분간 두었다가 12,000×g에 4℃에서 15분간 원심분리하여 상층액을 아이소프로판올 (isopropanol) 500 ㎕와 섞은 후 10분간 얼음에 두었다가 12,000×g에 4℃에서 15분간 원심분리하여 상층액 (supernatant)을 제거하고 펠릿 (pellet)을 디에틸피로카르본산 (DEPC) 처리된 3차 증류수로 녹였다. 2㎍의 mRNA를 Superscript First Strand cDNA Synthesis Kit (Bioneer, Daejeon, South Korea)를 이용하여 cDNA를 합성하고 이것을 주형으로 인간의 PPARγ2 (서열번호 1, 2), 14-3-3β (서열번호 3, 4), 14-3-3γ (서열번호 5, 6), SREBP-1c, FAT/CD36, β-액틴 특이적인 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 통해 증폭하였고, 쥐의 SREBP-1c, FAT/CD36, GAPDH 특이적인 프라이머를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR)을 통해 증폭하였다. β-액틴과 GAPDH는 각 세포의 mRNA를 동일량으로 비교한 것인지 알 수 있는 대조군으로서 사용하였다.
또한, 크로마틴 면역침강 분석법 (chromatin immunoprecipitation; ChIP)은 HepG2 세포를 100mm 플레이트에 각 웰당 4×106 세포를 씨딩한 후 Flag-PPARγ2 DNA (4㎍)와 mGST-14-3-3β DNA (4㎍) 또는 mGST-14-3-3γ DNA (4㎍) 및 si-14-3-3β (20μM, Santa Cruz) 또는 si-14-3-3γ (20μM, Santa Cruz)를 E-fection plus reagent (Lugen)를 이용하여 트랜스펙션하였다. DNA와 E-fection plus reagent의 비율은 1:2로 사용하였으며 방법은 제조업체의 매뉴얼에 따라 수행하였다. 해당 세포를 0.75% 포름알데히드를 15분간 상온에서 처리 후 글리신(glycine)을 첨가하고 ice-cold PBS에 세포를 긁어내어 1,000×g에 4℃에서 3분간 원심분리하여 상층액 (supernatant)을 제거하고 펠릿 (pellet)을 FA lysis buffer (50 mM HEPES, 150mM NaCl, 2mM EDTA pH8.0, 1% Triton-X100, 0.1% NaDeoxycholate) 400 ㎕로 푼 후 초음파 파쇄기 (sonicator)를 이용하여 high voltage, 30초 파쇄-30초 휴식 조건으로 10분씩 2번 반복 파쇄하였다. 항-Flag 항체 (Santa Cruz)를 이용하여 DNA-단백질 복합체를 면역침강시킨 후 FAT/CD36 프로모터 특이적인 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 통해 증폭하였다.
또한, HepG2 세포를 6-웰 플레이트에 각 웰당 5×105 세포를 씨딩한 후 HA-14-3-3β DNA (1㎍) 또는 HA-14-3-3γ DNA (1㎍)을 E-fection plus reagent (Lugen)를 이용하여 트랜스펙션하였다. DNA와 E-fection plus reagent의 비율은 1:2로 사용하였으며 방법은 제조업체의 매뉴얼에 따라 수행하였다. 트랜스펙션 후 올레산 (oleic acid; OA) 200 μM을 72시간 처리하였고 해당 세포를 ice-cold PBS로 세척 및 라이시스 버퍼 (150 mM NaCl, 1mM EDTA, 1% Nonidet P-40, 5% glycerol, 25 mM tris-HCl, pH 7.5, 프로테아제 저해제 첨가)로 웰당 80㎕를 사용하여 세포를 용해시킨 후 10,000×g에 4℃에서 10분간 원심분리하여 단백질 추출 후 30㎍의 단백질을 10% SDS-PAGE 젤로 분리하여 웨스턴 블랏으로 각각 (HA, SREBP-1c : Santa Cruz)의 항체를 사용해 단백질을 확인하였고, 모든 항체는 1:3000 비율로 사용하였다.
올레산에 의해 증가된 sterol regulatory element binding protein-1c (SREBP-1c)와 Fatty acid translocase (FAT)/CD36의 mRNA 발현이 14-3-3β 과발현에 의해 더 증가하였다. 그러나 14-3-3γ 과발현 시 SREBP-1c와 FAT/CD36의 mRNA의 발현이 감소하였다 (도 7A 및 도 7B).
또한, 크로마틴 면역침강법 (ChIP assay)을 이용하여 FAT/CD36 프로모터에 존재하는 PPARγ2의 결합사이트로 알려진 PPRE (PPAR response element)를 이용하여 PPARγ2의 결합 및 14-3-3β와 14-3-3γ의 발현에 따른 결합력을 확인하였다. 그 결과 FAT/CD36 프로모터에 PPARγ2의 결합이 14-3-3β 과발현에선 증가하며, 14-3-3γ의 과발현시 그 결합이 억제되었다 (도 7C, 상단).
그러나 14-3-3β의 발현을 억제할 경우 PPARγ2와 14-3-3β의 결합이 떨어지며 14-3-3γ의 발현 억제시 결합력이 증가함을 확인하였다 (도 7C, 하단).
이 결과는 CD36 유전자의 발현조절을 위해 프로모터 지역에 결합하는 PPARγ2가 14-3-3β에 의해 증가하며 14-3-3γ의해 감소함을 알 수 있다.
이러한 PPARγ2의 타겟 유전자의 mRNA 발현조절이 단밸질의 발현에서도 동일하게 나오는지 확인하기 위하여 SREBP-1c 단백질 발현량을 웨스턴 블랏 방법으로 확인하였다. 실험 결과, 14-3-3β 과발현에 의해 SREBP-1c의 단백질 발현이 증가되고 14-3-3γ 과발현에 의해서 감소됨을 확인하였다 (도 7D).
따라서, 위 실험결과로부터, 지방산의 자극에 의해 PPARγ2 발현 및 활성화가 증가되고, 증가된 PPARγ2의 전사활성을 14-3-3β와 14-3-3γ가 서로 반대로 조절함을 확인하였다.
<실시예 8> PPARγ2 활성화에 따른 14-3-3β와 14-3-3γ와의 결합
HEK-293T 세포를 100mm 플레이트에 각 웰당 2×106 세포를 씨딩한 후 mGST-PPARγ2 DNA (4㎍)와 HA-14-3-3β DNA (4㎍) 또는 HA-14-3-3γ DNA (4㎍)를 E-fection plus reagent (Lugen)를 이용하여 트랜스펙션하였다. DNA와 E-fection plus reagent의 비율은 1:2로 사용하였으며 방법은 제조업체의 매뉴얼에 따라 수행하였다. 트랜스펙션 후 올레산 (oleic acid; OA) 200 μM을 72시간 처리하였고 해당 세포를 ice-cold PBS로 세척 및 라이시스 버퍼 (150 mM NaCl, 1mM EDTA, 1% Nonidet P-40, 5% glycerol, 25 mM tris-HCl, pH 7.5, 프로테아제 저해제 첨가)로 웰당 500㎕를 사용하여 세포를 용해시킨 후 10,000×g에 4℃에서 10분간 원심분리하여 단백질 추출 후 1000㎍의 단백질을 glutathione Sepharose 4B beads (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) 20㎕와 6시간동안 반응시킨 후 beads를 ice-cold PBS 1㎖로 세척하는 과정을 5번 반복하고 beads를 100℃에서 10분간 끓인 후 10% SDS-PAGE 젤로 분리하여 웨스턴 블랏으로 각각 (GST, HA : Santa Cruz)의 항체를 사용해 단백질을 확인하였고, 모든 항체는 1:3000 비율로 사용하였다.
올레산 처리 시 PPARγ2와 14-3-3β의 결합이 증가되지만 (도 8A) 14-3-3γ와의 결합은 감소되었다 (도 8B). 현재까지 알려진 보고에 따르면 PPAR-RXR 복합체는 대사조절 및 대사관련 유전자 발현에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 따라서 PPAR와 RXR의 복합체형성에 있어서 14-3-3β와 14-3-3γ의 과발현이 영향을 미치는지 확인한 결과, PPARγ2-RXRα의 복합체 형성에는 영향을 주지 않았다(도 8C). 즉, 올레산에 의해 활성이 증가된 PPARγ2는 14-3-3β와의 결합이 증가되며, 14-3-3γ와의 결합은 감소하고, PPARγ2와 RXRα의 복합체 형성에는 관여하지 않았다.
<실시예 9> 올레산 처리에 의한 간세포 지방 축적에서 14-3-3β와 14-3-3γ의 역할
HepG2 세포와 일차 쥐 간세포를 6-웰 플레이트에 각 웰당 4×105 세포를 씨딩한 후 GFP-14-3-3β DNA (1㎍) 또는 GFP-14-3-3γ DNA (1㎍) 및 si-14-3-3β (10μM, Santa Cruz) 또는 si-14-3-3γ (10μM, Santa Cruz)를 E-fection plus reagent (Lugen)를 이용하여 트랜스펙션하였다. DNA와 E-fection plus reagent의 비율은 1:2로 사용하였으며 방법은 제조업체의 매뉴얼에 따라 수행하였다. 트랜스펙션 후 올레산 (oleic acid; OA) 200 μM을 72시간 처리하였고 해당 세포를 ice-cold PBS로 세척 후 4% 파라포름알데히드를 이용하여 세포를 고정하였고 6시간동안 실온에서 0.35% Oil Red-O 용액으로 세포를 염색하였다. 염색된 세포를 아이소프로판올 (isopropanol) 1㎖으로 탈색하여 550 nm 파장으로 DU530 spectrophotometer (Beckman Instruments, Palo Alto, CA)를 사용하여 분석하였다.
올레산의 농도 의존적 처리 결과, 일차 쥐 간세포와 HepG2 세포에서 지방 축적이 증가되었다 (도 9A). 14-3-3β의 과발현은 올레산에 의한 지방축적을 증가시키고, 14-3-3γ의 과발현은 지방 축적을 감소시켰다 (도 9B). 또한, si-14-3-3β를 통해 14-3-3β의 발현을 억제할 경우 지방 축적이 감소되고, 14-3-3γ 발현억제시 지방 축적이 증가되었다 (도 9C).
본 실험결과는 올레산에 의해 증가된 PPARγ2의 활성을 14-3-3β가 더욱 증가시켜 지방축적이 증가하며, 14-3-3γ는 PPARγ2 활성을 감소시켜 지방 축적을 감소시킴을 증명한다.
<실시예 10> 트리글리세리드 축적에 있어서의 14-3-3β와 14-3-3γ의 역할
트리글리세리드 (Triglyceride; 중성지방)는 지방산의 한 형태로 이는 지방량의 지표로 이용됨. 트리글리세리드를 측정하여 생화학적인 지질검사를 진행함.
HepG2 세포와 일차 쥐 간세포를 6-웰 플레이트에 각 웰당 4×105 세포를 씨딩한 후 GFP-14-3-3β DNA (1㎍) 또는 GFP-14-3-3γ DNA (1㎍) 및 si-14-3-3β (10μM, Santa Cruz) 또는 si-14-3-3γ (10μM, Santa Cruz)를 E-fection plus reagent (Lugen)를 이용하여 트랜스펙션하였다. DNA와 E-fection plus reagent의 비율은 1:2로 사용하였으며 방법은 제조업체의 매뉴얼에 따라 수행하였다. 트랜스펙션 후 올레산 (oleic acid; OA) 200 μM을 72시간 처리하였고 triglyceride colorimetric assay kit (Cayman Chemical)를 이용하여 트리글리세리드 양을 측정하였다. 해당 세포를 ice-cold PBS로 세척 후 standard diluent assay reagent로 세포를 긁어내고 초음파 파쇄기로 20번 반복하여 세포를 파쇄 후 enzyme buffer solution과 15분간 반응시킨 후 550 nm 파장으로 ELISA reader (Bio-Rad Laboratories, Inc)를 이용하여 측정하였다.
지방 축적 결과와 같이 일차 쥐 간세포 올레산 처리시 트리글리세리드 축적이 증가하였으며 14-3-3β 과발현 따라 트리글리세리드 축적이 더욱 증가되고. 14-3-3γ의 과발현은 트리글리세리드의 축적을 감소시켰다 (도 10A). 또한, 14-3-3β 발현억제는 트리글리세리드 축적을 감소시켰고, 14-3-3γ 발현억제는 축적을 증가시켰다 (도 10B).
상기 모든 결과를 토대로 종합해보면, 14-3-3β와 14-3-3γ는 PPARγ2의 같은 잔기에 결합하여 서로 다르게 PPARγ2의 활성을 조절하고 그 조절은 서로 경쟁적으로 작용함을 알 수 있다. 기초 조건에서는 PPARγ2 S273 잔기에 14-3-3β와 14-3-3γ의결합이 균형을 이루는 기초대사유지를 하고 지방산이 많은 조건에서는 PPARγ2 S273 잔기에 대한 14-3-3β 결합이 증가하여 지방 축적이 증가하여, 이에 따라 비알콜성 지방간으로 발전하는 것으로 예상된다. 따라서, 14-3-3β와 14-3-3γ 발현량 조절을 통해 PPARγ2 활성을 조절함으로써 비알콜성 지방간을 예방 또는 치료할 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (14)

14-3-3β 유전자에 대한 저해제를 포함하며,
상기 저해제는 14-3-3β 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA, 또는 이를 포함하는 벡터인, 비알콜성 지방간 예방 또는 치료용 의약 조성물.
14-3-3β 단백질에 대한 저해제를 포함하며,
상기 저해제는 14-3-3β 단백질에 대한 항체인, 비알콜성 지방간 예방 또는 치료용 의약 조성물.
비알콜성 지방간 의심환자의 생물학적 시료로부터 14-3-3β 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하기 위한 프로브를 포함하는, 비알콜성 지방간 진단용 조성물.
제3항에 있어서,
14-3-3β 유전자의 mRNA 수준을 측정하기 위한 프로브는 상기 mRNA에 대한 핵산 프로브 또는 프라이머인, 비알콜성 지방간 진단용 조성물.
제3항에 있어서,
14-3-3β 단백질의 수준을 측정하기 위한 프로브는 상기 단백질에 대한 항체인, 비알콜성 지방간 진단용 조성물.
14-3-3β 유전자 또는 단백질을 포함하는 세포를 후보물질과 인체 외에서 접촉시키고,
상기 후보물질에 의한 상기 유전자 또는 단백질의 발현량 변화를 측정하는 것을 포함하는 비알콜성 지방간 예방 또는 치료용 의약의 스크리닝 방법.
제6항에 있어서,
상기 후보물질이 14-3-3β 유전자 또는 단백질의 발현을 하향조절할 때 비알콜성 지방간 예방 또는 치료용 의약으로 판별하는, 비알콜성 지방간 예방 또는 치료용 의약의 스크리닝 방법.
14-3-3β 유전자에 대한 저해제를 개체에 투여하는 단계를 포함하며,
상기 저해제는 14-3-3β 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNA, 또는 이를 포함하는 벡터인, 비알콜성 지방간 예방 또는 치료방법.
14-3-3β 단백질에 대한 저해제를 개체에 투여하는 단계를 포함하며,
상기 저해제는 14-3-3β 단백질에 대한 항체인, 비알콜성 지방간 예방 또는 치료방법.
비알콜성 지방간 의심환자로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계;
상기 생물학적 시료에 14-3-3β 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하기 위한 프로브를 처리하여 14-3-3β를 검출하는 단계; 및
상기 검출된 14-3-3β의 수준을 정상 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 비알콜성 지방간 진단방법.
제10항에 있어서,
상기 14-3-3β 유전자의 mRNA수준을 측정하기 위한 프로브는 상기 mRNA에 대한 핵산 프로브 또는 프라이머인, 비알콜성 지방간 진단방법.
제10항에 있어서,
상기 14-3-3β 단백질의 수준을 측정하기 위한 프로브는 상기 단백질에 대한 항체인, 비알콜성 지방간 진단방법.
제10항에 있어서,
상기 측정된 14-3-3β 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준이 정상 대조군에 비해 높은 경우, 증가된 비알콜성 지방간 위험도를 나타내는 것을 특징으로 하는, 비알콜성 지방간 진단방법.
비알콜성 지방간 의심환자로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계; 및
상기 생물학적 시료에 14-3-3β 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하기 위한 프로브를 처리하여 14-3-3β의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 14-3-3β 검출방법.
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