KR101598899B1

KR101598899B1 - 골격근 이완 장애 관련 질환의 예방, 진단 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101598899B1
Application number: KR1020130121969A
Authority: KR
Inventors: 이은희; 김도한
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2013-10-14
Filing date: 2013-10-14
Publication date: 2016-03-10
Also published as: KR20150043031A

Abstract

본 발명은 골격근 이완 장애 관련 질환의 예방, 진단 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, STIM1이 SERCA1a와 결합하여 SERCA1a의 활성을 촉진함으로써 골격근 이완을 촉진하여 골격근 이완 장애와 이에 따른 수축 장애가 있는 질환, 예컨대, 브로디 신드롬, 근긴장증, 근육퇴행위축 또는 뇌성마비 등을 예방, 진단 또는 치료할 수 있고, STIM1의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정함으로써 골격근 이완 장애가 있는 질환을 진단할 수 있다.

Description

골격근 이완 장애 관련 질환의 예방, 진단 또는 치료용 조성물 {Composition for preventing, diagnosing or treating skeletal muscle relaxation disorder-related diseases}

본 발명은 골격근의 이완 장애가 있는 질환의 예방, 진단 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

브로디 신드롬(Brody Syndrome) 환자는 상염색체에 기인된 유전적 골격근육병증(inherited skeletal myopathy)으로, 골격근 조직의 파괴(rhabdomyolysis)로 발생하며, 신체의 움직임 또는 운동 과정에서 근육 경직과 경련통(exiercise-induced muscle stiffness and cramping)이 수반된다. 다리, 팔, 얼굴(특히 눈꺼풀)에 심하게 나타나 이동(movement) 장애와 표정(expression) 장애를 일으킨다. 최근, SERCA1a에 돌연변이가 전혀 발견되지 않는 환자에게서도 브로디 병의 증상과 징후(이 경우, 브로디 신드롬(Brody Syndrome)이라 명함)가 나타나는데, 원인은 SERCA1a의 유전자에 변함이 없음에도 불구하고, SERCA1a의 활성이 떨어지기 때문이다. 브로디 신드롬 환자의 경우에는, 그 원인이 전혀 밝혀져 있지 않고, 진단 방법 등이 전무후무하며, 다만 증상과 징후(근육 이와 지연, 근육 경직, 경련통), 환자만이 존재하는 상태이다.

근긴장증(Myotonia)은 골격근(skeletal muscle)의 이완 장애(특히 오랜 수축에 따른 이완 장애)를 특징으로 하는 신경근병의 증상으로, 선천성 근긴장증(Myotonia congenita), 악성고열증(Malignant hyperthermia) 등이 있다. 이 환자의 경우, 물건을 잡았다가 다시 놓는 과정에서 손힘을 적절히 빼지 못한다든가, 앉은 자세에서 일어나는 과정이 매우 불완전하거나, 뻣뻣한 몸 자세로 인해 비정상적 걸음을 하게 된다. 악성고열증 환자의 경우에는 몇몇 마취제에 반응하여 생명을 잃게 된다. 악성고열증에 대한 사전 진단법이 있기는 하나, 진단 비용이 매우 고가이고 발병 빈도가 다른 병에 비해서는 낮다는 점을 감안한다면, 사전 진단 차원에서 모든 사람이 고가의 진단을 받는다는 것에는 무리가 따르는 실정이다.

근육긴장저하(Muscular hypotonia) 환자는 근육의 저항(tone)이 낮아진 상태로, 근육의 긴장저하를 초래한다. 양팔과 다리를 힘없이 축 늘어뜨리는 모습을 하게 되고 머리를 잘 가누지 못하여 봉제인형(rag doll) 현상을 보이는데, 이동, 자세 취하기, 호흡, 및 발화에 곤란을 겪는다. 발달기 아동에게서 사회적 능력, 언어, 그리고 전반적인 학습에 있어서 다른 사람들보다 지연을 초래한다. 근육긴장저하는 특히 다운증후군, 근이영양증, 뇌성마비, 프레더－윌리 증후군(Prader-Willi syndrome), 테이－샥스병(Tay-Sachs disease)을 가진 사람들에게서 많이 발견되고, 또한 근력이 떨어진 정상인 고령자에게도 나타나고 있으며, 암, 에이즈, 노인성 질환 등에 대한 2차 질병 형태로도 나타난다. 근육긴장저하는 근육퇴행위축(muscular dystrophy)이나 뇌성마비(cerebral palsy)의 전조 증상으로 나타나 이들 병의 진행에 대한 사전 표시(indication)가 되기도 한다.

따라서, 본 발명자들은 골격근의 이완 장애 및 그에 따른 수축 장애가 있는 질환을 진단 또는 치료하기 위해 골격근의 수축과 이완에 관여하는 STIM1의 역할을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

Tianyu Li et al., MCB, 32(15), pp.3009-3017 (2012.08) Paul B. Rosenberg, J. Physiol 587.13, pp.3149-3151 (2009)

본 발명의 목적은 골격근의 수축과 이완에 관여하는 STIM1의 역할을 규명함으로써 골격근의 이완 장애 및 그에 따른 수축 장애가 있는 질환을 예방, 진단 또는 치료하기 위한 용도로 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 기질 상호작용 분자 1(stromal interaction molecule 1: STIM1) 단백질을 포함하는 브로디 신드롬(Brody syndrome) 또는 근긴장증(Myotonia)의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 기질 상호작용 분자 1(stromal interaction molecule 1: STIM1) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 브로디 신드롬(Brody syndrome), 근긴장증(Myotonia), 근육퇴행위축(Muscular Dystrophy) 또는 뇌성마비(Cerebral Palsy) 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 기질 상호작용 분자 1(stromal interaction molecule 1: STIM1) 유전자를 후보물질과 인체 외에서 접촉시키고, 상기 후보물질이 상기 유전자의 발현을 촉진하는지 또는 억제하는지를 판단하는 것을 포함하는 브로디 신드롬(Brody syndrome) 또는 근긴장증(Myotonia)의 예방 또는 치료용 의약의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 기질 상호작용 분자 1(stromal interaction molecule 1: STIM1) 단백질을 후보물질과 인체 외에서 접촉시키고, 상기 후보물질이 상기 단백질의 기능 또는 활성을 증진하는지 또는 억제하는지를 판단하는 것을 포함하는 브로디 신드롬(Brody syndrome) 또는 근긴장증(Myotonia)의 예방 또는 치료용 의약의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명은 STIM1이 SERCA1a와 결합하여 SERCA1a의 활성을 촉진함으로써 골격근 이완을 촉진하여 골격근 이완 장애가 있는 질환, 예컨대, 브로디 신드롬 또는 근긴장증 등을 예방 또는 치료할 수 있다.

또한, 본 발명은 STIM1의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정함으로써 브로디 신드롬, 또는 근긴장증 관련 질환을 진단할 수 있다.

도 1은 재조합 STIM1 단백질과 토끼 골격근의 트라이아드 샘플(triad sample)에서 결합된 단백질들을 규명한 결과를 도시한 것으로, (A)는 STIM1, STIM1 도메인들, 및 본 발명에서 사용한 STIM1-UI(449-671 아미노산 서열: SERCA1a-binding region(STIM1-UI)을 의미함)에 대한 도식, (B)는 대장균에서 성공적으로 발현된 재조합 GST-STIM1-UI 단백질(검은색 별표로 표시)의 10% SDS-PAGE 후, 쿠마시 블루 염색 결과, (C)는 정제된 GST-STIM1-UI 단백질의 10% SDS-PAGE 결과 후, 쿠마시 블루 염색 결과, (D)는 GST-STIM1-UI 단백질과 트라이아드 샘플과의 결합 반응 후, 얻어진 단백질들의 10% SDS-PAGE 결과 후, 쿠마시 블루 염색 결과로, STIM1-UI에 특이적으로 결합하여 새롭게 발견된 밴드 4개는 SR+STIM1-UI 샘플의 오른쪽에 표시(밴드 1-4)하고GST 단독은 음성 대조군(negative control)이고, GST-STIM1-UI 단백질들은 흰색 별표로 표시되어 있다.
도 2 내지 5는 도 1D에서 새롭게 발견된 밴드 1 내지 4에 대한 각각의 qTOP MS 스펙트럼 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 토끼 골격근 트라이드아드 샘플에서 STIM1과 SERCA1a의 공동면역침전(A) 및 생쥐 분화골격근세포에서 면역세포화학법(B)을 수행한 결과이다.
도 7은 생쥐 분화골격근세포에서 STIM1을 넉다운 한 후에 옥살레이트-보조 방사선 ⁴⁵칼슘-유입 측정으로 STIM1의 골격근 내 역할을 확인한 결과로, (A) 및 (B)는 STIM1의 성공적 넉다운을 qPCR을 통해 STIM1 mRNA 수준(A), 그리고 면역탁본법을 통해 단백질 수준(B)에서 확인한 결과이고(혼합 siRNA(scrambed siRNA)는 음성 대조군(negative control)으로 사용), (C)는 STIM1이 넉다운 된 분화골격근세포의 분화를 확인한 결과, (D)는 STIM1이 넉다운 된 분화골격근세포의 균질액을 사용하여 70 nM의 자유 ⁴⁵Ca² ⁺ 상태에서 옥살레이트-보조 방사선 ⁴⁵칼슘-유입 (oxalate-supported ⁴⁵Ca² ⁺-uptake)을 측정하여 SR로의 칼슘 유입 정도를 관찰한 결과, (E)는 1μM의 자유 ⁴⁵Ca² ⁺ 상태에서 옥살레이트-보조 방사선 ⁴⁵칼슘-유입 (oxalate-supported ⁴⁵Ca² ⁺-uptake)을 측정하여 SR로의 칼슘 유입 정도를 관찰한 결과이다(유의차 (*)는 P<0.05 일 경우에 별표로 표시함).

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 기질 상호작용 분자 1(stromal interaction molecule 1: STIM1) 단백질을 포함하는 브로디 신드롬(Brody syndrome) 또는 근긴장증(Myotonia)의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

SERCA1a는 Ca² ⁺-pump의 일종으로 ATP를 소모하여 세포질에 있는 칼슘을 근세포질세망(sarcoplasmic reticulum: SR) 안으로 저장하는 역할을 하는데, 이 과정은 근육이 수축한 후에 다시 평상 상태인 이완상태로 돌아오는 과정의 핵심 과정이다.

본 발명자들은 사람 유래의 STIM1과 SERCA1a와의 결합은 STIM1의 C-말단에 존재하는 449번째에서 671번째 아미노산 서열까지의 부분(SERCA1a-binding region(STIM1-UI))에 의해 매개됨을 발견하였다. 토끼 골격근에서 얻어진 샘플에서 전장(full-length) STIM1과 SERCA1a의 결합을 확인하였고, 또한 생쥐에서 얻은 분화골격근세포에서 STIM1과 SERCA1a이 핵 주위에서 주로 공존함을 확인하여, STIM1과 SERCA1a의 결합은 종(species)에 관계없이 골격근 전반에 적용할 있는 결과임을 확인하였다.

또한, STIM1이 넉다운 된 분화골격근세포의 경우, 마이크로몰 단위의 칼슘 존재 하에서, 정상 골격근 세포에 비해서 현격히 낮은 SERCA1a 활성(50% 가량)을 가짐을 확인하였다. 즉, 골격근 세포에서 STIM1은 STIM1-UI 부분을 통해서 SERCA1a에 직접적으로 결합하여 SERCA1a의 활성을 최대 상태로 유지하는 역할을 하는 것을 발견하였다. 따라서, STIM1은 골격근 세포의 세포질에 마이크로몰 단위의 칼슘이 존재하는 시기인 골격근 이완(skeletal muscle relaxation) 과정에서, 골격근의 수축이 100%로 일어나게 유지함에 매우 중요한 역할을 수행함을 알 수 있다.

따라서, 골격근 이완 장애가 있는 질환, 예컨대, 브로디 신드롬 또는 근긴장증 환자의 경우, STIM1 유전자 또는 단백질의 발현 증가 특히 STIM1의 SERCA1a 결합 부위인 STIM1-UI(사람의 STIM1의 449-671 부분)의 발현 양을 조절하거나 이를 환자에 투여하는 경우, SERCA1a의 활성을 높일 수 있고, 이로 인한 골격근 이완을 촉진할 수 있어 브로디 신드롬 또는 근긴장증 환자의 증상을 개선, 완화 또는 치료할 수 있다.

상기 STIM1 단백질은 천연형 또는 재조합 STIM1 단백질, 또는 상기 단백질의 SERCA1a와 결합하는 부위(STIM1-UI)인 SEQ ID NO: 1로 표시되는 아미노산 서열 부분일 수 있다. 또는 상기 단백질 또는 아미노산 서열 부분과 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 것일 수 있다. 상기 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 단백질에는 천연형/재조합 STIM1 단백질 또는 상기 단백질의 STIM1-UI과 그 기능적 동등물(functional equivalent) 및 기능적 유도체(functional derivative)가 포함된다.

상기 "기능적 동등물"에는 천연형 단백질의 아미노산 중 일부 또는 전부가 치환되거나, 아미노산의 일부가 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체로서 천연형 STIM1 단백질 또는 상기 단백질의 STIM1-UI과 실질적으로 동등한 생리활성을 갖는 것을 말한다.

"기능적 유도체"는 상기 STIM1 단백질 또는 상기 단백질의 STIM1-UI의 물리 화학적 성질을 증가 또는 감소시키기 위한 변형을 가한 단백질로서 천연형 STIM1 단백질 또는 상기 단백질의 STIM1-UI과 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 것을 의미한다.

상기 STIM1 단백질은 포유동물, 바람직하게는 인간, 생쥐, 집쥐, 토끼, 오랑우탄, 원숭이, 햄스터, 고양이, 돌고래, 고릴라 등에서 기원하는 단백질이며, 특히 STIM1-UI의 아미노산 서열은 종(species) 간에 높은 서열 상동성을 나타낸다. 예컨대, 사람 유래의 GenBank accession no. NM_003156.3, XP_005253144.1, XP_005253143.1; 생쥐 유래의 GenBank accession no. NP_033313.2, NM_009287.4; 고릴라 유래의 GenBank accession no. XP_004050545.1; 수마트라 오랑우탄(Pongo Abelii) 유래의 GenBank accession no. XP_002822220.1; 다람쥐 원숭이(Saimiri boliviensis boliviensis) 유래의 GenBank accession no. XP_003923448.1; 햄스터(Cricetulus griseus) 유래의 GenBank accession no. XP_003509756.1, **EGV96289.1, **ERE79443.1, XP_005074118.1; 집쥐 유래의 GenBank accession no. EDM18193.1, NP_001101966.2; 고양이(Felis catus) 유래의 GenBank accession no. XP_003992832.1; 히말라야 원숭이(Macaca mulatta) 유래의 GenBank accession no. NP_001248464.1; 나무타기 쥐(Tupaia chinensis) 유래의 GenBank accession no. ELW71828.1; Oryctolagus cuniculus (xhRL) 유래의 GenBank accession no. **XP_002708775.1; 돌고래(Tursiops truncatus) 유래의 GenBank accession no. XP_004319125.1 등의 아미노산 서열을 갖는 STIM1 단백질들은 STIM1-UI의 80 내지 100%의 서열 상동성을 나타낸다. 상기에서 ** 표시가 있는 것은 아미노산 서열에서 80~89% 동일성을 나타내는 것이고, 표시가 없는 것은 90 이상의 동일성을 가진 것이며, 상당수가 사람 유래의 STIM1 대비 100% 동일성을 보인다.

본 발명에 사용된 STIM1 또는 STIM1-UI는 GenBank accession no. NM_003156.3 등으로부터 당업자에 공지된 유전공학적 방법으로 제조할 수 있다. 천연형의 STIM1은 유전자 재조합 방법에 의하여 단백질을 제조하는 경우 대장균(E. coli)이나 곤충 세포를 이용하는 것보다 포유동물 세포를 이용하는 경우가 단백질의 활성도나 용해성 측면에서 천연형의 것과 유사할 것으로 여겨진다.

상기 재조합 STIM1 단백질은 통상의 컬럼 크로마토그라피 방법 등을 이용하여 분리할 수 있다. 또한 단백질의 정제 정도는 소듐 도데실 술페이트-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)등으로 확인할 수 있다.

본 발명의 브로디 신드롬 또는 근긴장증의 예방 또는 치료용 조성물은 SERCA1a 활성화제를 더 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 기질 상호작용 분자 1(stromal interaction molecule 1: STIM1) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 브로디 신드롬(Brody syndrome), 근긴장증(Myotonia), 근육퇴행위축(Muscular Dystrophy) 또는 뇌성마비(Cerebral Palsy) 진단용 조성물에 관한 것이다.

골격근 이완 장애가 있는 질환, 즉, 브로디 신드롬 또는 근긴장증의 경우 SERCA1a 활성이 저하되어 있는 상태이다. STIM1이 넉다운되었을 때 SERCA1a 활성이 떨어지므로 SERCA1a 활성이 저하된 브로디 신드롬 환자의 경우 STIM1의 mRNA 또는 이의 단백질 수준 역시 정상 개체 대비 검출가능하게 감소된 상태일 것으로 예상된다. 따라서, 이로부터 브로디 신드롬을 진단할 수 있는 것이다.

또한, 근육긴장저하는 근육퇴행위축이나 뇌성마비의 전조 증상으로 나타나 이들 병의 진행에 대한 사전 표시(indication)가 되기도 한다. 이 경우, 영유아기(infancy)에 감지가 가능한데, 근육 긴장이 낮아진 상태로 SERCA1a 활성이 증가되어 있을 것으로 예상되며, STIM1이 넉다운 되었을 때 SERCA1a 활성이 떨어지므로 SERCA1a 활성을 촉진하는 STIM1의 mRNA 또는 이의 단백질 수준은 정상 개체 대비 검출가능하게 증가된 상태일 것으로 예상되므로 이를 측정하여 근육퇴행위축이나 뇌성마비의 전조 증상으로 나타날 수 있는 근육긴장저하를 진단함이 가능할 수 있다.

상기 근육퇴행위축은 뒤시엔느 근육퇴행위축(Duchenne Muscular Dystrophy), 벡터 근육퇴행위축(Becker Muscular Dystrophy), 지대형 근육퇴행위축(Limb-girdle Muscular Dystrophy), 안면견갑상완 근육퇴행위축(Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy), 눈인두 근육퇴행위축(Oculopharyngeal Muscular Dystrophy) 또는 근육긴장(Myotonia) 등을 포함할 수 있다.

상기 STIM1 단백질은 인간, 생쥐, 집쥐, 토끼, 오랑우탄, 원숭이, 햄스터, 고양이, 돌고래, 고릴라 등의 포유동물 유래의 STIM1 단백질 또는 SEQ ID NO: 1에 기재된 아미노산 서열로 표시되는 상기 단백질의 SERCA1a-binding region(STIM1-UI), 또는 상기 STIM1 또는 STIM1-UI과 80 내지 100%의 서열 상동성을 나타내는 것을 포함할 수 있다.

용어, "진단"은 병리 상태를 확인하는 것을 의미하는 것으로서, 본 발명의 목적상 상기 진단은 브로디 신드롬, 근긴장증, 근육퇴행위축 또는 뇌성마비 진단 마커의 발현 유무를 확인하여 이들 질환의 발병 여부, 발전 및 경감 여부를 확인하는 것을 의미한다.

용어, "진단용 마커(diagnosis marker)"란 브로디 신드롬, 근긴장증, 근육퇴행위축 또는 뇌성마비의 세포를 정상세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질을 의미하며, 정상세포에 비하여 브로디 신드롬, 근긴장증, 근육퇴행위축 또는 뇌성마비의 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예컨대, mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명에서 제공하는 브로디 신드롬, 근긴장증, 근육퇴행위축 또는 뇌성마비 진단용 마커는 정상세포에 비해 브로디 신드롬, 근긴장증, 근육퇴행위축 또는 뇌성마비의 세포에서 발현 양이 증가 또는 감소하는 STIM1 유전자로부터 발현된 단백질일 수 있다.

본 발명의 브로디 신드롬, 근긴장증, 근육퇴행위축 또는 뇌성마비 진단용 조성물은 STIM1 유전자의 mRNA의 발현 수준 또는 상기 유전자로부터 발현된 단백질의 양을 측정하는 제제를 포함하고, 이러한 제제로 STIM1 mRNA에 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드, 예컨대, STIM1 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 핵산 프로브나, STIM1 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다.

상기 프라이머는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다. 또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머는 유전자 증폭 반응에 이용될 수 있는 것이 좋다. 상기 증폭 반응은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 말하며, 이러한 유전자의 증폭 반응들에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있고, 예컨대, 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 리가아제 연쇄반응(LCR), 전자 중재 증폭(TMA), 핵산 염기서열 기판 증폭(NASBA) 등이 포함될 수 있다.

상기 핵산 프로브는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타켓 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것을 말한다. 본 발명에 따른 프로브는 단일쇄일 수 있으며, 바람직하게는 올리고디옥시리보뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 프로브는 자연 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA) (M. Egholm et al ., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O- 알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.

상기 STIM1에 특이적인 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인간항체 및 인간화 항체를 사용할 수 있다.

상기 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디(diabody); 선형 항체(Zapata et al ., Protein Eng. 8 (10):1057-1062(1995)); 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체 등이 포함된다.

항체를 파파인 (papain)으로 분해하면 2개의 동일한 항원 결합 단편, 즉 단일 항원 결합 부위가 있는 각 "Fab" 단편, 및 그 나머지인 "Fc" 단편이 생성된다. 펩신을 처리하면, 2개의 항원 결합 부위가 있으며 여전히 항원에 교차결합할 수 있는 F(ab ')2 단편이 생성된다. Fv는 완전한 항원인식 및 결합 부위를 포함하는 최소한의 항체 단편이다. 이 부위는 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 영역의 이합체로 구성되며 비공유결합으로 단단히 결합되어 있다.

폴리클로날 항체의 제조방법은 당업자에게 공지되어 있다. 폴리클로날 항체는 포유동물에 1회 이상 면역화제를 주입, 필요한 경우 면역보강제와 함께 주입하여 제조할 수 있다. 통상, 면역화제 및(또는) 면역보강제는 포유동물에 피하주사 또는 복강내 주사로 수 회 주입된다. 면역화제는 본 발명의 단백질 또는 이의 융합 단백질일 수 있다. 면역화되는 포유동물에 면역원성이 있는 것으로 공지된 단백질과 함께 면역화제를 주사하는 것이 효과적일 수 있다.

본 발명에 따른 모노클로날 항체는 문헌(Kohler et al.,Nature, 256:495 (1975))에 기재된 하이브리도마 방법으로 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법(예를 들어, 미국특허 제4,816,576호 참조)으로 제조할 수 있다. 모노클로날 항체는 또한 예를 들어, 문헌(Clackson et al ., Nature,352:624-628 (1991) 및 Marks et al ., J. Mol . Biol., 222:581-597 (1991))에 기재된 기술을 이용하여 파지항체 라이브러리로부터 단리할 수 있다.

본 발명에서의 모노클로날 항체는 구체적으로, 목적하는 활성을 발휘한다면 중쇄 및(또는) 경쇄의 일부분이 특정 종으로부터 유래된 항체 또는 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이 있지만, 쇄(들)의 나머지는 다른 종으로부터 유래된 항체 또는 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 또는 그러한 항체의 단편과 동일하거나 상동성이 있는 "키메라" 항체를 포함한다(Morrison et al ., Proc . Natl . Acad . Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)).

비-인간 (예를 들어, 쥐과 동물) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유도된 최소서열을 포함하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 그의 단편 (예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원 결합 서열) 이다. 대부분의 경우 인간화 항체는 수용자의 상보성 결정 영역(CDR)의 잔기를 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 생쥐, 쥐 또는 토끼와 같은 인간 이외의 종(공여자 항체)의 CDR 잔기로 치환시킨 인간 면역글로불린(수용자 항체)을 포함한다. 몇몇 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 치환된다. 또한, 인간화 항체는 수용 항체, 또는 도입되는 CDR 또는 프레임워크 서열에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 하나 이상, 일반적으로 둘 이상의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함하며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 면역글로불린의 영역에 대응하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 서열의 영역에 해당한다. 또한, 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 일반적으로 인간면역글로불린 영역의 일부를 포함한다(Presta, Curr . Op . Struct . Biol. 2:593-596 (1992)).

본 발명의 브로디 신드롬, 근긴장증, 근육퇴행위축 또는 뇌성마비 진단용 조성물은 키트의 형태로 포함될 수 있다.

상기 키트는 STIM1 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 양을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체를 포함할 수 있고, 이들의 정의는 상술한 바와 같다.

상기 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합효소 보조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으며,

상기 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

또한, 본 발명의 브로디 신드롬, 근긴장증, 근육퇴행위축 또는 뇌성마비 진단용 조성물은 마이크로어레이의 형태로 포함될 수 있다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기 STIM1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기질(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기질은 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함할 수 있다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기 기질 상에 배열되고 고정화되며, 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기질에 결합될 수 있다.

한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료가 핵산일 경우에는 표지될 수 있고, 마이크로어레이 상의 어레이 요소와 혼성화 될 수 있다. 혼성화 조건은 다양할 수 있으며, 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 STIM1 유전자의 발현수준 또는 그 발현 단백질 수준을 측정하는 방법을 통해 브로디 신드롬, 근긴장증, 근육퇴행위축 또는 뇌성마비를 진단하는 방법을 제공하는데, 보다 구체적으로 상기 방법은, (a) 브로디 신드롬, 근긴장증, 근육퇴행위축 또는 뇌성마비 의심환자의 생물학적 시료로부터 STIM1 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 양을 측정하는 단계; 및 (b) 정상 대조군 시료로부터 상기 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 양을 측정하여 상기 (a) 단계의 측정결과와 비교하는 단계를 포함할 수 있다.

상기에서 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 양을 측정하는 방법은 공지의 기술을 이용하여 생물학적 시료로부터 mRNA 또는 단백질을 분리하는 공지의 공정을 포함하여 수행될 수 있다.

상기 생물학적 시료는 브로디 신드롬, 근긴장증, 근육퇴행위축 또는 뇌성마비 발생 또는 진행 정도에 따른 상기 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 수준이 정상 대조군과는 다른, 생체로부터 채취된 시료를 말하며, 상기 시료로는 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨 등이 포함될 수 있다.

상기 유전자의 발현 수준 측정은 바람직하게는 mRNA의 수준을 측정하는 것이며, mRNA의 수준을 측정하는 방법으로는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응, RNase 보호 분석법, 노던 블럿 및 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 단백질 수준의 측정은 항체를 이용할 수 있는데, 이러한 경우, 생물학적 시료 내의 상기 STIM1 단백질과 이에 특이적인 항체는 결합물, 즉, 항원-항체 복합체를 형성하며, 항원-항체 복합체의 형성양은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물질, 리간드, 발광물질, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 웨스턴 블럿, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있다.

따라서 본 발명은 상기와 같은 검출 방법들을 통하여, 대조군의 mRNA 발현 양 또는 단백질의 양과 브로디 신드롬, 근긴장증, 근육퇴행위축 또는 뇌성마비 의심환자에서의 mRNA 발현 양 또는 단백질의 양을 확인할 수 있고, 상기 발현 양의 정도를 대조군과 비교함으로써 브로디 신드롬, 근긴장증, 근육퇴행위축 또는 뇌성마비의 발병여부, 진행단계 등을 진단할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 상기 브로디 신드롬, 근긴장증, 근육퇴행위축 또는 뇌성마비의 진단방법은 본 발명에 따른 STIM1 유전자의 발현 수준 또는 그 발현 단백질의 양이 정상 대조군 시료에 비해 증가 또는 감소되었을 경우, 브로디 신드롬, 근긴장증, 근육퇴행위축 또는 뇌성마비가 유발된 것으로 판단할 수 있다.

또한, 본 발명의 의약 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다.

상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 의약 분야에서 통상 사용되는 담체 및 비히클을 포함하며, 구체적으로 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 각종 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소캄륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 또는 양모지 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제, 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

한 양태로서, 본 발명에 따른 조성물은 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 한스 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 완충 용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소듐 카르복시메틸셀룰로즈, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다.

본 발명의 조성물은 전신계 또는 국소적으로 투여될 수 있으며, 이러한 투여를 위해 공지의 기술로 적합한 제형으로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 불활성 희석제 또는 식용 담체와 혼합하거나, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐에 밀봉되거나 또는 정제로 압형하여 투여할 수 있다. 경구 투여용의 경우, 활성 화합물은 부형제와 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다.

주사용, 비경구 투여용 등의 각종 제형은 당해 기술 분야 공지된 기법 또는 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다. STIM1는 식염수 또는 완충액에 잘 용해되므로 냉동 건조 상태로 보관한 후, 유효량의 STIM1을 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등에 적합한 형태로 식염수 또는 완충액에 투여 직전에 용액으로 제제화하여 투여할 수도 있다.

본 발명의 의약 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 예방, 억제 또는 경감 효과를 이루는데 요구되는 양을 의미한다.

따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 예컨대, 성인의 경우, 1일 1회 내지 수회 투여 시, 본 발명의 폴리펩타이드, 단백질 또는 항체일 경우 0.1ng/kg 내지 10g/kg의 용량으로 투여할 수 있다.

본 발명은 또한 약제학적 유효량의 STIM1 단백질을 포함하는 브로디 신드롬의 예방 또는 치료용 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 동물의 브로디 신드롬 또는 근긴장증의 치료 방법을 제공한다.

상기 브로디 신드롬 또는 근긴장증의 치료 방법에 사용되는 약학적 조성물 및 투여 방법은 상기에서 설명하였으므로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

한편, 상기 브로디 신드롬 또는 근긴장증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 투여할 수 있는 개체는 모든 동물을 포함한다. 예를 들어, 개, 고양이, 생쥐와 같은 인간을 제외한 동물일 수 있다.

본 발명은 또한 기질 상호작용 분자 1(stromal interaction molecule 1: STIM1) 유전자를 후보물질과 인체 외에서 접촉시키고, 상기 후보물질이 상기 유전자의 발현을 촉진하는지 또는 억제하는지를 판단하는 것을 포함하는 브로디 신드롬(Brody syndrome) 또는 근긴장증(Myotonia)의 예방 또는 치료용 의약의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 기질 상호작용 분자 1(stromal interaction molecule 1: STIM1) 단백질을 후보물질과 인체 외에서 접촉시키고, 상기 후보물질이 상기 단백질의 기능 또는 활성을 증진하는지 또는 억제하는지를 판단하는 것을 포함하는 브로디 신드롬(Brody syndrome) 또는 근긴장증(Myotonia)의 예방 또는 치료용 의약의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 스크리닝 방법에 따르면, 먼저 상기 유전자 또는 단백질을 포함하는 브로디 신드롬 또는 근긴장증 세포에 분석하고자 하는 후보물질을 접촉시킬 수 있다.

상기 후보물질은 통상적인 선정방식에 따라 STIM1 유전자 염기서열에서 mRNA, 단백질로의 전사, 번역을 촉진하거나 억제하는 물질 또는 STIM1 단백질의 기능 또는 활성을 증진하거나 억제하는 의약으로서의 가능성을 지닌 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 펩타이드, 기타 추출물 또는 천연물, 화합물 등이 될 수 있다.

이후, 후보물질이 처리된 세포에서 상기 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성을 측정할 수 있으며, 측정 결과, 상기 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성이 증가 또는 감소하는 것이 측정되면 상기 후보물질은 브로디 신드롬 또는 근긴장증을 치료 또는 예방할 수 있는 물질로 판단할 수 있다.

상기에서 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성을 측정하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 수행될 수 있는데, 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay) 등을 이용하여 수행할 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법을 통해 얻은, 유전자 발현을 증진시키거나 단백질의 기능을 증진시키는 활성을 나타내는 후보물질은 브로디 신드롬 치료제 후보물질이 될 수 있다.

이와 같은 브로디 신드롬 또는 근긴장증 치료제 후보물질은 이후의 브로디 신드롬 또는 근긴장증 치료제 개발과정에서 선도물질(leading compound)로서 작용하게 되며, 선도물질이 STIM1 유전자 또는 그로부터 발현되는 단백질의 기능을 촉진 또는 억제효과를 나타낼 수 있도록 그 구조를 변형시키고 최적화함으로써, 새로운 브로디 신드롬 또는 근긴장증치료제를 개발할 수 있다.

본 발명에서 유전공학적 기술과 관련된 사항은 샘브룩 등의 문헌(Sambrook, et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001)) 및 프레드릭 등의 문헌(Frederick M. Ausubel et al., Current protocols in molecular biology volume 1, 2, 3, John Wiley & Sons, Inc. (1994))에 개시되어 있는 내용에 의해 보다 명확하게 된다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> GST-결합 STIM1-UI 단백질(GST-STIM1-UI)을 위한 cDNA 제작 및 발현

인간 STIM1 cDNA(GenBank accession number: NM_003156.3)를 대상으로 표 1에 제시된 PCR 프라이머들을 이용하여 PCR 수행하였다.

얻어진 PCR 합성체는 pGEX-4T-1에 제한효소 EcoR1과 Sal1을 이용하여 삽입하고, 만들어진 cDNA의 염기서열은 유전자 서열기를 통하여 다시 확인하였으며, E. coli(DH5α)로 형질전환하여 GST-STIM1-UI(도 1 참조) 단백질을 발현하고 GST 비드를 이용하여 정제하였다.

GST-STIM1-UI 단백질의 클로닝에 사용된 PCR 프라이머 서열과 사용한 제한효소

	PCR 프라이머		제한효소
GST-STIM1-UI	순방향	5’- CGGAATTCATGTCACTGGTGGCTGCCCTCAAC-3’	EcoRI
GST-STIM1-UI	역방향	5’-CGTCGACTCACCGGCCTGGGCTGGAGTCTGTTTC-3’	SalI

q-TOP MS를 통해 동정된 단백질 목록

밴드	단백질 명칭	Mascot #	질량 (Da)	종	대응 점수	대응 펩타이드
#1	대응 단백질 없음
#2	SERCA1a	gi\|18159010	110654	토끼	100	781.3 VGEATETALTTLVEK
#3	Chain A, chaperonin groel	gi\|1421648	57202	대장균	95	801.3 ANDAAGDGTTTATVLAQAIITEGLK
#4	Chain A, Ompf porin mutant D74a	gi\|6729727	37018	대장균	124	909.7; 1102.0 NSNFFGLVDGLNFAVQYLGK

(트라이아드 샘플 준비와 GST- STIM1-UI 단백질들과의 결합 반응)

토끼 골격근(rabbit fast-twitch skeletal muscle (등과 다리)에서 트라이아드 낭(triad vesicle)을 얻었고, 용해액(1% Triton X-100, 10 mM Tris-HCl, 1 mM Na₃VO₄, 10% 글리세롤, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, a protease inhibitor cocktail, pH 7.4)과 트라이아드 낭을 섞어 4℃에서 4시간 동안 용해(solubilize)하여 트라이아드 샘플을 얻었다. GST 구슬에 붙은 GST-STIM1 단백질에 트라이아드 샘플(150 ㎍)을 섞어서 4℃에서 8시간 동안 결합 반응을 진행하였고, 얻어진 구슬에 붙은 모든 단백질들은 SDS-PAGE 젤에서 분리하고 쿠마시 블루(Coomassie Blue) 염색을 통해서 가시화하였다.

(젤 상태 단백질 분해, 사극자 비행시간 질량분석(quadrupole time-of-flight mass spectrometry (qTOF MS)), 데이터 베이스 탐색)

결합 반응에서 얻어진 단백질은 젤 상태에서 트립신(trypsin)을 이용하여 단백질을 분해(digestion)하여, qTOF MS을 통해 분석하고, 분석 결과를 Mascot 데이터 베이스를 이용하여 탐색하였다.

도 1(A)는 STIM1, STIM1 도메인들, 및 본 발명에서 사용한 STIM1-UI(449-671 아미노산 서열)에 대한 도식을, 도 1(B)는 E. coli 에서 성공적으로 발현된 재조합 GST-STIM1-UI 단백질이 10% SDS-PAGE 젤에서 분리되어 쿠마시 블루로 염색된 GST와 GST-STIM1-UI 단백질(검은색 별표로 표시됨)을, 도 1(C)는 정제된 GST와 GST-STIM1-UI 단백질의 10% SDS-PAGE 결과 후, 쿠마시 블루 염색 결과, 도 1(D)는 GST-STIM1-UI 단백질(GST-fused STIM1 proteins)과 트라이아드 샘플(triad sample)과의 결합 반응(binding assay)을 통해 얻어진 단백질들이 10% SDS-PAGE 젤에 분리되고 쿠마시 블루로 염색된 영상을 나타낸 것이다. GST 단독은 음성 대조군(negative control)이고, GST-STIM1-UI 단백질들은 흰색 별표로 표시하였다. GST-STIM1-UI 단백질에 결합하여 나타난 단백질들에 대해서는 SR+STIM1-UI 샘플의 오른쪽에 흰색 점으로 표시하였고, 4개의 새롭게 발견된 밴드는 오른쪽에 표시되고 qTOF MS 분석에 사용하였다.

도 1에 나타난 바와 같이, STIM1과 STIM1-UI에 대한 아미노산 서열 도식과 GST-STIM1-UI 단백질(GST-fused STIM1 proteins)과 트라이아드 샘플과의 결합 반응으로 STIM1과 결합하는 단백질을 발견하였다.

도 2 내지 5는 도 1(D)에 도시된 새롭게 발견된 밴드 1 내지 4에 대한 qTOP MS 스펙트럼 결과를 나타낸 것으로, 도 2는 밴드 1에 대한 MS 스펙트럼으로, 현존하는 데이터베이스에는 대응하는 단백질이 발견되지 않았다. 도 3은 밴드 2에 대한 MS 스펙트럼으로 토끼에서 유래된 SERCA1a 에 대응하는 스펙트럼을 나타낸 것이다. 도 4는 밴드 3에 대한 MS 스펙트럼으로, 대장균에서 유래된 단백질에 대응하는 스펙트럼으로 결합 반응에서 들어간 대장균의 불특정 단백질이다. 도 5는 밴드 4에 대한 MS 스펙트럼으로, 대장균에서 유래된 단백질에 대응하는 스펙트럼으로 결합 반응에서 들어간 대장균의 불특정 단백질이다.

상기 결과로부터 GST-STIM1-UI 단백질은 SERCA1a와 결합함을 알 수 있었다.

<실시예 2>

(골격근 세포의 배양과 분화 유도)

생쥐의 골격근에서 일차 골격근 세포(primary skeletal muscle cell)를 분리하고 세포 배양액(F10 Nutrient Mixture 조성: 20% FBS, 100 units/mL 페니실린, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민, 20 nM basic fibroblast growth factor)을 처리하여 37℃ 조건의 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 사용한 배양 접시로는 용도에 따라서 10-cm 또는 96-웰 접시를 사용하였고, 모든 접시는 Matrigel로 코팅하여 사용하였다.

일차 골격근 세포가 배양 접시의 70% 가량을 차지할 정도로 자랐을 때, 세포의 분화(differentiation)를 유도하였다(세포 분화액 조성: 세포 배양액에서 20% FBS와 F-10 Nutrient Mixture 대신 5% heat-inactivated horse serum과 low-glucose DMEM을 사용하고, bFGF는 넣지 않음, 18% CO₂ 인큐베이터를 사용함). 분화가 완성된 세포는 분화골격근세포(myotube)라 하고, 광학현미경을 사용하여 분화골격근세포의 이미지를 얻었다.

(공동면역침전법, 면역탁본검사, 면역세포화학법 방법)

분화골격근세포(myotube)는 용해 용액(lysis buffer 조성: 1% Triton X-100, 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1 mM Na₃VO₄, 10% 글리세롤, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, protease inhibitors(1 ? pepstatin, 1 ? leupeptin, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 20 mg/mL aprotinin, 1 ? trypsin inhibitor))을 처리하여 24시간 동안 4℃에서 용해(solubilize) 시켰다. 이때 10-cm 배양 접시에서 자란 세포를 예로 들면, 300 ㎕의 용해 용액을 세포에 처리하고, 용해된 분화골격근세포 용액(총 단백질 30 ㎍)을 SDS-PAGE 젤로 분리한 뒤, 젤을 쿠마시 블루로 염색하거나, 또는 용해된 분화골격근세포 용액(총 단백질 800 ㎍)을 항-STIM1 항체(10 ㎍/mL)를 이용하여 공동면역침전법(co-immunoprecipitation)을 수행하고 얻어진 샘플은 항-STIM1 항체(1:1000), 항-SERCA1a 항체(1:1000) 및 항-액틴 항체를 이용하여 면역탁본검사(immunoblot assay)를 수행하였다. 면역세포화학법(immunocytochemistry)은 항-STIM1 항체(1:500), 항-SERCA1a 항체(1:500), Cy-3-컨쥬게이티드 항-생쥐 이차 항체(1:500), 그리고 FITC- 컨쥬게이티드 항 토끼 이차 항체(1:500, Sigma)를 이용하여 수행하였다.

도 6(A)의 결과를 통해 전체 크기(full-length)의 STIM1과 SERCA1a의 직접적 결합을 재확인하였다. 도 6(B)는 면역세포화학법을 통해 생쥐 분화골격근세포에서 STIM1과 SERCA1a이 핵 근처에서 서로 공존함을 확인(확대된 합병 이미지에서 흰색 화살표 머리로 표시됨)하여 직접적으로 결과를 재확인하였다.

상기 결과는 토끼의 골격근에서 얻은 샘플 및 생쥐 분화골격근세포를 사용하였으므로, 그 생명체에 원래 존재하는 전장 STIM1 단백질에 대한 실험 결과로, STIM1 단편을 이용한 도 1의 실험 결과는 원래 생명체가 가지고 있는 전장 STIM1에서도 동일하게 발견되고, 또한 종에 상관없이 모두 확인됨을 의미한다.

(STIM1 단백질 넉다운과 정량적 실시간 PCR(qPCR))

생쥐 STIM1(GenBank accession number: NM_009287.4)에 대한 siRNA는 siRNA 디자인 프로그램(Dharmacon RNAi Technologies)을 이용하여 합성하였다(표 3).

분화가 유도된 날로부터 3일째가 되는 미성숙 분화골격근세포에 4시간 동안 표 3에 제시된 siRNA를 처리하고, 분화 5일째가 되는 날(분화가 완성된 분화골격근세포)에 세포로부터 총 RNA를 얻어 cDNA로 역전사를 수행한 후에, 표 3에 제시된 PCR 프라이머를 통해 qPCR을 수행하여 STIM1에 대한 mRNA 수준을 확인하였다.

STIM1을 넉다운할 때 사용한 siRNA 와 qPCR 프라이머의 서열

siRNA 프라이머	센스	안티센스 프라이머
Scrambled siRNA	5’CUGCCGUCCAAAGUUGUAAUU 3’	5’UUACAACUUUGGACGGCAGUU3’
#1 siRNA	5’GGGAAGACCUCAAUUACCAUU 3’	5’UGGUAAUUGAGGUCUUCCCUU3’
#2 siRNA	5?CAGAGAAGGAGCUGGAAUUU 3’	5’AUUCCAGCUCCUUCUCUGCUU3’
qPCR 프라이머	정방향	역방향
	5?GAATGAGAGGAGCCGTCAA 3	5’GCCTCTCTGCATTTTGCTTC3’
	(PCR 예상 크기: 192 bp)

(분화된 세포 균질액 준비와 옥살레이트-보조 방사선 ⁴⁵칼슘-유입 측정)

STIM1이 넉다운 된 분화골격근세포는 균질화 용액(50 mM KH₂PO₄, 10 mM NaF, 1 mM EDTA, 0.3 M 수크로오스, protease inhibitor cocktail, and 0.5 mM DTT, pH 7.0)을 이용하여 균질화 되고, 얻어진 균질액(250 ㎍)은 준비 용액(40 mM imidazole, 100 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 5 mM NaN₃, 0.5 mM EGTA, pH 7.0.)과 섞고, ⁴⁵칼슘-유입 측정은 반응 용액(5 mM MgATP, 5 mM K-옥살레이트, 및 70 nM 또는 1μM의 유리 ⁴⁵Ca² ⁺)의 유입에 의해서 이루어졌으며, 0, 1, 2, 3, 4 분에 방사능의 변화를 측정하였다.

(통계 분석)

모든 데이터는 다수의 실험을 통해 얻어진 데이터들을 종합하여 ±S.E.로 표현하였다. 대조군에서 얻어진 수치를 1로 하고 그에 대한 상대적 변화를 표현하는 표준화비율(normalized ratio) 방식으로 표현하였다. 유의차(significant differences)는 paired t-test (GraphPad InStat, v2.04)를 이용하여 수행하였고, 유의차는 P<0.05 일 경우에 별표로 표시하였다. 그래프 작성은 Origin v7 프로그램을 사용하였다.

도 7(A)에 나타난 바와 같이, qPCR 을 통해 STIM1 mRNA 수준 확인한 결과, siRNA #2가 보다 효과적으로 STIM1을 넉다운 시킴을 알 수 있었다. 혼합 siRNA(scrambed siRNA)는 음성 대조군(negative control)으로 사용되었다.

도 7(B)는 STIM1의 단백질 수준이 siRNA(#2)에 의해서 94%수준 까지 감소함을 면역탁본법으로 확인한 결과이다. 더불어, STIM1 넉다운에 의해서 SERCA1a의 단백질 발현 수준에는 변함 없음을 확인하였다. 알파-액틴과 쿠마시 블루 염색 결과는 동량샘플 적용 기준으로 쓰였다.

도 7(C)에 나타난 바와 같이, STIM1이 넉다운 된 분화골격근세포의 분화과정은 영향을 받지 않음을 확인하였다.

도 7(D)에 나타난 바와 같이, 옥살레이트-보조 방사선 ⁴⁵칼슘-유입 (oxalate-supported ⁴⁵Ca² ⁺-uptake)을 STIM1이 넉다운된 분화골격근세포의 균질액에서 측정한 결과, 70 nM 의 자유 ⁴⁵Ca² ⁺ 상태에서, SR로의 ⁴⁵Ca² ⁺의 유입 양이 변하지 않았으나, 1μM 자유 ⁴⁵Ca² ⁺ 상태에서는 SR로의 ⁴⁵칼슘-유입이 현격히 감소됨이 관찰되었다(도 7(E)). 유의차는 P<0.05 일 경우에 별표로 표시하였다.

상기 결과로부터, 본 발명자들은 STIM1이 근세포질세망(SR)의 비워짐(depletion)에 의해서 작동되는 외부 칼슘 유입(store-operated Ca² ⁺ entry(SOCE))에 관여한다는 보고는 많았으나, SERCA1a에 결합하여 SERCA1a의 활성을 조절함을 최초로 발견하였다.

또한, STIM1과 SERCA1a와의 결합은 STIM1의 C-말단에 존재하는 449번째 아미노산부터 671번째 아미노산까지의 부분(STIM1-UI)에 의해 매개됨을 발견하였다. 토끼 골격근에서 얻어진 샘플에서 전장 STIM1과 SERCA1a의 결합을 확인하였고, 또한 생쥐에서 얻은 분화골격근세포에서 STIM1과 SERCA1a가 핵 주위에서 주로 공존함을 확인하여, STIM1과 SERCA1a의 결합은 종(species)에 관계없이 골격근 전반에 적용할 있는 결과임을 확인하였다.

또한, STIM1이 넉다운 된 분화골격근세포의 경우에, 마이크로몰 단위의 칼슘 존재 하에서, 정상 골격근 세포에 비해서 현격히 낮은 SERCA1a 활성(50% 가량)을 가짐을 확인하였다. 골격근 세포에서 STIM1은 SERCA1a에 직접적으로 결합하여 SERCA1a의 활성을 최대 상태로 유지하는 역할을 하는 것을 발견하였다. 따라서, STIM1은 골격근 세포의 세포질에 마이크로몰 단위의 칼슘이 존재하는 시기인 골격근 이완(skeletal muscle relaxation) 과정에서, 골격근의 수축이 100%로 일어나게 유지함에 매우 중요한 역할을 함을 의미하는 것이다.

<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Composition for preventing, diagnosing or treating skeletal muscle relaxation disorder-related diseases <130> P131057 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 223 <212> PRT <213> Homo sapiens stromal interaction molecule 1(STIM1) C-terminus <400> 1 Ser Leu Val Ala Ala Leu Asn Ile Asp Pro Ser Trp Met Gly Ser Thr 1 5 10 15 Arg Pro Asn Pro Ala His Phe Ile Met Thr Asp Asp Val Asp Asp Met 20 25 30 Asp Glu Glu Ile Val Ser Pro Leu Ser Met Gln Ser Pro Ser Leu Gln 35 40 45 Ser Ser Val Arg Gln Arg Leu Thr Glu Pro Gln His Gly Leu Gly Ser 50 55 60 Gln Arg Asp Leu Thr His Ser Asp Ser Glu Ser Ser Leu His Met Ser 65 70 75 80 Asp Arg Gln Arg Val Ala Pro Lys Pro Pro Gln Met Ser Arg Ala Ala 85 90 95 Asp Glu Ala Leu Asn Ala Met Thr Ser Asn Gly Ser His Arg Leu Ile 100 105 110 Glu Gly Val His Pro Gly Ser Leu Val Glu Lys Leu Pro Asp Ser Pro 115 120 125 Ala Leu Ala Lys Lys Ala Leu Leu Ala Leu Asn His Gly Leu Asp Lys 130 135 140 Ala His Ser Leu Met Glu Leu Ser Pro Ser Ala Pro Pro Gly Gly Ser 145 150 155 160 Pro His Leu Asp Ser Ser Arg Ser His Ser Pro Ser Ser Pro Asp Pro 165 170 175 Asp Thr Pro Ser Pro Val Gly Asp Ser Arg Ala Leu Gln Ala Ser Arg 180 185 190 Asn Thr Arg Ile Pro His Leu Ala Gly Lys Lys Ala Val Ala Glu Glu 195 200 205 Asp Asn Gly Ser Ile Gly Glu Glu Thr Asp Ser Ser Pro Gly Arg 210 215 220

Claims

기질 상호작용 분자 1(stromal interaction molecule 1: STIM1) 단백질과 SERCA1a의 복합체를 형성하는 조건에서, 상기 STIM1과 SERCA1a를 임의의 후보물질과 인체 외에서 접촉시키고,
상기 후보물질이 STIM1/SERCA1a 복합체의 형성을 촉진 또는 억제하는지 여부를 측정하고,
상기 후보물질이 STIM1/SERCA1a 복합체의 형성을 촉진하는 것으로 평가되는 경우 브로디 신드롬(Brody syndrome) 또는 근긴장증(Myotonia)을 예방 또는 치료하는 약물로 판정하는 것을 포함하는, 브로디 신드롬 또는 근긴장증의 예방 또는 치료용 의약의 스크리닝 방법.
제1항에 있어서,
STIM1/SERCA1a 복합체는 STIM1 단백질의 SERCA1a-binding region(STIM1-UI)와 SERCA1a의 결합을 통해 형성되고,
상기 SERCA1a-binding region(STIM1-UI)은 SEQ ID NO: 1에 기재된 아미노산 서열로 표시되는, 브로디 신드롬 또는 근긴장증의 예방 또는 치료용 의약의 스크리닝 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
STIM1 단백질은 인간, 생쥐, 집쥐, 토끼, 오랑우탄, 원숭이, 햄스터, 고양이, 돌고래 또는 고릴라 유래인, 브로디 신드롬 또는 근긴장증의 예방 또는 치료용 의약의 스크리닝 방법.
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