KR102292141B1 - 근육긴장저하 관련 질환의 예방 또는 치료용 약물의 스크리닝 방법 및 근육긴장저하의 진단을 위한 정보 제공 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 STIM1-R429C가 발현된 골격근 세포에서 미토콘드리아 과분열에 따른 미토콘드리아 모양 및 길이 변화가 발생하며, 이로 인해 감소된 ATP 양을 나타내는 것을 통해, 미토콘드리아 분열 및 융합에 관여하는 단백질들의 발현 수준과 ATP 양의 변화를 확인함으로써, 근육긴장저하 관련 질환을 진단하기 위한 정보를 제공할 수 있으며, 상기 단백질들의 발현 수준을 조절하여 근육긴장저하 관련 질환의 예방 또는 치료용 약물을 스크리닝할 수 있다.

Description

근육긴장저하 관련 질환의 예방 또는 치료용 약물의 스크리닝 방법 및 근육긴장저하의 진단을 위한 정보 제공 방법 {Screening method of therapeutics for preventing or treating of diseases associated with muscular hypotonia and method of providing information for diagnosis of diseases associated with muscular hypotonia}

본 발명은 근육긴장저하 관련 질환의 예방 또는 치료용 약물의 스크리닝 방법 및 근육긴장저하 관련 질환의 진단을 위한 정보제공방법에 관한 것이다.

근육긴장저하(muscular hypotonia)는 근육의 저항이 낮아진 상태를 말하며, 근육긴장저하 환자는 흔히 양팔과 다리를 힘없이 축 늘어뜨리는 모습을 하게 되고 머리를 잘 가누지 못하며, 이동, 자세 취하기, 호흡 및 발화에 곤란을 겪는다. 근육긴장저하는 지능에 직접적인 영향을 주지는 않으나, 발달기 아동에게서 사회적 능력, 언어, 그리고 전반적인 학습에 있어서 다른 사람들보다 지연을 초래한다. 특히, 근육긴장저하는 다운증후군(비특허문헌 1), 근이영양증(비특허문헌 2), 뇌성마비(비특허문헌 3), 프레더-윌리 증후군(비특허문헌 4) 및 테이-샥스병(비특허문헌 5)을 가진 사람들에게서 많이 발견되고, 근력이 떨어진 정상 고령자에게도 나타나고 있으며, 암, 에이즈, 노인성 질환 등에 대한 2차 질병 형태로도 나타난다. 근육긴장저하는 근육퇴행위축(muscular dystrophy)이나 뇌성마비(cerebral palsy)의 전조 증상으로 나타나 이들 병의 진행에 대한 사전 표시(indication)가 되기도 한다.

이에, 본 발명자들은 근육긴장저하, 그 중에서도 STIM1 단백질의 R429C 변이에 기인한 근육긴장저하의 진단 및 치료를 위한 작용기전을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

Nora Shields and Nicholas F Taylor, Journal of Physiotherapy (2010), 56: 187-193. Rafael-Fortney et al. Circulation (2011), 124:582-588. C.L. Chen et al. Research in Developmental Disabilities 33(2012), 1087-1094. Edouard et al. J Clin Endocrinol Metab (2012) 97: E275-E281. Shapiro et al. Genetics IN Medicine, (2009) 11(6): 425-433

본 발명의 목적은 근육긴장저하 관련 질환의 예방 또는 치료용 약물의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 근육긴장저하 관련 질환의 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 분화 골격근 세포에서 기질 상호작용 분자 1(stromal interaction molecule 1; STIM1)의 R429C 변이를 발현시킨 결과, 상기 R429C 변이가 골격근 세포의 외형에 영향을 미치지 않으면서 비정상적인 미토콘드리아의 발생과 이에 따른 ATP 생산 양 감소를 나타내는 것을 확인함으로써 미토콘드리아의 형태 변화 및 ATP 양 감소를 근육긴장저하의 진단 마커로 활용할 수 있을 뿐만 아니라, 미토콘드리아의 분열에 관여하는 단백질의 발현을 감소시키고 이에 대한 역작용을 하는 단백질의 발현은 증가시킴으로써 근육긴장저하를 치료할 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 근육긴장저하 관련 질환의 예방 또는 치료용 약물의 스크리닝 방법 및 근육긴장저하의 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 Drp1(Dynamin related protein 1) 유전자 또는 Mfn1(mitofusin 1) 유전자를 후보물질과 인체 외에서 접촉시키고,

상기 후보물질이 Drp1 유전자 또는 Mfn1 유전자의 발현을 촉진하는지 또는 억제하는지를 판단하는 것을 포함하는 근육긴장저하 관련 질환의 예방 또는 치료용 약물의 스크리닝 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 Drp1(Dynamin related protein 1) 단백질 또는 Mfn1(mitofusin 1) 단백질을 후보물질과 인체 외에서 접촉시키고,

상기 후보물질이 Drp1 단백질 또는 Mfn1의 기능 또는 활성을 촉진하는지 또는 억제하는지를 판단하는 것을 포함하는 근육긴장저하 관련 질환의 예방 또는 치료용 약물의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 스크리닝 방법에 따르면, 먼저 상기 Drp1 및/또는 Mfn1 유전자 또는 단백질을 포함하는 근육긴장저하 환자로부터 채취한 생물학적 시료에 분석하고자 하는 후보물질을 접촉시킬 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 후보물질은 통상적인 선정방식에 따라 Drp1 및/또는 Mfn1 유전자 염기서열에서 mRNA, 단백질로의 전사, 번역을 촉진하거나 억제하는 물질 또는 Drp1 및/또는 Mfn1 단백질의 기능 또는 활성을 증진하거나 억제, 넉다운(knock-down) 시키는 의약으로서의 가능성을 지닌 것으로 추정되는 물질 또는 무작위로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 펩타이드, 기타 추출물 또는 천연물, 화합물 등이 될 수 있다.

상기 스크리닝 방법은 근육세포를 후보물질과 인체 외에서 접촉시키고, 상기 후보물질이 ATP의 양을 증가시키는지 또는 감소시키는지 판단하는 것을 추가로 포함할 수 있다.

이에, 본 후보물질은 ATP의 양을 증가시키는 의약으로서의 가능성을 지닌 것으로 추정되는 물질 또는 무작위로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 펩타이드, 기타 추?물 또는 천연물, 화합물 등이 될 수 있다.

이후, 후보물질이 처리된 시료에서 상기 Drp1 및/또는 Mfn1 유전자의 발현양, 단백질의 양, 단백질의 활성을 측정 또는 확인할 수 있으며, 측정 결과, 상기 Drp1 및/또는 Mfn1 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성이 증가 또는 감소되는 것이 측정되면 상기 후보물질은 근육긴장저하 관련 질환을 치료할 수 있는 물질로 판단할 수 있다.

한 구체예에서, 후보물질이 Drp1 유전자의 발현을 억제시키는 것과 동시에 감소된 ATP의 양을 증가시키면 상기 후보물질을 근육긴장저하 관련 질환을 치료할 수 있는 물질로 판단할 수 있다. 또한, 후보물질이 Drp1 단백질의 기능 또는 활성을 억제시키는 것과 동시에 감소된 ATP의 양을 증가시키면 상기 후보물질을 근육긴장저하 관련 질환을 치료할 수 있는 물질로 판단할 수 있다.

다른 구체예에서, 후보물질이 Mfn1 유전자의 발현을 증가시키는 것과 동시에 감소된 ATP의 양을 증가시키면 상기 후보물질을 근육긴장저하 관련 질환을 치료할 수 있는 물질로 판단할 수 있다. 또한, 후보물질이 Mfn1 단백질의 기능 또는 활성을 촉진시키는 것과 동시에 감소된 ATP 의 양을 증가시키면 상기 후보물질을 근육긴장저하 관련 질환을 치료할 수 있는 물질로 판단할 수 있다.

상기 Drp1 및/또는 Mfn1 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 양을 측정하는 방법은 공지의 기술을 이용하여 생물학적 시료로부터 mRNA 또는 단백질을 분리하는 공지의 공정을 포함하여 수행될 수 있다.

상기 생물학적 시료는 근육긴장저하 발생 또는 진행 정도에 따른 상기 Drp1 및/또는 Mfn1 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 수준이 정상 대조군과는 다른, 생체로부터 채취된 시료를 말하며, 상기 시료로는 예컨대, 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨 등이 포함될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 방법에서 유전자의 발현양, 단백질의 양 또는 단백질의 활성을 측정하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 수행될 수 있는데, 예컨대 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcripatase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블랏, 노던 블랏, 서던 블랏, EMSA(electrophoric mobility shift assay), 면역형광염색(immunofluorescence), ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 방사선 면역분석(RIA; radioimmuno assay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion) 또는 면역침전분석(immunoprecipitation) 등을 이용하여 수행할 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법을 통해 얻은, 유전자 발현을 억제시키거나 단백질의 기능을 저하시키는 활성을 나타내는 후보물질은 근육긴장저하 관련 질환의 치료제의 후보물질이 될 수 있다. 즉, 본 발명에 있어서, 상기 스크리닝 방법에 따라 후보물질이 Drp1 유전자의 발현을 억제시키면 근육긴장저하 관련 질환의 치료제로 판정할 수 있으며, 상기 후보물질이 Drp1 단백질의 기능 또는 활성을 억제시키면 근육긴장저하 관련 질환의 치료제로 판정할 수 있다. 또한, 상기 스크리닝 방법에 따라 후보물질이 Mfn1 유전자의 발현을 촉진시키면 근육긴장저하 관련 질환의 치료제로 판정할 수 있으며, 상기 후보물질이 Mfn1 단백질의 기능 또는 활성을 촉진시키면 근육긴장저하 관련 질환의 치료제로 판정할 수 있다.

이와 같은 근육긴장저하 관련 질환의 치료제 후보물질은 이후의 근육긴장저하 관련 치료제 개발 과정에서 선도물질(leading compound)로서 작용하게 되며, 선도물질이 Drp1 및/또는 Mfn1 유전자 또는 그로부터 발현되는 단백질의 기능을 촉진 또는 억제 효과를 나타낼 수 있도록 그 구조를 변형시키고 최적화함으로써, 새로운 근육긴장저하 관련 질환의 치료제를 개발할 수 있다.

본 발명에서 유전공학적 기술과 관련된 사항은 샘브룩 등의 문헌(Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y(2001)) 및 프레드릭 등의 문헌(Prederick M. Ausubel et al. Current protocols in molecular biology volume 1, 2, 3, John Wiley & Sons, Inc. (1994))에 개시되어 있는 내용에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명에 있어서, “근육긴장저하(muscular hyotonia)”는 근육의 저항이 낮아진 상태를 의미하며, 근육긴장저하를 나타내는 환자들은 양팔과 다리를 힘없이 축 늘어뜨리거나, 머리를 잘 가누지 못해 이동, 자세 취하기, 호흡 또는 발화에 곤란을 겪는 증상을 보인다. 상기 근육긴장저하는 특히 다운증후군, 근이영양증, 뇌성마비, 프레더-윌리 증후군, 근긴장증, 테이-샥스병 환자에서 많이 발견되며, 근력이 약해진 고령자 또는 암, 에이즈, 노인성 질환 등에 대한 2차 질병의 형태로도 나타날 수 있다. 이에, 상기 “근육긴장저하 관련 질환”은 상기 근육긴장저하를 유발하는 다운증후군, 근이영양증, 뇌성마비, 프레더-윌리 증후군, 근긴장증 및 테이-샥스병으로 이루어진 군에서 선택된 질환일 수 있으며, 이에 제한 없이 근육긴장저하를 유발하는 질환이라면 모두 적용시킬 수 있다.

상기 근이영양증은 뒤시엔느 근이영양증(Dychenne muscular dystrophy), 벡커 근이영양증(Becker muscular dystrophy), 지대형 근이영양증(Limb-girdle muscular dystrophy), 안면견갑상완 근이영양증(Facioscapulohumeral muscular dystrophy) 또는 눈인두 근이영양증(Oculopharyngeal muscular dystrophy)를 포함할 수 있다.

예컨대, 본 발명의 근육긴장저하는 기질 상호작용 분자1(STIM1) 단백질의 R429C 변이가 발생하여 발병된 질환을 의미한다. 본 발명에서, 상기 STIM1 단백질의 R429C 변이는 “STIM1-R429C”와 상호교환적으로 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, “근육긴장저하 관련 질환”은 근육긴장저하를 동반하는 질환을 의미하며, 예컨대 다운증후군, 근이영양증, 뇌성마비, 프레더-윌리 증후군 또는 테이-샥스병일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 있어서, 상기 근육긴장저하 관련 질환은 STIM1-R429C에 의한 근육긴장저하일 수 있다.

본 발명에서, “기질 상호작용 분자 1(stromal interaction molecule 1; STIM1)”는 Orai1 칼슘채널을 활성화하여 Orai1 칼슘채널을 통해 세포 외부로부터 세포 안으로 칼슘 유입을 일으키는 단백질을 의미하며, 포유동물, 바람직하게는 인간, 생쥐, 집쥐, 토끼, 오랑우탄, 원숭이, 햄스터, 고양이, 돌고래, 고릴라 등에서 기원하는 단백질을 의미한다. 예컨대 상기 STIM1 단백질의 아미노산 서열은 GenBank accession no. NP_003149로, 그 유전자 서열은 GenBank accession no. NM_003156.3으로 각각 알려져 있다.

본 발명에서, “STIM1 단백질의 R429C 변이” 또는 “STIM1-R429C”는 STIM1 단백질의 429번째 위치의 R(알지닌)이 C(시스테인)으로 치환된 형태의 돌연변이를 의미한다.

하기 실시예에서는, STIM1-R429C가 발현된 분화 골격근 세포에서 골격근 세포의 외형 변화가 나타나지 않았음에도 미토콘드리아의 과분열이 발생하여 미토콘드리아의 모양 및 길이 변화가 나타나는 것을 확인하였다. 또한, 상기 변화된 미토콘드리아에 의해 ATP 양이 감소되었음을 확인하였다. 이를 통해 미토콘드리아의 분열 및/또는 융합에 관여하는 Drp1 및/또는 Mfn1의 발현 수준의 확인 및 ATP의 양 변화를 통해 근육긴장저하 관련 질환의 진단을 위한 정보를 제공할 수 있으며, 상기 Drp1 및/또는 Mfn1의 발현 조절에 관여하는 후보물질로부터 근육긴장저하 관련 질환을 치료할 수 있음을 확인하였다.

따라서, 근육긴장저하를 나타내는 질환, 예컨대 STIM1-R429C에 의한 근육긴장저하를 나타내는 경우, Drp1 유전자 또는 단백질의 발현을 억제하는 물질을 선택하거나, Mfn1 유전자 또는 단백질의 발현을 증가시키는 물질을 선택한다면, 근육긴장저하의 치료제로서 선택할 수 있다.

또한, 본 발명은 근육긴장저하 의심 개체로부터 분리한 생물학적 시료에서 근육세포 내 미토콘드리아의 모양 및 길이를 정상 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 근육긴장저하 관련 질환의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

본 발명에서, 상기 정보 제공 방법에 따라 정상 대조군과 비교하여 미토콘드리아의 모양 및 길이가 변화된 경우, 근육긴장저하가 발병하거나 근육긴장저하의 발병 가능성이 높은 것으로 판단할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 개체는 근육긴장저하를 나타내거나 근육긴장저하 의심 증상을 갖는 개체일 수 있으며, 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등의 가축을 포함할 수 있다.본 발명에 있어서, 상기 생물학적 시료는 조직, 혈액, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액, 뇨 또는 변일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 Drp1 및/또는 Mfn1의 발현 수준을 측정할 수 있는 마커를 포함하는 근육긴장저하 관련 질환의 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명에서, “진단”은 병리 상태를 확인하는 것을 의미하는 것으로서, 본 발명의 목적상 상기 진단은 근육긴장저하 관련 질환의 진단 마커의 발현 유무를 확인하여 이들 질환의 발병 여부, 발전 및 경감 여부를 확인하는 것을 의미한다.

본 발명에서, “진단 마커”는 근육긴장저하 관련 질환의 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질을 의미하며, 정상 세포에 비해 근육긴장저하 관련 질환의 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예컨대, mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명에서 제공하는 근육긴장저하 진단용 마커는 정상 세포에 비해 근육긴장저하가 나타나는 세포에서 발현 양이 증가 또는 감소하는 Drp1 및/또는 Mfn1 유전자로부터 발현된 단백질일 수 있다.

본 발명의 근육긴장저하 관련 질환의 진단용 조성물은 Drp1 및/또는 Mfn1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 상기 Drp1 및/또는 Mfn1 유전자로부터 발현된 단백질의 양을 측정하는 제제를 포함하고, 이러한 제제로 Drp1 및/또는 Mfn1 mRNA에 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드, 예컨대 Drp1 및/또는 Mfn1 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 핵산 프로브나 Drp1 및/또는 Mfn1 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 Drp1 저해제를 유효성분으로 포함하는 근육긴장저하 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 Drp1 저해제는 근육긴장저하 관련 질환에서 근력 증진 효과를 나타내는 약물을 의미한다. 예컨대, 상기 Drp1 저해제는 Drp1 유전자의 mRNA 발현 또는 이의 단백질의 발현을 넉다운(knock-down) 시키거나, 기능 또는 활성을 감소시키는 모든 제제를 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 Drp1 저해제는 Drp1 유전자에 상보적인 서열을 포함하는 안티센스-올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA, miRNa 또는 이를 포함하는 벡터; 또는 Drp1 단백질에 특이적인 항체 중 어느 하나 일 수 있다.

본 명세서에서, “siRNA”는 표적 유전자의 mRNA의 절단을 통해 RNA 간섭현상을 유도하는 이중사슬 RNA를 의미하며, 표적 유전자의 mRNA와 같은 서열을 가지는 센스서열의 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 서열의 RNA 가닥으로 구성된다.

상기 siRNA는 시험관 내에서 합성한 siRNA 자체 또는 siRNA를 코딩하는 염기서열을 발현 벡터에 삽입하여 발현되는 형태를 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 “벡터”는 폴리펩타이드를 코딩하는 게놈 내로 삽입된 외부 DNA를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.

본 발명과 관련된 벡터는 상기 유전자를 저해하는 핵산 서열이 게놈 내로 삽입된 벡터로서, 이들 벡터는 DNA 벡터, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터, 효모 벡터 또는 바이러스 벡터를 예로 들 수 있다.

또한, 상기 안티센스는 STIM1 유전자 또는 그의 단편으로부터 전사되는 mRNA 서열 전체 또는 일부와 상보적인 서열을 지니고, 상기 mRNA와 결합하여 상기 STIM1 유전자 또는 단편의 발현을 억제할 수 있다.

또한, 상기 shRNA(short hairpin RNA)는 인간 또는 생쥐상의 shRNA 공통 염기서열 부위를 표적으로 하여 통상의 방법에 따라 제작된 것을 사용할 수 있다.

또한, 항체는 STIM1 단백질에 대한 다클론 항체, 단클론 항체, 인간 항체 및 인간화 항체를 사용할 수 있다.

상기 항체 단편의 예로는, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디(diabody); 선형 항체(Zapata et al. Protein Eng. 8(10):1057-1062(1995)); 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이성 항체 등이 포함된다.

항체를 파파인(papain)으로 분해하면 2개의 동일한 항원 결합 단편, 즉 단일 항원 결합 부위가 있는 각 “Fab” 단편, 및 그 나머지인 “Fc” 단편이 생성된다. 펩신을 처리하면, 2개의 항원 결합 부위가 있으며 여전히 항원에 교차결합할 수 있는 F(ab')2 단편이 생성된다. Fv는 완전한 항원 인식 및 결합 부위를 포함하는 최소한의 항체 단편이다. 이 부위는 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 영역의 이합체로 구성되며 비공유결합으로 단단히 결합되어 있다.

다클론 항체의 제조방법은 당업자에게 공지되어 있다. 다클론 항체는 포유 동물에 1회 이상 면역화제를 주입, 필요한 경우 면역 보강제와 함께 주입하여 제조할 수 있다. 통상, 면역화제 및/또는 면역 보강제는 포유 동물에 피하주사 또는 복강내 주사로 수회 주입된다. 면역화제는 본 발명의 단백질 또는 이의 융합 단백질일 수 있다. 면역화되는 포유동물에 면역원성이 있는 것으로 공지된 단백질과 함께 면역화제를 주사하는 것이 효과적일 수 있다.

본 발명에 따른 단클론 항체는 문헌(Kohler et al. Nature, 256:495(1975))에 기재된 하이브리도마 방법으로 제조하거나 또는 재조합 DNA 방법(예를 들어, 미국 특허 제4,816,576호 참조)으로 제조할 수 있다. 단클론 항체는 또한, 문헌(Clackson et al. Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al. J. Mol. Biol., 222:581-597(1991))에 기재된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리할 수 있다.

본 발명에서의 단클론 항체는 구체적으로, 목적하는 활성을 발휘한다면 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분이 특정 종으로부터 유래된 항체 또는 특정 항체 클래스 또는 서브 클래스에 속하는 항체에 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이 있지만, 쇄(들)의 나머지는 다른 종으로부터 유래된 항체 또는 다른 항체 클래스 또는 서브 클래스에 속하는 항체 또는 그러한 항체의 단편과 동일하거나 상동성이 있는 “키메라” 항체를 포함한다(Morrison et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855(1984)).

비-인간(예컨대, 쥐과 동물) 항체의 “인간화” 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유도된 최소서열을 포함하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 그의 단편(예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원 결합 서열)이다. 대부분의 경우 인간화 항체는 수용자의 상보성 결정(CDR)의 잔기를 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 생쥐, 쥐 또는 토끼와 같은 인간 이외의 종(공여자 항체)의 CDR 잔기로 치환시킨 인간 면역글로불린(수용자 항체)을 포함한다. 몇몇 경우에 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 치환된다. 또한, 인간화 항체는 수용 항체, 또는 도입되는 CDR 또는 프레임워크 서열에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 인간화 항체는 하나 이상, 일반적으로 둘 이상의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함하며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 면역글로불린의 영역에 대응하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 서열의 영역에 해당한다. 또한, 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 일반적으로 인간 면역글로불린 영역의 일부를 포함한다(Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992)).

상기 약학 조성물은 Drp1 저해제를 통해 STIM1-R429C에 의한 과분열에 따른 미토콘드리아의 형태 변형을 억제할 수 있으므로, 근육긴장저하 관련 질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.

또한, 본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 의약 분야에서 통상적으로 사용되는 담체 및 비히클을 포함하며, 구체적으로 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 각종 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨 및 아연염), 교질성실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오즈계 기질, 폴리에틸렌글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈, 폴리아릴레이트, 왁스 또는 양모지 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

한 구체예에서, 본 발명에 따른 조성물은 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 한스 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 완충 용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소디움카르복시메틸셀룰로오즈, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다.

본 발명의 조성물은 전신계 또는 국소적으로 투여될 수 있으며, 이러한 투여를 위해 공지의 기술로 적하반 제형으로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 불활성 희석제 또는 식용 담체와 혼합하거나, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐에 밀봉되거나 또는 정제로 압형하여 투여할 수 있다. 경구 투여용의 경우, 활성 화합물은 부형제와 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다.

주사용, 비경구 투여용 등의 각종 제형은 당해 기술 분야 공지된 기법 또는 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다. 또한, 유효량의 STIM1 저해제를 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등에 적합한 형태로 식염수 또는 완충액에 투여 직전에 용액으로 제제화하여 투여할 수도 있다.

본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

또한, 본 발명은 치료상 유효량의 STIM1 저해제를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 근육긴장저하 또는 근육긴장저하 관련 질환의 치료 방법을 제공한다.

여기에서 사용된 대상체는 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.

본 명세서에서, "유효량"은 목적하는 치료되어야 할 특정 질환의 발병 또는 진행을 지연하거나 전적으로 중지시키는 데 필요한 양을 의미하며, 본 발명의 약학 조성물에 포함되는 STIM1 저해제의 유효량은 근육긴장저하 또는 다운증후군, 근이영양증, 뇌성마비, 근긴장증, 프레더-윌리 증후군 및 테이-샥스병에서 선택되는 질환에 있어서 근수축력의 강화 또는 근력 증진 효과를 이루는데 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 상기 유효량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 다른 성분의 종류 및 함량, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다.

본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.

본 명세서에서, “치료”는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화(즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감(부분적이거나 전체적으로), 검출 가능하거나 또는 검출되지 않거나의 여부를 포함한다. 또한, “치료”는 치료를 받지 않았을 때 예상되는 생존율과 비교하여 생존율을 늘이는 것을 의미할 수도 있다. “치료”는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방 조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다. 질병을 “완화”하는 것은 치료를 하지 않은 경우와 비교하여, 질병 상태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되거나 및/또는 진행의 시간적 추이(time course)가 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다.

또한, 본 발명은 Mfn1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는, 근육긴장저하 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 Mfn1 단백질은 천연에서 추출하거나 합성(Merrifield. J. Amer. Chem. Soc., 85:2149-2156, 1093) 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 유전자 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다(Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2판, 1989).

본 발명에서 상기 Mfn1 단백질을 코딩하는 유전자는 Mfn1 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 의미하며, 이들은 자연에서 분리되거나 인위적으로 합성 변형된 것일 수 있다. 즉, 천연형 DNA에 한정되는 것은 아니며, Mfn1 활성을 유지하는 범위 내에서 적절한 변형이 가해지거나 발현 조절을 위한 요소가 부가되거나, 유전공학적 방법 혹은 화학적 방법에 의해 얻어지는지 여부를 불문하고 본 발명의 목적에 적합하게 사용될 수 있는 것을 의미한다.

또한, 본 발명의 Mfn1 유전자는 벡터에 포함된 상태로 세포배양 시스템에서 적절한 진핵세포에 도입시켜 Mfn1을 직접적으로 발현시키거나, 원핵세포에 형질전환시켜 Mfn1 단백질을 발현시킨 후, 이들 단백질을 정제하여 사용할 수 있다. 이러한 본 발명의 Mfn1 단백질은 예를 들면 정제된 단백질, 수용성 단백질, 또는 표적 세포로의 전달 또는 투여를 위한 담체에 결합된 형태의 단백질이나 아미노산 잔기와 융합된 형태를 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물에서 Mfn1 단백질을 환부에 지속적으로 공급하기 위해 Mfn1 코딩 유전자를 삽입할 수 있는 벡터로는 레트로바이러스 (retrovirus) 벡터, 아데노바이러스 (adenovirus) 벡터, 아데노 관련 바이러스 (adeno-associated virus) 벡터 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스 (herpes simplex virus) 벡터와 같은 바이러스 유래 벡터와, 동물의 체내에서 발현될 수 있는 플라스미드 및 이들의 변형 벡터 등이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 약제학적 유효량의 Drp1 저해제; 및/또는 Mfn1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 근육긴장저하 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 근육긴장저하 관련 질환의 치료 방법을 제공한다.

상기 근육긴장저하 관련 질환의 치료 방법에 사용되는 약학 조성물 및 투여 방법은 상기에서 설명하였는바, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.

상기 근육긴장저하 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 투여할 수 있는 개체는 인간을 제외한 모든 동물을 포함한다. 예컨대, 개, 고양이, 생쥐와 같은 동물일 수 있다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

본 발명은 STIM1-R429C가 발현된 골격근 세포에서 미토콘드리아 과분열에 따른 미토콘드리아 모양 및 길이 변화가 발생하며, 이로 인해 감소된 ATP 양을 나타내는 것을 통해, 미토콘드리아 분열 및 융합에 관여하는 단백질들의 발현 수준과 ATP 양의 변화를 확인함으로써, 근육긴장저하 관련 질환을 진단하기 위한 정보를 제공할 수 있으며, 상기 단백질들의 발현 수준을 조절하여 근육긴장저하 관련 질환의 예방 또는 치료용 약물을 스크리닝할 수 있다.

도 1a는 STIM1 단백질 서열 상에서 R429의 위치를 표시한 것이고(S: signal peptide; cEF: canonical EF-hand domain; hEF: non-functional hidden EF-domain; SAM: sterile α-motif domain; T: transmembrane domain; C: coiled-coil domain; CAD/SOAR: Ca2+ release-activated Ca2+-activating domain/STIM1-Orai1-activating region; PS: Pro/Ser rich domain; L: Lys rich domain), 도 1b는 분화 골격근 세포에 CFP 벡터(control, 대조군), 야생형 STIM1, R429C의 발현을 확인한 결과이며, 도 1c는 정량적 실시간 유전자 증폭 실험으로, MyoD, myogenin 및 MHC에 대한 mRNA 양을 비교한 결과이고, 도 1d는 분화 골격근 세포의 너비를 측정한 결과이다.
도 2a는 R429C를 발현하는 분화 골격근 세포를 투과전자현미경으로 관찰한 결과이고, 도 2b는 R429C를 발현하는 분화 골격근 세포의 용해물에서 ATP 양(위)과 R429C를 발현하는 분화 골격근 세포에서 양파-형태 미토콘드리아를 제외한 나머지 미토콘드리아의 길이를 비교한 결과이다(아래).
도 3a는 R429C를 발현하는 분화 골격근 세포의 용해물에서 미토콘드리아의 분열과 융합에 관여하는 Drp1 및 Mfn1 단백질의 발현 양을 비교한 것이고, 도 3b는 R429C를 발현하는 분화 골격근 세포의 용해물에서 미토콘드리아의 분열에 관여하는 단백질의 활성을 증가시키는데 관여하는 calcineurin 및 CaMKII 단백질의 발현 양을 비교한 결과이다.

이하, 본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1.

R429C에 대한 cDNA 제작 및 발현

인간 STIM1 cDNA (GenBank accession number: NM_003156.3)를 견본으로 하여, 표 1의 PCR 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 이렇게 얻은 PCR 합성체는 pGEX-4T-1에 제한효소 EcoR1과 Sal1을 이용하여 삽입하고, 완성된 cDNA의 염기 서열은 단백질 서열기를 통하여 재차 확인하였으며, 대장균 (E.coli(DH5α))로 형질전환하여 GST-STIM1-UI(도 1 참조) 단백질로 발현하고, GST 구슬(bead)을 이용하여 정제를 하였다.

R429C에 대한 cDNA 제작을 위한 PCR 프라이머 서열
SEQ ID NO: 1 정방향 프라이머	5'-CATTGCGGGAGCGCCTGCACTGCTGGCAACAGATC-3'
SEQ ID NO: 2 역방향 프라이머	5'-GATCTGTTGCCAGCAGTGCAGGCGCTCCCGCAATG-3'

골격근 위성 세포 분리 및 분화 골격근 세포(myotube)로의 분화 방법

생쥐(mouse)의 골격근에서 골격근 위성 세포(satellite cells)를 분리하고, 이를 일차 배양(primary culture)하여 골격근 전구세포(myoblast)를 얻었다. 배양 과정에서, 세포 배양액(F10 Nutrient Mixture 조성: 20% FBS, 100 units/ml penicillin, 100 ㎍/ml streptomycin, 2 mM L-glutamine, 20 nM basic fibroblast growth factor(bFGF))을 처리하여 37℃ 조건의 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 사용한 배양 접시로는 용도에 따라 10-cm 또는 96-well 접시를 사용하였고, 모든 접시는 matrigel로 코팅하여 사용하였다. 골격근 세포가 배양 접시의 70% 가량을 차지할 정도로 증식했을 때, 분화 골격근 세포로의 분화(differentiation)를 유도하였다(세포 분화액 조성: 세포 배양액에서 20% FBS와 F-10 Nutrient Mixture 대신 5% heat-inactivated horse serum과 low-glocose DMEM을 사용하고, bFGF는 넣지 않았음, 18% CO2 인큐베이터 사용). 분화가 완성된 세포는 분화 골격근 세포(myotube)라 명명하고, 이하 실험에 사용하였다.

골격근 분화세포(myotube)에 야생형(wild-type) STIM1과 R429C의 발현

분화가 유도된 날로부터 3일째가 되는 골격근 미성숙 분화세포(immature myotubes)에 야생형 STIM1과 R429C에 대한 cDNA를 4시간 동안 유전자 전달 감염(cDNA transfection: 각각의 cDNA는 pMO91-CFP vector 형태로 되어 있으며, 10-cm 배양 접시에 배양된 세포를 예로 들 경우, 30 ㎕ FuGENE6, 20 ㎍ cDNA가 같이 처리됨) 시켰다. cDNA가 전달감염된 세포는 36시간동안 추가 분화를 유도하였다. 이 상태의 세포가 야생형 STIM1과 R429C를 발현하는 동시에 분화가 완성된 분화 세포이며, 이하 실험에 사용하였다.

면역세포화학법

분화 골격근 세포에서 야생형 STIM1과 R429C의 발현을 확인하고자 면역세포화학법(immunocytochemistry)을 수행하였다. 차가운 메탄올(cold methanol)로 30분동안 분화 골격근 세포를 고정한 뒤에, anti-GFP 항체(1:500)과 cy3-컨쥬게이트된 이차 항제(1:500, Sigma)를 이용하여 수행하였다.

정량적 실시간 유전자 증폭 방법

야생형 STIM1 또는 R429C에 대한 mRNA 수준을 확인하고자, 분화가 완성된 분화 골격근 세포로부터 전체 RNA(total RNA)를 얻어 cDNA로 역전사를 수행한 후, 각 단백질에 대한 하기 표 2의 PCR 프라이머를 이용하여 정량적 실시간 PCR(quantitative real-time PCR)을 수행하였다.

	프라이머 서열
MyoD	SEQ ID NO: 3 정방향 프라이머	5'-GACCTGCGCTTTTTTGAGGACC-3'
	SEQ ID NO: 4 역방향 프라이머	5'-CAGGCCCACAGCAAGCAGCGAC-3'
Myogenin	SEQ ID NO: 5 정방향 프라이머	5'-TTGCTCAGCTCCCTCAACCAGGA-3'
	SEQ ID NO: 6 역방향 프라이머	5'-TGCAGATTGTGGGCGTCTGTAGG-3'
MHC(type II)	SEQ ID NO: 7 정방향 프라이머	5'-GGCCAAAATCAAAGAGGTGA-3'
	SEQ ID NO: 8 역방향 프라이머	5'-CGTGCTTCTCCTTCTCAACC-3'
GAPDH(대조군)	SEQ ID NO: 9 정방향 프라이머	5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG- 3'
	SEQ ID NO: 10 역방향 프라이머	5'-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3'

투과 전자 현미경 관찰 방법

분화가 완성된 분화 골격근 세포의 미토콘드리아를 관찰하기 위해, 세포를 에폭시 레진에 고정하고 70 내지 80 nm의 두께로 잘라 준비하여 투과 전자 현미경으로 관찰하여 세포 사진을 얻었다. 세포 사진에서 미토콘드리아의 길이를 ImageJ 프로그램(http://imagej.nih.gov/ij)으로 측정하였다.

ATP 양 측정

분화가 완성된 분화 골격근 세포의 가장 두꺼운 부분의 길이를 ImageJ 프로그램을 이용하여 측정하였다.

면역탁본검사

분화 골격근 세포(myotube)를 사용한 면역탁본검사를 수행하기 위해, 분화 골격근 세포는 용해 용액(lysis buffer 조성: 1% Triton X-100, 10 mM Tris-HCl(pH7.4), 1 mM Na₃VO₄, 10% glycerol, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, protease inhibitors(1 μM pepstatin, 1 μM leupeptin, 1 mM phenylmethysulfonyl fluoride, 20 mg/ml aprotinin, 1 μM trypsin inhibitor))을 처리하여 4℃에서 24시간 동안 용해시켰다(solubilize). 이때 10-cm 배양 접시에서 분화된 분화 골격근 세포를 예를 들면, 300 ㎕의 용해 용액을 처리하였다. 용해 용액을 처리하여 얻은 용해물은 10% SDS-PAGE 젤에서 분리하고, 젤 상에서 분리된 단백질들은 PVDF(poly-vinylidenefluoride) 막으로 옮겨 (100V로 2시간 동안) 5% 무지방 우유(non-fat milk)를 1시간동안 처리하였다. 해당 일차 항체(3 내지 12시간 동안, anti-Drp1, anti-Mfn1, anti-calcineurin, anti-CaMKII, anti-actin 항체(1:1000))를 처리하고, 연이어 해당 이차 항체(horseradish peroxidase-conjugated secondary antibodies)를 45분 동안 처리한 후, 발색 반응(SuperSignal ultrachemiluminescent substrate, Pierce)을 통해 시각화 및 분석하였다.

데이터 분석

모든 데이터는 다수의 실험을 통해 얻어진 데이터들을 종합하여 ± S.E.로 표현하였다. mRNA 발현양 및 단백질 발현양 비교의 경우, 대조군에서 얻어진 수치를 1로 하고 그에 대한 상대적 변화를 표현하는 표준화 비율(normalized ratio) 방식으로 표현하였다. 유의차(significant differences)는 unpaired t-test(GraphPad InStat, v2.04)를 이용하여 수행하였고, 유의차는 P<0.05 일 경우에 별표로 표시하였다. 그래프 작성은 Origin v7 프로그램을 사용하였다.

실시예 2. 생쥐 분화 골격근 세포에서의 야생형 STIM1 또는 R429C의 발현 및 분화 상태 비교

1) 분화 골격근 세포에서의 R429C 발현 확인

분화 골격근 세포에 CFP 벡터(control, 대조군), 야생형 STIM1 및 R429C의 발현을 확인하였다. 도 1a는 STIM1 단백질 서열 상에서 R429C의 위치를 표시한 것으로, 숫자는 단백질 서열을 나타낸다. 야생형 STIM1 및 R429C의 발현 확인을 위해 CFP 항체와 Cy3 이차 항체를 이용하여 면역세포화학법으로 염색하여 도 1b에 나타내었다(흰색자: 100㎛).

2) R429C를 발현하는 생쥐 분화 골격근 세포에서의 MyoD, myogenin 및 MHC의 mRNA 발현 수준 비교

정량적 실시간 유전자 증폭 실험(qRT-PCR)으로, 각 유전자를 발현하는 분화 골격근 세포에서 분화의 정도에 따라 그 발현양이 달라지는 MyoD, myogenin, MHC에 대한 mRNA 양을 비교하였다. 분석과 통계에 사용된 실험의 횟수와 얻은 수치는 도 1c 및 하기 표 3의 괄호에 나타내었다. 대조군(GAPDH)의 수치를 1로 설정하고, 그에 대한 상대적 변화를 표준화 비율(normalized ratio)로 나타내었다.

	Control (대조군)	Wild-type STIM1 (야생형 STIM1)	R429C
MyoD	1.00 ± 0.02 (3)	1.22± 0.05 (3)	0.98 ± 0.14 (3)
Myogenin	1.00 ± 0.02 (3)	0.92 ± 0.05 (3)	1.07 ± 0.14 (3)
MHC	1.00 ± 0.15 (3)	1.00 ± 0.04 (3)	0.97 ± 0.25 (3)

3) R429C를 발현하는 생쥐 분화 골격근 세포의 너비 비교

분화 골격근 세포의 너비 측정을 위해 가장 두꺼운 부분의 너비를 측정하였다. 측정된 너비 값은 대조군과 비교하여 분석하였으며, 분석과 통계에 사용된 실험의 횟수와 얻은 수치는 도 1d 및 하기 표 4의 괄호에 나타내었다. 이때 대조군의 수치를 1로 설정하고, 그에 대한 상대적 변화를 표준화 비율로 표현하였다.

	Control (대조군)	Wild-type STIM1 (야생형 STIM1)	R429C
분화 골격근 세포의 너비	1.00 ± 0.05 (40)	1.02 ± 0.07 (40)	0.95 ± 0.07 (40)

투과전자현미경을 통한 분화 골격근 세포의 모양 관찰, 분화의 정도를 나타내는 단백질의 mRNA 발현 수준 비교, 및 분화 골격근 세포의 너비 관찰 등을 통해, R429C를 발현하는 분화 골격근 세포의 분화 상태를 다방면으로 살펴보았다. 그 결과, 분화의 정도에는 R429C에 의한 영향이 없음을 알 수 있었다. 이는 R429C가 근육긴장저하를 일으키지만, 골격근 세포의 외관(즉, 분화 정도)에는 영향을 미치지 않아 겉으로 보아서는 정상처럼 보였다. 이는 R429C에 기인된 골격근 질병을 세포 외관상으로 알아 볼 수 없음을 의미한다. 따라서, R429C에 기인된 골격근 질병을 쉽게 보여줄 수 있는 활성적 또는 내부적인 마커나 표지자가 필요함을 의미한다.

실시예 3. R429C를 발현하는 생쥐 분화 골격근 세포의 미토콘드리아 특징 및 관련 단백질의 발현양 비교

1) 투과전자현미경 관찰

R429C를 발현하는 분화 골격근 세포를 투과전자현미경으로 관찰하였다. 네모로 표시된 세 영역을 확대하여 미토콘드리아의 모양을 관찰하였다. 도 2a에서는 양파-형태의 미토콘드리아를 화살표로 표시하였고, 상대적으로 작은 미토콘드리아를 화살표 이중머리(double arrowheads)로 표시하였다(흰색자: 2㎛).

2) ATP 양 및 미토콘드리아 길이 비교

R429C를 발현하는 분화 골격근 세포 용해물(1mg/ml 당)에서 ATP 양을 비교하였다. *는 대조군과 비교하여 유의성 있는 다름을 표시한 것이며(P < 0.05), 분석과 통계에 사용된 실험의 횟수와 얻은 수치는 도 2b 및 하기 표 5에 괄호로 나타내었다.

또한, R429C를 발현하는 분화 골격근 세포에서, 양파-형태의 미토콘드리아를 제외한 나머지 미토콘드리아의 길이를 비교하였다. 결과를 하기 표 3 및 도 2b에 나타내었다.

		Control (대조군)	Wild-type STIM1 (야생형 STIM1)	R429C
ATP 양 (1 mg/ml myotube lysate, μM)		0.302 ± 0.006 (3)	0.305 ± 0.007 (3)	0.157 ± 0.008 * (3)
평균 미토콘드리아 길이 (μm)		1.72 ± 0.23(81)	1.80 ± 0.22 (57)	1.20 ± 0.17 * (57)
단백질 발현 수준	Drp-1	1.000 ± 0.000 (3)	0.979 ± 0.061 (3)	1.196 ± 0.114 * (3)
	Mfn-1	1.000 ± 0.000 (3))	0.990 ± 0.048 (3)	0.872 ± 0.070 * (3)
	calcineurin	1.000 ± 0.000(3)	0.992 ± 0.046 (3)	1.250 ± 0.043 * (3)
	CaMKII	1.000 ± 0.000(3)	1.025 ± 0.027 (3)	1.263 ± 0.054 * (3)

투과전자현미경으로 관찰한 결과, 양파-형태의 비정상적 미토콘드리아 또는 작은 미토콘드리아가 R429C에 의해 유도됨을 발견하였다. 또한 이러한 비정상적 미토콘드리아를 가진 분화 골격근 세포는 적은 양의 ATP를 생산하고 있음을 발견하였다. 이는 R429C에 기인된 골격근 질병이 비정상적 형태 또는 작은 미토콘드리아를 보이고, 이러한 비정상적 미노콘드리아는 ATP 생산에 비효율적임을 의미한다. 따라서, 생체 조직 검사(biopsy)에서 비정상적 형태의 미토콘드리아가 발견되거나 ATP 양의 현저한 감소가 발견된다면, R429C에 기인된 골격근 질병은 물론 다른 골격근 질병이 발병되었음을 알 수 있다. 즉, 비정상적 미토콘드리아 형태 또는 ATP의 양 저하가 골격근 질병 진단의 마커나 표지자가 될 수 있음을 의미한다.

3) 미토콘드리아 분열(fission) 및 융합(fusion)에 관여하는 단백질의 발현 양 비교

R429C를 발현하는 분화 골격근 세포 용해물에서 미토콘드리아의 분열(fission)과 융합(fusion)에 관여하는 Drp-1 및 Mfn-1 단백질의 발현 양을 비교하였다. 대조군으로서 α-action 단백질 발현 양의 수치를 1로 설정하고, 분석과 통계에 사용된 실험의 횟수와 얻은 수치는 도 3a 및 상기 표 5에 나타내었다. *는 대조군과 비교하여 유의성 있는 다름을 표시한 것이다(P < 0.05).

4) 미토콘드리아 분열에 관여하는 calcineurin과 CaMKII 단백질의 발현 양 비교

R429C를 발현하는 분화 골격근 세포 용해물에서 미토콘드리아의 분열에 관여하는 Drp-1의 활성을 높이는데 관여하는 calcineurin 및 CaMKII 단백질의 발현 양을 비교하였다. 대조군으로서 α-actin 단백질의 발현 양의 수치를 1로 하고, 그에 대한 상대적 변화를 표준화 비율로 표시하였다. 분석과 통계에 사용된 실험의 횟수와 얻은 수치는 도 3b 및 상기 표 5에 나타내었다.

R429C를 발현하는 분화 골격근 세포에서 미토콘드리아의 형태 및 길이 변화에 관여하는 단백질의 발현 양을 비교한 결과, 미토콘드리아의 분열(작은 미토콘드리아 발생 유도)에 관여하는 Drp-1 단백질의 발현 및 Drp-1의 활성을 촉진하는 calcineurin 또는 CaMKII 단백질의 발현은 증가하는 반면, 이들에 대한 역작용을 하는 Mfn-1의 발현은 줄어듦을 확인할 수 있었다. 이는 R429C에 기인된 골격근 질병이 미토콘드리아의 과다한 분열에 의해 유발될 수 있음을 의미한다. 따라서 Drp-1 단백질의 발현을 줄이거나, Mfn-1의 발현을 증가시킨다면 R429C에 기인된 골격근 질병을 치료할 수 있다. 즉, 미토콘드리아의 분열은 줄이고 융합을 촉진하는 Drp-1과 Mfn-1의 발현(mRNA, 단백질)의 조절을 통해 근육긴장저하를 치료할 수 있다.

<110> THE CATHOLIC UNIVERSITY OF KOREA INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Screening method of therapeutics for preventing or treating of diseases associated with muscular hypotonia and method of providing information for diagnosis of diseases associated with muscular hypotonia <130> P19U11C1756 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R429C_primer_F <400> 1 cattgcggga gcgcctgcac tgctggcaac agatc 35 <210> 2 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R429C_primer_R <400> 2 gatctgttgc cagcagtgca ggcgctcccg caatg 35 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MyoD_primer_F <400> 3 gacctgcgct tttttgagga cc 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MyoD_primer_R <400> 4 caggcccaca gcaagcagcg ac 22 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Myogenin_primer_F <400> 5 ttgctcagct ccctcaacca gga 23 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Myogenin_primer_R <400> 6 tgcagattgt gggcgtctgt agg 23 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MHC(typeII)_primer_F <400> 7 ggccaaaatc aaagaggtga 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MHC(typeII)_primer_R <400> 8 cgtgcttctc cttctcaacc 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_primer_F <400> 9 aggtcggtgt gaacggattt g 21 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_primer_R <400> 10 tgtagaccat gtagttgagg tca 23

Claims (11)

1. 근육긴장저하 의심 개체로부터 분리한 생물학적 시료에서 근육세포 내 미토콘드리아의 모양 및 길이를 정상 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, STIM1 단백질의 R429C 변이의 발생에 의한 근육긴장저하 관련 질환의 진단을 위한 정보 제공 방법.
2. 제1항에 있어서,
   정상 대조군과 비교하여 미토콘드리아의 모양 및 길이가 변화된 경우,
   STIM1 단백질의 R429C 변이의 발생에 의한 근육긴장저하 관련 질환이 발병하거나, STIM1 단백질의 R429C 변이의 발생에 의한 근육긴장저하 관련 질환의 발병 가능성이 높은 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는, STIM1 단백질의 R429C 변이의 발생에 의한 근육긴장저하 관련 질환의 진단을 위한 정보 제공 방법.
3. 제1항에 있어서,
   생물학적 시료는 조직, 혈액, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇨 또는 변인, STIM1 단백질의 R429C 변이의 발생에 의한 근육긴장저하 관련 질환의 진단을 위한 정보 제공 방법.
4. 제1항에 있어서,
   근육긴장저하 관련 질환은 다운증후군, 근이영양증, 뇌성마비, 프레더-윌리 증후군 및 테이-샥스병으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, STIM1 단백질의 R429C 변이의 발생에 의한 근육긴장저하 관련 질환의 진단을 위한 정보 제공 방법.
5. 근육긴장저하 의심 개체로부터 분리한 생물학적 시료에서 근육세포의 Drp1(Dynamin related protein 1) 및 Mfn1(mitofusin 1) 중 하나 이상의 발현 수준을 정상 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, STIM1 단백질의 R429C 변이의 발생에 의한 근육긴장저하 관련 질환의 진단을 위한 정보 제공 방법.
6. 제5항에 있어서,
   정상 대조군과 비교하여 근육세포의 Drp1의 발현이 증가한 경우,
   STIM1 단백질의 R429C 변이의 발생에 의한 근육긴장저하 관련 질환이 발병하거나, STIM1 단백질의 R429C 변이의 발생에 의한 근육긴장저하 관련 질환의 발병 가능성이 높은 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는, STIM1 단백질의 R429C 변이의 발생에 의한 근육긴장저하 관련 질환의 진단을 위한 정보 제공 방법.
7. 제5항에 있어서,
   정상 대조군과 비교하여 근육세포의 Mfn1의 발현이 감소한 경우,
   STIM1 단백질의 R429C 변이의 발생에 의한 근육긴장저하 관련 질환이 발병하거나, STIM1 단백질의 R429C 변이의 발생에 의한 근육긴장저하 관련 질환의 발병 가능성이 높은 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는 STIM1 단백질의 R429C 변이의 발생에 의한 근육긴장저하 관련 질환의 진단을 위한 정보 제공 방법.
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