WO2016190480A1 - 미토콘드리아 분열 조절제의 스크리닝 방법 - Google Patents

미토콘드리아 분열 조절제의 스크리닝 방법 Download PDF

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WO2016190480A1
WO2016190480A1 PCT/KR2015/006825 KR2015006825W WO2016190480A1 WO 2016190480 A1 WO2016190480 A1 WO 2016190480A1 KR 2015006825 W KR2015006825 W KR 2015006825W WO 2016190480 A1 WO2016190480 A1 WO 2016190480A1
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mitochondrial
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최철희
김은수
최경선
류승욱
하지강
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재단법인 지능형 바이오 시스템 설계 및 합성 연구단
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Definitions

  • the present invention relates to a method for screening a mitochondrial cleavage regulator, and more particularly, the present invention relates to a method for screening a mitochondrial cleavage regulator using cells treated with a PPD (protopanaxadiol) ginsenoside compound, the PPD ginsenoside compound It relates to a mitochondrial cleavage regulator screening composition comprising a and a kit comprising the composition.
  • a PPD protopanaxadiol
  • Mitochondria are cellular organelles present in most eukaryotic cells.
  • One of the main functions of mitochondria is oxidative phosphorylation, through which the energy derived from the metabolism of fuel substances such as glucose or fatty acids is converted into ATP, which is used to drive various energy-required biosynthesis and other metabolic activities. .
  • mitochondria are composed of outer and inner membranes and are dynamic organelles that constantly move, fuse, and divide. Mitochondria form a tubular network connected to each other, and their morphology and number are precisely controlled by the mitochondrial fusion-fission machinery.
  • mitofusin 1 mitofusin 1
  • mitofusin 2 mitofusin 2
  • Opa1 proteins involved in mitochondrial binding
  • Drp1 and Fis1 proteins involved in mitochondrial cleavage.
  • Korean Patent Laid-Open Publication No. 2002-0042020 discloses a dihydroxybenzaldehyde compound that effectively inhibits damage caused by hydroxy radicals of mitochondria
  • Korean Patent Publication No. 2014-0000733 discloses a mitochondrial damage.
  • a composition for preventing and treating Parkinson's disease comprising N-terminal removed ubiquitin C-terminal hydrolase-L1 as an active ingredient, which plays a major role in the regulation of stress.
  • the present inventors earnestly researched to develop a method for effectively discovering an agent capable of controlling the damage of mitochondria, and as a result, when using PPD-type ginsenoside compounds that can promote the division of mitochondria in isolated cells, mitochondrial damage It was confirmed that the inhibitor can be effectively excavated, and the present invention was completed.
  • One object of the present invention is to provide a method for screening a mitochondrial division regulator using cells treated with PPD class ginsenoside compounds.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for screening mitochondrial cleavage regulators comprising the PPD ginsenoside compound.
  • Still another object of the present invention is to provide a kit for screening a mitochondrial cleavage regulator comprising the composition.
  • the method of screening the mitochondrial cleavage regulator of the present invention it is possible to effectively find a preparation that can prevent, improve or treat mitochondrial-related diseases by controlling the cleavage of mitochondria, can be widely used in the development of therapeutic agents for mitochondrial-related diseases There will be.
  • FIG. 1 shows the survival rate of MCF-7 cells in which PPD-type ginsenoside compounds (F2, Rh2, CK or PPD) at various concentrations (0, 5, 10, 20, 50, 100 or 200 ⁇ g / ml) are breast cancer cell lines. It is a graph showing the result of comparing the effect.
  • PPD-type ginsenoside compounds F2, Rh2, CK or PPD
  • Figure 2a is a graph showing the results of comparing the effects of PPD ginsenoside compounds on the anticancer activity of cancer cells.
  • Figure 2b is a graph showing the results of comparing the survival rate of breast cancer cells co-treated with CK or PPD and various concentrations of doxorubicin, ( ⁇ ) represents a negative control, ( ⁇ ) represents a positive control, ( ⁇ ) The experimental group treated with CK is indicated, and ( ⁇ ) represents the experimental group treated with PPD.
  • Figure 3a is a Western blot analysis picture showing the result of comparing the expression level of apoptosis-related protein in breast cancer cells treated with C-K or PPD and doxorubicin simultaneously.
  • Figure 3b is a Western blot analysis picture showing the result of comparing the expression level of apoptosis-related protein with treatment time in breast cancer cells treated with PPD and doxorubicin at the same time.
  • Figure 3c is a graph showing the results of comparing the effect of PARP or caspase-9 activity inhibitors on the anticancer effect by the simultaneous treatment of C-K or PPD and doxorubicin.
  • 4A is an immunofluorescence staining photograph showing the change in the level of cytochrome-C released from mitochondria by simultaneous treatment of C-K or PPD with doxorubicin.
  • Figure 4b is a graph showing the number of cytochrome-C released from the mitochondria by the simultaneous treatment time of C-K or PPD and doxorubicin.
  • Figure 5a is a photograph showing the result of fluorescence staining of mitochondria contained in MCF-7 cells treated with C-K or PPD.
  • Figure 5b shows the expression level of proteins involved in mitochondrial cleavage (Drp1, Fis1 or OPA-3) expressed in CK or PPD treated MCF-7 cells and proteins involved in mitochondrial fusion (Mfn1. Mfn2 or OPA1). This picture shows the results of Western blot analysis.
  • Figure 6a is a Western blot analysis picture showing the results of confirming the inhibition of the expression of the protein by siRNA that inhibits the expression of proteins (Mfn1 or Mfn2) involved in mitochondrial fusion.
  • Figure 6b is a graph showing the results of comparing the anticancer activity of doxorubicin and tamoxifen against the cells induced mitochondrial division.
  • Figure 7 is a schematic diagram showing the anticancer activity mechanism of the anticancer agent provided by the present invention and the anticancer agent showing mitochondrial mediated anticancer activity.
  • the present inventors have been paying attention to the phenomenon of mitochondria cleavage while conducting various studies to develop a method for effectively discovering an agent that can effectively control the damage of various mitochondria.
  • mitochondria regulate their activity by repeating fusion and cleavage.
  • the fused mitochondria can perform the main functions of mitochondria such as ATP production, and the cleaved mitochondria multiply the number of mitochondria so that the overall activity of mitochondria is increased.
  • the cleavage of the mitochondria occurs during the segmentation by the damage of the mitochondria, the cleavage of the mitochondria is known to play a key role that can activate or damage the mitochondria. Therefore, by developing a formulation that can control the cleavage of the mitochondria, it can be used to more effectively treat diseases caused by the damage of the mitochondria.
  • the mitochondria in order to develop an agent that regulates the cleavage of mitochondria, the mitochondria must be maintained in artificial cleavage state, and thus the present inventors are conducting various studies to develop an agent capable of inducing mitochondrial cleavage, while PPD (protopanaxadiol ) Ginsenoside compounds reduce the expression of proteins involved in the fusion of mitochondria (eg, Mfn2, etc.) and increase the expression of proteins involved in the division of mitochondria (eg, OPA-3, etc.) It was confirmed.
  • PPD protopanaxadiol
  • Ginsenoside compounds reduce the expression of proteins involved in the fusion of mitochondria (eg, Mfn2, etc.) and increase the expression of proteins involved in the division of mitochondria (eg, OPA-3, etc.) It was confirmed.
  • the treatment of the protopanaxadiol (PPD) -like ginsenoside compound and the candidate substance expected to be able to regulate the cleavage of mitochondria in the isolated cells, and the mitochondria It provides a method for screening a mitochondrial cleavage regulator comprising the step of measuring the level of cleavage.
  • the method for screening a mitochondrial cleavage regulator of the present invention comprises: (a) a candidate compound treatment step of treating a candidate compound expected to be able to control the cleavage of PPD ginsenoside compound and mitochondria to the separated cells; (b) measuring the level of cleavage of mitochondria in the cells treated with the candidate compound; And (c) selecting a candidate compound that promotes or inhibits the level of cleavage of the mitochondria as compared to the negative control not treated with the candidate compound.
  • the separated cells are not particularly limited as long as they can induce mitochondrial division by PPD-type ginsenoside compounds, but may be, for example, insulin secreting cells, cancer cells, and the like.
  • the level of cleaved mitochondria is observed under a microscope, the expression level of proteins involved in the fusion of mitochondria (eg, Mfn1, Mfn2, OPA1, etc.) or the proteins involved in the cleavage of mitochondria (eg, Drp1, Fis1, OPA-3, etc.) can be performed by measuring the expression level.
  • the candidate may be selected as a regulator that promotes the division of mitochondria, and the level of mitochondria cleaved in the cells treated with the candidate is increased.
  • the candidate When reduced, the candidate may be selected as a regulator that inhibits the cleavage of the mitochondria, and if the expression level of the protein involved in the fusion of the mitochondria in the cells treated with the candidate decreases, the candidate promotes the cleavage of the mitochondria. If the expression level of the protein involved in the fusion of the mitochondria in the cells treated with the candidate is increased, the candidate may be selected as a regulator that inhibits the cleavage of the mitochondria, and the candidate is treated.
  • the candidate may be selected as a regulator that promotes the division of the mitochondria, and if the expression level of the protein involved in the division of the mitochondria is reduced in the cells treated with the candidate, the candidate is regulated to inhibit the division of the mitochondria. Can be screened to zero.
  • the method for measuring the cleavage of the mitochondria can be any method known in the art in addition to the above-described method, it is apparent that those skilled in the art can selectively use the known method as needed.
  • Mitochondrial cleavage regulators discovered through the screening method of mitochondrial cleavage regulator provided by the present invention can promote or inhibit the level of mitochondrial cleavage, thereby improving or treating diseases caused by mitochondrial damage caused by cleavage of mitochondria.
  • the disease caused by the mitochondrial damage is not particularly limited, metabolic diseases (diabetes, etc.), degenerative brain diseases (such as Parkinson's disease, Alzheimer's disease), liver dysfunction, myopathy, autoimmune diseases (such as rheumatoid arthritis) This can be used.
  • PPD protopanaxadiol
  • the PPD ginsenoside compound may be interpreted to be a compound that damages the intracellular mitochondria and plays a role in assisting the anticancer activity of an anticancer agent showing mitochondrial mediated anticancer activity.
  • the PPD ginsenoside compounds may be those extracted from ginseng, red ginseng, or the like, or may be chemically synthesized.
  • PPD protopanaxadiol
  • the PPD can be used in a method for screening an agent capable of controlling the division of mitochondria by promoting mitochondrial division, and the concentration that can be used to promote mitochondrial division does not show cytotoxicity by itself.
  • the present invention is not particularly limited so long as it can promote the cleavage of the mitochondria, but as an example, the treatment concentration may be 10 ⁇ g / ml or less, and as another example, the treatment concentration may be 0.1-10 ⁇ g / ml. In another example, the treatment concentration may be 5 to 10 ⁇ g / ml.
  • compound-K (CK) of the present invention is not present in the ginseng itself, but saponins such as ginsenosides Rb1, Rb2, Rc, and Rd present in ginseng or red ginseng are intestinal, such as bifidus bacteria.
  • the CK may be used in a method for screening an agent capable of controlling the cleavage of mitochondria by promoting mitochondrial cleavage, the concentration that can be used to promote mitochondrial cleavage by itself does not exhibit cytotoxicity
  • the present invention is not particularly limited so long as it can promote the cleavage of the mitochondria, but as an example, the treatment concentration may be 10 ⁇ g / ml or less, and as another example, the treatment concentration may be 0.1-10 ⁇ g / ml. In another example, the treatment concentration may be 5 to 10 ⁇ g / ml.
  • PPD ginsenoside compounds may exhibit concentration-dependent anticancer activity against breast cancer cells (FIG. 1), but some compounds (CK or PPD) when treated at a dose that does not exhibit anticancer activity ) Inhibits the expression of proteins involved in the fusion of mitochondria of breast cancer cells, and can promote the expression of proteins involved in mitochondrial division (Figs. 5a and 5b).
  • PPD or C-K belonging to the PPD ginsenoside compounds may be used in a method for screening an agent capable of promoting the cleavage of the mitochondria and controlling the cleavage of the mitochondria.
  • the present invention provides a composition for screening a mitochondrial cleavage regulator comprising a PPD ginsenoside compound and a kit for screening a mitochondrial cleavage regulator comprising the composition.
  • the PPD ginsenoside compounds included in the compositions and kits can promote the division of mitochondria in the cell, so the compositions and kits can be used to screen for mitochondrial division regulators.
  • the kit may include not only PPD ginsenoside compounds but also one or more other constituent compositions, solutions or devices suitable for a method of determining whether a candidate substance can control mitochondrial cleavage.
  • Appropriate buffers used for the measurement, fluorescent materials (FITC, RITC, etc.) used to measure the level of expression of proteins involved in the fusion or cleavage of the mitochondria may be further included.
  • the kit for screening mitochondrial cleavage regulator of the present invention may be a kit containing essential elements necessary for performing Western blot analysis to measure the expression level of proteins involved in the fusion or cleavage of the mitochondria. That is, the kit may include a cell disruption buffer, a primary antibody, a secondary antibody, a secondary antibody detection agent, a buffer required for Western blot analysis, a test tube, or other suitable container.
  • the kit for screening the mitochondrial cleavage regulator of the present invention may be a kit containing essential elements necessary for performing the RT-PCR to measure the expression level of the protein involved in the fusion or cleavage of the mitochondria.
  • the kit includes a primer pair specific for the DNA of the protein involved in the fusion or cleavage of the mitochondria, a test tube or other appropriate container, reaction buffers (pH and magnesium concentrations vary), deoxynucleotides (dNTPs). ), Enzymes such as Taq-polymerase and reverse transcriptase, DNase, RNAse inhibitors, DEPC-water, sterile water, and the like. It may also comprise primer pairs specific for the genes used as quantitative controls.
  • human breast cancer cell line MCF-7 cells were inoculated in DMEM medium containing 10% FBS and 1% penicillin / streptomycin, and cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 conditions. Subcultured at 5 to 5 day intervals.
  • PPD ginsenoside compounds F2, Rh2, CK or PPD
  • F2, Rh2, CK or PPD PPD ginsenoside compounds at various concentrations (0, 5, 10, 20, 50, 100 or 200 ⁇ g / ml) were cultured in the cultured MCF-7 cells for 24 hours. And the survival rate of these cells was determined by performing WST-1 analysis on the cells (FIG. 1). At this time, the WST-1 assay inoculated each cell into a medium containing 10% EZ-Cytox and reacted at 37 ° C. for 1.5 hours, and then absorbed (450 nm) the level of the water-soluble formazan dye produced by the viable cells. ) was measured and analyzed to calculate cell viability.
  • FIG. 1 shows the survival rate of MCF-7 cells in which PPD-type ginsenoside compounds (F2, Rh2, CK or PPD) at various concentrations (0, 5, 10, 20, 50, 100 or 200 ⁇ g / ml) are breast cancer cell lines. It is a graph showing the result of comparing the effect. As shown in Figure 1, the PPD ginsenoside compound was confirmed to exhibit anti-cancer activity against breast cancer cells in a concentration-dependent manner. Although there is a difference in each compound, when treated at a concentration of 20 ⁇ g / ml or more began to show anti-cancer activity, when treated at a concentration of 200 ⁇ g / ml or more shows the effect of killing all breast cancer cells Confirmed.
  • PPD-type ginsenoside compounds F2, Rh2, CK or PPD
  • PPD ginsenoside compounds exhibit anticancer activity against breast cancer cells in a concentration-dependent manner.
  • PPD ginsenoside compounds The effects of PPD ginsenoside compounds on the anticancer activity of doxorubicin, a type of anticancer agent known to exhibit mitochondrial mediated anticancer activity, were studied.
  • PPD ginsenoside compounds a type of anticancer agent known to exhibit anticancer activity.
  • PPD ginsenoside compound F2, Rh2, CK or PPD
  • 10 ⁇ g / ml of PPD ginsenoside compound F2, Rh2, CK or PPD
  • 10 ⁇ g / ml of PPD ginsenoside compound F2, Rh2, CK or PPD
  • 20 ⁇ M tamoxifen or 5 ⁇ g / ml of doxorubicin The cells were incubated for 24 hours, and after the incubation was completed, survival rates of MCF-7 cells were compared by WST-1 analysis (FIG. 2A).
  • Figure 2a is a graph showing the results of comparing the effects of PPD ginsenoside compounds on the anticancer activity of cancer cells.
  • FIG. 2A breast cancer cells were treated with PPD-type ginsenoside compounds having no anticancer activity through Example 1 and treated with anticancer agents.
  • CK or PPD in PPD-type ginsenoside compounds was observed. It was confirmed that the anticancer activity by doxorubicin can be improved.
  • tamoxifen was treated, it was confirmed that no PPD ginsenoside compound improved the anticancer activity of tamoxifen.
  • CK or PPD affects the treatment concentration of doxorubicin
  • 10 ⁇ g / ml of PPD ginsenoside compound (CK or PPD) was added thereto, followed by incubation for 12 hours, and then various concentrations (0, 0.1, 0.5, 1, 2, 5, 10, 50 [mu] g / ml) of doxorubicin was incubated for 24 hours, and after the incubation was completed, the survival rate of MCF-7 cells was calculated from the WST-1 analysis. LC50 values were compared (FIG. 2B).
  • the experimental group was not treated with ginsenoside as a negative control, the experimental group treated with F2, a PPD ginsenoside compound confirmed to have no effect on doxorubicin as a positive control.
  • Figure 2b is a graph showing the results of comparing the survival rate of breast cancer cells co-treated with CK or PPD and various concentrations of doxorubicin, ( ⁇ ) represents a negative control, ( ⁇ ) represents a positive control, ( ⁇ ) The experimental group treated with CK is indicated, and ( ⁇ ) represents the experimental group treated with PPD. As shown in Figure 2b, when simultaneously treated with C-K or PPD and doxorubicin, it was confirmed that the anticancer activity is increased than when doxorubicin alone.
  • Figure 3a is a Western blot analysis picture showing the result of comparing the expression level of apoptosis-related protein in breast cancer cells treated with C-K or PPD and doxorubicin simultaneously. As shown in FIG. 3A, levels of phosphorylated-JNK, cleaved-PARP and cleaved-caspase-9 were increased in all cells treated with doxorubicin.
  • the levels of phosphorylated-JNK and cleaved-PARP in the increased phosphorylated-JNK, cleaved-PARP and cleaved-caspase-9 were not affected by treatment of CK or PPD, but cleaved-caspase -9 was significantly increased when CK or PPD was treated, especially when the PPD was treated significantly increased.
  • medium containing 10 ⁇ g / ml of PPD was added to MCF-7 cells and cultured for 12 hours, followed by replacement with medium containing 10 ⁇ g / ml of PPD and 5 ⁇ g / ml of doxorubicin, followed by 0, 0.5. Incubated for 1, 2, 4 or 6 hours.
  • the same Western blot analysis was performed using the cultured cells (FIG. 3B).
  • the comparison group instead of the medium containing PPD and doxorubicin, the comparison group used cells incubated with a medium containing doxorubicin alone.
  • Figure 3b is a Western blot analysis picture showing the result of comparing the expression level of apoptosis-related protein with treatment time in breast cancer cells treated with PPD and doxorubicin at the same time. As shown in FIG. 3b, it was confirmed that cleaved-PARP and cleaved-caspase-9 were formed faster in breast cancer cells treated with PPD and doxorubicin simultaneously than breast cancer cells treated with doxorubicin alone.
  • a medium containing 10 ⁇ g / ml of CK or PPD was added to MCF-7 cells pretreated with Z-LEHD-FMK, an inhibitor of caspase-9, or 3-AB, an inhibitor of PARP, and cultured for 12 hours.
  • the cells were replaced with a medium containing 10 ⁇ g / ml of CK or PPD and 0 or 5 ⁇ g / ml of doxorubicin and incubated for 24 hours.
  • the same western blot analysis was performed using the cultured cells (FIG. 3C).
  • the experimental group was not treated with ginsenoside as a negative control, the experimental group treated with F2, a PPD ginsenoside compound confirmed to have no effect on doxorubicin as a positive control.
  • Figure 3c is a graph showing the results of comparing the effect of PARP or caspase-9 activity inhibitors on the anticancer effect by the simultaneous treatment of C-K or PPD and doxorubicin. As shown in Figure 3c, it was confirmed that the anticancer effect of doxorubicin is suppressed when treated with PARP or caspase-9 activity inhibitor in all control and experimental groups. However, when treated with PARP activity inhibitors, anti-cancer activity was slightly recovered when C-K or PPD and doxorubicin were co-treated, which was analyzed by the caspase-9 activity upstream of PARP.
  • Example 2 From the results of Example 2, it was confirmed that the CK or PPD belonging to the PPD ginsenoside compound can promote the anticancer activity of doxorubicin, a kind of anticancer agent known to exhibit mitochondrial mediated anticancer activity, so that the CK or PPD To determine if it affects the mitochondria.
  • doxorubicin a kind of anticancer agent known to exhibit mitochondrial mediated anticancer activity
  • FIG. 4A is an immunofluorescence staining photograph showing the change in the level of cytochrome-C released from mitochondria by simultaneous treatment of C-K or PPD with doxorubicin.
  • Figure 4a when treated with doxorubicin, the release level of cytochrome-C is increased compared to the case of not treated with doxorubicin, even if treated with doxorubicin alone CK or PPD and doxorubicin than treated with doxorubicin alone When treated together, it was confirmed that the emission level of cytochrome-C was increased.
  • the purpose of this study was to determine whether the release level of cytochrome-C was changed by the treatment time of doxorubicin. That is, a medium containing 10 ⁇ g / ml of CK or PPD was added to MCF-7 cells, incubated for 24 hours, and then replaced with a medium containing 5 ⁇ g / ml of doxorubicin, followed by 0, 0.5, 1, 2, 4 Or immunofluorescence staining was performed by the same method as described above except using cells cultured for 6 hours, and the number of cytochrome-C released cells from the mitochondria into the cytoplasm was measured (FIG. 4B). ). At this time, the experimental group was not treated with ginsenoside as a control group.
  • Figure 4b is a graph showing the number of cytochrome-C released from the mitochondria by the simultaneous treatment time of C-K or PPD and doxorubicin. As shown in FIG. 4B, after 6 hours, cytochrome-C was released in 7% of all cells in the control group treated with doxorubicin alone, but in 20% of all cells in the experimental group treated with CK and doxorubicin. -C was released, and in the experimental group treated with PPD and doxorubicin, cytochrome-C was released in 43% of all cells.
  • C-K or PPD has an effect of promoting the release of cytochrome-c in mitochondria by doxorubicin.
  • Example 3-1 it was confirmed that C-K or PPD can promote the release of cytochrome-c in the mitochondria by doxorubicin. Therefore, it was intended to confirm whether the C-K or PPD could damage the mitochondria.
  • a medium containing 10 ⁇ g / ml of C-K or PPD was added to MCF-7 cells and cultured for 24 hours.
  • 4% paraformaldehyde was added to the cells, and the cells were pierced with 0.5% Triton X-100 solution, followed by staining with mitochondria using Tom-20. After staining was completed, the cells were washed with PBS, photographed by confocal microscopy, and the color fluorescence level was measured (FIG. 5A).
  • an experimental group not treated with ginsenoside was used as a negative control
  • an experimental group treated with F2, a PPD ginsenoside compound was used as a positive control.
  • Figure 5a is a photograph showing the result of fluorescence staining of mitochondria contained in MCF-7 cells treated with C-K or PPD. As shown in Figure 5a, compared to the mitochondria of the negative control, the mitochondria of the positive control did not show a significant change, it was confirmed that the mitochondria contained in the MCF-7 cells treated with C-K or PPD.
  • Figure 5b shows the expression level of proteins involved in mitochondrial cleavage (Drp1, Fis1 or OPA-3) expressed in CK or PPD treated MCF-7 cells and proteins involved in mitochondrial fusion (Mfn1. Mfn2 or OPA1).
  • This picture shows the results of Western blot analysis.
  • OPA-3 a protein involved in mitochondrial cleavage
  • Mfn2 a protein involved in mitochondrial fusion
  • CK or PPD may cause damage to the mitochondria, so when the CK or PPD is treated with doxorubicin, the CK or PPD is treated for doxorubicin.
  • the anticancer activity of doxorubicin can be improved.
  • Example 4 Analysis of the association between the cleavage of mitochondria and the anticancer activity of doxorubicin
  • Example 3-2 From the results of Example 3-2, it was confirmed that CK or PPD causes damage to mitochondria, and thus inhibits expression of proteins (Mfn1 or Mfn2) involved in mitochondrial fusion, induces mitochondrial cleavage, and thus doxorubicin
  • the purpose of this study was to analyze the association between the cleavage of mitochondria and the anticancer activity of doxorubicin.
  • siRNAs targeting Mfn1 and Mfn2 were synthesized, and random siRNA was synthesized as a negative control.
  • Mfn1 5'-GUGUAGAUUCUGGUAAUGA-3'-dTdT (SEQ ID NO: 2)
  • Mfn2 5'-CGAUGCAACUCUAUCGUCA-3'-dTdT (SEQ ID NO: 3)
  • Each synthesized siRNA was introduced into MCF-7 cells and cultured for 12 hours, and the cells were re-incubated for 48 hours in a normal medium containing no siRNA, and then the proteins involved in mitochondrial fusion expressed in these cells ( Expression level of Mfn1 or Mfn2) was confirmed by Western blot analysis (Fig. 6a).
  • Figure 6a is a Western blot analysis picture showing the results of confirming the inhibition of the expression of the protein by siRNA that inhibits the expression of proteins (Mfn1 or Mfn2) involved in mitochondrial fusion. As shown in Figure 6a, it was confirmed that the expression of proteins (Mfn1 or Mfn2) involved in mitochondrial fusion by the introduction of the siRNA is suppressed.
  • each of the synthesized siRNAs was introduced into MCF-7 cells and cultured for 12 hours, the cells were re-incubated for 48 hours in a normal medium containing no siRNA, and then treated with 5 ⁇ M of doxorubicin or 20 ⁇ M of tamoxifen. The cells were incubated for 24 hours, and after the incubation was completed, survival rates of MCF-7 cells were compared by WST-1 analysis (FIG. 6B). In this case, cells cultured without treatment with doxorubicin or tamoxifen were used as controls.
  • Figure 6b is a graph showing the results of comparing the anticancer activity of doxorubicin and tamoxifen against the cells induced mitochondrial division.
  • the survival rate was not reduced even after induction of mitochondrial cleavage in cells not treated with doxorubicin or tamoxifen, but treatment with doxorubicin or tamoxifen showed anticancer activity, and in particular, treatment with doxorubicin compared to tamoxifen. In this case, it was confirmed that a markedly high level of anticancer activity appeared.
  • CK or PPD belonging to the PPD ginsenoside compound inhibits the expression of Mfn2 belonging to the mitochondrial fusion protein, thereby promoting the cleavage of mitochondria
  • mitochondria are damaged, and in this state, treatment of cancer cells with an anticancer agent (doxorubicin) that exhibits mitochondrial mediated anticancer activity further damages the outer membrane of the damaged mitochondria, thereby releasing more cytochrome-C from the mitochondria into the cytoplasm.
  • the released cytochrome-C induces apoptosis through apoptosomes, which in turn kills cancer cells.

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Abstract

본 발명은 PPD(protopanaxadiol)류 진세노사이드 화합물이 처리된 세포를 사용하여 미토콘드리아 분열 조절제를 스크리닝하는 방법, 상기 PPD류 진세노사이드 화합물을 포함하는 미토콘드리아 분열 조절제 스크리닝용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다. 본 발명의 미토콘드리아 분열 조절제를 스크리닝하는 방법을 사용하면, 미토콘드리아의 분열을 조절하여 미토콘드리아 관련 질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 제제를 효과적으로 발굴할 수 있으므로, 미토콘드리아 관련 질환의 치료제 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

미토콘드리아 분열 조절제의 스크리닝 방법
본 발명은 미토콘드리아 분열 조절제의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 PPD(protopanaxadiol)류 진세노사이드 화합물이 처리된 세포를 사용하여 미토콘드리아 분열 조절제를 스크리닝하는 방법, 상기 PPD류 진세노사이드 화합물을 포함하는 미토콘드리아 분열 조절제 스크리닝용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다.
미토콘드리아는 대부분의 진핵세포에 존재하는 세포성 소기관이다. 미토콘드리아의 주 기능 중 하나는 산화성 인산화이고, 상기 과정을 통하여 포도당 또는 지방산과 같은 연료 물질의 대사로부터 유래되는 에너지가 ATP로 전환되며, 이는 다양한 에너지-요구 생합성 및 다른 대사성 활성을 추진시키는 데 이용된다.
구조적으로, 미토콘드리아는 외막(outer membrane)과 내막(inner membrane)으로 구성되어 있으며, 끊임없이 움직(move)이고, 융합(fusion)하며, 분열(fission)하는 역동적인 세포소기관이다. 미토콘드리아는 서로 연결된 관상의 네트워크(tubular network)를 형성하고 있으며, 미토콘드리아 결합-분열 기작(mitochondrial fusion-fission machinery)에 의해 그 모양(morphology)과 숫자가 정교하게 조절되고 있다. 미토콘드리아 결합에 관여하는 단백질로는 미토퓨신 1(mitofusin 1; Mfn1), 미토퓨신 2(mitofusin 2; Mfn2), Opa1 등이 알려져 있고, 미토콘드리아 분열에 관여하는 단백질로는 Drp1, Fis1 등이 알려져 있다.
한편, 1990년대 이후부터 미토콘드리아를 구성하는 주요 성분이 세포사멸에 중요한 역할을 한다는 것이 밝혀져 세포사멸에서 매우 중요한 위치를 차지하게 되었다. 세포사멸이 유도되면, 여러 가지 세포사멸 조절 단백질, 소포체(ER), 세포질에 존재하는 칼슘 이온 및 이와 관련된 단백질이 미토콘드리아로 이동하고, 미토콘드리아 형태 단백질(mitochondria-shaping protein)에 의해 미토콘드리아의 분열 및 단편화(fragmentation)가 유발된다. 단편화된 미토콘드리아는 막 전위가 상실되고, 외막이 손상되며, 이에 따라 외막의 투과성이 증가되는데, 이같은 외막의 투과성이 증가함에 따라 상기 외막을 통해 미토콘드리아 내의 여러 단백질(예를들어, 시토크롬-C 등)이 세포질로 방출됨과 동시에, 미토콘드리아 핵이 응집되고, 미토콘드리아 DNA가 절단되어, 미토콘드리아의 기능이 중단되며, 이로 인하여 세포가 사멸한다. 이러한 미토콘드리아 매개성 세포사멸기작은 다양한 세포에서 광범위하게 관찰되었고, 특히, 파킨스씨 병, 유전적 시신경 병증과 같은 다양한 퇴행성 신경 질환의 발병의 원인이 된다고 알려져 있다.
이에, 미토콘드리아의 손상에 의하여 유발되는 질환을 예방 또는 치료하기 위한 목적으로, 상기 미토콘드리아의 손상을 억제할 수 있는 제제를 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 예를 들어, 한국공개특허 제2002-0042020호에는 미토콘드리아의 하이드록시 라디칼에 의한 손상을 효과적으로 억제하는 디하이드록시벤즈알데하이드 화합물이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2014-0000733호에는 미토콘드리아 손상을 유도하는 스트레스의 조절에서 주요한 역할을 수행하는 N-말단이 제거된 유비퀴틴 C-말단 가수분해효소-L1을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 예방 및 치료용 조성물이 개시되어 있다. 이처럼, 미토콘드리아 손상을 조절하는 제제가 개발되고 있으나, 이같은 제제 개발은 비교적 느리게 진행되고 있는데, 그 이유는 상기 제제가 미토콘드리아 손상에 미치는 효과를 확인하기 위하여는 많은 비용과 시간이 소요되기 때문이다. 만일, 다양한 미토콘드리아 손상 조절제를 효과적으로 발굴할 수 있는 방법이 개발된다면, 미토콘드리아의 손상으로 인한 질환을 치료할 수 있는 제제를 보다 효과적으로 개발할 수 있을 것으로 예상되고 있다.
본 발명자들은 미토콘드리아의 손상을 조절할 수 있는 제제를 효과적으로 발굴할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 분리된 세포에서 미토콘드리아의 분열을 촉진시킬 수 있는 PPD류 진세노사이드 화합물을 사용할 경우, 미토콘드리아 손상 억제제를 효과적으로 발굴할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 PPD류 진세노사이드 화합물이 처리된 세포를 사용하여 미토콘드리아 분열 조절제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 PPD류 진세노사이드 화합물을 포함하는 미토콘드리아 분열 조절제 스크리닝용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 미토콘드리아 분열 조절제 스크리닝용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 미토콘드리아 분열 조절제를 스크리닝하는 방법을 사용하면, 미토콘드리아의 분열을 조절하여 미토콘드리아 관련 질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 제제를 효과적으로 발굴할 수 있으므로, 미토콘드리아 관련 질환의 치료제 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 다양한 농도(0, 5, 10, 20, 50, 100 또는 200 ㎍/㎖)의 PPD류 진세노사이드 화합물(F2, Rh2, C-K 또는 PPD)이 유방암 세포주인 MCF-7 세포의 생존율에 미치는 효과를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2a는 PPD류 진세노사이드 화합물이 암세포의 항암활성에 미치는 효과를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2b는 C-K 또는 PPD와 다양한 농도의 독소루비신이 동시처리된 유방암 세포의 생존율을 비교한 결과를 나타내는 그래프로서, (●)는 음성 대조군을 나타내고, (■)는 양성 대조군을 나타내며, (▲)는 C-K가 처리된 실험군을 나타내고, (▼)는 PPD가 처리된 실험군을 나타낸다.
도 3a는 C-K 또는 PPD와 독소루비신을 동시 처리한 유방암 세포에서 세포자멸 관련 단백질의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 3b는 PPD와 독소루비신을 동시 처리한 유방암 세포에서 처리시간에 따른 세포자멸 관련 단백질의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 3c는 C-K 또는 PPD와 독소루비신의 동시 처리에 의한 항암효과에 대한 PARP 또는 카스파제-9 활성억제제의 효과를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4a는 C-K 또는 PPD와 독소루비신의 동시 처리에 의한 미토콘드리아로부터 방출된 시토크롬-C의 수준변화를 나타내는 면역형광염색 사진이다.
도 4b는 C-K 또는 PPD와 독소루비신의 동시 처리시간에 의한 미토콘드리아로부터 시토크롬-C가 방출된 세포수를 나타내는 그래프이다.
도 5a는 C-K 또는 PPD가 처리된 MCF-7 세포에 포함된 미토콘드리아를 형광염색한 결과를 나타내는 사진이다.
도 5b는 C-K 또는 PPD가 처리된 MCF-7 세포에서 발현되는 미토콘드리아 분열에 관여하는 단백질(Drp1, Fis1 또는 OPA-3)과 미토콘드리아 융합에 관여하는 단백질(Mfn1. Mfn2 또는 OPA1)의 발현수준을 나타내는 웨스턴블럿 분석결과를 나타내는 사진이다.
도 6a는 미토콘드리아 융합에 관여하는 단백질(Mfn1 또는 Mfn2)의 발현을 억제하는 siRNA에 의한 상기 단백질의 발현억제를 확인한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 6b는 미토콘드리아 분열이 유발된 세포에 대한 독소루비신과 타목시펜의 항암활성을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 본 발명에서 제공하는 항암보조제와 미토콘드리아 매개성 항암활성을 나타내는 항암제의 항암활성 기작을 나타내는 개략도이다.
본 발명자들은 다양한 미토콘드리아의 손상을 조절할 수 있는 제제를 효과적으로 발굴할 수 있는 방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하던 중, 미토콘드리아의 분열현상에 주목하게 되었다. 통상적으로, 미토콘드리아는 융합과 분열을 반복하여 그의 활성을 조절하게 되는데, 융합된 미토콘드리아는 ATP 생성과 같은 미토콘드리아의 주기능을 수행할 수 있고, 분열된 미토콘드리아는 미토콘드리아의 수를 증식시켜서 미토콘드리아의 전체적인 활성을 향상시킨다. 또한, 미토콘드리아의 분열은 미토콘드리아의 손상에 의한 분절화시에도 발생하므로, 미토콘드리아의 분열은 미토콘드리아를 활성화시킬 수도 있고, 손상시킬 수도 있는 핵심적인 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 상기 미토콘드리아의 분열을 조절할 수 있는 제제를 개발하면, 이를 사용하여 미토콘드리아의 손상으로 인한 질환을 보다 효과적으로 치료할 수 있다.
이처럼, 미토콘드리아의 분열을 조절하는 제제를 개발하기 위하여는 미토콘드리아를 인위적으로 분열상태로 유지시켜야만 하므로, 본 발명자들은 미토콘드리아의 분열을 유도할 수 있는 제제를 개발하고자 다양한 연구를 수행하던 중, PPD(protopanaxadiol)류 진세노사이드 화합물이 미토콘드리아의 융합에 관여하는 단백질(예를 들어, Mfn2 등)의 발현을 감소시키고, 미토콘드리아의 분열에 관여하는 단백질(예를 들어, OPA-3 등)의 발현을 증가시킴을 확인하였다.
따라서, PPD류 진세노사이드 화합물을 처리한 세포에 미토콘드리아의 분열을 조절할 것으로 예상되는 후보물질을 처리하고, 이로부터 미토콘드리아의 분열여부를 확인할 경우, 미토콘드리아 분열 조절제를 효과적으로 스크리닝할 수 있음을 확인하였으며, 이처럼 PPD류 진세노사이드 화합물을 사용하여 미토콘드리아 분열 조절제를 스크리닝하는 방법은 종래에 공지되지 않고, 본 발명자에 의하여 최초로 개발되었다.
상술한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로서 분리된 세포에 PPD(protopanaxadiol)류 진세노사이드 화합물과 미토콘드리아의 분열을 조절할 수 있을 것으로 예상되는 후보물질을 처리하고, 상기 세포에서 미토콘드리아의 분열수준을 측정하는 단계를 포함하는 미토콘드리아 분열 조절제의 스크리닝 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 미토콘드리아 분열 조절제의 스크리닝 방법은 (a) 분리된 세포에 PPD류 진세노사이드 화합물과 미토콘드리아의 분열을 조절할 수 있을 것으로 예상되는 후보 화합물을 처리하는 후보 화합물 처리단계; (b) 상기 후보 화합물을 처리한 세포 내 미토콘드리아의 분열수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 후보 화합물을 처리하지 않은 음성 대조군과 비교하여 상기 미토콘드리아의 분열수준을 촉진 또는 억제하는 후보 화합물을 선별하는 단계를 포함한다.
이때, 상기 분리된 세포는 PPD류 진세노사이드 화합물에 의하여 미토콘드리아 분열을 유도할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 례로서 인슐린 분비세포, 암세포 등이 될 수 있고, 상기 미토콘드리아의 분열수준 측정은 분열된 미토콘드리아의 수준을 현미경 등으로 관찰하거나, 미토콘드리아의 융합에 관여하는 단백질(예를 들어, Mfn1, Mfn2, OPA1 등)의 발현수준을 측정하거나 또는 미토콘드리아의 분열에 관여하는 단백질(예를 들어, Drp1, Fis1, OPA-3 등)의 발현수준을 측정하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 후보물질이 처리된 세포에서 분열된 미토콘드리아의 수준이 증가되면, 상기 후보물질이 미토콘드리아의 분열을 촉진하는 조절제로 선별할 수 있고, 후보물질이 처리된 세포에서 분열된 미토콘드리아의 수준이 감소되면, 상기 후보물질이 미토콘드리아의 분열을 억제하는 조절제로 선별할 수 있으며, 후보물질이 처리된 세포에서 미토콘드리아의 융합에 관여하는 단백질의 발현수준이 감소되면, 상기 후보물질이 미토콘드리아의 분열을 촉진하는 조절제로 선별할 수 있고, 후보물질이 처리된 세포에서 미토콘드리아의 융합에 관여하는 단백질의 발현수준이 증가되면, 상기 후보물질이 미토콘드리아의 분열을 억제하는 조절제로 선별할 수 있으며, 후보물질이 처리된 세포에서 미토콘드리아의 분열에 관여하는 단백질의 발현수준이 증가되면, 상기 후보물질이 미토콘드리아의 분열을 촉진하는 조절제로 선별할 수 있고, 후보물질이 처리된 세포에서 미토콘드리아의 분열에 관여하는 단백질의 발현수준이 감소되면, 상기 후보물질이 미토콘드리아의 분열을 억제하는 조절제로 선별할 수 있다.
이러한 미토콘드리아의 분열을 측정하는 방법은 상술한 방법 이외에도 당업계에 공지된 모든 방법을 사용할 수 있고, 당업자가 필요에 따라 상기 공지된 방법을 선택적으로 사용할 수 있음은 자명하다.
본 발명에서 제공하는 미토콘드리아 분열 조절제의 스크리닝 방법을 통해 발굴된 미토콘드리아 분열 조절제는 미토콘드리아의 분열수준을 촉진시키거나 또는 억제할 수 있으므로, 미토콘드리아의 분열에 의하여 유발되는 미토콘드리아 손상에 의한 질환을 개선 또는 치료하는데 사용될 수 있다. 이때, 상기 미토콘드리아 손상에 의한 질환은 특별히 이에 제한되지 않으나, 대사성질환(당뇨병 등), 퇴행성뇌질환(파킨슨병, 알쯔하이머병 등), 간기능 이상, 근육병증, 자가면역질환(류마티스 관절염 등) 등이 될 수 있다.
본 발명의 용어 "PPD(protopanaxadiol)류 진세노사이드 화합물"이란, 상기 PPD와 유사한 화학적 구조를 갖는 진세노사이드 화합물을 의미한다.
본 발명에 있어서, PPD류 진세노사이드 화합물은 세포내 미토콘드리아를 손상시켜서, 미토콘드리아 매개성 항암활성을 나타내는 항암제의 항암활성을 보조하는 역할을 수행하는 화합물인 것으로 해석될 수 있는데, 일 례로서, 하기 화학식 1의 PPD, 하기 화학식 2의 C-K 등이 될 수 있다. 상기 PPD류 진세노사이드 화합물은 인삼, 홍삼 등으로부터 추출된 것을 사용할 수도 있고, 화학적으로 합성된 것을 사용할 수도 있다.
본 발명의 용어 "PPD(protopanaxadiol)"이란, C30H52O3의 화학식으로 표시되고, 약 460Da의 분자량을 갖으며, 인삼으로부터 분리된 하기 화학식 1의 구조를 갖는 화합물을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 PPD는 미토콘드리아 분열을 촉진시켜서, 미토콘드리아의 분열을 조절할 수 있는 제제를 스크리닝하는 방법에 사용될 수 있는데, 상기 미토콘드리아 분열을 촉진시키기 위하여 사용될 수 있는 농도는 그 자체로서 세포독성을 나타내지 않고, 미토콘드리아의 분열을 촉진시킬 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 례로서, 10㎍/㎖ 이하의 처리농도가 될 수 있고, 다른 예로서, 0.1 내지 10㎍/㎖의 처리농도가 될 수 있으며, 또 다른 예로서, 5 내지 10㎍/㎖의 처리농도가 될 수 있다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2015006825-appb-I000001
본 발명의 용어 "컴파운드-K(compound-K, C-K)"란, 인삼자체에는 존재하지 않으나, 인삼 또는 홍삼에 존재하는 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd 등의 사포닌이 비피더스 균과 같은 장내 미생물 또는 토양미생물의 작용에 의하여 체내에서 흡수가능한 형태로 전환된 형태의 진세노사이드 화합물로서, C36H62O8의 화학식으로 표시되고, 약 622Da의 분자량을 갖으며, 하기 화학식 2의 구조를 갖는 화합물을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 C-K는 미토콘드리아 분열을 촉진시켜서, 미토콘드리아의 분열을 조절할 수 있는 제제를 스크리닝하는 방법에 사용될 수 있는데, 상기 미토콘드리아 분열을 촉진시키기 위하여 사용될 수 있는 농도는 그 자체로서 세포독성을 나타내지 않고, 미토콘드리아의 분열을 촉진시킬 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 례로서, 10㎍/㎖ 이하의 처리농도가 될 수 있고, 다른 예로서, 0.1 내지 10㎍/㎖의 처리농도가 될 수 있으며, 또 다른 예로서, 5 내지 10㎍/㎖의 처리농도가 될 수 있다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2015006825-appb-I000002
본 발명의 일 실시예에 의하면, PPD류 진세노사이드 화합물은 유방암 세포에 대하여 농도의존적인 항암활성을 나타낼 수 있으나(도 1), 항암활성을 나타내지 않는 용량으로 처리할 경우 일부 화합물(C-K 또는 PPD)이 유방암 세포의 미토콘드리아의 융합에 관여하는 단백질의 발현을 억제시키고, 미토콘드리아 분열에 관여하는 단백질의 발현을 촉진시킬 수 있음(도 5a 및 5b)을 확인하였다.
따라서, PPD류 진세노사이드 화합물에 속하는 PPD 또는 C-K는 미토콘드리아의 분열을 촉진시켜서, 미토콘드리아의 분열을 조절할 수 있는 제제를 스크리닝하는 방법에 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명은 다른 양태로서 PPD류 진세노사이드 화합물을 포함하는 미토콘드리아 분열 조절제 스크리닝용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 미토콘드리아 분열 조절제 스크리닝용 키트를 제공한다.
상기 조성물 및 키트에 포함된 PPD류 진세노사이드 화합물은 세포내 미토콘드리아의 분열을 촉진시킬 수 있으므로, 상기 조성물 및 키트는 미토콘드리아 분열 조절제를 스크리닝하기 위하여 사용될 수 있다.
특히, 상기 키트는 PPD류 진세노사이드 화합물 뿐만 아니라, 후보물질이 미토콘드리아 분열을 조절할 수 있는지의 여부를 확인하는 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수도 있다. 예를 들어, PPD류 진세노사이드 화합물에 의해 미토콘드리아 분열이 촉진되는 세포, 상기 세포의 배양에 사용되는 용기, 상기 세포의 배양에 사용되는 배지, 미토콘드리아의 융합 또는 분열에 관여하는 단백질의 발현수준의 측정에 사용되는 적절한 완충액, 미토콘드리아의 융합 또는 분열에 관여하는 단백질의 발현수준의 측정에 사용되는 형광물질(FITC, RITC 등) 등을 추가로 포함할 수 있다.
구체적인 일례로서, 본 발명의 미토콘드리아 분열 조절제 스크리닝용 키트는 미토콘드리아의 융합 또는 분열에 관여하는 단백질의 발현수준을 측정하는 웨스턴블럿 분석을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 즉, 상기 키트는 세포파쇄용 완충액, 1차 항체, 2차 항체, 2차 항체 검출용 제제, 웨스턴블럿 분석에 필요한 완충액, 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너 등을 포함할 수 있다.
다른 일례로서, 본 발명의 미토콘드리아 분열 조절제 스크리닝용 키트는 RT-PCR을 수행하여 미토콘드리아의 융합 또는 분열에 관여하는 단백질의 발현수준을 측정하기 위하여 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 즉, 상기 키트는, 상기 미토콘드리아의 융합 또는 분열에 관여하는 단백질의 DNA에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍, 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조구로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: PPD(protopanaxadiol)의 세포독성
암세포에 대하여 PPD(protopanaxadiol)류 진세노사이드 화합물이 세포독성을 나타내는지를 확인하고자 하였다.
먼저, 인간 유방암 세포주 MCF-7 세포를 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 DMEM 배지에 접종하고, 37℃ 및 5% CO2 조건에서 배양하였으며, 배양된 MCF-7가 포화되면 3 내지 5일 간격으로 계대배양하였다.
다음으로, 상기 배양된 MCF-7 세포에 다양한 농도(0, 5, 10, 20, 50, 100 또는 200 ㎍/㎖)의 PPD류 진세노사이드 화합물(F2, Rh2, C-K 또는 PPD)를 24시간 동안 처리하고, 상기 세포를 대상으로 WST-1 분석을 수행함으로써, 이들 세포의 생존율을 측정하였다(도 1). 이때, WST-1 분석은 상기 각 세포를 10% EZ-Cytox를 포함하는 배지에 접종하고 37℃에서 1.5시간 동안 반응시킨 후, 생존세포에 의해 생성되는 수용성 포르마잔 염료의 수준을 흡광도(450 nm)를 측정하고, 이를 분석함으로써, 세포 생존율을 산출하는 방식으로 수행하였다.
도 1은 다양한 농도(0, 5, 10, 20, 50, 100 또는 200 ㎍/㎖)의 PPD류 진세노사이드 화합물(F2, Rh2, C-K 또는 PPD)이 유방암 세포주인 MCF-7 세포의 생존율에 미치는 효과를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 1에서 보듯이, 상기 PPD류 진세노사이드 화합물은 농도의존적으로 유방암 세포에 대한 항암활성을 나타냄을 확인하였다. 각 화합물별로 차이가 있기는 하지만, 대체로 20 ㎍/㎖ 이상의 농도로 처리할 경우 항암활성을 나타내기 시작하였고, 200 ㎍/㎖ 이상의 농도로 처리할 경우 대부분의 유방암세포를 모두 사멸시키는 효과를 나타냄을 확인하였다. 이에 반하여, 10 ㎍/㎖ 이하의 농도로 처리할 경우 항암활성을 전혀 나타내지 않음을 확인하였다. 특히, PPD류 진세노사이드 화합물 중에서 C-K 또는 PPD가 상대적으로 우수한 항암활성을 나타냄을 확인하였다.
따라서, PPD류 진세노사이드 화합물은 농도의존적으로 유방암 세포에 대한 항암활성을 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 2: 독소루비신의 항암효과에 미치는 PPD의 영향
미토콘드리아 매개성 항암활성을 나타낸다고 알려진 항암제의 일종인 독소루비신의 항암활성에 미치는 PPD류 진세노사이드 화합물의 효과를 연구하였다.
실시예 2-1: 독소루비신에 대한 감수성에 미치는 효과
인간 유방암 세포주 MCF-7 세포, 상기 실시예 1에서 우수한 항암활성을 나타내는 것으로 확인된 C-K 또는 PPD, 호르몬 수용체의 길항제로 작용하여 호르몬 매개성 암의 성장을 저해하는 항암활성을 나타내는 타목시펜 및 미토콘드리아 매개성 항암활성을 나타낸다고 알려진 항암제의 일종인 독소루비신을 사용하여, 항암제에 대한 암세포의 감수성에 미치는 PPD류 진세노사이드 화합물의 효과를 확인하고자 하였다.
구체적으로, MCF-7 세포에 10 ㎍/㎖의 PPD류 진세노사이드 화합물(F2, Rh2, C-K 또는 PPD)을 가하고 12시간 동안 배양한 다음, 20μM의 타목시펜 또는 5㎍/㎖의 독소루비신을 처리하고 24시간 동안 배양하였으며, 배양이 종료된 후, WST-1 분석을 통해 MCF-7 세포의 생존율을 비교하였다(도 2a).
도 2a는 PPD류 진세노사이드 화합물이 암세포의 항암활성에 미치는 효과를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 2a에서 보듯이, 실시예 1을 통하여 항암활성을 전혀 나타내지 않는 농도의 PPD류 진세노사이드 화합물을 유방암 세포에 처리하고, 이에 항암제를 처리한 결과, PPD류 진세노사이드 화합물 중에서 C-K 또는 PPD가 독소루비신에 의한 항암활성을 향상시킬 수 있음을 확인하였다. 이에 반하여, 타목시펜을 처리한 경우에는 어떠한 PPD류 진세노사이드 화합물도 타목시펜의 항암활성을 향상시키지 못함을 확인하였다.
이에 따라, 상기 C-K 또는 PPD가 독소루비신의 처리농도에 영향을 미치는지를 확인하고자, 10 ㎍/㎖의 PPD류 진세노사이드 화합물(C-K 또는 PPD)을 가하고 12시간 동안 배양한 다음, 다양한 농도(0, 0.1, 0.5, 1, 2, 5, 10, 50 ㎍/㎖)의 독소루비신을 처리하고 24시간 동안 배양하였으며, 배양이 종료된 후, WST-1 분석을 통해 MCF-7 세포의 생존율과 이로부터 산출된 LC50 값을 비교하였다(도 2b). 이때, 음성 대조군으로는 진세노사이드를 처리하지 않은 실험군을 사용하고, 양성 대조군으로는 독소루비신에 대하여 별다른 효과를 나타내지 않는 것으로 확인된 PPD류 진세노사이드 화합물인 F2를 처리한 실험군을 사용하였다.
도 2b는 C-K 또는 PPD와 다양한 농도의 독소루비신이 동시처리된 유방암 세포의 생존율을 비교한 결과를 나타내는 그래프로서, (●)는 음성 대조군을 나타내고, (■)는 양성 대조군을 나타내며, (▲)는 C-K가 처리된 실험군을 나타내고, (▼)는 PPD가 처리된 실험군을 나타낸다. 도 2b에서 보듯이, C-K 또는 PPD와 독소루비신을 동시처리할 경우, 독소루비신을 단독으로 처리한 경우보다도 항암활성이 증가됨을 확인하였다. 특히, LC50 값을 비교하면, 독소루비신을 단독으로 처리하거나(음성 대조군) 또는 F2와 독소루비신을 동시에 처리한 경우(양성 대조군)에는 약 10 ㎍/㎖을 나타낸 반면, C-K와 독소루비신을 동시에 처리한 경우에는 2 ㎍/㎖를 나타내었고, PPD와 독소루비신을 동시에 처리한 경우에는 1.5 ㎍/㎖를 나타내어, C-K 또는 PPD가 독소루비신의 항암활성을 향상시키는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 2-2: 세포자멸(apoptosis) 관련 단백질의 발현수준에 미치는 효과
MCF-7 세포에 10 ㎍/㎖의 C-K 또는 PPD를 포함하는 배지를 가하고 12시간 동안 배양한 다음, 10 ㎍/㎖의 C-K 또는 PPD와 0 또는 5 ㎍/㎖의 독소루비신을 포함하는 배지로 교체하고 24시간 동안 배양하였다. 배양이 종료된 세포를 파쇄하고, 이를 대상으로 인산화-JNK에 대한 항체, PARP에 대한 항체, 절단된-PARP에 대한 항체, 카스파제-9에 대한 항체 또는 절단된-카스파제-9에 대한 항체를 사용한 웨스턴블럿 분석을 수행하였다(도 3a). 이때, 음성 대조군으로는 진세노사이드를 처리하지 않은 실험군을 사용하고, 양성 대조군으로는 독소루비신에 대하여 별다른 효과를 나타내지 않는 것으로 확인된 PPD류 진세노사이드 화합물인 F2를 처리한 실험군을 사용하였다.
도 3a는 C-K 또는 PPD와 독소루비신을 동시 처리한 유방암 세포에서 세포자멸 관련 단백질의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 3a에서 보듯이, 독소루비신이 처리된 모든 세포에서 인산화-JNK, 절단된-PARP 및 절단된-카스파제-9의 수준이 증가되었다. 또한, 상기 증가된 인산화-JNK, 절단된-PARP 및 절단된-카스파제-9 중에서 인산화-JNK 및 절단된-PARP의 수준은 C-K 또는 PPD의 처리에 의하여 영향을 받지 않았으나, 절단된-카스파제-9은 C-K 또는 PPD가 처리된 경우에 유의하게 증가하였고, 특히 PPD가 처리된 경우에 현저하게 증가함을 확인하였다.
이에 따라, MCF-7 세포에 10 ㎍/㎖의 PPD를 포함하는 배지를 가하고 12시간 동안 배양한 다음, 10 ㎍/㎖의 PPD와 5 ㎍/㎖의 독소루비신을 포함하는 배지로 교체하고 0, 0.5, 1, 2, 4 또는 6시간 동안 배양하였다. 상기 배양된 세포를 이용하여 동일한 웨스턴블럿 분석을 수행하였다(도 3b). 이때, 비교군으로는 PPD와 독소루비신을 포함하는 배지 대신에, 독소루비신을 단독으로 포함하는 배지로 배양된 세포를 사용하였다.
도 3b는 PPD와 독소루비신을 동시 처리한 유방암 세포에서 처리시간에 따른 세포자멸 관련 단백질의 발현수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 3b에서 보듯이, PPD와 독소루비신을 동시 처리한 유방암 세포에서는 독소루비신을 단독 처리한 유방암 세포 보다도 절단된-PARP 및 절단된-카스파제-9이 빠르게 형성됨을 확인하였다.
상기 결과로부터, 독소루비신의 항암활성에 PARP 및 카스파제-9이 영향을 미침을 알 수 있었으므로, 상기 PARP 및 카스파제-9의 활성을 억제할 경우, 독소루비신의 항암활성이 억제되는지를 확인하고자 하였다.
구체적으로, 카스파제-9의 억제제인 Z-LEHD-FMK 또는 PARP의 억제제인 3-AB를 전처리한 MCF-7 세포에 10 ㎍/㎖의 C-K 또는 PPD를 포함하는 배지를 가하고 12시간 동안 배양한 다음, 10 ㎍/㎖의 C-K 또는 PPD와 0 또는 5 ㎍/㎖의 독소루비신을 포함하는 배지로 교체하고 24시간 동안 배양하였다. 상기 배양된 세포를 이용하여 동일한 웨스턴블럿 분석을 수행하였다(도 3c). 이때, 음성 대조군으로는 진세노사이드를 처리하지 않은 실험군을 사용하고, 양성 대조군으로는 독소루비신에 대하여 별다른 효과를 나타내지 않는 것으로 확인된 PPD류 진세노사이드 화합물인 F2를 처리한 실험군을 사용하였다.
도 3c는 C-K 또는 PPD와 독소루비신의 동시 처리에 의한 항암효과에 대한 PARP 또는 카스파제-9 활성억제제의 효과를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 3c에서 보듯이, 모든 대조군 및 실험군에서 PARP 또는 카스파제-9 활성억제제를 처리한 경우, 독소루비신의 항암효과가 억제됨을 확인하였다. 다만, PARP 활성 억제제를 처리한 경우에는, C-K 또는 PPD와 독소루비신을 동시처리한 경우에, 항암활성이 다소 회복되었는데, 이는 PARP의 상류에 존재하는 카스파제-9의 활성에 의한 것으로 분석되었다.
실시예 3: 미토콘드리아에 미치는 PPD의 효과
상기 실시예 2의 결과로부터, PPD류 진세노사이드 화합물에 속하는 C-K 또는 PPD가 미토콘드리아 매개성 항암활성을 나타낸다고 알려진 항암제의 일종인 독소루비신의 항암활성을 촉진시킬 수 있음을 확인하였으므로, 상기 C-K 또는 PPD가 미토콘드리아에 영향을 미치는지를 확인하고자 하였다.
실시예 3-1: 미토콘드리아에서 유발되는 시토크롬-C의 방출에 미치는 효과
MCF-7 세포에 10 ㎍/㎖의 C-K 또는 PPD를 포함하는 배지를 가하고 24시간 동안 배양한 다음, 5 ㎍/㎖의 독소루비신을 포함하는 배지로 교체하고 0 또는 4시간 동안 배양하였다. 배양이 종료된 세포에 4% 파라포름알데히드를 가하여 고정시키고, 0.5% Triton X-100 용액을 가하여 천공한 다음, 시토크롬-C에 대한 항체를 사용하여 30분동안 면역염색하였다. 염색이 종료된 후, 상기 세포를 PBS로 세척하고, 형광표지된 이차항체를 30분 동안 가하여 반응시켰으며, PBS로 세척한 다음, 공초점 현미경으로 촬영하고, 발색된 형광수준을 측정하였다(도 4a). 이때, 음성 대조군으로는 진세노사이드를 처리하지 않은 실험군을 사용하고, 양성 대조군으로는 독소루비신에 대하여 별다른 효과를 나타내지 않는 것으로 확인된 PPD류 진세노사이드 화합물인 F2를 처리한 실험군을 사용하였다.
도 4a는 C-K 또는 PPD와 독소루비신의 동시 처리에 의한 미토콘드리아로부터 방출된 시토크롬-C의 수준변화를 나타내는 면역형광염색 사진이다. 도 4a에서 보듯이, 독소루비신을 처리한 경우에는, 독소루비신을 처리하지 않은 경우에 비하여 시토크롬-C의 방출수준이 증가하고, 독소루비신을 처리하더라도 단독으로 독소루비신을 처리한 경우 보다는, C-K 또는 PPD와 독소루비신을 함께 처리한 경우에 시토크롬-C의 방출수준이 증가함을 확인하였다.
이에 따라, 독소루비신의 처리시간에 의하여 시토크롬-C의 방출수준이 변화되는지의 여부를 확인하고자 하였다. 즉, MCF-7 세포에 10 ㎍/㎖의 C-K 또는 PPD를 포함하는 배지를 가하고 24시간 동안 배양한 다음, 5 ㎍/㎖의 독소루비신을 포함하는 배지로 교체하고 0, 0.5, 1, 2, 4 또는 6시간 동안 배양된 세포를 사용하는 것을 제외하고는 상술한 바와 동일한 방법을 수행하여 면역형광염색을 수행하고, 미토콘드리아에서 세포질내로 방출된 시토크롬-C이 방출된 세포의 수를 측정하였다(도 4b). 이때, 대조군으로는 진세노사이드를 처리하지 않은 실험군을 사용하였다.
도 4b는 C-K 또는 PPD와 독소루비신의 동시 처리시간에 의한 미토콘드리아로부터 시토크롬-C가 방출된 세포수를 나타내는 그래프이다. 도 4b에서 보듯이, 6시간이 경과된 후, 독소루비신을 단독으로 처리한 대조군에서는, 전체 세포의 7%에서 시토크롬-C가 방출되었으나, C-K와 독소루비신을 처리한 실험군에서는 전체 세포의 20%에서 시토크롬-C가 방출되었고, PPD와 독소루비신을 처리한 실험군에서는 전체 세포의 43%에서 시토크롬-C가 방출됨을 확인하였다.
따라서, C-K 또는 PPD는 독소루비신에 의한 미토콘드리아에서 시토크롬-c의 방출을 촉진하는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 3-2: 미토콘드리아의 손상유도에 미치는 효과
상기 실시예 3-1의 결과로부터 C-K 또는 PPD가 독소루비신에 의한 미토콘드리아에서 시토크롬-c의 방출을 촉진시킬 수 있음을 확인하였으므로, 상기 C-K 또는 PPD가 미토콘드리아를 손상시킬 수 있는지를 확인하고자 하였다.
즉, MCF-7 세포에 10 ㎍/㎖의 C-K 또는 PPD를 포함하는 배지를 가하고 24시간 동안 배양하였다. 배양이 종료된 세포에 4% 파라포름알데히드를 가하여 고정시키고, 0.5% Triton X-100 용액을 가하여 천공한 다음, Tom-20을 사용하여 미토콘드리아를 염색하였다. 염색이 종료된 후, 상기 세포를 PBS로 세척하고, 공초점 현미경으로 촬영하고, 발색된 형광수준을 측정하였다(도 5a). 이때, 음성 대조군으로는 진세노사이드를 처리하지 않은 실험군을 사용하고, 양성 대조군으로는 PPD류 진세노사이드 화합물인 F2를 처리한 실험군을 사용하였다.
도 5a는 C-K 또는 PPD가 처리된 MCF-7 세포에 포함된 미토콘드리아를 형광염색한 결과를 나타내는 사진이다. 도 5a에서 보듯이, 음성 대조군의 미토콘드리아에 비하여, 양성 대조군의 미토콘드리아는 별다른 변화를 나타내지 않았으나, C-K 또는 PPD가 처리된 MCF-7 세포에 포함된 미토콘드리아는 손상됨을 확인하였다.
이에 따라, 상기 배양된 각 세포를 대상으로 웨스턴블럿 분석을 수행하여, 미토콘드리아 분열에 관여하는 단백질(Drp1, Fis1 또는 OPA-3)과 미토콘드리아 융합에 관여하는 단백질(Mfn1. Mfn2 또는 OPA1)의 발현수준을 비교하였다(도 5b).
도 5b는 C-K 또는 PPD가 처리된 MCF-7 세포에서 발현되는 미토콘드리아 분열에 관여하는 단백질(Drp1, Fis1 또는 OPA-3)과 미토콘드리아 융합에 관여하는 단백질(Mfn1. Mfn2 또는 OPA1)의 발현수준을 나타내는 웨스턴블럿 분석결과를 나타내는 사진이다. 도 5b에서 보듯이, C-K 또는 PPD가 처리된 MCF-7 세포에서는 미토콘드리아 분열에 관여하는 단백질인 OPA-3의 발현수준이 증가하는 반면, 미토콘드리아 융합에 관여하는 단백질인 Mfn2의 발현수준이 감소됨을 확인하였다.
상기 실시예 3-1 및 3-2의 결과를 종합하면, C-K 또는 PPD는 미토콘드리아의 손상을 유발할 수 있으므로, 상기 C-K 또는 PPD를 독소루비신과 함께 처리한 경우에는, 상기 C-K 또는 PPD가 독소루비신의 처리에 의하여 미토콘드리아로부터 방출되는 시토크롬-C의 방출수순을 증가시켜서, 독소루비신의 항암활성을 향상시킬 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 4: 미토콘드리아의 분열과 독소루비신의 항암활성의 연관성 분석
상기 실시예 3-2의 결과로부터 C-K 또는 PPD는 미토콘드리아의 손상을 유발시킴을 확인하였으므로, 미토콘드리아 융합에 관여하는 단백질(Mfn1 또는 Mfn2)의 발현을 억제시켜서, 미토콘드리아의 분열을 유발하고, 이에 독소루비신을 처리하여 미토콘드리아의 분열과 독소루비신의 항암활성의 연관성을 분석하고자 하였다.
구체적으로, Mfn1 및 Mfn2를 표적으로 하는 siRNA를 합성하고, 음성 대조군으로서 랜덤 siRNA를 합성하였다.
대조군: 5'-CCUACGCCAAUUUCGU-3'-dTdT(서열번호 1)
Mfn1: 5'-GUGUAGAUUCUGGUAAUGA-3'-dTdT(서열번호 2)
Mfn2: 5'-CGAUGCAACUCUAUCGUCA-3'-dTdT(서열번호 3)
상기 합성된 각 siRNA를 MCF-7 세포에 도입하여 12시간 동안 배양하고, 상기 세포를 siRNA가 포함되지 않은 정상 배지에서 48시간 동안 다시 배양한 다음, 이들 세포에서 발현되는 미토콘드리아 융합에 관여하는 단백질(Mfn1 또는 Mfn2)의 발현수준을 웨스턴블럿 분석을 통해 확인하였다(도 6a).
도 6a는 미토콘드리아 융합에 관여하는 단백질(Mfn1 또는 Mfn2)의 발현을 억제하는 siRNA에 의한 상기 단백질의 발현억제를 확인한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 6a에서 보듯이, 상기 siRNA의 도입에 의하여 미토콘드리아 융합에 관여하는 단백질(Mfn1 또는 Mfn2)의 발현이 억제됨을 확인하였다.
한편, 상기 합성된 각 siRNA를 MCF-7 세포에 도입하여 12시간 동안 배양하고, 상기 세포를 siRNA가 포함되지 않은 정상 배지에서 48시간 동안 다시 배양한 다음, 5μM의 독소루비신 또는 20μM의 타목시펜을 처리하고 24시간 동안 배양하였으며, 배양이 종료된 후, WST-1 분석을 통해 MCF-7 세포의 생존율을 비교하였다(도 6b). 이때, 대조군으로는 독소루비신 또는 타목시펜을 처리하지 않고 배양한 세포를 사용하였다.
도 6b는 미토콘드리아 분열이 유발된 세포에 대한 독소루비신과 타목시펜의 항암활성을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 6b에서 보듯이, 독소루비신 또는 타목시펜이 처리되지 않은 세포에서는 미토콘드리아 분열이 유도된 후에도 생존율이 감소되지 않았으나, 이에 독소루비신 또는 타목시펜을 처리한 경우에는 항암활성을 나타내었고, 특히 타목시펜에 비하여 독소루비신을 처리한 경우에, 현저하게 높은 수준의 항암활성이 나타남을 확인하였다. 아울러, 미토콘드리아 분열이 유도된 경우, Mfn1의 발현이 억제된 경우 보다는 Mfn2의 발현이 억제된 경우에 독소루비신의 항암활성이 더욱 증가함을 확인하였다. 그러나, 타목시펜이 처리된 경우에는 각 siRNA의 처리에 따른 항암활성의 차이가 나타나지 않음을 확인하였다.
상기 실시예 1 내지 4의 결과를 종합하면, 도 7에 도시된 바와 같이, PPD류 진세노사이드 화합물에 속하는 C-K 또는 PPD는 미토콘드리아 융합단백질에 속하는 Mfn2의 발현을 억제시켜서, 미토콘드리아의 분열을 촉진하고, 그 결과에 따라 미토콘드리아가 손상되며, 이러한 상태에서 미토콘드리아 매개성 항암활성을 나타내는 항암제(독소루비신)을 암세포에 처리하면, 손상된 미토콘드리아의 외막을 더욱 손상시켜서, 미토콘드리아로부터 세포질로 시토크롬-C가 더욱 많이 방출되며, 이처럼 방출된 시토크롬-C는 아팝토좀을 통한 세포자멸을 유도하게 되어, 결과적으로는 암세포를 사멸시키게 된다.
따라서, C-K 또는 PPD와 미토콘드리아 매개성 항암활성을 나타내는 항암제를 복합적으로 사용할 경우, 상기 항암제의 투여량을 감소시켜서 보다 안전한 항암치료를 수행할 수 있음을 알 수 있었다.

Claims (7)

  1. (a) 분리된 세포에 PPD(protopanaxadiol)류 진세노사이드 화합물과 미토콘드리아의 분열을 조절할 수 있을 것으로 예상되는 후보 화합물을 처리하는 후보 화합물 처리단계;
    (b) 상기 후보 화합물을 처리한 세포 내 미토콘드리아의 분열수준을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 후보 화합물을 처리하지 않은 음성 대조군과 비교하여 상기 미토콘드리아의 분열수준을 촉진 또는 억제하는 후보 화합물을 선별하는 단계를 포함하는, 미토콘드리아 분열 조절제의 스크리닝 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 분리된 세포는 인슐린 분비세포 또는 암세포인 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 PPD류 진세노사이드 화합물은 하기 화학식 1의 PPD(protopanaxadiol)인 것인 방법.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2015006825-appb-I000003
  4. 제1항에 있어서,
    상기 PPD류 진세노사이드 화합물은 하기 화학식 2의 컴파운드-K(compound-K, C-K)인 것인 방법.
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2015006825-appb-I000004
  5. PPD(protopanaxadiol)류 진세노사이드 화합물을 포함하는 미토콘드리아 분열 조절제 스크리닝용 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 PPD류 진세노사이드 화합물은 PPD(protopanaxadiol) 또는 컴파운드-K(compound-K, C-K)인 것인 조성물.
  7. 제5항 또는 제6항의 조성물을 포함하는, 미토콘드리아 분열 조절제 스크리닝용 키트.
PCT/KR2015/006825 2015-05-22 2015-07-02 미토콘드리아 분열 조절제의 스크리닝 방법 WO2016190480A1 (ko)

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