KR20020042020A

KR20020042020A - 디하이드록시벤즈알데하이드 또는 이의 유도체를유효성분으로 하는 미토콘드리아 보호제 및 항노화제

Info

Publication number: KR20020042020A
Application number: KR1020000071708A
Authority: KR
Inventors: 정해영; 최재수; 양영환; 김애라
Original assignee: 정해영; 남홍길; 최재수; (주)제노마인
Priority date: 2000-11-29
Filing date: 2000-11-29
Publication date: 2002-06-05

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 디하이드록시벤즈알데하이드 (dihydroxybenzaldehyde) 또는 이의 유도체를 유효 성분으로 하는 미토콘드리아 보호제 및 항노화제 조성물에 관한 것이다. 상기 디하이드록시벤즈알데하이드 또는 이의 유도체들은 강력한 하이드록시 라디칼 소거능을 나타내므로, 하이드록시 라디칼에 의해 유도되는 미토콘드리아 막의 지질과산화를 방지하고, 항산화 작용을 나타내며, 세포를 산화적 손상으로부터 보호하는 글루타치온의 수준을 유지시켜 미토콘드리아 손상을 억제할 수 있다. 또한, 세포에 필요한 에너지를 공급하는 미토콘드리아의 하이드록시 라디칼에 의한 손상을 효과적으로 억제하므로 라디칼 등의 지속적인 축적에 의해 발생하는 노화에 대한 억제 효과가 뛰어나 효과적인 항노화제로 사용될 수 있다.

Description

디하이드록시벤즈알데하이드 또는 이의 유도체를 유효성분으로 하는 미토콘드리아 보호제 및 항노화제{Use of dihydroxybenzaldehyde and its derivatives as a mitochondria protective agent and an antiaging agent}

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 디하이드록시벤즈알데하이드 또는 이의 유도체를 유효 성분으로 하는 미토콘드리아 보호제 및 항노화제 조성물에 관한 것이다.

노화란 인간이 태어나서 사망할 때까지 지속적으로 일어나는 기능적, 구조적, 생화학적 과정으로 인체를 구성하고 있는 세포와 신체조직 전체에서 일어나며, 대사속도의 저하, 질병 증가, 적응력 저하 등을 나타내어 궁극적으로는 세포와 신체 전체의 사망에 이르게 되는 현상이다. 노화 과정 및 원인을 설명하는 학설은 크게 유전자설 (Chung,Kor. J. Gerontol.2:1-11, 1992)과 소모설 (Chung,Kor. J. Gerontol.2:1-11, 1992)로 나뉜다. 유전자설은 생물체가 태어날 때부터 이미수명을 결정하는 프로그램이 짜여진 유전자를 갖고 있으며 노화와 관련된 유전자의 활동에 의해 예정된 순서대로 노화가 진행된다는 이론으로 노화시계이론 (aging clock theory), 다면발현성 유전자설 (pleiotropic gene theory), 텔로미어 이론 (telomere theory), 돌연변이 축적설 (mutation accumulation theory) 등이 대표적이다. 한편, 소모설은 기계를 오래 사용하면 소모가 되는 것처럼 생물체의 구성 세포가 시간의 경과에 따라 기능이 저하된다고 설명하거나 (wear & tear theory), 유해물질의 축적에 의한 것으로 설명하며, 특히 그 중에서도 인체 대사과정, 방사능 노출, 바이러스, 중금속 및 대기오염 등을 통해 생성되는 자유 라디칼들이 독성이 강한 물질을 형성함으로써 노화를 촉진할 뿐 아니라 노화와 관련된 각종 질병을 일으킨다는 자유 라디칼 이론 (free radical theory)이 가장 유력한 학설로 받아들여지고 있다.

자유 라디칼 (free radical)은 최외곽 전자궤도에 짝짓지 않은 전자를 하나 가지는 물질을 총칭하는데, 그 구조가 매우 불안정하여 전자를 얻어 안정화하려는 성질로 인해 반응성이 매우 높다. 특히 산소에서 유래되는 자유 라디칼을 활성 산소라 칭하며, 이들은 단백질, 지질, 탄수화물 등과 반응하여 지질과산화, DNA 손상, 단백질의 산화 등을 유발하여 세포내 구조물에 손상을 야기하며 결과적으로 세포의 사멸을 초래하게 된다. 예를 들어 수퍼옥사이드 (superoxide,^.O₂ ^-), 과산화수소 (H₂O₂), 하이드록시 라디칼 (hydroxyl radical, ㆍOH) 등과 같은 활성 산소종 (reactive oxygen species)이 대표적이다.

이러한 자유 라디칼에 의한 손상으로부터 세포를 보호하기 위하여 항산화 효소 또는 항산화제에 대한 연구가 활발히 진행되어 왔으며, 천연물 유래 항산화제와 합성 항산화제가 다수 개발되어 의약품과 식품 분야에서 이용되고 있다. 특히 비타민 C, E, 셀레늄 (Se), 수퍼록사이드 디스뮤타제 (superoxide dismutase), 글루타치온 퍼록시다제 (glutathione peroxidase) 등이 자유 라디칼에 의한 산화작용의 억제에 효과가 있는 것으로 보고되어 있다 (Takenaga Met al.,Free Radic. Biol. Med.26:1117-1125, 1999). 또한 일부 페놀 유도체들 (phenol derivatives)도 항산화 작용을 갖는 것으로 보고되어 있으며 (Haenen GRet al., Biochem. Biophys. Res. Commun236:591-593, 1997) , 녹차에서 추출한 EGCG 그리고 GCG는 높은 항산화 활성을 나타내었으나 (Chung HYet al., J. Agric. Food Chem.46:4484-4486, 1998), 이들의 세포에 대한 산화적 손상 억제의 작용과 기전은 알려져 있지 못한 실정이다. 따라서 페놀 유도체와 같은 기존 물질을 모델로 여러 위치에서 치환, 변형을 가하여 활성 산소종에 대한 강력한 항산화력을 갖는 물질을 개발하고 그 작용기전을 규명하여 효과적인 항노화제를 개발하기 위한 연구가 절실히 요구된다.

다수의 약리 작용을 나타내는 단삼은 카페인산 (caffeic acid), 3,4-디하이드록시페닐아세트산 (3,4-dihydroxyphenylacetic acid) 등의 4번 탄소 위치가 치환된 카테콜 (4-substituted catechol)기를 가지는 다수의 페놀성 물질을 함유하는 것으로 보고되어 왔다. 이들은 강한 항산화 작용을 나타내어 자유 라디칼 생성을 저해하고, 지질 과산화를 방지하며, SOD의 활성을 유지시켜 노화를 저해하고 (Kim JWet al., Kor. J. Gerontol.8(1):83-89, 1998) 심장질환을 호전시키는 작용을나타냄이 보고되었다 (Xing ZQet al., Chung Kuo Chung Hsi I Chieh Ho Tra Chih, May 16(5): 287-288, 1996).

특히 자유 라디칼에 의한 세포의 손상이 심하게 나타나는 세포 소기관은 미토콘드리아 (mitochondria)이다. 미토콘드리아는 탄수화물, 지방 등의 산화적 인산화 과정을 통해 세포의 에너지인 ATP를 공급하는 중요한 기관이다. 특히, 미토콘드리아는 활성 산소에 의해 민감하게 손상받는데, 손상시에는 미토콘드리아 막 투과성 전이 (mitochondrial permeability transition)가 활성화되고 거대채널을 활성화시키며, 이로부터 시토크롬 c (cytochrome c)가 유리되고 지질이 과산화되는 등 급격한 산화를 거쳐 결국 세포의 사멸, 세포예정사 (apoptosis) 또는 괴사 (necrosis) 등을 유발하게 된다 (Gunter TE.et al., Am. J. Physiol.267:C313-C339, 1994). 손상받은 미토콘드리아는 과량의 활성 산소를 생성시키므로 세포의 산화적 손상은 더욱 증폭된다. 따라서 세포 내에서 중요한 역할을 담당하는 세포 소기관인 미토콘드리아를 산화적 손상으로부터 보호함으로써 산화적 손상의 축적에 의해 진행되는 노화를 억제할 수 있을 것으로 기대된다.

이에 본 발명자들은 활성 산소종에 의한 세포의 산화적 손상과 이로 인한 노화를 억제할 수 있는 새로운 화합물을 찾고자 연구한 결과, 활성 산소종에 의한 미토콘드리아의 산화적 손상이 디하이드록시벤즈알데하이드 또는 이의 유도체에 의해 특이적으로 억제됨을 밝혀내어 이들 화합물이 미토콘드리아 보호 작용을 통해 항노화제로 이용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 활성 산소종에 의한 세포 내 미토콘드리아의 산화적 손상을 특이적으로 억제하여 미토콘드리아 보호제 및 항노화제로 유용한 화합물 및 이들을 유효성분으로 하는 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 하이드록시 라디칼에 대해 소거 효과를 갖는 디하이드록시벤즈알데하이드 및 이의 유도체들의 화학 구조식을 나타내는 그림이고,

도 2a는 하이드록시 라디칼에 의해 유도되는 미토콘드리아 투과성 전이 (mitochondrial permeability transition, MPT)가 3,4-디하이드록시벤즈알데하이드 (3,4-DB)에 의해 억제되는 것을 나타내는 그래프이고,

CON : 대조군 (미토콘드리아 시료)

OH + 3,4-DB : 하이드록시 라디칼과 3,4-DB로 병용 처리

도 2b는 하이드록시 라디칼에 의해 유도되는 미토콘드리아 투과성 전이가 2,3-디하이드록시벤즈알데하이드 (2,3-DB)에 의해 억제되는 것을 나타내는 그래프이고,

OH + 2,3-DB : 하이드록시 라디칼과 2,3-DB로 병용 처리

도 3은 하이드록시 라디칼에 의해 유도되는 미토콘드리아로부터의 시토크롬 c의 유리가 3,4-디하이드록시벤즈알데하이드 (3,4-DB)와 2,3-디하이드록시벤즈알데하이드 (2,3-DB)에 의해 억제되는 것을 나타내는 그래프이고,

EGTA : 칼슘과 EGTA로 병용 처리

2,3-DB : 하이드록시 라디칼과 2,3-DB로 병용 처리

3,4-DB : 하이드록시 라디칼과 3,4-DB로 병용 처리

도 4a는 분리된 간세포의 미토콘드리아에서 활성 산소의 생성이 3,4-디하이드록시벤즈알데하이드에 의해 억제되는 것을 나타내는 그래프이고,

도 4b는 분리된 간세포의 미토콘드리아에서 활성 산소의 생성이 2,3-디하이드록시벤즈알데하이드에 의해 억제되는 것을 나타내는 그래프이고,

도 5a는 하이드록시 라디칼에 의해 유도되는 미토콘드리아 막의 지질과산화가 3,4-디하이드록시벤즈알데하이드 (3,4-DB)에 의해 억제되는 것을 나타내는 그래프이고,

MDA : 말론디알데하이드 (malondialdehyde)

3,4-디하이드록시벤즈알데하이드 : 하이드록시 라디칼과 3,4-DB로 병용 처리

도 5b는 하이드록시 라디칼에 의해 유도되는 미토콘드리아 막의 지질과산화가 2,3-디하이드록시벤즈알데하이드 (2,3-DB)에 의해 억제되는 것을 나타내는 그래프이고,

2,3-디하이드록시벤즈알데하이드 : 하이드록시 라디칼과 2,3-DB로 병용 처리

도 6a는 하이드록시 라디칼에 의해 유도되는 미토콘드리아 내 글루타치온 감소가 3,4-디하이드록시벤즈알데하이드에 의해 억제되는 것을 나타내는 그래프이고,

GSH : 글루타치온 (glutathione)

도 6b는 하이드록시 라디칼에 의해 유도되는 미토콘드리아 내 글루타치온 감소가 2,3-디하이드록시벤즈알데하이드에 의해 억제되는 것을 나타내는 그래프이이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 디하이드록시벤즈알데하이드 또는 이의 유도체들을 유효성분으로 하는 미토콘드리아 보호제 및 항노화제를 제공한다.

화학식 1

구체적으로 본 발명의 디하이드록시벤즈알데하이드로는 3,4-디하이드록시벤즈알데하이드, 2,3-디하이드록시벤즈알데하이드, 2,4-디하이드록시벤즈알데하이드, 2,5-디하이드록시벤즈알데하이드 또는 3,5-디하이드록시벤즈알데하이드 등이 바람직하다.

또한 본 발명의 디하이드록시벤즈알데하이드 유도체로는 2,3,4-트리하이드록시벤즈알데하이드, 2,4,6-트리하이드록시벤즈알데하이드, 3,4-디하이드록시벤조산또는 3,4-디하이드록시페닐아세트산 등이 이용될 수 있다.

상기 화합물들의 구조식은도 1에 나타난 바와 같다.

상기 화합물들은 세포 구조물 중 활성 산소에 의한 미토콘드리아 막의 지질과산화를 억제하고, 활성 산소에 의한 미토콘드리아의 투과성 전이 (MPT) 활성화를 억제하며, 손상된 미토콘드리아로부터 시토크롬 c의 유리를 저해하고, 미토콘드리아 내의 활성 산소 생성을 억제할 뿐만 아니라, 미토콘드리아 내 항산화 물질인 글루타치온 함량을 유지시키는 작용을 한다. 이를 통해 활성 산소에 의한 산화적 손상에 따른 세포의 사멸, 세포예정사 및 괴사 등을 억제하여 궁극적으로는 항노화 물질로 이용될 수 있다.

상기 디하이드록시벤즈알데하이드 또는 이의 유도체들은 일반적인 공지의 화학합성 방법에 따라 제조될 수도 있으나, 바람직하게는 단삼 (Salvia miltiorrhiza), 율무 (Coix lacryma-jobi L.) 등과 같이 상기 화합물을 다량 함유하고 있는 것으로 알려진 식물체의 추출물을 이용할 수도 있으며, 이 경우 안전성 및 비용 면에서 화학합성에 의한 경우보다 유리하다.

예를 들어 본 발명의 디하이드록시벤즈알데하이드를 포함하는 단삼 추출물을 이용하는 경우, 단삼 추출물은 에탄올 추출물을 사용하거나 에탄올 추출물을 물에 현탁하여 디클로로메탄 또는 클로로포름으로 분획하여 얻은 클로로포름 분획물 등을 사용하는 것이 바람직하다.

단삼은 널리 사용되는 민간 생약재의 하나로 B형 간염 치료 (대한민국 특허공개 2000-27306)와 알콜탐닉 치료 (대한민국 특허공개 1999-14692) 등을 위한 약재로 알려져 있다. 또한 단삼은 다량의 디하이드록시벤즈알데하이드 유도체를 함유하고 있으며, 이에 더하여 항산화 작용을 갖는 것으로 알려진 카페인산 (caffeic acid)를 포함하고 있다 (Weng XCet al., J. Agric. Food Chem.40:1331-1336, 1992). 그러나, 아직까지 단삼 등에 다량 함유되어 있는 디하이드록시벤즈알데하이드 유도체가 활성 산소에 의한 미토콘드리아의 산화적 손상을 억제함으로써 미토콘드리아 보호제 및 항노화제로 이용될 수 있음은 밝혀진 바가 없다.

한편, 본 발명의 미토콘드리아 보호제 또는 항노화제용 약학적 조성물은 본 발명에 따른 1 종 이상의 디하이드록시벤즈알데하이드 또는 이의 유도체를 포함하며, 이외에도 비독성, 불활성, 제약상 적합한 부형제 등을 추가적으로 포함하여 제제화할 수 있다. 본 발명의 화합물은 임상 투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있으며, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

본 발명은 또한 투약 단위의 제형들을 포함한다. 제형은 개별 투약 형태, 예를 들면 정제, 피복 정제, 캡슐제, 환제, 좌약 및 앰플제로 존재하고, 약제 중 유효 화합물의 함량은 개별 투약량의 분율 또는 배수에 해당한다. 투약 단위는, 예를 들면 개별 투약량의 1, 2, 3 또는 4배로, 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배를 함유할 수 있다. 개별 투약량은 바람직하기로는 유효 화합물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다.

비독성이고 불활성인 제약상 적합한 부형제는 고상, 준고상 또는 액상 희석제, 충전제 및 모든 유형의 제형 보조물이다.

바람직한 제형으로는 정제, 피복 정제, 캡슐제, 환제, 과립제, 좌약, 액제, 현택액제 및 에멀전제, 페이스트제 (pastes), 연고제, 겔제, 크림제, 로션제, 산제 및 분무제 등이 포함된다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다.

본 발명의 미토콘드리아 보호제 또는 항노화제용 약학적 조성물에서 디하이드록시벤즈알데하이드 또는 이의 유도체의 유효용량은 5∼20 μM이고, 바람직하게는 10∼20 mg/kg이다. 투여는 치료할 객체의 체질 특이성 및 체중, 질병의 종류 및 심도, 제형의 성질, 의약품 투여의 성질, 및 투여기간 또는 간격을 고려해서 변화시킬 수 있으나 일반적으로 하루 1∼3회 투여되는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는 활성 산소종 중 하이드록시 라디칼에 의한 미토콘드리아의 산화적 손상에 대하여 디하이드록시벤즈알데하이드 (이하 "DB"라한다) 및 이의 유도체에 의한 억제 효과를 탐색하였다. 3,4-디하이드록시벤즈알데하이드 (3,4-DB), 3,4-디하이드록시벤조산, 3,4-디하이드록시페닐아세트산, 2,3-디하이드록시벤즈알데하이드 (2,3-DB), 2,4-디하이드록시벤즈알데하이드 (2,4-DB), 2,5-디하이드록시벤즈알데하이드 (2,5-DB), 3,5-디하이드록시벤즈알데하이드 (3,5-

DB), 2,3,4-트리하이드록시벤즈알데하이드, 2,4,6-트리하이드록시벤즈알데하이드 등 9개의 DB 및 이의 유도체를 이용하여 하이드록시 라디칼에 대한 소거력과 미토콘드리아의 산화적 손상 보호 효과를 조사한 결과, DB 유도체들 모두 강한 하이드록시 라디칼 소거력과 미토콘드리아의 산화적 손상에 대한 억제효과를 나타냈으며, 특히 2,3-DB와 3,4-DB가 탁월한 효과를 나타내었다.

DB의 활성 산소에 대한 소거력을 분석하기 위해, 활성 산소들 중에서 가장 독성이 강한 하이드록시 라디칼(hydroxyl redical, ㆍOH)을 선택하여 이용하였는데, 상기 하이드록시 라디칼은 Fe²⁺를 과산화수소(H₂O₂)와 반응시켜 얻었다. 하이드록시 라디칼은 비형광성(non-fluorescent)의 2,7-디클로로하이드로플루오르세인 (2.7-dichlorodihydrofluorescein, DCHF)을 형광성의 2,7-클로로플루오르세인(2.7-dichlorofluorescein, DCF)으로 산화시킨다. 따라서, 본 발명에서는 DB 첨가에 따른 시료의 형광도 변화를 측정함으로써 DB에 의한 하이드록시 라디칼 소거 능력을 측정하였다. DB의 하이드록시 라디칼 소거력은 하이드록시 라디칼로 처리한 시료의 형광도를 50% 감소시키는 DB 첨가농도 (IC₅₀, μM)로서 나타내었다.

그 결과, 9종류의 DB 및 이의 유도체의 IC₅₀값은 6-50 μM이었으며, 하이드록시 라디칼에 의한 DCHF의 DCF로의 산화가 낮은 농도의 DB에 의해 강력히 억제됨을 확인하였다. 따라서, DB 및 이의 유도체들이 하이드록시 라디칼 소거제로 작용함을 알 수 있다.

세포의 구성물 중 미토콘드리아는 활성 산소에 민감하게 손상된다. 손상된 미토콘드리아에서는 미토콘드리아 투과성 전이 (MPT)가 활성화되어 거대채널 활성화, 지질과산화, 시토크롬 c의 유리, 글루타치온 양의 감소 등이 일어나며, 이러한 미토콘드리아의 산화적 손상은 세포의 사멸, 세포예정사 (apoptosis), 괴사(necrosis)를 유도하는 것으로 알려져 있다.

따라서 본 발명에서는 하이드록시 라디칼에 의한 미토콘드리아의 산화적 손상을 평가하기 위해 MPT 활성을 측정하였다. MPT 활성은 SD 래트 (Sprague-Dawley rat)의 간장 균질액에서 분리한 미토콘드리아를 하이드록시 라디칼과 2,3-DB 또는 3,4-DB로 처리한 후 흡광도 (absorbance)의 변화를 분석함으로써 측정하였다. MPT가 진행됨에 따라 거대채널 (megachannel)이 활성화되어 세포막의 밀도가 감소하고 이에 따라 흡광도가 감소된다.

실험 결과, 강력한 MPT 유도제로 알려진 칼슘을 처리한 경우와 마찬가지로 하이드록시 라디칼에 의해서도 거대채널의 활성화에 따른 흡광도 감소가 뚜렷하게 나타났다. 그러나, DB를 하이드록시 라디칼과 병용 처리한 경우 흡광도 감소가 현저히 완화되었으며, 특히 50 μM의 DB를 처리한 경우 하이드록시 라디칼에 의해 유도되는 MPT 및 거대채널 활성화가 60% 가량 억제되었다. 상기 결과로부터, DB가 강력한 하이드록시 라디칼 소거제로 작용하여 MPT 활성화를 억제함으로써 하이드록시 라디칼에 의한 미토콘드리아의 산화적 손상을 억제함을 알 수 있다.

손상된 미토콘드리아에서 MPT가 활성화되면 미토콘드리아 막 외로 시토크롬 c가 유리된다. 본 발명의 또 다른 실시예에서는 하이드록시 라디칼에 의한 미토콘드리아의 산화적 손상을 평가하기 위해 시토크롬 c의 유리를 웨스턴 블럿 분석법 (Western blot analysis)을 이용하여 관찰하였다. 간 균질액에서 분리한 미토콘드리아를 하이드록시 라디칼과 2,3-DB 또는 3,4-DB로 처리하고 원심분리한 다음, 미토콘드리아를 제거한 상등액을 회수하여 전기영동하였다. 전기영동 후 니트로셀룰로스 막으로 단백질을 전이시키고 시토크롬 c에 대한 토끼의 항체와 2차 항체로 항토끼 IgG 항체를 반응시켜, ECL 검출시약과 반응시킨 후 X-선 필름에 감광시켜 시토크롬 c이 유리된 양을 측정하였다.

실험 결과, 강력한 MPT 유도제로 알려진 칼슘을 처리한 경우 거대채널이 활성화되어 시토크롬 c 유리가 증가되었으나, 칼슘 킬레이트화제 (chelator)인 EGTA 를 칼슘과 병용투여한 경우에는 시토크롬 c 유리량이 감소되었다. 하이드록시 라디칼을 처리한 경우에도 시토크롬 c 유리가 증가되었으나, DB와 하이드록시 라디칼을 병용 처리한 경우 MPT를 통한 시토크롬 c의 유리가 현저히 감소됨을 확인하였다. 따라서 DB 및 이의 유도체가 하이드록시 라디칼의 MPT 유도 작용을 억제하며미토콘드리아에서 시토크롬 c의 유리를 저해하여 미토콘드리아의 산화적 손상을 억제함을 알 수 있다.

하이드록시 라디칼을 포함한 활성 산소종은 생체 내 미토콘드리아에서 자체적으로 생성되기도 하며, 특히 손상된 미토콘드리아에서는 활성 산소의 생성이 증가된다. 본 발명의 또 다른 실시예에서는 DB가 생체 내 미토콘드리아에서의 활성 산소 생성에 미치는 영향을 조사하였다. 간세포에서 분리한 미토콘드리아에 2,7-디클로로디하이드로플루오르세인 디아세테이트 (2.7-dichlorodihydrofluorescein diacetate, DCHFDA)를 첨가하면 시간에 따라 시료의 형광도 (fluorescence intensity)가 증가하게 되는데, 이는 미토콘드리아에서 자체 생성되는 활성 산소에 의해 비형광물질 DCHFDA가 형광물질인 DCFDA (2.7-dichlorofluorescein diacetate)로 산화되기 때문이다. DCHFDA는 탈아세틸화 (deacetylation)되면 DCHF가 되는데, 조직 균질액 등에는 이미 에스터라제 (esterase)가 충분하므로 DCHFDA를 그냥 사용하지만 균질액이 아닌 경우에는 시험관에서 DCHFDA와 에스터라제를 반응시켜 DCHF로 만든후 활성산소종과 반응시키게 된다. 따라서 미토콘드리아 시료의 단백질 1 mg 당 형광도 증가 속도(FL/min)를 측정함으로써 미토콘드리아 내 활성 산소 생성 속도를 알 수 있다. 본 발명에서는 미토콘드리아 내의 활성 산소 생성에 대한 DB의 억제 효과를 조사하기 위해, 간세포에서 분리한 미토콘드리아에 DCFDA를 첨가한 후 DB의 첨가에 따른 형광도 증가속도를 측정하였다.

분리된 간세포의 미토콘드리아에서 생성된 활성 산소 생성속도는 DB를 첨가하지 않은 경우 단백질 1 mg 당 4.74±0.41 FL/min이었다. 2,3-DB를 각각 2, 10,50μM 첨가함에 따라 활성 산소 생성속도가 각각 단백질 1 mg 당 3.18±0.29, 2.23±0.16, 1.49±0.17 FL/min로 감소되었으며, 2,3-DB 첨가 농도가 클수록 분리된 간세포의 미토콘드리아에서 활성 산소 생성 억제 작용이 증가하였다.

하이드록시 라디칼을 포함한 활성 산소종은 생체막을 구성하는 지방산을 산화시켜 과산화지질의 양을 증가시키는데, 특히 손상된 미토콘드리아에서는 과산화지질의 생성이 증가된다. 본 발명의 또 다른 실시예에서는 하이드록시 라디칼에 의해 손상된 미토콘드리아에 있어 DB에 의한 지질과산화 억제 효과를 확인하기 위하여, TBA (Thiobarbituric acid assay; Laganiere S and Yu BP.Biochem. Biophys. Res. Comm.145:1185-1191, 1987) 방법을 사용하여 DB 첨가 농도에 따른 손상된 미토콘드리아에서의 과산화지질 함량 변화를 측정하였다. 지질과산화는 TBA 방법으로 측정되는데, TBA로 처리된 시료에 함유된 말론디알데하이드 (malondialdehyde, MDA)의 흡광도를 측정함으로써 MDA 함유량을 계산하여 이로부터 과산화지질의 양을 측정한다. 간세포에서 분리한 미토콘드리아에 하이드록시 라디칼 또는 DB와 하이드록시 라디칼을 병용 첨가하고, TBA로 처리한 후 94 ℃에서 끓여 식힌 다음, TBA-활성 물질을 1-부탄올로 추출하여 원심분리한 뒤 상등액의 형광도를 여기파장 530nm, 방출파장 590nm에서 MDA를 기준 물질로하여 농도별로 측정된 형광도로부터 기준곡선 (standard curve)을 얻고, 이 기준 곡선을 이용하여 미토콘드리아 시료의 형광도를 MDA 양 (μmol/mg 단백질)으로 환산하여 과산화지질의 양을 나타내었다.

그 결과 하이드록시 라디칼로 처리된 미토콘드리아에서 생성되는 과산화지질의 양은 단백질 1 mg당 95.33±0.57 MDA μmole이었다. 2,3-DB를 각각 2, 10, 50μM 첨가 한 경우 과산화지질 생성량은 각각 89.24±2.10, 69.15±1.32, 29.63±0.28 MDA μmole/mg 단백질로 현저하게 감소되었으며, 2,3-DB 첨가 농도가 클수록 분리된 간세포의 미토콘드리아 막의 지질과산화 억제 효과가 증가함을 확인하였다.

글루타치온 (glutathione)은 미토콘드리아에 함유되어 있는 항산화 물질 중의 하나로 알려져 있으며 글루타치온의 양을 유지함으로써 미토콘드리아의 산화적 손상을 억제할 수 있다. 본 발명에서 하이드록시 라디칼에 의해 손상된 미토콘드리아에 대하여 DB에 의한 글루타치온 양의 감소 억제 효과를 확인하기 위하여, 손상된 미토콘드리아 시료의 DB 첨가 농도에 대한 글루타치온 농도 변화에 따른 흡광도 변화를 측정하였다.

그 결과, 하이드록시 라디칼로 처리하기 전 미토콘드리아 시료의 글루타치온 양은 24 μmol/mg 단백질이었고, 하이드록시 라디칼로 처리 한 후에는 15 μmol/mg 단백질로 현저히 감소하였으나, 2,3-DB (50μM)를 첨가한 경우 글루타치온의 양은 23 μmol/mg 단백질로 그 감소 정도가 현저히 줄어들어 산화적 손상이 없는 대조군에서의 양과 비슷한 정도를 나타내었다. 따라서 DB 및 그의 유도체들은 손상된 세포내에서 글루타치온의 양을 유지시킴으로써 미토콘드리아의 산화적 손상을 억제함을 알 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> DB 유도체들에 의한 하이드록시 라디칼 소거 효과 (시험관 내 실험)

본 발명의 DB 및 이의 유도체들이 활성 산소에 대한 소거 능력를 갖는지 확인하기 위하여 활성 산소 가운데 독성이 가장 강한 것으로 알려진 하이드록시 라디칼에 대한 소거 효과를 측정하였다. 하이드록시 라디칼은 1mM Fe²⁺와 1mM 과산화수소 (H₂O₂)를 5분간 37℃에서 반응시켜 생성시켰으며, 2.5μM의 비형광성 DCHF (2.7-dichlorodihydrofluorescein)가 하이드록시 라디칼에 의해 형광성인 DCF (2.7-dichlorofluorescein)로 산화되는 반응을 이용하였다. 즉, DB 유도체들의 하이드록시 라디칼 소거 능력이 뛰어날수록 하이드록시 라디칼에 의한 형광성 DCF의 생성이 감소하는 성질을 이용하여 형광도 감소를 측정함으로써 DB 유도체들의 하이드록시 라디칼 소거력을 측정하였다. DB 또는 그 유도체들로는 시그마사 (Sigma, 미국)의 2,3-DB, 3,4-DB, 3,4-디하이드록시벤조산, 3,4-디하이드록시페닐아세트산, 2,4-DB, 2,5-DB, 3,5-DB, 2,3,4-트리하이드록시벤즈알데하이드, 2,4,6-트리하이드록시벤즈알데하이드를 사용하였다. 형광도는 여기파장 480nm와 방출파장 525nm에서 형광 광도계로 측정하였다. 이 때 IC₅₀(μM)은 하이드록시 라디칼만 첨가한 시료의 형광도 값을 50% 감소시키는 데 필요한 DB 유도체의 양(μM)이다.

하기 표 1은 DB 유도체들의 하이드록시 라디칼 소거력 (IC₅₀)를 나타내 주는 결과인데, DB 유도체 첨가에 따른 시료의 형광도 감소는 하이드록시 라디칼이 소거됨에 따라 DCFH에서 DCF로의 산화가 억제되었음을 나타낸다. 특히, 2,3-DB (IC₅₀= 6.08 μM), 2,5-DB (IC₅₀= 9.9 6μM), 3,4-DB (IC₅₀= 16.11 μM)가 탁월한 하이드록시 라디칼 소거 효과를 나타냈다.

DB 유도체에 의한 하이드록시 라디칼 소거력

실험 물질	하이드록시 라디칼 소거력 (IC₅₀: μM)
3,4-디하이드록시벤즈알데하이드	16.11 ± 2.74
3,4-디하이드록시벤조산	36.39 ± 3.15
3,4-디하이드록시페닐아세트산	31.92 ± 7.66
2,3-디하이드록시벤즈알데하이드	6.08 ± 0.81
2,4-디하이드록시벤즈알데하이드	> 50
2,5-디하이드록시벤즈알데하이드	9.96 ± 0.78
3,5-디하이드록시벤즈알데하이드	> 50
2,3,4-트리하이드록시벤즈알데하이드	19.13 ± 1.80
2,4,6-트리하이드록시벤즈알데하이드	22.74 ± 2.02

<실시예 2> 미토콘드리아 투과성 전이의 DB에 의한 억제 효과

하이드록시 라디칼에 의한 미토콘드리아 손상을 평가하기 위해 미토콘드리아 투과성 전이 (mitochondrial permeability transition, MPT) 활성 측정 실험을 실시하였다. SD 래트의 간 균질액을 1000 ×g로 10분간 원심분리한 후, 침전물을 10000 ×g에서 15분간 원심 분리하여 미토콘드리아가 함유된 침전물을 얻었다. 상기 침전물을 완충액 (250mM mannitol, 75mM sucrose, 100μM EDTA, 10mM HEPES, pH7.4)으로 2회 씻은 후 지방산을 함유하지 않은 0.5% 소 혈청 알부민 (bovine serum albumin)을 첨가하고 10000 rpm에서 원심 분리를 통해 미토콘드리아를 분리하였다. 미토콘드리아 1mg을 1ml의 완충액 (215mM mannitol, 71mM sucrose, 3mM HEPES, 5mM succinate pH 7.4)에 현탁시킨 후, 각각 50μM 칼슘, 하이드록시 라디칼 단독 처리, 또는 1mM Fe²⁺와 1mM 과산화수소처리에 의해 생성되는 하이드록시 라디칼과 디하이드록시벤즈알데하이드 유도체를 병용 처리하여, 540nm 파장에서 시간에 따른 흡광도의 변화를 측정하였다. 미토콘드리아가 손상을 입으면 미토콘드리아의 막에 존재하는 거대채널 (megachannel)이 활성화되며, 이로 인해 막의 투과성 전이 (MPT)가 일어나게 되고, 결과적으로 세포사멸, 세포예정사, 괴사 등을 유발하게 된다. 본 실험에서는 MPT 활성을 거대채널의 활성화로 인한 미토콘드리아 막의 밀도 변화로 측정하였으며, 상기 밀도 변화는 흡광도 변화로써 측정하였다. DB 유도체 중 실시예 1에서 활성 산소 소거력이 우수한 것으로 나타난 3,4-DB와 2,3-DB를 각각 2, 10 및 50 μM씩 처리하여 MPT 활성 변화에 미치는 영향을 조사하였으며, 그 결과를 각각도 2a와도 2b에 나타내었다.

도 2a과도 2b에서 볼 수 있듯이, 강력한 MPT 유도제로 알려진 칼슘 (Bernardi P.Ital. J. Neurol. Sci. Dec 20(6):395-400, 1999)을 처리한 경우 거대채널의 활성화에 따른 급격한 흡광도 감소를 관찰할 수 있었으며, 하이드록시 라디칼만을 단독으로 처리한 군에서도 칼슘 처리군과 비슷한 정도의 흡광도 감소를 보여 하이드록시 라디칼이 거대채널 활성화와 이에 따른 MPT 활성 유도로 미토콘드리아 손상을 야기함을 확인하였다. 한편, 3,4-DB와 2,3-DB를 하이드록시 라디칼과 병용 처리한 군에서는 흡광도의 감소가 현저히 완화되었으며 그 정도는 DB 처리 농도에 비례하였다. 상기 결과로부터 DB 유도체들이 하이드록시 라디칼의 MPT 유도 작용을 억제함으로써 미토콘드리아 손상을 저해하는 보호제로 작용할 수 있음을 알 수 있다.

<실시에 3> 미토콘드리아 손상에 따른 시토크롬 c 유리에 대한 DB의 억제 효과

미토콘드리아가 손상되면 MPT가 활성화되어 미토콘드리아의 막 외로 시토크롬 c (cytochrome c)가 유리된다. 미토콘드리아의 손상 평가를 위해 유리된 시토크롬 c의 양을 웨스턴 블럿으로 측정하였다. 대조군으로는 강력한 MPT 유도제인 칼슘을 처리한 군과 칼슘 킬레이트화제인 EGTA와 칼슘의 병용 처리군 및 하이드록시 라디칼 단독 처리군을 이용하였다. 먼저, 실시예 2에서 얻은 미토콘드리아 2mg을 완충액 (215mM mannitol, 71mM sucrose, 3mM HEPES, 5mM succinate, pH 7.4)에 현탁 시킨 후 각각 50μM 칼슘, 50μM 칼슘과 50μM EGTA , 그리고 상기 하이드록시 리디칼 생성을 위한 1mM Fe²⁺와 1mM 과산화수소, 그리고 상기 하이드록시 라디칼에 3,4-DB 또는 2,3-DB를 각각 50μM씩 병용 첨가하여 25℃에서 2시간 동안 반응 시켰다. 반응액을 10,000 ×g로 15분간 원심분리하고 미토콘드리아를 제거한 상등액을 회수하여 15% SDS-PAGE에 전기영동 하였다. 전기 영동 후 니트로셀룰로스 막으로 단백질을 전이시키고 1% 탈지유가 포함된 TBS-Tween 용액 (10 mM Tris. HCl,100 mM NaCl, 0.1% Tween 20, pH 7.5)에 담궈 비특이적 반응을 차단하였다. 이 후 시토크롬 c에 대한 토끼의 항체 (Santa Cruz)를 1/200로 희석한 용액과 상온에서 1시간 동안 반응시킨 다음, 2차 항체로서 항 토끼 IgG 항체를 이용하여 반응시켰다. 반응이 끝난 막을 TBS-Tween용액으로 4회 세척하고 ECL 검출시약과 1 분간 반응시킨 후 상온에서 X-선 필름에 감광시켰다.

그 결과,도 3에 나타난 바와 같이 강력한 MPT 유도제인 칼슘을 처리한 군에서는 거대채널이 활성화되어 시토크롬 c 유리량이 증가되었으며, 칼슘 킬레이트화제 (chelator)인 EGTA를 칼슘과 병용 투여한 군에는 시토크롬 c 유리량이 감소되었다. 하이드록시 라디칼 처리군에서도 시토크롬 c 유리량이 증가되었으며, 3,4-DB와 2,3-DB를 하이드록시 라디칼과 병용 처리한 군에서는 MPT를 통한 시토크롬 c 유리량이 현저히 감소되었다. 상기 결과를 통하여 DB 유도체들이 하이드록시 라디칼의 MPT 유도 작용을 억제하며 미토콘드리아에서 시토크롬 c의 유리를 저해하여 미토콘드리아 보호제로 작용함을 알 수 있다.

<실시예 4> 미토콘드리아 내 활성 산소 생성에 대한 DB의 억제 효과 (세포계 실험)

미토콘드리아에서 본 발명의 DB 유도체들이 활성 산소 생성을 억제하는 효과를 조사하기 위하여, 실시예 2에서 분리된 간세포의 미토콘드리아에 비형광성 2,7-DCFDA (2.7-dichlorodihydrofluorescein diacetate)를 첨가한 후, 디하이드록시벤즈알데하이드 유도체들의 첨가에 따른 형광도의 변화를 측정하였다. 하이드록시 라디칼을 포함한 활성 산소종은 생체 내 미토콘드리아에서 자체적으로 생성되기도 하며, 특히 손상된 미토콘드리아에서는 활성 산소의 생성이 증가된다. 간세포에서 분리한 미토콘드리아에 비형광 물질인 DCHFDA를 첨가하면 시간에 따라 시료의 형광도가 증가하게 되는데, 이는 미토콘드리아에서 자체 생성되는 활성 산소에 의해 비형광물질 DCHFDA가 형광물질인 DCFDA (2.7-dichlorofluorescein diacetate)로 산화되기 때문이다. 본 실시예에서는 미토콘드리아 시료 1mg에 3,4-DB 또는 2,3-DB를 각각 2, 10 및 50 μM씩 처리한 후, 여기 파장 480nm와 방출 파장 525nm에서 시간에 따른 형광도를 측정하여 단백질 1 mg 당 형광도 증가 속도(FL/min)를 계산함으로써 미토콘드리아 내 활성 산소 생성 속도를 측정하였다.

하기 표 2에 나타난 바와 같이, 분리된 간세포의 미토콘드리아에서 생성된 활성 산소 생성속도는 디하이드록시벤즈알데하이드를 첨가하지 않은 경우 단백질 1 mg 당 4.74±0.41 FL/min이었다.

한편 3,4-DB를 각각 2, 10, 50μM 첨가한 경우, 활성 산소 생성이 각각 단백질 1mg당 3.10 ±0.27, 2.68±0.15 및 2.38±0.04 FL/min로 억제되었고, 3,4-DB 첨가 농도가 클수록 분리된 간세포의 미토콘드리아에서 활성 산소 생성 억제 작용이 증가하였다 (도 4a참조).

분리된 간세포 미토콘드리아에서 활성 산소 생성에 대한 DB 유도체의 억제 효과

디하이드록시벤즈알데하이드유도체	첨가량 (μM)	단백질 1mg 당 활성 산소 생성속도 (FL/min)
3,4-디하이드록시벤즈알데하이드	0 (CON)	4.74
	2	3.10^*
	10	2.68^**
	50	2.38^***
2,3-디하이드록시벤즈알데하이드	0 (CON)	4.74
	2	3.18^*
	10	2.23^**
	50	1.49^***

각 값은 평균 ±표준편차, *p < 0.05, **P < 0.01, ***p > 0.001, CON; 대조군 용액 (미토콘드리아 시료)을 나타냄.

2,3-DB를 각각 2, 10, 50μM 첨가한 경우, 활성 산소 생성속도가 단백질 1 mg당 각각 3.18±0.29, 2.23±0.16 및 1.49±0.17 FL/min로 감소되었으며, 2,3-DB 첨가 농도가 클수록 분리된 간세포의 미토콘드리아에서 활성 산소 생성 억제 작용이 증가하였고, 억제효과는 3,4-DB보다 2,3-DB의 경우가 더 크게 나타났다 (도 4b참조). 따라서, 본 발명의 DB 유도체들은 미토콘드리아에서의 활성 산소 생성을 억제함으로써 미토콘드리아의 산화적 손상을 억제할 수 있음을 알 수 있다.

<실시예 5> 미토콘드리아의 지질과산화에 대한 DB의 억제 효과

본 발명의 DB 유도체들이 하이드록시 라디칼에 의해 손상된 미토콘드리아의 지질과산화 (lipid peroxidation)를 억제하는지 확인하기 위하여, DB 유도체의 첨가 농도에 따른 미토콘드리아의 과산화지질 함량 변화를 TBA (Thiobarbituric acid assay; Laganiere S and Yu BP.Biochem. Biophys. Res. Comm.145:1185-1191,1987) 방법으로 측정하였다. 하이드록시 라디칼을 포함한 활성 산소종은 생체막을 구성하는 지방산을 산화시켜 과산화지질의 양을 증가시키는데, 특히 손상된 미토콘드리아에서는 과산화지질의 생성이 증가된다.

TBA 방법을 사용하여 DB 첨가 농도에 따른 손상된 미토콘드리아에서의 과산화지질 함량 변화를 측정하였으며, 과산화지질의 양은 TBA로 처리된 시료에 함유된 MDA의 흡광도를 측정함으로써 MDA 함유량을 계산하여 이로부터 측정할 수 있다.

실시예 2에서 분리된 간세포의 미토콘드리아 1mg에 1mM Fe²⁺와 1mM 과산화수소 처리에 의해 생성되는 하이드록시 라디칼, 그리고 3,4-디하이드록시벤즈알데하이드 또는 2,3-디하이드록시벤즈알데하이드 각각 2, 10 및 50 μM와 하이드록시 라디칼을 병용 처리하고, 반응액 (1.2% TBA 용액:8.1% SDS 용액:20% 아세트산 = 20:4:30) 0.5ml을 가한 후 94^oC에서 30분간 끓여 식혔다. TBA-활성 물질을 부탄올로 추출하고 600 ×g에서 10분간 원심 분리한 후 상등액의 형광도를 여기파장 530nm, 방출파장 590nm에서 MDA를 기준 물질로하여 농도별로 측정된 형광도로부터 기준곡선 (standard curve)을 얻고, 이 기준 곡선을 이용하여 미토콘드리아 시료의 형광도를 MDA 양 (μmol/mg 단백질)으로 환산하여 과산화지질의 양을 나타내었다.

미토콘드리아 지질과산화에 의한 과산화지질 생성량 변화를 하기 표 3에 나타내었다. 하이드록시 라디칼로 처리한 미토콘드리아에서 생성된 과산화지질의 양은 단백질 1 mg당 95.33±0.57 μmole이었으나, 3,4-DB를 각각 2, 10, 50μM 첨가 한 경우 과산화지질 생성량은 단백질 1 mg당 각각 87.11±1.06, 81.43±2.46 및59.72±1.34 μmole로 감소되었다 (도 5a참조). 한편, 2,3-DB를 각각 2, 10, 50μM 첨가한 경우 과산화지질 생성량은 단백질 1 mg당 각각 89.24±2.10, 69.15±1.32 및 29.63±0.28 μmole로 감소되었으며 (도 5b참조), 3,4-DB보다 2,3-DB가 지질과산화 억제에 더욱 효과적이었다.

상기 결과는 하이드록시 라디칼에 의해 유도되는 미토콘드리아 막의 지질과산화 과정이 DB 유도체 첨가에 의해 억제될 수 있음을 나타내며, 첨가농도가 높을 수록 미토콘드리아에서 생성되는 과산화지질의 생성 억제 효과가 증가함을 보여준다.

분리된 간세포 미토콘드리아의 지질과산화에 대한 DB 유도체의 억제 효과

시료	첨가량 (μM)	과산화지질 생성량, MDA(μmole/ mg 단백질)
대조군 용액 (CON)	-	22.89
하이드록시 라디칼로 처리(OH)	1000	95.76
하이드록시 라디칼 +3,4-디하이드록시벤즈알데하이드	2	87.11^*
	10	81.43^**
	50	59.72^***
하이드록시 라디칼 +2,3-디하이드록시벤즈알데하이드	2	89.24^*
	10	69.15^**
	50	29.63^***

<실시예 6> DB 유도체에 의한 미토콘드리아 내 글루타치온 감소 억제 효과

글루타치온은 미토콘드리아에 함유되어 있으며 산화적 손상을 방지하는 주된항산화제로 알려져 있다. 본 실험에서는 본 발명의 DB 유도체들이 글루타치온 농도의 감소에 미치는 영향을 조사하기 위해 하이드록시 라디칼과 상기 유도체들을 각각 2, 10, 50μM 병용 처리한 후 글루타치온의 농도를 측정하였다. 미토콘드리아 시료에 10% TBA를 동량 가하고 5000rpm에서 25분간 원심분리하였다. 0.01M 아질산나트륨 (1vol)과 0.2N 황산 (9vol)의 혼합액 150 ㎕를 시료 150 ㎕에 첨가 후 실온에서 5분간 방치하였다. 설파민산 암모늄(sulfamic acid ammonium) 용액 100 ㎕, 1% 염화수은(II) (1vol)과 3.4% 설파닐아마이드 (sulfanilamide)/0.4N 염산 (9vol) 0.5 ㎖, 0.1% N-1-나프틸에틸렌 디아민 (N-1-naphthylethylene diamine)/0.4N 염산 0.5 ㎖을 가하여 실온에서 5분간 방치한 후, 540nm파장에서 시료에 함유된 글루타치온에 의한 흡광도를 측정하였으며, 글루타치온를 기준 물질로하여 농도별로 측정된 흡광도로부터 기준곡선 (standard curve)을 얻고, 이 기준 곡선을 이용하여 글루타치온의 양 (GSH, μmole/mg 단백질)을 계산하였다.

그 결과 표 4에 나타난 바와 같이, 하이드록시 라디칼로 처리하기 전의 미토콘드리아 시료의 글루타치온 양은 23.99±0.86 μmole/mg protein 이었고, 하이드록시 라디칼로 처리한 후에는 15.37±0.48 μmole/mg protein으로 현저히 감소하였다. 그러나, 3,4-DB 또는 2,3-DB를 각각 2, 10, 50μM 첨가한 경우 글루타치온의 양은 각각 14.65±0.96, 16.57±0.63 및 22.79±0.42 μmole/mg 단백질과 17.53±0.24, 22.55±0.63 및 23.75±0.24 μmole/mg 단백질로 다시 증가하여 하이드록시 라디칼로 처리하기 전의 글루타치온 함량을 유지하였다 (도 6a와도 6b참조). 따라서, DB 유도체들은 손상된 세포내에서 글루타치온의 양을 유지시킴으로써 미토콘드리아의 산화적 손상을 억제함을 알 수 있다.

시료	첨가량 (μM)	글루타치온의 양, GSH(μmole/ mg 단백질)
Control 용액 (CON)		23.99
하이드록시 라디칼로 처리 (OH)	1000	15.37
하이드록시 라디칼 +3,4-디하이드록시벤즈알데하이드	2	14.65
	10	16.57
	50	22.79^***
하이드록시 라디칼 +2,3-디하이드록시벤즈알데하이드	2	17.53^*
	10	22.55^**
	50	23.75^***

(각 값은 평균 ±표준편차, *p < 0.05, **P < 0.01, ***p > 0.001vs OH)

본 발명의 DB 유도체들은 활성 산소에 의한 미토콘드리아의 지질과산화를 억제하고 미토콘드리아 내에서 글루타치온의 감소와 활성 산소의 생성을 억제시켜 미토콘드리아 내의 항산화계를 유지시킴으로써, 세포내 미토콘드리아의 산화적 손상을 억제하는 미토콘드리아 보호제로 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 DB 유도체들은 하이드록시 라디칼과 같은 활성 산소종의 소거 효과가 뛰어나며, MPT 활성화에 의한 미토콘드리아의 손상을 억제하는 효과를 갖는다. 따라서 본 발명의 DB 유도체들은 세포 내 산화적 손상의 축적에 의해 진행되는 노화를 효과적으로 방지할 수 있는 항노화제로 이용될 수 있다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 디하이드록시벤즈알데하이드 (dihydroxybenzaldehyde) 또는 이의 유도체를 유효성분으로 하는 미토콘드리아 보호제용 약학적 조성물.

화학식 1
화학식 1로 표시되는 디하이드록시벤즈알데하이드 또는 이의 유도체를 유효성분으로 하는 항노화제용 약학적 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 디하이드록시벤즈알데하이드는

3,4-디하이드록시벤즈알데하이드

2,3-디하이드록시벤즈알데하이드

2,4-디하이드록시벤즈알데하이드

2,5-디하이드록시벤즈알데하이드 또는

3,5-디하이드록시벤즈알데하이드인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 디하이드록시벤즈알데하이드의 유도체는

2,3,4-트리하이드록시벤즈알데하이드

2,4,6-트리하이드록시벤즈알데하이드

3,4-디하이드록시벤조산 또는

3,4-디하이드록시페닐아세트산인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 디하이드록시벤즈알데하이드 또는 이의 유도체는 단삼 (salvia miltiorrhiza) 또는 율무 (Coix lacryma-jobi L.) 추출물의 형태로 첨가되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 활성 산소에 의한 미토콘드리아 투과성 전이 및 미토콘드리아 막의 지질과산화를 억제하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 활성 산소에 의해 손상된 미토콘드리아의 글루타치온 함량을 유지시켜 주는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 활성 산소에 의해 손상된 미토콘드리아로부터 시토크롬 c의 유리를 억제하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 미토콘드리아에서의 활성 산소 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.