WO2015105235A1 - 소포체 스트레스 저해제를 포함하는 방사선 방호용 조성물 - Google Patents

소포체 스트레스 저해제를 포함하는 방사선 방호용 조성물 Download PDF

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WO2015105235A1
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이은상
이해준
이윤진
임영빈
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한국원자력의학원
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    • A61K31/198—Alpha-amino acids, e.g. alanine or edetic acid [EDTA]

Definitions

  • the present inventors made an effort to find a substance having excellent radiation protection effect even at high level of radiation exposure and having a therapeutic effect on gastrointestinal syndrome. As a result, for the first time, it was confirmed that the vesicle stress is involved in the intestinal epithelial cell death caused by radiation exposure. The present invention was completed by confirming that the vesicle stress inhibitor protects the small intestine epithelial cells from radiation even at high levels of radiation exposure.
  • An object of the present invention is to provide a composition for radiation protection comprising a vesicle stress inhibitor as an active ingredient.
  • the present invention provides a composition for radiation protection comprising an antifoam stress inhibitor as an active ingredient.
  • the endoplasmic reticulum stress inhibitor may be a substance that inhibits signal transduction of the unfolded protein response.
  • Substances that inhibit signal transduction of the unfolded protein response may be sibp of xbp1, siRNA of atf, or a combination thereof.
  • compositions of the present invention can be used to protect individuals from radiation exposure of 10 Gy or more.
  • the radiation protection composition according to the present invention shows a protective effect even at a high level of radiation, and can be usefully used as a radiation protection agent in an environment or radiation treatment in which radiation exposure is inevitable.
  • the chemical chaperone is glycine (glycine), taurine (taurine), alanine (alanine), proline (proline), glycerol (glycerol), sorbitol (sorbitol), inositol (inositol), betaine (betaine), trimethyl Amine (trimethylamine), trimethylamine N-oxide, trehalose, heavy water, dimethyl sulfoxide, lysophosphatidic acid, 4-phenylbutyl acid (4 -phenylbutyric acid, butyrate derivatives, ursodeoxycholic acid and derivatives thereof, tauroursodeoxycholic acid, and pharmaceutically acceptable salts thereof It may be selected from.
  • the “derivative” shows the same activity as the compound of the chemical chaperone, and a compound having an antifoam stress inhibitor function may be included without limitation.
  • the endoplasmic reticulum stress inhibitor may be a substance that inhibits signal transduction of the unfolded protein response.
  • the substance that inhibits signal transduction of the unfolded protein response may be siRNA of xbp1, siRNA of atf, or a combination thereof.
  • the siRNA may be represented by SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8, and also one or more deoxythymidine (dT) may bind to the 3 'end of SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8.
  • the small intestine epithelial cells are pretreated with xRNA or atf siRNAs, each of which has two deoxythymidines bound to the 3 'end of the nucleotide having the sequence represented by SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8, followed by radiation treatment.
  • the radiation inhibitor can be at least one selected from the group consisting of antioxidants, free radical scavengers, cytokines, flanzelins and derivatives thereof.
  • the additional antioxidant or free radical scavenger that can be used in combination with the endoplasmic reticulum stress inhibitor includes amifostin, vitamin E, butylated hydroxytoluene (BTH), N acetylcysteine, thio Sodium sulfate, glutathione ethyl ester, glutathione, D methionine, cysteamine, cystamine, aminopropylmethylisothiourea, ethiol, edarabon (3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one ), Melatonin, polyniloxyl-albumin, idebenone, nitric oxide, carvedilol, alpha lipoic acid, allopurinol, 2 O octadecyl ascorbic acid, N-2-mercaptopropionyl glycine, superoxide Dismutase (SOD), recombinant human CuZn-SOD, glutathio
  • the effect of the radiation protection composition of the present invention can be seen without limitation on the type of radiation or the intensity / time of the radiation.
  • the compositions of the present invention can protect individuals from radiation even by high levels of radiation exposure.
  • the high level radiation is at least 2 Gy, preferably 10 to 200 Gy.
  • the compositions of the invention can be used to protect an individual from exposure of at least 10 Gy of radiation.
  • compositions of the present invention can be used to protect an individual from the treatment or condition causing an unfolded protein response.
  • compositions of the present invention are not limited but may be administered in any manner via oral, parenteral, sublingual, transdermally, rectal, transmucosally, topical inhalation, oral administration, or a combination thereof.
  • Parenteral administration is not limited to intravenous, intraarterial, intraperitoneal, subcutaneous, intramuscular, intrathecal injection and Intraarticular injection.
  • tunicamycin, thapsigagin, and 4-phenylbutyric acid which are used as chemical chaperones in the present invention, are all purchased from Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA). It was.
  • Taururusodeoxycholic acid (TUDCA) was purchased from TCI America (Portland, OR, USA).
  • Anti-cleaved caspase3 (cat # 9661) was purchased from Cell Signaling (Danvers, MA, USA) and anti-beta actin (cat # A1978) was Sigma-Aldrich. (St Louis, MO, USA).
  • a 50 ug aliquot of protein sample was electrophoresed and then transferred to nitrocellulose membrane.
  • the nitrocellulose membrane was immunoblotted with primary antibody and horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse IgG. Immunoblotting proteins were visualized with a chemiluminescent ECL system (Amersham Biosciences).
  • RNA was isolated using a Hybrid-R Kit (GeneAll Biotechnology, Seoul, Korea). RNA (1.0 g) was reverse transcribed with PrimeScript RT master mix according to the manufacturer's protocol (Takara, Tokyo, Japan). PCR was performed using a CFX96 TM Real-Time system (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) and qPCR SYBR Green master mix (m.biotech, Gyeonggi, Korea).
  • Primers for qRT-PCR were designed using the AmplifX program (http://crn2m.univ-mrs.fr). Primers were purchased from Integrated DNA Technologies (Coralville, IA, USA) and the specific sequences were as follows.
  • ATF6 activating transcription factor 6
  • SiRNA (small interference RNA) oligonucleotides were designed using the siRNA design tool provided by Dhamacon Research (Lafayette, Co., USA). The sequence of the oligonucleotide used was as follows.
  • Transfection was performed using the RNAiMAX protocol provided by Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). After 24 hours, transfected cells were used for the experiment.
  • caspase 3 activity was measured after 8 and 16 hours of irradiation with 15 Gy of IEC-6 cells. As a result, as shown in Figure 1C, it was confirmed that the caspase 3 activity increased with time after irradiation.

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Abstract

본 발명은 소포체 스트레스 저해제를 유효성분으로 포함하는 방사선 방호용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 화학적 샤페론 또는 미접힘 단백질 반응의 신호 전달을 억제하는 물질을 이용하여 방사선의 영향으로부터 포유류를 보호하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방사선 방호용 조성물은 고준위의 방사선에 대해서도 우수한 세포 손상 억제 효과를 보이는 바, 방사선 노출이 불가피한 환경 또는 방사선 치료에 방사선 방호제로서 유용히 사용될 수 있다.

Description

소포체 스트레스 저해제를 포함하는 방사선 방호용 조성물
본 발명은 소포체 스트레스 저해제를 유효성분으로 포함하는 방사선 방호용 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 화학적 샤페론 또는 미접힘 단백질 반응의 신호 전달을 억제하는 물질을 이용하여 방사선의 영향으로부터 포유류를 보호하는 방법에 관한 것이다.
핵에서 전사된 유전정보는 리보솜에서 번역(translation)되며, 번역된 단백질의 성숙(maturation)이 소포체 내강에서 이루어진다. 단백질 성숙에서 가장 중요한 이벤트 중 하나가 적절한 접힘(folding)을 통한 3차원 구조를 완성하는 것이다. 생리적 혹은 병리적 환경에 의해 소포체가 처리할 수 있는 능력이상의 미성숙 단백질이 소포체 내에 축적되면 소포체 기능에 장애가 발생하는데 이러한 상태를 소포체 스트레스 (endoplasmic reticulum stress)라고 한다.
소포체 스트레스가 발생하면 세포는 생존하기 위한 방어기전을 활성화시키는데 이를 미접힘 단백질 반응(unfolded protein response) 이라고 한다.
진핵세포 내에서 진화적으로 잘 보존되어 있는 미접힘 단백질 반응은 소포체내에 과축적된 미접힘 및 변형 단백질에 의해 유도되는 세포 내 소포체 스트레스로부터 세포의 항상성 유지와 세포를 보호하는 데 중요한 역할을 한다. PERK, IRE1, ATF6의 서로 다른 3 종류의 신호전달계로 이루어진 미접힘 단백질 반응은 여러 유전자의 발현을 조절하여 소포체 내 항상성을 유지하여 세포를 보호하지만 소포체 스트레스가 해결되지 않고 지속적으로 이어지면 세포고사(apoptosis)를 유도하여 세포를 사멸시킨다. 소포체 스트레스 및 미접힘 단백질 반응은 여러 외부 스트레스에 의해 유도될 수 있으며 이러한 외부 스트레스는 당 또는 산소의 결핍, 활성산소에 의한 단백질의 질적 손상 등이 알려져 있지만 방사선에 의한 소포체 스트레스와 세포 손상과의 연관성은 거의 알려져 있지 않다.
방사선에 노출되면 정상세포 및 조직에서 손상이 발생할 수 있으며 인체의 경우 피폭된 방사선의 종류, 세기, 피폭 시간 등에 따라 인체의 반응이 서로 다르게 나타난다. 피폭 후 인체에 대한 영향이 짧은 시간 안에 나타나는 급성 방사선증후군 (acute radiation syndrome)은 골수, 위장관, 심혈관의 3가지 증후군으로 나누어진다. 0.7-10 Gy의 방사선에 의해 나타나는 골수증후군 (Hematopoietic syndrome)은 항생제, 수혈, 골수 이식 등의 치료법이 이미 제안되고 있지만 10-100 Gy의 방사선에 의해 야기되는 위장관증후군 (gastrointestinal syndrome)의 경우 위장관 파괴로 인한 감염, 탈수 그리고 전해질 불균형에 의하여 대부분 2주내 사망에 이르게 된다. 하지만 현재까지 FDA 승인 방호제 (방어제, 완화제, 치료제)는 전무하다. 위장관증후군의 생물학적 원인은 방사선에 의한 소장 상피세포 또는 소장 상피세포 전구세포의 손상이다. 방사선 피폭에 의한 인체사망의 가장 주요한 요인이 되는 것이 위장관증후군이지만 현재까지 피폭에 의한 소장 상피세포 사멸의 기작이 정확히 알려져 있지 않다. 따라서, 소장 상피세포 사멸에 대한 치료제는 그 개발의 시급함에도 불구하고 FDA 승인 방호제가 전혀 없는 것이다. 그러므로, 소장 상피세포 사멸에 관여하는 생체반응의 연구는 효과적인 방사선 방호제 개발을 위하여 반드시 선행되어야 하는 연구이다.
또한, 현재 개발되고 있는 방호제들의 대부분이 5-8 Gy 이하의 비교적 낮은 준위의 방사선에만 방호 효과를 보여 방사선 민감도가 가장 높은 골수조직에 대해서는 방사선 보호 효과를 보이지만 방사선 민감도가 낮은 위장관증후군에는 치료효과를 보이지 못하고 있는 실정이다. 지금까지 개발되어 사용되고 있는 손상 제어제 대부분이 항산화제로서 터트-부틸하이드록시톨루엔 (tert-butylhydroxytoluene, BHT), 터트-부틸하이드록시아니솔 (tert-butylhydroxyanisol, BHA)등과 같은 합성 항산화제, 비타민 C, 카로테노이드(carotenoids), 플라보노이드(flavonoids) 등과 같은 일부 천연 항산화제가 있다. 이들 항산화제는 독성, 낮은 활성 및 용도의 한계성 등의 여러 가지 문제로 인하여 사용에 제한을 받고 있다.
이에, 본 발명자는 높은 준위의 방사선 피폭에 의해서도 방사선 방호 효과가 뛰어나 위장관 증후군에도 치료 효과가 있는 물질을 찾고자 예의 노력한 결과, 방사선 피폭에 의한 소장 상피세포 사멸에 소포체 스트레스가 관여함을 처음으로 확인하고, 소포체 스트레스 저해제가 높은 준위의 방사선 노출에도 소장 상피세포를 방사선으로부터 보호함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 소포체 스트레스 저해제를 유효성분으로 포함하는 방사선 방호용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 소포체 스트레스 저해제를 유효성분으로 포함하는 방사선 방호용 조성물을 제공한다.
구체적으로 상기 소포체 스트레스 저해제는 화학적 샤페론일 수 있다.
상기 화학적 샤페론은 글리신(glycine), 타우린(taurine), 알라닌(alanine), 프로린(proline), 글리세롤(glycerol), 소르비톨(sorbitol), 이노시톨(inositol), 베타인(betaine), 트리메틸아민(trimethylamine), 트리메틸아민 N-옥시드(trimethylamine N-oxide), 트레할로스(trehalose), 중수, 다이메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide), 리소포스파티드산(lysophosphatidic acid), 4-페닐부틸산(4-phenylbutyric acid), 부티레이트 유도체(butyrate derivatives), 우루소데옥시콜린산(ursodeoxycholic acid) 및 이의 유도체, 타우로우루소데옥시콜릭산(tauroursodeoxycholic acid), 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
또한, 상기 소포체 스트레스 저해제는 미접힘 단백질 반응의 신호 전달을 억제하는 물질일 수 있다.
상기 미접힘 단백질 반응의 신호 전달을 억제하는 물질은 xbp1의 siRNA, atf의 siRNA, 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 siRNA는 서열번호 7 또는 8의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 소포체 스트레스 저해제에 방사선 방지제가 추가로 포함되는 방사선 방호용 조성물을 제공한다.
상기 방사선 방지제는 항산화제, 자유 라디칼 제거제, 사이토카인, 플란젤린 및 이의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 일 이상일 수 있다.
본 발명의 방사선 방호용 조성물에 있어서, 방사선은 X-방사선, γ-방사선, 에너지 전자 방사선, 자외선, 열 방사선, 우주 방사선, 전자기 방사선, 핵 방사선, 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 10Gy 이상의 방사선 노출로부터 개체를 보호하는데 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 방사선 노출에 의한 위장관 증후군을 예방 또는 치료할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 방사선 노출 전에 방사선으로부터 보호가 필요한 개체에 투여될 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 미접힘 단백질 반응을 유발하는 치료 또는 조건으로부터 개체를 보호하기 위해 사용될 수 있다.
상기 미접힘 단백질 반응을 유발하는 치료 또는 조건은 방사선, 상해, 중독, 감염 및 온도쇼크로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 방사선 방호용 조성물은 높은 준위의 방사선에 대해서도 방호 효과를 보이는 바, 방사선 노출이 불가피한 환경 또는 방사선 치료에 있어서, 방사선 방호제로서 유용히 사용될 수 있다.
특히, 본 발명에 따른 방사선 방호용 조성물은 높은 준위의 방사선 노출에 따른 소장 상피세포의 손상까지도 억제하여, 방사선 노출에 따른 위장관증후군을 예방 또는 치료할 수 있다.
도 1A는 15 Gy의 방사선에 노출된 IEC6 세포에서 소포체 스트레스 마커인 GRP78과 XBP1S mRNA의 발현 변화를 real-time PCR로 정량화한 그래프이다.
도 1B는 IEC6 세포에서 방사선 (15 Gy)을 조사하고 8, 16시간 후 카스파제3(Caspase3)의 절단을 확인하기 위하여 항-절단 카스파제3(anti-cleaved caspase3) 항체로 탐침한 웨스턴 블랏팅 결과이다.
도 1C는 IEC6 세포에서 방사선 (15 Gy)을 조사하고 8, 16시간 후 카스파제3의 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 1D는 IEC6 세포에서 방사선 (15 Gy)을 조사하고 24시간 후 DNA 단편화 (fragmentation)을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2A는 IEC6 세포에 방사선 (15 Gy) 단독, 투니카마이신(tunicamycin) (5 μg/ml) 단독, 또는 방사선 (15 Gy)과 투니카마이신 (5 μg/ml)을 동시 처리하고 4시간 후에 소포체 스트레스 마커인 GRP78과 XBP1S mRNA의 발현 변화를 real-time PCR로 정량화한 그래프이다.
도 2B는 IEC6 세포에 방사선 (15 Gy) 단독, 투니카마이신 (5 μg/ml) 단독, 또는 방사선 (15 Gy)과 투니카마이신 (5 μg/ml)을 동시 처리하고 16시간 후에 카스파제3 (Caspase3)의 절단을 확인하기 위하여 항-절단 카스파제3 (anti-cleaved caspase3) 항체로 탐침한 웨스턴 블랏팅 결과를 나타낸 것이다.
도 2C는 IEC6 세포에 방사선 (15 Gy) 단독, 투니카마이신 (5 μg/ml) 단독, 또는 방사선 (15 Gy)과 투니카마이신 (5 μg/ml)을 동시 처리하고 16시간 후에 카스파제3의 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2D는 IEC6 세포에 방사선 (15 Gy) 단독, 탑시가르긴(thapsigargin) (100 nM) 단독, 또는 방사선 (15 Gy)과 탑시가르긴 (100 nM)을 동시 처리하고 16시간 후에 카스파제3의 절단을 확인하기 위하여 항-절단 카스파제3(anti-cleaved caspase3) 항체로 탐침한 웨스턴 블랏팅 결과를 나타낸 것이다.
도 2E는 IEC6 세포에 방사선 (15 Gy) 단독, 탑시가르긴 (100 nM) 단독, 또는 방사선 (15 Gy)과 탑시가르긴 (100 nM)을 동시 처리하고 16시간 후에 카스파제3의 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3A는 IEC6 세포에 si-xbp1 단독, si-atf6 단독, 또는 si-xbp1과 si-atf6를 동시 처리하여 세포내 xbp1, atf6, 또는 xbp1과 atf6의 발현을 저하시킨 IEC6에 방사선 처리 16 시간 후 카스파제3(Caspase3)의 절단을 확인하기 위하여 항-절단 카스파제3(anti-cleaved caspase3) 항체로 탐침한 웨스턴 블랏팅 결과를 나타낸 것이다.
도 3B는 IEC6 세포에 si-xbp1 단독, si-atf6 단독, 또는 si-xbp1과 si-atf6를 동시 처리하여 세포내 xbp1, atf6, 또는 xbp1과 atf6의 발현을 저하시킨 IEC6에 방사선 처리 16 시간 후 카스파제3의 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4A는 IEC6 세포에 PBA (1 mM) 또는 TUDCA (2 mM)를 1 시간 전처리한 후 방사선 처리하고 16 시간 후에 소포체 스트레스 마커인 GRP78 mRNA의 발현 변화를 real-time PCR로 정량화한 그래프이다.
도 4B는 IEC6 세포에 PBA (0.2, 1, 5) 또는 TUDCA (0.02, 0.1, 0.5)를 1 시간 전처리한 후 방사선 처리하고16 시간후에, 카스파제3(Caspase3)의 절단을 확인하기 위하여 항-절단 카스파제3(anti-cleaved caspase3) 항체로 탐침한 웨스턴 블랏팅 결과를 나타낸 것이다.
도 4C는 IEC6 세포에 PBA (1 mM) 또는 TUDCA (2mM)를 1 시간 전처리한 후 방사선 처리 16 시간 후에 카스파제3의 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4D는 IEC6 세포에 PBA (1 mM) 또는 TUDCA (2mM)를 1 시간 전처리한 후 방사선 처리 16 시간 후 DNA 단편화 (fragmentation)을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 소포체 스트레스 저해제를 유효성분으로 포함하는 방사선 방호용 조성물에 관한 것이다.
본원에서 사용되는 용어, "소포체 스트레스(ER stress)"란 생리적 혹은 병리적 환경에 의해 소포체가 처리할 수 있는 능력 이상의 미성숙 단백질이 소포체 내로 유입이 되거나 소포체 내 칼슘이 고갈되어 소포체 기능에 장애가 발생하는 것을 말한다.
본 발명에서 사용되는 "소포체 스트레스 저해제"란 소포체 스트레스의 발생을 억제하거나, 또는 이미 발생한 소포체 스트레스로 인해서 나타나는 소포체 스트레스 반응을 저해하는 물질을 모두 포함한다.
상기 소포체 스트레스 반응이란, 소포체 스트레스가 발생할 때 세포가 생존하기 위해 갖는 방어기전을 의미한다. 구체적으로, 소포체 스트레스로 인해 발생하는 미접힘 단백질 반응을 포함한다.
본 발명에서 상기 “방사선 방호”란 방사선에 노출된 또는 노출될 정상 세포에 대하여 방사선에 의한 유해 작용을 감소 또는 제거하는 것을 말하는 것으로서, 방사선 방어제, 완화제, 치료제를 모두 포함한다. 상기 "방사선 방어제"는 방사선에 의한 세포 및 분자적 손상을 예방하기 위해 방사선 노출 전에 투여하는 예방제를 의미하며, "방사선 완화제"는 방사선 노출 즉시 투여하여 방사선에 의한 손상의 회복을 촉진시키는 것을 의미하고, "방사선 치료제"는 방사선 노출에 따른 명시적인 증상이 나타난 후에 투여함으로써, 방사선에 의한 손상을 회복시키는 것을 의미한다.
본 발명의 일 실시예에서는 소장 상피세포에 고준위의 방사선을 노출시킨 결과, 방사선 노출 초기단계에서 소포체 스트레스 마커인 GRP78과 XBP1S의 mRNA 발현이 급격히 증가함을 확인하였다. 또한, 방사선 노출로 인하여 카스파제3가 절단되고, 카스파제3의 활성이 증가하며, DNA 단편화가 일어남으로써 세포고사(apoptosis)가 일어남을 확인할 수 있었다(실시예 1). 즉, 본 발명에서는 고준위의 방사선 노출로 인한 세포 사멸에 소포체 스트레스가 관여하고 있음을 처음으로 확인하였으며, 이에 따라 소포체 스트레스 저해제를 세포에 처리하였을 때, 방사선 방호제의 역할을 할 수 있음을 확인한 것이다.
상기 소포체 스트레스 저해제는 화학적 샤페론(chemical chaperon)일 수 있다.
번역된 단백질은 소포체 내에서 폴딩(folding) 등을 통해 성숙(maturation)이 이루어지는데, 생리적 또는 병리적 환경에 의해 적절한 폴딩이 이루어지지 않은 미성숙 단백질들은 소포체 내에 축적되어 소포체 기능에 장애, 즉, 소포체 스트레스가 발생하게 된다. 이 때, 화학적 샤페론은 소포체 내에서, 폴딩되지 않거나 미스폴딩된 단백질들의 응집을 억제하고, 이러한 미스폴딩된 단백질을 퀄리티 컨트롤 시스템으로부터 벗어나게 해준다(Diabetes, Obesity and Metabolism 12 (Suppl. 2): 108115, 2010). 즉, 화학적 샤페론은 단백질의 잘못된 폴딩으로 인하여 발생한 소포체 스트레스를 저해하는 역할을 하므로, 본 발명에서 소포체 스트레스 저해제는 화학적 샤페론이 될 수 있다.
본 발명에서 화학적 샤페론은 소포체 스트레스를 저해하는 기능을 갖는 화합물이라면 그 종류가 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 화학적 샤페론은 소포체 스트레스를 저해하는 기능을 갖는 아미노산, 탄수화물, 메틸 아민, 4-페닐부틸산, 또는 타우로우루소데옥시콜릭산 등일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 화학적 샤페론은 글리신(glycine), 타우린(taurine), 알라닌(alanine), 프로린(proline), 글리세롤(glycerol), 소르비톨(sorbitol), 이노시톨(inositol), 베타인(betaine), 트리메틸아민(trimethylamine), 트리메틸아민 N-옥시드(trimethylamine N-oxide), 트레할로스(trehalose), 중수, 다이메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide), 리소포스파티드산(lysophosphatidic acid), 4-페닐부틸산(4-phenylbutyric acid), 부티레이트 유도체(butyrate derivatives), 우루소데옥시콜린산(ursodeoxycholic acid) 및 이의 유도체, 타우로우루소데옥시콜릭산(tauroursodeoxycholic acid), 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 "약학적으로 허용가능한 염"이란 환자에게 비교적 비독성이고 무해한 유효작용을 갖는 농도로서 이 염에 기인한 부작용이 상기 화학적 샤페론의 이로운 효능을 저하시키지 않는 임의의 모든 유기 또는 무기 부가염일 수 있다.
상기 “유도체”는 상기 화학적 샤페론의 예로 든 화합물과 동일한 활성을 나타내며, 소포체 스트레스 저해제 기능을 갖는 화합물은 제한없이 포함될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 화학적 샤페론 중 하나인 페닐부틸산(PBA), 또는 타우로우루소데옥시콜릭산(TUCDA)를 소장 상피세포에 전처리한 후, 방사선 처리를 한 경우, 상기 화학적 샤페론을 전처리하지 않은 경우보다 소포체 스트레스 마커의 감소 뿐만 아니라, 카스파제3 절단 및 활성화 감소, DNA 단편화의 감소가 나타남을 확인할 수 있었다(실시예 4). 즉, 본 발명에서는 화학적 샤페론이 고준위의 방사선 노출에도 소장 상피세포의 사멸을 현저히 감소시킴을 확인한 것으로써, 화학적 샤페론을 방사선 방호제로서 유용히 사용할 수 있다.
또한, 상기 소포체 스트레스 저해제는 미접힘 단백질 반응의 신호 전달을 억제하는 물질일 수 있다.
소포체 스트레스가 발생하면 세포는 생존하기 위한 방어기전으로서 미접힘 단백질 반응을 활성화시키는데, 이러한 미접힘 단백질 반응의 신호 전달을 억제하는 물질은 본 발명의 소포체 스트레스 저해제가 될 수 있다.
상기 미접힘 단백질 반응은 소포체 막에 존재하는 세 가지의 신호전달체계인 PERK (pancreatic ER kinase), IRE-1α/XBP-1 (inositol-requiring 1α/X-box binding protein 1) 및 ATF6 (activating transcription factor)에 의해 매개된다. 상기 IRE1, PERK와 ATF6는 포유류에서 소포체 내강에서 잘못 폴딩된 단백질들의 존재를 감지하는 소포체 막 관통 단백질이다.
따라서, 본 발명에서 미접힘 단백질 반응의 신호 전달을 억제하는 물질은 PERK, IRE-1α/XBP-1, ATF6에 의해 매개되는 신호 전달을 억제하는 물질이면 그 종류가 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 PERK, IRE-1α/XBP-1, ATF6 신호에 관여하는 단백질들의 발현을 억제하여 미접힘 단백질 반응이 이루어지지 못하도록 하는 물질일 수 있다. 구체적으로 상기 단백질들의 발현을 억제하는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
바람직하게, 상기 올리고뉴클레오티드는 PERK, IRE-1, XBP-1, ATF6 단백질의 mRNA에 대한 siRNA, shRNA 또는 상기 단백질의 mRNA에 상보적인 안티센스 핵산 서열일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "siRNA"는 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNAi(RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 짧은 이중사슬 RNA를 의미한다. 표적 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운 방법으로서 또는 유전자 치료의 방법으로 제공될 수 있다.
siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 더욱 바람직하게는 20 내지 70염기이다. siRNA 말단 구조는 표적 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의해 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 또는 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3' 말단 돌출한 구조와 5' 말단 쪽이 돌출한 구조 모두 가능하다. 돌출하는 염기 수는 한정되지 않는다. 또한 siRNA는 표적 유전자의 발현 억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서 예를 들어, 한쪽 말단의 돌출 부분에 저분자 RNA(예를 들어, tRNA, rRNA, 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA 분자 또는 인공의 RNA 분자)를 포함할 수 있다. siRNA 말단 구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고, 이중 사슬 RNA 일반의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스텝 루프형 구조일 수도 있다.
본 발명에서 사용되는 siRNA는 그 자체로 폴리뉴클레오타이드 페어링을 갖는 완전한 형태, 즉 시험관에서 siRNA를 직접 합성한 두 형질전환 과정을 거쳐 세포 안으로 도입되는 형태이거나, 생체 내에 투여된 후 이러한 형태를 갖도록 하나의 단일쇄 올리고뉴클레오타이드 단편과 이의 역방향(reverse) 상보물이 스페이서에 의해 분리된 단일쇄 폴리뉴클레오타이드로부터 유도될 수 있는 형태, 예를 들어 siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된 siRNA 발현 벡터 또는 PCR-유도된 siRNA 발현 카세트를 형질전환 또는 감염(infection) 과정을 거쳐 세포 안으로 도입되는 형태일 수 있다. siRNA를 제조하고 세포 또는 동물로 도입하는 방법의 결정은 목적 및 표적 유전자 산물의 세포 생물학적 기능에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 미접힘 단백질 반응의 신호 전달을 억제하는 물질은 xbp1의 siRNA, atf의 siRNA, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 siRNA는 서열번호 7 또는 서열번호 8로 표시될 수 있으며, 또한 서열번호 7 또는 서열번호 8의 3' 말단에 1개 이상의 디옥시티미딘(dT)이 결합할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 서열번호 7 또는 서열번호 8로 표시되는 서열을 가진 뉴클레오티드의 3' 말단에 2개의 디옥시티미딘이 결합한 xbp1 또는 atf의 siRNA를 소장 상피세포에 전처리한 후 방사선을 처리한 경우, 상기 siRNA을 처리하지 않은 경우보다 방사선에 의한 세포 손상이 현저히 감소함을 확인하였다(실시예 3). 이를 통해, 미접힘 단백질 반응의 신호 전달을 억제하는 물질, 바람직하게는 PERK, IRE-1α/XBP-1, ATF6에 의해 매개되는 신호 전달을 억제하는 물질은 고준위의 방사선 노출에도 소장 상피세포의 사멸을 현저히 감소시켜, 방호제로서 유용히 사용할 수 있다.
본 발명의 방호용 조성물에는 소포체 스트레스 저해제 이외에 방사선 방지제를 추가로 포함할 수 있다.
*상기 방사선 방지제는 방사선의 노출로부터 개체를 보호할 수 있는 제제를 의미하는 것으로서, 본 조성물에 추가로 포함되어 방사선 방호 효과를 더 높이는 것이라면 제한없이 포함될 수 있다.
*바람직하게, 상기 방사선 방지제는 항산화제, 자유 라디칼 제거제, 사이토카인, 플란젤린 및 이의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 일 이상일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 소포체 스트레스 저해제와 조합하여 사용될 수 있는 추가의 상기 항산화제 또는 자유라디칼 제거제로는 아미포스틴(amifostin), 비타민 E, 부틸화된 히드록시톨루엔(BTH), N 아세틸시스테인, 티오황산나트륨, 글루타티온 에틸 에스테르, 글루타티온, D 메티오닌, 시스테아민, 시스타민, 아미노프로필메틸이소티오우레아, 에티올(Ethyol), 에다라본 (3-메틸-1-페닐-2-피라졸린-5-온), 멜라토닌, 폴리니트록실-알부민, 이데베논, 산화질소, 카르베딜롤(Carvedilol), 알파 리포산, 알로푸리놀, 2 O 옥타데실아스코르브산, N-2-머캅토프로피오닐 글리신, 슈퍼옥시드 디스뮤타제(SOD), 재조합 인간 CuZn-SOD, 글루타티온 퍼옥시다제, 카탈라제, 산화질소 신타제, 아스코르브산(비타민 C), 셀레늄, 아세틸시스테인, 셀레기닌(Deprenyl), 피크노제놀, 코엔자임 Q10, 베타 카로틴, PC 01, SC-55858, 철포르피린(III), 미트라마이신, 크로모마이신, 다우노마이신, 올리보마이신 및 WP-631, 또는 그의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 소포체 스트레스 저해제와 조합하여 사용될 수 있는 추가의 방사선 방지제로는, 플러렌(Fullerene) DF-1, 부틸화된 히드록시아니솔(BHA), 부틸화된 히드록시톨루엔(BHT), 탄소 나노튜브, 자가 및 동종이계 골수 유래 줄기 세포, CD34 양성 세포, 단백질 및/또는 Rad51 또는 Rad52 및 관련 유전자의 cDNA 및/또는 mRNA, TGF 베타 II형 수용체 유전자 및/또는 생성물, 및 p53 유전자 및/또는 생성물, 또는 그의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 사이토카인은 줄기세포 인자를 포함한다.
본 발명의 방사선 방호용 조성물에 있어서, 방사선은 X-방사선, γ-방사선, 에너지 전자 방사선, 자외선, 열 방사선, 우주 방사선, 전자기 방사선, 핵 방사선, 또는 그의 조합을 포함한다.
본 발명의 방사선 방호용 조성물의 효과는 방사선의 종류 또는 방사선의 세기/시간에 제한없이 나타날 수 있다. 본 발명의 조성물은 고준위의 방사선 노출에 의해서도 개체를 방사선으로부터 보호할 수 있다. 상기 고준위의 방사선은 2 Gy 이상, 바람직하게는 10 내지 200Gy이다. 따라서, 발명의 조성물은 방사선 10Gy 이상의 노출로부터 개체를 보호하는데 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 개체는 인간 및 인간이 아닌 모든 동물을 포함하며, 방사선에 노출될 계획이 있거나, 노출 위험에 있는 또는 노출된 모든 생물을 의미한다.
또한, 본 발명의 조성물은 방사선 노출 후 짧은 시간 안에 나타나는 급성 방사선 증후군의 예방 또는 치료 용도로 사용될 수 있다. 바람직하게는, 고준위의 방사선 노출 후 짧은 시간 안에 나타나는 소장 상피세포의 손상을 예방 또는 개선하는데 사용될 수 있으며, 이에 따라 방사선 노출에 따른 위장관증후군의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 방사선에 노출되거나 또는 노출될 위험이 있는 대상의 부위에 투여할 수 있으며, 상기 투여는 방사선에 노출되기 이전, 노출된 즉시, 또는 노출된 후에 투여할 수 있다. 바람직하게는 방사선에 노출되기 이전에 방사선으로부터 보호가 필요한 개체에 투여할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 미접힘 단백질 반응을 유발하는 치료 또는 조건으로부터 개체를 보호하기 위해 사용될 수 있다.
상기 미접힘 단백질 반응을 유발하는 치료 또는 조건은 방사선, 상해, 중독, 감염 및 온도쇼크로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게, 방사선 조사 시 방사선에 의해 노출된 세포 또는 조직의 손상으로 발생하는 질환들을 예방, 개선 및 치료하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 암 치료를 위한 방사선 요법을 개체에 적용할 시, 본 발명의 방사선 방호용 조성물은 상기 암 치료에 조합되어 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 방사선 방호용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 소포체 스트레스 저해제 이외에 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 방사선 조사시 방사선으로부터 세포 또는 조직을 방호 또는 보호하기에 충분한 양을 말하며, 대상의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.
본 발명의 조성물의 유효 투여량의 범위는 성별, 체표면적, 질환의 종류 및 중증도, 연령, 약물에 대한 민감도, 투여경로 및 배출비율, 투여시간, 치료기간, 표적세포, 발현 수준 등 기타 의학 분야에 잘 알려진 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
상기에서 약학적으로 허용되는 이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 대상에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
본 발명의 조성물은 한정되지는 않지만, 경구, 비경구, 혀 밑, 경피(transdermally), 직장, 경점막(transmucosally), 국소적으로 흡입, 구강 투여 또는 이들의 결합을 거쳐는 어떤 방식으로 투여될 수 있다. 비경구의 투여는 한정되지는 않지만, 정맥주사(intravenous), 동맥내투여(intraarterial), 복강내 투여(intraperitoneal), 피하주사(subcutaneous), 근육내 주사(intramuscular), 척추 강내의 주사(intrathecal) 및 관절내 주사(intraarticular)를 포함한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험예 1: 세포 배양, 시약 구입, 및 방사선 조사 조건
랫트의 소장 상피세포주인 IEC-6 세포를 미국 미생물보존센터 (ATCC) 에서 구입하여 DMEM 배지에서 섭씨 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였다.
또한, 본 발명에서 화학적 샤페론으로 사용한 투니카마이신(tunicamycin), 탑시가르긴(thapsigagin), 및 4-페닐부틸산(4-phenylbutyric acid)는 모두 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 또한, 타우로우루소데옥시콜릭산(Tauroursodeoxycholic acid, TUDCA)은 TCI America (Portland, OR, USA)에서 구입하였다.
방사선 조사는 137Cs γ-ray source(Atomic Energy of Canada)를 이용하여 상온에서 3.51 Gy/분으로 조사하였다.
실험예 2: 웨스턴 블랏팅
웨스턴 블랏팅에 사용한 일차 항체 구입처는 다음과 같다.
항-절단 카스파제3(anti-cleaved caspase3 (cat #9661))은 Cell Signaling (Danvers, MA, USA)로부터 구입하였고, 항-베타 액틴(anti-beta actin (cat #A1978))은 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)로부터 구입하였다.
웨스턴 블랏팅 방법은 다음과 같이 하였다.
총 세포용해액(cell lysate)을 제조하기 위해, 세포를 차가운 인산 완충 식염수에 세척하고, 세포를 용해용액[50 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드, 1 ㎍/ml 아프로티닌, 1 ㎍/ml 류펩틴, 1 ㎍/ml 펩스타틴, 1 mM NaF, 1 mM 소듐 오르토바나데이트, 0.25% 소듐 데옥시콜레이트, 및 1% Nonidet P-40]에 용해하였다. 10,000 x g에서 원심분리 후, 상청액(supernatant)을 수집하였다. 단백질 샘플 50 ug 분액(aliquot)을 전기영동한 다음, 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼다. 상기 니트로셀룰로오스 막을 1차 항체 및 horseradish 퍼옥시다제-접합 항-마우스 IgG로 면역블롯팅 하였다. 면역블롯팅된 단백질을 화학발광 ECL 시스템 (Amersham Biosciences)으로 가시화하였다.
실험예 3: 카스파제-3 활성 에세이
카스파제3의 활성은 CaspACE Assay System (Promega, WI, USA)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 측정하였다. 구체적으로, CaspACE Assay System에 포함되어 있는 용해액 (lysis buffer)으로 세포용해액 (cell lysate)을 제조하였다. 활성화된 카스파제3와 반응하여 유색의 p-니트로아닐라이드(p-nitroanilide)를 생산하는 DEVD-p-nitroanilide를 이용하여 카스파제3의 활성을 측정하고자 단백질 샘플 100 ㎍ 분액 (aliquot)을 DEVD-p-nitroanilide와 반응하여 p-nitroanilide의 생산을 유도하였다. 생산된 p-nitroanilide은 405 nM에서 흡광도를 측정하여 정량화하였다.
실험예 4: DNA 단편화 측정
세포고사에서 발생하는 DNA 단편화는 Cell Death Detection ELISAPLUS (Roche Diagnostics) 키트로 측정하였다. 측정은 다음과 같이 하였다.
Cell Death Detection ELISAPLUS 키트에서 제공되는 용해액으로 세포 용해액을 제조하였다. 세포 용해액에서 취한 단백질 샘플 20 ㎕ 분액 (aliquot)을 대상으로 효소면역분석방법을 진행하여 DNA 단편화 정량화하였다.
실험예 5: 양적 실시간 역전사-중합효소 연쇄반응 (qRT-PCR)
하이브리드-R 키트(Hybrid-R Kit (GeneAll Biotechnology, Seoul, Korea))를 사용하여 총 RNA를 분리하였다. 제조사(Takara, Tokyo, Japan)의 프로토콜에 따라 PrimeScript RT master mix로 RNA (1.0 g)을 역전사시켰다. CFX96TM Real-Time system (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)및 qPCR SYBR Green master mix (m.biotech, Gyeonggi, Korea)를 사용하여 PCR을 수행하였다.
qRT-PCR을 위한 프라이머는 AmplifX program (http://crn2m.univ-mrs.fr)를 사용하여 디자인하였다. 프라이머들은 Integrated DNA Technologies (Coralville, IA, USA)에서 구매하였고, 구체적인 서열은 하기와 같았다.
- spliced X-box binding protein 1 (XBP-1s)
정방향: 5′-CTGAGTCCGAATCAGGTGCAG-3′(서열번호 1),
역방향: 5′-ATCCATGGGAAGATGTTCTGG-3′(서열번호 2)
- glucose-regulated protein, 78kD (GRP78)
정방향: 5′-GACTTGGGGACCACCTATTCCTGCG-3′(서열번호 3)
역방향: 5′-CATTCAGTCCAGCAATAGTGCCAGC-3′ (서열번호 4)
- activating transcription factor 6 (ATF6)
정방향: 5′-TTCTCAGCTGATGGCTGTCCAGTA-3′(서열번호 5),
역방향: 5′-TGCAGCTCACTCCCAGAATTCCTA-3′(서열번호 6).
실험예 5: siRNA 및 세포 트랜스펙션
Dhamacon Research (Lafayette, CO, USA)에서 제공하는 siRNA 디자인 도구를 사용하여 siRNA(Small interference RNA) 올리고뉴클레오티드를 디자인하였다. 사용한 올리고뉴클레오티드의 서열은 하기와 같았다.
- XBP1 siRNA: 5'-GCUGUUGCCUCUUCAGAUU-dTdT-3'(서열번호 7)
- ATF6 siRNA: 5'-GCACAUGAGACUUACGAAA-dTdT-3'(서열번호 8)
- scrambled siRNA: 5'-AAUCAACUGACUCGACCAC-dTdT-3'(서열번호 9)
트랜스펙션은 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)에서 제공하는 RNAiMAX 프로토콜을 사용하여 수행하였다. 24시간 후, 트랜스펙션된 세포를 실험에 사용하였다.
실시예 1: 방사선 노출과 소장 상피세포주의 소포체 스트레스와의 관계 규명
방사선 노출이 소장 상피세포주의 소포체 스트레스에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 137Cs γ-ray source(Atomic Energy of Canada)를 이용하여 소장 상피세포주인 IEC-6에 방사선을 총 15Gy 조사하였다. 그 후, IEC-6 세포에서 소포체 스트레스 마커인 GRP78과 XBP1S의 mRNA 발현 변화를 real-time PCR로 측정하였다. 그 결과, 도 1A에 나타난 바와 같이, 방사선 조사 후 초기에 소장 상피세포주의 GRP78과 XBP1S의 mRNA 발현량이 급격히 증가함을 확인할 수 있었다.
또한, IEC-6 세포에 15Gy의 방사선 조사하고 8시간 및 16시간 후에 카스파제3의 절단을 확인하기 위하여 항-절단 카스파제3 항체를 사용하여 웨스틴 블랏팅을 수행하였다. 그 결과, 도 1B에 나타난 바와 같이, 방사선 조사후 카스파제3의 절단이 이뤄졌음을 확인할 수 있었다.
아울러, IEC-6 세포에 15Gy의 방사선 조사하고 8시간 및 16시간 후에 카스파제3의 활성을 측정하였다. 그 결과, 도 1C에 나타난 바와 같이, 방사선 조사 후 시간이 지날수록 증가된 카스파제3의 활성을 확인할 수 있었다.
또한, IEC6 세포에 15Gy의 방사선 조사하고 24시간 후에 효소면역분석방법을 진행하여 DNA 단편화를 정량화하여 그래프로 나타냈다. 그 결과, 도 1D에 나타난 바와 같이, 방사선 조사로 인해 DNA 단편화되고, 세포고사가 일어남을 확인할 수 있었다.
실시예 2: 소포체 스트레스와 방사선 노출에 의한 소장 상피세포의 세포고사 와의 관계 규명
소포체 스트레스가 방사선 노출에 의해 발생하는 소장 상피세포주의 세포고사에 미치는 영향을 확인하기 위하여 37Cs γ-ray source(Atomic Energy of Canada)를 이용하여 소장 상피세포주인 IEC-6에 방사선 (15 Gy) 단독, 투니카마이신(tunicamycin) (5 μg/ml) 단독, 또는 방사선 (15 Gy)과 투니카마이신 (5 μg/ml)을 동시 처리하였다. 그 후, IEC-6 세포에서 소포체 스트레스 마커인 GRP78과 XBP1S의 mRNA 발현 변화를 real-time PCR로 측정하였다. 그 결과, 도 2A에 나타난 바와 같이, 방사선 (15 Gy) 단독, 투니카마이신(tunicamycin) (5 μg/ml) 단독, 또는 방사선 (15 Gy)과 투니카마이신 (5 μg/ml)을 동시 처리한 조건 모두에서 소장 상피세포주의 GRP78과 XBP1S의 mRNA 발현량이 증가함을 확인할 수 있었다.
또한, IEC-6에 방사선 (15 Gy) 단독, 투니카마이신 (5 μg/ml) 단독, 또는 방사선 (15 Gy)과 투니카마이신 (5 μg/ml)을 동시 처리하고 16시간 후에 카스파제3의 절단을 확인하기 위하여 항-절단 카스파제3 항체를 사용하여 웨스틴 블랏팅을 수행하였다. 그 결과, 도 2B에 나타난 바와 같이, 방사선 단독 조사뿐만 아니라 투니카마이신 단독 처리에서도 카스파제3의 절단이 이루어 졌으며 방사선 (15 Gy)과 투니카마이신 (5 μg/ml) 동시 처리 조건에서의 카스파제3의 절단은 방사선 단독 또는 투니카마이신 단독 처리에서 나타나는 카스파제3의 절단에 비하여 급격히 증가함을 확인할 수 있었다. 아울러 방사선 (15 Gy) 단독, 투니카마이신(tunicamycin) (5 μg/ml) 단독, 또는 방사선 (15 Gy)과 투니카마이신 (5 μg/ml)을 동시 처리하고 16시간 후에 카스파제3의 활성을 측정하였다. 그 결과, 도 2C에 나타난 바와 같이, 방사선 (15 Gy)과 투니카마이신 (5 μg/ml) 동시 처리에 의해 유도되는 카스파제3의 활성은 방사선 (15 Gy) 단독, 투니카마이신 (5 μg/ml) 단독 처리에 의해 유도되는 카스파제3 활성에 비하여 높은 수준으로 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
도 2D에 나타난 바와 같이, 또 다른 소포체 유도체인 탑시가르긴(thapsigargin) (100 nM) 단독 처리에 의해서도 카스파제3의 절단이 이루어 졌으며 방사선 (15 Gy)과 탑시가르긴 (100 nM) 동시 처리 조건에서의 카스파제3의 절단은 방사선 (15 Gy) 단독 또는 탑시가르긴 (100 nM) 단독 처리에서 나타나는 카스파제3의 절단에 비하여 급격히 증가함을 확인할 수 있었다. 아울러 방사선 (15 Gy) 단독, 탑시가르긴 (100 nM) 단독, 또는 방사선 (15 Gy)과 탑시가르긴 (100 nM)을 동시 처리하고 16시간 후에 카스파제3의 활성을 측정하였다. 그 결과, 도 2C에 나타난 바와 같이, 방사선 (15 Gy)과 탑시가르긴 (100 nM) 동시 처리에 의해 유도되는 카스파제3의 활성은 방사선 (15 Gy) 단독, 또는 탑시가르긴 (100 nM) 단독 처리에 의해 유도되는 카스파제3활성에 비하여 높은 수준으로 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
이상의 결과에서 소포체 스트레스는 방사선 노출에 의한 소장상피세포의 세포고사를 증강 시킴을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 미접힘 단백질 반응과 방사선 노출에 의한 소장 상피세포의 세포 고사와의 관계 규명
방사선 노출에 의해 발생하는 미접힘 단백질 반응이 소장 상피세포의 세포고사에 미치는 영향을 확인하기 위하여 si-xbp1 단독, si-atf6 단독, 또는 si-xbp1과 si-atf6를 동시 처리하여 세포내 xbp1, atf6, 또는 xbp1과 atf6의 발현을 저하시킨 소장 상피세포주인 IEC-6에 37Cs γ-ray source(Atomic Energy of Canada)를 이용하여 방사선을 총 20Gy 조사하였다. 16시간 후에 카스파제3의 절단을 확인하기 위하여 항-절단 카스파제3 항체를 사용하여 웨스틴 블랏팅을 수행하였다. 그 결과, 도 3A에 나타난 바와 같이, 방사선 조사에 의해 이루어진 카스파제3의 절단이 si-xbp1 단독, si-atf6 단독, 또는 si-xbp1과 si-atf6 동시 처리에 의해 저해됨을 확인할 수 있었다. 아울러 si-xbp1 단독, si-atf6 단독, 또는 si-xbp1과 si-atf6를 동시 처리하여 세포내 xbp1, atf6, 또는 xbp1과 atf6의 발현을 저하시킨 IEC-6에 방사선 (20 Gy) 처리하고 16시간 후에 카스파제3의 활성을 측정하였다. 그 결과, 도 3B에 나타난 바와 같이 si-xbp1 단독, si-atf6 단독, 그리고 si-xbp1과 si-atf6 동시 처리에 의해 방사선 노출에 의해 유도되는 카스파제3 활성이 저해되는 것을 확인할 수 있었다.
이상의 결과에서 방사선 노출에 의해 발생하는 미접힘 단백질 반응경로인 XBP1 그리고 ATF6 신호전달계가 방사선에 노출된 소장 상피세포에서 발생하는 세포고사를 중재함을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 화학적 샤페론을 이용한 소포체 스트레스 저해가 방사선 노출에 의한 소장 상피세포의 세포고사에 미치는 영향 규명
화학적 샤페론을 이용한 소포체 스트레스 저해가 방사선 노출에 의해 발생하는 소장 상피세포의 세포고사에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 소장 상피세포주인 IEC-6에 화학적 샤페론인 PBA (1 mM) 또는 TUDCA (2 mM)를 1 시간 전처리한 후 137Cs γ-ray source(Atomic Energy of Canada)를 이용하여 방사선을 총 15Gy 조사하였다. 그 후, IEC-6 세포에서 소포체 스트레스 마커인 GRP78의 mRNA 발현 변화를 real-time PCR로 측정하였다. 그 결과, 도 4A에 나타난 바와 같이, 방사선 조사 후 증가한 GRP78의 mRNA 발현량이 PBA (1 mM) 또는 TUDCA (2 mM)의 전처리에 의해 저해됨을 확인할 수 있었다. 이는 화학적 샤페론이 방사선에 의해 소장 상피세포에서 발생하는 소포체 스트레스를 저해할 수 있음을 나타낸다. 또한, IEC-6 세포에 PBA (0.2, 1, 5 mM) 또는 TUDCA (0.02, 0.1, 0.5 mM)를 1시간 전처리한 후 방사선을 조사하고 16시간 후에, 카스파제3의 절단을 확인하기 위하여 항-절단 카스파제3(anti-cleaved caspase3) 항체로 탐침한 웨스턴 블랏팅을 수행하였다. 그 결과, 도 4B에 나타난 바와 같이, 방사선 조사에 의해 이루어진 카스파제3의 절단이 PBA (1 mM) 또는 TUDCA (2 mM) 전처리에 의해 저해 됨을 확인할 수 있었다. 아울러 PBA (1 mM) 또는 TUDCA (2 mM)를 1시간 전처리한 후 방사선 (20 Gy)을 조사하고 16시간 후에 카스파제3의 활성을 측정하였다. 그 결과, 도 4C에 나타난 바와 같이, 방사선 (20 Gy) 조사에 의해 유도되는 카스파제3의 활성이 PBA (1 mM) 또는 TUDCA (2 mM)의 전처리에 의해 저해됨을 확인할 수 있었다. 또한 PBA (1 mM) 또는 TUDCA (2 mM)를 1시간 전처리한 후 방사선 (20 Gy)을 조사하고 24시간 후에 DNA 단편화를 측정하였다. 그 결과, 도 4D에 나타난 바와 같이, 방사선 (20 Gy) 조사에 의해 유도되는 DNA 단편화가 PBA (1 mM) 또는 TUDCA (2 mM)의 전처리에 의해 저해됨을 확인할 수 있었다. 이상의 결과에서 화학적 샤페론을 이용한 소포체 스트레스 저해를 통해 방사선에 노출된 소장 상피세포에서 발생하는 세포고사를 저해할 수 있음을 확인할 수 있었다.

Claims (13)

  1. 소포체 스트레스 저해제를 유효성분으로 포함하는 방사선 방호용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 소포체 스트레스 저해제는 화학적 샤페론인 것인 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 화학적 샤페론은 글리신(glycine), 타우린(taurine), 알라닌(alanine), 프로린(proline), 글리세롤(glycerol), 소르비톨(sorbitol), 이노시톨(inositol), 베타인(betaine), 트리메틸아민(trimethylamine), 트리메틸아민 N-옥시드(trimethylamine N-oxide), 트레할로스(trehalose), 중수, 다이메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide), 리소포스파티드산(lysophosphatidic acid), 4-페닐부틸산(4-phenylbutyric acid), 부티레이트 유도체(butyrate derivatives), 우루소데옥시콜린산(ursodeoxycholic acid) 및 이의 유도체, 타우로우루소데옥시콜릭산(tauroursodeoxycholic acid), 및 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 일 이상인 것인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 소포체 스트레스 저해제는 미접힘 단백질 반응의 신호 전달을 억제하는 물질인 것인 조성물
  5. 제4항에 있어서, 상기 미접힘 단백질 반응의 신호 전달을 억제하는 물질은 xbp1의 siRNA, atf의 siRNA, 또는 이들의 조합인 것인 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 siRNA는 서열번호 7 또는 8의 염기서열로 이루어진 것인 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 조성물에 방사선 방지제가 추가로 포함되는 것인 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 방사선 방지제는 항산화제, 자유 라디칼 제거제, 사이토카인, 플란젤린 및 이의 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 일 이상인 것인 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 방사선은 X-방사선, γ-방사선, 에너지 전자 방사선, 자외선, 열 방사선, 우주 방사선, 전자기 방사선, 핵 방사선, 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 10Gy 이상의 방사선 노출로부터 개체를 보호하는데 사용되는 것인 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 방사선 노출 전에 방사선으로부터 보호가 필요한 개체에 투여되는 것인 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 미접힘 단백질 반응을 유발하는 치료 또는 조건으로부터 개체를 보호하기 위해 사용되는 것인 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 미접힘 단백질 반응을 유발하는 치료 또는 조건은 방사선, 상해, 중독, 감염 및 온도쇼크로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
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