KR100917657B1 - 산화환원 효소에 의해 ｎａｄ（ｐ）／ｎａｄ（ｐ）ｈ비율을 조절하는 방법 - Google Patents

산화환원 효소에 의해 ｎａｄ（ｐ）／ｎａｄ（ｐ）ｈ비율을 조절하는 방법

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Abstract

본 발명은 NAD(P)H:quinone oxidoreductase (NQO1) 등의 산화환원 효소(oxidoreductase)가 NAD(P)H을 기질 또는 보효소로 사용하여 생체 조건(in vivo) 또는 시험관 조건(in vitro)에서 NAD(P)+의 농도를 높임으로써, 궁극적으로 NAD(P)+/NAD(P)H 비율을 높여 에너지 과잉의 문제로 인하여 발생될 수 있는 모든 질환, 즉, 비만, 당뇨, 대사증후군, 퇴행성 질환, 미토콘드리아 기능이상 질환 등을 효과적으로 치료할 수 있는 방법, 이를 위한 약제의 스크리닝 방법, 이를 바탕으로 하는 치료 약제 등을 제공한다.

Description

산화환원 효소에 의해 ＮＡＤ（Ｐ）／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ 비율을 조절하는 방법 {Method for Controlling NAD(P)/NAD(P)H Ratio by Oxidoreductase}
본 발명은 산화환원 효소(oxidoreductase), 바람직하게는NAD(P)H:quinone oxidoreductase (NQO1)에 의해 NAD(P)+/NAD(P)H 비율을 조절하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 에너지 수준을 의미하는 NAD(P)+/NAD(P)H 비율을 높게 유지하도록 유도하는 작용을 통해, 과잉에너지 또는 산화환원 상태의 문제로 야기되는 질환, 즉, NAD(P)+/NAD(P)H 비율이 낮음으로 인해 발생될 수 있는 질환과 관련된 문제점을 해결할 수 있는 기술에 관한 것이다. 예를 들어, NQO1이 NAD(P)H을 기질로 사용하여 생체 조건(in vivo) 또는 시험관 조건(in vitro)에서 NAD(P)+의 농도를 높임으로써, 궁극적으로 NAD(P)+/NAD(P)H 비율을 높여, 에너지 과잉의 문제로 인해 발생될 수 있는 다양한 질환들, 즉, 비만, 당뇨, 대사증후군, 퇴행성 질환, 미토콘드리아 이상 질환 등의 문제점을 효과적으로 해결할 수 있다.
비만이란, 체지방량이 표준체중보다 비정상적으로 증가된 상태로 소비된 칼로리보다 섭취된 칼로리가 많을 경우 여분의 칼로리가 지방조직으로 몸 속에 축적돼 생기는 질환을 뜻한다. 비만으로 인한 합병증은 고혈압, 심근경색, 정맥류증, 폐색전증, 관상동맥질환, 뇌출혈, 치매, 파킨슨, 제2형 당뇨병, 고지혈증, 뇌졸중, 암(자궁, 유방, 전립선, 대장암 등), 심장병, 담낭질환, 수면 중 무호흡, 관절염, 불임증, 정맥궤양, 돌연사, 지방간, 비대심장 근육병증, 혈전색전증, 식도염, 복벽 탈장, 요실금, 심혈관질환, 고혈압, 내분비 질환 등이다(obesity research vol.12(8), 2004, 1197-1211).
당뇨병이란, 유전적 또는 환경적 요인으로 발병되는 전신적인 대사질환의 일종으로 체내에 인슐린의 절대적 또는 상대적인 부족으로 인하여 야기되는 질병으로 혈중의 당 농도가 비정상적으로 높아진 상태를 말한다. 당뇨병 합병증으로는 저혈당증, 케톤산증, 고삼투압성 혼수, 대혈관 합병증, 발기부전, 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성신증 등이 있다.
대사증후군(Metabolic Syndrome)이란, 고중성지방혈증, 고혈압, 당대사 이상, 혈액응고 이상 및 비만과 같은 위험인자가 함께 나타나는 증후군을 지칭한다. 2001년에 공표된 미국 NCEP(National Cholesterol Education Program)의 ATP III에 따르면, 허리둘레가 남자 40인치(102 cm), 여자 35인치(88 cm) 이상인 복부 비만, 중성지방(triglycerides) 150 mg/dL 이상, HDL 콜레스테롤이 남자 40 mg/dL, 여자 50 mg/dL 이하, 혈압 130/85 mmHg 이상, 공복혈당(fasting glucose)이 110 mg/dL 이상 등의 다섯 가지 위험인자 중 한 환자가 세 개 이상을 나타낼 경우 대사증후군으로 판정하게 된다.
인슐린 저항성이란, 인슐린이 체내에서 정상적으로 분비됨에도 불구하고, 그들이 수행하는 "포도당을 세포 내로 공급하는 작용"이 제대로 일어나지 못하는 현상을 의미하는 바, 혈액 중의 포도당은 세포 내로 들어가지 못해 고혈당 증세를 보이게 되고, 세포는 세포대로 포도당이 부족해 정상 기능을 수행하지 못하므로, 결국 대사증후군 증상이 나타나게 되는 것이다.
퇴행(degeneration)이란, 병리학적 소견에서 유래된 용어로서 "산소 소모량이 감소되는 경우"를 의미하는 바, 세포내에서 산소를 이용해서 에너지를 생성하는 소기관인 미토콘드리아 기능이상이 노화와 관련된 퇴행성 질환을 뜻한다. 이와 관련하여, 알츠하이머, 파킨슨질환, huntington 질환과 같은 신경퇴행성 질환 등이 있다(생화학. 분자생물학소식, 2004, 11(2), 16-22).
미토콘드리아 기능이상(mitochondria dysfunction)으로 인한 질병은, 미토콘드리아 막전위 이상으로 인한 팽윤, 활성산소종, 또는 자유라디칼 등에 의한 산화적 스트레스로 인한 기능이상, 유전적 요인으로 인한 기능이상, 그리고 미토콘드리아의 에너지 생성을 위한 산화적 인산화 기능의 결함으로 인한 질환 등이 포함될 수 있는데, 상기 원인으로 인한 질병은 다발성경화증, 뇌척수염, 뇌신경근염, 말초신경변증, 라이증후군, 프리드리히 보행실조, 알퍼증후군, MELAS, 편두통, 정신병, 우울증, 발작과 치매, 중풍성 에피소드, 시신경위축, 시신경병증, 망막색소변성, 백내장, 고알도스테론혈증, 부갑상선기능저하증, 근육병증, 근육위축, 미오글로빈뇨, 근육긴장저해, 근육통, 운동내성저하, 세뇨관증, 신부전, 간부전, 간기능부전, 간비대, 철적혈구빈혈, 호중성백혈구 감소증, 저혈소판증, 설사, 융모위축, 다발성구토, 연하곤란, 변비, 감각신경난청, 간질, 정신지체, 간질, 알츠하이머, 파킨슨, 헌팅턴 질환 등이 발생할 수 있다 (미국 특허등록 제6,183,948호, 한국 특허출원공개 제2004-7005109호, Journal of clinical investigation 111, 303-312, 2003, Mitochondria 74, 1188-1199, 2003, Biochimica et Biophysica acta 1658(2004) 80-88 참조).
상기에서 언급된 비만, 당뇨, 대사증후군, 퇴행성 질환 및 미토콘드리아 기능이상으로 인한 질환 등을 총칭하여, 본 발명에서는 "질환 증후군"으로 명명한다.
이러한 질환 증후군의 증상 개선을 위한 최선의 방법은 운동, 식이제한 및 체중 감량인 것으로 알려지고 있다. 상기 "질환 증후군"에 효과를 발휘하는 방법들의 공통점은, 에너지 대사를 촉진시켜 체내에 있는 잉여의 에너지를 최대한 소비하여 축적되지 않도록 하는 것이다. 이러한 잉여의 에너지를 효과적으로 소진시키는 방법이 상기 질환 증후군 치료의 방법이 될 것으로 판단된다. 잉여의 에너지를 효과적으로 제거하기 위해서는 대사의 활성을 높이는 것이 필수적인 것으로 판단되며, 이를 위해서는 지방합성억제, 당신생억제, 당소비촉진, 지방산화촉진 및 에너지 대사의 핵심인 미토콘드리아의 생성 촉진 및 활성화에 관여하는 인자들을 총체적으로 활성화시키는 것이 필수적일 것으로 판단된다.
상기 질환 증후군을 치료하기 위한 표적은 거의 알려지지 않았고, 단지 개별적인 질환을 치료하기 위한 표적단백질 또는 유전자들은 많이 알려져 있으며, 이를 통해 질환을 예방하거나 치료할 수 있는 방법들이 제시되고 있다. 그러나, 아직까지 비만, 당뇨를 포함한 대사증후군 등의 개별적 질환의 치료조차 획기적으로 개선되고 있지 못한 상황이다. 질환 치료를 위한 많은 연구가 이루어지고 있음에도 불구하고 아직도 에너지과잉 및 노화로 인하여 초래되는 다양한 질환들을 치료할 수 있는 적절한 약물이 개발되지 못하고 있음이 현실이다.
대부분의 비만, 당뇨, 대사증후군, 퇴행성 질환 및 미토콘드리아 기능이상으로 인한 질병, 즉, "질환 증후군"을 포함한 많은 질환들이 에너지 대사 및 산화환원 상태의 불균형에서 시작된다. 이의 가장 중요한 원인은 NAD(P)H의 과다에 의한 에너지 과잉으로부터 모든 질환이 출발된다고 본다.
NADPH는 지방합성의 중요한 인자이며, 팔미테이트(palmitate)를 합성하기 위해서는 14 개의 NADPH가 사용된다. NADPH는 환원제(reducing agent)로서 지방을 포함한 생합성 공정에 사용되는 반면에, NADH는 에너지를 생산하는 반응에 사용된다. 그러나, 지방합성 및 에너지 생성에 이용되고 남는 잉여의 NAD(P)H는 플라즈마 막에 존재하는 NAD(P)H oxidase라고 하는 산화효소에 의하여 과잉의 NAD(P)H를 해소하는 과정에서 반응성 산소종(reactive oxygen species (ROS))인 유리기가 만들어 진다. 비만과 당뇨질환에서 산화적 스트레스가 증가하는 원인의 하나는 NAD(P)H oxidase 때문인 것으로 밝혀졌다(Free Radical Biology & Medicine. vol 37, No 1, 115-123, 2004). NAD(P)H oxidase에 의해 생성된 반응성 산소종과 같은 유리기는 암, 심혈관계질환, 고혈압, 동맥경화, 심장비대증, 허혈성심장질환, 패혈증, 염증성질환, 혈전증, 뇌신경질환(뇌일혈, 알츠하이머, 파킨슨질환), 노화촉진 등의 다양한 질환 발병의 주요 요인인 것으로 또한 밝혀졌다(J pharm pharmacol. 2005, 57(1):111-116).
따라서, 생체 조건(in vivo) 또는 시험관 조건(in vitro)에서 NAD+/NADH 및 NADP+/NADPH 비율이 감소되어 NADH 및 NADPH가 잉여로 남아돌 때, 이들은 지방 생합성 과정에 사용될 뿐만 아니라, 과잉의 경우 반응성 산소종(ROS)을 생성시키는 주요기질로서 사용되기도 하므로, ROS로 인한 염증질환을 비롯한 중요한 질환의 원인이 되기도 한다. 이러한 이유로, NAD+/NADH 및 NADP+/NADPH 비율이 증가한 상태를 안정적으로 유지하도록 생체 조건(in vivo) 또는 시험관 조건(in vitro)의 환경을 조성할 수 있다면, NAD+ 및 NADP+에 의한 지방산화 및 다양한 에너지 소비대사가 활성화될 것으로 판단된다. 결과적으로, NAD(P)H의 농도를 지속적으로 낮게 유지하는 작용기전을 활성화시킬 수 있다면, 과잉의 에너지가 소진되도록 유도하여 비만을 포함한 다양한 질환을 치료할 수 있을 것으로 판단된다.
최근, NAD(P)+가 많은 주목을 받고 있는 바, NAD(P)+는 지방산화를 포함한 다양한 효소의 기질 또는 조효소로 작용한다. 구체적으로, NAD(P)+는 많은 생물대사과정에 관여하는 생체 내 물질로서 에너지대사조절, DNA 수선(repair) 및 전사 등에 관여하는 다양한 효소에 보효소로서 사용될 뿐만 아니라, NAD+는 NAD+ 의존성 DNA ligase, NAD+ 의존성 산화환원효소, poly(ADP-ribose) polymerase(PARP) CD38, AMPK, CtBP, Sir2p 계열 등의 많은 효소에 기질 또는 보효소로서 사용된다. NAD+는 생체 내에서 상기와 같은 역할을 통해 전사조절, 장수, 칼로리 제한 등을 매개로 한 생명연장, 노화관련 질환에서 중요한 역할을 하는 것을 보여주고 있다. NAD+는 NAD+ 의존성 탈아세틸화효소인 Sir2p 계열의 조절을 통해 장수와 전사침묵(transcriptional silencing)에 영향을 준다.
한편, NAD(P)+/NAD(P)H 비율은 세포내 산화환원 상태를 조절하는 주요 인자로서, 종종 대사상태를 나타내는 지표로 간주되고 있다. 대사과정에서의 변화에 따라 NAD(P)+/NAD(P)H 비율은 변화된다. 이중에서도 NAD+가 대사조절제로서 작용하는 것으로 알려지고 있다. 여러 노화관련 질환들은 직간접적으로 NAD+ 또는 NAD(P)+/NAD(P)H의 산화환원 상태의 변화와 관련되어 있다.
NAD(P)+에 의해 활성에 영향을 받거나 조절되는 단백질 및 유전자들의 대표적인 사례는 다음과 같다. 공유억제제인(co-repressor) CtBP는 NAD+ 의존성인 항노화 관련 유전자인 Sir2와 협력하여 세포내 에너지 상태에 따라 염색질(chromatin)의 전사를 조절하는 에너지 센서로서 작용하며 암생성 조절에 중요한 역할을 한다(Nature Struct Mol Biol. 2005 12(5):423-8). NAD+는 Sir2를 경유해 암억제 유전자인 p53을 조절한다(Molecular & Cellular Biology 2004, 24(22), 9958-67).
NAD+ 의존성 유전자인 Sirt1은 PGC1-α의 탈아세틸화를 유도하여 당신생 유전자 및 해당대사과정의 유전자를 조절하며, 간에서의 포도당 방출을 자극하여 에너지 평형, 당뇨 및 생명연장에 역할을 한다(Nature, 434(3), 113-118, 2005).
Sirt1은 칼로리 제한에 의한 생명연장, 노화관련 질환(당뇨, 암, 심혈관계질환 등), 지방조직에서 만들어지는 호르몬(adiponectin, leptin, TNFα, & resistin) 생성, 인슐린 민감도 증가, 뇌신경질환(헌팅턴질환, 알츠하이머질환, 파킨슨질환 & stroke) 및 활성산소종과 같은 유리기에 의한 산화적 손상을 줄여 노화억제 등에 주요한 역할을 하는 것으로 알려지고 있다(Nature Reviews Molecular Cell Biology 6, 298-305, 2005). Sirt1의 활성은 Nmnat 활성을 증가시켜 뇌 및 척수를 보호하여 신경섬유질환 및 퇴행성뇌질환(다발성경화증, 뇌척수염, 파킨슨병, 알츠하이머병, Leigh 증후군, Friedreich ataxia, Spastic paraplegia, Deafness-dystonia 증후군, wilson병, Amyotrophic lateral sclerosis, Huntington병 등)의 치료에 효과적인 것으로 확인되었다(Science, 305(13), 1010-1013, 2005). Sirt1은 PPAR-γ(peroxisome proliferator activated receptor)를 억제하여 백색지방세포에서 지방의 이동을 촉진시킨다(Nature 429(17), 771-776, 2004). Sirt1은 Tat 단백질의 탈아세틸화를 거쳐 HIV 전사를 조절하여 HIV 감염 치료를 위한 새로운 표적임을 보여주었다(PLoS Biology 3, 210-220, 2005).
또한, 칼로리 제한이 혈중 포도당, 중성지방 및 호르몬과 같은 생리적 특성에 변화를 줄 뿐만 아니라, 이동(movement), 활동(activity), 지구력(endurance) 등의 행동특성에 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 따라서, 칼로리 제한에 영향을 주는 Sirt1이 이동능력, 활동능력 및 지구력 증강에 밀접하게 관여하고 있음을 Sirt1 유전자를 이용한 실험을 통해 매우 유의성이 있음을 입증한 바 있다(Science, 310(9), 2005, 1641).
한편, AMPK(AMP-activated protein kinase)는 생체내 에너지 상태, 산화환원 상태 및 인산화 정도를 감지하는 단백질로서, AMP 뿐만 아니라 NAD+에 의해서 활성화되는 것으로 확인되었다(J Biol Chem. 2004 Dec 17;279(51):52934-9). 인산화에 의해 활성화된 AMPK는 생체 내에서 지방합성 억제, 포도당흡수 촉진, 지방분해 및 지방산화 촉진, 당분해 촉진, 인슐린민감도 증가, 글리코겐 합성억제, 중성지방 및 콜레스테롤 합성억제, 염증제거, 혈관확장, 심혈관계 기능향상, 미토콘드리아 재생 및 근육구조 변화, 항산화기능, 항노화 및 항암 등의 다양한 기능을 갖고 있는 것으로 보고 되어있다. 또한, AMPK는 상기의 다양한 기능을 발휘하여 비만, 당뇨, 대사성 증후군, 지방간, 허혈성심장질환, 고혈압, 퇴행성뇌질환, 고지혈증, 당뇨성합병증, 발기부전 등의 질환치료를 위한 표적단백질로 인식되고 있다(Nat Med. 2004 Jul;10(7):727-33, Nature reviews 3, 340-351, 2004, Genes & Development 27, 1-6, 2004).
NAD(P)+가 직접적으로 조효소 또는 기질로서 사용되는 것 이외에, NAD+는 ADP ribosyl cyclase(CD38)에 의해 cADPR(cyclic adenosine diphosphate-ribose)로 전환되고, NADP+는 ADP ribosyl cyclase(CD38)에 의해 NAADP(nicotinic acid adeninedinucleotide phosphate)로 전환된다. CD38에 의해 생성된 cADPR 및 NAADP는 세포내 칼슘의 이동에 관여하는 제 2 신호전달자(second messenger) 역할을 한다.
이와 같은 다양한 기능을 하는 것으로 알려진 신호전달자인 NAD(P)+의 농도 및 비율을 높이는 방법은, 첫째, NAD(P)+ 생합성 공정인 salvage 합성공정을 조절하는 방법, 둘째, NAD(P)H를 기질 또는 조효소로 사용하는 효소의 유전자 또는 단백질을 활성화시켜 생체 내 NAD(P)+ 농도를 높이는 방법, 셋째, NAD(P)+ 또는 그의 유사체, 유도체, 전구체와 프로드럭을 외부로부터 공급하여 NAD(P)+의 농도를 높이는 방법 등을 고려할 수 있다.
한편, NAD(P)H:quinone oxidoreductase(EC1.6.99.2)는 DT-diaphorase, quinone reductase, menadione reductase, vitamin K reductase, 또는 azo-dye reductase 등으로 불리고 있으며, 이러한 NQO는 두 개의 isoform, 즉, NQO1과 NQO2로 존재한다(ROM. J. INTERN. MED. 2000-2001, vol. 38-39, 33-50). NQO는 플라보프로테인(flavoprotein)으로서, 퀴논 또는 퀴논 유도체들의 쌍전자환원(two electron reduction) 및 무독화를 촉매하는 작용을 한다. NQO은 전자 공여체로 NADH 및 NADPH를 모두 사용한다. NQO의 활성은 반응성이 매우 큰 퀴논 대사물의 형성을 예방하고, benzo(d)pyrene, quinone을 무독화시키며, 크롬의 독성을 감소시킨다. NQO의 활성은 모든 조직에 존재하지만, 활성은 조직에 따라 다르다. 일반적으로 암세포조직, 간, 위, 신장과 같은 조직에서 NQO의 발현량이 높은 것으로 확인되었다. NQO의 유전자 발현은 xenobiotics, 항산화제, 산화제, 중금속, 자외선, 방사선 등에 의해 유도된다. NQO는 산화적 스트레스에 의해 유도되는 수많은 세포방어기작 중의 일부이다. NQO을 포함한 이러한 방어기작에 관여하는 유전자들의 연합된 발현은 산화적 스트레스, 유리기 및 종양형성(neoplasia)에 대하여 세포를 보호하는 역할을 수행한다. NQO은 매우 넓은 기질 특이성을 갖고 있는데, 퀴논 이외에 quinone-imines, nitro 및 azo 화합물이 기질로서 사용될 수 있다.
그 중, NQO1은 주로 상피세포와 내피세포에 주로 분포해 있다. 이는 공기, 식도 또는 혈관을 통해 흡수된 화합물에 대한 방어기작으로 작용할 수 있음을 뜻한다. 최근, NQO1이 암억제 유전자인 p53의 안정화에 산화환원 기작을 통해 관여하는 것으로 밝혀져, 암발생 억제에 중요한 역할을 할 것으로 기대된다. NQO1은 특히 많은 고형암세포에 높은 수준으로 존재하기 때문에, 퀴논 화합물에 의해 활성화되는 NQO1이 특별한 주목을 받고 있다.
본 발명은 또한 생체 내의 NAD(P)+/NAD(P)H 비율을 인위적으로 높여 생물 객체의 운동능력 및/또는 지구력의 향상을 유도하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명에 따라 생체 내의 NAD(P)+/NAD(P)H 비율을 인위적으로 높이는 경우 에너지 생산능력 향상, 피로회복, 활력 증진, 활성산소 및 유리기의 제거능력 향상(reactive oxygen species) 등의 효과도 유도할 수 있다.
상기 NAD(P)+/NAD(P)H 비율을 인위적으로 높이기 위한 방법으로서 예를 들어, NAD(P)+의 농도 및 비율을 높이기 위해 NAD(P)+ 또는 그의 유사체, 유도체, 전구체와 프로드럭을 외부로부터 공급하여 인위적으로 NAD(P)+의 농도를 높이는 방법이나 NAD(P)H를 기질 또는 조효소로 사용하는 효소의 유전자 또는 단백질을 활성화시키는 화합물을 외부로부터 공급하여 인위적으로 NAD(P)+ 농도를 높이는 방법 등을 고려할 수 있으나, 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 발명자들은 심도 있는 연구와 다양한 실험을 거듭한 끝에, 산화환원 효소, 바람직하게는 NAD(P)H:quinone oxidoreductase, 특히 NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 (NQO1)이 산화환원효소로서 산화환원 반응에 의해 NAD(P)H로부터 NAD(P)+를 만듦으로써, 세포내의 산화환원 상태 및 에너지 수준을 조절하는 효소로서 작용함을 발견하였다. 생체 조건(in vivo) 또는 시험관 조건(in vitro)에서 NAD(P)+/NAD(P)H 비율이 높아지면 에너지가 부족한 것으로 인식하게 되어 포도당, 지방 및 글리코겐 같은 에너지원을 기질로 사용하여 부족한 에너지를 보충하기 위한 에너지 생산 시스템으로 전환되도록 대사가 조절된다. 따라서, 과잉의 에너지 또는 산화환원의 불균형 상태에서 NQO1이 활성화되는 환경이 형성되면, NQO1이 NAD(P)H를 기질로 사용하여 NAD(P)+를 생성시킴으로써, 세포질의 NAD(P)+/NAD(P)H 비율이 증가하게 된다.
즉, 생체는 에너지가 부족한 것으로 인식하여 부족한 NAD(P)H를 보충하고자 체내에 있는 에너지 생성 및 산화환원 관련 시스템을 활성화시켜 대사 활성을 높이게 된다. 이는 NQO1이 비만, 당뇨, 대사증후군, 퇴행성 질환 및 미토콘드리아 기능이상으로 인한 질환, 즉, "질환 증후군"을 치료할 수 있는 새로운 표적 단백질 및 유전자임을 의미한다.
이러한 사실을 바탕으로, NQO1를 활성화시키거나 생성을 유도하는 화합물이 비만, 당뇨 및 대사증후군을 포함한 퇴행성 질환 치료제 개발에 효능이 있음을 확인하였으며, 이는 생체 조건(in vivo) 또는 시험관 조건(in vitro)에서 NAD(P)+/NAD(P)H 비율을 높게 유지하도록 함으로써 가능해짐을 또한 확인하였다. 이와 관련하여, 과잉에너지 또는 산화환원 상태의 문제로 야기되는 NAD(P)+/NAD(P)H 비율이 낮음으로 인해 발생되는 질환을 예방하고 치료할 수 있는 방법으로, NQO1에 의해 NAD(P)H을 기질(substrate) 또는 보효소로 사용하여 NAD(P)+의 농도를 높임으로써, 궁극적으로 NAD(P)+/NAD(P)H 비율을 높여 에너지 과잉 또는 산화환원 상태의 문제로 인해 발생될 수 있는 모든 질환을 효과적으로 치료할 수 있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명에서는 NQO1이 에너지 과잉 또는 산화환원 상태의 문제로 인해 발생될 수 있는 모든 질환의 치료 표적이 됨을 확인함과 동시에, 결과적으로 NAD(P)+/NAD(P)H 비율을 높임으로써 NAD(P)+를 기질(substrate) 또는 보효소로 필요로 하는 단백질 및 유전자를 활성화시켜 대사를 조절하여 질환의 예방 및 치료에 효과가 있음을 입증하였다.
이를 바탕으로, 본 발명은 산화환원 효소(oxidoreductase), 바람직하게는 NAD(P)H:quinone oxidoreductase, 특히 NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 (NQO1)에 의해 생체 조건(in vivo) 또는 시험관 조건(in vitro)에서 NAD(P)+/NAD(P)H 비율을 높이는 방법을 제공한다.
상기의 산화환원 효소와 같이 NAD(P)H를 기질 또는 보효소로 사용하여 NAD(P)+로 전환시킬 수 있는 동종의 효소로는, NAD(P)H:quinone oxidoreductase 이외에, Nitric Oxide synthase (NOS 또는 NOS NADPH DT-diaphorase), thioredoxin reductase (NADPH-oxidized thioredoxin oxidoreductase, E.C. 1.6.4.5), glutathione dependent oxidoreductase(thiol-disulfide oxidoreductase), NADPH dehydrogenase (E.C. 1.6.99.6), NADH:ubiquinone oxidoreductase, succinate:ubiquinone oxidoreductase, plasma membrane oxidoreductase, cytochrome c oxidoreductase (EC 1.10.2.2, bc(1) complex), oxoglutarate oxidoreductase 등을 들 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면, 소정의 화합물을 생체 조건 또는 시험관 조건에 부가하여 NQO1을 활성화시키거나 그것의 양을 증가시켜 NAD(P)H가 NAD(P)+로 전환되도록 유도함으로써, 결과적으로 NAD(P)+/NAD(P)H 비율을 높일 수 있다. 따라서, 과잉에너지 또는 산화환원 상태의 문제로 인해 야기되는 낮은 NAD(P)+/NAD(P)H 비율과 관련하여 발생될 수 있는 비만을 포함한 다양한 질환들을 예방하고 치료할 수 있다. 또한, NAD(P)+/NAD(P)H 비율이 주로 생체 내에서의 에너지 소비와 관련하여 높아지고 그러한 에너지 소비가 운동 등에 의해 유발됨을 고려할 때, NQO1의 양 또는 활성 증가에 의해 객체의 활동 능력, 지구력 향상 등을 달성할 수 있다. 이는 마치 유사 운동 유발 효과로서 표현될 수도 있다.
본 발명에서 상기 생체 조건(in vivo)은 생물 객체에서의 생리 상태 조건을 의미이고, 상기 시험관 조건(in vitro)은 생물 객체로부터 분리한 세포 상태, 세포 구성 성분들 또는 그것의 일부로 구성된 무세포 상태의 조건 등을 포함하는 개념이다. 이하, 상기 '생체 조건 또는 시험관 조건'은 때때로 '체내·외'로 약칭하기도 한다.
본 발명에 따른 상기 생체는 세포 단위까지 포함하는 개념이므로 살아있는 생물체라면 특별히 제한되는 것은 아니고, 바람직하게는 포유 동물(mammal)일 수 있으며, 상기 포유동물은 바람직하게는 사람일 수 있다.
NQO1의 활성화에 의해 NAD(P)+/NAD(P)H 비율이 증가함으로써, 체내·외에서 NAD(P)+ 비율의 증가에 의해 세포는 에너지가 부족한 것으로 인식하게 되고, 에너지 생성에 관여하는 유전자 및 단백질을 활성화시키거나 NAD(P)+가 직접 공여인자로 작용하여 다양한 대사과정을 조절하게 된다.
NQO1에 의해 NAD(P)+/NAD(P)H 비율을 높이는 방법은, 바람직하게는, 첫째, NQO1의 활성을 증가시켜 임계값 이상의 속도로 NAD(P)H로부터 NAD(P)+를 생성시키는 방법, 둘째, NQO1 단백질 또는 유전자의 양을 증가시켜 기질로서 NAD(P)H의 소비량을 늘리는 방법, 셋째, NAD(P)+, 또는 이들의 유도체 또는 프로드럭을 직접 부가하여 NAD(P)+/NAD(P)H 비율을 높이는 방법을 들 수 있다.
상기 NAD(P)+/NAD(P)H 비율의 변화는, 바람직하게는, NQO1 에 대한 활성화제가 존재하지 않는 조건에서의 NAD(P)H의 양을 기준으로, NQO1의 활성화제에 의하여 NAD(P)H 양이 20% 이상 감소하여 결과적으로 NAD(P)+/NAD(P)H 비율이 증가하는 범위일 수 있다. 상기 NAD(P)H의 더욱 바람직한 감소량은 30% 이상일 수 있다. 다만, NAD(P)H의 감소량이 지나치게 큰 경우에는 체내·외 대사에 문제를 유발할 수도 있으므로, 바람직하게는 80%를 초과하지 않는 범위일 수 있다.
상기 NQO1의 활성을 증가시키거나 및/또는 NQO1 단백질 또는 유전자의 양을 증가시키는 방법으로는, 예를 들어, NQO1의 활성 또는 양을 증가시키는 소정의 화합물을 사용하는 방법을 고려할 수 있다.
그러한 화합물은 하이드라이드 억셉터(H- acceptor)로서 작용하며, 예를 들어, 퀴논계 화합물, 퀴논-이민(quinone-imine)계 화합물, 니트로(nitro)계 화합물, 아조(azo)계 화합물 등을 들 수 있지만, 이들만으로 한정되는 것은 아니다. 또한, 이들 화합물들은 단독으로 또는 둘 이상의 조합으로 사용될 수 있다.
상기 퀴논계 화합물의 대표적인 예로는 나프토퀴논계 화합물 유도체를 들 수 있으며, 바람직하게는 하기 화학식 1의 4-substituted-1,2-naphthoquinone을 들 수 있다. 본 발명에서 별도의 설명이 없는 한, 약리학적 유효성을 갖는 화합물로서 설명되는 화합물은 그것의 약제학적으로 허용되는 염, 프로드럭, 용매화물 및 이성질체를 모두 포함하는 개념이다.
(1)
상기 식에서,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 알콕시, 히드록시 또는 탄소수 1 ~ 6의 저급알킬이며;
R3, R4, R5, R6, R7 및 R8는 각각 독립적으로 수소, 히드록시, 탄소수 1 ~ 20의 알킬, 알켄 또는 알콕시, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴이고, 또는 이들 중 두 개의 치환기가 상호 결합에 의해 환형 구조를 이룰 수 있으며;
X는 산소, 질소 또는 황이며;
m 및 n은 각각 독립적으로 0 또는 1이고, 그 중 m 또는 n이 0인 경우에 그것의 인접 탄소원자들은 직접결합에 의해 환형 구조를 이룰 수도 있다.
그 중, 특히 바람직한 화합물로는, X 가 산소이고, m이 1 이며, n은 0 또는 1로서, n이 0인 경우에 그것의 인접 탄소원자들은 직접결합에 의해 환형 구조를 이루는 화합물을 들 수 있다.
상기 바람직한 화합물의 예에서, n이 0인 경우에는 furano-O-naphthoquinone, n이 1인 경우에는 pyrano-O-naphthoquinone 등으로 표현될 수도 있다. 이들 furano-O-naphthoquinone 또는 pyrano-O-naphthoquinone의 대표적인 예로는 하기 화학식 2 또는 3의 화합물들을 들 수 있다.
(2)
(3)
상기 식들에서, R1 내지 R8는 화학식 1에서 정의한 바와 동일하다.
상기 물질들은 인위적으로 합성할 수도 있고, 생약제인 salvia miltiorrhiza, perovskia abrotanoides 등에서 추출할 수도 있다. 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 일반적인 유기합성의 지식을 바탕으로 상기 화학구조의 화합물을 합성함에 어려움이 없을 것이고, 또한, 단삼 등의 생약제에서 해당 성분들을 추출하는 방법은 공지되어 있으므로, 그에 대한 자세한 설명을 본 명세서에서는 생략한다.
본 발명에서는 NQO1와 NAD(P)+/NAD(P)H 비율 관계를 입증하기 위하여 하기와 같은 실험적 검증 과정을 거쳤다. 상기 NQO1에는 천연 및 합성 퀴논들에 대해 높은 친화성을 갖는 세포질 NAD(P)H-의존성 산화환원 효소가 풍부한 바, 이를 산화환원 효소로서 치료용 표적으로 선택하였다.
(1) NQO1의 조직에서의 분포 및 활성을 NQO1의 활성을 측정하는 DCPIP 방법에 의해 NAD(P)+/NAD(P)H 비율의 변화 정도를 측정하여 NQO1의 활성과 조직에서의 분포를 확인하였다.
(2) NQO1을 통해서만 NAD(P)+/NAD(P)H 비율을 높일 수 있음을, NQO1-/- 세포와 정상세포에 NQO1을 활성화시키는 약물을 부가하고 NAD(P)+/NAD(P)H 비율의 변화를 점검하여 NQO1이 세포내의 NAD(P)+/NAD(P)H 비율을 조절하는데 중요한 역할을 하는 지 여부를 약물을 통해 확인하였다.
(3) NQO1에 의해 세포내의 NAD(P)+/NAD(P)H 비율이 증가함을 증명하기 위한 또 다른 실험으로서, NQO1이 없는 세포에 NQO1의 유전자를 삽입한 세포에 약물을 처리하여 NAD(P)+/NAD(P)H 비율의 변화를 측정하였다.
(4) NQO1의 유무 및 활성화에 의해 영향을 받는 단백질을 확인함에 있어서, NAD(P)+/NAD(P)H 비율의 변화로 인해 활성화에 영향을 받는 것으로 알려진 AMP-activated kinase(AMPK)의 인산화 유무의 확인을 통해 NQO1의 활성이 단백질들의 발현 및 활성에 미치는 영향을 확인하였다. NQO1이 없는 세포와, NQO1이 없는 세포에 NQO1 유전자를 삽입한 세포에, NQO1을 활성화시키는 약물을 각각 처리하여 AMPK 단백질의 인산화 여부를 확인함으로써, NQO1의 활성화에 의해 에너지 수준 및 산화환원 상태의 차이에 의하여 영향을 받을 수 있는 단백질들의 발현 및 활성화에 미치는 영향을 확인하였다.
(5) NQO1의 유무 및 활성화에 의해 세포내에서 칼슘의 유입량을 측정하기 위하여, NQO1을 함유한 세포와 NQO1-/- 세포에서의 NQO1 활성화 약물에 의한 칼슘 유입의 유무 및 정도를 확인하고자 하였으며, 한편 NQO1 함유세포에 NQO1 활성화 약물 및 저해약물을 처리하여 NQO1 활성화의 억제를 통해 칼슘유입이 영향을 받는지 여부를 확인하였다.
(6) NQO1을 활성화시키는 약물이 미토콘드리아의 생합성 및 발기부전에 관여하는 내피세포에서의 NO 생성에 관여하는지 여부를 알아보기 위하여, eNOS(endothelial nitric oxide synthase) 단백질의 인산화 여부 및 정도를 확인하였다.
(7) NQO1에 의한 생체내의 산화환원 상태의 변화를 확인하기 위하여, NQO1을 활성화시키는 약물을 마우스의 정맥을 통해 주사한 후 간조직을 적출하여 NAD+와 NADH의 양의 변화를 측정하였다.
(8) NAD+, 그것의 유사체, 전구체, 프로드럭 등을 외부에서 부가하여, 생체내의 NAD+ 농도를 높임으로 인한 체중의 변화, 혈액학적 변화, 조직학적 변화, 유전자의 발현 및 단백질의 활성 변화, 지방분포의 변화, 호르몬의 변화, 호흡 지수, 운동능력, 그리고 지구력의 정도를 확인하여, NAD+의 외부 부가에 의한 치료효과를 확인하고자 하였다.
따라서, 본 발명에서는 다양한 생체 조건(in vivo) 및 시험관 조건(in vitro) 실험들을 통해, NQO1이 체내·외의 NAD(P)+/NAD(P)H 비율을 높이는데 직접적으로 영향을 미치므로, 비만, 당뇨, 대사증후군, 퇴행성 질환, 미토콘드리아 기능이상 등으로 인한 질병의 예방 및 치료와, 활동성, 운동성 및 지구력을 향상시키는데 매우 우수한 표적 단백질 및 유전자임을 확인하였다.
더욱 구체적으로 설명하면, 상기 실험들을 통해, NAD(P)+/NAD(P)H의 비율 증가는 세포질과 미토콘드리아 칼슘의 부수적인 증가를 촉진하고, AMPK와 Sirt protein을 활성화시키며, 미토콘드리아 산화적 인산화와 지방산 산화를 촉진하는 것을 확인하였다.
NQO1 활성화제와 높은 수치의 NAD+는 적어도 두 단계의 반응기전에 의해 AMPK를 활성화한다; 즉, AMP의 직접적 결합과 CaMKK 및 LKB1에 의한 AMPK의 인산화이다. CaMKK는 rapid early phase 활성화와 AMPKα의 T172 인산화에 관여하고, LKB1는 sustained AMPK의 활성화에 역할을 수행하는 것으로 추측된다. 반면에, DIO 마우스의 시상하부(hypothalamus)에서 NQO1 활성화제는 AMPK의 활성을 저해하여 식욕 감소, 음식 섭취의 감소, 및 체중 감량을 이끈다는 것을 확인하였다. 이러한 발견은 NQO1 활성화제로 치료하는 경우 에너지 소비를 증가시킴으로써 체중 감소를 촉진할 수 있음을 제시한다.
본 발명은 또한 NQO1을 통해 NAD(P)+/NAD(P)H 비율을 높이는 화합물의 확인을 위하여, 화합물 후보군을 NQO1에 접촉시키는 단계, 및 상기 화합물 후보군에 의한 NQO1의 양 또는 활성을 모니터링하는 단계를 포함하는 것으로 구성된 NAD(P)+/NAD(P)H 비율의 제어를 위한 화합물의 확인 방법을 제공한다.
상기 "접촉(contacting)"은, 예를 들어, 화합물 후보군을 포함하는 것으로 구성된 용액을 NQO1이 포함되어 있는 세포들을 적신 용액상 매체와 혼합하는 것을 의미한다. 화합물 후보군을 포함하는 것으로 구성된 용액은, 세포들 내로 화합물 또는 화합물들의 도입을 용이하게 하는 디메틸술폭사이드(DMSO)와 같은 다른 성분들을 또한 포함하는 것으로 구성될 수 있다. 화합물 후보군을 포함하는 것으로 구성된 용액은 피펫계 장치나 주사기계 장치와 같은 전달 장치를 사용하여 세포들을 적신 매체에 부가될 수도 있다.
상기 "모니터링(monitoring)"은 화합물의 부가로 나타나는 효과를 관찰하는 것을 의미한다. 상기 효과는, 예를 들어, NAD(P)+/NAD(P)H 비율, AMPK 활성화, ACC 활성 억제, eNOS 인산화 증가, 에너지 대사에 관여하는 유전자 발현, 미토콘드리아 생합성에 관여하는 유전자의 발현 등에 대한 변화로서 관찰될 수 있다.
상기 방법의 구체적인 예로는, NQO1에 검색하고자 하는 화합물 및 NAD(P)H를 사용하여 일정 시간 반응시킨 후, 생성된 NAD(P)+ 또는 잔량 NAD(P)H를 정량화하는 방법을 들 수 있다.
상기 생성된 NAD(P)+의 생성량을 정량화하는 방법으로는 예를 들어, 양성자(proton) 수용체로 사용된 DCPIP의 환원에 의한 흡수파장의 변화로 발색이 유도되어 흡광도의 변화를 측정하는 방법을 들 수 있다. 또한, 상기 NAD(P)H의 잔량을 정량화하는 방법으로는 예를 들어, 테트라졸리움염(tetra-zolium salt)의 발색에 의한 흡광도의 변화를 측정하여 NAD(P)H의 잔량을 정량화하는 방법을 들 수 있다.
NQO1을 활성화시키는 화합물로는 나프토퀴논계 화합물 유도체, fumaric acid의 에스테르 화합물, oltipraz (4-methyl-5(2-pyrazynyl)-1,2-dithiole-3-thione), curcumin, anethole dithiolethione, sulforaphane, 6-methylsulphinylhexyl isothiocyanate, caffeic acid phenethyl ester, 4'-bromoflavone, avicins, fisetin, resveratrol 등과 이들의 유도체들을 들 수 있다. 상기 fumaric acid의 에스테르 화합물의 대표적인 예로는 dimethylfumarate, monoethylfumarate, monomethylfumarate 및 이들의 염 등을 들 수 있다.
본 발명은 또한 NAD(P)+/NAD(P)H 비율 저하와 관련된 질병의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에 NQO1의 양 또는 활성을 향상시키는 화합물을 사용하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 NQO1의 양 또는 활성을 향상시키는 화합물의 약리학적 유효량을 필요한 객체에 부가하는 단계를 포함하는, NAD(P)+/NAD(P)H 비율 저하와 관련된 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
상기 "NAD(P)+/NAD(P)H 비율 저하와 관련된 질병"이란, NAD(P)+/NAD(P)H 비율의 저하로 인해 직간접적으로 유발되는 다양한 유형의 질병으로서, 예를 들어, 비만, 비만 합병증, 당뇨, 당뇨 합병증, 대사증후군, 퇴행성 질환, 미토콘드리아 기능이상 등을 들 수 있다.
상기 "치료"란 발병 증상을 보이는 객체에 사용될 때 질병의 진행을 중단 또는 지연시키는 것을 의미하며, 상기 "예방"이란 발병 증상을 보이지는 않지만 그러한 위험성이 높은 객체에 사용될 때 발병 징후를 중단 또는 지연시키는 것을 의미한다.
상기 방법의 실험적 입증을 위하여, 본 발명에서는 NQO1을 활성화시키는 약물을 비만, 당뇨 및 질환 동물에 부가하여 NQO1의 활성화에 의해 유도되는 체중의 변화, 혈액학적 변화, 조직학적 변화, 유전자의 발현 및 단백질의 활성 변화, 지방분포의 변화, 호르몬의 변화, 호흡지수, 운동능력, 지구력 등의 정도를 확인하여, NQO1의 활성화에 의한 질환의 치료영역을 설정하는 근거를 확보하고자 하였다.
구체적으로, NQO1에 기반한 산화환원 및 에너지 상태의 변화를 통해 NAD(P)+/NAD(P)H 비율을 높임으로써, 대사증후군과 관련된 임상질환의 예방 및/또는 치료가 가능하다. 이러한 임상질환에는 일반비만, 복부비만, 고혈압, 동맥경화, 과인슐린혈증, 과혈당증, 2형 당뇨 및 인슐린 내성을 특징으로 하는 이상지혈증이 포함될 것이나, 이로 제한되는 것은 아니다. 아테롬성 리포단백질로도 알려진 이상지혈증은 비-에스터화 지방산의 상당한 증가, 초저밀도 리포단백질(VLDL) 트리글리세리드 풍부 입자의 증가, 높은 ApoB 수치, 작고 밀집된 저밀도 리포단백질(LDL)입자, 표현형 B의 존재시 높은 ApoB 수치 및 낮은 apoAI 입자 수치와 연관되는 낮은 고밀도 리포단백질(HDL) 수치로 특징지어 진다.
산화환원 및 에너지 상태 변화를 통해 NAD(P)+/NAD(P)H 비율을 높임으로써 배합 또는 혼합 과지혈증 또는 대사증후군의 다른 징후를 가진 또는 가지지 않는 과트리글리세리드혈증 및 식후 이상지혈증의 다양한 정도를 가지는 환자의 치료에 유용하리라 기대된다.
산화환원 및 에너지 상태 변화를 통해 NAD(P)+/NAD(P)H 비율을 높임으로써, 이들의 항염증성은 물론 항이상지혈증으로 인해 동맥경화증과 연관된 심장혈관 질병률 및 사망률을 낮출 것으로 기대된다. 심장혈관 질환에는 심근경색을 유발하는 다양한 내부기관의 매크로 혈관증, 심부전, 뇌혈관질병 및 말단 말초동맥부전이 포함된다. 한편, 인슐린 민감성 효과로 대사증후군에서의 2형 당뇨 및 임신 중 당뇨의 발전을 막거나 지연시키리라 기대된다. 따라서, 당뇨병에서의 임상적 과혈당과 연관된 장기간의 합병증의 발전, 예를 들어, 신장질병, 망막장애 및 말단 말초혈관 질병을 초래하는 마이크로 혈관증의 발전도 지연시키리라 기대된다. 더욱이, 본 발명은 인슐린 내성과의 연관 여부와 상관없이 심장혈관시스템 이외의 다양한 질환, 예를 들어, 다낭성난소증후군, 비만, 암, 및 염증성질병, 예를 들어, 경도인지장애, 알츠하이머병, 파킨슨병 및 다발성경화증과 같은 퇴행성 신경질환에 유용하다.
산화환원 및 에너지 상태 변화를 통해 NAD(P)+/NAD(P)H 비율을 높임으로써, 간에서 지방간 상태의 발생에 억제 효과를 나타낼 뿐 아니라, β-산화를 활성화시켜 트리글리세롤의 농도를 저하시키는데 역할을 할 수 있어, 알콜성 및 비알콜성 간의 지질대사 이상으로 인한 지방간, 간염 및 간경화에 유용하리라 기대된다.
본 발명에 따르면, 산화환원 및 에너지 상태 변화를 통해 NAD(P)+/NAD(P)H 비율을 높임으로써, 여러 가지 조직에서 지질의 조성을 변화시킨다. 또한, 본 발명은 지방 함량을 변화시킬 뿐 아니라 지방 분포를 변화시킬 수 있는 것으로 확인되었다.
또한, 혈장내 콜레스테롤 및 트리아실글리세롤 수준을 감소시킨다. 따라서, 본 발명에 따르면, 혈장내 트리글리세리드 및 콜레스테롤의 수준을 감소시키게 된다는 것을 알 수 있다.
산화환원 및 에너지 상태 변화를 통해 NAD(P)+/NAD(P)H 비율을 높임으로써, eNOS 합성 효소의 활성화를 통해 내피세포에서 NO 생성에 유효하므로, 허혈성 심장질환, mitochondrial myopathy, 퇴행성 뇌질환, 당뇨, cardiomyopathy, 노화 관련 질환, 혈관계질환 고혈압 및 발기부전에 유용하리라 기대된다. 고혈압에 원인이 있는 병으로는 심부전, 심근경색증, 뇌혈관의 파열 및 혈전, 신장 손상 등이 있다.
산화환원 및 에너지 상태 변화를 통해 NAD(P)+/NAD(P)H 비율을 높임으로써, 말단 조직에서의 지방산화 촉진과 에너지 소비 촉진을 유도하여, 일반 비만은 물론 피하 및 복부지방과 같은 국부적인 지방, 즉, 눈두덩이, 팔 및 엉덩이 피하지방, 복부지방 그리고 셀룰라이트와 같은 특정 부위의 지방 제거에도 유용할 것으로 기대된다.
또한, 본 발명에 따르면, 혈당 농도를 감소시킴으로써, 과인슐린증 동물의 혈장내 인슐린 농도를 감소시킴을 확인하였다. 인슐린에 대한 감소된 민감성을 가지는 동물의 경우, 인슐린의 효과를 강화하는 것으로 확인되었다.
산화환원 및 에너지 상태 변화를 통해 NAD(P)+/NAD(P)H 비율을 높임으로써, 미토콘드리아의 생성(biogenesis)을 촉진시켜, 미토콘드리아의 활성 용량을 증가시킴과 동시에, 근육조직의 운동조직으로의 전환을 유도하여, 운동능력 향상, 지구력 증강, 에너지 생산능력 향상, 피로회복, 활력 증진, 활성산소 및 유리기의 제거능력 향상(reactive oxygen species)에 따른 산화스트레스 저감을 통해 관련 질환치료에 유효할 것으로 기대된다. 활성산소(ROS)로 인하여 발생될 수 있는 질환은 다음과 같다: 동맥경화, 당뇨병, 허혈성심장질환, 심장비대증, 신경질환, 신장병, 간경변, 혈전증, 염증성질환, 관절염, 미숙아망막증, 안구포도막염, 노인성백내장, 방사선치료시의 부작용적 장해, 흡연성기관지손상, 제암제 부작용장해, 뇌부종, 패혈증, 폐부종, 족부종, 뇌경색, 용혈성빈혈, 조로증, 간질, 알츠하이머병, 다운증후군, 크론병, 교원병 등 많은 질환에 대한 관련이 보고 되고 있다.
산화환원 및 에너지 상태 변화를 통해 NAD(P)+/NAD(P)H 비율을 높임으로써, 비만은 물론, 비만으로 인한 합병증인 고혈압, 심근경색, 정맥류증, 폐색전증, 관상동맥질환, 뇌출혈, 치매, 파킨슨, 제2형 당뇨병, 고지혈증, 뇌졸중, 암 (자궁, 유방, 전립선, 대장암), 심장병, 담낭질환, 수면 중 무호흡, 관절염, 불임증, 정맥궤양, 돌연사, 지방간, 비대심장 근육병증, 혈전색전증, 식도염, 복벽 탈장, 요실금, 심혈관질환, 고혈압, 내분비 질환 치료 표적으로 유용할 것으로 기대된다.
산화환원 및 에너지 상태 변화를 통해 NAD(P)+/NAD(P)H 비율을 높임으로써, 당뇨병 뿐 아니라 당뇨병 합병증인 저혈당증, 케톤산증, 고삼투압성 혼수, 대혈관 합병증, 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성신증 등에 유용할 것으로 기대된다.
산화환원 및 에너지 상태 변화를 통해 NAD(P)+/NAD(P)H 비율을 높임으로써, 산소 소모량이 감소됨으로 인한 에너지 생성 소기관인 미토콘드리아의 기능이상 및 노화와 관련된 퇴행성 질환인 알츠하이머, 파킨슨질환, 헌팅턴(Huntington) 질환과 같은 신경퇴행성 질환의 치료 표적으로 유용할 것으로 기대된다.
구체적으로, 산화환원 및 에너지 상태 변화를 통해 NAD(P)+/NAD(P)H 비율을 높임으로써, 미토콘드리아 기능이상으로 인한 질병, 즉, 미토콘드리아 막상태 이상으로 인한 팽윤, 활성산소종, 또는 자유라디칼 등에 의한 산화적 스트레스로 인한 기능이상, 유전적 요인으로 인한 기능이상, 미토콘드리아의 에너지 생성을 위한 산화적 인산화 기능의 결함으로 인하여 발생할 수 있는 다발성경화증, 뇌척수염, 뇌신경근염, 말초신경변증, 라이증후군, 프리드리히 보행실조, 알퍼증후군, MELAS, 편두통, 정신병, 우울증, 발작과 치매, 중풍성 에피소드, 시신경위축, 시신경병증, 망막색소변성, 백내장, 고알도스테론혈증, 부갑상선기능저하증, 근육병증, 근육위축, 미오글로빈뇨, 근육긴장저해, 근육통, 운동내성저하, 세뇨관증, 신부전, 간부전, 간기능부전, 간비대, 철적혈구빈혈, 호중성백혈구 감소증, 저혈소판증, 설사, 융모위축, 다발성구토, 연하곤란, 변비, 감각신경난청, 간질, 정신지체, 간질, 알츠하이머, 파킨슨, 헌팅턴 질환 등의 치료 표적으로 유용할 것으로 판단된다.
산화환원 및 에너지 상태 변화를 통해 NAD(P)+/NAD(P)H 비율을 높임으로써, 과인슐린증, 인슐린 저항성, 비만, 포도당 비내성(glucose intolerance), 2형 당뇨병, 이상지질증(dyslipidemia), 심혈관계질환 또는 고혈압에 특히 특징이 있는 다중대사 증후군(대사 증후군)의 치료 및/또는 예방을 위한 표적으로 유용할 것으로 판단된다.
경우에 따라서는, NAD+를 외부로부터 객체에 직접 부가하여 치료 또는 효과를 얻을 수도 있는 바, 이와 관련하여 본 발명에서는 NAD+의 농도를 높임으로 인하여, 체중의 변화, 혈액학적 변화, 조직학적 변화, 유전자의 발현 및 단백질의 활성변화, 지방분포의 변화, 호르몬의 변화, 호흡지수, 운동능력, 지구력 등의 정도를 확인하여 NAD+의 외부 부가에 의한 치료 효과를 확인하였다.
본 발명은 또한, (a) NQO1의 양 또는 활성을 향상시키는 약리학적 유효량의 화합물 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제, 또는 이들의 조합을 포함하는 것으로 구성된 약제 조성물, 즉, NQO1 항진 조성물을 제공한다.
용어 "약제 조성물(pharmaceutical composition)"은 상기 화합물과 담체, 희석제 등과 같은 다른 화학 성분들의 혼합물을 의미한다. 약제 조성물은 생물체내로 화합물의 부가를 용이하게 한다. 화합물을 부가하는 다양한 기술들이 존재하며, 여기에는 경구, 주사, 에어로졸, 비경구, 및 국소 부가 등이 포함되지만, 이들만으로 한정되는 것은 아니다. 약제 조성물은 염산, 브롬산, 황산, 질산, 인산, 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 살리실산 등과 같은 산 화합물들을 반응시켜서 얻어질 수도 있다.
용어 "약리학적 유효량(therapeutically effective amount)"은 투여되는 화합물의 양이 치료하는 장애의 하나 또는 그 이상의 증상을 어느 정도 경감 또는 줄이거나, 예방을 요하는 질병의 임상학적 마커 또는 증상의 개시를 지연시키는데 유효한 활성성분의 양을 의미한다. 따라서, 약리학적 유효량은, (1) 질환의 진행 속도를 역전시키는 효과, (2) 질환의 그 이상의 진행을 어느 정도 금지시키는 효과, 및/또는 (3) 질환과 관련된 하나 또는 그 이상의 증상을 어느 정도 경감(바람직하게는, 제거)하는 효과를 가지는 양을 의미한다. 약리학적 유효량은 치료를 요하는 질병에 대한 공지된 생채내(in vivo) 및 생체외(in vitro) 모델 시스템에서 화합물을 실험함으로써 경험적으로 결정될 수 있다.
용어 "담체(carrier)"는 세포 또는 조직내로의 화합물의 부가를 용이하게 하는 화합물로 정의된다. 예를 들어, 디메틸 술폭사이드(DMSO)는 생물체의 세포 또는 조직내로의 많은 유기 화합물들의 투입을 용이하게 하는 통상 사용되는 담체이다.
용어 "희석제(diluent)"는 대상 화합물의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 화합물을 용해시키게 되는 물에서 희석되는 화합물로 정의된다. 버퍼 용액에 용해되어 있는 염은 당해 분야에서 희석제로 사용된다. 통상 사용되는 버퍼 용액은 포스페이트 버퍼 식염수이며, 이는 인간 용액의 염 상태를 모방하고 있기 때문이다. 버퍼 염은 낮은 농도에서 용액의 pH를 제어할 수 있기 때문에, 버퍼 희석제가 화합물의 생물학적 활성을 변형하는 일은 드물다.
여기에 사용된 화합물들은 인간 환자에게 그 자체로서, 또는 결합 요법에서와 같이 다른 활성 성분들과 함께 또는 적당한 담체나 부형제와 함께 혼합된 약제 조성물로서 투여될 수 있다. 본 응용에서의 화합물의 제형 및 투여에 관한 기술은 "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA, 18th edition, 1990에서 확인할 수 있다.
본 발명의 약제 조성물은, 예를 들어, 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 당제-제조, 분말화, 에멀션화, 캡슐화, 트래핑과 또는 동결건조 과정들의 수단에 의해, 공지 방식으로 제조될 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 약제 조성물은, 약제학적으로 사용될 수 있는 제형으로의 활성 화합물의 처리를 용이하게 하는 부형제들 또는 보조제들을 포함하는 것으로 구성되어 있는 하나 또는 그 이상의 약리학적으로 허용되는 담체를 사용하여 통상적인 방법으로 제조될 수도 있다. 적합한 제형은 선택된 투여 루트에 따라 좌우된다. 공지 기술들, 담체 및 부형제들 중의 어느 것이라도 적합하게, 그리고 당해 분야, 예를 들어, 앞서 설명한 Remingston's Pharmaceutical Sciences에서 이해되는 바와 같이 사용될 수 있다. 본 발명에서는 화학식 1의 화합물을 목적하는 바에 따라 주사용 제제 및 경구용 제제 등으로 제형화될 수 있다.
주사를 위해서, 본 발명의 성분들은 액상 용액으로, 바람직하게는 Hank 용액, Ringer 용액, 또는 생리 식염수 버퍼와 같은 약리학적으로 맞는 버퍼로 제형될 수 있다. 점막 투과 투여를 위해서, 통과할 베리어에 적합한 비침투성제가 제형에 사용된다. 그러한 비침투성제들은 당업계에 일반적으로 공지되어 있다.
경구 투여를 위해서, 화합물들은 당업계에 공지된 약리학적으로 허용되는 담체들을 활성 화합물들과 조합함으로써 용이하게 제형화될 수 있다. 이러한 담체들은 본 발명의 화합물들이 정제, 알약, 산제, 입제, 당제, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로 제형화될 수 있도록 해 준다. 바람직하게는 캅셀제, 정제, 환제, 산제 및 입제가 가능하고, 특히 캅셀제와 정제가 유용하다. 정제 및 환제는 장피제로 제조하는 것이 바람직하다. 경구 사용을 위한 약제 준비는 본 발명의 하나 또는 둘 이상의 화합물들과 하나 또는 둘 이상의 부형제를 혼합하고, 경우에 따라서는 이러한 혼합물을 분쇄하고, 필요하다면 적절한 보조제를 투과한 이후 과립의 혼합물을 처리하여 정제 또는 당체 코어를 얻을 수 있다. 적절한 부형제들은 락토스, 수크로즈, 만니톨, 또는 소르비톨과 같은 필러 옥수수 녹말, 밀 녹말, 쌀 녹말, 감자 녹말, 겔라틴, 검 트래거켄스, 메틸 셀룰로우즈, 히드록시프로필메틸-셀룰로우즈, 소듐 카르복시메틸 셀룰로우즈, 및/또는 폴리비닐피롤리돈(PVP)와 같은 셀룰루오즈계 물질 등이다. 필요하다면, 가교 폴리비닐 피롤리돈, 우뭇가사리, 또는 알긴산 또는 알긴산 나트륨과 같은 그것의 염 등의 디스인터그레이팅 에이전트와 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제, 결합제 등과 같은 담체가 첨가될 수도 있다.
경구에 사용될 수 있는 제약 준비물은, 젤라틴 및 글리콜 또는 소르비톨과 같은 가소제로 만들어진 부드러운 밀봉 캡슐 뿐만 아니라, 겔라틴으로 만들어진 밀어 고정하는 캡슐을 포함할 수도 있다. 밀어 고정하는 캡슐은 락토오스와 같은 필러, 녹말과 같은 바인더, 및/또는 활석 또는 마그네슘 스테아레이트와 같은 활제와의 혼합물로서, 활성 성분들을 포함할 수도 있다. 연질 캡슐에서, 활성 화합물들은 지방산, 액체 파라핀, 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 용체에 용해 또는 분산될 수도 있다. 또한, 안정화제가 포함될 수도 있다. 경구 투여를 위한 모든 조제들은 그러한 투여에 적합한 함량으로 되어 있어야 한다.
화합물들은, 주사에 의해, 예를 들어, 큰 환약 주사나 연속적인 주입에 의해, 비경구 투입용으로 제형화될 수도 있다. 주사용 제형은, 예를 들어, 방부제를 부가한 앰플 또는 멀티-도스 용기로서 단위 용량 형태로 제공될 수도 있다. 조성물은 유성 또는 액상 비히클상의 현탁액, 용액, 에멀션과 같은 형태를 취할 수도 있으며, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형용 성분들을 포함할 수도 있다.
또한, 활성 성분은, 사용 전에 멸균 무 발열물질의 물과 같은 적절한 비히클과 구성을 위해 분말의 형태일 수도 있다.
화합물들은, 예를 들어, 코코아 버터나 다른 글리세라이드와 같은 통상적인 좌약 기재를 포함하고 있는 좌약 또는 정체관장과 같은 직장 투여 조성물로 제형화될 수도 있다.
본 발명에서 사용에 적합한 약제 조성물에는, 활성 성분들이 그것의 의도된 목적을 달성하기에 유효한 양으로 함유되어 있는 조성물이 포함된다. 더욱 구체적으로, 치료적 유효량은 치료될 객체의 생존을 연장하거나, 질환의 증상을 방지, 경감 또는 완화시키는데 유효한 화합물의 양을 의미한다. 치료적 유효량의 결정은, 특히, 여기에 제공된 상세한 개시 내용 측면에서, 당업자의 능력 범위내에 있다.
단위 용량 형태로 제형화하는 경우, 활성성분으로서의 화합물은 약 0.1 내지 5,000 mg의 단위 용량으로 함유되는 것이 바람직하다. 상기 화합물의 투여량은 환자의 체중, 나이 및 질병의 특수한 성질과 심각성과 같은 요인에 따라 의사의 처방에 따른다. 그러나, 성인 치료에 필요한 투여량은 투여의 빈도와 강도에 따라 하루에 약 1 내지 1,000 mg 범위가 보통이다. 성인에게 근육내 또는 정맥내 투여시 일회 투여량으로 분리하여 하루에 보통 약 1 내지 500 mg의 전체 투여량이면 충분할 것이나, 일부 환자의 경우 더 높은 일일 투여량이 바람직할 수 있다.
이하, 본 발명을 다음의 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠지만 본 발명의 범위가 다음 실시예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용된 연구재료 및 실험방법은 다음과 같다.
(1) 재료
실험에 사용된 배양액, 세포 배양 시약과 재료는 각각 life Technologies, Inc, Sigma, Fisher Scientific에서 구입하였다. NQO1 항체는 Santa Cruz에서 구입하였고, ACC, pS79ACC, AMPK, pT172AMPK, HA 항체는 New England Biolabs에서 구입하였고, fluo-4는 Molecular Probe에서, Cell Counting Kit-8(CCK-8 kit)는 Dojindo Laboratories에서 구입하였다. 14C-palmitic acid는 Perkin Elmer 사에서 구입하였다. Actin 항체와 NAD+, NADH, hrNQO1 등 그 외 시약은 모두 Sigma에서 구입하였다.
(2) Plasmid
본 실험에 사용한 plasmid는 pSG5alpha-HA(Hemaglutinin)-NQO1(NAD(P)H dehydrogenase)과 pSG5alpha-HA-NQO1-C609T(1) 이다.
(3) 세포배양
HEK293, MCF-7, MN9D와 MN9X 세포는 10% fetal bovine serum이 포함된 DMEM 배지에서 배양하며, 5% 이산화탄소와 37℃ 조건에서 키웠다. 간세포주인 HepG2 세포는 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum)이 포함된 RPMI1640 배양액에서 키웠다. 이들 배양액엔 100 U/ml penicillin과 100 ug/ml streptomycin이 포함된다.
(4) 형질전환
세포에 플라스미드를 형질전환하는 방법으로 LipofectAMINE PLUS (Invitrogen, San Diego, CA)을 이용하였다. 먼저 플라스미드를 plus 시약과 섞어 15 분 동안 반응시키고, 여기에 LipofectAMINE을 넣어 주어 다시 15 분간 반응시켰다. 이 반응물을 세포에 처치하여 3 시간 동안 유지한 뒤, 혈청이 들어있는 배지로 교체한 다음 세포를 24 시간 더 키웠다.
(5) Immunoblotting
세포는 SDS sample buffer(62.5 mM Tris-HCl(pH 6.8), 6%(w/v) SDS, 30% glycerol, 125 mM DTT, 및 0.03%(w/v) bromophenol blue)에 용해하였다. 총 세포 lysates를 100℃에서 5 분간 끓인 다음 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel에서 전기영동하고, 이어서 nitrocellulose 멤브레인으로 단백질을 이동시켰다. 멤브레인을 TBS(5% (wt/vol) 우유와 0.1% Tween 20)에서 1 시간 동안 반응시키고, 1차 항체로 2 시간 반응시켰다. 이어서 HRP가 접합된 2차 항체를 이용하여 현상하였다(Phototope-HRP Western Blot Detection Kit, New England Biolabs, Beverly, MA).
(6) 칼슘유입(Calcium Influx)
세포를 배지로 coverslip에 24 시간 키운 다음, RPMI1640 serum free 배지로 1 시간 동안 유지한 뒤, calcium indicator인 fluo-4(5uM)(2)를 30 분 전처리 하였다. 전처리 후 coverslip을 slide glass에 mounting하였다. 형광현미경(Carl Zeiss)을 이용해서 30 초 동안 세포내의 칼슘 변화를 관찰 후 후보 화합물(e.g., pyrano-1,2-naphthoquinone)을 처치함과 동시에 2 초간 연속으로 형광현미경(Carl Zeiss)을 이용하여 칼슘 변화를 이미지로 얻었다. Dicoumarol 처치는 fluo-4(5 uM)와 함께 dicoumarol을 30 분 전처리한 뒤 coverslip을 slide glass에 mounting하고, 형광현미경(carl Zeiss)을 이용해서 30 초 동안 세포내의 칼슘 변화를 관찰 후, pyrano-1,2-naphthoquinone(10 uM)을 처리한 다음, 2 초간 연속으로 형광현미경을 이용하여 촬영하였다. 촬영된 이미지는 LSM 이미지분석 프로그램(Carl Zeiss)을 이용하여, 2 초마다 10 분간 촬영한 300 장의 이미지를 시간 순에 맞게 정리하여 그래프로 나타내었다.
(7) NQO1을 통해 NAD + 의 생성량 증가를 확인하는 검색법(NADH 감소를 확인하는 방법)
마우스의 조직(간과 근육)에서 HPLC-MS(High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectroscopy)를 이용하여 NAD+와 NADH를 정량하는 것은 가능하지만, 세포를 배양하여 NADH를 정량하는 것은 양적으로 매우 적으므로(detection range에 들어오지 않음), CCK-8을 이용하여 상대적으로 비교하였다.
1) LC-MS: 샘플들은 G1322A degasser, G1312A binary pump, G1315A photo-diode-array detector, 59987A electrospray interface와 5989B mass spectrometer로 구성되어 있는 Agilent 1100 series LC/MSD system으로 분석하였다. ES-MS 분석은 hexapole ion guide로 맞춰진 Agilent Atmospheric Pressure Ionization(API) interface가 부착된 Agilent 5989 electrospray(ES) mass spectrometer(MS)를 이용하여 시행하였다. 크로마토그램은 Chemstation software로 자동적으로 통합되었으며, 농도는 표준조정곡선을 사용하여 결정하였다.
1-1) 세포 및 간 조직에서 adenine과 oxidized pyridine nucleotide(AOPN)의 추출: 세포 및 간 조직에서 AOPN의 농도를 분석하기 위해서는 산 추출법을 이용하였다. 100 mm dish에서 배양한 세포에 400 ul의 6% HClO4를 가하고, 간 조직은 2 배의 6% HClO4를 가한 후 즉시 균질화 하였다. 14,000 g, 4℃에서 10 분간 원심한 후 얻은 상청액에 4 mM EDTA가 포함된 1 M borate buffer(pH 11)를 75% 가하여 중화시켰다. 샘플들은 분주하여 -80℃에 보관하였다.
1-2) 간 조직에서 reduced pyridine nucleotide(RPN)의 추출: 간 조직에서 RPN의 농도를 분석하기 위하여 알칼리 추출법을 이용하였다. 간 조직은 1배의 차가운 0.5 M KOH를 가한 후 즉시 균질화 하였다. 이후 2배 부피의 차가운 증류수를 가하여 2 분간 혼합한 후, Amicon 한외여과막(ultrafiltration membrane(MILLIPORE사))을 이용하여 14,000 g, 4℃에서 40 분간 원심 분리하였다. 얻은 여과액에 1 M KH2PO4(pH 6.5)를 10% 가하여 중화시켰다. 샘플들은 분주하여 -70℃에 보관하고, 72 시간 내에 측정하도록 하였다.
1-3) Chromatography 분석조건: 이동상은 100 mM ammonium acetate:MeOH(98:02 (v/v))를 사용하고, 조제 후 0.22-um Millipore filter로 여과하였다. 유속은 분당 0.8 ml이며, 254 nm에서 검출하였다. 분리는 ZORBAX Bonus-RP C18 column(3.5 um, 4.6 150 mm I.D., Waters, USA)을 사용하였다. 샘플들은 컬럼으로 주입되기 전까지 자동검체기(autosampler) 온도조절 장치로 4℃로 유지하였다.
2) 수용성 tetrazolium salt-8 (WST-8)을 이용한 세포내 NAD(P)H 양 결정: 수용성의 tetrazolium salt는 환원되면 노랑색의 formazan dye로 되는 성질을 이용하여 NAD(P)H 양을 알아내기 위해 사용하였다. 배지에 살아있는 세포들내의 NAD(P)H 총량은 분광광도계를 이용하여 일정 시간 동안 측정하였다. 세포들을 96-well plate(2 X 104 cells/well)에 분주한 후 우태아혈청(fetal bovine serum)과 항생제가 포함된 100 ul의 배지로 하루 동안 배양하였다. 정해진 농도의 후보 화합물(e.g., pyrano-1,2-naphthoquinone)과 1/10 부피(volume)의 CCK-8 (Dojindo Molecular Technology)을 처리한 직후부터 분광광도계를 이용하여 흡광도를 측정하였다. CCK-8은 수용성의 2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfo-phenyl)-2H-tetrazolium monosodium salt (WST-8, 5 mM)와 전자매개체인 1-methoxy-5-methylphenazinium methylsulfate (1-methoxy PMS, 0.2 mM)로 구성되어 있다. WST-8은 전자운반체인 1-methoxy PMS와 NAD(P)H가 존재시 환원(bioreduction)을 통해 수용성인 노랑색의 formazan dye를 생성하였다. 따라서, tetrazolium염의 환원은 전적으로 세포내 NAD(P)H의 양에 의해 결정된다. 배지내에 살아있는 세포들에 의해 생성된 formazan dye의 양은 분광광도계를 이용하여 450 nm의 파장(650 nm의 reference filter)에서 일정 시간 동안 측정하였으며, 대조군과 비교하였다. 또한, 생리식염수만 넣은 값을 기본(blank)으로 사용하였다.
(8) S9 상청액 분리방법
DIO(diet induced obesity) 마우스로부터 여러 조직들(간, 뇌, 근육, 폐, 신장 등)을 적출한 후 0.25 M sucrose와 단백질 전해제 혼합물(protease inhibitor cocktail(Roche))이 포함된 50 mM Tris(pH 7.4) 완충액을 4 배 가하여 균질화한 후, 세포질 분획을 얻기 위하여 105,000 g, 4℃에서 1 시간 동안 초원심분리 하였다. 상청액은 보관하게 되면 NQO1 활성이 감소되므로, 되도록이면 얻은 즉시 실험에 사용하도록 하였다. NADH recycling assay를 위한 S9 상청액들은 분주하여 사용 전까지 -80℃에 보관하고, 72 시간 내에 측정하였다.
(9) NQO1 활성 측정
효소 반응액은 25 mM Tris/HCl(pH 7.4), 0.2 mg/ml bovine serum albumin, 200 uM NADH(전자 공여자), 50 uM 2,6-dichlorophenolindophenol(DCPIP, 전자 수용체) 그리고 10 ug의 S9 단백질이 포함된다. 10 uM dicoumarol 존재 유무시에 dicoumarol-sensitive NQO1 활성 측정을 하였다. 효소반응은 S9 상청액의 첨가로 개시되며, 37℃에서 시행하였다. 이때 반응 속도는 DCPIP가 환원되면서 흡광도가 감소됨을 600 nm에서 10 분 동안 관찰하며, NQO1 활성 정도는 10 uM dicoumarol 유무에 따른 반응 속도 차이를 토대로 dicoumarol-sensitive NQO1 활성 측정을 하였다.
(10) NAD (P)H recycling assay
위에서 추출한 S9 상청액 또는 인간재조합 NQO1(hrNQO1)을 사용하여 NADH recycling assay를 시행하였다. 0.2 mg/ml bovine serum albumin이 포함된 25 mM Tris/HCl(pH 7.4) 용액에 200 uM NAD(P)H와 함께 20 ug S9 상청액 또는 0.5 unit의 hrNQO1을 첨가하였다. 효소 반응은 20 uM의 후보 화합물을 첨가하면서 시작되며, 340 nm의 파장에서 10분 동안 흡광도의 변화 값을 기록하였다. NQO1 activity assay에서와 마찬가지로 10 uM dicoumarol(NQO1 저해제) 존재 유무에 따른 반응 속도의 차이를 통해 NAD(P)H recycling 정도를 구할 수 있다.
(11) Beta - oxidation assay
1) 14C-palmitic acid 주사액 준비: 100% EtOH로 녹여져 있는 1-14C palmitic acid에 0.02 N NaOH를 첨가하여 건조하였다. 이렇게 분말화된 sodium palmitate를 다시 0.1% BSA/PBS로 녹여 잘 섞어준 뒤에 40℃로 데웠다.
2) Albumin과 결합된 14C-palmitic acid 주사: 위에서 준비한 주사액을 10 microCi/150 ul/head로 DIO 마우스의 꼬리에 정맥주사하고, 10 분 뒤에 간을 적출하였다.
3) 간조직내 지방 추출: 떼어낸 간은 액체 질소에 바로 넣어 급냉동한 후, 무게를 재어 0.25 M sucrose, 5 mM MgCl2, 1 mM mercaptoethanol 및 0.5 mM EDTA가 포함된 5 mM Tris-HCl 완충액을 간 무게의 5 배 양으로 넣어주고 균질화하였다. 각 샘플은 동량을 취해 새로운 15 ml 용기에 각각 옮겨 담고 2.5 배 양의 C/M 용액(chloroform:MetOH= 2:1) 첨가하여 2 분간 균질기를 이용해 잘 섞어준 뒤, 2500 rpm, 20 min으로 원심 분리하여 chloroform 층만 분리하여 새 용기에 옮겼다. 나머지에는 2 배 양의 C/M 용액을 첨가하여 다시 2 분간 잘 섞어주고 원심분리하여, chloroform 층만 분리해내는 과정을 2-3회 반복하였다. 이렇게 모은 chloroform층을 농축한 뒤에 5 mM deoxycholate 첨가하여 scintillation 바이알에 옮겼다. 그리고, 10 배 이상의 톨루엔 혼합용액(toluene cocktail solution)을 넣고 교반기를 이용하여 충분히 섞어준 뒤에 scintillation countor로 방사선활성(radioactivity) 측정하였다.
(12) 광학 현미경적 관찰
적출한 조직은 일정부위를 적당한 크기로 자른 다음 통상의 방법에 따라 10% 포르말린에 고정하고 수세, 파라핀 포매 과정을 거쳐 블록을 제작하였다. 만들어진 블록은 4 ㎛ 두께로 절편을 만들어 일반적인 변화를 관찰하기 위해 hematoxylin과 eosin(H&E) 염색을 실시하였다.
(13) 투과 전자현미경적 관찰
세포의 미세구조적 관찰을 하기 위하여, 적출한 조직은 1 mm3의 크기로 세절한 후, 2.5% glutaraldehyde(0.1M 인산완충용액 pH 7.4, 4℃)에 2-4 시간 전고정하고 세척 후, 다시 1% osmium tetroxide 용액에 2 시간 후고정하여, 통상의 방법에 따라 연속농도의 에탄올로 탈수시키고, propylene oxide로 치환하여 에폭시(epoxy) 수지 혼합물에 포매한 후, 열중합시켜 블록을 제작하였다. 만들어진 블록은 초박절편기를 이용하여 0.5-1 ㎛ 두께로 박절하여 toludine blue로 염색하여 광학 현미경하에서 관찰 부위를 선정한 다음 60-70 nm 두께로 초박절하여 uranyl acetate와lead citrate로 이중 염색하여 가속 전압 75 Kv에서 Hitachi H-600형 투과 전자현미경으로 관찰하였다.
(14) Oil Red O 염색
동결절편한 조직을 5 ㎛ 두께로 박절하여 공기 중에서 1 시간 동안 건조시킨 후 여과한 0.5% oil red O 용액에서 20 분간 반응시켰다. 흐르는 물에서 수세한 후 Gill hematoxylin으로 20-30 초간 이중염색하고 수세 후 관찰하였다.
(15) Perilipin 염색
지방조직을 3 ㎛ 두께로 박절하여 탈파라핀 후 4 분 동안 구연산(citrate) 완충액에서 고압으로 항원을 노출 후 수세하였다. 3% 과산화수소수 용액에서 10 분 동안 반응 후 TBST 용액으로 3 분 동안 3 번 세척하였다. 200 배 희석한 perilipin에 대한 일차항체(guinea pig, anti-perilipin)로 1 시간 반응시키고 TBST 용액으로 세척 후 이차항체(donkey anti-guinea pig, cy3-conjugated)를 가하여 30 분간 반응시켰다. TBST 용액으로 3 분 동안 3 번 세척 후 fluourmount G로 mounting 후 형광 현미경으로 관찰하였다.
(16) Oligonucleotide sequence
(17) 식이에 의한 DIO 마우스의 제작 및 후보 화합물의 처치
고농도의 지방을 포함하는 사료를 3 내지 4 주 정도 계속 먹임으로써 DIO 마우스를 만들고 마우스의 유지를 위한 조건은 12 시간 light/12 시간 dark 상태에서 마우스를 사육하였다. 생리식염수 투여 군 각 3 마리, vehicle 투여 군 각 5 마리, 그리고 50 mg/kg의 후보 화합물 투여군 각 7 마리로 정하고 경구투여 방법을 통해 매일 투여하고 7 일, 28 일 및 56 일에 각각의 조직을 잘라내고 액체질소를 이용해서 조직을 얼리고 -80℃에서 장기 및 단기 보관하였다.
(18) 실시간 정량 PCR
두 그룹의 식이에 의해 유도된 DIO 마우스를 7 일, 28 일 및 56 일째에서 간, 비만조직, 근육을 분리한 후 total RNA를 Trizol를 이용하여 추출하고 1 ug의 total RNA를 이용하여 cDNA를 만들고 사용된 중합효소는 M-MLV ploymerase를 이용하여 제공된 방법에 따라 준비하였다. 준비된 cDNA를 이용하여 실시간 정량 PCR를 수행하였다. 각각의 올리고는 위 표에서 제시한 Tm 값을 이용하여 수행하였다.
(19) cDNA microarray
cDNA microarray는 affymetrix mouse genome 430A 2.0 array chip을 이용하여 DIO 마우스의 7 일, 28 일, 56 일에서 취한 간, 지방조직, 근육에서 Trizol를 이용해서 1 ug/1 ul의 농도보다 높은 농도로 전체 13 ug정도 되게total RNA를 추출한 후 microarray를 수행하였다. 기능에 따른 분류는 affymetrix 홈페이지에서 지원되는 netaffx를 통해 분류하였다.
(20) AMPK kinase assay
AMPK kinase의 활성을 알아보기 위하여, 실험에 사용된 조직을 AMPK 반응 용액(20 mM HEPES-NaOH, pH 7.0, 0.4 mM dithiothreitol, 0.01% Brij-35)으로 조직을 용해시켜서 단백질을 분리하고 2 시간 동안 AMPK를 인식하는 항체를 이용하여 붙였다. 그 후 protein A/G agarose를 이용하여 AMPK 단백질을 전체 단백질에서 1시간을 반응시켜 분리하고 SAMS 기질 peptide 7 ul와 γ[32P]ATP (1mCi/100 ul) 10 ul를 넣고 30℃에서 15 분간 반응시켰다. 반응물을 2 cm X 2 cm P81 paper square에 붙이고 5 분간 0.75% phosphoric acid로 3 번 세척 후, 5 ml scintillation cocktail를 vial에 paper와 함께 넣고, scintillation counter를 이용하여 CPM 값을 측정하였다.
(21) 동물 모델(Animal model)
모든 동물 시술(procedure)은 충남국립의과대학(Chungnam National University School of Medicine)의 동물 관리와 이용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 가이드라인에 따라 수행하였다. OLETF 마우스는 Otsuka Research Institute에서 구입하였다. 수컷 ob/ob 및 C57BL/6 마우스는 Jackson Laboratory에서 구입하였고, 항온 2℃가 유지되는 방에 light:dark 12:12-h 스케줄로 수용하였다. 4 주령 수컷 C57BL/6 마우스는 7 주 동안 고지방식(HFD (Research Diets Inc), 24% (w/w), 45% calories as fat)을 자유롭게 식이하였다. 마우스 군들은 미처리군(untreated), 부형제-처리군(칼슘 실리케이트), pair-fed 군 및 후보 화합물-처리군(칼슘 실리케이트로 코팅된 βL 나노입자) 이었다. 체중과 식이량은 매일 측정되었다. 실험 종료시, 한 군의 마우스는 마취시켜 MRI를 실시하였다. 다른 군의 마우스는 해부하고 조직 중량을 측정하였다. Epidydimal 지방, 간, soleus 근육 및 EDL(extensor digitorum longus) 부분들을 준비하고, 면역조직화학(immunohistochemical), oil-red O 및 pH-sensitive ATPase 염색을 하여 분석하였다.
(22) 세포 및 웨스턴 블롯 분석( western blot analysis )
HepG2, HEK293, C2C12, 및 L6 근원세포는 ATCC에서 구입하였다. LKB-/- MEFs는 R. A. DePinho에서 구입하였다. 공지의 방법으로 Rat ventricular myocytes를 성인 마우스 심장으로부터 효소적으로(enzymatically) 분리하였다. AMPK (Thr172)와 ACC (Ser79)의 인산화는 각각 Cell Signaling Technologies 및 Upstate, Inc.로부터 전체 및 인특이성(phosphospecific) 항체들을 이용하여 웨스턴 블롯으로 분석하였다.
(23) 형광영상 ( fluorescence imaging )
실험들은 드라이 타입 형광 대물렌즈(dry-type fluorescence objective lens; x40, numerical aperture of 0.85), 광전 증배관(type R1527, Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japan), 및 Deltascan illuminator (Photon Technology International Inc., Lawrenceville, NJ)를 포함하는 Nikon 형광도립현미경(inverted fluorescence microscope; Eclipse TE300, Japan)으로 구성된 microfluorometric system을 이용하여 수행하였다.
형광은 단색광(350 nm)을 내기 위해 10 Hz chopper wheel로 된 75 W xenon arc lamp로 조사하였다; 405ㅁ15의 강도(intensity)와 460ㅁ10 nm 광이 측정되었다. 비록 460 nm에서 자가형광은 미지의 세포내 성분들이나 cytosolic NAD(P)H로부터 발생할 수 있지만, 본 방법에 의해 검출된 빛의 대부분은 미토콘드리아 NAD(P)H로부터 발생한 것이다.
(24) 미토콘드리아 막 전위 측정
ΔΨm의 측정을 위해, 세포에 형광 지시약 TMRE(tetramethylrhodamine ethyl ester) 20 nM를 계속적으로 도포하여 로드(load)하였다. 미토콘드리아의 Ca2 +를 모니터하기 위해, glass coverslip 상의 세포들을 cold loading/warm incubation에 의해 10 μM Rhod-2 AM으로 로드하였다. 시토졸(cytosol)의 Ca2+ 를 모니터하기 위해, 세포들을 37 ℃에서 30 분 동안 10 μM Fluo-4 AM으로 상호-로드하였다. 세포들을 KB 용액으로 두 번 세척한 다음, perfusion chamber에 장착하였다. 형광영상은 x200 및 x400 배율로 confocal laser scanning microscope (LSM-510 META, Carl Zeiss)를 사용하고, appropriate laser lines 및 filter set를 사용하여 얻었다. 영상들을 LSM-510 META software (Zeiss)를 사용하여 분석하였다. 적색 형광의 TMRE, Rhod-2 및 녹색 형광의 Fluo-4은 x63 numerical aperture, 1.4 oil-immersion planapochromat lens가 장착된 inverted Zeiss 510META laser-scanning confocal microscope로 영상을 얻었다. 녹색과 적색 형광은 각각 488 nm와 543 nm 빛으로 조사되었다. 입사광은 545 nm dichroic mirror 로 투과되었고, 500 ~ 530 nm band-pass (green)와 560 nm long-pass (red) barrier filter를 통해 관찰하였다.
(25) 효소 분석( Enzyme assays )
효소 분석을 위해 마우스 조직으로부터 세포질 추출을 수행하였다. Dicoumarol-sensitive NQO1 활성을 공지의 방법으로 측정하였다: 이 방법은 DCPIP의 환원으로 인한 600 nm에서 흡광도 감소를 측정한다. Total AMPK 활성을 공지의 방법으로 합성 "SAMS" 펩티드 및 [γ-32P] ATP를 사용하여 측정하였다. ACC 활성은 ACC의 allosteric activator인 citrate (2 mM)의 존재 또는 부재에서 acid-stable 생성물에 14CO2의 고착을 정량하여 측정하였다. CPT 활성은 공지의 방법으로 L6 근원세포 및 soleus 근육에서 측정하였다. HAD 활성은 L6 근원세포 및 근육에서 acetoacetyl-CoA에서 L-3-hydroxybutyryl CoA로의 전환 및 이에 수반되는 NADH에서 NAD+로의 산화를 모니터링 함으로써 측정하였다. 반응은 공지의 방법으로 340 nm에서 모니터링하였다.
(26) 지방산 산화 (Fatty acid oxidation)
[14C]palmitoyl-CoA (Perkin Elmer) 산화를 공지의 방법으로, labelled CO2 및 0.2 ml benzethonium solution을 사용하여 L6 근원세포 및 soleus 근육에서 측정하였다.
(27) Malonyl - CoA 함유
Malonyl-CoA를 공지의 방법13으로 HPLC에 의해 측정하였다. Acyl-CoA esters를 0.2 M 암모늄 아세테이트를 함유하는 acetonitrile/water (1.75:98.25)를 사용하여 HPLC에 의해 분리하였다. 샘플들을 20 분 동안 세척하고, 0.2 M 암모늄 아세테이트를 함유하는 acetonitrile/water (10:90)에 100 분 선형구배(linear gradient)로 용출하였다.
(28) Physiological 측정
O2 소비량을 공지의 방법으로 기록하였다. 간접적 열량 측정(indirect calorimetry)을 위해, 마우스를 개별적으로 calorimetry chamber(Oxymax OPTO-M3 system; Columbus Instruments, Columbus, OH)에 두었다. 48 시간의 적응 기간 후, O2 소비량 및 CO2 생성량을 24 시간 동안 매 30 분 마다 측정하였다. 처음 24 시간 동안, 마우스는 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있었고, 두 번째 24 시간 동안에 마우스는 단지 물에만 접근할 수 있었다. heparinized tube에서 혈액 샘플을 채취하여 즉시 얼음에 놓고, 원심 분리하여 장차 사용을 위해 -20℃에서 보관하였다. TG(triglyceride), total cholesterol, 유리 지방산, 및 포도당(Beckman Instruments, CA)를 정량하기 위해 Enzymatic colorimetry를 사용하였다. 플라즈마 인슐린(Linco Research, MO), TNFα(R&D System), adiponectin (Linco Research, MO), resistin (KOMED) 및 leptin (Linco Research, MO)는 ELISA로 정량하였다.
(29) HPLC-MS/MS 분석
ATP, ADP, AMP, NAD 및 NADP를 분석하기 위해, perchloric acid (HClO4)로 추출한 간 샘플 50 uL에 5 mM ammonium acetate 450 uL을 가하여 10 회 희석하였다. 희석된 샘플을 vortexing (1 분)하여 혼합하고, 0.2 ㎛ nylon syringe filter (Whatman, Brentford, UK)로 여과한 후, 5 uL aliquot 을 HPLC 시스템으로 주입하였다. 이들 분석물들을 위한 각각의 스탠더드 용액(50 uL)을 2-chloroadenosine(internal standard)을 함유하는 추출액 50 uL 및 5 mM ammonium acetate 400 uL에 첨가하였고, 상기 샘플과 동일하게 혼합 및 여과하였다. NADH 및 NADPH를 분석하기 위해 potassium hydroxide (KOH) 용액으로 추출한 간 샘플들 100 uL을 동량의 5 mM ammonium acetate (KOH solution for standards)를 첨가함으로써 2 회 희석하였다. HPLC 시스템은 Agilent 1100 series vacuum degasser, binary pump, autosampler, thermostatted column compartment, DAD detector (Agilent technologies, Palo Alto, CA)로 구성되어 있다. 아데닌 및 뉴클레오티드 동족류들에 대해 gradient 법을 사용하여 Waters XTerra MS C18 2.1 X 150 mm, 3.5 μm column (Waters, Milford, Massachusetts, USA)으로 크로마토그래피 분리를 하였다. 아데닌 및 뉴클레오티드 동족류들에 대한 이동상(mobile phase)은 5 mM ammonium acetate (A) 및 methanol (B)이다. NAD+- related 화합물들을 98%(A)에서 시작되고 8 분에 70%(B)로 종료되는 linear gradient를 사용하여 분리하였다. 이동상은 70%(B)에서 7 분 동안 전개되었다. 마지막으로, 이동상은 16 분에서 98%(A)로 복귀되었고, 12 분 동안 98% (A)로 재평형(reequilibriating)하였다. 유량(flow rate)은 전 시간에서, 0.2 mL/min 이었고 주입부피(injection volume)는 5 uL이었다. 전기분무 질량분석법(Electrospray-ionization mass spectrometry)을 positive ion mode에서 MDS Sciex API 4000 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (Applied Biosystems, Ontario, CA)를 사용하여 수행하였다. 분석물들을 unit resolution에 MRM (multiple reaction monitoring) mode로 하기 transition을 이용하여 관찰하였다: ATP, m/z 508 → 136; ADP, m/z 428 → 136; AMP, m/z 348 → 136; NAD, m/z 664 → 136; NADP, m/z 744 → 136; NADH, m/z 665 → 136; NADPH, m/z 745 → 136; 2-chloroadenosine, m/z 302 → 170.
(30) 포도당 내성 및 인슐린 자극 테스트
공지의 방법으로 12 시간 단식 마우스에 포도당 내성 테스트를 수행하였다. 6 시간 단식 마우스에 상기한 바와 같이, 인슐린 자극 테스트를 수행하였다.
(31) DNA 마이크로 어레이 및 PCR 정량 ( DNA microarray and quantitative PCR )
부형제 또는 후보 화합물로 4 주 동안 처치한 수컷 마우스로부터 pooled 지방 조직, 간 또는 근육으로 마이크로 어레이 분석을 실시하였다. Trizol reagent(Invitrogen, Carlsbad, CA)로 균질화된 조직으로부터 Total RNA를 준비하였다. 마이크로 어레이 분석을 위한 탐침(Probe)을 10 μg total RNA로부터 준비하였고, Mouse 430A GeneChips (Affymetrix, Santa Clara, CA)을 교배하였다. 교배된 어레이를 스캔하고, Microarray Analysis Suite 5.0 (Affymetrix)를 사용하여 원데이타(raw data)를 추출하였다. PCR 정량을 위해, Superscript II 및 oligo(dT) 프라이머로 1 μg total RNA로부터 cDNA를 역전사하였다. LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I kit 및 LightCycler로 제조사(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)의 설명에 따라 생성된 cDNA들을 증폭하였다. 발현데이타(Expression data)는 β-actin에 표준화하였다.
(32) ICV cannulation 및 injection
공지의 방법으로, 23 게이지 스테인레스 스틸 cannulae (Plastics One, Roanoke, VA)를 3rd ventricle (1.8 mm caudal to the bregma 및 5.0 mm ventral to the sagittal sinus)에 이식하였다. 7 일 회복 후, 부형제(0.2% DMSO) 또는 후보 화합물을 2 ㎕ 부피에 1 분에 걸쳐 ICV 실시 후, 밤새 단식시켰다. 주입 후 7 시간 동안 음식 섭취를 모니터하였고, 24 시간 주입 후 체중을 측정하였다. 독립적으로 평가하여 cannulae에 바르게 자리잡은 동물들만을 분석에 포함시켰다.
(33) Statistical analyses
결과는 mean±s.d 또는 mean±s.e.m으로 표현하였다. Student's t test 및 analysis of variance (ANOVA) 분석을 사용하여 통계적 의의에 대해 군들 간의 차이점을 실험하였다. P<0.05인 경우 의의에 대해 차이점을 고려하였다.
(34) 기타 방법
단백질 농도는 Bradford method (Bio-Rad)를 이용하여 측정하였다. 이때 표준단백은 BSA를 사용하였으며, 모든 실험은 3회 반복하였다.
실시예 1: NQO1 활성화제에 의한 NADH 의 세포내 농도 변화
본 실험에서는 NQO1 활성화제인 pyrano-1,2-naphthoquinone 화합물(이하에서는, 때때로 'βL'로 약칭하기도 함)이 NQO1에 의존적으로 반응해서 환원됨을 보여 준다.
도 1-A는 NQO1 효소활성이 존재하는 간세포주인 HepG2에 NQO1 활성화제인 pyrano-1,2-naphthoquinone을 2 시간 동안 처리하면서 실시간으로 세포내 NADH의 양을 측정하였을 때 농도에 의존적으로 NADH의 양이 감소함을 보여 준다.
도 1-B는 NQO1 효소활성이 없는 HEK293 세포에 pyrano-1,2-naphthoquinone을 2 시간 동안 처리하면서 실시간으로 세포내 NADH의 양을 측정하였을 때 농도와 시간에 관계없이 NADH의 양은 변화되지 않음을 보여 준다.
도 1-C는 NQO1 효소활성이 없는 HEK293 세포에 NQO1 유전자를 삽입시킨 후 pyrano-1,2-naphthoquinone을 2 시간 동안 처리하면서 실시간으로 세포내 NADH의 양을 측정하였을 때 농도에 의존적으로 NADH의 양이 감소함을 보여 준다. 이 결과는 pyrano-1,2-naphthoquinone에 의한 NADH의 감소는 NQO1에 의존적으로 일어남을 입증한다.
구체적으로, HepG2, HEK293 및 pSG5 HA-NQO1 또는 pSG5 HA-NQO1 C609T가 삽입된 HEK293 세포들에서 NQO1 활성 및 NQO1 활성의 유무에 따른 NAD(P)H 형광의 세포 내 농도 변화를 측정하였는 바, βL이 NQO1-의존성 NAD(P)H의 산화를 촉진함으로써 NQO1 효소활성이 존재하는 HepG2 세포와 심장 근육 세포(cardiomyocyte)에서 NAD(P)H가 대략 40% 정도 감소되었다(도 2 및 도 3 참조).
그러나, NQO1 효소활성이 없는 HEK293 세포 대조군에서는 이러한 변화가 나타나지 않았고, wild-type NQO1이 삽입된 HEK293 세포에서는 βL에 의해 NAD(P)H 산화가 촉진되었으며, 촉매적 불활성의 NQO1C609T가 삽입된 HEK293 세포에서는 NAD(P)H 산화가 일어나지 않았다(도 4 참조). 또한, βL-촉진 NAD(P)H의 산화는 NQO1의 특유 저해제인 dicoumarol에 의해 제한되었다(도 5 참조).
실시예 2: Lean 마우스와 DIO 마우스의 조직에서의 NQO1 의 양 및 활성의 변화
NQO1의 조직 및 세포내 분포를 확인하기 위하여, 마우스의 여러 조직을 적출하여 초원심분리를 통해 정제된 세포질 분획을 이용하여 10 uM dicoumarol 유무시에 따른 반응 속도 차이를 토대로 dicoumarol-sensitive NQO1의 활성 측정을 하였다. NQO1 활성 값은 환원된 2,6-dichlorophenolindophenol /min/mg proteins으로 나타낸다.
도 6은 Lean 및 DIO 마우스의 여러 조직 중에 NQO1 활성이 있음을 보여 준다. Lean 마우스와 DIO 마우스 조직에서의 NQO1 활성을 비교 측정한 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, Lean 마우스보다 DIO 마우스의 근육 및 간에서 NQO1 활성이 특히 높게 나타났다.
실시예 3: NQO1 활성화제에 의한 세포내에서 ATP 농도의 변화
도 7은 신경세포에서 pyrano-1,2-naphthoquinone에 의해 세포내 ATP 농도가 급격히 감소함을 보여 준다. 도파민성 신경세포인 MN9D 세포와 비도파민성 신경세포인 MN9X 세포에 5 uM pyrano-1,2-naphthoquinone을 처리하고 정해진 시간에 세포내 ATP 농도를 측정한 바, MN9D와 MN9X 세포에서 ATP 농도가 감소하였고, MN9D 세포가 MN9X 세포보다 pyrano-1,2-naphthoquinone에 더 민감하게 반응하였다.
실시예 4: NQO1 에 의한 세포내 에너지 농도의 변화
세포내에서 NQO1을 활성화시키는 약물을 처리하여 에너지 농도의 변화를 확인함으로써, NQO1이 에너지 농도의 조절에 중요한 역할을 하는 지를 확인하고자 하였다.
도 8-A는 간세포주인 HepG2에 10 uM pyrano-1,2-naphthoquinone을 2 시간 동안 처리하면서 각 시간에 따른 세포내 ATP, ADP와 AMP의 양을 LC-MS로 측정하였을 때, pyrano-1,2-naphthoquinone처리 후 30 분에ATP 양은 최소로 감소하고 AMP 양은 최대로 증가함을 보여 준다. 도 8-B는 NQO1 효소활성이 없는 HEK293 세포에 pyrano-1,2-naphthoquinone을 2 시간 동안 처리하면서, 마찬가지로 세포내 ATP, ADP와 AMP의 양을 LC-MS로 측정하였을 때, 세포내 ATP의 양은 HepG2 세포에 비해 변화되지 않음을 보여 준다. 따라서, NQO1 활성화제에 의한 ATP 농도의 감소는 NQO1에 의존적으로 일어남을 알 수 있다.
실시예 5: 생체내에서 NQO1 활성화제에 의한 NAD + / NADH , AMP / ATP 및 NADP + / NADPH 비율의 변화
NQO1 활성화제가 NQO1을 통해서 생체내에서도 NAD+/NADH 비율 변화에 영향을 주는 지를 확인하고자 하였다. DIO 마우스의 꼬리 정맥에 5 mg/kg pyrano-1,2-naphthoquinone을 정맥주사 한 후 6 시간 동안 간 조직내 NADH 양과 NAD+/NADH 비율의 변화를 보았다.
도 9-b는 AMP의 농도를 측정하였을 때 βL의 처리 후 30 분에 최대로 증가하였으며, 120 분에 회복됨을 보였고, AMP/ATP 비율은 30 분에 최대로 증가하였으며 점차 감소하여 360 분에 회복됨을 보였다.
도 9-c는 NAD+와 NADH의 양을 측정하고, NAD+/NADH 비로 표시하여 변화 양상을 나타내었을 때, NAD+ 양 및 NAD+/NADH 비율은 120 분에 최대로 증가하였으며, 이후 감소함을 보였다. 즉, βL을 정맥 주사한 경우, NAD+ 와 AMP를 일시적으로 증가시켜 간에서 실험군이 대조군보다 더 높은 AMP/ATP 와 NAD+/NADH 비율을 나타냈다.
또한, 도 9-d는 βL로 처치한 후, NADP+의 수치는 변하지 않았지만 120 분에 NADP+/NADPH 비율은 최대로 증가하였는 바, 이는 NADPH가 감소하였기 때문이다.
상기와 같은 실험 방법으로, βL을 Lean 마우스와 DIO 마우스에 각각 투여하였을 때 AMP/ATP 비율과 NAD+/NADP 비율의 변화 결과가 도 10과 도 11에 각각 개시되어 있다. 이들 도면에서 보는 바와 같이, Lean 마우스의 경우, 대조군과 비교하여 AMP/ATP 비율과 NAD+/NADP 비율의 변화가 적었으나, DIO 마우스의 경우에는 큰 변화를 나타내었고, 시간이 경과함에 따라 Lean 마우스의 비율과 유사한 크기로 수렴함을 확인할 수 있다. 따라서, NQO1 활성 화합물은 비만 객체에서 AMP/ATP 비율과 NAD+/NADP 비율의 변화에 크게 기여함을 알 수 있다.
실시예 6: NQO1 이 C57BL /6 마우스의 지방산화(β-oxidation)에 미치는 영향
NQO1의 활성화제인 pyrano-1,2-naphthoquinone이 C57BL/6 마우스의 지방산화(β-oxidation)에 미치는 영향을 검토하였다.
도 12는 부형제 또는 50 mg/kg pyrano-1,2-naphthoquinone을 7 일간 먹인 DIO 마우스의 꼬리 정맥에 14C-palmitic acid를 정맥주사한 후, 간 (중성지방(triglyceride(TG))에 삽입된 14C-palmitic acid의 양을 측정하였다. 10 uCi의 14C-palmitic acid를 마우스 꼬리에 정맥주사하고 10 분 후에 간을 적출하여 균질화 하였다. 그로부터 지방을 추출 후, liquid scintillation counter로 방사선활성(radioactivity)를 측정하였다. pyrano-1,2-naphthoquinone을 처리한 마우스에서 간 중성지방(TG)에 삽입된 14C-palmitic acid의 양은 부형제 처리한 마우스(대조군)보다 약 45% 적었다. 이는 pyrano-1,2-naphthoquinone을 처리한 마우스는 대조군에 비해 간외 조직에서 더 많은 양의 palmitic acid를 이용함을 보여 준다.
도 13에서 j 및 k는 CPT 와 미토콘드리아 지방산 산화의 중요한 억제제인 ACC 활성과 malonyl CoA의 수치가 βL에 대응하여 감소하였다는 것을 보여 준다. 반면에, 도 13에서 l, m 및 n는 CPT, HAD의 활성 및 14C-palmitoyl CoA β-산화의 비율은 대조군보다 βL-처치 DIO 마우스의 근육에서 현저하게 높아졌다는 것을 보여 준다. 이는, βL에의 접촉은 NAD(P)/NAD(P)H 비율에서 일시적인 NQO1-mediated elevation을 가져오고, 이는 생체 내에서 AMPK를 활성화시키고 미토콘드리아 산화적 인산화와 지방산 산화를 촉진한다는 것을 나타낸다. 즉, βL로 장기간 치료 시, 미토콘드리아 산화적 인산화를 촉진할 수 있고, adaptive 미토콘드리아 생합성을 증진할 수 있다는 것을 의미한다. 따라서, βL은 대사 질환 치료제로 사용될 수 있다.
실시예 7: NQO1 활성화제에 의한 AMPK 및 ACC 의 인산화 조절
NQO1 활성화제가 NQO1을 통해 생체내 에너지 조절 단백질인 AMPK 및 ACC의 인산화에 영향을 주는지 여부를 확인하였다. NQO1 활성화제인 pyrano-1,2-naphthoquinone에 의한 AMP kinase, ACC(acetyl-CoA carboxylase)의 인산화를 알아보기 위하여, HepG2 세포를 RPMI+10% FBS배지로 6 well plate에 1X105 개로 분주한 다음 24 시간 동안 키운 뒤, RPMI 무혈청 배지로 교체하고 pyrano-1,2-naphthoquinone (10 uM)을 각각 30 분, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 6 시간 동안 대조군(DMSO)과 함께 각각 처치하였다. 인산화된 ACC를 관찰하기 위하여 Anti-ACC, Anti-pS79-ACC를, 인산화된 AMP kinase를 관찰하기 위하여 Anti-AMPK, Anti-pT172-AMPK를 각각 사용하였다. 도 14에서 pyrano-1,2-naphthoquinone에 의한 AMP kinase의 인산화는 초기 시간(30 분)부터 관찰할 수 있고, 이는 6 시간까지 지속되는 것을 확인할 수 있다. 또한, AMP kinase의 대상 단백으로 알려져 있는 ACC도 인산화가 된 것을 확인할 수 있다. 이는 NQO1 활성화제에 의해 AMPK가 활성화 됨으로써, 지방합성(lipogenesis)의 중요 조절 효소인 acetyl-CoA carboxylase의 활성을 억제하고, 그 결과 지방산의 산화에 NQO1이 역할을 할 수 있음을 보여 준다.
2 일 동안 부형제 또는 βL 로 처리한 DIO 마우스의 간, 생식선 지방(gonadal fat; WAT), EDL 및 soleus 근육으로부터 각각 추출한 단백질에 대해 Western blot 으로 AMPK의 T172 인산화 및 ACC의 S79 인산화를 측정하였다. 간과 근육(EDL, Soleus)에서 ACC의 S79 인산화와 AMPKα의 T172 인산화는 증가하였으나, βL에 대응하는 DIO 마우스의 생식선 지방 (gonadal fat)에서는 그렇지 않았다 (도 15 참조).
실시예 8: NQO1 의 유무에 의한 AMPK 의 인산화에 미치는 영향
AMP kinase의 인산화에 있어서 NQO1 단백 존재의 중요성을 알아보기 위해, HepG2, MCF-7, HEK293 세포를 60 mm plate에 1X106 개로 분주한 다음, 24 시간 배양하고 무혈청 배지로 교체한 뒤, pyrano-1,2-naphthoquinone (10 uM)을 대조군(DMSO)과 함께 각각 30 분간 처치하였다. 세포는 RIPA 완충액으로 용해하여 분광광도계(spectrophotometer)를 이용해 모든 단백의 양을 정량한 다음, 50 ug의 단백을 전기영동 하였다. AMP kinase 인산화는 Anti-AMPK, Anti-pT172-AMPK를, NQO1 단백은 Anti-NQO1을 각각 사용하였다. HEK293 세포에서는 pyrano-1,2-naphthoquinone (10 uM)에 의한 AMP kinase의 인산화가 관찰되지 않는 것으로 보아, NQO1 단백이 AMP kinase의 인산화에 중요한 역할을 함을 알 수 있다.
도 16은 AMP kinase 인산화에 있어서 NQO1의 활성이 중요함을 알아보기 위해, HEK293 세포를 6 well plate에 1X105 개로 분주한 다음, 24시간 배양하고 pSG5-HA-NQO1(500 ng)과pSG5-HA-NOQ1-C609T(500 ng) 플라스미드를 세포로 형질 도입한 후, 24시간 뒤 무혈청 배지로 교체하고, pyrano-1,2-naphthoquinone (10 uM)과 AICAR(2 mM)을 대조군(DMSO)과 함께 각각 30분간 처치하였다. AMP kinase 인산화는Anti-AMPK, Anti-pT172-AMPK, 형질 도입된 NQO1은 Anti-HA를 각각 사용하였다. AMP kinase의 인산화는 효소활성이 없는 NQO1-C609T에서 일어나지 않는 것으로 볼 때, pyrano-1,2-naphthoquinone에 의한 AMP kinase의 인산화는 NQO1 단백의 효소활성이 중요함을 알 수 있다.
또한, NQO1에 의한 NAD(P)H 산화와 AMPK 인산화/활성화 사이의 관계를 각각 NQO1의 발현이 높은 βL-처치 HepG2, NQO1의 발현이 낮은 MCF-7, 및 NQO1의 발현이 없는 HEK293 세포에서 관찰하였다.
도 17-j는 βL-처치 세포에서 NQO1 활성화가 AMPK의 T172 인산화와 상호 관련이 있다는 것을 보여 준다. 도 17-k는 HEK293 세포가 AICAR(5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-beta-D-ribofuranoside)로 처치될 때, AMPK의 인산화 역시 증가한다는 것을 나타낸다. 또한, wild type NQO1으로 감염된 HEK293 세포를 제외하고, HEK293 세포에서는 AMPK 인산화/활성화가 촉진되지 않았다. 도 17-l 및 도 18는 HepG2 세포에서 βL은 ACC (acetyl-CoA carboxylase)의 인산화 뿐만 아니라, AMPK의 인산화 및 활성화를 촉진하는 한편 ACC의 활성화를 감소시킨다는 것을 보여 준다.
실시예 9: NQO1 에 의한 세포내 칼슘 농도의 변화 및 미토콘드리아 막 전위의 변화에 미치는 영향
NQO1 활성화제인 pyrano-1,2-naphthoquinone에 의한 HepG2 세포내의 칼슘 유입(calcium influx)을 관찰하고 NQO1의 억제제인 dicoumarol에 의한 칼슘 유입의 변화를 보고자 하였다. 세포를 24 시간 배양한 후, fluo-4로 30 분 전처리 하였다. 덮개판(coverslip)에 고정된 세포는 미끄럼유리(slide glass)에 옮긴 후 pyrano-1,2-naphthoquinone (10 uM)을 처리함과 동시에 형광현미경을 이용하여 2 초 간격으로 10 분 동안 이미지를 얻었다. Dicoumarol(5 uM)에 의한 세포내의 칼슘 유입의 변화를 관찰하기 위하여, fluo-4(5 uM)와 dicoumarol을 30 분 전처리 한 후, pyrano-1,2-naphthoquinone (10 uM)을 처리하고 형광현미경을 이용하여 관찰하였다.
도 19에서 보는 바와 같이, pyrano-1,2-naphthoquinone에 의한 칼슘 유입은 처치 후 약 10 초에 칼슘정점(calcium peak)를 보였고, 이는 dicoumarol에 의해서 억제되는 것을 관찰할 수 있었다. 또한, NQO1이 없는 HEK293에서 칼슘정점은 나타나지 않았다. 이는 NQO1 효소 활성이 칼슘유입에 밀접히 연관되어 있음을 보여 준다.
도 20에 나타난 바와 같이, βL 처치된 NQO1-proficient HepG2 세포 및 심장 근육 세포에서 TMRE (tetramethylrhodamine ethyl ester) 형광이 대략 20% 정도 감소되었는 바, 미토콘드리아 막 전위(membrane potential; ΔΨm)가 변화하였다. 그러나, 이러한 효과는 HEK293 세포에서는 관찰되지 않았다. βL의 ΔΨm에 미치는 영향은 일시적이고, dicoumarol로 처리된 세포에서는 관찰되지 않았다. 따라서, NQO1에 의존적으로 미토콘드리아 막 전위가 변화함을 알 수 있다.
한편, 칼슘 항상성(homeostasis)이 변화됨에 따라 칼슘-의존성 키나아제(dependent kinases; CDKs), 미토콘드리아 효소, 또는 기타 칼슘-의존적 프로세스의 활성이 조절된다. 도 21은 세포질 ([Ca2 +]c) 및 미토콘드리아 ([Ca2 +]m), Ca2 + 농도를 각각 나타내는 Flou4 및 Rhod-2-AM 형광을 보여주고 있는 바, 세포질 ([Ca++]c) 과 미토콘드리아 ([Ca++]m) 수치는 βL로 처치된 세포에서 유사한 거동(kinetic)으로 증가함이 지속적으로 관찰된다. 또한, βL이 세포 내 칼슘에 미치는 영향은 dicoumarol에 의한 억제에 민감하게 나타났다. 이는 NQO1 효소 활성이 칼슘 농도에 밀접히 연관되어 있음을 보여 준다.
또한, 도 22는 βL에 의해 HepG2 세포 및 심장 근육 세포에서 미토콘드리아 산소 소비가 증가되지만, HEK293 세포에서는 그렇지 않다는 것을 나타낸다. 이는 NAD(P)H의 빠른 산화를 동반하는 NQO1-mediated βL 환원은 세포 산화 환원 상태를 이동시키고, 미토콘드리아 산화적 인산화를 촉진한다는 것을 의미한다.
실시예 10: NQO1 과 AMPK α, β, γ 간의 결합 여부 확인
NQO1과 AMPKα, β, γ 간의 결합을 확인하기 위하여, HEK293 세포를 DMEM+10% FBS 배지로 100 mm plate에 분주한 다음, 세포 양이 80% 정도 되게 배양한 후, HA-NQO1을 형질전환 하였다. 형질전환 24 시간 후 세포를 용해시키고, 500 ug의 단백을 이용하여 면역침전을 수행하였다.
도 23에서 보는 바와 같이, NQO1은 AMPKα, β, γ 어느 것과도 결합하지 않음을 알 수 있다.
실시예 11: NQO1 활성화제가 endothelial nitric oxide synthase ( eNOS )의 인산화에 미치는 영향
AMPK의 활성화가 NRF-1을 활성화시키고 미토콘드리아 생합성(biogenesis)을 촉진함은 주지의 사실이다. 또한, 미토콘드리아 생합성을 촉진하기 위하여 NO/cGMP는 PGC-1α와 NRF-1을 활성화시킨다. AMPK를 활성화시키는 NQO1 활성화제가 NO 생성에 관여하는지 알아보기 위해 endothelial nitric oxide synthase(eNOS) 활성을 증가시키는 인산화를 측정하였다. NQO1 활성화제에 의한 eNOS의 인산화를 알아보기 위해, HUVEC 세포를 EBM2+5% FBS배지로 60 mm plate에 1X105 개로 분주한 다음 24 시간 동안 키운 뒤, EBM2 무혈청 배지로 교체하고 pyrano-1,2-naphthoquinone(10uM)을 정한 시간 동안 각각 처치하였다. 인산화된 eNOS를 관찰하기 위해 Anti-pS1177eNOS를 사용하였다.
도 24에서 eNOS의 인산화는 pyrano-1,2-naphthoquinone처리 후 30 분에 최대로 증가하였고 이후 감소하여 2 시간에는 관찰할 수 없었다. pyrano-1,2-naphthoquinone에 의한 eNOS의 인산화의 증가는 pyrano-1,2-naphthoquinone이 허혈성 심장질환, 미토콘드리아 근질환(mitochondrial myopathy) 뿐만 아니라 미토콘드리아 기능의 이상(퇴행성 뇌질환, 당뇨, 심근질환(cardiomyopathy), 노화 관련 질환을 나타내는 질환 등에 이용될 가능성을 보여 준다.
실시예 12: NQO1 활성화제가 C57BL /6 마우스에서 AMPK 활성화에 미치는 영향
도 25는 NQO1 활성화제가 C57BL/6 마우스에서 AMPK 활성화 시킴을 보여 준다. C57BL/6 마우스에 2 시간, 4 시간을 마우스의 꼬리부위에 있는 정맥을 통해 부형제와 5 mg/kg의 pyrano-1,2-naphthoquinone을 투여한 후, 간 및 생식선지방조직을 적출하여 AMPK kinase 활성을 분석하였다. 활성화 정도는 방사성 동위원소의 CPM 값으로 나타낸다. 동일한 방법으로 사람의 간에서 유래한 HepG2 세포주에 10 uM의 농도로 pyrano-1,2-naphthoquinone을 30 분간 처치한 후 AMPK kinase 활성분석을 수행하였다. Hep G2에서 AMPK의 활성이 증가하는 것을 확인하였다. 도 25의 결과에서 보는 바와 같이, pyrano-1,2-naphthoquinone 투여에 의하여 간과 생식선 지방조직 및 간세포에서 AMPK의 활성이 증가하는 것을 확인하였다.
실시예 13: NQO1 활성화제가 DIO 마우스에서 AMPK & ACC 인산화에 미치는 영향
도 26은 NQO1 활성화제의 항비만 효과를 알아보기 위해, 50 mg/kg의 농도로 DIO 마우스에 구강을 통해 매일 투여한 후, 간 및 생식선 지방 조직에서 에너지대사 및 지방합성에 중요한 역할을 하는 AMPK 와 ACC의 인산화에 미치는 영향을 검토하였다. 도 26에서 보는 바와 같이, NQO1 활성화제인 pyrano-1,2-naphthoquinone이 C57BL/6 마우스의 생식선 및 간 조직에서 AMPK와 ACC의 인산화에 영향을 주는 것을 western blot을 통해 확인하였다. 인산화된 AMPK는 에너지 관련 대사를 활성화시킬 것으로 판단되며, AMPK의 활성화에 의해 영향을 받는 ACC는 인산화가 됨으로 지방합성 활성이 억제되어 비만억제를 포함한 지질대사에 영향을 미칠 것으로 판단된다.
도 27는 부형제-처치된 대조군보다 βL를 50 mg/kg씩 경구 투여한 DIO 마우스의 간, EDL (extensor digitorum longus), 및 soleus 근육에서 AMPK 활성이 더 높게 나타나는 것을 보여 준다. βL의 경구 투여 효과는 투여 후 최대 2 시간에 이르고, 투여 후 대략 6 시간 동안 유지되었다(data not shown).
실시예14 : NQO1 활성화제가 DIO 마우스의 지질대사에 관여하는 유전자 발현에 미치는 영향
NQO1 활성화제의 항비만 효과를 알아보기 위해, 50 mg/kg의 농도로 DIO 마우스에 구강을 통해 매일 투여한 후, 간 및 생식선 지방 조직에서 지질대사에 관여하는 acetyl CoA carboxylase(ACC) 1, ACC2, fatty acid synthase(FAS), lipoprotein lipase(LPL), 및 stearoyl-CoA desaturase1(SCD1)의 mRNA 정도를 실시간 정량 PCR를 통해 확인하고자 하였다. 이들 효소들은 지질대사에 매우 중요하게 작용하는 효소인 바, ACC는 acetyl CoA에서 malonyl CoA의 형성을 촉매하고, FAS는 malonyl CoA에서 palmitate의 형성을 촉매하며, SCD1은 단일불포화지방(monounsaturated fat)의 형성을 촉매해서 에너지 저장체인 삼아실글리세롤 형성에 결정적 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 이들 효소들은 비만과 당뇨 및 지질대사관련 질환과 밀접하게 관련되어 있다. 도 28에서 보는 바와 같이, ACC1, ACC2, FAS, LPL 및 SCD1의 mRNA의 발현 정도가 대조군들에 비해 pyrano-1,2-naphthoquinone이 투여된 실험군에서 현저하게 감소하고, LPL의 mRNA의 정도는 대조군에 비해서 대략 2 배 정도 증가하였다. 이러한 효소 관련 유전자 발현의 증감을 통해, NQO1의 대사 질환 치료에 있어서의 표적 가능성을 추정할 수 있다.
실시예 15: NQO1 활성화제가 DIO 마우스의 포도당 대사에 관여하는 단백질의 유전자 발현에 미치는 영향
pyrano-1,2-naphthoquinone을 50 mg/kg의 농도로 DIO 마우스에 구강을 통해 매일 투여한 후, 간 및 생식선 지방 조직에서 hexokinase 2(HK2), glucose transporter(GLUT)2, GLUT4의 mRNA의 정도를 실시간 정량 PCR를 통해 확인하였다. GLUT는 간, 지방세포, 근육세포 등의 기관에서 혈중에 있는 포도당을 세포내로 유입해 소비시키는 단백질로서 잘 알려져 있고, HK2는 glucokinase의 한 효소로서 단백질을 인산화 시킴으로써 해당과정으로 진행되도록 하는 효소이다. 도 29의 결과에서 보는 바와 같이, HK2의 mRNA 정도는 대조군에 비해서 감소하였고, 두 종류의 포도당 수송에 관여하는 효소의 경우에는 GLUT2 및 GLUT4의 mRNA 발현이 유의적으로 증가하였다. GLUT2 및 GLUT4의 증가는 혈중내 포도당의 세포내 유입을 촉진함으로써, NQO1이 당뇨 치료 표적으로서의 가능성을 보여주는 결과이다.
실시예 16: NQO1 활성화제가 DIO 마우스의 미토콘드리아 생합성에 관여하는 단백질의 유전자 발현에 미치는 영향
pyrano-1,2-naphthoquinone을 50 mg/kg의 농도로 DIO 마우스에 구강을 통해 매일 투여한 후, 간 및 생식선 지방 조직에서 peroxisome proliferator-activated receptor coactivator alpha1(PGC1α), nuclear respiratory factor1(NRF1), mitochondria transcription factor(mtTFA), cytochrome c oxidase(COX)4, 7의 mRNA의 정도를 실시간 정량 PCR를 통해 확인하였다. 도 30에서 보여주는 단백질 유전자들은 세포내에서 에너지의 생합성에 관여하는 미토콘드리아의 생합성 조절에 관여하는 대표적인 효소들로서, 다양한 세포 생리조절에도 관여하는 것으로 알려져 있다. 이들 효소들의 mRNA의 양은 정도의 차이는 있지만, 모두 대조군에 비해서 pyrano-1,2-naphthoquinone을 투여한 군에서 증가하였다. 이러한 결과는, 여러 대사 질환들에 비정상적인 미토콘드리아의 활성이 보고되고 있는데, 이러한 현상을 개선함으로써, NQO1이 대사질환, 미토콘드리아 이상으로 인한 질환 및 에너지대사 관련 질환 치료 표적이 될 수 있다는 가능성을 보여 준다.
실시예 17: NQO1 활성화제가 DIO 마우스에서 에너지 대사에 관여하는 유전자 발현에 미치는 영향
pyrano-1,2-naphthoquinone을 50 mg/kg의 농도로 DIO 마우스에 구강을 통해 매일 투여한 후, 간 및 생식선 지방 조직에서 에너지 대사에 관여하는 유전자의 전사체의 정도를 실시간 정량 PCR를 이용해 측정하였다. 도 31 의 효소를 보면, 먼저 PPAR alpha와 gamma는 에너지 소비에 관련된 효소들의 전사조절에 관여하는 효소이고, AMPK는 AMP/ATP의 비율을 감지해 에너지의 항상성을 유지시키는 기능을 하고, AOX는 지질대사의 한 과정에 있는 acyl CoA를 산화시킴으로써 산화적 인산화가 활성화 하도록 촉매하는 효소이다. CPT1 역시 에너지 대사에 관여하는 효소로 long chain acyl CoA가 삼아실글리세롤로 가지 않고 미토콘드리아 내로의 유입을 가능케 하는 효소로서 잘 알려져 있다. pyrano-1,2-naphthoquinone을 투여한 군에서 peroxisome proliferator activated receptor(PPAR) alpha의 mRNA는 변하지 않고, gamma의 경우에 두 배 가까이 증가하였다. 또한, acyl CoA oxidase(AOX), AMP-activated protein kinase(AMPK) alpha1, 2, carnitine palmitoyltransferase 1의 mRNA도 정도의 차이는 있지만, pyrano-1,2-naphthoquinone 투여한 군에서 대조군에 비해 증가하였다. 이와 같이, 유전자의 증가는 NQO1이 에너지관련 대사질환의 단백질 표적으로의 가능성을 보여 줌을 알 수 있다.
실시예 18: NQO1 활성화제가 DIO 마우스에서 SIRT 관련 전사체 발현에 미치는 영향
pyrano-1,2-naphthoquinone을 50 mg/kg의 농도로 DIO 마우스에 구강을 통해 매일 투여한 후, 각각 7 일, 28 일 및 56 일이 되었을 때, 생식선 지방 조직에서 Sirtuin(SIRT) 유전자의 전사체의 정도를 실시간 정량 PCR를 이용해 측정하였다. SIRT 관련 전사체는 사람에서 7 가지 정도가 알려져 있는데, 특히 SIRT1은 장수에 관여하는 효소로서 잘 알려져 있으며, 이 효소는 칼로리를 제한적으로 섭취할 때 많이 증가한다고 보고되어 있다. 도 32에서 보는 바와 같이, SITR1, SIRT3, SIRT6는 유의성 있게 증가하고, SIRT2, SIRT5, SIRT7의 경우에는 대조군과 실험군 사이에 큰 차이를 보이지는 않는다.
실시예 19: NQO1 활성화제가 DIO 마우스에서 UCP1 과 UCP2 유전자의 전사체 발현에 미치는 영향
pyrano-1,2-naphthoquinone을 50 mg/kg의 농도로 DIO 마우스에 구강을 통해 매일 투여한 후, 간 및 생식선 조직에서 uncoupling protein 1 & 2(UCP1 & 2) 유전자의 전사체의 양을 실시간 정량 PCR를 이용해 측정하였다. UCP 1 & 2는 열의 발생을 통해 에너지를 소비시키는 효소로서, ROS의 생성을 동반하지 않고 에너지를 소비시키는 작용을 하며, 비만과도 밀접하게 관련되어 있다고 보고되어 있다. 도 33에서 보는 것과 같이, UCP1 & 2의 mRNA가 pyrano-1,2-naphthoquinone투여에 의해 유의성 있게 증가하였다. 이러한 결과는, 에너지 생성에서 부수적으로 생성되는 ROS에 의한 스트레스를 감소시킴으로써, NQO1이 안전한 대사질환 치료 표적으로의 가능성을 보여 준다.
실시예 20: 기관에 따른 NQO1 활성화제가 포도당과 지방 대사에 관여하는 유전자의 발현에 미치는 영향
간, 골격근 및 백색 지방 조직에서 βL이 포도당과 지방 대사와 관련된 유전자의 발현에 미치는 영향을 gene expression microarray analysis 및 mouse A42 Affymetrix GeneChip 을 사용하여 실험하였다.
도 34는 부형제-처리된 마우스 및 βL-처리된 마우스의 indicated gene에 대한 유전자 발현율을 RT-PCR로 정량한 도면으로서, 도 34-h 및 i는 βL -처치 마우스에서 미토콘드리아 생합성 및 에너지 대사와 관련된 몇몇 유전자의 발현이 증가되었음을 보여 준다. 예를 들어, 미토콘드리아 생합성에 관여하는 PGC-1α 및 NRF-1는 간과 근육에서 βL에 의해 크게 유도되었고(도 34-h, i), 미토콘드리아 유전자 COX4, COX7, AOX, UCP2 및 UCP3는 처치된 동물의 근육에서 강하게 upregulate되었다 (도 34-i).
glucose transporter(GLUT) 2 및 GLUT 4는 βL-처치 마우스의 근육에서 유도되었다 (도 34-i). 흥미롭게도, 칼로리 제한(caloric restriction)에 중요한 역할을 하는 Sirt1 및 Sirt3는 βL-처치 마우스에서 근육과 WAT에서 유도되었다 (도 34-i, j).
또한, 지방조직에서, lipolysis 유전자인 LPL와 ATGL, 지방산 산화 유전자인 PPARα와 SIRT1, 및 포도당 uptake 유전자인 Glut2와 Glut4는 vehicle-처치된 마우스보다 βL-처치 마우스에서 더욱 높다 (도 34-j).
실시예 21: NQO1 활성화제 투여에 의한 DIO 마우스에서 체중 및 식이의 경시적 변화
도 35은 pyrano-1,2-naphthoquinone을 50 mg/kg의 농도로 구강을 통해 매일 투여한 후, 56 일 동안 체중당 식이량의 변화와 체중 변화를 보여 준다. 처음 2 주 동안 식사량의 감소를 보였으나, 이후 대조군과 같은 식이량을 보였다. 이는 지방의 분해가 촉진되어 충분한 양의 에너지가 생성된 결과로 보여진다. 또한, 대조군과 비교하였을 때, 고지방 식이에도 불구하고 56일 동안 지속적인 체중감소를 보여 주었다. 이러한 체중 감소는 도 36의 두정과 횡근 부위(coronal and transverse sections)의 MRI 이미지에서 보여지는 것처럼 피하와 내장지방 조직의 감소 때문이다.
도 37은 C57BL/6 DIO 마우스에 56일 동안 pyrano-1,2-naphthoquinone 투여 후, 여러 장기의 무게 변화를 대조군과 비교한 도면이다. 도면에서 보는 바와 같이, pyrano-1,2-naphthoquinone 투여 후 피하, mesenteric, perirenal 및 gonadal 지방의 양이 처치 첫 4 주에 걸쳐 점진적으로 감소되었고, 그 후 남은 4 주 동안 안정화되었다 것을 확인하였다.
도 38 는 C57BL/6 DIO 마우스에 56 일 동안 pyrano-1,2-naphthoquinone 투여 후, 마우스를 개복하여 전체 모양과 간 조직의 지방 축적량을 알아보기 위해, oil red O 염색 및 전자현미경 소견을 보여 준다.
도 38-A에서 보는 바와 같이, pyrano-1,2-naphthoquinone을 56 일 동안 투여한 마우스에서 뚜렷한 내장지방과 체중의 감소를 보이고, 간 조직의 크기가 작아졌으며, 색깔도 적색으로 전환되었음을 알 수 있다. 지방간의 개선을 확인하기 위해, oil red O를 이용하여 축적된 지방을 염색한 결과, 대조군에 비해 90% 이상의 지방소실을 확인하였다 (도 38-B). 도 38-C는 간 조직의 전자현미경 소견으로, 대조군에 비해 지방 공포와 글리코겐 저장량이 현저하게 감소하였고, 미토콘드리아 모양이 정상으로 개선되었고 미토콘드리아 수가 유의하게 증가하였으며, endoplasmic reticulum의 모양도 개선되었음을 알 수 있다.
도 39에 나타난 바와 같이, 미처치 동물의 근육에서 미토콘드리아는 부풀고 꼬였으며 불충분했으나, 반면에 βL-처치 DIO 및 ob/ob 마우스에서 미토콘드리아의 모양이 정상이고 미토콘드리아 수가 증가하였다. 또한, 도 40에 나타난 바와 같이, βL-처치 DIO 마우스의 soleus 근육에서 타입 1 근섬유의 수가 증가하였다.
도 41은 C57BL/6 DIO 마우스에 pyrano-1,2-naphthoquinone을 50 mg/kg의 농도로 구강을 통해 매일 투여한 후, 56 일이 되었을 때 마우스를 개복하여 생식선 지방조직을 perilipin 염색을 시행한 결과를 보여 준다. 도면에서 보는 바와 같이, 지방세포의 크기가 현저히 감소하였음을 알 수 있다.
도 42는 C57BL/6 DIO 마우스에 pyrano-1,2-naphthoquinone을 50 mg/kg의 농도로 구강을 통해 매일 투여한 후, 3, 7, 14, 28, 56 일이 되었을 때 혈액을 채취하여, 혈중 TG, cholesterol, 유리 지방산, 포도당, 인슐린, TNFα, resistin과 leptin의 변화를 보여 준다. 도면에서 보는 바와 같이, 혈중 지방과 포도당 농도가 유의하게 개선되었을 뿐만 아니라, 인슐린과 leptin 저항증이 개선되었음을 알 수 있다. 또한, 인슐린 저항증을 야기시키는 resistin의 혈중 농도가 유의하게 개선되었다. 이 결과에 따르면, 지방간, 고지혈증, 제2형 당뇨병 및 인슐린 저항성에 탁월한 효과가 있을 것으로 기대된다.
도 43는 C57BL/6 DIO 마우스에 pyrano-1,2-naphthoquinone을 50 mg/kg의 농도로 구강을 통해 매일 투여한 후, 56일이 되었을 때 마우스의 갈색지방조직을 H&E 염색한 결과를 보여 준다. 도면에서 보는 바와 같이, 지방세포의 크기가 현저하게 감소하였음을 알 수 있다.
도 44은 C57BL/6 DIO 마우스에 pyrano-1,2-naphthoquinone을 50 mg/kg의 농도로 구강을 통해 매일 투여한 후, 56 일이 되었을 때 마우스의 갈색지방조직의 전자현미경 소견을 보여 준다. 도면에서 보는 바와 같이, 지방세포의 크기가 현저히 감소하였음을 알 수 있다.
실시예 22: NQO1 활성화제 투여에 의한 OLETF 랫트에서 인슐린 민감성 및 포도당 내성 시적 변화
도 45은 부형제-처치 OLETF 랫트 및 βL-처치 OLETF 랫트로 측정한 포도당 내성과 인슐린 민감성(Insulin sensitivity)을 나타낸 도면이다. 포도당 및 인슐린을 각각 i.p. 및 i.v. 주사하였고 혈당을 측정하였다. 그 결과, 도 45-a, c와 도 45-b, d에 나타난 바와 같이, βL-처치 후 3 일과 21 일에 측정한 결과 OLETF 랫트에서 포도당 내성 및 인슐린 민감성이 개선되었다.
실시예 23: 렙틴 ( leptin ) 수용체가 결손되어 있는 ob / ob 마우스에 NQO1 활성화제 투여에 따른 변화
도 46 및 47은 각각 렙틴(leptin) 수용체가 결손되어 있는ob/ob 마우스에 pyrano-1,2-naphthoquinone을 200 mg/kg의 농도로 구강을 통해 매일 투여하면서 56 일 동안 체중당 식이량의 변화와 체중 변화를 보여 준다. 체중당 식이량의 변화는 특이적으로 10 일 주위에 감소하였으나 이후 대조군 대비 70% 수준의 식이량을 보였다. 이는 leptin 수용체가 결손된 마우스에서도 pyrano-1,2-naphthoquinone이 효과적으로 체중을 감소시킴을 보여 준다.
56 일 후에 마우스를 개복하여 간 조직의 지방 축적량을 알아보기 위해 H&E 염색 및 전자현미경 소견을 관찰하였다. 도 48는 간 조직의 H&E 염색 소견으로 대조군에 비해 거의 모든 지방공포가 소실됨을 보여 준다. 이러한 결과에 따르면, leptin이 결손된 마우스에서도 지방간에 탁월한 효과가 있을 것으로 기대된다. 도 49는 간조직의 전자현미경 소견으로 대조군에 비해 지방 공포와 글리코겐 저장량이 현저하게 감소하였고, 미토콘드리아 모양이 정상으로 개선되었고 그 수가 유의하게 증가하였으며, endoplasmic reticulum의 모양도 개선되었음을 보여 준다. 도 50는 다리 근육조직의 전자현미경 소견으로 대조군의 기괴한 미토콘드리아 모양이 정상으로 개선되었고 그 수가 유의적으로 증가하였음을 보여 준다.
실시예 24: 자발적 이동과 활동능력( spontaneous locomotor activity )에 미치는 NQO1 활성화제의 영향
pyrano-1,2-naphthoquinone을 C57BL/6 DIO 마우스에 투여하고 3시간 후 Versa MAX Activity Monitors & Analyzer(AccuSan Instruments, Columbus, OH)를 사용해서 자발적 이동과 활동능력을 측정하였다. 각 움직임을 측정하는 모니터는 41 cm x 41 cm Plexiglas chamber(높이 30 cm)로 x축 및 y축에 2.5 cm 간격으로 적외선이 장착되어 총 앞뒤로 16 주사선과 좌우 16 주사선이 배치되어 있다. 자발적 이동(spontaneous locomotor)과 반복적인 행동(stereotypic)과 단순한 치장을 위한 발사용(grooming)을 구별하기 위한 기준으로, 두 개의 다른 주사선을 연속적으로 간섭하는 것을 기준으로 하여 측정하였다. pyrano-1,2-naphthoquinone 투여군, 부형제 투여군(vehicle) 및 대조군을 각각의 측정 장치에 넣고, 7 시간 동안 활동성과 움직임을 측정하였다. 마우스는 새로운 환경의 변화에 익숙해지도록 측정 두 시간 전에 측정 장치 안에 넣었다. 측정 결과는, 도 51에서 보는 바와 같이, 부형제 투여군과 대조군에는 거의 차이가 없으나, pyrano-1,2-naphthoquinone 투여군의 경우, 움직임과 활동성이 유의적으로 차이가 있음을 확인하였다.
실시예 25: 지구력 증강에 미치는 NQO1 활성화제의 영향
수영을 통해 지구력의 차이를 측정하고자 하였다. 지름 9.5 cm, 높이 25 cm의 원통형 통에 물을 넣은 후, pyrano-1,2-naphthoquinone을 C57BL/6 DIO 마우스에 투여하고, 3 시간 후 시료 투여군과 대조군 각각을 동시에 측정하고자 하는 원통형 통에 넣은 후, 각각의 지구력을 비교 측정하였다. 도 52의 결과에서 보는 바와 같이, pyrano-1,2-naphthoquinone 투여군이 대조군에 비해 1 회 투여에 의해서도 2 배 이상 수영을 지속할 수 있다는 것을 확인하였다.
실시예 26: 호흡지수( RQ )에 미치는 NQO1 활성화제의 영향
호흡지수(RQ) 측정을 통해, pyrano-1,2-naphthoquinone이 지방대사에 미치는 영향을 검토하고자 하였다. 산소 소비와 이산화탄소 생성을 Oxyscan open-circuit indirect calorimeter(AccuScan Instruments, Columbus, OH)을 사용하여 측정하였다. 장치는 밀봉된 아크릴장치로(21 x 21 x 21 cm)로 이루어져 있으며, 각 측정장치는 1500 ml/min의 속도로 신선한 공기가 주입된 후 산소와 이산화탄소가 검출기를 통과해 빠져나가도록 이루어져 있다. 이들 가스의 농도를 ml/kg 체중/min으로 기록되도록 하였다. RQ는 V CO2/V O2 식에 의해 계산되었다. pyrano-1,2-naphthoquinone투여군, 부형제 투여군(vehicle) 및 대조군을 각각의 측정 장치에 넣고, 7 시간 동안 RQ를 측정하였다. 마우스는 새로운 환경의 변화에 익숙해지도록 측정 두 시간 전에 측정 장치 안에 넣었다. 측정 결과는, 도 53에서 보는 바와 같이, 부형제 투여군 및 대조군에 비하여 pyrano-1,2-naphthoquinone투여군의 경우 RQ값이 유의적으로 차이가 있음을 확인하였다.
간접적 열량 측정 결과 낮시간과 밤시간 산소 소모량이 증가하였고 (도 54), 에너지 소비는 βL-처치 마우스가 대조군 마우스보다 높았으며 (도 55), 마우스를 주변 온도 4℃에서 12 시간 동안 노출하여 평균 체온을 측정한 결과 βL-처치 마우스가 추위에 보다 잘 저항하였다 (도 56).
실시예 27: NAD + 투여에 의한 체중 감소 효과
NAD(P)+/NAD(P)H의 생체내에서 비율을 높일 수 있는 방법 중의 하나인 NAD(P)+를 외부에서 임으로 공급하여, 생체내의 NAD(P)+/NAD(P)H 비율의 변화에 따른 영향을 측정하고자 하였다. 렙틴(leptin) 수용체가 결손되어 있는 ob/ob 마우스에 NAD+를 100 mg/kg의 농도로 복강을 통해 매일 투여하였으며, 대조군은 생리식염수를 동일하게 복강으로 매일 투여하였다. 30 일 동안의 체중당 식이량의 변화(A)와 체중 변화(B)를 측정하였다.
도 57에서 보는 바와 같이, 체중당 식이량의 변화는 특이적으로 10 일 주위에 감소하였으나, 이후 대조군과 비슷한 식이량을 보였다. 이는 비슷한 식이량에도 불구하고, 지방의 분해가 촉진되어 충분한 양의 에너지가 생성된 결과로 보여진다. 또한, 대조군과 비교하였을 때, 유전적으로 렙틴이 결손된 비만형 마우스 임에도 불구하고, 30 일 동안 지속적으로 체중 감소를 유지하도록 유도함을 알 수 있다. 이러한 결과는, NAD(P)+의 외부투여에 의해 NAD(P)+/NAD(P)H 비율을 높임으로써, 효과적으로 체중을 감소시킬 수 있음을 보여 준다.
실시예 28: NQO1 활성화제인 dimethylfumarate ( DMF ) 투여에 의한 체중 감소 효과
도 58은 렙틴(leptin) 수용체가 결손되어 있는ob/ob 마우스에 NQO1 활성화제인 dimethylfumarate를 200 mg/kg의 농도로 구강을 통해 매일 투여하였으며, 대조군은 생리식염수를 동일하게 복강으로 매일 투여하였다. 30일 동안의 체중 변화 (A)와 식이량의 변화 (B)를 측정하였다. 식이량의 변화는 대조군 대비 60 ~ 70% 수준에서 식이량이 조절되는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 leptin 수용체가 결손된 마우스에서 NQO1의 활성화제인 dimethylfumarate가 효과적으로 체중을 감소시킴을 보여 준다.
실시예 29: 다양한 NQO1 활성 후보 화합물들의 NAD (P)H 감소와 ob / ob 마우스의 체중 감소 여부 실험
하기 표 1에서와 보는 바와 같은 다양한 NQO1 활성 후보 화합물들을 대상으로, 상기 실험방법(10: NADH recycling assay)을 바탕으로 NAD(P)H 감소 여부를 측정하였고, 상기 실시예 23의 실험방법을 바탕으로 ob/ob 마우스의 4 주 후의 체중을 측정하였다.
그러한 측정 결과가 하기 표 1에 개시되어 있는 바, NAD(P)H의 감소 정도는, NQO1에 대한 활성화제가 존재하지 않는 조건에서의 NAD(P)H의 양을 100으로 하였을 때, NQO1 활성 후보 화합물의 투여시 측정된 NAD(P)H의 양을 상대적으로 표현하여 나타내었다. 또한, 체중 감소의 정도는, NQO1활성 후보 물질을 투여하지 않은 ob/ob 마우스(대조군)의 4 주 후의 체중을 기준으로, NQO1 활성 후보 화합물을 투여한 ob/ob 마우스의 체중을 백분율로 나타내었다.
[표 1]
상기 표 1에서 보는 바와 같이, NAD(P)H의 감소시 체중이 유의적으로 감소함을 알 수 있다. 특히, 4-substituted-1,2-naphthoquinone인 2-Methyl-2,3-dihydro-naphtho[1,2-b]furan-4,5-dione, 2,3,3-Trimethyl-2,3-dihydro-naphtho[1,2-b]furan-4,5-dione, 2,2-Dimethyl-2,3-dihydro-naphtho[1,2-b]furan-4,5-dione, 2,2,3-Trimethyl-2,3-dihydro-naphtho[1,2-b]furan-4,5-dione, 2,2-Dimethyl-3,4-dihydro-2H-benzo[h]chromene-5,6-dione, 10-Isopropyl-7a-methyl-7a,8,9,11a-tetrahydro-7H-benzo[c]xanthene-5,6-dione 등의 투여시 현저한 NAD(P)H 감소와 그에 따른 체중 감소가 나타남을 확인할 수 있다.
이상의 설명과 같이, 본 발명에 따르면, NQO1 등과 같은 oxidoreductase를 활성화시켜 생체 조건(in vivo) 또는 시험관 조건(in vitro)에서의 NAD(P)+/NAD(P)H 비율을 높여 비만, 당뇨, 대사증후군, 퇴행성 질환, 미토콘드리아 이상 질환 등의 치료할 수 있고, 또한 이동능력(locomotor), 활동능력(activity), 지구력(endurance) 등을 증가시킬 수 있다. 또한, NQO1 단백질 및 유전자를 표적으로 하여NAD(P)+/NAD(P)H 비율을 높일 수 있는 약제로서의 화합물을 검색하고 개발할 수 있다.
본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 상기 내용을 바탕으로 본 발명의 범주 내에서 다양한 응용 및 변형을 행하는 것이 가능할 것이다.
도 1은 NQO1에 의한 NADH의 세포 내 농도변화를 나타낸 도면이다;
도 2는 NQO1 효소활성 효소 유무에 따른 NQO1 활성을 나타낸 도면이다;
도 3은 NQO1 활성의 유무에 따른 NAD(P)H 형광의 세포 내 농도변화를 나타낸 도면이다;
도 4는 NQO1 유전자의 유무에 따른 NAD(P)H 형광의 HEK 세포 내 농도변화를 나타낸 도면이다;
도 5는 Dicoumarol의 처리에 따른 NAD(P)H 형광의 세포 내 농도변화를 나타낸 도면이다;
도 6은 Lean 및 DIO 마우스 조직에서의 NQO1 양 및 활성을 측정한 도면이다;
도 7은 NQO1 활성화제에 의한 세포내에서 ATP 농도의 변화를 나타낸 도면이다;
도 8은 NQO1에 의한 세포내 에너지 농도의 경시적 변화를 나타낸 도면이다;
도 9는 생체내에서 NQO1 활성화제에 의한 AMP/ATP, NAD+/NADH 및 NADP+/NADPH 비율의 변화를 나타낸 도면이다;
도 10 및 도 11은 NQO1 활성화제를 Lean 마우스와 DIO 마우스에 각각 투여하였을 때의 시간 경과에 따른 AMP/ATP 및 NAD+/NADH 비율의 변화를 나타낸 도면이다;
도 12는 NQO1이 C57BL/6 마우스의 지방산화(β-oxidation)에 미치는 영향을 나타낸 도면이다;
도 13은 NQO1 활성화제가 DIO 마우스에서 ACC, CPT, 및 HAD의 활성, Malonyl-CoA 및 14C plamitoyl-CoA의 산화에 미치는 영향을 나타낸 도면들이다;
도 14는 NQO1에 의한 세포 내에서의 AMPK 및 ACC의 인산화 조절에 미치는 영향을 나타낸 도면이다;
도 15는 DIO 마우스의 간, WAT, EDL 및 soleus 에서 AMPKα 및 ACC의 인산화를 측정한 도면이다;
도 16은 NQO1의 유무에 의한 AMPK의 인산화에 미치는 영향을 나타낸 도면이다;
도 17은 NQO1 활성화제에 의한 AMPKα 및 ACC의 인산화에 미치는 영향을 나타낸 도면이다;
도 18은 NQO1 활성화제가 AMPK 및 ACC의 활성에 미치는 영향을 나타낸 도면이다;
도 19는 NQO1에 의한 세포내 칼슘농도의 변화에 미치는 영향을 나타낸 도면이다;
도 20은 TMRE 형광 및 confocal microscopy를 이용하여 실시간 미토콘드리아 막전위 변화를 측정한 도면이다;
도 21은 세포질 ([Ca2 +]c) 및 미토콘드리아 ([Ca2 +]m)에서 Ca2 + 농도를 각각 나타내는 Flou4 및 Rhod-2-AM 형광을 측정한 도면이다;
도 22는 미토콘드리아 산소 소비를 Clark-type 산소 전극을 이용하여 모니터링한 도면이다;
도 23은 NQO1과 AMPK α, β, γ 간의 결합 여부를 확인하기 위한 도면이다;
도 24는 NQO1 활성화제가 endothelial nitric oxide synthase(eNOS)의 인산화에 미치는 영향을 나타낸 도면이다;
도 25는 NQO1 활성화제가 C57BL/6 마우스에서 AMPK 활성화에 미치는 영향을 나타낸 도면이다;
도 26은 NQO1 활성화제가 C57BL/6 마우스에서 AMPK & ACC 인산화에 미치는 영향을 나타낸 도면이다;
도 27은 기관에 따라 NQO1 활성화제가 DIO 마우스에서 AMPK 활성에 미치는 영향을 나타낸 도면이다;
도 28은 NQO1 활성화제가 C57BL/6 마우스의 지질대사에 관여하는 단백질의 전사체 발현에 미치는 영향을 나타낸 도면이다;
도 29는 NQO1 활성화제가 C57BL/6 마우스의 포도당 대사에 관여하는 단백질의 전사체 발현에 미치는 영향을 나타낸 도면이다;
도 30은 NQO1 활성화제가 C57BL/6 마우스의 미토콘드리아 생합성에 관여하는 단백질의 전사체 발현에 미치는 영향을 나타낸 도면이다;
도 31은 NQO1 활성화제가 C57BL/6 마우스에서 에너지 대사에 관여하는 단백질의 전사체 발현에 미치는 영향을 나타낸 도면이다;
도 32는 NQO1 활성화제가 C57BL/6 마우스에서 SIRT 관련 단백질의 전사체 발현에 미치는 영향을 나타낸 도면이다;
도 33은 NQO1 활성화제가 C57BL/6 마우스에서 UCP1과 UCP2 유전자의 전사체 발현에 미치는 영향을 나타낸 도면이다;
도 34는 기관에 따른 NQO1 활성화제가 indicated gene에 대한 유전자 발현율에 미치는 영향을 나타낸 도면이다;
도 35는 NQO1 활성화제 투여에 의한 C57BL/6 DIO 마우스에서 체중 및 식이의 경시적 변화를 나타낸 도면이다;
도 36은 미처치된 Lean (n=5), 미처치된 DIO (n=10), 부형제-처치된 DIO (n=10) 및 βL-처치 DIO (n=10) 마우스 내장 지방(visceral fat)의 MRI 사진이다 (8 주 동안 처치 후 개복하였다);
도 37은 DIO 마우스에 NQO1 활성화제를 투여한 후 여러 장기의 무게 변화를 대조군과 비교한 도면이다;
도 38은 C57BL/6 DIO 마우스에 NQO1 활성화제를 투여한 후 마우스를 개복하여 전체 모양과 간 조직의 지방 축적량을 알아보기 위해 oil red O 염색 및 전자현미경 소견을 나타낸 도면이다;
도 39는 부형제-처치된 DIO 및 βL-처치 DIO 마우스에서 soleus 근육의 EM 분석 및 전자현미경 소견을 나타낸 도면이다;
도 40은 부형제-처치된 DIO 및 βL-처치 DIO 마우스에서 Type 1 soleus 근섬유의 전자현미경 소견을 나타낸 도면이다;
도 41은 C57BL/6 DIO 마우스에 NQO1 활성화제를 투여한 후 생식선 지방조직의 지방세포 크기를 비교한 도면이다;
도 42는 NQO1 활성화제가 대사 파라미터(TG, total cholesterol, 유리지방산, 포도당, 인슐린, TNFα, adiponectin, resistin 및 leptin 등)에 미치는 영향을 나타낸 도면이다;
도 43은 C57BL/6 DIO 마우스에 NQO1 활성화제를 투여한 후 갈색지방조직의 H&E 염색한 결과를 비교한 도면이다;
도 44는 C57BL/6 DIO 마우스에 NQO1 활성화제를 투여한 후 갈색지방조직의 전자현미경 소견을 보여준 도면이다:
도 45는 부형제 또는 βL로 처치된 OLETF 마우스에서 포도당 내성 및 인슐린 민감성을 나타낸 도면이다;
도 46 및 도 47은 ob/ob 마우스에 부형제 또는 βL 처치 후 체중 당 식이량 변화 및 체중 변화를 보여준 도면이다;
도 48 내지 도 50는 ob/ob 마우스에 부형제 또는 βL 처치 후 지방 축적량 및 조직의 전자현미경 소견을 보여준 도면이다; 도 48은 간 부위들을 hematoxylin 및 eosin로 염색한 사진이고 (Scale bar, 100 ㎛), 도 49는 간 부위의 투과전자현미경분석 소견(Scale bar, 5 ㎛) 이며, 도 50은 EDL 근육의 투과전자현미경분석 소견(Scale bar, 20 ㎛)이다;
도 51은 C57BL/6 DIO 마우스에 NQO1 활성화제를 투여한 후 자발적이동(spontaneous locomotor)에 미치는 영향을 나타낸 결과이다;
도 52는 C57BL/6 DIO 마우스에 NQO1 활성화제를 투여한 후 지구력 증강에 미치는 영향을 나타낸 결과이다;
도 53은 C57BL/6 DIO 마우스에 NQO1 활성화제를 투여한 후 호흡지수(RQ)에 미치는 영향을 나타낸 결과이다;
도 54 및 도 55는 부형제 또는 βL로 처치한 동물에 간접적 열량 측정으로 VO2 및 에너지 소비량을 측정한 도면이다;
도 56은 부형제 또는 βL로 처치한 동물의 평균 체온을 측정한 도면이다;
도 57은 렙틴(leptin) 수용체가 결손되어 있는 ob/ob 마우스에 NAD+를 투여한 후 체중 변화 및 식이량 변화를 나타낸 도면이다;
도 58은 렙틴(leptin) 수용체가 결손되어 있는 ob/ob 마우스에Dimethylfumarate를 투여한 후 체중 변화 및 식이량 변화를 나타낸 도면이다.
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<220> <223> mUCP1 (PCR primer: forward) <400> 14 gggacctaca atgcttacag agt 23 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mUCP2 (PCR primer: forward) <400> 15 agcctacaga tgtggtaaag gtc 23 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mtTFA (PCR primer: forward) <400> 16 ataccttcga ttttccacag aac 23 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mPPAR gamma (PCR primer: forward) <400> 17 atcttaactg ccggatccac 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mPPAR alpha (PCR primer: forward) <400> 18 tgcagacctc aaatctctgg 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mGLUT4 (PCR primer: forward) <400> 19 cagcgagtga ctggaacact 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mNRF1 (PCR primer: forward) <400> 20 tgatggagag gtggaacaaa 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mCOX4i1 (PCR primer: forward) <400> 21 gactacccct tgcctgatgt 20 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<400> 29 acctcctgca tccctaacag 20 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATGL (PCR primer: forward) <400> 30 cgccttgctg agaatcacca t 21 <210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leptin (PCR primer: forward) <400> 31 ggtgtgaaag aacctgagct gagg 24 <210> 32 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adiponectin (PCR primer: forward) <400> 32 tctcctgttc ctcttaatcc tgcc 24 <210> 33 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mPGC1-alpha (PCR primer: Reverse) <400> 33 cgagagcgca tcctttgg 18 <210> 34 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mAMPK alpha1 (PCR primer: Reverse) <400> 34 acgcaaataa taggggttta caa 23 <210> 35 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mAMPk alpha2(PCR primer: Reverse) <400> 35 ccaggtaaag ctgtaagctc att 23 <210> 36 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mGLUT2(PCR primer: Reverse) <400> 36 gtcctgaaat tagcccacaa tac 23 <210> 37 <211> 23 <212> 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Reverse) <400> 44 ctcctttaca gtgtccatcc tct 23 <210> 45 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mAOX (PCR primer: Reverse) <400> 45 gggtcacatc cttaaagtca aag 23 <210> 46 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mUCP1 (PCR primer: Reverse) <400> 46 gtacaatcca ctgtctgtct gga 23 <210> 47 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mUCP2 (PCR primer: Reverse) <400> 47 gctcataggt gacaaacatc act 23 <210> 48 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mtTFA (PCR primer: Reverse) <400> 48 tcatttcatt gtcgtaacga atc 23 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mPPAR gamma (PCR primer: Reverse) <400> 49 tggtgatttg tccgttgtct 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mPPAR alpha (PCR primer: Reverse) <400> 50 tagccttggc aaattctgtg 20 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mGLUT4 (PCR primer: Reverse) <400> 51 cagcatagcc cttttccttc 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA 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20 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mSIRT6 (PCR primer: Reverse) <400> 60 gtctgcacat cacctcatcc 20 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mSIRT7 (PCR primer: Reverse) <400> 61 agaggcgggg atatttcttt 20 <210> 62 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATGL (PCR primer: Reverse) <400> 62 agtgagtggc tggtgaaagg t 21 <210> 63 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leptin (PCR primer: Reverse) <400> 63 cagtggatgc taatgtgccc tg 22 <210> 64 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Adiponectin (PCR primer: Reverse) <400> 64 catctccttt ctctcccttc tctcc 25

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  22. NQO1을 통해 생체 조건(in vivo) 또는 시험관 조건(in vitro)에서 NAD(P)+/NAD(P)H 비율을 높이는 화합물을 확인하는 방법으로서,
    화합물 후보군을 NQO1에 접촉시키는 단계, 및 그 후 NQO1의 양 또는 활성을 모니터링하는 단계를 포함하고,
    상기 물질은 NQO1에 대한 활성화제가 존재하지 않는 조건에서의 NAD(P)H의 양을 기준으로 NAD(P)H의 양을 20% 이상 감소시키며,
    상기 NAD(P)H의 감소에 의해, 비만, 비만 합병증, 당뇨, 당뇨 합병증, 대사증후군, 퇴행성 질환 및 미토콘드리아 기능이상 질환으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 질환을 치료 또는 예방하는 것을 특징으로 하는 NAD(P)+/NAD(P)H 비율을 높이는 화합물을 확인하는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 방법은 NQO1에 검색하고자 하는 화합물 및 NAD(P)H를 사용하여 일정 시간 반응시킨 후, 생성된 NAD(P)+ 또는 잔량 NAD(P)H를 정량화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, 상기 생성된 NAD(P)+의 생성량을 하이드라이드(H-) 수용체로 사용된 dichlorophenolindophenol(DCPIP)의 환원에 의한 흡수파장의 변화로 발색이 유도되어 흡광도의 변화를 측정하여 NAD(P)+의 생성량을 정량화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 23 항에 있어서, 상기 NAD(P)H의 잔량을 테트라졸리움염의 발색에 의한 흡광도의 변화를 측정하여 NAD(P)H의 잔량을 정량화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 22 항에 있어서, 상기 방법은 NQO1에 검색하고자 하는 화합물을 사용하여 일정 시간 반응시킨 후, NAD(P)H의 감소량을 정량화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 26 항에 있어서, 상기 방법은 NQO1에 검색하고자 하는 화합물을 사용하여 일정 시간 반응시킨 후, 세포내 ATP 농도의 감소량 또는 AMP 농도의 증가량을 정량화하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 22 항에 있어서, 상기 모니터링은 세포내 칼슘 농도의 증가량을 관찰하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 22 항에 있어서, 상기 모니터링은 AMPK의 인산화 및 활성화 정도를 관찰하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 22 항에 있어서, 상기 모니터링은 Acetyl CoA Carboxylase (ACC)의 인산화의 증가량 또는 ACC의 활성의 감소량을 관찰하는 것을 특징으로 하는 방법.
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