CN110403940A - 琥珀酰化相关制剂在调控线粒体ocr中的应用 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了琥珀酰化相关制剂在调控线粒体OCR中的应用。本申请通过棕榈酸处理人甲状腺上皮细胞后线粒体耗氧量明显降低(p均<0.05)，而棕榈酸与去琥珀酰化抑制剂联合处理人甲状腺上皮细胞后线粒体耗氧量的变化则相反(p均<0.05)。进一步检测琥珀酰化IDH2(异柠檬酸脱氢酶2)的结果表明，上述结果是通过调控IDH2的琥珀酰化实现的，即IDH2的琥珀酰化降低，线粒体OCR降低，去琥珀酰化抑制剂参与提高或恢复IDH2的琥珀酰化，从而使线粒体OCR提高或恢复。本申请为甲状腺功能低下症的治疗提供了一个新的药物靶点。

Description

琥珀酰化相关制剂在调控线粒体OCR中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，涉及琥珀酰化相关制剂在调控线粒体OCR中的应用，具体涉及去琥珀酰化抑制剂在改善线粒体OCR紊乱中的用途。
背景技术
甲状腺激素是由甲状腺合成和分泌的，在人的正常发育、分化和代谢过程中起着至关重要的作用。甲状腺激素的紊乱可导致多种甲状腺疾病。
甲状腺功能减退症是内分泌系统的一种常见而严重的疾病。甲状腺素缺乏症是指血清甲状腺素总量(TT4)过低，常通过下丘脑-垂体-甲状腺轴的负反馈导致促甲状腺素(TSH)浓度升高。原发性甲状腺功能低下是由甲状腺自身功能障碍引起的，是甲状腺功能低下的主要原因。成人甲状腺功能减退症的发病往往很隐秘，表现为一系列非特异性症状。然而，严重未经治疗的甲状腺功能减退症可能导致预后不良，如心力衰竭，精神病，甚至昏迷。毫无疑问，甲状腺功能减退给经济带来了巨大的负担，大大降低了患者的生活质量。因此，有必要研究其发病机制，探索新的治疗策略。
蛋白质翻译后修饰(PTMs)是指蛋白质生物合成后的共价和酶修饰，是蛋白质多样性的关键机制，对多种物种的生物学功能具有重要影响。PTMs通过调节蛋白亚基的裂解，将修饰后的基团添加到一个或多个氨基酸中，或降解整个蛋白质来调节蛋白质的性能，从而确定其活性状态、细胞定位和与其它分子的相互作用。
赖氨酸作为最常见的翻译后修饰氨基酸残基，对蛋白质结构的形成和蛋白质功能的调控起着至关重要的作用。赖氨酸残基可以有多种蛋白质后修饰，如甲基化、乙酰化、生物素化、泛素化、泛素样修饰、丙酰化、丁酰化等。这些蛋白质赖氨酸残基蛋白后修饰，在细胞生理和病理过程中发挥重要作用，从而影响细胞生物学和发病机制的几乎所有方面。赖氨酸琥珀酰化已被确认为一种新的蛋白质后修饰形式，并参与多种细胞功能。
最近的研究表明，一些蛋白质后修饰与甲状腺疾病密切相关。CinziaPuppina等人通过免疫组化发现，甲状腺滤泡腺瘤、甲状腺乳头状癌、滤泡甲状腺癌和未分化癌中H3组蛋白(H3K9-K14ac)9-14位乙酰化赖氨酸水平明显高于正常组织。Andrea Henze等报道Cys10的氧化修饰影响T3与甲状腺素运载蛋白的结合，为精确研究甲状腺激素的有效性提供了一个可能的机制。同时赖氨酸琥珀酰化在甲状腺疾病中的作用尚不清楚，仍需进一步研究。
发明内容
针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种去琥珀酰化抑制剂在改善线粒体OCR紊乱中的用途。
一方面，本发明提供了去琥珀酰化抑制剂在制备用于改善受试者线粒体OCR(氧消耗速率)紊乱的产品中的用途；
所述产品具体可为一种药物组合物、试剂或试剂盒。
在上述用途中，所述改善线粒体OCR紊乱为提高受试者线粒体OCR。
在上述用途中，所述受试者线粒体OCR紊乱为高脂导致的线粒体OCR紊乱；
进一步的，所述高脂为高脂肪酸，所述脂肪酸优选为棕榈酸。
在上述用途中，所述去琥珀酰化抑制剂可为琥珀酸脱氢酶抑制剂、和/或Sirtuin蛋白家族抑制剂，优选，琥珀酸脱氢酶抑制剂，
进一步的，所述琥珀酸脱氢酶抑制剂为烟酰胺、和/或曲古菌素A；优选，烟酰胺。
另一方面，本发明还提供了一种提高离体细胞中线粒体OCR的方法，包括利用去琥珀酰化抑制剂对离体细胞进行处理的步骤，
优选的，所述离体细胞为经脂肪酸处理的离体细胞，
更优选的，所述脂肪酸包括棕榈酸，
更优选的，所述离体细胞为来源于甲状腺的离体细胞，更优选的，所述离体细胞为甲状腺上皮细胞。
在上述方法中，所述去琥珀酰化抑制剂可为琥珀酸脱氢酶抑制剂、和/或Sirtuin蛋白家族抑制剂，优选，琥珀酸脱氢酶抑制剂，
进一步的，所述琥珀酸脱氢酶抑制剂选自烟酰胺、和/或曲古菌素A；优选，烟酰胺。
本发明的有益效果如下：
本发明对高脂饮食诱导的低甲状腺素血症大鼠甲状腺中蛋白质赖氨酸琥珀酰化的含量进行了定量分析。总共对129个差异表达蛋白进行了定量。表达下调的蛋白富集于甲状腺激素合成和甲状腺激素信号通路中，主要定位于线粒体。此外，104个蛋白上的172个赖氨酸琥珀酰化位点发生明显变化。琥珀酰化水平降低的蛋白参与了多种代谢途径，主要定位于线粒体。最后，我们测量正常人甲状腺上皮细胞线粒体耗氧量，进一步验证蛋白质琥珀酰化的作用。棕榈酸处理人甲状腺上皮细胞后线粒体耗氧量明显降低(p均<0.05)，而棕榈酸与去琥珀酰化抑制剂联合处理人甲状腺上皮细胞后线粒体耗氧量的变化则相反(p均<0.05)。进一步检测琥珀酰化IDH2(异柠檬酸脱氢酶2)的结果表明，上述结果是通过调控IDH2的琥珀酰化实现的，即IDH2的琥珀酰化降低，线粒体OCR降低，去琥珀酰化抑制剂参与提高或恢复IDH2的琥珀酰化，从而使线粒体OCR提高或恢复。即本申请为甲状腺功能低下症的治疗提供了一个新的药物靶点。
附图说明
图1为基于GO二级注释分类差异表达蛋白的分布-生物过程分类结果。
图2为基于GO二级注释分类差异表达蛋白的分布-细胞成分类别结果。
图3为基于GO二级注释分类差异表达蛋白的分布-分子功能分类结果。
图4为基于wolfpsort软件的亚细胞结构的差异表达蛋白预测结果。
图5为差异表达蛋白的富集分析-基于GO功能注释分析中表达水平上升蛋白分布。
图6为差异表达蛋白的富集分析-基于GO功能注释分析中表达水平下降蛋白分布。
图7为差异表达蛋白的富集分析-基于KEGG功能注释分析中表达水平上升蛋白分布。
图8为差异表达蛋白的富集分析-基于KEGG功能注释分析中表达水平下降蛋白分布。
图9为差异表达蛋白的富集分析-基于结构域注释分析中表达水平上升蛋白分布。
图10为差异表达蛋白的富集分析-基于结构域注释分析中表达水平下降蛋白分布。
图11为基于GO功能注释分类琥珀酰化水平变化的蛋白分布-生物过程分类结果。
图12为基于GO功能注释分类琥珀酰化水平变化的蛋白分布-细胞成分分类结果。
图13为基于GO功能注释分类琥珀酰化水平变化的蛋白分布-分子功能分类结果。
图14为基于wolfpsort软件的亚细胞结构的琥珀酰化水平变化蛋白预测结果。
图15为琥珀酰化水平差异表达蛋白的富集分析-基于GO功能注释分析中琥珀酰化水平表达水平上升的蛋白分布。
图16为琥珀酰化水平差异表达蛋白的富集分析-基于GO功能注释分析中琥珀酰化水平表达水平下降蛋白分布。
图17为琥珀酰化水平差异表达蛋白的富集分析-基于KEGG功能注释分析中琥珀酰化水平下降蛋白分布。
图18为琥珀酰化水平差异表达蛋白的富集分析-基于蛋白结构域注释分析中琥珀酰化水平下降蛋白分布。
图19为正常人甲状腺上皮细胞的线粒体OCR检测结果，其中，左图为加入Oligo(ATP合酶抑制剂)、FCCP(解耦联剂)和ROT/AA(抗霉素A和寡霉素)后的OCR变化结果，右图中从左至右的四组结果分别为由左图计算得出的测定线粒体OCR的基础呼吸(Ⅰ)、ATP产量(Ⅱ)、最大呼吸(Ⅲ)和呼吸能力储备值(Ⅳ)，ns代表p>0.05，*代表p<0.05，**代表p<0.01。
图20为免疫沉淀反应和Western Blotting检测经不同处理的人正常甲状腺上皮细胞中琥珀酰化IDH2的结果(a)和总蛋白提取及免疫沉淀效率验证结果(b)。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中统计方法：
定量数据以均数±SEM表示，采用GraphPad Prism 6.0(La Jolla,CA,USA)和SPSSversion 22.0(Chicago,IL,USA)处理。采用单因素方差分析(One-way ANOVA)和图基事后检验法(Turkey’s post hoc test)进行多重比较。高脂饮食组甲状腺标本与相应普通饮食组甲状腺标本比较，p值<0.05被认为是显著的。
下述实施例实验设计和流程：
我们比较了高脂饮食(HFD)组和普通饮食(CD)组大鼠甲状腺组织的蛋白表达谱和琥珀酰化水平。实验过程包括以下四个关键步骤：(1)如前所述建立甲减大鼠模型并采集样本；(2)蛋白提取、胰蛋白酶消化、高效液相色谱(HPLC)、赖氨酸琥珀酰化肽的抗体亲和富集；(3)液相色谱-质谱联用分析(LC-MS/MS分析)；(4)生物信息学分析。进行了三次技术重复，用于蛋白质组和琥珀酰化组的全面分析。
以下实施例将详细描述该流程和相应的结果。
实施例1、动物模型-高脂饮食诱导的大鼠甲状腺功能障碍模型的构建
雄性SD大鼠26只(北京维通利华实验动物技术有限公司)，体重190-210g，置于恒温恒湿条件下，进行12h:12h光暗循环。将大鼠随机平均分为两组：CD对照组(n＝13，进行普通饮食)和HFD研究组(n＝13，进行高脂饮食)，饮食中脂肪酸的详细组成见表1，每周称重并喂食24周，建立高脂饮食诱导的大鼠甲状腺功能障碍模型。我们之前的研究发现，过量摄入膳食脂肪会引起大鼠明显的甲状腺功能障碍和甲状腺功能低下，详见文献“S.S.Shao,Y.F.Zhao,Y.F.Song,C.Xu,J.M.Yang,S.M.Xuan,H.L.Yan,C.X.Yu,M.Zhao,J.Xu,J.J.Zhao,Acta Pharmacol Sin 2014,35,1411”和文献“X.Zhang,W.Chen,S.Shao,G.Xu,Y.Song,C.Xu,L.Gao,C.Hu,J.Zhao,Mol Nutr Food Res 2018,62,e1700599”。
在喂食的第24周，所有的大鼠在宰杀前禁食12小时，然后采集每只大鼠甲状腺组织-80℃保存备用。
表1、普通饮食和高脂饮食中脂肪酸的详细组成
实施例2、动物模型的甲状腺组织中定量蛋白质组的一般特征
取实施例1保存的CD对照组和HFD研究组的大鼠甲状腺组织，分别进行蛋白提取、胰蛋白酶消化，获得肽段，然后将肽段采用高效液相色谱(HPLC)分馏和高分辨率液相色谱-质谱联用分析(LC-MS/MS)进行了定量的全蛋白质组分析。
结果共鉴定出3869个蛋白，其中2982个蛋白在两组大鼠间发生定量变化。以差异倍数值(HFD研究组相对于CD对照组)变化超过1.5倍作为显著上调、小于1/1.5作为显著下调的变化标准，两组大鼠共定量表达差异蛋白129个，其中上调蛋白69个，下调蛋白60个。然后，通过生物信息学分析对这些差异表达的蛋白进行注释。
对HFD和CD甲状腺组织进行了基于GO的分类。在生物过程分类中(图1)，前四位受影响的过程分别是细胞过程(18％)、代谢过程(15％)、单生物过程(14％)和生物调控(11％)，这意味着这些生物过程中涉及的各种蛋白可能参与了HFD诱导的甲状腺功能障碍的整个过程。在细胞成分类别中(图2)，细胞(25％)和细胞器(24％)相关蛋白是主要的差异表达蛋白，而其他细胞成分相关蛋白相对较少。在分子功能分类中(图3)，结合相关蛋白(49％)是最主要的差异表达蛋白。
利用Wolfpsort软件进行亚细胞定位预测结果(图4)表明，这些差异表达蛋白主要定位于细胞质(28％)和细胞外(22％)，其次是细胞核(16％)、线粒体(15％)、质膜(8％)、细胞质中的核(5％)和细胞骨架(2％)。
上述蛋白提取和胰酶酶解的实验方法如下：
动物组织样品从-80℃取出，称取适量组织样品至液氮预冷的研钵中，加液氮充分研磨至粉末。各组样品分别加入4倍体积裂解缓冲液(8M尿素，1％蛋白酶抑制剂，3μM TSA，50mM NAM和2mM EDTA)，超声裂解。4℃，12000g离心10min，去除细胞碎片，上清液转移至新的离心管，利用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定。
蛋白溶液中加入二硫苏糖醇使其终浓度为5mM，56℃还原30min。之后加入碘代乙酰胺使其终浓度为11mM，室温避光孵育15min。最后将样品的尿素浓度稀释至低于2M。以1:50的质量比例(胰酶：蛋白)加入胰酶，37℃酶解过夜。再以1:100的质量比例(胰酶：蛋白)加入胰酶，继续酶解4h，获得肽段。
上述HPLC分馏的实验方法如下：
肽段用高pH反向HPLC分级，色谱柱为Agilent 300Extend C18(5μm粒径，4.6mm内径，250mm长)。操作如下：肽段分级梯度为8％-32％乙腈、pH 9，60min时间分离60个组分，随后肽段合并为4个组分，合并后的组分经真空冷冻干燥后进行后续操作。
上述液相色谱-质谱联用分析的实验方法如下：
肽段用液相色谱流动相A相(0.1％(v/v)甲酸水溶液)溶解后使用EASY-nLC 1000超高效液相系统进行分离。流动相A为含0.1％甲酸和2％乙腈的水溶液；流动相B为含0.1％甲酸和90％乙腈的水溶液。液相梯度设置：0-38min，7％～25％B；38-52min，25％～40％B；52-56min，40％～80％B；56-60min，80％B，流速维持在700nL/min。
肽段经由超高效液相系统分离后被注入NSI离子源中进行电离然后进QExactiveTM Plus质谱进行分析。离子源电压设置为2.1kV，肽段母离子及其二级碎片都使用高分辨的Orbitrap进行检测和分析。一级质谱扫描范围设置为350-1800m/z，扫描分辨率设置为70,000；Orbitrap扫描分辨率设置为17,500。数据采集模式使用数据依赖型扫描(DDA)程序，即在一级扫描后选择信号强度最高的前15肽段母离子依次进入HCD碰撞池使用28％的碎裂能量进行碎裂，同样依次进行二级质谱分析。为了提高质谱的有效利用率，自动增益控制(AGC)设置为5E4，信号阈值设置为10000ions/s，最大注入时间设置为200ms，串联质谱扫描的动态排除时间设置为30秒以避免母离子的重复扫描。
上述生物信息学分析方法中蛋白注释方法具体如下：
1)Gene Ontology分析
Gene Ontology分析，或GO分析，是一种能够将基因与基因产物(如蛋白质)的各项信息有机的联系在一起进而提供统计学信息的生物信息学分析方法。
Gene Ontology(GO)对蛋白质组学层面的注释来源于UniProt-GOA数据库(www.http://www.ebi.ac.uk/GOA/)。首先，系统会将蛋白ID转换为UniProt ID，之后用UniProt ID去匹配GO ID，并依据GO ID从UniProt-GOA数据库中调取相应的信息。如果UniProt-GOA数据库中没有所查询的蛋白信息，那么会使用一款基于蛋白序列的算法软件，InterProScan，去预测该蛋白的GO功能。之后按照细胞成分、分子功能或生物过程对此蛋白进行分类。
2)蛋白结构域注释
蛋白的结构域是指蛋白质中在序列上具有保守性，且一般情况下可以独立行使功能的特定蛋白区域，是分子功能的结构元件，一般由25至500个氨基酸构成。这些区域在空间上相对紧凑、结构上相对稳定、能够独立的被折叠为功能性的结构。一个蛋白质可能拥有多个结构域，相对的，一个结构域也可能存在于多种蛋白质中。
数据中，使用基于蛋白序列算法的软件InterProScan以及相应InterPro结构域数据库对鉴定到的蛋白质进行蛋白结构域注释。InterPro结构域数据库(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)是一个整合了包括蛋白家族分类、蛋白结构域分类以及蛋白功能位点分类等信息的免费网络数据库。其核心是以数据库中结构域的模式或特征为标准，通过对所提交蛋白质的序列进行评估，利用相应算法来确定蛋白质所匹配到的结构域。
3)KEGG通路注释
KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)能够将当前已知的蛋白相互作用网络信息，比如通路及相关复合体(“Pathway”数据库)、基因及基因产物(“Gene”数据库)、生物内复合物及相关反应(“compound and reaction”数据库)等信息进行整合。KEGG的通路主要包括：代谢、遗传信息处理、环境信息相关进程、细胞生理进程、药物研究等。
使用KEGG通路数据库对蛋白通路进行注释：首先，使用KEGG在线服务工具KAAS对提交的蛋白进行注释，之后通过KEGG mapper将注释过的蛋白匹配入数据库中相应的通路中。
4)亚细胞定位
真核生物组织细胞中的蛋白，依据与其结合的膜结构的差异，被详尽的定位到细胞内各种元件上。真核细胞主要的亚细胞定位包括：胞外、细胞质、细胞核、线粒体、高尔基体、内质网、过氧化物酶体、液泡、细胞骨架、核质、核基质以及核糖体等。
基于此，使用预测亚细胞定位的软件wolfpsort对所提交的蛋白进行亚细胞定位注释。
实施例3、动物模型的甲状腺组织中差异表达蛋白的富集分析
根据实施例2中鉴定到全体蛋白的注释以及差异表达蛋白的筛选，我们进行了GO、KEGG、蛋白结构域等功能注释类型的富集分析，目的是检测差异表达的蛋白是否在某些功能类型有显著性的富集趋势。对于富集检验(此处运用Fisher's exact test即费希尔精确检验)得到的p值进行负对数(-log10)转换，即得到转换后的值越大则此功能类型的富集越显著。
通过GO功能注释分析来分类差异表达蛋白的生物学过程和分子功能，如图5和图6所示，在细胞成分中，定位于核糖体和核糖体亚基的蛋白表达增加，而定位于线粒体和ATP酶复合物的蛋白表达明显减少，在分子功能中，核糖体组成蛋白和结构分子活性蛋白上调，ATP酶活性下调，在生物过程中，上调蛋白在几类代谢过程(包括肽、细胞酰胺、大分子代谢等)，生物合成过程(肽、酰胺、大分子、有机物生物合成等)和翻译过程中均有显著富集。相比之下，一些下调蛋白在氮循环和硫代谢等一系列代谢过程中富集。
我们还进行了KEGG通路富集分析，以进一步研究这些差异表达蛋白的功能。与GO分析结果一致，结果表明核糖体途径是上调蛋白最显著的富集途径(图7)。同时观察到下调的蛋白在甲状腺激素信号通路和甲状腺激素合成中富集，提示这些通路可能在低甲状腺素血症的发生中发挥重要作用(图8)。
在蛋白结构域富集分析中，上调蛋白在1型甲状腺球蛋白中富集，下调蛋白在线粒体载体域和ATP酶中富集(图9和图10)。
上述蛋白质功能富集分析方法如下：
1)GO富集分析
蛋白的GO注释被分为3个大类：生物过程、细胞成分、分子功能。费歇尔精确双端检验方法(Fisher's exact test)被用于检验差异表达蛋白在以鉴定到的蛋白为背景。GO富集检验P-value值小于0.05被认为是显著的。
2)通路富集分析
Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)数据库被用于通路的富集分析。费歇尔精确双端检验方法被用于检验差异表达蛋白在以鉴定到的蛋白为背景。通路富集检验P-value值小于0.05被认为是显著的。最后根据KEGG网站通路层级分类方法将这些通路进行分类。
3)蛋白结构域富集分析
InterPro(对蛋白序列的家族分类、结构域和特殊位点的预测等功能分析提供资源)数据库用于分析差异表达蛋白的功能结构域的富集情况。费歇尔精确双端检验方法被用于检验差异表达蛋白在以鉴定到的蛋白为背景。结构域单元富集检验P-value值小于0.05被认为是显著的。
4)基于蛋白功能富集的聚类分析
基于不同差异倍数的差异蛋白功能富集的聚类分析用于研究其在特定功能(GO，KEGG通路，蛋白结构域等)上存在的潜在联系和差异。我们首先收集所用蛋白分组富集到的功能分类信息和对应的富集P-value值，然后筛选出至少在一个蛋白分组中为显著富集(P-value<0.05)的功能分类。筛选得到的P-value数据矩阵首先经过以-log10的对数变换，然后将变换后的数据矩阵对各功能分类运用Z变换。最后将Z变换后得到的数据集使用分层聚类(欧式距离，平均连接聚类)方法做单边聚类分析。
实施例4、动物模型的甲状腺组织中蛋白琥珀酰化定量的一般特征
采用基于抗体的亲和富集法对经实施例2中消化后获得的肽段进行赖氨酸琥珀酰体定量分析，然后进行LC-MS/MS分析。
结果共鉴定了250个蛋白中685个琥珀酰化位点，其中对229个蛋白中621个琥珀酰化位点进行了定量。以差异倍数值(HFD研究组相对于CD对照组)变化超过1.5倍作为显著上调、小于1/1.5作为显著下调的变化标准，104个蛋白中172个琥珀酰化位点发生显著变化(5个蛋白中的7个琥珀酰化位点表现为明显上调，99个蛋白中的165个琥珀酰化位点表现为明显下调)。
采用基于GO注释的分类方法，阐明HFD诱导的甲状腺功能低下甲状腺组织中赖氨酸琥珀酸酰化的生物学特性：在生物过程中(图11)，琥珀酰化蛋白主要存在于代谢过程(21％)、细胞过程(20％)和单细胞过程(20％)中；在细胞成分类别中(图12)，细胞(27％)、细胞器(25％)和膜(13％)相关蛋白是琥珀酰化水平改变的主要蛋白；分子功能分析(图13)表明琥珀酰化蛋白差异表达主要为催化活性(46％)和结合相关蛋白(42％)。
我们还进行了基于wolfpsort的亚细胞预测分析，以研究这些差异表达的琥珀酰化蛋白的性质。图14结果表明，这些差异表达琥珀酰化蛋白主要定位于线粒体(65％)、细胞质(11％)和细胞核(8％)。
本实施例中涉及的LC-MS/MS和生物信息学分析方法与实施例2相同。
实施例5、动物模型的甲状腺组织中差异变化琥珀酰化蛋白的富集分析
根据实施例4中鉴定到的差异表达的琥珀酰化蛋白，按照实施例2的方法进行GO、KEGG、蛋白结构域等功能注释类型的富集分析，目的是检测差异表达的琥珀酰化蛋白是否在某些功能类型有显著性的富集趋势。对于富集检验(此处运用Fisher's exact test即费希尔精确检验)得到的p值进行负对数(-log10)转换，即得到转换后的值越大则此功能类型的富集越显著。
结果：如图15和图16所示，在细胞成分中，琥珀酰化水平下调的蛋白主要为三羧酸循环酶复合物；分子功能方面，琥珀酰化水平下调的蛋白主要为连接酶活性蛋白；在生物过程方面，琥珀酰化水平上调的蛋白主要富集于对脂质调节过程相关的蛋白，而琥珀酰化水平下调的蛋白主要富集于柠檬酸代谢、细胞呼吸、三羧酸循环、氧化柠檬酸代谢、有机化合物氧化产能和有氧呼吸过程相关的蛋白。
KEGG通路富集分析表明，柠檬酸循环是琥珀酰化水平下调的蛋白最富集的通路。此外，丙酸代谢和丙酮酸代谢相关通路也显著富集(图17)。
蛋白结构域分析显示，前两个显著富集的结构域是生物素/脂酰结合域和单杂交基序域(图18)。
本实施例中涉及的富集分析方法与实施例3相同。
实施例6、人正常甲状腺上皮细胞的线粒体氧消耗速率(OCR)测定
为了研究脂肪酸对线粒体功能的影响，我们在正常人甲状腺上皮细胞经不同处理后测量了代表线粒体功能水平的OCR，具体使用XF96分析仪(美国海马生物科技公司)进行OCR的测量，实验方法如下：
1)将每孔约7×103个人正常甲状腺上皮细胞Nthy-ori3-1植入海马XF96细胞培养孔板，培养24小时；再将孔板细胞随机分四组：NC组(空白对照，不加棕榈酸PA和烟酰胺NAM)、NAM组、PA组和PA+NAM组培养24小时，其中，NAM组给予烟酰胺(NAM)10mM，PA组给予棕榈酸(PA)0.2mM，PA+NAM组给予棕榈酸(PA)0.2mM和烟酰胺(NAM)10mM，本步骤使用的培养基为添加10％胎牛血清(FBS；Excell Bio，上海，中国)、青霉素(100IU/ml)，链霉素(100IU/ml)和L-谷氨酰胺(2mM)的RPMI-1640(Gibco,Thermo Fisher Scientific,Inc.，Waltham,MA,USA)，培养条件为37℃，含5％CO2的潮湿的环境，除另有说明外，所有试剂均购自Sigma-Aldrich。
2)将步骤1)的孔板细胞置于低缓冲、无碳酸氢盐的试验培养基(含2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和25mM葡萄糖的XF基培养基)中37℃无CO2培养箱中孵育1小时。
3)将步骤2)处理后的细胞在XFe 96细胞外通量分析仪(海马生物科学)中测定线粒体OCR(按该分析仪使用说明操作)，结果用每个孔的蛋白浓度进行校正。
结果：图19的左图中，Oligo是ATP合酶抑制剂，加入此药后减少的耗氧代表的是机体用于ATP合成的耗氧量，间接显示此时细胞的ATP产量；FCCP为线粒体氧化磷酸化解偶联剂，可破坏线粒体内膜，使线粒体膜去极化，形成质子漏，从而导致氧耗增加而不影响细胞磷酸化，使ATP生成显著减少；ROT/AA为最后加入是抗霉素A和寡霉素，二者是呼吸链抑制剂，完全阻止线粒体耗氧。
根据图19左图结果得出右图结果，当人甲状腺上皮细胞在加入PA的培养基中培养时，代表线粒体OCR的基础呼吸(Ⅰ)、ATP产量(Ⅱ)、最大呼吸(Ⅲ)均显著低于(均p<0.05)NC组；而当人甲状腺上皮细胞同时使用PA和去琥珀酰化抑制剂(NAM—为琥珀酸脱氢酶抑制剂)处理时，线粒体OCR上述指标的变化发生逆转(均p<0.05)，即去琥珀酰化抑制剂可以缓解人甲状腺上皮细胞中脂肪酸对线粒体OCR水平的影响；具体而言，脂肪酸会降低线粒体的OCR水平，加入去琥珀酰化抑制剂可以使线粒体的OCR水平恢复到正常或高于正常水平。
实施例7、人正常甲状腺上皮细胞中琥珀酰化IDH2的免疫沉淀反应
根据实施例5的结论，对柠檬酸循环中蛋白IDH2(异柠檬酸脱氢酶2)的琥珀酰化水平变化进行测定，从实施例6步骤1)中取培养24小时的四组细胞(NC、PA、NAM、PA+NAM)，同时分别按照如下方法进行免疫沉淀反应和Western检测琥珀酰化IDH2：
1、用预冷的PBS洗涤细胞三次，最后一次吸净PBS；
2、加入预冷的RIPA Buffer 1ml；刮下细胞并收集悬液至1.5ml EP管中，孵育20min，期间液氮速冻与37℃水浴反复4-6次以充分裂解细胞；
3、4℃、12000g离心15min，转移上清至新EP管，BCA法测定蛋白浓度；
4、吸取500μg蛋白/管，用PBS补足500μl，共6管：B、IgG、NC、NAM、PA、PA+NAM，其中B、IgG用NC组蛋白。
5、加一抗到500μg总蛋白中：B管不加任何一抗，IgG管加入抗IDH2抗体的同种属的IgG 0.2μl，NC、NAM、PA、PA+NAM管加入抗IDH2的特异性抗体5ul；
6、封口膜封口，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜；
7、加入40ul Protein A琼脂糖珠/管，4℃缓慢摇动3h；
8、1000g瞬离30s，吸取部分上清单独留存以验证实验效率，收集下层琼脂糖珠-抗原抗体复合物，贴壁加入预冷的PBS 1ml上下颠倒洗4次，1000g，30s离心，最后一遍尽量洗净PBS；
9、各管加入24μl PBS+10μl 4×上样缓冲液，剧烈震荡，100℃变性10min；
10、13000rpm常温离心10min，吸取上清做western blot；
11、Western Blotting转膜结束后PVDF膜封闭抗原，孵育稀释好的抗琥珀酰化赖氨酸一抗，4℃水平摇床孵育过夜；
12、回收一抗，洗膜3次后孵育二抗(琥珀酰化泛抗体)，再次洗膜3次后显影。
结果：如图20a所示，经PA处理的甲状腺上皮细胞中琥珀酰化IDH2含量明显低于NC、NAM、PA+NAM组，且经PA和NAM处理的甲状腺上皮细胞中琥珀酰化IDH2与NC组和NAM组结果相同；同时四组细胞中IDH2蛋白本身的表达基本相同；对总蛋白及免疫沉淀后的上清分别用抗IDH2的特异性抗体和内参GAPDH抗体检测，结果如图20b所示，实验所提取的总蛋白中有目的蛋白IDH2，且免疫沉淀后上清中不含有目的蛋白IDH2，即目的蛋白已完全被沉淀。
以上结果表明，脂肪酸的作用是降低甲状腺上皮细胞中IDH2的琥珀酰化，而NAM的作用是可以恢复或提高IDH2的琥珀酰化。
实施例6和实施例7的结果表明，实施例6的结果“去琥珀酰化抑制剂恢复或提高人甲状腺上皮细胞中脂肪酸对线粒体OCR的降低作用”是通过调控IDH2的琥珀酰化实现的，IDH2的琥珀酰化降低，线粒体OCR降低，去琥珀酰化抑制剂参与提高或恢复IDH2的琥珀酰化，从而使线粒体OCR提高或恢复。
本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。

Claims (10)

1.去琥珀酰化抑制剂在制备用于改善受试者线粒体OCR(氧消耗速率)紊乱的产品中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述改善线粒体OCR紊乱为提高受试者线粒体OCR。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述受试者线粒体OCR紊乱为高脂导致的线粒体OCR紊乱。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述高脂为脂肪酸，所述脂肪酸优选为棕榈酸。
5.根据权利要求1-4中任一所述的用途，其特征在于：所述去琥珀酰化抑制剂为琥珀酸脱氢酶抑制剂、和/或Sirtuin蛋白家族抑制剂，优选，琥珀酸脱氢酶抑制剂。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述琥珀酸脱氢酶抑制剂为烟酰胺、和/或曲古菌素A；优选，烟酰胺。
7.根据权利要求1-6中任一所述的用途，其特征在于：所述线粒体为甲状腺组织的线粒体。
8.一种提高离体细胞中线粒体OCR水平的方法，其特征在于：包括利用去琥珀酰化抑制剂对离体细胞进行处理的步骤，
优选的，所述离体细胞为经脂肪酸处理的离体细胞，
更优选的，所述脂肪酸包括棕榈酸，
更优选的，所述离体细胞为来源于甲状腺的离体细胞，更优选的，所述离体细胞为甲状腺上皮细胞。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述去琥珀酰化抑制剂为琥珀酸脱氢酶抑制剂、和/或Sirtuin蛋白家族抑制剂，优选，琥珀酸脱氢酶抑制剂。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述琥珀酸脱氢酶抑制剂为烟酰胺、和/或曲古菌素A；优选，烟酰胺。
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