CN1623554A - 一种以c－k为有效成分的抗癌辅助药物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种以人参皂苷C－K为有效成分，用于增强抗癌药物疗效，降低化疗药物毒性，预防和治疗放化疗引起的白细胞降低及组织损伤、增强机体免疫功能的药物，及含有C－K和药学上可接受的载体或辅料组成的药物组合物，及其在增强抗癌药物疗效，降低化疗药物毒性，预防和治疗放化疗引起的白细胞降低及组织损伤、增强机体免疫功能方面的用途。

Description

一种以C-K为有效成分的抗癌辅助药物及其应用

技术领域

本发明涉及一种用于增强抗癌药物疗效，降低化疗药物毒性，预防和治疗放化疗引起的白细胞降低及组织损伤，以及增强机体免疫功能的抗癌辅助药物，及其在增强抗癌药物疗效，降低化疗药物毒性，预防和治疗放化疗引起的白细胞降低及组织损伤，以及增强机体免疫功能的药物中的应用。

背景技术

癌症一直是人类健康的大敌，人类的科技水平发展到今天也不能完全征服癌症，反而其发病率呈逐年升高的趋势，并有年轻化的趋向。在某些国家癌症的发病率和死亡率已超过其它疾病上升到第一位，在我国每年至少有150万人死于癌症。癌症给患者的身心都造成了难以修复和治愈的创伤。癌症的药物治疗近年来已经取得了显著的进展，但目前临床应用成功的抗癌药物大多为细胞毒性药物，在抑制肿瘤细胞增殖的同时，机体正常细胞的增殖也被抑制，如造血干细胞等，从而导致骨髓造血机能受损，白细胞水平低下，往往是抑制了肿瘤的增殖，但也破坏了患者的免疫力，最终很难取得良好的治疗效果，也限制了化疗药物的临床应用。因此，开发高效低毒、靶向性强的抗肿瘤药物成为抗肿瘤药物开发的热点。另外一种思路就是利用其它辅助治疗药物，在降低化疗药物毒性的同时，起到增效的作用，也成为抗肿瘤药开发中重要的方向之一。

中医药在我国的应用具有几千年的历史，在肿瘤治疗及肿瘤辅助治疗中积累了丰富的经验。在肿瘤的治疗中，中医多以扶正治疗为主，可明显改善患者生存质量，增强免疫功能，减少手术、放疗化疗副反应，预防肿瘤的复发以及远处转移，提高患者的远期疗效和生存率。

人参属中药上品。具有大补元气，复脉固脱，补脾益肺，生津、安神等功能。研究发现，人参在肿瘤的临床治疗中，除具有一定的抑瘤作用外，主要具有减轻化疗药物的骨髓毒性，明显改善化疗药物导致白细胞水平低下状态，提高机体免疫功能，改善生活质量及临床症状，增加体重，增加食欲、缓解疲劳倦怠感的自觉症状等功效(林丽珠等，人参注射液在中晚期恶性肿瘤化疗中的协同作用——附66例临床分析，新中医，1997，02；郭恒岳等，人参养荣汤对恶性肿瘤放疗致白细胞减少及自觉症状的有效性，日本医学介绍，1996(5)；杨娜等，人参的抗肿瘤及对放化疗远期效应的抑制作用，齐鲁肿瘤杂志，1995(4))。

人参皂苷是人参的主要活性成分之一，许多研究表明，人参皂苷具有抑制肿瘤细胞增殖，抗转移等功效，金永日等人也发现人参皂苷20-(S)-Rh2具有明显的减毒增效作用，用于预防和治疗放化疗引起的白细胞降低及增强机体免疫功能(公号号：1415304)。

传统中药中的人参均为口服，而多种人参皂苷口服后以原型入血的比率很低。日本多项研究表明，多种人参皂苷口服后均在肠道菌代谢下产生人参皂苷C-K(结构式见图1)，然后再吸收入血，所以在血中检测到的人参皂苷的原型量很低，但可以检到C-K(ODANI T et al，Studies on absorption，distribution，excretion and metabolism of ginseng saponins.III.the absorption，distribution，excretion of ginsenoside Rb1 in the rats.ChemPharm Bull 1983，31(3)：1059-1066；AKAO T et al，Metabolic activation of crude drugcomponents by intestinal bacterial enzymes.J Med Pharm Soc.WAKEN-YAKU 1992，9：1-13.(in Japanese)；KARIKURA M et al，Studies on absorption，distribution，excretion andmetabolism of ginseng saponins.V.the decomposition products of ginsenoside Rb2 inthe large intestine of rats.Chem Pharm Bull 1990，38(9)：2859-2861；KARIKURA M etal，Studies on absorption，distribution，excretion and metabolism of ginseng saponins.VII.comparison of the decomposition modes of ginsenoside-Rb1 and-Rb2 in thedigestive tract of rats.Chem Pharm Bull 1991，39(9)：2357-2361)。这表明C-K可能是传统中药人参在肿瘤治疗中起作用的重要成分之一。研究表明C-K具有抑制肿瘤的肺转移，诱导HL-60细胞凋亡等作用(董淑华，人参皂苷的体内代谢反应研究，人参研究，2003，15(1))。但对于C-K对肿瘤患者免疫机能以及对临床放化疗中的减毒增效作用还未见相关研究。我们对C-K的抗癌活性尤其是其对荷瘤之后的免疫增强作用及对放化疗治疗的减毒增效作用进行了深入研究，结果发现，C-K具有一定的抑瘤活性，同时它也能明显提高荷瘤小鼠的免疫力，降低放化疗的毒副作用，增强放化疗的疗效，从而完成本发明。

图1C-K的结构(其中R为-OH，R₁为-glu，R₂为-CH₃)

发明内容

本发明的目的是提供一种以人参皂苷C-K为有效成分的能够增强现有抗肿瘤药物疗效，降低其毒性，预防和治疗放化疗引起的白细胞降低及增强肿瘤患者免疫功能，预防和治疗放疗导致的皮肤及内脏溃疡性损伤的抗癌辅助药物。

本发明还提供了由人参皂苷C-K和其它抗癌药物和药学上可接的载体或辅料组成的药物组合物。

本发明还提供了由人参皂苷C-K在制备具有增强抗癌药物疗效，降低抗癌药物毒性，预防和治疗放化疗引起的白细胞降低及增强机体免疫功能，预防和治疗放疗导致的皮肤及内脏溃疡性损伤的抗癌辅助药物药物组合物中的用途。

目前还未发现天然存在的人参皂苷C-K，只能通过不同的手段从天然的人参皂苷降解得到，我们按照公开专利(公开号：1417345)方法制备纯化了人参皂苷C-K，并分别以药剂学常规方法和我公司的专利(申请号：03100025.8)中方法将其制备成了注射用人参皂苷C-K冻干粉针，按制备例2方法制备了人参皂苷C-K软胶囊，并用其进行了人参皂苷C-K的抑瘤、对化疗和放疗的减毒增效作用、对患瘤机体免疫功能的作用等的研究。结果表明人参皂苷C-K口服和注射给药均能增强抗癌药物疗效，降低化疗药物毒性，降低抗癌药物毒性，预防和治疗放化疗引起的白细胞降低及组织损伤，增强机体免疫功能。

根据试验例结果，我们推荐人参皂苷C-K作为注射用药时的临床剂量为0.01~10mg/kg体重，较优剂量为0.05~5mg/kg体重，最佳为0.5~2mg/kg体重。作为口服用药时的临床剂量优选0.01~20mg/kg体重，较优为0.05~10mg/kg体重，最佳为0.5~5mg/kg体重。

下面结合制备例和实验例对我们的发明进行更详细的说明。

具体实施方式

制备例1：注射用人参皂苷C-K冻干粉针的制备

称取1.00g人参皂苷-c-k，加入20ml乙醇使皂苷完全融解，再加入40ml甘油混合均匀。将0.20g盐酸丁卡因、0.02g的EDTA-2Na加入到40ml注射用水中，使辅料完全溶解。并将上述水溶液加入到药物溶液中，混合均匀。以0.01mol/L的氢氧化钠和稀盐酸调节pH值为5.5±1.0。加入0.1％的针用活性炭85度保温15分钟，G3垂熔玻璃漏斗过滤，0.22μm的微孔滤膜过滤。滤液分装于7ml西林瓶中，每支装量2ml。分装好的注射剂半压塞，于冻干机冻干。冻干后压塞，压铝盖制成冻干粉针剂，20mg/支。

制备例2：人参皂苷C-K软胶囊的制备

人参皂苷C-K软胶囊的制备方法、步骤如下：

称取明胶100g，甘油30g和水130g。取明胶加入适量的水使其吸水膨胀。另将甘油及余下的水置煮胶锅中加热至70~80℃，混合均匀，加入膨胀的明胶搅拌，熔融。保温1~2小时，静置，使泡沫上浮，刮去上浮的泡沫，以洗净白布过滤，加入0.0075mgr Fe₂O₃粉末，混匀，保温待用。配成的胶液粘度一般为2.8~3.2度。

称取人参皂苷10g溶于90g聚乙二醇中，加热使其充分溶解，放至室温。

压制软胶囊：将已制好的明胶甘油和当归油装入自动旋转轧囊机中，温度控制在40~50℃，压制出每囊含100mg药液油的软胶囊。

试验例1：人参皂苷C-K对小鼠移植瘤生长的抑制作用

试验材料

1.药物及试剂：注射用人参皂苷C-K冻干粉针，山东省天然药物工程技术研究中心制剂室提供，批号：20020425，20mg/支；人参皂苷C-K软胶囊，山东省天然药物工程技术研究中心制剂室提供，批号：20020525，10mg/粒。环磷酰胺，上海华联制药有限公司生产，批号：000205。DMEM培养基，GIBCO公司。胰蛋白酶、MTT、ConA、IL-2，SIGMA公司生产。大鼠抗小鼠CD3、CD4、CD8单抗，FITC兔抗大鼠单抗，购自武汉生物制品研究所。

2.动物：昆明种小鼠，5~8周龄，体重18~22g，山东省天然药物工程技术研究中心毒理室提供，合格证号：鲁动质字20021132。雌雄兼用，每批实验采用同一性别。C57BL/6纯系小鼠，5~8周龄，体重18~22g，中国医学科学院实验动物研究所提供，合格证号：SCXK11-00-0006。

3.细胞株：小鼠H22肝癌和Lewis肺癌，购自中国医学科学院北京药物研究所。

试验方法：

药物配制：注射用C-K用生理盐水溶成相应浓度，。

H22肝癌接种：取于昆明鼠腹腔内接种传代七天的上述荷瘤小鼠，消毒腹部皮肤后，抽取腹水，加入三倍体积的注射用生理盐水稀释，消毒昆明鼠腋下皮肤，每只小鼠于腋下注射瘤细胞悬液0.2ml。

Lewis肺癌接种：取已接种10天的Lewis肺癌、生长状态良好的小鼠，脱颈处死，用酒精消毒皮肤后，剥取肿瘤组织，加入五倍量的生理盐水后用组织匀浆器研磨成匀浆，100目不锈钢网过滤。消毒每只小鼠左侧腋下皮肤，接种瘤液0.2ml。

接瘤后第二天随机分为如下5组并给药：

溶剂对照组：给予含等量辅料的生理盐水溶液

阳性药对照：给予环磷酰胺20mg/kg

药物小剂量组(i.v.)：给予人参皂苷C-K 0.5mg/kg

药物中剂量组(i.v.)：给予人参皂苷C-K 5mg/kg

药物高剂量组(i.v.)：给予人参皂苷C-K 50mg/kg

灌胃给药组：给予人参皂苷C-K 50mg/kg

连续给药10天，停药后24小时处死小鼠，剥取瘤组织称重。计算抑瘤率。

实验结果：结果表明，人参皂苷C-K静脉注射与灌胃给药均对小鼠H22肝癌和Lewis生长呈剂量依赖性抑制作用，给药组与模型组具有明显差别。结果见表1-2。

表1.人参皂苷C-K对小鼠H22肝癌生长的抑制作用

                    剂量     体重            瘤重            抑瘤率

组别         鼠数

                    (mg/kg)  (g)             (g)             (％)

模型组       10     ——          29.8±2.17      1.96±0.71

环磷酰胺组   10     20       25.8±1.68^**   1.05±0.31^**   46.7

C-K(i.v.)    10     50       27.4±2.33^#*   1.17±0.45^**   40.3

C-K(i.v.)    10     5        29.4±2.41^##   1.30±0.39^*    33.9

C-K(i.v.)    10     0.5      30.1±2.64^##   1.42±0.29^*    27.4

C-K(p.o.)    10     50       29.6±2.87^##   1.41±0.64^*    28.1

与模型组比较：^**，P＜0.01；^*，P＜0.05。与环磷酰胺组比较：^##，P＜0.01。

表2 人参皂苷C-K对小鼠Lewis肺癌生长的抑制作用

                    剂量     体重            瘤重            抑瘤率

组别          鼠数

                    (mg/kg)  (g)             (g)             (％)

模型组        10    ——          25.6±2.37      1.53±0.26

环磷酰胺组    10    20       22.3±2.48^**   0.72±0.19^**   52.9

C-K(i.v.)     10    50       24.4±2.47^#*   0.98±0.30^**   36.1

C-K(i.v.)     10    5        26.0±2.34^##   1.02±0.29^**   33.1

C-K(i.v.)     10    0.5      25.5±2.28^##   1.21±0.30^*    20.9

C-K(p.o.)     10    50       25.8±2.53^##   1.18±0.47^*    22.9

与模型组比较：^**，P＜0.01；^*，P＜0.05。与环磷酰胺组比较：^##，P＜0.01。

试验例2.人参皂苷C-K对化疗药物的增效试验

试验材料：同试验例1

试验方法：用小鼠肝癌H22和Lewis肺癌建立小鼠体内移植性肿瘤模型，按如下分组及给药：

溶剂对照组：给予等量辅料的生理盐水溶液

阳性药小剂量对照组：给予环磷酰胺5mg/kg

阳性药小剂量+药物小剂量组(i.v.)：给予环磷酰胺5+人参皂苷C-K 0.5mg/kg

阳性药小剂量+药物大剂量组(i.v.)：给予环磷酰胺5+人参皂苷C-K 50mg/kg

阳性药小剂量+灌胃药物组(p.o.)：给予环磷酰胺5+人参皂苷C-K 50mg/kg

阳性药大剂量对照组：给予环磷酰胺10mg/kg

阳性药大剂量+药物小剂量组(i.v.)：给予环磷酰胺10+人参皂苷C-K 0.5mg/kg

阳性药大剂量+药物大剂量组(i.v.)：给予环磷酰胺10+人参皂苷C-K 50mg/kg

阳性药小剂量+灌胃药物组(p.o.)：给予环磷酰胺5+人参皂苷C-K 50mg/kg

给药方法如前所述。末次给药后脱颈椎处死小鼠，取瘤并称重，比较单纯应用环磷酰胺5mg/kg和10mg/kg治疗同与人参皂苷C-K 3mg/kg和27mg/kg合用治疗各组之间抑瘤率差异，观察人参皂苷C-K增效作用。

实验结果：结果表明，环磷酰胺5mg/kg剂量组对H22肝癌和Lewis肺癌的抑瘤率分别为23.2％和21.2％，而用0.5mg/kg和50mg/kg人参皂苷C-K注射给药或灌胃给药后，抑瘤率明显提高，各组与环磷酰胺组比较具有明显差异。10mg/kg环磷酰胺与不同浓度人参皂苷C-K合用后也具有相同效果，表明人参皂苷C-K对化疗药具有增效作用。结果见表3-4。

表3 环磷酰胺与人参皂苷C-K联合应用对小鼠H22肝癌生长的抑制作用

组别                  剂量(mg/kg)    瘤重(g)          抑瘤率(％)

溶剂对照组            等量溶剂       2.46±0.58       ——

环磷酰胺              5              1.89±0.49       23.2

环磷酰胺              10             1.67±0.51^*     32.1

环磷酰胺+C-K(i.v.)    5+0.5          1.38±0.41^**#   43.9

环磷酰胺+C-K(i.v.)    5+50           1.24±0.44^**#   49.6

环磷酰胺+C-K(p.o.)    5+50           1.41±0.42^**#   42.7

环磷酰胺+C-K(i.v.)    10+0.5         1.13±0.37^**#   54.1

环磷酰胺+C-K(i.v.)    10+50          1.10±0.32^**#   55.3

环磷酰胺+C-K(p.o.)    10+50          1.15±0.44^**#   53.3

与模型组比较：^**，P＜0.01；^*，P＜0.05。与环磷酰胺组比较：^#，P＜0.05；^##，P＜0.01。

表4 环磷酰胺与人参皂苷C-K联合应用对小鼠Lewis生长的抑制作用

组别                  剂量(mg/kg)    瘤重(g)         抑瘤率(％)

溶剂对照组            等量溶剂       1.79±0.44      ——

环磷酰胺              5              1.41±0.38      21.2

环磷酰胺              10             1.29±0.32^*    27.9

环磷酰胺+C-K(i.v.)    5+0.5          1.13±0.28^**   36.9

环磷酰胺+C-K(i.v.)    5+50           1.06±0.31^**   40.8

环磷酰胺+C-K(p.o.)    5+50           1.21±0.52^**#  32.4

环磷酰胺+C-K(i.v.)    10+0.5         0.87±0.24^**   51.4

环磷酰胺+C-K(i.v.)    10+50          0.74±0.21^**   58.7

环磷酰胺+C-K(p.o.)    5+50           0.81±0.47^**#  54.7

与模型组比较：^**，P＜0.01；^*，P＜0.05。与环磷酰胺组比较：^#，P＜0.05；^##，P＜0.01。

试验例3 人参皂苷C-K对放疗的减毒增效作用

试验材料：同试验例1。

试验方法：用Lewis建立小鼠移植性肿瘤模型，按如下组别分组给药：

荷瘤对照组：等量溶剂对照，⁶⁰Co组：等量溶剂对照+⁶⁰Co照射

⁶⁰Co+人参皂苷C-K大剂量组(i.v.)：人参皂苷C-K 50mg/kg+⁶⁰Co照射

⁶⁰Co+人参皂苷C-K中剂量组(i.v.)：人参皂苷C-K 5mg/kg+⁶⁰Co照射

⁶⁰Co+人参皂苷C-K小剂量组(i.v.)：人参皂苷C-K 0.5mg/kg+⁶⁰Co照射

⁶⁰Co+人参皂苷C-K大剂量组(p.o.)：人参皂苷C-K 50mg/kg+⁶⁰Co照射

于接种肿瘤后第二天各组给予相应药物，于接种肿瘤后3天，除荷瘤对照组外，其余4组均一次性给予500Rad ⁶⁰Co照射。于末次给药24h后，各组动物眼眶后静脉丛取血，测定红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、白细胞(WBC)量，剥离肿瘤组织称重并计算抑瘤率。

试验结果：表5.人参皂苷C-K对⁶⁰Co照射后毒副作用及抑瘤的影响

                剂量        RBC             HGB              WBC             瘤重              抑瘤率

组别

                (mg/kg)     (×10⁹/L)      (g/L)            (×10⁹/L)      (g)               (％)

溶剂对照组       ——            6.35±0.46      112.7±8.7       6.95±1.40      1.55±0.30

⁶⁰Co照射组       ——            5.03±0.58^**   90.3±10.3^**    4.53±1.58^**   0.96±0.18^**       38.0

⁶⁰Co+C-K(i.v.)   50        5.87±0.45^##   107.3±9.1^**##   6.13±1.43^#   0.69±0.11^**##      55.4

⁶⁰Co+C-K(i.v.)   5         5.71±0.63^#    103.5±6.7^*##   5.98±1.11^#    0.77±0.12^**#      50.3

⁶⁰Co+C-K(i.v.)   0.5       5.59±0.48^#    99.2±6.8^*#     5.15±2.13^*    0.81±0.10^**#      47.6

⁶⁰Co+C-K(p.o.)   50        5.64±0.52^#    103.9±5.2^*##   5.95±1.25^#    0.77±0.20^**#      50.5

^**，P＜0.01，与溶剂对照组比较；^##，P＜0.01，^#，P＜0.05，与⁶⁰Co照射组比较。

结果表明，荷瘤小鼠经⁶⁰Co射线照射后，肿瘤的生长被明显抑制，但同时照射又导致小鼠红细胞、血红蛋白和外周血白细胞下降，说明照射导致骨髓损伤，人参皂苷C-K不同剂量组静注或口服均可改善小鼠放疗后的损伤。不同剂量的人参皂苷C-K与照射合用可明显增强放疗的抑瘤作用，各剂量组与单纯照射组比较均有显著性差别(见表5)。

试验例4 人参皂苷C-K对化疗药物治疗的减毒试验

试验材料：同试验例1。

试验方法：

用小鼠肝癌和Lewis肺癌建立小鼠体内移植性肿瘤模型，按如下组别分组及给药：

溶剂对照组：给予等量辅料的生理盐水溶液

阳性药大剂量对照组：给予环磷酰胺20mg/kg

阳性药大剂量+药物小剂量组：给予环磷酰胺20+人参皂苷C-K 0.5mg/kg

阳性药大剂量+药物大剂量组：给予环磷酰胺20+人参皂苷C-K 50mg/kg

给药方法如前所述。比较单纯应用环磷酰胺20mg/kg治疗同与人参皂苷C-K 0.5mg/kg和50mg/kg联合应用治疗各组之间动物体重差异、胸腺指数和脾指数差异，用血细胞读数仪计数外周血白细胞，观察各组间白细胞数目差异。

试验结果：

在小鼠Lewis肺癌移植性肿瘤模型中，环磷酰胺20mg/kg剂量组在抑瘤的同时可见体重、免疫器官及白细胞均明显低于对照组。与人参皂苷C-K合用后可明显改善此状态，C-K可以对抗环磷酰胺所致小鼠体重降低、白细胞下降及免疫器官的萎缩，提高小鼠胸腺及脾脏重量(见表6)。表明人参皂苷C-K可明显降低环磷酰胺的毒副作用。

表6 人参皂苷C-K对环磷酰胺在治疗小鼠Lewis肺癌中的减毒作用

                剂量                                                 WBC

组别

                             胸腺指数            脾指数

                (mg/kg)                                              (×10⁹)

溶剂对照组      等量溶剂     0.184±0.023        0.803±0.104        8.79±2.18

环磷酰胺        20           0.052±0.011^**     0.406±0.067^**     4.23±1.44^**

环磷酰胺+C-K    20+0.5       0.098±0.016^**##    0.657±0.086^**##   6.34±1.68^*#

环磷酰胺+C-K    20+50        0.126±0.018^**##    0.768±0.092^**##   7.51±1.79^##

与溶剂对照组比较：^**，P＜0.01；^*，P＜0.05。与环磷酰胺组比较：^##，P＜0.01；^#，P＜0.05。

试验例5 人参皂苷C-K对荷瘤小鼠毒副作用

试验材料：同试验例1。

试验方法：在进行人参皂苷C-K对小鼠Lewis肺癌抑瘤率实验的过程中，每天称量体重，观察荷瘤鼠一般状态和体重变化，于处死小鼠前自眼眶采血，计数外周血白细胞数目，取瘤同时解剖分离胸腺、脾脏及靶器官，称重并计算脏器指数。

试验结果：小鼠给予环磷酰胺后，毛色暗淡，被毛脱落严重，精神萎靡，体重较对照组比较明显降低，胸腺指数与脾指数也明显低于对照组。人参皂苷C-K各给药组荷瘤小鼠的体重及外周血白细胞与溶剂对照比较差别不明显，给予人参皂苷C-K小鼠的胸腺指数还有一定升高趋势(无统计学差异)。结果见表7。

表7 人参皂苷C-K对Lewis肺癌荷瘤小鼠的毒副作用

                   体重                                                WBC

组别

                                   胸腺指数          脾指数

                   (g)                                                 (×10⁹)

溶剂对照组         25.6±1.37      0.184±0.103      0.803±0.274      8.79±2.18

环磷酰胺           22.3±2.48^**   0.052±0.041^**   0.406±0.137^**   4.23±1.44^**

C-K大剂量(i.v.)    24.9±3.47      0.198±0.114      0.827±0.286      8.54±1.68

C-K中剂量(i.v.)    26.0±2.34      0.216±0.138      0.848±0.292      8.61±1.79

C-K低剂量(i.v.)    25.5±2.28      0.205±0.108      0.792±0.272      8.89±1.61

C-K(p.o.)          26.3±2.45      0.210±0.179      0.824±0.241      8.90±1.79

与溶剂对照组比较：^**，P＜0.01。

试验例6 人参皂苷C-K对小鼠脾淋巴细胞转化功能的影响

试验材料：同试验例1。

试验方法：

Lewis肺癌荷瘤小鼠，荷瘤给药方法同试验例1，末次给药后，无菌条件下取出荷瘤小鼠脾脏，玻璃组织匀浆器研磨，200目不锈钢筛网过滤，0.83％氯化铵裂解红细胞，DMEM培养基洗三次后，调整脾细胞浓度至1×10⁷个/ml。取96孔平底培养板，每只鼠设：

(1)对照孔，3复孔，每孔加100μl DMEM培养液

(2)ConA刺激孔，3复孔，每孔加10μl ConA(10μg/ml)

然后每孔加100μl脾细胞悬液，在37℃、5％CO₂、饱合湿度的培养箱中培养72小时，终止培养前4小时，每孔加入5mg/ml MTT溶液10μl。终止培养后，小心吸弃孔内上清液，每孔加入150μl DMSO，振荡10分钟，使结晶充分溶解。用BioRad 550酶标仪在570nm波长、630nm参考波长下测定吸光度，计算刺激指数(SI)。

试验结果：结果表明(见表8)，Lewis肺癌荷瘤小鼠给予人参皂苷C-K不同剂量治疗后，小鼠注射或灌胃给予不同剂量人参皂苷C-K 10天后，ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖反应能力明显升高，且呈剂量依赖性。高剂量组与溶剂对照组比较均有极显著性差异。结果见表8。

试验例7 药物对荷瘤小鼠NK细胞活性、IL-2水平和T淋巴细胞亚群的影响

试验材料：同试验例1。

试验方法：

7.1药物对荷瘤小鼠NK细胞活性的影响

常规培养YAC-1细胞悬液，调浓度至1×10⁶细胞/ml作为靶细胞。按试验例6方法制备Lewis肺癌荷瘤小鼠脾细胞悬液，调整细胞浓度至1×10⁷细胞/ml作为效应细胞。于96孔平底培养板中，按如下比例加入上述细胞悬液：

效应细胞∶靶细胞(20∶1)孔，加100μl效应细胞悬液，加50μl靶细胞悬液，50μlDMEM培养液。

效应细胞对照孔：加100μl效应细胞悬液，100μlDMEM培养液。

靶细胞对照孔：加50μl靶细胞悬液，150μlDMEM培养液。

上述各处理均设三复孔。将培养板于37℃、5％CO₂、饱合湿度下培养24小时后，各孔加入5mg/mlMTT溶液10μl，同样条件下继续孵育4小时，小心吸弃上清，每孔加入150μlDMSO，振荡使完全溶解，测定OD₅₇₀，计算NK细胞毒活性。

7.2药物对小鼠IL-2活性的影响

利用IL-2依赖性细胞株CTLL2细胞测定人参皂苷C-K对荷瘤小鼠IL-2水平的影响。

(1)小鼠脾细胞IL-2的诱生：无菌制脾细胞悬液方法同试验例6，DMEM培养基冲洗一次后调整细胞浓度为0.5×10⁷细胞/ml细胞悬液，加入终浓度的ConA 10μg/ml，3000rpm/min离心10分钟，取上清待测。

(2)IL-2活性的测定：IL-2标准品用DMEM倍比稀释，每浓度设3复孔加入96孔培养板，100μl/孔。待测样品同样设3复孔加入96孔培养板中。另于每孔中加入5×10⁶个/ml的CTLL2细胞悬液，置37℃，5％CO₂饱和湿度培养22小时。每孔加入MTT(5mg/ml)10μl，继续培养4h，弃上清，DMSO 150μl，充分振荡使结晶溶解，BioRad 550酶标仪于570nm测定OD570，根据标准曲线计算IL-2浓度。

7.3人参皂苷C-K对荷瘤小鼠T淋巴细胞亚群的影响

Lewis肺癌荷瘤小鼠分组给药按试验例1中方法进行。处死前眼眶采血。用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，然后调整细胞浓度为1×10⁷个/ml。取50μl加入试管中，加100μl大鼠抗小鼠CD3或CD4或CD8单克隆抗体，4℃孵育30min，用Hanks液洗3遍，每管加入100μl异硫氰酸荧光素(FITC)标记的兔抗大鼠单抗，再放入4℃孵育30min，用Hanks液洗3遍，取10μl细胞悬液滴片，在荧光显微镜(激发光490nm，屏障滤板透光范围520nm～530nm)下观察计数。每个样品共计数200个细胞，其中阳性荧光细胞数换算成阳性百分率(％)。试验结果：小鼠静注或灌胃给予不同剂量人参皂苷C-K 10天后，NK细胞活性以及IL-2活性均明显升高，且存在量效关系。结果见表8。

荧光显微镜计数CD3、CD4和CD8阳性细胞并计算阳性细胞百分率。统计结果表明，人参皂苷C-K连续给药10天后，可明显提高CD3和CD4阳性细胞百分率，各给药组与对照组比较有显著性差异，给药后CD4/CD8比值也明显升高。结果见表9。

表8 人参皂苷C-K对荷瘤小鼠脾淋巴细胞刺激指数、NK细胞活性和IL-2活性的影响

              剂量

组别                        SI                NK(％)          IL-2

              (mg/kg)

模型组        等量溶剂      1.084±0.146      18.72±0.72     2.364±0.166

环磷酰胺组    20            1.123±0.125      17.95±1.00     2.458±0.138

C-K(i.v.)     0.5           1.236±0.132^*    19.65±0.94^*  2.526±0.142^*

C-K(i.v.)     5             1.243±0.163^**   20.3±1.43^**   2.627±0.158^**

C-K(i.v.)     50            1.315±0.133^**   22.0±1.72^**   2.763±0.239^**

C-K(p.o.)     50            1.265±0.147^*    20.3±1.63^*   2.56±0.20^*

与溶剂对照组比较：^**，P＜0.01；^*，P＜0.05。

表9 人参皂苷C-K对荷瘤小鼠T淋巴细胞亚群的影响

             剂量

                                                                          DCD4/CD8

组别                     CD3              CD4(％)          CD8

             (mg/kg)

溶剂对照     等量溶剂    45.92±3.19      30.02±2.81      27.44±3.64    1.11±0.19

环磷酰胺     20          45.35±3.05      26.94±6.01      25.13±3.09    1.08±0.24

C-K(i.v.)    0.5         49.26±2.97^*    33.59±4.43^*   26.88±2.57    1.20±0.23

C-K(i.v.)    5           51.73±2.81^**   35.53±4.37^**   26.02±2.60    1.37±0.30^*

C-K(i.v.)    50          55.74±4.40^**   36.98±7.06^**   25.05±2.48    1.49±0.34^**

C-K(p.o.)    50          51.02±5.25^*    35.16±6.21^*   25.86±2.81    1.38±0.29^*

与溶剂对照组比较：^**，P＜0.01；^*，P＜0.05。

试验例8 人参皂苷C-K对疗所致放射性皮肤溃疡的治疗作用

肿瘤的放射治疗也已经成为目前临床治疗肿瘤的重要手段之一，在治疗中经常发生放射性皮肤溃疡，已经成为肿瘤放疗严重副反应之一。而且溃疡一旦形成，很难愈合，长期反复发作，紧最终有可能发展为癌变。我们发现人参皂苷C-K在预防和治疗放射性溃疡方面也有很好的疗效。

试验材料：

清洁级Wistar大鼠40只，体重180～220g，山东省天然药物工程技术研究中心毒理室提供，

合格证号：鲁动质字20021133。⁶⁰Coγ射线源：莱阳农学院。

试验方法：

40只大鼠水合氯醛麻醉后，行60Coγ射线局部照射术，照射野为双侧臀部，吸收剂量50Gy，吸收剂量率4.612Gy/min，1次照射。随机分为4组，分别为模型组、C-K高(25mg/kg)剂量组、C-K中剂量组(2.5mg/kg)和C-K低剂量(0.25mg/kg)组。观察溃疡愈合时间。于病变60d后，处死大鼠取皮，扫描仪扫描溃疡疤痕部位，Photoshop软件测定疤痕面积。

试验结果：

结果表明，给予人参皂苷C-K后，大鼠的放射性溃疡形成时间明显推迟，愈合时间明显缩短，愈合后疤痕面积也明显减小，说明人参皂苷C-K可以抑制放射性溃疡的形成，同时能够促进溃疡的愈合，并能够减小愈合后疤痕的形成。

表10 人参皂苷C-K对放射导致皮肤溃疡形成及愈合时间以及疤痕大小的影响

               剂量     溃疡形成时间    愈合时间       疤痕面积

组别

              (mg/kg)       (d)            (d)           (cm²)

模型组         ——           12.0±2.3       46.4±7.2      2.49±0.55

C-K小剂量组    0.25      14.2±1.5^*    38.7±7.4^*    1.94±0.37^*

C-K中剂量组    2.5       15.4±1.8^**   37.7±7.8^*    1.89±0.39^*

C-K高剂量组    25        15.7±2.2^**   36.4±8.2^**   1.82±0.41^**

与模型组比较：^**，P＜0.01；^*，P＜0.05。

Claims (8)

1.一种以人参皂苷C-K为有效成分，用于增强抗癌药物疗效，降低化疗药物毒性，预防和治疗放化疗引起的白细胞降低及组织损伤、增强机体免疫功能的药物。

2.根据权利要求1所述的药物是人参皂苷C-K和药学上可接受的载体或辅料组成的药物组合物。

3.根据权利要求2所述的药物组合物，其可以口服或注射给药，注射给药可以静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射或瘤体内注射等。

4.根据权利要求2所述的药物组合物，其可以以片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊、糖浆、注射剂、霜剂、软膏、喷雾剂、口嚼剂或贴剂等形式存在。

5.根据权利要求3所述的药物组合物，优选滴丸、软胶囊、冻干粉针、静脉注射用乳剂。

6.人参皂苷C-K在制备增强抗癌药物疗效的药物中的应用。

7.人参皂苷C-K在制备降低化疗药物毒性，预防和治疗放化疗引起的白细胞降低及组织损伤的药物中的应用。

8.人参皂苷C-K在制备增强机体免疫功能作用的药物中的应用。