CN1336233A - 一种治疗乙肝的药物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种治疗乙型肝炎的药物,主要包括蚂蚁、黄芪、人参、枸杞子、黄精、丹参、白术、地黄、赤芍、当归、蒲公英、虎杖、秦艽、苍术、猪苓等原料。经临床试验证实,本发明药物的治愈率高达47.93－49.42%,总有效率为86.98%－88.80%。

Description

一种治疗乙肝的药物
发明领域
本发明涉及一种治疗乙型肝炎的药物，具体说是治疗乙型肝炎的中药制剂。
技术背景
乙型肝炎是一种发病率高的传染性疾病，尤其在我国，乙肝患者及带病毒者高达1亿多人。慢性乙肝患者往往久治不愈，部分可发展成肝硬化甚至肝癌。
中国专利公开CN 1194849A公开了一种治疗乙肝的中成药-乙肝转阴散，主要包括五味子、丹参、赤芍、当归、黄芪、水蛭、全虫等原料，该药治疗急慢性乙肝的总有效率为84.64％。
中国专利公开CN 1179323A公开了一种治疗乙肝病的中药剂及其制备方法。该药组分主要包括党参、黄芪、白芍、丹参片、千日红、凤尾草等，具有清热解毒、疏肝醒脾、理气止痛、祛瘀生新、清除体内病毒、促进肝细胞再生等功效。
发明内容
本发明是在同一申请人的发明专利ZL93 101758.0基础上的改进发明。因此，本发明的目的是提供一种有效治疗乙型肝炎的药物，经动物试验证实，本发明的药物具有显著的保肝、促进肝再生、促进肝脏BSP排泄功能、增强免疫功能等作用，能够显著抑制乙型肝炎表面抗原和e抗原以及显著抑制鸭乙型肝炎病毒感染。
本发明的药物由以下原料制成(按重量份计)：
蚂蚁150-450    黄芪20-60    参10-30
枸杞子1030     黄精10-30    丹参30-90
白术10-30      地黄30-90    赤芍10-30
当归10-30      蒲公英30-90  虎杖15-45
秦艽10-30      苍术10-30    猪苓10-30
陈皮10-30      山楂10-30    六神曲10-30
麦芽10-30      青皮10-30
本发明药物的制备方法为：将上述原料粉碎成细粉，过筛，混匀，每1千克粉末加炼蜜250-300克与适量的水，制成水蜜丸，干燥，即可得到。
或者，用下面的方法制备本发明的药物：将人参粉碎成细粉，过筛；丹参用乙醇(优选90％)回流提取二次，第一次2小时左右，第二次1.5小时左右，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇，得到丹参提取液；白术、当归、苍术、陈皮、青皮提取挥发油，蒸馏后的水溶液另器收集；药渣与其余蚂蚁等十三味及上述乙醇提取后的丹参药渣，加水煎煮两次，第一次2小时，第二次1.5小时，滤过，合并滤液，滤液浓缩至适量，放置至室温，缓缓搅拌下加乙醇使含醇量达60％左右，静置，滤过，滤液回收乙醇；合并该滤液，丹参提取液及上述水溶液，减压浓缩成相对密度为1.35-1.40(50℃)的清膏，加入上述人参细粉混匀，低温干燥，粉碎，制成颗粒，干燥，加入上述挥发油，混匀，装入胶囊即得。
附图简述
图1是试验三中的第一批实验的鸭血清DHBV-DNA斑点杂交放射自显影照片。
图2是试验三中的第二批实验的鸭血清DHBV-DNA斑点杂交放射自显影照片。
图3是试验三中的第三批实验的鸭血清DHBV-DNA斑点杂交放射自显影照片。
优选实施方案
实施例
蚂蚁300g     黄芪40g        人参20g
枸杞子20g    黄精20g        丹参60g
白术20g      地黄60g        赤芍20g
当归20g      蒲公英60g      虎杖30g
秦艽20g      苍术20g        猪苓20g
陈皮20g      山楂(焦)20g    六神曲(焦)20g
麦芽(焦)20g  青皮20g
将人参粉碎成细粉，过筛；丹参用90％乙醇回流提取二次，第一次2小时左右，第二次1.5小时左右，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇，得到丹参提取液；白术、当归、苍术、陈皮、青皮提取挥发油，蒸馏后的水溶液另器收集；药渣与其余蚂蚁等十三味及上述乙醇提取后的丹参药渣，加水煎煮两次，第一次2小时，第二次1.5小时，滤过，合并滤液，滤液浓缩至适量，放置至室温，缓缓搅拌下加乙醇使含醇量达60％，静置，滤过，滤液回收乙醇；合并该滤液、丹参提取液及上述水溶液，减压浓缩成相对密度为1.35-1.40(50℃)的清膏，加入上述人参细粉混匀，低温干燥，粉碎，制成颗粒，干燥，加入上述挥发油，混匀，装入胶囊即得。
当然，可以将本发明药物制成任何一种适合于临床上应用的剂型，例如丸剂、散剂、口服液、浓缩丸等。试验一  本发明药物的药效学研究
以CCl4或D-半乳糖胺所致实验性急慢性肝损伤和卡介苗所致免疫性肝损伤，灌服本药可使异常升高的ALT、AST活力下降，并减轻肝脂肪变性、水肿、坏死的范围和程度；能促进肝细胞再生，降低小鼠BSP的滞留量；同时对巨噬细胞吞噬、T淋巴细胞转化、溶血素抗体生成等细胞与体液免疫，亦有增强作用。
试验目的
本药临床试验对乙型肝炎有一定疗效，现通过动物试验，观察对肝损伤病理模型和机体免疫功能的影响。
试验材料
1、动物：小白鼠有昆明种，NIH种，本所繁殖，BALB/C种小鼠与C57BL/6种小鼠，购自中国医科院药物研究所。Wistar种大白鼠，本所繁殖。
2、药物：本发明药物；联苯双酯滴丸，锦州市制药厂，930420批；乙肝宁冲剂由长沙九芝堂制药厂生产；批号9504210；盐酸左旋咪唑，上海延安制药厂生产，批号930107；龟令集，山西中药厂，9110060批；冻干卡介苗，卫生部生物制品研究所，3940308批。
一、保肝作用
1、对小鼠四氯化碳急性肝损伤的作用
昆明种小白鼠50只，体重20±2g，雌雄兼用，随机分为5组。1组正常对照，2组灌服生理盐水，3、4组分别灌服本发明药物8g/kg、4g/kg的水混悬液，5组灌服联苯双酯0.2kg/kg的水混悬液，每日一次，连续给予6日。于末次给药后1小时，后4组分别腹腔注射0.2％CCl4油溶液10ml/kg。禁食不禁水20小时后，各组小鼠眼眶静脉采血，按改良的赖氏法测定丙氨酸氨基转换酶(ALT)，并摘取肝脏做病理形态学检查。
从表1可见，各给药组都可使病理性升高的ALT明显降低(P＜0.01)，显微镜下看到肝小叶结构基本清晰，肝细胞仅见轻度浊肿，肝窦略窄，散在点状坏死灶，而CCl4模型组则肝细胞大部分空泡变性或广泛浊肿，多数散在点片状坏死灶，个别血管周围形成大片状浸润，汇管区炎细胞浸润明显。
表1    对小鼠CCl4急性肝损伤的降酶作用
组别 小鼠数 剂量(g/kg) ALT(μ)
正常对照模型本药本药联苯双酯 1010101010 840.2 33.6±1.40***117.4±17.273.4±15.1***55.2±11.0***48.8±16.2***
与模型组比较，***P＜0.01
2、对小鼠D-半乳糖胺盐酸盐(D-Gal)急性肝损伤的影响
昆明种小白鼠60只，18-22g，雌雄兼有，随机分为6组，1、2组生理盐水，3、4、5组分别给予本药8g/kg、4g/kg、2g/kg的水混悬液，6组给予联苯双酯0.2g/kg的水悬液，均为每日灌胃1次，共6次。末次灌胃后1小时，后5组腹腔注射D-Gal 0.65g/kg生理盐水液。20小时后，眼眶静脉丛采血，取血清测ALT与AST(门冬氨酸氨基转换酶)。剖取肝脏，固定，送病理检查。
从表2可见，模型组的ALT与AST，和正常对照组比较，显著升高，说明肝功能受到严重损害。与模型组比较，本药高、中剂量组可使ALT与AST明显降低(P＜0.01)，低剂量组亦显著降低ALT的活力。
病理组织学结果显示，高、中、低剂量用药组小鼠肝之病理改变基本上与正常对照组相同，与D-GAL模型组相比，肝细胞的损伤程度明显减轻。
表2  对小鼠D-GAL急性肝损伤的降酶作用
组别 小鼠数 剂量(g/kg) ALT(μ) AST(μ)
正常对照 10 17±10*** 46±16***
模型 10 107±41 138±10
本药 10 8 40±15*** 87±26***
本药 10 4 47±20*** 67±15***
本药 10 2 64±16*** 129±12*
联苯双酯 10 0.2 40±16*** 90±20***
与模型组比较，***P＜0.01，P＞0.05
表3  对小鼠半乳糖胺肝损伤病变的影响
组别 鼠数 镜检所见
正常对照 10 基本正常
模型 10 坏死灶，而且可见相邻肝小叶中央静脉间的带状坏死
本药高剂量 10 同正常对照组，未见明显坏死灶
本药中剂量 10 同正常对照组，未见明显坏死灶
本药低剂量 10 8例正常，2例病变似模拟组
联苯双酯 10 同正常对照组，未见明显坏死灶
3、对小鼠免疫性肝损伤的影响
取雌性BALB/C小鼠50只，体重22±2g，随机分为5组。除正常对照组给予同体积生理盐水外，其余4组给每鼠尾静脉注射冻干卡介苗2.5mg，溶解为0.2ml。同时分别灌服生理盐水或药液，每日1次，共12日。末次给药后，给每鼠静脉注射细菌内毒素5000Eu(0.2ml)，正常对照组注射生理盐水。16小时后，眼眶静脉丛采血，分离血清，测ALT与AST。剖取肝脏固定，进行病理检查。结果显示，本药高低剂量均可降低异常升高的ALT与AST活性(表4)，说明对免疫性肝损伤也有同样保护作用。
病理组织学结果显示，本发明药物高、低剂量组可不同程度减少肝细胞点、片状坏死、水肿、增生和炎性细胞浸润，其作用与阳性对照药联苯双酯相似。
表4  对小鼠免疫性肝损伤转氨酶活力的影响
组别 剂量 小鼠数 ALT(μ) AST(μ)
正常对照 10 31±14*** 86±21***
模型 10 60±17 137±19
本药 8 10 42±12** 105±10***
本药 4 10 44±13** 116±20**
联苯双酯 0.2 10 30±14*** 86±15***
与模型对照组比较**P＜0.05，***P＜0.01
表5  对小鼠免疫性肝损伤组织病变的影响
组别 鼠数 镜检所见
正常对照 10 组织正常，无细胞水肿，坏死
模型 10 10例均有坏死；6例片状、并有桥接现象；3例病灶坏死有慢性炎细胞浸润，以单核细胞为主，另2例坏死较轻，桥接现象不明显，但可见片状坏死，并伴有细胞水肿。
本药高剂量 10 3例点状坏死，伴细胞水肿2例，其中1例并可见少数小灶状坏死，此例汇管区有较轻的慢性炎细胞浸润，另2例变化不显著；1例细胞水肿。
本药低剂量 10 4例灶状坏死，4例点状坏死。
联苯双酯 10 1例细胞水肿及汇管区轻微的慢性炎细胞浸润，3例可见少数小灶状或灶状坏死，其中1例有较明显慢性炎细胞浸润，其中有1例有桥接现象。
4、对大鼠四氯化碳慢性肝损伤的影响
大白鼠49只，体重150-200g，♂25只，♀24只。随机分为6组，即本药高、中、低剂量，阳性对照药乙肝宁冲剂，生理盐水和正常对照组。每日灌胃给药1次，共8周(56日)。除正常对照组外，其余5组给药期间每隔3日于每鼠颈背皮下注射40％CCl4油溶液3ml/kg，首次量为5ml/kg。末次给药24小时后，眼眶静脉丛采血，分离血清，测总蛋白、白蛋白含量，ALT、AST活性。断头处死，取每只大鼠同一叶部位的肝组织，固定，送病理切片检查。
结果显示，本药各剂量可使异常升高的ALT活力有明显降低，但对升高的AST只有高剂量表现降低之效，对总蛋白和白蛋白的有增加的趋势，但与对照组比较无显著性差异(P＞0.05)。
表6  对慢性肝损伤大鼠血清转氨酶与蛋白质的影响
组别 剂    量(g/kg) 大鼠数 ALT(μ) AST(μ) 总蛋白(g/kg) 白蛋白(g/L)
正常对照 8 27±8*** 29±12*** 70.5±3.1*** 39.1±7.3*
模型 8 180±42 105±12 60.4±7.3 36.7±2.6
本药 8 9 92±46*** 82±24** 66.7±8.3* 39.2±2.4*
本药 4 8 106±42*** 186±24* 66.4±5.8* 36.4±2.6*
本药 2 8 121±21*** 104±2* 66.4±7.5* 37.2±2.1*
乙肝宁冲剂 17 8 105±13*** 89±7*** 66.3±11.2* 36.5±3.3*
与模型组比较，***P＜0.01，**P＜0.05，*P＞0.05
肝组织切片镜检所见(表7)，与模型组比较，给药组肝细胞的脂肪变性，水肿和坏死，明显较少和较轻。
表7  对CCl4慢性肝损伤大鼠组织病变的影响
组别 鼠数 镜检所见
模型 10 10例均有明显脂肪变性，9例明显细胞水肿，并有2例伴有中央静脉周围的胶原纤维增生，另1例可见2个小灶性坏死及纤维化的较大灶状坏死，中央静脉周围也有明显的胶原纤维增生。
本药高剂量 10 6例可见脂肪变性，5例肝脂变很轻。4例细胞水肿，2例点状坏死。
本药中剂量 10 10例均可见肝细胞脂肪变性，6例细胞水肿，2例小灶状坏死。
本药低剂量 10 10例均可见肝细胞脂肪变性，3例小灶状坏死。
乙肝宁冲剂 10 3例明显脂肪变性，另7例较轻；7例细胞水肿，4例有小坏死灶。
二、本发明药物对小鼠肝再生能力的影响
昆明种小鼠，18-22g，♂♀各半，随机分为5组，即对照组，联苯双酯(200mg/kg)，本药高剂量组(8g/kg)、中剂量组(4g/kg)和低剂量组(2g/kg)。于实验第一天1.5％巴比妥纳麻醉(ip)切除肝左叶包扎后im邻氯青霉素钠。次日开始给药，共给药三日，末次给药1小时后，称重，处死，称肝重，并固定标本，显微镜检计数新生细胞数，计算肝再生度及肝脏系数。结果见表8。
A切除肝重    B再生后肝重    0.31为切除肝重与原肝重之比
表8  本发明药物对小鼠再生肝重的影响(X±SD)
组别 动物数 剂量(g/kg) 再生度(％) 肝指数(％) 新生细胞数
对照组 8 114.4±85.0 4.4±0.5 27.6±7.2
联苯双酯组 8 0.2 160.8±55.4* 4.7±0.4* 36.5±10.4**
本药高剂量组 10 8 168.7±57.2* 4.6±0.3* 37.3±8.9**
本药中剂量 10 4 162.5±79.7* 4.6±0.7* 34.5±11.9*
组
本药低剂量组 8 2 143.5±62.0* 4.4±0.5 33.6±8.6
与对照组比较，*P＞0.05，**P＜0.05。
由表8可见，本发明药物有促进肝再生的趋势，使肝再生度有一定提高，但统计不显著(P＞0.05)，联苯双酯与其作用相似，联苯双酯与本发明药物均可使小鼠肝脏小叶中新生细胞数明显增多，核分裂相增多，与对照组比较有显著性意义(P＜0.05)。
三、对小鼠肝脏BSP排泄功能的影响：
昆明种小鼠，体重20±1.2g，随机分为5组：本发明药物高(8g/kg)、中(4g/kg)、低(2g/kg)三个剂量组，联苯双酯组(200mg/kg)和空白对照组。灌胃给药3日，每日一次。末次给药后1小时，尾iv BSP(磺溴酞钠)100mg/kg(用生理盐水配成1％溶液，0.2ml/10g)，iv后15分钟，眼眶静脉丛采血，离心。取0.1ml血清，加0.01mol/LHCl 5ml，用UV-240型分光光度计于520nm处测吸收值(OD)，再加入2mol/L NaOH一滴，测OD；两次OD之差值，即为BSP在血中的储留量，结果见表9。
结果可见，本发明药物高、中、低剂量组均有促进肝脏排泄，BSP滞留值均比对照组低。
表9  本发明药物对肝脏排泄BSP功能的影响
组别 动物数 BSP残留吸光度 相当于对照的百分比
对照组 10 0.0318±0.0097 100％
本药高剂量组 10 0.0206±0.0073*** 64.8％
本药中剂量组 10 0.219±0.0054** 68.9％
本药低剂量组 10 0.023±0.0084** 72.3％
联苯双酯 10 0.0206±0.0056*** 64.8％
与对照组比较，**P＜0.05，***P＜0.01
四、对免疫功能的影响
1、对小鼠碳粒廓清速率的影响
取昆明种小鼠48只，20±2g，分5组。即本药高(8g/kg)、中(4g/kg)、低(2g/kg)三个剂量组，左旋咪唑组和对照组。每日灌胃给药1次，共7次。末次给药后24小时，尾静脉注射印度墨汁生理盐水稀释液10ml/kg。注射后2和20分钟，从眼眶静脉丛采血20u1，加入0.1％碳酸钠溶液2ml中，摇匀。用UV-240型分光光度计于680nm波长处测定吸收度；计算廓清指数K和吞噬指数α。结果可见，本药高剂量能够明显提高小鼠血中碳粒异物的清除速率，中、低剂量对碳廓清指数的增加虽不显著，但按单位重量校正的吞噬指数则有明显提高(P＜0.05)，说明本药有增强网状内皮系统吞噬功能的作用。(表10)
表10  对小鼠碳粒廓清速率的影响
组别 剂量(g/kg) 鼠数 廓清指数K 吞噬指数α
对照 9 0.035±0.019 5.31±1.26
本药 8 9 0.060±0.017*** 7.07±0.89***
本药 4 9 0.047±0.012* 6.48±0.78**
本药 2 10 0.040±0.007* 6.28±0.60**
左旋咪唑 0.01 10 0.064±0.022*** 7.68±1.09***
与对照组比较，***P＜0.01，**P＜0.05，*P＞0.05
2、对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响
昆明种小白鼠100只，雄性，22±2g，随机分为10组。每日灌胃给药1次，共10日。第6～10组于给药第7、9两日，分别腹腔注射环磷酰胺70mg/kg。各组鼠给药第10日下午腹腔注射5％鸡红细胞生理盐水0.5ml，16小时后颈椎脱臼法处死小鼠，注入2ml生理盐水于腹腔内，轻揉腹部。2分钟后腹部正中剪开，用吸管吸出腹腔液约0.5ml，滴于载玻片上，置37℃孵箱内30分钟，用生理盐水洗去未贴片的细胞，凉干。用1∶1丙酮甲醇液固定，姬姆萨瑞氏液染色，油镜下计数200个巨噬细胞中吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数和被吞噬的鸡红细胞总数，算出吞噬百分率及吞噬指数。
结果见表11、12。本药各剂量均能明显增强正常小鼠巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数，对于环磷酰胺抑制的免疫功能低下鼠，本药亦能提高腹腔巨噬细胞吞噬率和吞噬指数，只有低剂量和阳性对照药龟令集对吞噬指数的增加，统计无明显意义的差别。
表11  对正常大鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响
组别 剂量(g/kg) 鼠数 吞噬率(％) 吞噬指数
对照 10 41.3±11.2 0.46±0.19
本药 8 10 69.1±10.1*** 0.66±0.21**
本药 4 10 64.2±9.9*** 0.76±0.11***
本药 2 10 55.7±11.6** 0.65±0.14**
龟令集 20 10 66.3±11.4*** 0.76±0.08***
与对照组比较，**P＜0.05，***P＜0.01
表12  对环磷酰胺抑制鼠吞噬功能的影响
组别     剂量(g/kg)   鼠数   吞噬率(％)     吞噬指数
对照 10 34.4±6.6 0.42±0.17
本药 8 10 41.7±6.4** 0.63±0.17**
本药 4 10 42.7±5.8*** 0.59±0.18**
本药 2 10 42.4±4.6** 0.54±0.16*
龟令集 20 10 45.6±9.5*** 0.52±0.18*
与对照组比较，*P＞0.05，**P＜0.05，***P＜0.01
3、对小鼠迟发型变态反应(DTH)的影响
取NIH种小白鼠50只，雌雄各半，18～22g。随机分为本药高、中、低剂量，左旋咪唑和生理盐水等5组。每日灌胃给药1次，共8次。给药第3日用20％羊红细胞生理盐水悬液(SRBC)0.2ml，给每鼠尾静脉注射致敏，末次给药后以40％SRBC0.02ml，注入每鼠左后足跖；以同体积生理盐水注入右后足跖作为对照。经24小时后，用游标卡尺测量左右足跖的厚度，其差值愈大者表示机体细胞免疫的功能愈强，从表13看出，本药各剂量均可显著增加左后足跖的厚度，提示对T淋巴细胞的功能有增强的作用。
表13  对大鼠迟发型变态反应的影响
组别 剂量 鼠数 左后足跖厚度(mm)
生理盐水 10 3.0±1.8
本药 8 10 6.9±2.0
本药 4 10 8.0±3.5***
本药 2 10 5.6±1.6***
左旋咪唑 0.01 10 6.1±1.8***
与盐水组比较，***P＜0.01
4、对小鼠脾脏T淋巴细胞增殖反应的影响
取C57种小鼠50只，20±2g，雌雄各半，随机分成5组。分别灌服药液或生理盐水，每日1次，共7日。末次给药后次日，颈动脉放血处死小鼠，无菌取脾，制备脾细胞悬液。用0.155M的NH4Cl液溶解红细胞，Hanks液洗2次，最后用RPMI1640完全营养液(含10％小牛血清)重悬浮，调整细胞浓度为2.5×106/ml，经台盼兰排斥试验，活细胞在95％以上。
取此浓度的脾细胞悬液加入96孔平底板中，每份样品加6个孔，每孔含5×105个细胞。分别加入4ug/孔的ConA，并设空白对照。混匀，置37℃，5％CO2孵箱中培养72小时。终止培养前6小时，每孔分别加入1μ Ci的3H-TdR，多头细胞收集器收集细胞于玻璃纤维滤膜上，液闪计数仪测量cpm值。
结果显示：本药各剂量均可促进有丝分裂原ConA刺激的T淋巴细胞的转化，提高其增殖反应(表14)。
表14  对小鼠T淋巴细胞增殖反应的影响
组别 剂量(g/kg) 鼠数 3H-TdR掺入cpm
正常对照 10 73099±18222
本药 8 10 1505414±42621***
本药 4 10 1496660±48421***
本药 2 10 128453±34980***
左旋咪唑 0.01 10 149316±27183***
与对照组比较，***P＜0.01
5、对小鼠溶血素抗体生成的影响
取NIH种小白鼠50只，雌雄各半，随机分为5组：本药高(8g/kg)、中(4g/kg)、低(2g/kg)剂量，左旋咪唑(0.01g/kg)和生理盐水组。每日灌胃给药1次，共7日。第2次给药后，每鼠腹腔注射羊红细胞生理盐水悬液0.2ml致敏。本次给药后1小时，眼眶静脉丛采血，按文献方法(李仪奎，中药药理实验方法学，1991，159)测定OD值，并计算半数溶血值(HC50)。结果显示，本药高、中剂量均可明显增加溶血素抗体的生成，其作用不及左旋咪唑。(表15)
表15  对小鼠溶血素抗体生成的影响
组别 剂量(g/kg) 鼠数 HC50
生理盐水 10 20.6±1.8
本药 8 10 26.1±2.7***
本药 4 10 24.6±2.4***
本药 2 10 21.8±1.2**
左旋咪唑 0.01 10 31.2±2.5***
与对照组比较，**P＞0.05，***P＜0.01试验二
本发明药物在2215细胞内对乙型肝炎病毒表面抗原和e抗原的抑制作用
材料与方法
一、药物
本发明药物为棕色粉末，实验时用培养液配成10mg/ml，0.45um滤膜除菌过滤。
二、2215细胞：
乙型肝炎病毒(HBV)DNA克隆转染人肝癌细胞(Hep G2)的2215细胞系，美国Mount Sinai医学中心构建，引进后自行传代培养。
试剂，Eagles MEM干粉，美国GIBCO公司产品；胎牛血清，美国Hyclone Lab公司产品；G-418(Geneticin)，MEM配制，美国Gibco公司产品；L-谷氨酰胺，京科化学试剂公司进口分装；HBsAg，HBeAg固相放射免疫测定盒，购自中国同位素公司北方免疫试剂研究所产品；青霉素、链霉素，华北制药厂。
实验用品及仪器
培养瓶，丹麦Tunclon TM；培养板，96孔板，24孔板，美国Corning公司产品；二氧化碳孵箱，美国Shel-lab产品。
2215细胞培养液及试剂配制
MEM培养液100ml：含胎牛血清10％，3％谷氨酰胺1％，G148380/ml，青、链霉素各100u/ml，加1ml，用5NaHCO3调pH至7。
细胞消化液：0.25％胰酶，用Hanks液配制。
四、实验方法
(一)2215细胞培养
在长满2215细胞的培养瓶内加0.25％胰酶，37℃消化3分钟，加培养液吹打，1∶3传代，10天长满，加入细胞计数板计数，配制成每毫升10万个细胞接种培养板，96孔板每孔0.2ml，24孔板每孔1ml，37℃5％CO2培养24小时，细胞长成单层后进行实验。
(二)药物对细胞毒性试验
本发明药物用培养液配制成10mg/ml溶液，用2倍稀释至0.156mg/ml，加入96孔板细胞培养板，每浓度3孔，每4天换同浓度药液，设无药物细胞对照组。因药物有色素不能采用染色法，故以观察细胞病变为指标，8天显微镜下观察细胞病变，完全破坏为4，75％为3，50％为2，25％为1，无病变为0。计算每浓度药液平均细胞病变程度和抑制％。按Reed Meuench法计算TC50，TC0。
Figure A0113095600141
A＝log＜50％药物浓度      B＝log稀释倍数
(三)药物对HBeAg、HBsAg抑制试验
每毫升10万个2215细胞接种24孔细胞培养板，每孔1ml，37℃5％CO2培养24小时，加无毒浓度以下2倍稀释试验药液，5个稀释浓度分别为2.5mg/ml；1.25mg/ml；0.625mg/ml，0.3125mg/ml；0.156mg/ml，每浓度3孔，37℃5％CO2培养，每4天换原浓度药液培养，第8天时收获培养液，-20℃冰冻保存，三批实验同时测定HBeAg和HBsAg。实验设HBeAg、HBsAg阳性和阴性对照和细胞对照。
1、HBeAg、HbsAg测定：用中国同位素公司北方免疫试剂研究所产品，固相放射免疫测定盒测定，方法见说明书，用γ-计数仪测定每孔cpm值。
2、药物效果计算：计算细胞对照及每浓度cpm均值及标准差，P/N值和抑制百分率(％)，半数有效浓度(IC50)及治疗指数(TI)。 (3)计算药物抑制抗原半数有效浓度(IC50)
Figure A0113095600153
A＝log＜50％药物浓度    B＝log稀释倍数
(4)本发明药物在2215细胞培养箱内对HBsAg和HBeAg的治疗指数(TI)，按其对细胞毒性指标细胞病变(TIc)计算。
(5)以t检验法计算各稀释浓度HBsAg、HBeAg和对照组间cpm的差别。
结果
一、本发明药物在2215细胞培养中的细胞毒性
为观察本发明药物对乙型肝炎病毒基因转染的人肝癌2215细胞的毒性，在接种2215细胞后24小时，加2倍稀释药液。实验自10mg/ml开始，7个稀释度分别为10；5；2.5；1.25；0.625；0.3125；0.156mg/ml每浓度3孔。4天换一次药液，维持8天，用显微镜观察细胞病变，按公式计算半数有毒浓度(TC50)和最大无毒浓度(TC0)，见表16。结果显微镜检CPE，TC50三批实验分别为5mg/ml、5mg/ml、5.57mg/ml，平均半数中毒浓度为5.19±0.33mg/ml；无毒剂量TC0为2.5mg/ml。
二、发明药物在2215细胞培养中对HBeAg和HBsAg表达的作用
本发明药物  2.5mg/ml；1.25mg/ml；0.625mg/ml；0.3125mg/ml及0.156mg/ml加入2215细胞培养，第8天对HBeAg和HBsAg效果见表17、表18、表19。
1、对HBeAg的抑制率：三批实验本发明药物各浓度组对2215细胞培养第8天上清液对HBeAg的平均抑制率(表19)分别为：2.5mg/ml抑制62.5±3.2％、1.25mg/ml抑制49.3±3.6％、0.625mg/ml抑制37.8±7.5％、0.3125mg/ml抑制26±4.4％、0.156mg/ml抑制18.5±3.8％。三批实验的HBeAg P/N值2.5mg/ml为4.97±0.06，与对照组比较抑制8.4±1.3；1.25mg/ml为6.73±0.21，与对照组比较抑制6.6±1.14；0.625mg/ml为8.23±0.29，与对照组比较抑制5.1±1.48；0.3125mg/ml为9.83±0.5与对照组比较抑制3.5±0.87；0.156mg/ml为10.87±0.68，与对照组比较抑制2.47±0.71。三批实验IC50各为(表19)：0.87mg/ml；0.86mg/ml；1.14mg/ml。平均0.96±0.16mg/ml。
2、对HBsAg的抑制率：本发明药物三批实验各浓度组对HBsAg的平均抑制率(表18)分别为种2.5mg/ml抑制28.3±2.96％、1.25mg/ml抑制28.03±4.1％、0.625mg/ml抑制12.4±10.6％、0.3125mg/ml抑制10.6±5.0％、0.156mg/ml抑制6.2±4.8％。HBsAg P/N值2.5mg/ml为2.78±0.18，与对照组比较抑制1.07±0.12；1.25mg/ml为2.77±0.11，与对照组比较抑制1.08±0.18；0.625mg/ml为3.33±0.32与对照组比较抑制0.52±0.39；0.3125mg/ml为3.43±0.15，与对照组比较抑制0.42±0.19；0.156mg/ml为3.6±0.1，与对照组比较抑制0.25±0.19。三批实验IC50各为1.9；2.21和＞2.5mg/ml。平均＞2.21±0.3mg/ml。
3、治疗指数[TI]：(1)本发明药物在2215细胞培养内对HBeAg的治疗指数[TI]按期细胞病变计算，三批实验IC50值分别为：5mg/ml，5mg/ml，5.57mg/ml，平均为5.1±0.33mg/ml。IC50分别为：0.87；0.86；1.14mg/ml。平均0.96±0.16。TI各为：5.97，6.03，4.55。平均5.52±0.84。
(2)本发明药物在2215细胞培养内对HBsAg的抑制％三批实验2.5mg/ml各为28％，31.4％和25.5％，1.25mg/ml各为31.7％；28.8％
和23.6％，IC50分别为：1.9；2.21和＞2.5mg/ml。治疗指数(TI)各为：2.37，2.35和2.08。平均＜2.4±0.33。
表16、本发明药物在2215细胞培养内的毒性
实验比次 实验方法 不同药物浓度mg/ml/细胞病变 TC50(ug/ml) TC0(ug/ml)
10 5 2.5 1.25 0.625 0.313 0.516 0
I CPE 4 2 0 0 0 0 0 0 5 2.5
4 2 0 0 0 0 0 0
4 2 0 0 0 0 0 0
破坏％ 100 50 0 0 0 0 0 0
II CPE 4 2 0 0 0 0 0 0 5 2.5
4 2 0 0 0 0 0 0
4 2 0 0 0 0 0 0
破坏％ 100 50 0 0 0 0 0 0
III CPE 4 2 0 0 0 0 0 0 5 2.5
4 2 0 0 0 0 0 0
4 2 0 0 0 0 0 0
破坏％ 83.3 50 0 0 0 0 0 0
三批平均 5.19±0.33 2.5
表17  本发明药物在2215细胞中第8天对HBeAg的抑制作用(三比实验)
实验批次 药物浓度(mg/ml) cpm(X±SD)            HBeAg ED50mg/ml TI
抑制％ P/N P/N抑制
I 2.5 2772±57.2*** 64.1 5.0 9 0.87 5.97
1.25 3796.7±133.0** 50.4 6.9 7.1
0.625 4320.7±653.2* 43.4 7.9 6.1
0.3125 5361.3±134* 29.5 9.9 4.1
0.156 6166±372.4 18.8 11.4 2.6
细胞对照 7570±881.5 14.0
II 2.5 2766±23.1*** 64.6 5.0 9.2 0.86 6.03
1.25 3708±197.4** 52.2 6.8 7.4
0.625 4588.7±535.9* 40.6 8.4 5.8
0.3125 5592.7±887.9 27.3 10.3 3.9
0.156 5990±978.9 22.1 11.1 3.1
细胞对照 766.27±1585.1 14.2
III 2.5 2684±72.6*** 58.8 4.9 6.9 1.14 4.55
1.25 3536±270*** 45.3 6.5 5.3
0.625 4551.3±464.1** 29.3 8.4 3.4
0.3125 5065.3±471.1* 21.1 9.3 2.5
0.156 5479.3±307* 14.6 10.1 1.7
细胞对照 6398.7±272.6 11.8
三批平均 0.96±0.16 5.55±0.84
阳性对照 53365±1776
阴性对照 618.7±100.3
空白对照 84.3
注：实验组与对照组比较***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05
表18  本发明药物在2215细胞中第8天对HBsAg的抑制作用(三批实验)
实验批次 药物浓度(mg/ml) cpm(X±SD)             HBeAg ED50mg/ml TI
抑制％ P/N P/N抑制
I 2.5 2462±96.6*** 28 2.95 1 1.9 2.73
1.25 2342±97*** 31.7 2.71 1.25
0.63 2699.3±113.2*** 20.8 3.1 0.86
0.31 2926±360.8 14 3.4 0.56
0.16 3002±27.1 11.7 3.5 0.46
细胞对照 7570±881.5 3.96
II 2.5 2263.3±136.1** 31.4 2.6 1.2 2.21 2.35
1.25 2346.7±106.8** 28.8 2.7 1.1
0.63 2760±124.9* 15.8 3.2 0.6
0.31 3111.3±96.5 4.8 3.6 0.2
0.16 3161.3±119.6 3.2 3.7 0.1
细胞对照 3262.7±283.7 3.8
III 2.5 2418±123.2*** 25.5 2.8 1 ＞2.5 ＜2.08
1.25 2477.3±152.3*** 23.6 2.9 0.9
0.63 3199.3±219.2** 0.5 3.7 0.1
0.31 2811.3±184.9 12.9 3.3 0.5
0.16 3103.3±111.6 3.6 3.6 0.2
细胞对照 3215.3±52.6 3.8
三批平均 ＞2.21±0.30 ＞2.39±0.33
阳性对照 23531±571
阴性对照 981.3±47.7
空白对照 84.3
表19本发明药物在2215细胞培养内对HBeAg和HBsAg的抑制效果分析
病毒抗原 药 物mg/ml 毒性CPE 抗原抑制％ P/N抑制
1 2 3 X±SD 1 2 3 X±SD
HbeAg 2.5 0 64.1 64.6 58.8 62.5±3.2 9 9.2 6.9 8.4±1.3
1.25 0 50.4 52.2 45.3 49.3±3.6 7.1 7.4 6.5 6.6±1.1
0.625 0 43.4 40.6 29.3 37.8±7.5 6.1 5.8 3.4 5.1±4.8
0.3125 0 29.5 27.3 21.1 26±4.4 4.1 3.9 2.5 9.8±0.5
0.156 0 18.8 22.1 14.6 18.5±3.8 2.6 3.1 1.7 2.5±0.7
HBsAg 2.5 0 28 31.4 25.5 28.3±3.0 1 1.2 1 1.1±0.1
1.25 0 31.7 28.8 23.6 28.0±4.1 1.3 1.1 0.9 1.8±0.2
0.625 0 20.8 15.8 0.5 12.4±10.6 0.9 0.6 0.1 0.5±0.4
0.3125 0 14 4.8 12.9 10.6±5.0 0.6 0.2 0.5 0.4±0.2
0.156 0 11.7 3.2 3.6 6.2±4.8 0.5 0.1 0.2 0.5±0.2
结论
一、本发明药物对2215细胞培养的毒性：本发明药物加入2215细胞培养8天，以细胞病变为指标，三批实验平均：半数毒性浓度(TC50)为5.19±0.33mg/ml。最大无毒浓度(TC0)为2.5mg/ml。
二、本发明药物在2215细胞培养内对HBeAg和HBsAg分泌的抑制作用：本发明药物在2215细胞中培养8天，三批实验平均：最大无毒浓度2.5mg/ml对HBeAg的抑制率为62.5±3.2，IC50为0.96±0.16mg/ml。治疗指数5.52±0.84。对HBsAg的抑制作用：最大无毒浓度2.5mg/ml抑制率为28.3±2.96％，IC为2.21±0.3mg/ml，治疗指数为＜2.39±0.33。
三、目前临床用于治疗乙型肝炎病毒的阿糖腺苷单磷酸(Ara-AMP)、无环鸟苷(ACV)、磷甲酸(PFA)等在2215细胞中虽能抑制HBV-DNA，但对HBeAg表达抑制低于50％，不能计算IC50。本实验未用阳性对照药。
试验三  本发明药物在鸭体内对鸭乙型肝炎病毒感染的治疗效果
为验证本发明药物体内抗肝炎病毒作用，本实验采用鸭乙型肝炎病毒感染雏鸭口服本发明药物进行治疗，观察其对鸭血清鸭乙型肝炎病毒DNA水平的影响，并与无环鸟苷(ACV)比较，同时观察了鸭口服本发明药物的毒性。
材料与方法
(一)药物1、本发明药物
2、阳性药物：无环鸟苷(ACV)，购自武汉科益制药公司。
(二)鸭乙型肝炎病毒  鸭乙型肝炎病毒DNA(DHBV-DNA)强阳性血清，采自上海麻鸭，-70℃保存。
(三)动物：
1  日龄北京鸭，购自中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所养鸭场。
(四)试剂：
α-P-dCTP购自北京福瑞生物技术工程公司。缺口翻译盒购自Promega Co.；Sephadex G-50，Ficoll PVP购自瑞典Pharmacia公司；SDS西德Merck公司产品；鱼精DNA、牛血清白蛋白为中科院生物物理所产品；硝酸纤维素膜0.45um Amersham公司产品。
(五)实验方法：
1、鸭乙型肝炎病毒感染：
1日龄北京鸭经腿胫静脉注射山东麻鸭DHBV-DNA阳性鸭血清，每只0.2ml，在感染后天取血，分离血清，-70℃保存待检。
2、药物治疗试验：
DHBV感染雏鸭7天后随机分组进行。药物治疗试验，每组5-7只不等；给药组每批实验分3个剂量组，第1批分2、4和8g/kg组口服1天2次，10天。第2、3批实验分2.5、5、10g/kg组口服1天2次，10天。设病毒对照组(DHBV)，以生理盐水代替药物。阳性药用无环鸟苷(ACV)，口服给药100mg/kg，1天2次，10天；在感染后第7天即用药前(T0)，用药第5天(T5)，用药第10天(T10)和停药后第3天(P3)，自鸭胫静脉取血，分离血清，-70℃保存待检。
3、检测方法：
取上述待检鸭血清，每批同时点膜，测定鸭血清中DHBV-DNA水平的动态。按缺口翻译试剂盒说明书方法，用P标记DHBV-DNA探针，并作鸭血清斑点杂交，放射自显影膜片斑点，在酶标检测仪测定OD值(滤光片为490nm)，计算血清DHBV-DNA密度，以杂交斑点OD值作为标本DHBV-DNA水平值，结果见附图1、2和3。
(六)药效计算：
1、计算每组鸭不同时间血清DNA OD值的平均值(X±SD)并将每组鸭用药后不同时间(T5，T10)和停药后第3天(P3)血清DHBV-DNA水平与同组给药前(T0)OD值比较，采用配对t检验，计算t1、P1值。作统计学处理，分析差异的显著性，判断药物对病毒感染的抑制效果。
2、计算每组鸭用药后不同时间(T5、T10)和停药前第3天(P3)血清DHBV-DNA的抑制％，并作图，比较各组鸭血清HBV-DNA抑制率的动态。
3、将给药治疗组不同时间DHBV-DNA抑制率比较，采用成组t检验，作统计学处理，计算t2、P2值，分析差异的显著性，判断药效。
结果
(一)1日龄北京鸭感染DHBV后，血清DHBV-DNA动态DHBV-DNA感染鸭口服生理盐水后DHBV-DNA全部阳性。病毒对照组18只雏鸭感染后第7天血清DHBV-DNA全部阳性，3批实验感染注射鸭乙型肝炎病毒，感染第7、12、17和20天血清DHBV-DNA水平第1、3批有上升趋势，第2批有下降趋势，但无显著性差异，为自然波动。
(二)阳性药无环鸟苷(ACV)对DHBV感染鸭血清DHBV-DNA的影响
第3批实验  DHBV感染鸭口服阳性药无环鸟苷100mg/kg，1天2次，10天，结果见表1、表2。6只鸭，给药第5天(T5)和第10天(T10)，与给药前(T0)比较，配对统计明显下降，差别有非常显著性(P＜0.01)，说明有显著抑制DHBV作用，为阳性对照。停药后抑制％降低，有反跳现象，虽仍有一定抑制，但无统计学意义。
(三)本发明药物在DHBV感染鸭体内对鸭血清DHBV-DNA的影响
三批实验结果见图1、2、3，表1、2及杂交照片1、2、3，结果表明：
1、第一批实验选用三个剂量组，分别为2、4和8g/kg组，在给药前(T0)与给药后第5天(T5)、第10天(T10)及停药后3天(P3)，取鸭血，分离血清，检测DHBV-DNA OD值，作自身配对比较。8g/kg组在给药后鸭血清OHBV-DNA OD值，与给药前比较，有明显的抑制作用，统计学显示有显著性意义(P＜0.05)，4和8g/kg组在停药后3天鸭血清DHBV-DNA的抑制％，与给药前比较(T0)比较，与病毒对照组成对比，有明显的抑制作用，统计学显示有显著或非常显著性意义(P＜0.01)，未见毒性反应。2g/kg组与感染对照组抑制％作成组分析，无显著差异。
2、第二批实验3个剂量组，分别为2.5，5和10g/kg组，结果表明：2.5和5g/kg组在给药第10天鸭血清DHBV-DNA OD值，与给药前(T0)比较，有明显的抑制作用，统计学显示有显著性意义(P＜0.05)。10g/kg组在给药第10天和停药后3天鸭血清DHBV-DNA抑制％与病毒对照组成组对比，有非常明显的抑制作用，统计学显示有非常显著性意义(P＜0.01)。
3、第三批重复实验，结果表明2.5、5g/kg组在给药第5天鸭血清DHBV-DNA水平OD值与给药前比较有显著抑制(P＜0.05)。5、10g/kg组给药后第5天鸭血清DHBV-DNA的抑制％与病毒对照组成组对比，有显著或非常显著抑制。无环鸟苷100mg/kg1天2次，10天，在给药后第5天、10天都有非常显著抑制。停药后有反跳，与以往多次实验一致。
表20  本发明药物在鸭体内对DHBV-DNA OD值的抑制作用
实验批次 组别 鸭数                  OD490值
T0 T5 T10 P3
I 病毒对照 5 0.25±0.05 0.22±0.02 0.26±0.06 0.30±0.03
本发明药物
2.0g/kg 5 0.27±0.03 0.25±0.04 0.19±0.06 0.26±0.07
4.0g/kg 5 0.25±0.06 0.33±0.04 0.24±0.09 0.19±0.04
8.0g/kg 6 0.38±0.06 0.30±0.11** 0.31±0.09* 0.13±0.06**
II 病毒对照 6 0.63±0.06 0.57±0.11 0.53±0.00 0.46±0.10**
本发明药物
2.5g/kg 6 0.67±0.14 0.49±0.18** 0.41±0.17** 0.41±0.12**
5.0g/kg 6 0.76±0.19 0.65±0.36 0.68±0.18 0.53±0.25**
10g/kg 5 1.03±0.15 0.93±0.23 0.21±0.12** 0.40±0.13**
III 病毒对照 7 0.28±0.07 0.22±0.02 0.26±0.06 0.30±0.03
本发明药物
2.0g/kg 6 0.31±0.06 0.25±0.04 0.19±0.06 0.26±0.07
4.0g/kg 6 0.31±0.09 0.33±0.04 0.24±0.09 0.19±0.04
8.0g/kg 5 0.45±0.09 0.30±0.11** 0.31±0.09* 0.13±0.06**
ACV0.1g/kg 6 0.45±0.17 0.08±0.06** 0.15±0.07* 0.28±0.17
给药后不同时间(T5、T10、P3)OD值与同组给药前(T0)OD值比较(配对t检验)*P＜0.05，**P＜0.01。
表21  发明药物治疗组与病毒对照组在鸭体内对DHBV-DNA抑制率的比较
实验批次 组别 鸭数            抑制率(％)
T5 T10 P3
I 病毒对照 5 11.75 -4.95 -24.26
发明药物
2.0g/kg 5 6.05 28.58 0.61
4.0g/kg 5 -42.21* -5.95 22.59*
8.0g/kg 6 23.88 18.80 63.89***
II 病毒对照 6 9.37 14.78 26.55
发明药物
2.5g/kg 6 28.20 40.02* 39.43
5.0g/kg 6 19.00 8.99* 32.74
10g/kg 6 8.98 80.99** 60.58**
III 病毒对照 7 -0.27 -1.53 -25.62
发明药物
2.5g/kg 6 -113.69** -133.08* 0.03
5.0g/kg 6 -35.76** 11.99 -5.88
10g/kg 5 49.99* 24.88 40.72
ACV0.1g/kg 6 79.52** 61.58** 22.68
给药治疗组不同时间DHBV-DNA抑制率分别与病毒对照组相同时间DHBV-DNA抑制率比较(成组t检验)，*P＜0.05，**P＜0.01。临床试验一
分治疗组和对照组，治疗组用本发明药物，对照组用乙肝养阴活血冲剂。随访一年后综合疗效：治疗组治愈率为49.42％，有效率为39.38％，总有效率为88.80％，明显优于对照组(P＜0.05)，见表22：
表22  随访一年疗效分析
组别 n 基本治愈％ 有效％ 无效％ 总有效率
治疗组 259 128(49.42) 102(39.38) 29(11.20) 230(88.80)
对照组 81 18(22.22) 21(25.90) 42(51.80) 39(48.12)
中医证候疗效：总的治疗组口干苦、乏力、腹胀、胁痛、纳差、腰膝酸软、面色紫暗等症状的改善，其疗效优于对照组(P＜0.05)，见表23：
表23  治疗组与对照组中医主要症状积分比较
项目 n 治疗组 对照组
治疗前 治疗后 治疗前 治疗后
口干苦 232 1.62±±0.61 0.59±0.35 1.62±0.56 0.90±0.72
腹胀 228 1.81±0.56 0.56±0.42 1.82±0.45 1.12±0.69
乏力 217 1.72±0.45 0.77±0.51 1.59±0.43 0.98±0.58
腰膝酸软 188 1.62±0.54 1.02±0.43 1.57±0.61 1.22±0.67
纳差 240 1.86±0.43 0.61±0.61 1.59±0.41 0.96±0.53
胁痛 245 1.83±0.62 0.76±0.58 1.69±0.65 1.11±0.49
面色紫暗 220 1.34±0.41 1.15±0.62 1.41±0.42 1.24±0.46
肝功能改善：ALT、AST、SB治疗组与对照组治疗前后自身比较差异显著(P＜0.05)。肝功能复常率治疗组优于对照组，具有显著性差异(P＜0.05)，见表24：
表24  肝功能复常时间、复常率比较
项目 平均复常时间(日) 复常率％ 时限(日)
S治疗组 39.2±10.9 75.4 90-15
B对照组 49.2±15.6 54.4 90-15
ALT 治疗组 36.5±0.92 84.8 90-15
对照组 42.6±11.2 60.7 90-15
AST 治疗组 41.8±9.5 83.2 90-15
对照组 55.1±12.5 57.8 90-15
HBV-M：HBsAg阴转率治疗组为35.9％(服用2个疗程后)，HBeAg阴转率为58.7％，HBV-DNA阴转率为57.1％，与对照组比较均有显著性差异(P＜0.05)，见表25。
表25  对HBV-M阴转率的影响
组别 n HBsAg％ HBeAg％ 抗-HBc HBV-DNA
治疗组 295 93(259)(35.9) 134(228)(58.7) 78/238(32.9) 113/199(57.1)
对照组 81 4/31(4.9) 14/72(19.4) 5/72(6.9) 12/73(16.4)
结果显示：本发明药物对慢性迁延性肝炎的疗效92.2％，高于慢性活动性肝炎的81.3％，见表26：
表26  慢迁肝、慢活肝疗效分析
分型 n 基本治愈％ 有效％ 无效％ 总有效率％
慢迁肝 179 97(54.2) 68(38.0) 14(7.8) 165(92.2)
慢活肝 80 31(38.80) 34(42.5) 15(18.7) 65(81.3)
上述结果表明，本发明药物治疗慢性乙型病毒性肝炎，在抑制病毒复制、改善主要症状、肝功能复常率指标等方面显著优于对照组。临床试验二
临床资料
1、研究对象的选择标准
慢性活动性、迁延性乙型肝炎(以下简称“慢活肝”，“慢迁肝”)的西医诊断标准按《中药新药临床研究指导原则(1993年第1辑)有关规定制定；中医辩证标准为：神疲乏力、胁痛、低热、纳呆、口干、腰酸、头晕、耳鸣、目花、面色黯滞、苔黄或剥、舌质暗红或有淤斑，脉小弦或细弦，属气阴两虚、湿瘀阻络证。
2、一般资料
按以上标准选择住院和门诊病例共400例。治疗组300例，其中住院患者258例，门诊患者42例，男性242例，女性58例，平均年龄38.6岁，平均病程2.8年，慢活肝197例，慢迁肝103例；对照组100例，其中住院患者81例，门诊患者19例，男性84例，女性16例，平均年龄38.5岁，平均病程2.9年，慢活肝75例，慢迁肝25例；两组以上各项目比较，经卡方检验结果显示差异无显著性统计学意义。
研究方法
1、分组方法
采用Casio(fx-3600p)计算器随机分组，分为治疗组、对照组；在1∶1对照试验中采用双盲法，2∶1对照试验中采用单盲法。
2、观察用药
药物采用双模拟方法处理，使其安慰剂、观察药、对照药在外观上完全一致。观察药为本发明药物，对照药选用乙肝养血冲剂(卫药准字Z-60号)。
3、用药方法与用量
治疗组给予本发明药物，口服，1日三次，每次12g，3个月为1疗程；并给予模拟对照药的安慰剂，口服，1日三次，每次12g。对照组给予乙肝养血冲剂，口服，1日三次，每次10g，3个月为1疗程；并给予观察药的安慰剂，口服，1日三次，每次12g。
4、观察项目
(1)症状与体征：采用评分的方法。
(2)一般体检项目与常规化验检查项目。
(3)血清SB、ALT、AST、总蛋白、A/G、血清HbsAg、抗-HBc、HbeAg、HBV-DNA等。
5、疗效标准
依据《中药新药临床研究指导原则(1993年第1辑)有关内容规定制定。
结果与讨论
研究结果显示，综合疗效：治疗组基本治愈率为47.93％，有效率39.0％，总有效率为86.9％，明显优于对照组(P＜0.05)；主要中医证候疗效：治疗组口干苦、腹胀、乏力、胁痛、纳差、头晕、耳鸣症状的改善优于对照组(P＜0.05)，而腰膝酸软、面色紫暗的改善与对照组比较无显著的统计学意义；肝功能改善ALT、AST、SB的治疗组与对照组治疗前后差值的组间比较有显著统计学意义(P＜0.05)；肝功能复常率治疗组ALT复常率为85.6％、AST复常率为82.1％，SB复常率为73.5％，优于对照组且有显著性差异(P＜0.05)；HBV-M：治疗组HbeAg阴转率为44.9％，HBV-DNA阴转率为44.8％，与对照组比较均有显著性差异(P＜0.05)。本发明药物对慢性迁延性肝炎的疗效(90.6％)高于慢性活动性肝炎(80.6％)，有非常显著性差异(P＜0.01)。
研究结果表明，本发明药物对改善主要症状、肝功能复常、抑制病毒复制指标等方面均优于对照组。在观察过程中未发现慢性毒副作用。

Claims (4)

1、一种治疗乙型肝炎的药物，其特征在于它由按重量份计的以下组分制成：
蚂蚁150-450    黄芪20-60    参10-30
枸杞子10-30    黄精10-30    丹参30-90
白术10-30      地黄30-90    赤芍10-30
当归10-30      蒲公英30-90  虎杖15-45
秦艽10-30      苍术10-30    猪苓10-30
陈皮10-30      山楂10-30    六神曲10-30
麦芽10-30      青皮10-30。
2、根据权利要求1的药物，其中各组分的重量配比为：
蚂蚁300        黄芪40       人参20
构杞子20       黄精20       丹参60
白术20         地黄60       赤芍20
当归20         蒲公英60     虎杖30
秦艽20         苍术20       猪苓20
陈皮20         山楂20       六神曲20
麦芽20         青皮20
3、制备权利要求1的药物的方法，包括将所述原料粉碎成细粉，过筛，混匀，每1千克粉末加炼蜜250-300克与适量的水，制成水蜜丸，再干燥。
4、制备权利要求1的药物的方法，包括：将人参粉碎成细粉，过筛；丹参用乙醇回流提取二次，合并提取液，滤过，滤液回收乙醇，得到丹参提取液；白术、当归、苍术、陈皮、青皮提取挥发油，蒸馏后的水溶液另器收集；药渣与其余蚂蚁等十三味及上述乙醇提取后的丹参药渣，加水煎煮两次，滤过，合并滤液，滤液浓缩至适量，放置至室温，缓缓搅拌下加乙醇使含醇量达60％左右，静置，滤过，滤液回收乙醇；合并该滤液，丹参提取液及上述水溶液，减压浓缩成相对密度为1.35-1.40(50℃)的清膏，加入上述人参细粉混匀，低温干燥，粉碎，制成颗粒，干燥，加入上述挥发油，混匀，装入胶囊即得。
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