具体实施方式
实施例1 本发明药物的制备
称取六味原料药材:郁金330g、栀子330g、川芎640g、香附540g、苍术330g、莱菔子330g。
以上六味药材,取川芎、郁金、香附、苍术4味药材粗粉加12倍量水,水蒸气蒸馏提取挥发油,收集挥发油,用β-环糊精进行包合,包合物研细,过100目筛,备用;药液滤过,取滤液浓缩至相对密度为1.10(60℃)的浸膏,备用;药渣与余下药材栀子、莱菔子合并,加75%乙醇回流提取二次,每次6倍量,每次提取1.5小时,合并提取液,缓缓加入上述浸膏,静置12小时,滤过,滤液减压回收乙醇,减压浓缩至相对密度为1.10(60℃)的浸膏,取1/3浸膏保温,喷雾干燥,收集干燥浸膏粉末,加入甜菊苷、枸橼酸、糊精,混匀,作为载体,其余2/3量浸膏作为粘合剂,进行沸腾制粒,得干燥颗粒,加入β-环糊精包合物,过筛,整粒,分装,即得。
开水冲服,一次5g,一日3次。
实施例2 本发明药物胶囊剂的制备
称取六味原料药材:郁金132g、栀子132g、川芎256g、香附216g、苍术132g、莱菔子132g。
以上六味药材,取川芎、郁金、香附、苍术4味药材粗粉加12倍量水,水蒸气蒸馏提取挥发油,收集挥发油,用β-环糊精进行包合,包合物研细,过100目筛,备用;药液滤过,取滤液浓缩至相对密度为1.10(60℃)的浸膏,备用;药渣与余下药材栀子、莱菔子合并,加75%乙醇回流提取二次,每次6倍量,每次提取1.5小时,合并提取液,缓缓加入上述浸膏,静置12小时,滤过,滤液减压回收乙醇,减压浓缩至相对密度为1.10(60℃)的浸膏,取1/3浸膏保温,喷雾干燥,收集干燥浸膏粉末,加入甜菊苷、枸橼酸、糊精,混匀,作为载体,其余2/3量浸膏作为粘合剂,进行沸腾制粒,得干燥颗粒,加入β-环糊精包合物,过筛,整粒,装入胶囊,制成1000粒,即得。
实施例3 本发明药物片剂的制备
称取六味原料药材:郁金132g、栀子132g、川芎256g、香附216g、苍术132g、莱菔子132g。
以上六味药材,取川芎、郁金、香附、苍术4味药材粗粉加12倍量水,水蒸气蒸馏提取挥发油,收集挥发油,用β-环糊精进行包合,包合物研细,过100目筛,备用;药液滤过,取滤液浓缩至相对密度为1.10(60℃)的浸膏,备用;药渣与余下药材栀子、莱菔子合并,加75%乙醇回流提取二次,每次6倍量,每次提取1.5小时,合并提取液,缓缓加入上述浸膏,静置12小时,滤过,滤液减压回收乙醇,减压浓缩至相对密度为1.10(60℃)的浸膏,取1/3浸膏保温,喷雾干燥,收集干燥浸膏粉末,加入甜菊苷、枸橼酸、糊精,混匀,作为载体,其余2/3量浸膏作为粘合剂,进行沸腾制粒,得干燥颗粒,加入β-环糊精包合物,过筛,整粒,压片,制成1000片,即得。
实施例4 本发明药物的制备
称取原料药材:郁金132g、栀子132g、川芎256g、香附216g、苍术132g、莱菔子132g、合欢皮132g、柴胡132g、石菖蒲132g,按实施例1的方法制备而成颗粒剂。
实施例5 本发明药物的制备
称取郁金330g、栀子330g、川芎640g、香附540g、苍术330g、莱菔子330g,合欢皮330g,按实施例2的方法制备成胶囊剂。
实施例6 本发明药物的制备
郁金300、栀子300g,按权利要求1的方法制备成颗粒剂。
实施例7 本发明药物的制备
称取原料药:郁金150g、栀子150g、川芎300g、香附200g、苍术300g、莱菔子300g、合欢皮300g、柴胡150g、石菖蒲150g,按实施例1的方法制备成颗粒剂。
实施例8 本发明药物的制备
称取原料药:郁金100g、栀子100g、川芎150g、香附100g、苍术100g、莱菔子10g、合欢皮100g、柴胡100g、石菖蒲50g,按实施例3的方法制备成片剂。
实施例9 本发明药物的制备
称取原料药:郁金150g、栀子150g、川芎300g、香附200g、苍术300g、莱菔子300g、合欢皮300g、柴胡150g、石菖蒲150g、青皮150g、佛手150g、合欢花150g,按实施例1的方法制备成颗粒剂。
实施例10 本发明药物的质量控制方法
检查
本品剂型为颗粒剂,按《中国药典》2000年版一部附录IC颗粒剂项下有关规定进行检查,并进行砷盐、重金属检查。其结果均符合规定。同时,砷盐含量低于百万分之二,重金属含量低于百万分之十。
含量测定
照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VI D)测定。
色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;乙腈-水(15∶85)为流动相;检测波长为239nm。理论板数按栀子苷峰计算应不低于3000。
对照品溶液的制备 精密称取栀子苷对照品适量,加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液,摇匀,即得。
供试品溶液的制备 取装量差异下的本品,研细,取约0.5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入70%甲醇50ml,称定重量,超声处理30分钟,放冷,再称定重量,用70%甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液5μl与供试品溶液10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
本发明药物颗粒剂每1g含栀子以栀子苷(C17H24O10)计不得少于4.0mg。
对本发明药物颗粒三批样品的栀子苷含量进行了测定,考虑到药材的来源、炮制加工、制剂生产及贮存等因素,含量限度在三批均值的基础上下降20%,故本发明药物每袋含栀子以栀子苷(C17H24O10)计,不得少于20.00mg。
以下通具体药效学试验及毒副试验证明本发明的有益效果。
试验例1 本发明药物抗动物抑郁模型试验
1、抗利血平眼睑下垂抑郁模型试验
(1)试验材料
①药品
本发明药物原料浸膏,60kg体重成人日服剂量为36g生药/日,即0.6g生药/kg。试验时用该品流浸膏(规格:0.3g生药/g浸膏),用蒸馏水配成所需浓度药液供试验用。以下均按生药量计算给药量(见表1)。
氟西丁胶囊,美国理来公司出品,20mg/粒,批号20010119。
利血平注射液,1mg/ml,广东江门制药厂生产,批号:991105。
艾司唑仑片,常州四药制药有限责任公司生产,批号:010428。
表1 本发明药物原料浸膏配制方法
组别 | 受试品 |
药物浓度(g生药/ml) |
给药体积(ml/kg) |
给药剂量(g生药/kg) |
临床倍数(倍) |
本发明药物组本发明药物组本发明药物组 |
本发明药物原料浸膏本发明药物原料浸膏本发明药物原料浸膏 | 1.20.60.3 | 101010 | 1263 | 20105 |
②动物 昆明种小鼠,由四川抗菌素工业研究所实验动物中心提供,合格证号:川实动管质第99-33。试验时在成都中医药大学药学院药理实验动物观察室(合格证:川实动质第114号)饲养及观察。
(2)方法与结果
①本发明药物单次给药对小鼠利血平致眼睑下垂的影响
选取50只昆明种小鼠,皆为雄性,体重20±2g,按体重随机分为5组,按表2所列药物和剂量分别灌胃给药一次。各组动物给药60min后,腹腔注射利血平注射剂2mg/kg。注射后60min将小鼠放于支架上观察2min,观察各组动物中眼睑至少关闭一半以上的动物个数。结果见表2。
表2 本发明药物单次给药对小鼠利血平致眼睑下垂的影响
组 别 |
剂量(g/kg) |
鼠数(只) |
眼睑至少关闭一半以上的动物数(只) |
蒸馏水组氟西丁组本发明药物组本发明药物组本发明药物组 |
--0.021263 |
1010101010 |
107**9109 |
注:各给药组与蒸馏水组比较*P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001
表2显示,本发明药物单次给药对小鼠利血平致眼睑下垂无显著性影响。
②本发明药物多次给药对小鼠利血平致眼睑下垂的影响
选取50只昆明种小鼠,皆为雄性,体重17±2g,按体重随机分为5组,按表3所列药物和剂量每日灌胃给药一次,连续7日。各组动物于末次给药60min后,腹腔注射利血平注射剂2mg/kg。注射后60min将小鼠放于支架上观察2min,观察各组动物中眼睑至少关闭一半以上的动物个数。结果见表3。
表3 本发明药物多次给药对小鼠利血平致眼睑下垂的影响
组别 |
剂量×天数(g/kg×d) |
鼠数(只) |
眼睑至少关闭一半以上的动物数(只) |
蒸馏水组氟西丁组本发明药物组本发明药物组本发明药物组 |
--0.02×712×76×73×7 |
1010101010 |
106***7**89 |
注:各给药组与蒸馏水组比较*P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001
表3显示,本发明药物高剂量组连续7天给药对小鼠利血平致眼睑下垂具有显著性对抗作用(P<0.01)。
2、抗利血平致运动不能抑郁模型试验
(1)试验材料
①药品
本发明药物原料浸膏、氟西丁胶囊和利血平注射液,同上。
②动物
昆明种小鼠,由四川抗菌素工业研究所实验动物中心提供,合格证号:川实动管质第99-33。试验时在成都中医药大学药学院药理实验动物观察室(合格证:川实动质第114号)饲养及观察。
(2)方法与结果
①本发明药物单次给药对小鼠利血平致运动不能的影响
选取50只昆明种小鼠,皆为雄性,体重20±2g,按体重随机分为5组,按表4所列药物和剂量分别灌胃给药一次。各组动物给药60min后,腹腔注射利血平注射剂2.5mg/kg。注射后60min将小鼠放于直径7.5cm的圆形滤纸中央,观察30sec内各组动物中仍然待在滤纸中的个数。结果见表4。
表4 本发明药物单次给药对小鼠利血平致眼睑下垂的影响
组别 |
剂量(g/kg) |
鼠数(只) |
30sec内各组动物中仍然待在滤纸中的个数(只) |
蒸馏水组氟西丁组本发明药物组本发明药物组本发明药物组 |
--0.021263 |
1010101010 |
107**9810 |
注:各给药组与蒸馏水组比较*P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001
表4显示,本发明药物单次给药对小鼠利血平致运动不能无显著性影响。
②本发明药物多次给药对小鼠利血平致运动不能的影响
选取50只昆明种小鼠,皆为雄性,体重17±2g,按体重随机分为5组,按表5所列药物和剂量每日灌胃给药一次,连续7日。各组动物于末次给药60min后,腹腔注射利血平注射剂2.5mg/kg。注射后60min将小鼠放于直径7.5cm的圆形滤纸中央,观察30sec内各组动物中仍然呆在滤纸中的个数。结果见表5。
表5 本发明药物多次给药对小鼠利血平致运动不能的影响
组别 |
剂量×天数(g/kg×d) |
鼠数(只) |
30sec内各组动物中仍然呆在滤纸中的个数(只) |
蒸馏水组氟西丁组本发明药物组本发明药物组本发明药物组 |
--0.02×712×76×73×7 |
1010101010 |
106***7**89 |
注:各给药组与蒸馏水组比较*P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001
表5显示,本发明药物高剂量多次给药对小鼠利血平致运动不能具有显著性对抗作用(P<0.01)。
3、小鼠悬尾法获得性绝望抑郁模型试验
(1)试验材料
①药品
本发明药物原料浸膏、氟西丁胶囊和利血平注射液,同上。
②动物
昆明种小鼠,由四川抗菌素工业研究所实验动物中心提供,合格证号:川实动管质第99-33。试验时在成都中医药大学药学院药理实验动物观察室(合格证:川实动质第114号)饲养及观察。
(2)方法与结果
①本发明药物单次给药对小鼠悬尾试验的影响
选取60只昆明种小鼠,皆为雄性,体重22~24g,按体重随机分为5组,按表6所列药物和剂量分别灌胃给药一次。各组动物给药30min后,将小鼠尾部距尖1cm处用胶布粘贴于直径1cm的PVC管上,勿使小鼠尾部扭曲折叠,然后架空PVC管,使小鼠呈倒悬状,头部距台面5cm,每两只小鼠间用隔板隔开,使其互不干扰,观察每只动物6min内的累计不动的时间(不动指标为动物除呼吸外所有肢体均不动)。结果见表6。
表6 本发明药物单次给药对小鼠悬尾试验的影响
组别 |
剂量(g/kg) |
鼠数(只) |
6min内的累计不动的时间(sec,x±SD) |
蒸馏水组氟西丁组本发明药物组本发明药物组本发明药物组 |
--0.021263 |
1212121212 |
125.38±45.6248.22±30.04***73.22±20.23**88.88±45.99*110.22±67.60 |
注:各给药组与蒸馏水组比较*P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001
表6显示,12~6g/kg本发明药物原料浸膏组单次给药对小鼠悬尾不动时间均有显著缩短(P<0.01,P<0.05)。
②本发明药物多次给药对小鼠悬尾试验的影响
选取60只昆明种小鼠,皆为雄性,体重18~22g,按体重随机分为5组,按表7所列药物和剂量每日灌胃给药一次,连续7天。各组动物于末次给药30min后,将小鼠尾部距尖1cm处用胶布粘贴于直径1cm的PVC管上,勿使小鼠尾部扭曲折叠,然后架空PVC管,使小鼠呈倒悬状,头部距台面5cm,每两只小鼠间用隔板隔开,使其互不干扰,观察每只动物6min内的累计不动的时间(不动指标为动物除呼吸外所有肢体均不动)。结果见表7。
表7 本发明药物多次给药对小鼠悬尾试验的影响
组别 |
剂量×天数(g/kg×d) |
鼠数(只) |
6min内的累计不动的时间(sec,x±SD) |
蒸馏水组氟西丁组本发明药物组本发明药物组本发明药物组 |
--0.02×712×76×73×7 |
1212121212 |
160.60±43.2876.50±35.24***83.88±34.59**110.22±49.83*133.12±66.63 |
注:各给药组与蒸馏水组比较*P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001
表7显示,12~6g/kg本发明药物原料浸膏组多次给药对小鼠悬尾不动时间均有显著缩短(P<0.01,P<0.05)
4、小鼠强迫游泳法获得性绝望抑郁模型试验
(1)试验材料
①药品
本发明药物原料浸膏、氟西丁胶囊和利血平注射液,同上。
②动物
昆明种小鼠,由四川抗菌素工业研究所实验动物中心提供,合格证号:川实动管质第99-33。试验时在成都中医药大学药学院药理实验动物观察室(合格证:川实动质第114号)饲养及观察。
(2)方法与结果
①本发明药物单次给药对小鼠强迫游泳试验的影响
选取50只昆明种小鼠,皆为雄性,体重22~24g,按体重随机分为5组,按表8所列药物和剂量分别灌胃给药一次。各组动物给药30min后,将小鼠单只放入2500ml大烧杯中,水温25℃,水深10cm,烧杯壁高20cm,直径14cm,观察每只动物6min内的后4min内的累计不动的时间(不动指标为动物除呼吸外所有肢体均不动)。结果见表8。
表8 本发明药物单次给药对小鼠强迫游泳试验的影响
组别 |
剂量(g/kg) |
鼠数(只) |
4min内的累计不动的时间(sec,x±SD) |
蒸馏水组氟西丁组本发明药物组本发明药物组本发明药物组 |
--0.021263 |
1010101010 |
101.47±38.6538.27±20.34***53.56±24.73***76.48±35.43**90.13±37.58 |
注:各给药组与蒸馏水组比较*P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001
表8显示,12~6g/kg本发明药物原料浸膏组单次给药对小鼠强迫游泳不动时间均有显著缩短(P<0.01,P<0.05)。
②本发明药物多次给药对小鼠强迫游泳试验的影响
选取50只昆明种小鼠,皆为雄性,体重20~22g,按体重随机分为5组,按表9所列药物和剂量每日灌胃给药一次,连续7天。各组动物于末次给药30min后,将小鼠单只放入2500ml大烧杯中,水温25℃,水深10cm,烧杯壁高20cm,直径14cm,观察每只动物6min内的后4min内的累计不动的时间(不动指标为动物除呼吸外所有肢体均不动)。结果见表9。
表9 本发明药物多次给药对小鼠强迫游泳试验的影响
组别 |
剂量×天数(g/kg×d) |
鼠数(只) |
4min内的累计不动的时间(sec,x±SD) |
蒸馏水组氟西丁组本发明药物组本发明药物组本发明药物组 |
--0.02×712×76×73×7 |
1010101010 |
82.58±28.7627.16±19.23***42.45±25.62***65.37±34.56**77.34±36.47 |
注:各给药组与蒸馏水组比较*P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001
表9显示,12~6g/kg本发明药物原料浸膏组多次给药对小鼠强迫游泳不动时间均有显著缩短(P<0.001,P<0.01)。
5、慢性应激性大鼠抑郁模型的行为学试验
(1)试验材料
①药品
本发明药物原料浸膏,参见13.1.1(1)①项下。
阳性药盐酸氯米帕明片,天津药物研究院药业有限责任公司出品,批号010608,规格25mg×48片。临用时用蒸馏水配成1mg/ml药液备用。
②动物
SD种大鼠,由四川抗菌素工业研究所实验动物中心提供,合格证号:川实动管质第99-30。试验时在成都中医药大学药学院药理实验动物观察室(合格证:川实动质第114号)饲养及观察。
(2)方法与结果
造模动物全部每笼一只孤养,接受21天各种不同的应激,包括冰水游泳(4℃,5min)、夹尾(3min)、禁水(40h)、禁食(40h)、配对饲养及潮湿、束缚和通宵照明刺激,平均每种刺激2~3次。正常组大鼠每笼5只饲养,不予任何刺激。各给药组于造模同时按表10所示药物和剂量灌胃给药,连续21天。采用Open-field法观察行为。本实验所用敞箱为立方形,高40cm,长宽80cm,周壁、底面由面积相等的25块组成,用白线划分。以动物穿越底面块数为水平活动(crossing)得分,以直立次数为垂直活动(rearing)得分。第22天进行观察,每只动物测定1次,每次测定时间为3min,计数水平活动得分和垂直活动得分。结果见表10。
表10 本发明药物原料浸膏对慢性应激性抑郁模型大鼠Open-field法行为的影响
组别 |
剂量×次数(g/kg×c) |
鼠数(只) |
水平运动(次/3min,x±SD) |
垂直运动(次/3min,x±SD) |
正常对照组模型对照组盐酸氯丙咪嗪组本发明药物组 |
----0.01×2112×216×213×21 | 1010101010 |
47.90±27.8413.20±10.70###26.70±11.98*34.30±15.24**25.10±12.29*20.80±10.16 |
11.60±5.664.10±2.42###10.40±4.81**8.10±3.70*7.20±3.01*6.10±2.69 |
注:①模型组对照组与正常对照组比较▲▲P<0.01
②各给药组与正常对照组比较 *P<0.05 **P<0.01
表10结果显示,慢性应激性抑郁模型大鼠的水平运动和垂直运动均极显著减少(P<0.001),12~6g/kg本发明药物原料浸膏均能明显对抗运动减少(P<0.05)。
试验例2 本发明药物抗抑郁药理作用
1、L-5-羟色氨酸所致小鼠震颤试验
①药品
本发明药物原料浸膏,由实施例1的方法制备。
吗氯贝胺片,湖南制药厂出品,规格0.1g/片,用蒸馏水配成0.08mg/ml药液供试验用。
L-5-羟色氨酸,Sigma公司。
②动物
昆明种小鼠,由四川抗菌素工业研究所实验动物中心提供,合格证号:川实动管质第99-33。试验时在成都中医药大学药学院药理实验动物观察室(合格证:川实动质第114号)饲养及观察。
(2)方法与结果
参照文献[Worms P,Kan J-P,Werwuth C G et,J Pharmacol Exp Therapeut,1987;240(1):241]方法,按表11所示药物和剂量各组小鼠灌胃给药1次。给药60min后,各鼠腹腔注射5-羟色氨酸200mg/kg(不引起小鼠震颤的最高剂量),随后将小鼠单个放在笼内(16×27cm),观察20min内出现震颤的动物数。结果见表11。
表11 本发明药物原料浸膏对5-羟色氨酸震颤作用的影响
组别 |
剂量×次数(g/kg×c) |
鼠数(只) |
震颤鼠数(只) |
蒸馏水+5-羟色氨酸组蒸馏水+吗氯贝胺组吗氯贝胺+5-羟色氨酸蒸馏水+本发明药物组本发明药物+5-羟色氨酸组本发明药物+5-羟色氨酸组本发明药物+5-羟色氨酸组 |
--0.8mg×10.8mg×112.0×112.0×16.0×11.5×1 |
10101010101010 |
0010**0410 |
注:各给药组与蒸馏水+5-羟色氨酸组比较**P<0.01
表11结果显示,仅给予小鼠L-5-羟色氨酸或受试药(本发明药物原料浸膏和吗氯贝胺),动物不出现震颤,而在给予受试药后再给5-羟色氨酸,则随着本发明药物原料浸膏剂量的增大,出现震颤的动物数增多,但无明显差异(P>0.05),说明本发明药物原料浸膏有加强5-羟色氨酸震颤作用的趋势。
2、加强左旋多巴行为效应的试验
①药品
本发明药物原料浸膏,由实施例1的方法制备。
左旋多巴片,中国广西东兰制药厂出品,批号20010425,规格0.25g×100片。临用时用蒸馏水配成20mg/ml药液,2500rpm/min离心20min取上清备用。
②动物
昆明种小鼠,由四川抗菌素工业研究所实验动物中心提供,合格证号:川实动管质第99-33。试验时在成都中医药大学药学院药理实验动物观察室(合格证:川实动质第114号)饲养及观察。
(2)方法与结果
参照文献[Worms P,Kan J-P,Werwuth C G et,J Pharmacol Exp Therapeut,1987;240(1):241],按表12所示药物和剂量各组小鼠灌胃给药1次。给药60min后,各鼠腹腔注射左旋多巴200mg/kg(不引起小鼠奔跑的最高剂量),随后将小鼠单个放在笼内,观察30min内出现奔跑的动物数。
表12 本发明药物原料浸膏对左旋多巴行为效应的影响
组别 |
剂量×次数(g/kg×c) |
鼠数(只) |
震颤鼠数(只) |
蒸馏水+左旋多巴组蒸馏水+吗氯贝胺组吗氯贝胺+左旋多巴酸蒸馏水+本发明药物原料浸膏组本发明药物原料浸膏+左旋多巴组本发明药物原料浸膏+左旋多巴组本发明药物原料浸膏+左旋多巴组 |
--8.0mg×10.8mg×112.0×112.0×16.0×11.5×1 |
10101010101010 |
0010**0521 |
注:各给药组与蒸馏水+左旋多巴组比较**P<0.01
表12结果显示,仅给予小鼠左旋多巴或受试药(本发明药物原料浸膏和吗氯贝胺),动物不出现震颤,而在给予受试药后再给左旋多巴,则有部分动物沿着笼子来回奔跑,并且随着本发明药物原料浸膏剂量的增大,出现奔跑的动物数增多,但无明显差异(P>0.05),说明本发明药物原料浸膏有加强左旋多巴行为效应的作用趋势。
3、兴奋中枢神经系统试验
(1)实验材料
①药品
本发明药物原料浸膏,由实施例1方法制备;氟西丁胶囊。
舒乐安定片,山西省临汾地区新星制药,2.5mg/片×100片/瓶,批号0001201。
②仪器
ZL-1计算机控制小动物成套行为活动测定仪,中国医学科学院药物研究所研制。
③试剂
戊巴比妥钠,佛山市化工试验厂进口分装,A.R级,25g/瓶,批号:971022。
④动物
昆明种小鼠,由四川抗菌素工业研究所实验动物中心提供,合格证号:川实动管质第99-33。试验时在成都中医药大学药学院药理实验动物观察室(合格证:川实动质第114号)饲养及观察。
(2)方法和结果
①本发明药物对小鼠自发活动的影响
选用72只昆明种小鼠,雌雄各半,鼠龄8周,体重20~22g,随机分为6组,每组12只,雌雄各半,试验前禁食不禁水12小时,试验安排于夜间进行,实验室温度控制在24~26℃。按表13所列药物与剂量灌胃一次。给药后0.5h,测定小鼠自发活动。测定方法:将小鼠放入ZL-1计算机控制小动物成套行为活动测定仪中适应1min后,测定其3min内的活动次数,按下式计算活动增加率,结果见表13。
表13 本发明药物对小鼠自发活动的影响
组别 |
剂量(g/kg) |
鼠数(只) |
活动次数(次/3min) |
增加率(%) |
蒸馏水组氟西丁组舒乐安定组本发明药物原料本发明药物原料组本发明药物原料组 |
等容积蒸馏水0.020.011263 | 121212121212 | 96.17±23.77105.41±29.7658.08±29.42***166.58±68.58**178.91±80.41***106.25±77.46 | --9.61-65.6273.2186.0410.48 |
注:各给药组与蒸馏水组比较*P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001
表13显示,6~12g/kg本发明药物原料浸膏对小鼠自发活动都有极显著和显著的兴奋作用(P<0.001和P<0.01)。
②对抗阈剂量戊巴比妥钠催眠试验
选取50只昆明种小鼠,雌雄各半,鼠龄8周,体重20~22g,随机分为5组,按表14所列药物与剂量各组分别灌胃一次,30min后,每只小鼠腹腔注射0.38%戊巴比妥钠38mg/kg,以翻正反射消失为入睡时间,从翻正反射消失到翻正反射恢复为睡眠时间,结果见表14。
表14 本发明药物原料浸膏协同阈剂量戊巴比妥钠催眠作用
组别 |
剂量×次数(g/kg×c) |
鼠数(只) |
入睡时间(min,x±SD) |
睡眠时间(min,x±SD) |
蒸馏水组安定片组本发明药物 |
--0.01×112×16×13×1 |
1010101010 |
6.10±1.323.84±1.45**6.68±1.686.57±1.456.40±1.94 |
37.51±8.2176.11±17.51***32.80±12.3634.09±10.4236.38±9.28 |
注:各给药组与蒸馏水组比较**P<0.01 ***P<0.001
表14显示,12~3g/kg本发明药物原料浸膏对阈剂量戊巴比妥钠催眠小鼠的入睡时间和睡眠时间均无明显影响(P>0.05)。
4、肝郁证模型试验
(1)试验材料
①药品
本发明药物原料浸膏,由实施例1的方法制备。
阳性药:逍遥颗粒,长春市北华制药厂出品,批号20001201,规格6g×8袋。临用时用蒸馏水配成0.6g/ml药液灌胃给药。
②仪器
NTE-1型粘度计:成都仪器厂,编号9063。
③动物
SD种大鼠,由四川抗菌素工业研究所实验动物中心提供,合格证号:川实动管质第99-30。试验时在成都中医药大学药学院药理实验动物观察室(合格证:川实动质第114号)饲养及观察。
(2)方法和结果
选取50只SD大鼠,雌雄各半,鼠龄16周,体重180~200g,随机分为5组,按表16所列药物与剂量各组分别灌胃每日一次。给药当天开始各组SD大鼠戴模具(单笼饲养)7天,模具为两块厚0.2cm,直径4cm的红色有机玻璃组成类似颈部枷锁形模具(模具可根据动物大小进行调节)。观察动物戴模具后前后情况(暴跳,抓咬笼具、模具,不断嘶叫,反应迟钝,行为迟缓,动物眼睛眯小,有眼屎,毛色枯黄,粪便小、干、少、尾呈棕红色并有鳞片出现,消瘦,体重减轻等),第7天测定大鼠自发活动、进食量,第八天从股动脉取血测定血液流变性指标。结果见表15~18。计算:
表15 本发明药物原料浸膏对模具法激怒肝郁证模型大鼠自发活动的影响
组别 |
剂量(g/kg) |
鼠数(只) |
活动次数(次/3min) |
增加率(%) |
正常对照组肝郁模型组逍遥颗粒组本发明药物组本发明药物组本发明药物组 |
----61263 |
101010101010 |
36.40±11.1722.50±6.75▲▲30.20±6.84*32.60±6.60**29.70±6.77*25.20±5.98 |
----34.2244.8932.0012.00 |
注:①肝郁模型组与正常对照组比较▲▲P<0.01
②各给药组与正常对照组比较*P<0.05,**P<0.01
表15显示,模具法激怒肝郁证模型大鼠自发活动显著减少,12~6g/kg本发明药物原料浸膏能显著或明显增加动物活动次数(P<0.01和P<0.05)。
表16 本发明药物原料浸膏对模具法激怒肝郁证模型大鼠体重增长的影响
组别 |
剂量(g/kg) |
鼠数(只) |
体重(g) |
增长率(%) |
造模前 |
造模及给药7天 |
正常对照组模型组逍遥颗粒组本发明药物组本发明药物组本发明药物组 |
--0.020.011263 |
101010101010 |
189.9±6.76189.6±7.26188.2±6.43188.6±7.32188.1±6.84190.5±7.72 |
201.2±5.63185.9±7.68▲▲▲188.0±6.45188.2±6.83187.1±7.22187.7±7.75 |
5.99±2.10-1.96±1.02▲▲▲-0.10±1.59**-0.20±1.20**-0.53±1.37*-1.47±1.11 |
注:①肝郁模型组与正常对照组比较▲▲▲P<0.001②各给药组与正常对照组比较*P<0.05 **P<0.01
表16显示,模具法激怒肝郁证模型大鼠体重增长极显著减慢(P<0.001),12~6g/kg本发明药物原料浸膏能显著或明显对抗体重降低(P<0.01和P<0.05)。
表17 本发明药物原料浸膏对模具法激怒肝郁证模型大鼠进食量的影响
组别 |
剂量(g/kg) |
鼠数(只) |
进食量(g) |
增长率(%) |
造模前 |
造模及给药7天 |
正常对照组模型组逍遥颗粒组本发明药物组本发明药物组本发明药物组 |
--0.020.011263 |
101010101010 |
18.60±6.1718.10±4.7518.70±4.6918.00±3.6518.50±3.8918.90±4.53* |
19.90±5.9217.40±4.1719.30±4.5518.50±3.2418.80±3.2618.40±3.78 |
8.22±5.33-3.19±4.67▲▲▲3.64±7.24*3.44±4.84**2.34±4.53*-1.60±6.81 |
注:①肝郁模型组与正常对照组比较▲▲▲P<0.001
②各给药组与正常对照组比较*P<0.05 **P<0.01
表17显示,模具法激怒肝郁证模型大鼠进食量显著减少(P<0.001),12~6g/kg本发明药物原料浸膏能显著或明显对抗进食量降低(P<0.01和P<0.05)。
表18 本发明药物原料浸膏对模具法激怒肝郁证模型大鼠血液流变性的影响(x±SD)
组别 |
剂量(g/kg) |
鼠数(只) |
全血粘度(mPa·s) | 红细胞压积(%) | 血浆粘度(mPa·S) | 红细胞聚集指数(Lb) |
300 1/s | 1 1/s |
正常对照组模型对照组逍遥颗粒组本发明药物本发明药物本发明药物 | 蒸馏水蒸馏水1.091263 | 101010101010 | 4.13±0.614.98▲▲±0.604.26**±0.454.20**±0.314.39*±0.514.67±0.71 | 5.21±0.455.95▲▲±0.525.32*±0.485.39*±0.525.35*±0.585.72±0.73 | 43.99±1.3444.76±4.8544.35±3.2744.21±4.2244.22±3.1044.40±3.34 | 1.24±0.091.39▲▲±0.091.28*±0.101.27*±0.101.33±0.051.35±0.05 | 1.52±0.141.71▲▲±0.131.56*±0.121.59*±0.111.62±0.091.62±0.12 |
注:①模型组对照组与正常对照组比较▲▲P<0.01
②各给药组与正常对照组比较*P<0.05 **P<0.01
表18显示,模具法激怒肝郁证模型大鼠全血粘度(高切和低切)、血浆粘度和红细胞聚集指数均显著升高(P<0.01),12~6g/kg本发明药物能明显降低上述升高(P<0.05)。
小结:
(1)抗动物抑郁模型试验:①抗利血平眼睑下垂抑郁模型试验显示,本发明药物单次给药对小鼠利血平致眼睑下垂无显著性影响,连续7天给药对具有显著对抗作用(P<0.01)。②抗利血平致运动不能抑郁模型试验显示,本发明药物单次给药对小鼠利血平致运动不能无显著性影响,多次给药具有显著对抗作用(P<0.01)。③小鼠悬尾法获得性绝望抑郁模型试验显示,12~6g/kg本发明药物原料浸膏组单次和多次给药对小鼠悬尾不动时间均有显著缩短(P<0.01,P<0.05)。④小鼠强迫游泳法获得性绝望抑郁模型试验显示,12~6g/kg本发明药物原料浸膏组单次和多次给药均对小鼠强迫游泳不动时间均有显著或明显缩短作用(P<0.01,P<0.05)。⑤慢性应激性大鼠抑郁模型的行为学试验显示,12~6g/kg本发明药物原料浸膏均能明显对抗慢性应激性抑郁模型大鼠水平运动和垂直运动减少(P<0.05)。
(2)抗抑郁药理作用分析试验显示,本发明药物原料浸膏有加强5-羟色氨酸震颤作用和加强左旋多巴行为效应的作用趋势,但无明显差异(P>0.05)。
(3)兴奋中枢神经系统试验显示,6~12g/kg本发明药物原料浸膏对小鼠自发活动都有极显著和显著的兴奋作用(P<0.001和P<0.01)。12~3g/kg本发明药物原料浸膏对阈剂量戊巴比妥钠催眠小鼠的入睡时间和睡眠时间均无明显影响(P>0.05)。
(4)肝郁证模型试验显示,12~6g/kg本发明药物原料浸膏能显著或明显增加模具法激怒肝郁证模型大鼠活动次数(P<0.01和P<0.05),显著或明显对抗体重和进食量降低(P<0.01和P<0.05)降低模型大鼠全血粘度(高切和低切)、血浆粘度和红细胞聚集指数(P<0.05)。
以下通过毒副试验证明本发明药物的安全性。
试验例5 本发明药物动物急性毒性试验
本发明药物无糖颗粒剂浸膏小鼠灌胃给药的最大给药量为300g生药/kg/24h最大给药倍数为60kg体重成人临床口服日用药量的500倍和900倍。灌胃给药后观察7天,观察动物的行为活动、呼吸循环、饮食、大小便、皮毛等变化。给药观察7天,动物无死亡,仅于给药后2h至12h,动物粪便量增多,此后,恢复正常。其余未见异常症状。观察期间,动物的摄食量和体重无明显减少。处死动物后,肉眼观察重要器官(心、肝、脾、肺、肾等)均无异常发现。
结论:本发明药物无糖颗粒安全剂量范围较大
试验例6 本发明药物的大鼠长期毒性试验
(1)大鼠长期毒性试验结论
本发明药物无糖颗粒剂浸肓按48、24和12g/kg三个剂量,分别相当于其临床口服剂量的80、40和20倍,连续对大鼠灌胃给药6个月及停药1个月,观察结果如下:
(1)一般情况及体重:给药期间,各组受试大鼠行为活动正常,动物毛泽光滑,各天然孔无异常分泌物。动物摄食量无明显增减。本发明药物浸膏连续给药7-133天雄鼠高,中剂量组体重分别明显或显著减轻(P<0.05或P<0.01),28-119天雌鼠低剂量组体重明显或显著减轻(P<0,05或P<0,01)停药1个月大鼠体重增长与对照组比较无明显差异(P>0.05)。
(2)血常规:给药3个月,可见本发明药物浸膏雄鼠和雌雄全部中`低剂量组WBC、W-SCR、W-LCR和W-SCC明显降低(P<0,05)MCH和MCHC明显升高(P<0.05)。给药6个月可见雄鼠和雌雄全部中剂.量组W-SCR明显降低(P<0.05),W-LCR显著升高(P<0,01);MCH和MCHC明显或显著升高(P<0.05或P<0.01)。停药1个月后,可见雄鼠和雌雄全部中、低剂量组RC明显降低(P<0.05);高、低剂量组HCT和PLT分别明显或显著降低(P<0.05或P<0.01),MCH和MCV明显或显著升高(P<0.05或P<0.01)。以上指标变化因无明显量效关系(P>0.05),故推测系正常生理值波动。此外,可见给药3、6个月和停药1个月RBC、HGB分别明显或显著降低(P<0,05或P<0,01)。
(3)肝功能:未见明显差异。
(4)肾功能:仅见给药6个月CREA分别明显或显著降低(P<0.05或P<0.01)。
(5)其它生化指标:未见明显差异。
(6)系统尸解及脏器指数:未见明显差异。
(7)病理组织学检查:给药3个月、6个月及停药1个月,在光学显微镜下对本发明药物浸膏高、中剂量组(给药3个月检查包括低剂量组)和对照组大鼠心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胃、食道、十二指肠、回肠、结肠、子宫、卵巢、皋丸、附睾、胸骨、颌下腺、甲状腺、淋巴结、胸腺、胰腺、眼、气管、大脑、小脑、丘脑、膀胱和前列腺进行病理组织学检查。结果发现;本发明药物浸膏高剂量组大鼠给药3月、6月后各器官组织无毒性损害。停药1月各器官组织无继发性毒性损害。
结论:本发明药物浸膏按48g、24g和12g生药/kg三个剂量连续给药6个月及停药1个月,各项指标未见明显异常,该药物24g生药/kg以下为安全剂量。