KR20230073574A - 외부 칼슘 유입 이상에 기인된 골격근 질환의 진단 및 예방 또는 치료를 위한 casq1-stim2 결합의 용도 - Google Patents
외부 칼슘 유입 이상에 기인된 골격근 질환의 진단 및 예방 또는 치료를 위한 casq1-stim2 결합의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 CASQ1(Calsequestrin 1)의 C1(N-말미 92개 아미노산 서열) 부위를 통해, CASQ1이 STIM2에 결합을 하고, 이러한 CASQ1 또는 이의 C1 부위 발현에 의해(CASQ1-STIM2 결합) 저장소-작동 칼슘 유입(SOCE) 및 세포질 칼슘 양은 낮추고, 근세포질세망(SR) 안의 칼슘 양은 늘어남을 확인함으로써 외부 칼슘 유입 이상에 기인된 골격근 질환의 진단, 예방 또는 치료 가능성을 제공할 수 있다.
Description
본 발명은 외부 칼슘 유입 이상에 기인된 골격근 질환의 진단 및 예방 또는 치료를 위한 CASQ1-STIM2 결합의 용도에 관한 것이다.
골격근은 신체를 움직이거나 자세를 유지하기 위해 수축하거나 이완하며, 이는 골격근 세포 (즉, 분화골격근세포(myotube))의 세포질 Ca2+ 수준에 의존한다.
세포질 Ca2+ 수준의 일시적인 상승은 t-관 막에 발생한 활동 전위의 결과로, 골격근의 수축을 일으키는 역할을 한다(흥분-수축(EC) 커플링이라고 함). 골격근의 EC 커플링 동안, 디히드로피리딘 수용체(DHPR, t-관 막에 존재하는 전압 개폐 Ca2+ 채널)는 아세틸콜린에 대한 반응인 활동 전위를 감지하여 활성화되고 구조가 변경된다. 활성화된 DHPR은 물리적 상호 작용을 통해 리아노딘 수용체 유형 1(RyR1, 근세포질세망(SR) 막에 존재하는 내부 Ca2+ 채널)을 활성화한다. 활성화된 RyR1은 SR(Ca2+ 저장소) 내부에서 세포질로 칼슘(Ca2+)을 방출하고, 그 칼슘(Ca2+)은 수축성 단백질들을 활성화하여 골격근의 수축을 유발한다.
내부 칼슘을 저장하는 SR의 주요 역할 외에도, 미토콘드리아는 골격근 세포에서 내부 칼슘을 저장하는 역할을 한다. 골격근을 이완시키기 위해 세포질 칼슘은 SERCA1a(sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase1a, SR 막에 존해하는 Ca2+- 펌프)를 통해 SR로 다시 이동한다. 두 개의 t-관과 그 사이의 SR로 구성되는 트라이어드 접합부(triad junction)에서 위에서 언급된 단백질의 적합한 배열은 골격근의 수축 또는 이완 동안 세포질 칼슘의 일시적인 상승 또는 제거에 필수이다.
골격근 수축에 사용되는 세포질 칼슘(Ca2+)은 SR뿐만 아니라 세포외 공간으로부터도 공급된다. 저장소-작동 칼슘 유입(SOCE, Store-operated Ca2+ entry)은 세포외 칼슘(Ca2+)이 골격근 세포질로 들어가는 것이다.
기질 상호작용 분자 1(STIM1, SR 막에 존재하는 Ca2+ 센서) 및 Orai1(t-관 또는 세포막에 존재하는 세포외 Ca2+ 유입 채널)은 주요 SOCE 매개 단백질이다. 간단히 말해서, 골격근의 SOCE 동안, STIM1은 SR에서 Ca2+의 고갈을 감지한 다음, Orai1과 상호 작용하여 기능적 반점(puncta)을 형성한다. 반점 형성은 Orai1을 활성화하여 세포외 Ca2+이 세포질로 들어갈 수 있도록 한다. SOCE에서 Orai1과 STIM1의 주요 역할 외에도, 다른 단백질도 골격 SOCE에 참여한다. 표준-타입(Canonical-type) TRPC (transient receptor potential cation channels)은 SOCE 메커니즘을 통해 Ca2+ 유입을 매개한다. 골격근에서 STIM2의 역할은 본 발명자들에 의해 앞서 다음과 같은 일부 기능에 대해서만 밝혀진 바 있다[비특허문헌 1]. STIM2의 453번부터 729번까지의 아미노산 영역은 SERCA1a에 결합하고, 골격근 수축 및 SOCE 동안 RyR1을 통해 Ca2+ 이동을 조절하고, STIM2는 SERCA1a 활성의 조절을 통해 골격근에서 세포 내 Ca2+ 분포와 Ca2+ 이동을 모두 조절하여, STIM1과 상이한 역할을 한다.
칼시퀘스트린 1(calsequestrin 1, CASQ1)은 성인의 골격근에서 주요 발현되는 동형으로, SR 내부에 존재한다. CASQ1은 저친화도 및 고용량 Ca2+ 결합 능력(40~50몰 또는 최대 ~80몰의 Ca2+/1몰의 CASQ1)으로 SR 내의 고농도 Ca2+을 완충한다. 이 능력은 SR에 높은 [Ca2+] 저장으로 인해 유해한 삼투 효과 없이, 골격근 수축 동안 SR에서 빠르게 방출될 Ca2+의 준비와 골격근 이완 동안 SR로의 Ca2+의 효율적인 흡수 모두에 중요하다. Ca2+ 완충 능력 외에도 CASQ1에는 Ca2+ 감지 능력이 있다. CASQ1은 SR로부터의 Ca2+ 고갈 정도를 감지하고 형태(즉, 중합) 의존적 방식으로 SR에서 RyR1을 통해 세포질로의 Ca2+ 방출을 조절한다.
SOCE의 조절 장애 및/또는 CASQ1 돌연변이는 관형 집합체 근병 (Tubular Aggregate Myopathy) 또는 악성 고열증과 같은 골격근 질환이 있는 인간 환자 또는 동물 모델에서 보고되었다[비특허문헌 2].
골격근 질환을 포함한 다양한 인간 질병에서 STIM1의 관련도 보고되었다. CASQ1의 C(카르복실기)-말단은 STIM1에 결합하고, 이종 발현 시스템 또는 C2C12 골격근 세포주에서 CASQ1 은 SOCE를 억제한다고 보고되었다[비특허문헌 2].
그러나, CASQ1과 STIM2 사이의 상호작용의 존재와 골격근에서 STIM2와 함께 CASQ1의 기능적 관련성은 알려지지 않았다.
Mi Ri Oh et al., STIM2 regulates both intracellular Ca2+ distribution and Ca2+ movement in skeletal myotubes, Scientific Reports (2017) 7:17936
Shin, D.W. et al.,; A retrograde signal from calsequestrin for the regulation of store-operated Ca2+ entry in skeletal muscle. J. Biol. Chem. 2003, 278, 3286-3292
본 발명자들은 CASQ의 C1(N(아미노)-말미 92개 아미노산 부위) 부분을 통해, CASQ1이 STIM2에 결합을 하고, 이러한 CASQ1-STIM 결합은 저장소-작동 칼슘 유입(SOCE) 및 세포질 칼슘 양은 낮추고, 근세포질세망 안의 칼슘 양은 늘이는 역할을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 CASQ1 또는 이의 C1 부위(N말단 1~92의 아미노산 서열 부위) 발현 촉진제 또는 활성화제를 포함하는 과도한 SOCE에 의해 발병하는 골격근 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 CASQ1 또는 이의 C1 부위(N말단 1~92의 아미노산 서열 부위) 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 낮은 SOCE에 의해 발병하는 골격근 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 외부 칼슘 유입 이상에 기인된 골격근 치료를 위한 약물의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 외부 칼슘 유입 이상에 기인된 골격근 질환 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 외부 칼슘 유입 이상에 기인된 골격근 질환의 예방 또는 치료를 위한 CASQ1-STIM2 결합의 용도에 관한 것이다.
일 구현예로, 본 발명은 CASQ1 또는 이의 C1 부위(N말단 1~92의 아미노산 서열 부위) 발현 또는 활성 촉진제를 포함하는 과도한 SOCE의 증가로 발병하는 골격근 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
일 구현예로, 본 발명은 CASQ1 또는 이의 C1 부위(N말단 7~92의 아미노산 서열 부위) 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 SOCE의 감소로 발병하는 골격근 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
일 구현예로, 본 발명은 외부 칼슘 유입 이상에 기인된 골격근 질환 치료를 위한 약물의 스크리닝 방법을 제공한다.
일 구현예로, 본 발명은 외부 칼슘 유입 이상에 기인된 골격근 질환 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 명세서에서 사용된 용어 " 칼시퀘스트린 1(calsequestrin 1, CASQ1)”은 근세포질세망(sarcoplasmic reticulum) 내의 칼슘-결합 단백질로서, 세포질보다 근세포질세망에서 칼슘의 농도가 더 높을지라도 골격근의 휴지기 또는 이완 과정 동안 칼슘과 결합하여 근세포질세망 내에 칼슘 이온을 저장할 수 있도록 한다. 하나의 칼시퀘스트린 분자가 여러 칼슘(예를 들면, 칼시퀘스트린 한 분자당 40-50개 가량의 칼슘 결합 부위를 가짐)과 결합할 수 있기 때문에 칼슘 저장 능력이 매우 우수하다.
본 발명에서 “C1 부위”는 CASQ1의 N-말단 1~92의 아미노산 부위 또는 7~92 아미노산 부위를 의미한다. 본원 실시예에서는 7~92의 아미노산 부위를 사용하여 실험하였으나, 1~92의 아미노산 부위도 가능하다. 1부터 시작되는 N-말단 20여개 아미노산은 신호 펩티드 (signal peptide)로 이 신호 펩티드의 역할은 CASQ1이 만들어진 후에 CASQ1이 세포의 어느 곳에 위치할 것인가를 결정하는 정보를 가진 곳이며, 통상 이 부분을 그대로 두거나 또는 떼어내어 연구하는 경우가 있기 때문에 1~92 또는 7~92 모두 가능하다.
본 발명에서, “기질 상호작용 분자 2(stromal interaction molecule 2; STIM2)”는 포유동물, 바람직하게는 인간, 래트, 마우스, 토끼, 오랑우탄, 원숭이, 햄스터, 고양이, 돌고래, 고릴라 등에서 기원하는 단백질을 의미한다. 예컨대 상기 STIM2 단백질은 인간 유래의 GenBank accession no. NM_001169117.1, NM_020860.3; 래트(Rattus norvegicus) 유래의 GenBank accession no. NM_001105750.2; 또는 마우스(mus musculus) 유래의 GenBank accession no. 001081103.2 등의 아미노산 서열을 갖는 STIM2 단백질일 수 있다.
본 발명에서, 용어 “저장소-작동 칼슘 유입(SOCE)”이란 세포 내 저장소, 즉 근세포질세망(sarcoplasmic reticulum) 또는 소포체(endoplasmic reticulum)로부터의 칼슘이온이 세포질로 방출되어 근세포질세망 또는 소포체 안에 있던 칼슘이 고갈되는 현상이 하나의 신호가 되어서 세포막(골격근 세포에서는 t-관 막)을 가로질러 외부의 칼슘 이온이 세포질로 유입되는 것을 말한다. 이때 저장소 내 칼슘 센서로 작용하는 것이 STIM1 단백질이며, 세포막에서 외부 칼슘이 유입되는 길로 작용하는 칼슘 채널이 Orai1이라고 알려져 있다.
본 발명에서, 용어 “외부 칼슘 유입 이상에 기인된 골격근 질환”은 SOCE의 양이 과도하게 증가하거나 감소하여 발병하는 골격근 질환으로, 근육의 수축 및 이완에 문제가 야기되며, 몸의 움직임이나 원하는 자세 유지가 어렵거나 불가능해지는 골격근 질환을 의미한다. 구체적으로, 과도한 SOCE의 증가로 발병하는 골격근 질환은 스톰오르켄 증후군(Stormorken syndrome), 요크 혈소판 신드롬(York Platelet syndromes) 또는 뒤시엔느 근위축증(Duchenne Muscular dystrophy) 등이며, 상기 SOCE의 저하로 발병하는 골격근 질환은 연령-연관-근육 기능장애(Age-related Muscle Dysfunction) 등이다.
하기 실시예에서는, CASQ1 또는 C1 부위가 분화골격근세포의 분화과정에는 영향을 주지 않으며, CASQ1의 C1(N-말미 92개 아미노산 부위) 부위를 통해, CASQ1이 STIM2에 결합을 하고, 이러한 CASQ1-STIM 결합은 저장소-작동 칼슘 유입(SOCE) 및 세포질 칼슘 양은 낮추고, 근세포질세망 안의 칼슘 양은 늘이는 역할을 확인하였다. 이를 통해 CASQ1 (또는 C1)을 발현시키면 (즉, CASQ1-STIM2 의 결합 또는 C1에 의한 CASQ1-STIM2 결합의 유사 현상 (C1-STIM2 결합)을 일으켜), 분화골격근세포의 분화에는 영향을 주지 않고 SOCE를 감소시켜, 과도한 SOCE의 증가로 인해 발병하는 골격근 질환의 진행 정도를 개선 및 증상을 완화할 수 있거나, CASQ1 또는 C1 부위 발현을 저해하여 (즉, CASQ1-STIM2 의 결합을 방해하여), 분화골격근세포의 분화에는 영향을 주지 않고 SOCE를 증가시켜, SOCE 감소에 의해 발병하는 골격근 질환의 진행 정도를 개선 및 증상을 완화할 수 있을 것으로 기대된다.
이에, 본 발명은 CASQ1 또는 이의 C1 부위(N 말단 1~92의 아미노산 서열 부위) 발현 촉진제 또는 활성화제를 포함하는 과도한 SOCE에 의해 발병하는 근육 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 포함한다.
또한, CASQ1 또는 이의 C1 부위(N 말단 1~92의 아미노산 서열 부위) 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 낮은 SOCE에 의해 발병하는 골격근 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 포함한다.
본 발명에서, 상기 CASQ1 또는 이의 C1 부위 발현 촉진제 또는 활성 화제는 CASQ1 또는 이의 C1 부위의 발현을 촉진시키거나 활성화시키는 모든 제제를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 CASQ1 또는 이의 C1 부위 발현 또는 활성 저해제는 CASQ1 또는 이의 C1 부위의 발현 또는 활성을 저해하는 약물을 의미한다. 예컨대, 상기 CASQ1 또는 이의 C1 부위 발현 또는 활성 저해제는 CASQ1 또는 이의 C1 부위의 단백질의 발현 또는 활성을 감소시키는 모든 제제를 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 CASQ1 또는 이의 C1 부위 발현 또는 활성 저해제는 CASQ1 발현을 낮추는 위한 siRNA, shRNA, miRNA, CASQ1에 대한 항체,; 또는 CASQ1 또는 이의 C1 부위 활성을 저해하는 화합물 중 어느 하나일 수 있다.
본 명세서에서, “siRNA”는 표적 유전자의 mRNA의 절단을 통해 RNA 간섭현상을 유도하는 이중 사슬 RNA를 의미하며, 표적 유전자의 mRNA와 같은 서열을 가지는 센스 서열의 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 서열의 RNA 가닥으로 구성된다.
상기 siRNA는 시험관 내에서 합성한 siRNA 자체 또는 siRNA를 코딩하는 염기서열을 발현 벡터에 삽입하여 발현되는 형태를 포함할 수 있다.
또한, 상기 shRNA(short hairpin RNA)는 인간 또는 마우스 상의 shRNA 공통 염기서열 부위를 표적으로 하여 통상의 방법에 따라 제작된 것을 사용할 수 있다.
본 발명에서, “항체”는 CASQ1 또는 이의 C1 부위 단백질에 대한 다클론 항체, 단일클론 항체, 인간 항체 및 인간화 항체를 사용할 수 있다.
상기 항체 단편의 예로는, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디(diabody); 선형 항체[Zapata et al. Protein Eng. 8(10):1057-1062(1995)]; 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이성 항체 등이 포함된다.
항체를 파파인(papain)으로 분해하면 2개의 동일한 항원 결합 단편, 즉 단일 항원 결합 부위가 있는 각 “Fab”단편, 및 그 나머지인 “Fc”단편이 생성된다. 펩신을 처리하면, 2개의 항원 결합 부위가 있으며 여전히 항원에 교차결합할 수 있는 F(ab')2 단편이 생성된다. Fv는 완전한 항원 인식 및 결합 부위를 포함하는 최소한의 항체 단편이다. 이 부위는 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 영역의 이합체로 구성되며 비공유결합으로 단단히 결합되어 있다.
다클론 항체의 제조방법은 당업자에게 공지되어 있다. 다클론 항체는 포유 동물에 1회 이상 면역화제를 주입, 필요한 경우 면역 보강제와 함께 주입하여 제조할 수 있다. 통상, 면역화제 및/또는 면역 보강제는 포유 동물에 피하주사 또는 복강내 주사로 수회 주입된다. 면역화제는 본 발명의 단백질 또는 이의 융합 단백질일 수 있다. 면역화되는 포유동물에 면역원성이 있는 것으로 공지된 단백질과 함께 면역화제를 주사하는 것이 효과적일 수 있다.
본 발명에 따른 단일클론 항체는 문헌[Kohler et al. Nature, 256:495(1975)]에 기재된 하이브리도마 방법으로 제조하거나 또는 재조합 DNA 방법(예를 들어, 미국 특허 제4,816,576호 참조)으로 제조할 수 있다. 단일클론 항체는 또한, 문헌[Clackson et al. Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al. J. Mol. Biol., 222:581-597(1991)]에 기재된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리할 수 있다.
본 발명에서의 단일클론 항체는 구체적으로, 목적하는 활성을 발휘한다면 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분이 특정 종으로부터 유래된 항체 또는 특정 항체 클래스 또는 서브 클래스에 속하는 항체에 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이 있지만, 쇄(들)의 나머지는 다른 종으로부터 유래된 항체 또는 다른 항체 클래스 또는 서브 클래스에 속하는 항체 또는 그러한 항체의 단편과 동일하거나 상동성이 있는 “키메라” 항체를 포함한다(Morrison et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855(1984)).
비-인간(예컨대, 쥐과 동물) 항체의 “인간화” 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유도된 최소 서열을 포함하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 이의 단편(예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원 결합 서열)이다. 대부분의 경우 인간화 항체는 수용자의 상보성 결정(CDR)의 잔기를 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 생쥐, 쥐 또는 토끼와 같은 인간 이외의 종(공여자 항체)의 CDR 잔기로 치환시킨 인간 면역글로불린(수용자 항체)을 포함한다. 몇몇 경우에 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 치환된다. 또한, 인간화 항체는 수용 항체, 또는 도입되는 CDR 또는 프레임워크 서열에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 인간화 항체는 하나 이상, 일반적으로 둘 이상의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함하며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 면역글로불린의 영역에 대응하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 서열의 영역에 해당한다. 또한, 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 일반적으로 인간 면역글로불린 영역의 일부를 포함한다(Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992)).
상기 약학 조성물은 CASQ1 또는 이의 C1 부위 발현 또는 활성 촉진제 및/또는 CASQ1 또는 이의 C1 부위 발현 또는 활성 저해제를 통해 CASQ1 또는 이의 C1-STIM2의 결합에 의한 비정상적인 칼슘 분포를 정상 수준으로 조절할 수 있으므로, SOCE 증가 또는 감소로 인해 발병하는 골격근 질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 의약 분야에서 통상적으로 사용되는 담체 및 비히클을 포함하며, 구체적으로 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 각종 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨 및 아연염), 교질성실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오즈계 기질, 폴리에틸렌글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈, 폴리아릴레이트, 왁스 또는 양모지 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물은 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 한스 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 완충 용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소디움카르복시메틸셀룰로오즈, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다.
본 발명의 조성물은 전신계 또는 국소적으로 투여될 수 있으며, 이러한 투여를 위해 공지의 기술로 적하반 제형으로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 불활성 희석제 또는 식용 담체와 혼합하거나, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐에 밀봉되거나 또는 정제로 압형하여 투여할 수 있다. 경구 투여용의 경우, 활성 화합물은 부형제와 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다.
주사용, 비경구 투여용 등의 각종 제형은 당해 기술 분야 공지된 기법 또는 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다. 또한, 유효량의 CASQ1 또는 이의 C1 부위 발현 또는 활성 촉진제 및/또는 CASQ1 또는 이의 C1 부위 발현 또는 활성 저해제를 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등에 적합한 형태로 식염수 또는 완충액에 투여 직전에 용액으로 제제화하여 투여할 수도 있다.
본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
여기에서 사용된 대상체는 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.
본 명세서에서, "유효량"은 목적하는 치료되어야 할 특정 질환의 발병 또는 진행을 지연하거나 전적으로 중지시키는데 필요한 양을 의미하며, 본 발명의 약학 조성물에 포함되는 CASQ1 또는 이의 C1 부위 발현 또는 활성 촉진제 또는 CASQ1 또는 이의 C1 부위 발현 또는 활성 저해제의 유효량은 외부 칼슘 유입 이상에 기인된 골격근 질환에 있어서 비정상적인 칼슘 분포를 정상 수준으로 조절하는데 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 상기 유효량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 다른 성분의 종류 및 함량, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다.
본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
본 명세서에서, “치료”는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화(즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감(부분적이거나 전체적으로), 검출 가능하거나 또는 검출되지 않거나의 여부를 포함한다. 또한, “치료”는 치료를 받지 않았을 때 예상되는 생존율과 비교하여 생존율을 늘이는 것을 의미할 수도 있다. “치료”는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방 조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다. 질병을 “완화”하는 것은 치료를 하지 않은 경우와 비교하여, 질병 상태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되거나 및/또는 진행의 시간적 추이(time course)가 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, “스톰오르켄 증후군(stormorken syndrome)은 STIM1의 지속적인 활성으로 인한 높은 저장소-작동 칼슘 유입(SOCE)이 그 발병의 원인이고, 다체계 질환(multi-systemic disease)이며, 특히 골격근과 관련된 심각한 증상들을 일으키며, 관형 집합체 근병(tubular aggregate myopathy)의 일종으로, 근연축(muscle spasm), 근 무력(muscle weakness), 근육 경련 (muscular cramps), 근육통(myalgia), 지구력 저하(decreased endurance) 등이 나타나고, 그 증상의 정도가 매우 심각하다.
본 발명에 있어서, “요크 혈소판 신드롬(York Platelet syndromes)”은 스톰오르켄 증후근과 유사하게 STIM1의 지속적인 활성으로 인한 높은 저장소-작동 칼슘 유입(SOCE)이 그 발병의 원인이며, 스톰오르켄 증후근과는 달리 관형 집합체 근병(tubular aggregate myopathy)은 나타나지 않는다. 골격 근육병증(Skeletal myopathy) 중 하나이며, 고어 사인(positive Gower's sign), 근 무력(muscle weakness), 근육 경련, 근육통, 구축(contractures) 등의 증상이 일어난다.
본 발명에 있어서, “뒤시엔느 근위축증(Duchenne Muscular dystrophy, DMD)”은 근육퇴행위축 (Muscular dystrophy, MD,)의 일종으로, 과도한 SOCE에 의한 과도한 외부 칼슘 유입(excessive Ca2+ entry via SOCE), 세포질 과다 칼슘 (myoplasmic Ca2+ overload) 등이 발병의 주요 원인이다..
본 발명에 있어서, “연령-연관 근육 기능장애(age-related muscle dysfunction)”는 노화가 일어남에 의해서, 골격근의 근력 감소 및 근 피로가 증가하며, 낮은 SOCE가 그 원인 중의 하나이다.
따라서, CASQ1 또는 이의 C1 부위 와 STIM2의 결합을 이용하여 외부 칼슘 유입 이상에 기인된 골격근 질환 치료제를 스크리닝할 수 있는 가능성이 확인되었다.
이에, 본 발명은, CASQ1 또는 이의 C1 부위 와 STIM2의 결합을 활성화시키는 물질을 결정하는 것을 포함하는, 과도한 SOCE 증가와 관련된 골격근 질환 치료 약물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
또한, CASQ1 또는 이의 C1 부위 와 STIM2의 결합을 방해하는 물질을 결정하는 것을 포함하는 SOCE 감소와 관련된 근육 질환 치료 약물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
일 구현예로, 상기 스크리닝 방법은 분화골격근세포에 외부 칼슘 유입 이상에 기인된 골격근 치료를 위한 약물 후보물질을 처리하고,
CASQ1 또는 이의 C1 부위(N말단 1~92의 아미노산 서열 부위)가 발현되는지 또는 발현되지 않는지의 여부를 확인하는 것을 포함하는 외부 칼슘 유입 이상에 기인된 골격근 치료를 위한 약물의 스크리닝 방법 에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 스크리닝 방법에 따라 상기 후보물질이 CASQ1 또는 이의 C1 부위 발현을 활성화시키면(즉, CASQ1 또는 이의 C1 부위가 STIM2와 결합하게 되어 SOCE 양 및 세포질 내 칼슘이온 농도가 감소하고 근육세포의 근세포질세망 내 칼슘이온 농도가 증가하면) 과도한 SOCE의 증가로 인해 발병하는 골격근 질환 치료제로 판정할 수 있다.
또는, 상기 후보물질이 CASQ1 또는 이의 C1 부위를 발현시키지 않으면(즉, STIM2와 결합되지 않아 SOCE 및 세포질 내 칼슘이온 농도가 증가되고 근육세포의 근세포질세망 내 칼슘이온 농도가 감소하면) SOCE 감소로 인해 발병하는 골격근 질환 치료제로 판정할 수 있다.
본 발명에서 용어, “후보 물질”은 CASQ1 또는 이의 C1 부위 발현을 활성 또는 저해시킬 것으로 예상되는 후보 물질을 의미한다. 이러한 후보 물질에는 유기 또는 무기 화합물과 같은 단일 화합물뿐만 아니라, 단백질, 탄수화물, 핵산분자 (RNA, DNA 등) 및 지질과 같은 고분자 화합물 및 복수의 화합물의 복합체 등이 포함될 수 있다.
본 발명에서 용어, “처리”는 후보물질이 CASQ1 또는 이의 C1 부위 에 직접적으로 접촉하는 것뿐 아니라, 물질이 세포막에 영향을 미치고 그 세포막으로부터 발생한 신호가 CASQ1 또는 이의 C1 부위에 접촉하거나 영향을 미치는 경우도 포함한다. 따라서 본 발명에 있어서, 상기 후보물에는 세포막 투과성인 물질뿐만 아니라, 세포막에 불투과성인 물질도 포함된다. 이때, 후보물질은 유효량의 범위 내에서 처리하도록 한다. “유효량”이란 반응을 유도하기에 충분한 양을 의미하는 것으로, 유효량 범위 이하에서는, 정확한 결과를 얻을 수 없으므로, 유효량 범위 내에서 억제능을 측정하는 것이 바람직하다. 나아가, CASQ1 또는 이의 C1 부위 발현을 활성 또는 저해시키는 물질의 검출은 세포 수준뿐만 아니라 래트, 마우스, 토끼, 햄스터, 기니피그 등의 실험 동물을 이용하여 생체 내에서 수행할 수 있다.
본 발명의 CASQ1 또는 이의 C1 부위 발현이 활성화되는지 또는 저해되는지의 여부는, 단백질-단백질 간 또는 단백질-화합물 간의 반응 여부를 확인하기 위하여 당업계에서 통상 사용되는 기술들을 적용하여 확인할 수 있다. 예를 들어, 면역학적 분석법, 형광 분석법, 효모 이중 혼성법 (yeast two-hybrid), 천연물 및 화학물질 라이브러리 등을 이용한 HTS (high throughput screening), 드럭히트 HTS 또는 세포 기반 스크리닝 (cell-based screening) 등을 이용하는 스크리닝 방법 등을 사용할 수 있으나, 이러한 방법에 제한되는 것은 아니다.
바람직한 하나의 구현예로, CASQ1 또는 이의 C1 부위에 특이적인 항체를 이용하여 CASQ1 또는 이의 C1 부위 및 STIM2의 결합 여부를 검출할 수 있다. 예를 들어, 생성된 항원-항체 복합체 형성량을 후보 물질을 처리하지 않은 대조군에서의 항원-항체 복합체 형성량과 비교하여 결합 여부를 결정할 수 있다. 항원-항체 복합체 형성량의 절대적 또는 상대적 차이는 분자생물학적 또는 조직학적 분석으로 확인 가능하며, 이러한 분석법에는 면역탁본법, 공동면역침전법 면역염색법, 및/또는 면역세포화학법 등이 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 즉, CASQ1 또는 이의 C1 부위 및 STIM2의 결합 여부는 면역탁본법, 공동면역침전법 면역염색법, 및/또는 면역세포화학법 등에 의해 검출될 수 있다.
상기 항원-항체 반응을 이용한 검출 방법에서 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨 (detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다. 본 발명에서 용어, "검출 라벨"은 분광분석적(spectroscopic), 광화학적 (photochemical), 생화학적 (biochemical), 면역화학적 (immunochemical), 화학적(chemical), 다른 물리화학적 (physical) 수단에 의해 검출될 수 있는 조성물을 말한다. 이러한 검출 표지체에는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자 (microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소 등이 있으며, 이로 제한되는 것은 아니다.
상기 과도한 SOCE 증가로 발병하는 골격근 질환은 스톰오르켄 증후군(Stormorken syndrome), 요크 혈소판 신드롬(York Platelet syndromes) 또는 뒤시엔느 근위축증(Duchenne Muscular dystrophy)이나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 SOCE 저하에 의해 발병하는 골격근 질환은 연령-연관 근육 기능장애(Age-related muscle dysfunction)이나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 외부 칼슘 유입 이상에 기인된 골격근 질환 의심 개체로부터 분리한 생물학적 시료로부터 CASQ1 또는 이의 C1 부위 발현 농도를 측정하는 단계; 및 측정된 발현 농도가 정상군보다 높거나 낮게 확인되면 외부 칼슘 유입 이상에 기인된 골격근 질환으로 판정하는 단계;를 포함하는 외부 칼슘 유입 이상에 기인된 골격근 질환 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명에서, 상기 정보 제공 방법에 따라 정상 대조군과 비교하여 CASQ1 또는 이의 C1 부위 발현 농도가 정상인에 비해 높게 나타나는 경우, CASQ1 이 STIM 2와 결합되어 CASQ1-STIM2 결합이 증가되면, 프리한 STIM2의 양이 감소하게 되고 결국 Orai11-STIM2 결합이 감소하면, SOCE 감소로 이어질 수 있습니다. 이러한 이유로, SOCE 저하에 기인된 골격근 질환이 발병하거나 발병 가능성이 높은 것으로 판단할 수 있다. 이와 반대로, CASQ1 또는 이의 C1 부위 발현 농도가 정상인에 비해 낮게 나타나는 경우, CASQ1 이 STIM 2와 결합이 되지 않아 CASQ1-STIM2 결합이 감소하게 되고, 프리한 STIM2의 양이 증가하여 결국 Orai11-STIM2 결합이 증가하여 SOCE 증가로 이어질 수 있습니다. 이러한 이유로, SOCE 증가에 기인된 골격근 질환이 발병하거나 발병 가능성이 높은 것으로 판단할 수 있다.
이때, CASQ1 또는 이의 C1 부위 발현 농도는 면역탁본법(단백질 양 검사)이나 qRT-PCR(mRNA 양 검사)로 확인할 수 있습니다.
본 발명에 있어서, 상기 생물학적 시료는 조직, 혈액, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇨 또는 변일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
본 발명은 외부 칼슘 유입 이상에 기인된 골격근 질환의 예방 또는 치료를 위한 CASQ1-STIM2 결합의 용도에 관한 것이다.
일 구현예로, 본 발명은 CASQ1 또는 이의 C1 부위(N말단 1~92의 아미노산 서열 부위) 발현 또는 활성 촉진제를 포함하는 과도한 SOCE의 증가로 발병하는 골격근 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
일 구현예로, 본 발명은 CASQ1 또는 이의 C1 부위(N말단 7~92의 아미노산 서열 부위) 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 SOCE의 감소로 발병하는 골격근 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
일 구현예로, 본 발명은 외부 칼슘 유입 이상에 기인된 골격근 질환 치료를 위한 약물의 스크리닝 방법을 제공한다.
일 구현예로, 본 발명은 외부 칼슘 유입 이상에 기인된 골격근 질환 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 명세서에서 사용된 용어 " 칼시퀘스트린 1(calsequestrin 1, CASQ1)”은 근세포질세망(sarcoplasmic reticulum) 내의 칼슘-결합 단백질로서, 세포질보다 근세포질세망에서 칼슘의 농도가 더 높을지라도 골격근의 휴지기 또는 이완 과정 동안 칼슘과 결합하여 근세포질세망 내에 칼슘 이온을 저장할 수 있도록 한다. 하나의 칼시퀘스트린 분자가 여러 칼슘(예를 들면, 칼시퀘스트린 한 분자당 40-50개 가량의 칼슘 결합 부위를 가짐)과 결합할 수 있기 때문에 칼슘 저장 능력이 매우 우수하다.
본 발명에서 “C1 부위”는 CASQ1의 N-말단 1~92의 아미노산 부위 또는 7~92 아미노산 부위를 의미한다. 본원 실시예에서는 7~92의 아미노산 부위를 사용하여 실험하였으나, 1~92의 아미노산 부위도 가능하다. 1부터 시작되는 N-말단 20여개 아미노산은 신호 펩티드 (signal peptide)로 이 신호 펩티드의 역할은 CASQ1이 만들어진 후에 CASQ1이 세포의 어느 곳에 위치할 것인가를 결정하는 정보를 가진 곳이며, 통상 이 부분을 그대로 두거나 또는 떼어내어 연구하는 경우가 있기 때문에 1-92 또는 7-92 모두 가능하다.
본 발명에서, “기질 상호작용 분자 2(stromal interaction molecule 2; STIM2)”는 포유동물, 바람직하게는 인간, 래트, 마우스, 토끼, 오랑우탄, 원숭이, 햄스터, 고양이, 돌고래, 고릴라 등에서 기원하는 단백질을 의미한다. 예컨대 상기 STIM2 단백질은 인간 유래의 GenBank accession no. NM_001169117.1, NM_020860.3; 래트(Rattus norvegicus) 유래의 GenBank accession no. NM_001105750.2; 또는 마우스(mus musculus) 유래의 GenBank accession no. 001081103.2 등의 아미노산 서열을 갖는 STIM2 단백질일 수 있다.
본 발명에서, 용어 “저장소-작동 칼슘 유입(SOCE)”이란 세포 내 저장소, 즉 근세포질세망(sarcoplasmic reticulum) 또는 소포체(endoplasmic reticulum)로부터의 칼슘이온이 세포질로 방출되어 근세포질세망 또는 소포체 안에 있던 칼슘이 고갈되는 현상이 하나의 신호가 되어서 세포막(골격근 세포에서는 t-관 막)을 가로질러 외부의 칼슘 이온이 세포질로 유입되는 것을 말한다. 이때 저장소 내 칼슘 센서로 작용하는 것이 STIM1 단백질이며, 세포막에서 외부 칼슘이 유입되는 길로 작용하는 칼슘 채널이 Orai1이라고 알려져 있다.
본 발명에서, 용어 “외부 칼슘 유입 이상에 기인된 골격근 질환”은 SOCE의 양이 과도하게 증가하거나 감소하여 발병하는 골격근 질환으로, 근육의 수축 및 이완에 문제가 야기되며, 몸의 움직임이나 원하는 자세 유지가 어렵거나 불가능해지는 골격근 질환을 의미한다. 구체적으로, 과도한 SOCE의 증가로 발병하는 골격근 질환은 스톰오르켄 증후군(Stormorken syndrome), 요크 혈소판 신드롬(York Platelet syndromes) 또는 뒤시엔느 근위축증(Duchenne Muscular dystrophy) 등이며, 상기 SOCE의 저하로 발병하는 골격근 질환은 연령-연관-근육 기능장애(Age-related Muscle Dysfunction) 등이다.
하기 실시예에서는, CASQ1 또는 C1 부위가 분화골격근세포의 분화과정에는 영향을 주지 않으며, CASQ1의 C1(N-말미 92개 아미노산 부위) 부분을 통해, CASQ1이 STIM2에 결합을 하고, 이러한 CASQ1-STIM 결합은 저장소-작동 칼슘 유입(SOCE) 및 세포질 칼슘 양은 낮추고, 근세포질세망 안의 칼슘 양은 늘이는 역할을 확인하였다. 이를 통해 CASQ1 (또는 C1)을 발현시키면 (즉, CASQ1-STIM2 의 결합 또는 C1에 의한 CASQ1-STIM2 결합의 유사 현상 (C1-STIM2 결합)을 일으켜), 분화골격근세포의 분화에는 영향을 주지 않고 SOCE를 감소시켜, 과도한 SOCE의 증가로 인해 발병하는 골격근 질환의 진행 정도를 개선 및 증상을 완화할 수 있거나, CASQ1 또는 C1 부위 발현을 저해하여 (즉, CASQ1-STIM2 의 결합을 방해하여), 분화골격근세포의 분화에는 영향을 주지 않고 SOCE를 증가시켜, SOCE 감소에 의해 발병하는 골격근 질환의 진행 정도를 개선 및 증상을 완화할 수 있을 것으로 기대된다.
이에, 본 발명은 CASQ1 또는 이의 C1 부위(N말단 1~92의 아미노산 서열 부위) 발현 촉진제 또는 활성화제를 포함하는 과도한 SOCE에 의해 발병하는 근육 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 포함한다.
또한, CASQ1 또는 이의 C1 부위(N말단 1~92의 아미노산 서열 부위) 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 낮은 SOCE에 의해 발병하는 골격근 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 포함한다.
본 발명에서, 상기 CASQ1 또는 이의 C1 부위 발현 촉진제 또는 활성 화제는 CASQ1 또는 이의 C1 부위의 발현을 촉진시키거나 활성화시키는 모든 제제를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 CASQ1 또는 이의 C1 부위 발현 또는 활성 저해제는 CASQ1 또는 이의 C1 부위의 발현 또는 활성을 저해하는 약물을 의미한다. 예컨대, 상기 CASQ1 또는 이의 C1 부위 발현 또는 활성 저해제는 CASQ1 또는 이의 C1 부위의 단백질의 발현 또는 활성을 감소시키는 모든 제제를 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 CASQ1 또는 이의 C1 부위 발현 또는 활성 저해제는 CASQ1 발현을 낮추는 위한 siRNA, shRNA, miRNA, CASQ1에 대한 항체,; 또는 CASQ1 또는 이의 C1 부위 활성을 저해하는 화합물 중 어느 하나일 수 있다.
본 명세서에서, “siRNA”는 표적 유전자의 mRNA의 절단을 통해 RNA 간섭현상을 유도하는 이중 사슬 RNA를 의미하며, 표적 유전자의 mRNA와 같은 서열을 가지는 센스 서열의 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 서열의 RNA 가닥으로 구성된다.
상기 siRNA는 시험관 내에서 합성한 siRNA 자체 또는 siRNA를 코딩하는 염기서열을 발현 벡터에 삽입하여 발현되는 형태를 포함할 수 있다.
또한, 상기 shRNA(short hairpin RNA)는 인간 또는 마우스 상의 shRNA 공통 염기서열 부위를 표적으로 하여 통상의 방법에 따라 제작된 것을 사용할 수 있다.
본 발명에서, “항체”는 CASQ1 또는 이의 C1 부위 단백질에 대한 다클론 항체, 단일클론 항체, 인간 항체 및 인간화 항체를 사용할 수 있다.
상기 항체 단편의 예로는, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디(diabody); 선형 항체[Zapata et al. Protein Eng. 8(10):1057-1062(1995)]; 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이성 항체 등이 포함된다.
항체를 파파인(papain)으로 분해하면 2개의 동일한 항원 결합 단편, 즉 단일 항원 결합 부위가 있는 각 “”단편, 및 그 나머지인 “”단편이 생성된다. 펩신을 처리하면, 2개의 항원 결합 부위가 있으며 여전히 항원에 교차결합할 수 있는 F(ab')2 단편이 생성된다. Fv는 완전한 항원 인식 및 결합 부위를 포함하는 최소한의 항체 단편이다. 이 부위는 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 영역의 이합체로 구성되며 비공유결합으로 단단히 결합되어 있다.
다클론 항체의 제조방법은 당업자에게 공지되어 있다. 다클론 항체는 포유 동물에 1회 이상 면역화제를 주입, 필요한 경우 면역 보강제와 함께 주입하여 제조할 수 있다. 통상, 면역화제 및/또는 면역 보강제는 포유 동물에 피하주사 또는 복강내 주사로 수회 주입된다. 면역화제는 본 발명의 단백질 또는 이의 융합 단백질일 수 있다. 면역화되는 포유동물에 면역원성이 있는 것으로 공지된 단백질과 함께 면역화제를 주사하는 것이 효과적일 수 있다.
본 발명에 따른 단일클론 항체는 문헌[Kohler et al. Nature, 256:495(1975)]에 기재된 하이브리도마 방법으로 제조하거나 또는 재조합 DNA 방법(예를 들어, 미국 특허 제4,816,576호 참조)으로 제조할 수 있다. 단일클론 항체는 또한, 문헌[Clackson et al. Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al. J. Mol. Biol., 222:581-597(1991)]에 기재된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리할 수 있다.
본 발명에서의 단일클론 항체는 구체적으로, 목적하는 활성을 발휘한다면 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분이 특정 종으로부터 유래된 항체 또는 특정 항체 클래스 또는 서브 클래스에 속하는 항체에 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이 있지만, 쇄(들)의 나머지는 다른 종으로부터 유래된 항체 또는 다른 항체 클래스 또는 서브 클래스에 속하는 항체 또는 그러한 항체의 단편과 동일하거나 상동성이 있는 “키메라” 항체를 포함한다(Morrison et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855(1984)).
비-인간(예컨대, 쥐과 동물) 항체의 “인간화” 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유도된 최소 서열을 포함하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 이의 단편(예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원 결합 서열)이다. 대부분의 경우 인간화 항체는 수용자의 상보성 결정(CDR)의 잔기를 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 생쥐, 쥐 또는 토끼와 같은 인간 이외의 종(공여자 항체)의 CDR 잔기로 치환시킨 인간 면역글로불린(수용자 항체)을 포함한다. 몇몇 경우에 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 치환된다. 또한, 인간화 항체는 수용 항체, 또는 도입되는 CDR 또는 프레임워크 서열에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 인간화 항체는 하나 이상, 일반적으로 둘 이상의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함하며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 면역글로불린의 영역에 대응하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 서열의 영역에 해당한다. 또한, 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 일반적으로 인간 면역글로불린 영역의 일부를 포함한다(Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992)).
상기 약학 조성물은 CASQ1 또는 이의 C1 부위 발현 또는 활성 촉진제 및/또는 CASQ1 또는 이의 C1 부위 발현 또는 활성 저해제를 통해 CASQ1 또는 이의 C1-STIM2의 결합에 의한 비정상적인 칼슘 분포를 정상 수준으로 조절할 수 있으므로, SOCE 증가 또는 감소로 인해 발병하는 골격근 질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 의약 분야에서 통상적으로 사용되는 담체 및 비히클을 포함하며, 구체적으로 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 각종 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨 및 아연염), 교질성실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오즈계 기질, 폴리에틸렌글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈, 폴리아릴레이트, 왁스 또는 양모지 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물은 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 한스 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 완충 용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소디움카르복시메틸셀룰로오즈, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다.
본 발명의 조성물은 전신계 또는 국소적으로 투여될 수 있으며, 이러한 투여를 위해 공지의 기술로 적하반 제형으로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 불활성 희석제 또는 식용 담체와 혼합하거나, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐에 밀봉되거나 또는 정제로 압형하여 투여할 수 있다. 경구 투여용의 경우, 활성 화합물은 부형제와 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다.
주사용, 비경구 투여용 등의 각종 제형은 당해 기술 분야 공지된 기법 또는 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다. 또한, 유효량의 CASQ1 또는 이의 C1 부위 발현 또는 활성 촉진제 및/또는 CASQ1 또는 이의 C1 부위 발현 또는 활성 저해제를 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등에 적합한 형태로 식염수 또는 완충액에 투여 직전에 용액으로 제제화하여 투여할 수도 있다.
본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
여기에서 사용된 대상체는 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.
본 명세서에서, "유효량"은 목적하는 치료되어야 할 특정 질환의 발병 또는 진행을 지연하거나 전적으로 중지시키는데 필요한 양을 의미하며, 본 발명의 약학 조성물에 포함되는 CASQ1 또는 이의 C1 부위 발현 또는 활성 촉진제 또는 CASQ1 또는 이의 C1 부위 발현 또는 활성 저해제의 유효량은 외부 칼슘 유입 이상에 기인된 골격근 질환에 있어서 비정상적인 칼슘 분포를 정상 수준으로 조절하는데 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 상기 유효량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 다른 성분의 종류 및 함량, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다.
본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
본 명세서에서, “치료”는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화(즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감(부분적이거나 전체적으로), 검출 가능하거나 또는 검출되지 않거나의 여부를 포함한다. 또한, “치료”는 치료를 받지 않았을 때 예상되는 생존율과 비교하여 생존율을 늘이는 것을 의미할 수도 있다. “치료”는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방 조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다. 질병을 “완화”하는 것은 치료를 하지 않은 경우와 비교하여, 질병 상태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되거나 및/또는 진행의 시간적 추이(time course)가 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, “스톰오르켄 증후군(stormorken syndrome)은 STIM1의 지속적인 활성으로 인한 높은 저장소-작동 칼슘 유입(SOCE)이 그 발병의 원인이고, 다체계 질환(multi-systemic disease)이며, 특히 골격근과 관련된 심각한 증상들을 일으키며, 관형 집합체 근병(tubular aggregate myopathy)의 일종으로, 근연축(muscle spasm), 근 무력(muscle weakness), 근육 경련 (muscular cramps), 근육통(myalgia), 지구력 저하(decreased endurance) 등이 나타나고, 그 증상의 정도가 매우 심각하다.
본 발명에 있어서, “요크 혈소판 신드롬(York Platelet syndromes)”은 스톰오르켄 증후근과 유사하게 STIM1의 지속적인 활성으로 인한 높은 저장소-작동 칼슘 유입(SOCE)이 그 발병의 원인이며, 스톰오르켄 증후근과는 달리 관형 집합체 근병(tubular aggregate myopathy)은 나타나지 않는다. 골격 근육병증(Skeletal myopathy) 중 하나이며, 고어 사인(positive Gower's sign), 근 무력(muscle weakness), 근육 경련, 근육통, 구축(contractures) 등의 증상이 일어난다.
본 발명에 있어서, “뒤시엔느 근위축증(Duchenne Muscular dystrophy, DMD)”은 근육퇴행위축 (Muscular dystrophy, MD,)의 일종으로, 과도한 SOCE에 의한 과도한 외부 칼슘 유입(excessive Ca2+ entry via SOCE), 세포질 과다 칼슘 (myoplasmic Ca2+ overload) 등이 발병의 주요 원인이다..
본 발명에 있어서, “연령-연관 근육 기능장애(age-related muscle dysfunction)”는 노화가 일어남에 의해서, 골격근의 근력 감소 및 근 피로가 증가하며, 낮은 SOCE가 그 원인 중의 하나이다.
따라서, CASQ1 또는 이의 C1 부위 와 STIM2의 결합을 이용하여 외부 칼슘 유입 이상에 기인된 골격근 질환 치료제를 스크리닝할 수 있는 가능성이 확인되었다.
이에, 본 발명은, CASQ1 또는 이의 C1 부위 와 STIM2의 결합을 활성화시키는 물질을 결정하는 것을 포함하는, 과도한 SOCE 증가와 관련된 골격근 질환 치료 약물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
또한, CASQ1 또는 이의 C1 부위 와 STIM2의 결합을 방해하는 물질을 결정하는 것을 포함하는 SOCE 감소와 관련된 근육 질환 치료 약물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
일 구현예로, 상기 스크리닝 방법은 분화골격근세포에 외부 칼슘 유입 이상에 기인된 골격근 치료를 위한 약물 후보물질을 처리하고,
CASQ1 또는 이의 C1 부위(N말단 1~92의 아미노산 서열 부위)가 발현되는지 또는 발현되지 않는지의 여부를 확인하는 것을 포함하는 외부 칼슘 유입 이상에 기인된 골격근 치료를 위한 약물의 스크리닝 방법 에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 스크리닝 방법에 따라 상기 후보물질이 CASQ1 또는 이의 C1 부위 발현을 활성화시키면(즉, CASQ1 또는 이의 C1 부위가 STIM2와 결합하게 되어 SOCE 양 및 세포질 내 칼슘이온 농도가 감소하고 근육세포의 근세포질세망 내 칼슘이온 농도가 증가하면) 과도한 SOCE의 증가로 인해 발병하는 골격근 질환 치료제로 판정할 수 있다.
또는, 상기 후보물질이 CASQ1 또는 이의 C1 부위를 발현시키지 않으면(즉, STIM2와 결합되지 않아 SOCE 및 세포질 내 칼슘이온 농도가 증가되고 근육세포의 근세포질세망 내 칼슘이온 농도가 감소하면) SOCE 감소로 인해 발병하는 골격근 질환 치료제로 판정할 수 있다.
본 발명에서 용어, “후보 물질”은 CASQ1 또는 이의 C1 부위 발현을 활성 또는 저해시킬 것으로 예상되는 후보 물질을 의미한다. 이러한 후보 물질에는 유기 또는 무기 화합물과 같은 단일 화합물뿐만 아니라, 단백질, 탄수화물, 핵산분자 (RNA, DNA 등) 및 지질과 같은 고분자 화합물 및 복수의 화합물의 복합체 등이 포함될 수 있다.
본 발명에서 용어, “처리”는 후보물질이 CASQ1 또는 이의 C1 부위 에 직접적으로 접촉하는 것뿐 아니라, 물질이 세포막에 영향을 미치고 그 세포막으로부터 발생한 신호가 CASQ1 또는 이의 C1 부위에 접촉하거나 영향을 미치는 경우도 포함한다. 따라서 본 발명에 있어서, 상기 후보물에는 세포막 투과성인 물질뿐만 아니라, 세포막에 불투과성인 물질도 포함된다. 이때, 후보물질은 유효량의 범위 내에서 처리하도록 한다. “유효량”이란 반응을 유도하기에 충분한 양을 의미하는 것으로, 유효량 범위 이하에서는, 정확한 결과를 얻을 수 없으므로, 유효량 범위 내에서 억제능을 측정하는 것이 바람직하다. 나아가, CASQ1 또는 이의 C1 부위 발현을 활성 또는 저해시키는 물질의 검출은 세포 수준뿐만 아니라 래트, 마우스, 토끼, 햄스터, 기니피그 등의 실험 동물을 이용하여 생체 내에서 수행할 수 있다.
본 발명의 CASQ1 또는 이의 C1 부위 발현이 활성화되는지 또는 저해되는지의 여부는, 단백질-단백질 간 또는 단백질-화합물 간의 반응 여부를 확인하기 위하여 당업계에서 통상 사용되는 기술들을 적용하여 확인할 수 있다. 예를 들어, 면역학적 분석법, 형광 분석법, 효모 이중 혼성법 (yeast two-hybrid), 천연물 및 화학물질 라이브러리 등을 이용한 HTS (high throughput screening), 드럭히트 HTS 또는 세포 기반 스크리닝 (cell-based screening) 등을 이용하는 스크리닝 방법 등을 사용할 수 있으나, 이러한 방법에 제한되는 것은 아니다.
바람직한 하나의 구현예로, CASQ1 또는 이의 C1 부위에 특이적인 항체를 이용하여 CASQ1 또는 이의 C1 부위 및 STIM2의 결합 여부를 검출할 수 있다. 예를 들어, 생성된 항원-항체 복합체 형성량을 후보 물질을 처리하지 않은 대조군에서의 항원-항체 복합체 형성량과 비교하여 결합 여부를 결정할 수 있다. 항원-항체 복합체 형성량의 절대적 또는 상대적 차이는 분자생물학적 또는 조직학적 분석으로 확인 가능하며, 이러한 분석법에는 면역탁본법, 공동면역침전법 면역염색법, 및/또는 면역세포화학법 등이 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 즉, CASQ1 또는 이의 C1 부위 및 STIM2의 결합 여부는 면역탁본법, 공동면역침전법 면역염색법, 및/또는 면역세포화학법 등에 의해 검출될 수 있다.
상기 항원-항체 반응을 이용한 검출 방법에서 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨 (detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다. 본 발명에서 용어, "검출 라벨"은 분광분석적(spectroscopic), 광화학적 (photochemical), 생화학적 (biochemical), 면역화학적 (immunochemical), 화학적(chemical), 다른 물리화학적 (physical) 수단에 의해 검출될 수 있는 조성물을 말한다. 이러한 검출 표지체에는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자 (microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소 등이 있으며, 이로 제한되는 것은 아니다.
상기 과도한 SOCE 증가로 발병하는 골격근 질환은 스톰오르켄 증후군(Stormorken syndrome), 요크 혈소판 신드롬(York Platelet syndromes) 또는 뒤시엔느 근위축증(Duchenne Muscular dystrophy)이나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 SOCE 저하에 의해 발병하는 골격근 질환은 연령-연관 근육 기능장애(Age-related muscle dysfunction)이나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 외부 칼슘 유입 이상에 기인된 골격근 질환 의심 개체로부터 분리한 생물학적 시료로부터 CASQ1 또는 이의 C1 부위 발현 농도를 측정하는 단계; 및 측정된 발현 농도가 정상군보다 높거나 낮게 확인되면 외부 칼슘 유입 이상에 기인된 골격근 질환으로 판정하는 단계;를 포함하는 외부 칼슘 유입 이상에 기인된 골격근 질환 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명에서, 상기 정보 제공 방법에 따라 정상 대조군과 비교하여 CASQ1 또는 이의 C1 부위 발현 농도가 정상인에 비해 높게 나타나는 경우, CASQ1 이 STIM 2와 결합되어 CASQ1-STIM2 결합이 증가되면, 프리한 STIM2의 양이 감소하게 되고 결국 Orai11-STIM2 결합이 감소하면, SOCE 감소로 이어질 수 있습니다. 이러한 이유로, SOCE 저하에 기인된 골격근 질환이 발병하거나 발병 가능성이 높은 것으로 판단할 수 있다. 이와 반대로, CASQ1 또는 이의 C1 부위 발현 농도가 정상인에 비해 낮게 나타나는 경우, CASQ1 이 STIM 2와 결합이 되지 않아 CASQ1-STIM2 결합이 감소하게 되고, 프리한 STIM2의 양이 증가하여 결국 Orai11-STIM2 결합이 증가하여 SOCE 증가로 이어질 수 있습니다. 이러한 이유로, SOCE 증가에 기인된 골격근 질환이 발병하거나 발병 가능성이 높은 것으로 판단할 수 있다.
이때, CASQ1 또는 이의 C1 부위 발현 농도는 면역탁본법(단백질 양 검사)이나 qRT-PCR(mRNA 양 검사)로 확인할 수 있습니다.
본 발명에 있어서, 상기 생물학적 시료는 조직, 혈액, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇨 또는 변일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
도 1는 토끼 골격근 조직에서 CASQ1과 STIM2 의 공동면역침전을 확인한 것이다[토끼 골격근의 용해된 트라이아드 샘플과 CASQ1 항체를 이용하여 공동면역침전법을 수행하고, 얻어진 샘플은 CASQ1 및 STIM2 항체를 이용하여 면역탁본법을 수행한 결과, CASQ1은 STIM2와 결합하였다. ;'Triad sample'은 단순 면역탁본법의 수행을 의미하고, 'Without anti-CASQ1 Ab'는 CASQ1 항체가 없이 실행한 음성 대조군임. IB, IP 또는 Ab는 면역탁본법 실험, 공동면역침전법 실험 또는 항체를 의미한다. *, 'Without anti-CASQ1 Ab'과 비교하여 유의성 있는 다름을 표시하였다 (p < 0.05).]
도 2는 CASQ1 및 CASQ1 부위들에 대한 도식 및 STIM2와의 결합 반응을 확인한 것으로,
도 2a는 CASQ1 및 각 CASQ1 부위들에 대한 도식을 나타낸 것이며[숫자는 아미노산 서열을 나타냄. S1B는 STIM1-결합 부위를 의미한다];
도 2b는 토끼 골격근의 용해된 트라이아드 샘플과 GST-A 또는 GST-B의 결합 반응을 수행한 후, GST 항체(GST가 부착된 CASQ1 부위를 감지하기 위함) 및 STIM2 항체를 이용하여 면역탁본법으로 단백질의 존재를 확인하여, GST-A가 STIM2에 높은 결합을 보임을 확인한 것이고; 도 2c는 GST-C, GST-D 및 GST-E에 대해서 동일한 결합 반응을 실시하여, GST-C가 STIM2에 높은 결합을 보임을 확인한 것이다[GST는 음성 대조군으로 쓰이고, GST-CASQ1은 양성 대조군으로 쓰임. 양성 대조군의 값을 1로 하고, 이에 대한 상대적 변화를 표준화 비율(normalized ratio)로 계산하여 오른쪽에 막대그래프로 나타내었다. *, 'GST 음성 대조군과 비교하여 유의성 있는 다름을 표시하였다 (p < 0.05)].
도 3은 CASQ1의 C 부위들에 대한 도식 및 STIM2와의 결합 반응을 확인한 것으로, 도 3a는 CASQ1의 C 부위들에 대한 도식을 나타낸 것이며[숫자: 아미노산 서열];
도 3b는 토끼 골격근의 용해된 트라이아드 샘플과 GST-C1부터 GST-C5의 결합반응을 수행한 후, GST 항체 및 STIM2 항체를 이용하여 면역탁본법으로 단백질의 존재를 확인하여 GST-C1과 GST-C3가 STIM2에 높은 결합을 보임을 나타낸 것이다[GST: 음성 대조군, GST-C: 양성 대조군. 양성 대조군의 값을 1로 하고, 이에 대한 상대적 변화를 표준화 비율 (normalized ratio)로 계산하여 오른쪽에 막대그래프로 나타내었다. *, 'GST 음성 대조군과 비교하여 유의성 있는 다름을 표시하였다 (p < 0.05)].
도 4는 마우스 분화골격근세포에 야생형 CASQ1 또는 C1 부위의 발현, 분화 상태 비교, CASQ1과 STIM2 의 공동면역침전법 결과를 나타낸 것으로,
도 4a는 분화골격근세포에 RFP 벡터 (vector control, 대조군), 야생형 CASQ1 (WT CASQ1) 또는 C1 부위 (C1)의 발현을 면역세포화학법으로 확인한 것이며[흰색 자: 100 μm. 모두 잘 발현됨을 확인하였다];
도 4b는 분화골격근세포의 가장 두꺼운 부분의 너비를 측정한 결과이고[대조군과 비교하여 분석하였으며, 분석과 통계에 사용된 실험의 횟수와 얻어진 수치는 [표 4] 괄호에 나타나 있다. 대조군의 값을 1로하고, 이에 대한 상대적 변화를 표준화 비율로 계산하여 오른쪽에 막대그래프로 나타내었다. *, 대조군과 비교하여 유의성 있는 다름을 표시하였다 (p < 0.05). 그러나, 분화골격근세포의 너비에 다름이 없었다];
도 4c는 야생형 CASQ1 (WT CASQ1) 또는 C1 부위 (C1)를 발현하는 분화골격근세포를 용해하여 샘플을 얻고, 그 샘플과 CASQ1 항체를 이용하여 공동면역침전법을 수행하고, 얻어진 샘플은 CASQ1 및 STIM2 항체를 이용하여 면역탁본법을 수행한 결과이다[CASQ1은 STIM2와 결합하였다. 'Myotube lysate'은 단순 면역탁본법의 수행을 의미하고, 'Without anti-CASQ1 Ab': CASQ1 항체가 없이 실행한 음성 대조군. IB, IP 또는 Ab는 면역탁본법 실험, 공동면역침전법 실험 또는 항체를 의미한다. *, 'Without anti-CASQ1 Ab'과 비교하여 유의성 있는 다름을 표시하였다 (p < 0.05)].
도 5는 야생형 CASQ1 또는 C1 부위를 발현하는 마우스 분화골격근세포에서 외부 칼슘 유입(SOCE) 비교 및 Orai1과 STIM2의 공동면역침전법 결과를 나타낸 것으로,
도 5a는 야생형 CASQ1 또는 C1 부위를 발현하는 마우스 분화골격근세포에 탑시가진(TG) 처리에 의해서 근세포질세망에 저장된 칼슘의 양을 고갈시킨 후, 그로 인해 발생하는 외부 칼슘 유임(SOCE)을 측정한 것이며;
도 5b는 SOCE의 양을 막대그래프로 (좌), SOCE 시작 점의 반응 속도를 막대그래프로(우) 나타낸 것이다[SOCE의 초기 발생 속도에는 변함이 없으나, SOCE가 야생형 CASQ1 또는 C1 부위의 발현에 의에 감소함. 대조군의 수치를 1로 하고 그에 대한 상대적 변화를 표준화 비율로 표현하였으며, 분석과 통계에 사용된 실험의 횟수와 얻어진 수치는 [표 4]에 괄호에 나타내었다. *, 대조군과 비교하여 유의성 있는 다름을 표시하였다 (p < 0.05)];
도 5c는 야생형 CASQ1 (WT CASQ1) 또는 C1 부위 (C1)를 발현하는 분화골격근세포를 용해하여 샘플을 얻고, 그 샘플과 Orai1 항체를 이용하여 공동면역침전법을 수행하고, 얻어진 샘플은 Orai1 및 STIM2 항체를 이용하여 면역탁본법을 수행한 결과이다[야생형 CASQ1 (WT CASQ1) 또는 C1 부위 (C1)의 발현에 의해서 Orai1은 STIM2와 결합이 현저하게 감소함.'Myotube lysate'은 단순 면역탁본법의 수행을 의미하고, 'Without anti-Orai1 Ab'는 Orai1 항체가 없이 실행한 음성 대조군. IB, IP 또는 Ab는 면역탁본법 실험, 공동면역침전법 실험 또는 항체를 의미한다. 실험의 결과를 우측 막대그래프로 나타내었다. *, 'Without anti-Orai1 Ab'과 비교하여 유의성 있는 다름을 표시하였다 (p < 0.05)].
도 6은 야생형 CASQ1 또는 C1 부위를 발현하는 마우스 분화골격근세포에서 근세포질세망에 저장된 칼슘 및 세포질 칼슘 양 비교한 것으로,
도 6a는 야생형 CASQ1 또는 C1 부위를 발현하는 마우스 분화골격근세포에 탑시가진(TG) 처리에 의해서 근세포질세망에 저장된 칼슘의 양을 간접적으로 측정 및 비교하고 막대그래프로 나타낸 것이며;
도 6b는 야생형 CASQ1 또는 C1 부위를 발현하는 마우스 분화골격근세포의 세포질 칼슘 양 측정 및 비교한 것이다[야생형 CASQ1 또는 C1 부위의 발현에 의에 근세포질세망에 저장된 칼슘의 양은 증가하고, 세포질 칼슘의 양은 감소하였다. 대조군의 수치를 1로 하고 그에 대한 상대적 변화를 표준화 비율로 표현하였으며, 분석과 통계에 사용된 실험의 횟수와 얻어진 수치는 [표 4]에 괄호에 나타나 있다. *, 대조군과 비교하여 유의성 있는 다름을 표시하였다 (p < 0.05)].
도 2는 CASQ1 및 CASQ1 부위들에 대한 도식 및 STIM2와의 결합 반응을 확인한 것으로,
도 2a는 CASQ1 및 각 CASQ1 부위들에 대한 도식을 나타낸 것이며[숫자는 아미노산 서열을 나타냄. S1B는 STIM1-결합 부위를 의미한다];
도 2b는 토끼 골격근의 용해된 트라이아드 샘플과 GST-A 또는 GST-B의 결합 반응을 수행한 후, GST 항체(GST가 부착된 CASQ1 부위를 감지하기 위함) 및 STIM2 항체를 이용하여 면역탁본법으로 단백질의 존재를 확인하여, GST-A가 STIM2에 높은 결합을 보임을 확인한 것이고; 도 2c는 GST-C, GST-D 및 GST-E에 대해서 동일한 결합 반응을 실시하여, GST-C가 STIM2에 높은 결합을 보임을 확인한 것이다[GST는 음성 대조군으로 쓰이고, GST-CASQ1은 양성 대조군으로 쓰임. 양성 대조군의 값을 1로 하고, 이에 대한 상대적 변화를 표준화 비율(normalized ratio)로 계산하여 오른쪽에 막대그래프로 나타내었다. *, 'GST 음성 대조군과 비교하여 유의성 있는 다름을 표시하였다 (p < 0.05)].
도 3은 CASQ1의 C 부위들에 대한 도식 및 STIM2와의 결합 반응을 확인한 것으로, 도 3a는 CASQ1의 C 부위들에 대한 도식을 나타낸 것이며[숫자: 아미노산 서열];
도 3b는 토끼 골격근의 용해된 트라이아드 샘플과 GST-C1부터 GST-C5의 결합반응을 수행한 후, GST 항체 및 STIM2 항체를 이용하여 면역탁본법으로 단백질의 존재를 확인하여 GST-C1과 GST-C3가 STIM2에 높은 결합을 보임을 나타낸 것이다[GST: 음성 대조군, GST-C: 양성 대조군. 양성 대조군의 값을 1로 하고, 이에 대한 상대적 변화를 표준화 비율 (normalized ratio)로 계산하여 오른쪽에 막대그래프로 나타내었다. *, 'GST 음성 대조군과 비교하여 유의성 있는 다름을 표시하였다 (p < 0.05)].
도 4는 마우스 분화골격근세포에 야생형 CASQ1 또는 C1 부위의 발현, 분화 상태 비교, CASQ1과 STIM2 의 공동면역침전법 결과를 나타낸 것으로,
도 4a는 분화골격근세포에 RFP 벡터 (vector control, 대조군), 야생형 CASQ1 (WT CASQ1) 또는 C1 부위 (C1)의 발현을 면역세포화학법으로 확인한 것이며[흰색 자: 100 μm. 모두 잘 발현됨을 확인하였다];
도 4b는 분화골격근세포의 가장 두꺼운 부분의 너비를 측정한 결과이고[대조군과 비교하여 분석하였으며, 분석과 통계에 사용된 실험의 횟수와 얻어진 수치는 [표 4] 괄호에 나타나 있다. 대조군의 값을 1로하고, 이에 대한 상대적 변화를 표준화 비율로 계산하여 오른쪽에 막대그래프로 나타내었다. *, 대조군과 비교하여 유의성 있는 다름을 표시하였다 (p < 0.05). 그러나, 분화골격근세포의 너비에 다름이 없었다];
도 4c는 야생형 CASQ1 (WT CASQ1) 또는 C1 부위 (C1)를 발현하는 분화골격근세포를 용해하여 샘플을 얻고, 그 샘플과 CASQ1 항체를 이용하여 공동면역침전법을 수행하고, 얻어진 샘플은 CASQ1 및 STIM2 항체를 이용하여 면역탁본법을 수행한 결과이다[CASQ1은 STIM2와 결합하였다. 'Myotube lysate'은 단순 면역탁본법의 수행을 의미하고, 'Without anti-CASQ1 Ab': CASQ1 항체가 없이 실행한 음성 대조군. IB, IP 또는 Ab는 면역탁본법 실험, 공동면역침전법 실험 또는 항체를 의미한다. *, 'Without anti-CASQ1 Ab'과 비교하여 유의성 있는 다름을 표시하였다 (p < 0.05)].
도 5는 야생형 CASQ1 또는 C1 부위를 발현하는 마우스 분화골격근세포에서 외부 칼슘 유입(SOCE) 비교 및 Orai1과 STIM2의 공동면역침전법 결과를 나타낸 것으로,
도 5a는 야생형 CASQ1 또는 C1 부위를 발현하는 마우스 분화골격근세포에 탑시가진(TG) 처리에 의해서 근세포질세망에 저장된 칼슘의 양을 고갈시킨 후, 그로 인해 발생하는 외부 칼슘 유임(SOCE)을 측정한 것이며;
도 5b는 SOCE의 양을 막대그래프로 (좌), SOCE 시작 점의 반응 속도를 막대그래프로(우) 나타낸 것이다[SOCE의 초기 발생 속도에는 변함이 없으나, SOCE가 야생형 CASQ1 또는 C1 부위의 발현에 의에 감소함. 대조군의 수치를 1로 하고 그에 대한 상대적 변화를 표준화 비율로 표현하였으며, 분석과 통계에 사용된 실험의 횟수와 얻어진 수치는 [표 4]에 괄호에 나타내었다. *, 대조군과 비교하여 유의성 있는 다름을 표시하였다 (p < 0.05)];
도 5c는 야생형 CASQ1 (WT CASQ1) 또는 C1 부위 (C1)를 발현하는 분화골격근세포를 용해하여 샘플을 얻고, 그 샘플과 Orai1 항체를 이용하여 공동면역침전법을 수행하고, 얻어진 샘플은 Orai1 및 STIM2 항체를 이용하여 면역탁본법을 수행한 결과이다[야생형 CASQ1 (WT CASQ1) 또는 C1 부위 (C1)의 발현에 의해서 Orai1은 STIM2와 결합이 현저하게 감소함.'Myotube lysate'은 단순 면역탁본법의 수행을 의미하고, 'Without anti-Orai1 Ab'는 Orai1 항체가 없이 실행한 음성 대조군. IB, IP 또는 Ab는 면역탁본법 실험, 공동면역침전법 실험 또는 항체를 의미한다. 실험의 결과를 우측 막대그래프로 나타내었다. *, 'Without anti-Orai1 Ab'과 비교하여 유의성 있는 다름을 표시하였다 (p < 0.05)].
도 6은 야생형 CASQ1 또는 C1 부위를 발현하는 마우스 분화골격근세포에서 근세포질세망에 저장된 칼슘 및 세포질 칼슘 양 비교한 것으로,
도 6a는 야생형 CASQ1 또는 C1 부위를 발현하는 마우스 분화골격근세포에 탑시가진(TG) 처리에 의해서 근세포질세망에 저장된 칼슘의 양을 간접적으로 측정 및 비교하고 막대그래프로 나타낸 것이며;
도 6b는 야생형 CASQ1 또는 C1 부위를 발현하는 마우스 분화골격근세포의 세포질 칼슘 양 측정 및 비교한 것이다[야생형 CASQ1 또는 C1 부위의 발현에 의에 근세포질세망에 저장된 칼슘의 양은 증가하고, 세포질 칼슘의 양은 감소하였다. 대조군의 수치를 1로 하고 그에 대한 상대적 변화를 표준화 비율로 표현하였으며, 분석과 통계에 사용된 실험의 횟수와 얻어진 수치는 [표 4]에 괄호에 나타나 있다. *, 대조군과 비교하여 유의성 있는 다름을 표시하였다 (p < 0.05)].
이하, 본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
[실험 과정]
트라이드아드 샘플, 분화골격근세포 용해물(myotube lysate) 준비, 및 공동면역침전법(co-immunoprecipitation assay)
토끼 골격근 (rabbit back and leg fast-twitch skeletal muscle) 에서 트라이아드 낭(triad vesicle)을 얻고, 얻어진 트라이아드 낭에 용해액 (1% Triton X-100, 10 mM Tris-HCl, 1 mM Na3VO4, 10% glycerol, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, a protease inhibitor cocktail, and pH 7.4)을 넣고 4 ℃에서 24시간 동안 용해 (solubilize)하여 트라이아드 샘플을 얻었다. 분화골격근세포(myotube)에 용해 용액(lysis buffer 조성: 1% Triton X-100, 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1 mM Na3VO4, 10% glycerol, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, protease inhibitors (1 μM pepstatin, 1 μM leupeptin, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 20 mg/ml aprotinin, 1 μM trypsin inhibitor))을 처리하여 24 시간 동안 4 ℃에서 용해(solubilize)시켜, 분화골격근세포 용해물을 얻었다. 이때 10-cm 배양 접시에서 분화된 분화골격근세포를 예로 들면, 300 μl의 용해 용액을 세포에 처리되었다.
용해 트라이아드 샘플 또는 분화골격근세포 용해물과 CASQ1 항체 또는 Orai1 항체 (10 μg/m)를 이용하여 공동면역침전법 (co-immunoprecipitation)을 수행하고 얻어진 샘플은 CASQ1, Orai1, 및 STIM2 항체를 이용하여 면역탁본법 (immunoblot assay)을 수행하였다.
GST가 표지된 CASQ1 및 CASQ1 부위별 단백질들에 대한 cDNA 제작과 단백질 발현 방법
마우스 CASQ1 cDNA (GenBank accession number: NM_009813)를 견본으로, 다음 표 1과 표 2에 제시한 PCR 프라이머들을 이용하여 PCR을 수행하였다. 얻어진 PCR 합성체는 pGEX-4T-1 벡터에 삽입하고 염기 서열은 단백질 서열기를 통하여 확인하였으며, E.coli (DH5α)로 형질전환하여 발현하고 GST 비드(bead)를 이용하여 정제하였다. CASQ1을 pGEX-4T-1 벡터에서 pCMS-RFP 벡터로 옮겨 전장 길이(full-length)의 야생형(wild-type) CASQ1 (WT CASQ1)에 대한 포유류 세포 발현용CASQ1 cDNA를 제작하였다. C1에 대한 포유류 세포 발현용 cDNA를 제작하기 위해, 다음 표 3에 제시한 PCR 프라이머들을 이용하여 PCR 을 수행하고 pCMS-RFP 벡터에 넣었다. 완성된 cDNA의 염기 서열은 유전자 염기 서열기를 통하여 재차 확인하였다.
STIM2와 GST-표지 CASQ1 단백질들과의 결합 반응
부위 별 GST-표지 CASQ1 단백질들을 GST 비드와 반응시키고, 이에 토끼 골겨근에서 얻은 트라이아드 샘플 (150 μg)을 섞어서 4 ℃에서 8시간 동안 결합 반응을 진행하였고, 얻어진 비드에 붙은 단백질들은 면역탁본법에 쓰였다.
면역탁본법(Immunoblot assay)
샘플을 10% SDS-PAGE 젤에서 분리하고, 젤 상에서 분리된 단백질들은 PVDF (poly-vinylidenefluoride) 막으로 옮겨 (100 V for 2 시간 동안) 5% 무지방 우유 (non-fat milk)를 1시간 동안 처리한 뒤, 해당 일차 항체(1:1000)를 처리하고, 연이은 해당 이차 항체 (horseradish peroxidase-conjugated secondary antibodies)를 45분 동안 처리한 후, 발색 반응 (SuperSignal ultrachemiluminescent substrate, Pierce)을 통해 시각화 및 분석하였다.
골격근 위성 세포 분리 및 분화골격근세포 (myotube)로의 분화 방법
마우스의 골격근에서 골격근 위성 세포(satellite cells)를 분리하고, 이를 일차배양(primary culture)하여 골격근전구세포(myoblast)를 얻었다. 배양 과정에서, 세포 배양액(F10 Nutrient Mixture 조성: 20% FBS, 100 units/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 2 mM L-glutamine, 20 nM basic fibroblast growth factor)을 처리하여 37 ℃ 조건의 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 사용한 배양 접시로는 용도에 따라서 10-cm 또는 96-well 배양 접시를 사용하였고, 모든 접시는 Matrigel로 코팅하여 사용하였다. 세포가 배양 접시의 70% 가량을 차지할 정도로 증식하였을 때, 분화골격근세포로의 분화 (differentiation)를 유도하였다 (세포 분화액 조성: 세포 배양액에서 20% FBS와 F-10 Nutrient Mixture 대신 5% heat-inactivated horse serum과 low-glucose DMEM을 사용하고, bFGF는 넣지 않음, 18% CO2 인큐베이터를 사용). 분화가 완성된 세포는 분화골격근세포 (myotube)이며, 이하의 실험에 사용되었다.
분화골격근세포(myotube)에 야생형 CASQ1 (WT CASQ1)과 C1 부위의 발현
분화가 유도된 날로부터 3일째가 되는 골격근 미성숙분화세포 (immature myotubes)에 야생형 CASQ1과 C1 부위에 대한 cDNA를 4시간 동안 유전자 전달감염시켰다 (cDNA transfection: 각각의 cDNA는 pCMS-RFP vector 형태로 되어 있으며, 10-cm 배양 접시에 배양된 세포를 예로 들 경우에, 30μl FuGENE6, 20 μg cDNA가 같이 처리됨). cDNA가 전달감염된 세포는 36 시간 동안 추가 분화를 유도하였다. 이 상태의 세포가 야생형 CASQ1과 C1 부위를 발현하는 동시에 분화가 완성된 분화골격근세포이고, 이하의 실험에 사용되었다.
면역세포화학법(Immunocytochemistry)
분화골격근세포에서 야생형 CASQ1과 C1 부위의 발현을 확인하고자, 면역세포화학법(immunocytochemistry)을 수행하였다.
차가운 메탄올 (cold methanol)로 30분 동안 분화골격근세포를 고정 (fix)한 뒤에, GFP 항체 (1:500)과 cy3-conjugated 이차 항체(1:500, Sigma)를 이용하여 수행하였다.
분화골격근세포 너비 측정 방법(Width measurement of myotubes)
분화가 완성된 분화골격근세포의 가장 두꺼운 부분의 길이를 ImageJ 프로그램을 이용하여 측정하였다.
단일 분화골격근세포 칼슘 이미징 기법으로 외부 칼슘 유입 (SOCE), 근세포질세망에 저장된 칼슘 양 및 세포질 칼슘 양 측정방법
칼슘과 결합하게 되면 칼슘이 결합되기 전과는 다른 파장의 형광을 내는 칼슘 형광 염색약 (Ca2+ dye)인 fluo-4 (5 μM, 탑시가진, 아이오노마이신, KCl 반응 측정) 또는 fura-2 (5 μM, 세포질 내 칼슘 양 측정)를 분화골격근세포에 45분 동안 37 ℃를 유지하면서 주입(incubation)하였다. 이때 분화골격근세포는 이미징 용액 (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM KH2PO4, 2 mM CaCl2, 25 mM HEPES, 6 mM glucose, 1.2 mM MgSO4, 0.05% BSA (fraction V), pH 7.4.)이 처리된 상태이다. 분화골격근세포 내의 칼슘 이동 측정을 위해 형광 현미경 (Nikon x40 oil-immersion objective, NA 1.30, ECLIPSE Ti, Nikon) 사용하였다. 칼슘 형광 염색약의 형광 변화는 형광 현미경에 연결된 75-watt Xenon lamp (FSM150Xe, Bentham Instruments, Ltd)와 12-bit CCD 카메라(DVC-340M-OO-CL, Digital Video Camera Company)를 사용하여 컴퓨터로 전송되었고, InCyt Im1 or InCyt Im2 image acquisition and analysis software (v5.29, Intracellular Imaging Inc)를 이용하여 분석되었다. 칼슘 저장소(즉, SR)의 칼슘이 고갈되었을 때 세포 외부에서 세포 내부로 유입되는 칼슘(store-operated Ca2+ entry (SOCE)의 양 측정 실험을 위해, 칼슘이 존재하지 않는 무칼슘(Ca2+-free) 이미징 용액을 분화골격근세포에 5분 동안 처리한 후에, 탑시가진(thapsigargin (TG))을 처리하여 SR 내 칼슘의 고갈을 유도하고, 세포 외부에 2mM 의 칼슘을 처리하여 세포 외부로 유입되는 칼슘의 양 측정하였다. 근세포질세망에서 세포질로 유리될 수 있는 칼슘의 양 측정 실험을 위해서는, 칼슘이 존재하지 않는 무칼슘(Ca2+-free) 이미징 용액을 세포에 5분 동안 처리한 후에, 탑시가진(thapsigargin(TG))을 처리하여 SR 내 칼슘의 고갈을 유도(간접적 칼슘저장소에 저장된 칼슘 양 측정 방법)하여 측정하였다. TG는 Me2SO (< 0.05%) 에 녹여 매뉴얼로 세포에 처리되었으며 Me2SO (< 0.05%) 자체에 의한 세포 칼슘 이동에 있어서의 변화는 없음이 확인되었음. SOCE 및 TG 반응 측정에 대한 결과는 칼슘 이동 그래프의 면적을 통계 처리하였다.
데이터 분석(Statistical analysis)
모든 데이터는 다수의 실험을 통해 얻어진 데이터들을 종합하여 ± SEM으로 표현하였다. 세포질의 칼슘 농도 측정을 제외하고, 대조군에서 얻어진 수치를 1로 하고 그에 대한 상대적 변화를 표현하는 표준화 비율 (normalized ratio)로 나타내었다. 유의차(significant differences)는 unpaired t-test (GraphPad InStat, v2.04)를 이용하여 수행하였고, 유의 차는 P<0.05 일 경우에 별표 (*)로 표시하였다. 그래프 작성은 Origin 2019b 프로그램을 사용하였다.
[실험 결과]
1. CASQ1의 N-말단 영역은 STIM2에 결합된다.
CASQ1이 STIM2에 결합하는지 여부를 조사하기 위해 토끼 골격근에서 얻은 트라이어드 샘플에 CASQ1 항체를 사용한 공동면역침전법을 실시하였고, 면역침전체를 CASQ1 또는 STIM2 항체로 면역탁본법을 실시하였다.
도 1에서 STIM2가 CASQ1과 공동면역침전되어, CASQ1이 STIM2에 결합함을 확인할 수 있다.
CASQ1의 어느 영역이 STIM2에 결합하는데 관여하는지 확인하기 위해, 마우스 CASQ1의 5개 영역(도 1B의 A에서 E까지)에 대한 cDNA를 GST 태그(tag) 형태로 구축하고, E. coli에서 발현시켰다. 마우스 CASQ1의 STIM1 결합(S1B) 영역은 도 2a에 표시된다. (인간 CASQ1의 S1B 영역에 해당하는 353-378개의 아미노산).
CASQ1의 S1B 영역도 STIM2에 대한 결합에 참여 여부를 조사하기 위해, CASQ1을 두 영역(GST-A 및 GST-B)으로 분할하여 S1B 영역이 중단되거나 그대로 유지되었다(GST-E).
첫째, GST-A 또는 GST-B와 STIM2의 결합 반응을 실행하였다(도 2b). GST-CASQ1(즉, 전체 길이 CASQ1)은 STIM2에 성공적으로 결합되었으며 양성 대조군으로 사용되었다. GST만 음성 대조군으로 사용되었다. GST-A(GST-B 아님)는 STIM2에 결합된다. 둘째, GST-C, GST-D 또는 GST-E와 STIM2와의 결합 분석 반응을 실행하였다(도 2c). GST-C는 STIM2에 결합되었지만 GST-D는 STIM2에 결합되지 않았다.
S1B를 보유하고 있는 GST-E도 STIM2에 유의하게 결합되었지만 GST-C보다 훨씬 적다. 이러한 결과는 CASQ1의 C 부위가 주로 CASQ1과 STIM2의 결합에 기여함을 보여준다.
CASQ1의 결합 영역을 C 영역 내에서 좁히기 위해 C 부위의 더 작은 영역들을 제작하고(도 3a), STIM2와의 결합 반응을 수행하였다(도 3b).
GST-C(전장 C 부위)를 양성 대조군으로 사용하였다. GST-C1 또는 GST-C3은 STIM2에 결합되었지만(C3 부위는 C1 부위를 덮음), 다른 것들은 그렇지 않았다. 이러한 결과는 C1 부위(CASQ1의 N-말단 아미노산 92개)가 CASQ1과 STIM2의 결합에 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다.
2. CASQ1 또는 C1 부위는 SOCE를 감소시키고 세포 내 Ca
2+
분포를 변경한다
골격근에서 CASQ1-STIM2 상호작용의 기능적 역할을 조사하기 위해, 전장 야생형 CASQ1(WT CASQ1) 또는 C1 부위(C1)는 세포 시스템에 기인된 아티팩트 및 변형을 피하기 위해 이종 발현 시스템 대신 마우스 1차 분화골격근세포에서 발현되었다. 빈 벡터로 형질감염된 분화골격근세포를 음성 대조군으로 사용하였다.
WT CASQ1 또는 C1이 성공적으로 발현되었다(도 4a). CASQ1이 토끼 골격근에서와 같이 마우스 골격근에서도 STIM2에 결합하는지 확인하기 위해, WT CASQ1 또는 C1이 발현된 분화골격근세포의 용해물에 CASQ1 항체를 사용한 공동면역침전법을 실시하고 면역침전물에 대해 면역탁본법을 실시하였다. CASQ1 또는 STIM2 항체(도 4b). STIM2는 CASQ1과 공동면역침전되어, 마우스 골격근에서 CASQ1이 STIM2에 결합함을 확인하였다.
말단 분화 정도를 추정할 수 있는 분화골격근세포의 폭을 측정하였고, WT CASQ1 또는 C1의 발현에 의한 폭의 유의한 차이는 없었다(도 4c 및 표 4).
SOCE 감소와 연관된 세포 현상을 알아내기 위해 분화골격근세포의 Ca2+ 수준을 측정하였다. 첫째, 세포외 Ca2+가 없을 때 SR에서 방출 가능한 Ca2+ (SR에서Ca2+의 양을 추정할 수 있음)을 TG를 처리하여 SR로부터 고갈시켜 측정하였다(도 5 및 표 4). 세포외 Ca2+의 부재는 SR 고갈 동안 세포외 Ca2+ 유입 없이 SR에서 독점적으로 방출 가능한 Ca2+ 양의 평가를 가능하게 한다.
특히, CASQ1 또는 C1 부위가 발현하면 CASQ1 또는 C1이 STIM2에 결합하여 자유로운 STIM2의 양이 감소하고, 이로 인해 Orail1-STIM2 결합이 감소하여 SOCE가 감소함을 확인하였다 (도 5c). CASQ1이 너무 많거나 STIM2가 너무 많을 때, (둘 중 하나가 많으면 결국 CASQ1-STIM2 결합이 증가하므로) SOCE 저하에 기인된 골격근 질병을 진단할 수 있다. Orai11-STIM2 결합이 감소하면, SOCE 감소에 의한 골격근 질병 진단 가능하며, 즉 Orai1-STIM2 결합이 감소하면, CASQ1-STIM2 결합이 증가한 것을 의미한다.
분화골격근세포의 SR에 있는 Ca2+ 양은 벡터 대조군에 비해, WT CASQ1과 C1 모두에 의해 유의하게 증가하였다. 둘째, 휴식 시 세포질 Ca2+ 수준을 분화골격근세포에서 측정하였다(도 6a 및 표 4). 세포질 Ca2+ 수준은 벡터 대조군에 비해 WT CASQ1과 C1 모두에 의해 유의하게 감소하였다. 이러한 결과는 SOCE의 감소에 더하여 CASQ1-STIM2 상호작용에 의해 SR과 세포질 사이의 세포내 Ca2+ 분포가 변화되었음을 시사한다.
Claims (13)
- CASQ1(calsequestrin 1) 또는 이의 C1(N 말단 1~92의 아미노산 서열 부위) 발현 촉진제 또는 활성화제를 포함하는 과도한 SOCE의 증가로 발병하는 골격근 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제 1 항에 있어서,
상기 CASQ1 또는 이의 C1 부위 발현 또는 활성 촉진제는 STIM2와의 결합을 촉진하는 것인, 약학 조성물.
- 제 1 항에 있어서,
과도한 SOCE 증가로 발병하는 골격근 질환은 스톰오르켄 증후군(Stormorken syndrome), 요크 혈소판 신드롬(York Platelet syndromes) 또는 뒤시엔느 근위축증(Duchenne muscular dystrophy)인, 약학 조성물.
- CASQ1 또는 이의 C1 부위(N 말단 1~92의 아미노산 서열 부위) 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 SOCE의 감소로 발병하는 골격근 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제 4 항에 있어서,
상기 CASQ1 또는 이의 C1 부위 발현 또는 활성 억제제는 STIM2와의 결합을 방해하는 것인, 약학 조성물.
- 제 5 항에 있어서,
상기 SOCE의 감소로 발병하는 골격근 질환은 연령-연관 근육 기능장애(Age-related muscle dysfunction)인, 약학 조성물.
- 분화골격근세포의 외부 칼슘 유입 이상에 기인된 골격근 질환의 치료를 위한 약물 후보물질을 처리하고,
CASQ1 또는 이의 C1 부위(N말단 1~92의 아미노산 서열 부위)가 발현되는지 또는 발현되지 않는지의 여부를 확인하는 것을 포함하는
외부 칼슘 유입 이상에 기인된 골격근 질환 치료를 위한 약물의 스크리닝 방법.
- 제 7 항에 있어서,
상기 후보물질이 CASQ1 또는 이의 C1 부위의 발현이 활성화되면 CASQ1 또는 이의 C1 부위가 STIM2와 결합이 촉진되어 SOCE 양 및 세포질 내 칼슘이온 농도가 감소하고 근육세포의 근세포질세망 내 칼슘이온 농도가 증가하게 되므로 과도한 SOCE의 증가로 발병하는 골격근 질환 치료제로 판정하는 것인, 약물의 스크리닝 방법.
- 제 8 항에 있어서,
상기 후보물질이 CASQ1 또는 이의 C1 부위의 발현을 저하시키면 STIM2와 결합하게 되지 않아 SOCE 및 세포질 내 칼슘이온 농도가 증가되고 근육세포의 근세포질세망 내 칼슘이온 농도가 감소하게 되므로 SOCE의 감소로 발병하는 골격근 질환 치료제로 판정하는 것인, 약물의 스크리닝 방법.
- 제 8 항에 있어서,
상기 과도한 SOCE의 증가로 발병하는 골격근 질환은 스톰오르켄 증후군(Stormorken syndrome), 요크 혈소판 신드롬(York Platelet syndromes) 또는 뒤시엔느 근위축증(Duchenne Muscular dystrophy)인, 약물의 스크리닝 방법.
- 제 9 항에 있어서,
상기 SOCE의 감소로 발병하는 골격근 질환은 연령-연관 근육 기능장애(Age-related Muscle Dysfunction)인, 약물의 스크리닝 방법.
- 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서,
CASQ1 또는 이의 C1 부위가 STIM2와의 결합 여부는 면역탁본법, 공동면역침전법, 면역염색법 및 면역세포화학법 중에서 선택된 하나 이상에 의해 검출되는 것인, 약물의 스크리닝 방법.
- 외부 칼슘 유입 이상에 기인된 골격근 질환 의심 개체로부터 분리한 생물학적 시료로부터 CASQ1 또는 이의 C1 부위 발현 농도를 측정하는 단계; 및
측정된 발현 농도가 정상군보다 높거나 낮게 확인되면 외부 칼슘 유입 이상에 기인된 골격근 질환으로 판정하는 단계;
를 포함하는, 외부 칼슘 유입 이상에 기인된 골격근 질환 진단을 위한 정보 제공 방법.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210160109A KR102709989B1 (ko) | 2021-11-19 | 외부 칼슘 유입 이상에 기인된 골격근 질환의 진단 및 예방 또는 치료를 위한 casq1-stim2 결합의 용도 | |
| PCT/KR2022/016018 WO2023090662A1 (ko) | 2021-11-19 | 2022-10-20 | 외부 칼슘 유입 이상에 기인된 골격근 질환의 진단 및 예방 또는 치료를 위한 casq1-stim2 결합의 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210160109A KR102709989B1 (ko) | 2021-11-19 | 외부 칼슘 유입 이상에 기인된 골격근 질환의 진단 및 예방 또는 치료를 위한 casq1-stim2 결합의 용도 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230073574A true KR20230073574A (ko) | 2023-05-26 |
| KR102709989B1 KR102709989B1 (ko) | 2024-09-26 |
Family
ID=
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Mi Ri Oh et al., STIM2 regulates both intracellular Ca2+ distribution and Ca2+ movement in skeletal myotubes, Scientific Reports (2017) 7:17936 |
| Shin, D.W. et al.,; A retrograde signal from calsequestrin for the regulation of store-operated Ca2+ entry in skeletal muscle. J. Biol. Chem. 2003, 278, 3286-3292 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2023090662A1 (ko) | 2023-05-25 |
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