KR101480365B1 - Ｍｇ53 저해제를 포함하는 브로디병과 브로디신드롬의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Ｍｇ53 저해제를 포함하는 브로디병과 브로디신드롬의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 MG53 (mitsugumin 53) 저해제를 포함하는, 브로디병 또는 브로디신드롬의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 및 이를 이용한 질환 치료 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 MG53 및 SERCA1a (sarcoplasmic reticulum Ca2 +-ATPase 1a)의 상호작용을 억제하는 약제를 브로디병 또는 브로디신드롬을 비롯한 근육 질환 치료제로 결정함으로써, 근육 질환 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

Description

ＭＧ53 저해제를 포함하는 브로디병과 브로디신드롬의 예방 또는 치료용 조성물 {Composition for preventing or treating Brody Disease and Brody Syndrome comprising MG53 inhibitor}
본 발명은 MG53 (mitsugumin 53) 저해제를 포함하는, 브로디병 또는 브로디신드롬의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 및 이를 이용한 질환 치료 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 MG53 및 SERCA1a (sarcoplasmic reticulum Ca2 +-ATPase 1a)의 상호작용을 억제하는 약제를 브로디병 또는 브로디신드롬을 비롯한 근육 질환 치료제로 결정함으로써, 근육 질환 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
브로디병 (Brody Disease) 또는 브로디신드롬 (Brody Syndrome)이란 상염색체에 기인된 유전적 골격근육병증 (inherited skeletal myopathy)으로, SERCA1a 유전자에 돌연변이가 일어나거나 또는 SERCA1a의 유전자는 정상이나 기타 알려지지 않은 원인에 의해서 SERCA1a의 기능 저하가 발생하여 근육의 이완이 완벽하게 일어나지 않고 이로 인해서 근육 이완과정에서 이완지연 (delayed muscle relaxation)이 발생하는 질환이다. 이에 따라, 신체의 움직임 또는 운동 과정에서 근육 경직과 경련통 (exiercise-induced muscle stiffness and cramping)이 수반되고, 일반적으로 날씨가 추워질수록 더욱 심해진다. 증상은 아동기부터 나타나며, 다리, 팔, 얼굴 (특히 눈꺼풀)에 심하게 나타나 이동 (movement) 장애와 표정 (expression) 장애를 일으킨다. 증상이 심한 환자의 경우에는 신체의 움직임이나 운동이 골격근 조직의 파괴 (rhabdomyolysis)로 이어진다.
브로디병은 희귀 질환으로 그 실태가 아직 잘 조사되어 있지 않다. 브로디병의 주요 원인은 SERCA1a 의 기능 저하로 알려져 있는데, SERCA1a은 ATP 를 에너지로 사용하여, 골격근 수축시 근세포질세망 (sarcoplasmci reticulum (SR)) 으로부터 칼슘채널을 통해 세포질로 빠져 나온 다량의 칼슘이 다시 근세포질세망 안으로 돌아가도록 (uptake) 함으로써, 골격근이 이완하는데 필수적인 역할을 한다. 따라서 SERCA1a 의 역할은 골격근의 이완은 물론 다음 수축을 위해서 매우 중요하여, 골격근 수축과 이완의 필수 핵심 단백질이다. 현재까지 SERCA1a의 기능을 조절하는 단백질로는 싸르코리핀 (sarcolipin) 이 유일하게 알려져 있다.
따라서, SERCA1a 의 기능을 활성을 높여 골격근의 수축과 이완을 개선하는 방법으로, 브로디병 또는 브로디신드롬 환자의 치료 및 증상을 개선할 수 있을 것으로 기대되며, 이를 위하여 SERCA1a 의 활성을 높일 수 있는 새로운 타겟또는 약제의 개발이 절실하다.
한편, MG53 단백질은 골격근 (skeletal muscle)과 심근 (heart)에서만 발현되는 특이 단백질로, TRIM (tripartite motif) 도메인, PRY 도메인, SPRY 도메인으로 이루어져 있고, 상기 TRIM 도메인은 다시 Ring 도메인 (ubiquitin E3 ligase 활성 보유), B-박스 (아연-결합 부위 보유), 코일-코일 도메인으로 이루어져 있는데, 이들에 대한 각각의 기능은 잘 알려져 있지 않다. MG53의 세포 내 기능으로는 골격근의 세포막 손상 (injury) 시에 막복구 (membrane repair system)에 참여함이 알려져 있다. 세포막 손상이 일어나면, 세포질에 상시 존재하는 낭 (vesicle)들이 손상 부위로 움직여 가서 손상으로 인해 벌어진 세포막을 신속히 메워 (resealing), 막 손상 부위를 복구하게 된다. 이 과정에서 낭의 막 (vesicular membrane)에 MG53 단백질이 결합 (MG53-coated vesicles) 되어 있음이 필수 과정이다. 또한 dysferlin, polmerase I and transcript release factor, non-muscle myosin type IIA 등과 같은 단백질이 MG53 과 함께 막복구에 참여한다.
그러나, 현재까지 MG53 이 골격근 고유의 기능인 골격근 수축과 이완에 미치는 영향에 대하여 명확히 규명되어 있지 않으며, 특히 MG53 과 SERCA1a 의 상호작용에 대해서는 전혀 알려져 있지 않다.
본 발명자들은 MG53 이 골격근 고유의 기능에 미치는 영향에 대한 연구를 수행하는 중, MG53 이 SERCA1a 에 직접적으로 결합한다는 것을 최초로 발견하고, 나아가 MG53 이 SERCA1a 의 활성을 낮은 상태로 유지되도록 조절한다는 것을 확인하게 되었다. 따라서, MG53 을 저해하여 SERCA1a 의 활성을 높임으로써 브로디병과 브로디신드롬 환자의 치료 및 증상을 개선할 수 있을 뿐만 아니라, MG53 과 SERCA1a의 상호작용을 이용하여 SERCA1a과 관련된 각종 근육 질환의 치료제를 스크리닝할 수 있는 가능성을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
Nora Shields and Nicholas F Taylor, Journal of Physiotherapy (2010) 56: 187-193. Rafael-Fortney et al., Circulation (2011) 124:582-588. C.L. Chen et al., Research in Developmental Disabilities 33 (2012) 1087-1094. Prader-Willi syndrome; Edouard et al., J Clin Endocrinol Metab (2012) 97:E275-E281. Tay-Sachs disease; Shapiro et al., Genetics IN Medicine, (2009) 11 (6): 425-433.
본 발명의 하나의 목적은 MG53 의 발현 또는 활성을 저해하는 물질을 포함하는, 브로디병 또는 브로디신드롬의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 MG53 의 발현 또는 활성을 저해하는 물질을 포함하는 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 브로디병 또는 브로디신드롬의 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 MG53 및 SERCA1a 의 상호작용을 저해하는 물질을 결정하는 단계를 포함하는, 근육 질환 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 MG53 이 SERCA1a 에 직접적으로 결합하여, SERCA1a 의 활성을 낮은 상태로 유지되도록 조절한다는 발견에 기초한 것으로, MG53 과 SERCA1a 의 상호작용 및 이러한 상호작용이 골격근 고유의 기능인 수축 및 이완의 조절에 중요한 역할을 한다는 것을 최초로 규명한 것이다.
따라서, 하나의 양태로서 본 발명은 MG53 의 발현 또는 활성을 저해하는 물질을 포함하는, 브로디병 또는 브로디신드롬의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
이를 위한 바람직한 양태로서, 본 발명은 MG53 의 발현을 억제하는 MG53 에 특이적인 siRNA, shRNA 또는 안티센스 핵산을 포함하는, 브로디병 또는 브로디신드롬의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
또 하나의 바람직한 양태로서, 본 발명은 MG53 의 활성을 억제하는 MG53 에 특이적인 항체를 포함하는, 브로디병 또는 브로디신드롬의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 MG53 및 SERCA1a 의 상호작용을 저해하는 물질을 결정하는 단계를 포함하는, 근육 질환 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
이를 위한 바람직한 양태로서, 본 발명은 (a) MG53 및 SERCA1a 를 발현하는 세포에 후보 화합물을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 세포에서 MG53 및 SERCA1a 의 상호작용이 저해되는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 근육 질환 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
또 하나의 바람직한 양태로서, 본 발명은 (a') 분리된 MG53 및 분리된 SERCA1a 의 혼합물에 후보 화합물을 처리하는 단계; 및 (b') MG53 및 SERCA1a 의 상호작용이 저해되는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 근육 질환 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에서 용어, "MG53 (mitsugumin 53)"은 골격근 및 심근에서 발현되는 단백질로, TRIM 도메인, PRY 도메인, SPRY 도메인으로 이루어져 있다. TRIM 도메인은 다시 Ring 도메인, B-박스, 코일-코일 도메인으로 구성된다. 마우스 MG53 유전자의 염기서열 및 단백질의 아미노산 서열은 NCBI의 등록번호 NM_001079932 (NM_001079932.3) 및 NP_001073401 (NP_001073401.1) 에서 얻을 수 있으며, 상기 마우스의 MG53 단백질의 아미노산 서열을 서열번호 1로 나타내었다. 인간 MG53 유전자의 염기서열 및 단백질의 아미노산 서열은 NCBI의 등록번호 NM_001008274 (NM_001008274.3) 및 NP_001008275 (NP_001008275.2) 에서 얻을 수 있으며, 상기 인간 MG53 단백질의 아미노산 서열을 서열번호 2로 나타내었다. 그러나 상기 서열은 대표적인 예시일 뿐, 본 발명에서 언급하는 MG53 단백질이 상기 서열의 단백질에 한정되는 것은 아니며, MG53 와 동등한 활성을 가지는 아형, 유사체, 변형체 또는 단편 등도 본 발명의 범위에 포함되며, 종(species) 을 불문하고 본 발명의 범위에 포함될 수 있다.
본 발명에서 용어, "SERCA1a (sarcoplasmic reticulum Ca2 +-ATPase 1a)"은 P-type 이온수송 ATPase 패밀리에 속하는 단백질로, ATP를 에너지로 사용하여 근육의 수축 과정에서 근육 세포의 세포질에 다량으로 존재하는 칼슘을 근세포질세망 (sarcoplasmci reticulum; SR) 안으로 유입하여 SR membrane과 세포질 사이의 칼슘농도 비율을 조절하고 골격근의 수축 및 이완을 조절하는 역할을 한다. 인간 SERCA1a 의 염기서열 및 단백질의 아미노산 서열은 NCBI의 등록번호 BX537784.1 에서 얻을 수 있으며, SERCA1a 단백질의 아미노산 서열을 서열번호 3으로 나타내었다. 그러나 상기 서열은 대표적인 예시일 뿐, 본 발명에서 언급하는 SERCA1a 단백질이 상기 서열의 단백질에 한정되는 것은 아니며, SERCA1a 와 동등한 활성을 가지는 아형, 유사체, 변형체 또는 단편 등도 본 발명의 범위에 포함되며, 종(species) 을 불문하고 본 발명의 범위에 포함될 수 있다.
본 발명자들은 MG53 이 골격근 고유의 기능에 미치는 영향에 대한 연구를 수행하기 위하여, MG53의 각 도메인 별로 GST-결합 단백질을 제작하여 E. coli 에서 발현 및 정제하고 (GST-TRIM, GST-PRY, GST-SPRY, GST-PRY-SPRY, GST-MG53 (전체 길이)), 이에 골격근의 수축과 이완에 관여하는 단백질들을 명하는 트라이아드 단백질들 (triad proteins)이 농축된 시료를 섞어서 결합 실험 (binding assay)을 진행하여, 각 도메인 별 MG53 단백질들에 결합하는 트라이아드 단백질들을 찾았고, 이 단백질들의 정체를 밝히고자 사극자 비행시간 질량분법 (quadrupole time-of-flight mass spectrometry (qTOF MS)) 분석과 데이터베이스 탐색 (database search)을 수행하였다. 그 결과, SERCA1a 가 MG53 에 직접적으로 결합한다는 것을 확인하였고, MG53 과 SERCA1a의 직접적 결합을 토끼 골격근 시료 (vesicle sample from rabbit skeletal muscle)와 분화된 쥐 골격근 세포 (mouse primary skeletal myotube)에서 재 확인하여(도 3a 및 도 3b), 종 (species)에 관계없이 골격근 전반에 적용할 있는 결과임을 확인하였다.
본 발명자들은 MG53 이 SERCA1a 에 결합 한다는 결과를 바탕으로, SERCA1a 의 기능이 MG53에 의해서 직접적으로 조절되는지를 확인하고자, 쥐 골격근 세포 (mouse primary skeletal myotube)에서 siRNA 방법을 이용하여 MG53 단백질을 넉다운 (knockdown) 하였고, 이 MG53 넉다운 분화 골격근 세포에서 SERCA1a 의 활성을 측정하고자 방사선으로 표식된 45칼슘-유입 실험 (45Ca2 +-uptake experiment)을 수행하였다. 그 결과, MG53 이 넉다운 된 분화 골격근 세포의 경우 정상 골격근 세포에 비해서 현격히 높은 SERCA1a 활성 (35% 이상 증가)을 나타낸다는 것을 확인하였다 (도 4c). 이는 MG53 이 SERCA1a 에 결합함에 의해서 SERCA1a의 활성을 낮은 상태로 유지하는 기능을 함을 의미한다.
결론적으로, 골격근 세포에서 MG53 이 SERCA1a 에 직접적으로 결합하여 SERCA1a 의 활성을 조절하고, 골격근의 수축과 이완에 중요한 역할을 하는 것으로 확인되었다. 따라서, 현재까지 SERCA1a의 기능을 조절하는 단백질로 유일하게 알려져 있는 싸르코리핀 (sarcolipin) 단백질 외에, SERCA1a 의 기능을 조절하는 두 번째 단백질로 MG53 이 최초로 규명되었다. 또한, MG53 을 저해하여 SERCA1a 의 활성을 높임으로써 브로디병과 브로디신드롬 환자의 치료 및 증상을 개선할 수 있을 뿐만 아니라, MG53 과 SERCA1a의 상호작용을 이용하여 골격근의 수축과 이완 장애와 관련된 각종 근육 질환의 치료제를 스크리닝할 수 있는 가능성이 확인되었다.
따라서, 본 발명은 MG53 의 발현 또는 활성을 저해하는 물질을 포함하는, 브로디병 또는 브로디신드롬의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
일예로, 본 발명의 조성물은 MG53 유전자의 발현을 억제하기 위하여 MG53 mRNA 에 특이적인 siRNA, shRNA 또는 안티센스 핵산을 유효성분으로 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "siRNA"는 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNAi(RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 짧은 이중사슬 RNA를 의미한다. 표적 유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운 방법으로서 또는 유전자 치료의 방법으로 제공될 수 있다.
siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 더욱 바람직하게는 20 내지 70 염기이다. siRNA 말단 구조는 표적 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의해 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 또는 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3' 말단 돌출한 구조와 5' 말단 쪽이 돌출한 구조 모두 가능하다. 돌출하는 염기 수는 한정되지 않는다. 또한 siRNA는 표적 유전자의 발현 억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서 예를 들어, 한쪽 말단의 돌출 부분에 저분자 RNA(예를 들어, tRNA, rRNA, 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA 분자 또는 인공의 RNA 분자)를 포함할 수 있다. siRNA 말단 구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고, 이중 사슬 RNA 일반의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스텝 루프형 구조일 수도 있다.
본 발명에서 사용되는 siRNA는 그 자체로 폴리뉴클레오타이드 페어링을 갖는 완전한 형태, 즉 시험관에서 siRNA를 직접 합성한 두 형질전환 과정을 거쳐 세포 안으로 도입되는 형태이거나, 생체 내에 투여된 후 이러한 형태를 갖도록 하나의 단일쇄 올리고뉴클레오타이드 단편과 이의 역방향(reverse) 상보물이 스페이서에 의해 분리된 단일쇄 폴리뉴클레오타이드로부터 유도될 수 있는 형태, 예를 들어 siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된 siRNA 발현 벡터 또는 PCR-유도된 siRNA 발현 카세트를 형질전환 또는 감염(infection) 과정을 거쳐 세포 안으로 도입되는 형태일 수 있다.　siRNA를 제조하고 세포 또는 동물로 도입하는 방법의 결정은 목적 및 표적 유전자 산물의 세포 생물학적 기능에 따라 달라질 수 있다.　본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 siRNA는 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18 또는 서열번호 19 로 표시되는 핵산서열을 가질 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "shRNA" 는 siRNA의 고가의 생합성 비용, 낮은 세포 형질감염 효율로 인한 RNA 간섭 효과의 단시간 유지 등의 단점을 극복하기 위한 것으로 RNA 중합효소 Ⅲ의 프로모터로부터 아데노 바이러스, 렌티 바이러스 및 플라스미드 발현 벡터 시스템을 이용하여 이를 세포 내로 도입하여 발현시킬 수 있으며, 이러한 shRNA는 세포 내에 존재하는 siRNA 프로세싱 효소(Dicer or Rnase Ⅲ)에 의해 정확한 구조를 갖는 siRNA로 전환되어 목적 유전자의 사일런싱을 유도함이 널리 알려져 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "안티센스 핵산"이란 특정 mRNA 의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 특징이 있다. 본 발명의 안티센스 서열은 MG53 mRNA에 상보적이고 MG53 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고, MG53 mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 핵산의 길이는 6 내지 100 염기이고, 바람직하게는 8 내지 60 염기이고, 보다 바람직하게는 10 내지 40 염기이다.
안티센스 RNA의 경우 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나, 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 할 수 있다. 시험관에서 안티센스 RNA를 합성하는 한 예는 RNA 폴리머라제Ⅰ를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한가지 예는 인식부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 이런 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물은 MG53의 siRNA, shRNA 또는 안티센스 핵산을 포함하는 외에, siRNA 또는 안티센스 핵산 분자의 유입을 촉진시키는 제제, 예를 들어 리포좀을 이용하거나 콜레스테롤, 콜레이트 및 데옥시콜산을 비롯한 다수의 스테롤류 중 1종의 친유성 담체와 함께 배합할 수도 있다. 또한 안티센스 핵산은 세포에 의해 흡수되는 펩티드에 접합시킬 수도 있다. 유용한 펩타이드의 예로는 펩타이드 호르몬, 항원 또는 항체 및 펩타이드 독소 등이 있다.
다른 일예로, 본 발명의 조성물은 MG53 의 활성을 억제하기 위하여, MG53 에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함할 수 있다. 이러한 항체는 단일클론항체 및 이에 대한 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체를 모두 포함하는 것이고, 신규한 항체 외에 이미 당해 기술분야에서 공지된 항체들도 포함될 수 있다.
상기 항체는 MG53을 특이적으로 인식하는 결합의 특성을 갖는 한, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄의 전체 길이를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체의 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.
본 발명의 조성물은 브로디병 또는 브로디신드롬의 예방 및/또는 치료에 효과적이다. 본원에 있어서, "예방"이란 조성물의 투여로 질환의 형성을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하는 것이며, "치료"란 조성물의 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하는 것이다. 브로디병 또는 브로디신드롬은 SERCA1a 의 기능 저하로 인하여 근육의 이완이 완벽하게 일어나지 않아서 근육 이완과정에서 이완지연이 발생하는 질환이므로, MG53 을 저해하여 SERCA1a 의 활성을 높임으로써 브로디병과 브로디신드롬 환자의 치료 및 증상 개선할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가적으로 포함하여 제제화될 수 있다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체" 란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 본 발명에서의 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 또는 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 및 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 또는 정제로 제제화 할 수 있다.
또한 바람직하게 본 발명의 약제학적 조성물은 충진제, 부형제, 붕해제, 결합제 및 활택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 약제학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화 될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용 약, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
또한, 본 발명은 MG53 의 발현 또는 활성을 저해하는 물질을 포함하는 조성물의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 브로디병 또는 브로디신드롬의 치료 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물의 투여경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 경구 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 강내 투여, 복강 내 투여, 경막 내 투여가 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지는 않으며, 바람직하게는 질환 병소를 나타내는 조직, 즉 근육 조직에 직접 투여할 수 있다.
본 발명의 치료방법은 상기 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 치료 방법은 브로디병 또는 브로디신드롬이 발생할 수 있는 임의의 동물에 적용가능하며, 동물은 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등의 가축을 포함한다.
또한, 본 발명은 MG53 및 SERCA1a 의 상호작용을 저해하는 물질을 결정하는 단계를 포함하는, SERCA1a 과 관련된 근육 질환 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
일예로, 상기 스크리닝 방법은
(a) MG53 및 SERCA1a 를 발현하는 세포에 후보 화합물을 처리하는 단계; 및
(b) 상기 세포에서 MG53 및 SERCA1a 의 상호작용이 저해되는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
다른 일예로, 상기 스크리닝 방법은
(a') 분리된 MG53 및 분리된 SERCA1a 의 혼합물에 후보 화합물을 처리하는 단계; 및
(b') MG53 및 SERCA1a 의 상호작용이 저해되는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 스크리닝 방법은 MG53 및 SERCA1a 에 후보 화합물을 처리하는 단계를 포함하며, 이 때, 후보 화합물을 MG53 및 SERCA1a 를 발현하는 세포에 처리하거나, 분리된 MG53 및 분리된 SERCA1a 의 혼합물에 후보 화합물을 직접적으로 처리할 수 있다.
본 발명에서 용어, "후보 화합물" 이란 MG53 및 SERCA1a 의 상호작용을 저해시킬 것으로 예상되는 후보 물질을 의미한다. 이러한 후보 물질에는 유기 또는 무기 화합물과 같은 단일 화합물뿐만 아니라, 단백질, 탄수화물, 핵산분자 (RNA, DNA 등) 및 지질과 같은 고분자 화합물 및 복수의 화합물의 복합체 등이 포함될 수 있다.
본 발명에서 용어, "처리" 란 후보 화합물이 MG53 및 SERCA1a 중 어느 하나 이상에 직접적으로 접촉하는 것뿐 아니라, 물질이 세포막에 영향을 미치고 그 세포막으로부터 발생한 신호가 MG53 및 SERCA1a 중 어느 하나 이상에 접촉하거나 영향을 미치는 경우도 포함한다. 따라서 본 발명에 있어서, 상기 후보 화합물에는 세포막 투과성인 물질 뿐만 아니라, 세포막에 불투과성인 물질도 포함된다. 이 때, 후보 화합물은 유효량의 범위 내에서 처리하도록 한다. "유효량" 이란 반응을 유도하기에 충분한 양을 의미하는 것으로, 유효량 범위 이하에서는, 정확한 결과를 얻을 수 없으므로, 유효량 범위 내에서 억제능을 측정하는 것이 바람직하다.
후보 화합물을 MG53 및 SERCA1a 를 발현하는 세포에 처리하는 경우, 본 발명은 (a) MG53 및 SERCA1a 를 발현하는 세포에 후보 화합물을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 세포에서 MG53 및 SERCA1a 의 상호작용이 저해되는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는 근육 질환 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
MG53 및 SERCA1a 를 발현하는 세포는, 본래 MG53 및 SERCA1a 를 포함하는 세포이거나, 의도적으로 MG53 및 SERCA1a 를 발현하는 벡터를 세포에 트랜스펙션하여 제조한 것일 수 있다. 또한, MG53 및 SERCA1a 를 발현하는 벡터의 경우 하나의 벡터에 MG53 및 SERCA1a 에 대한 서로 다른 프로모터를 포함하고 있어 하나의 벡터로부터 각각 발현될 수도 있고, MG53 를 발현하는 벡터 및 SERCA1a 를 발현하는 벡터를 공동 트랜스펙션하여 제조할 수도 있다.
상기 세포는 인간 또는 소, 염소, 돼지, 쥐, 토끼, 햄스터, 시궁쥐, 기니피그 등의 동물 기원의 모든 세포를 포함하며, 일차세포, 이차세포, 불멸화된 세포 등을 이용할 수 있다. 또한, MG53 및/또는 SERCA1a 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 사용하여 세포 내에서 MG53 및/또는 SERCA1a 가 세포 내에서 안정적으로 또는 일시적으로 과발현되도록 조작된 세포를 사용할 수 있다.
나아가, MG53 및 SERCA1a 의 상호작용을 저해시키는 물질의 검출은, 세포 수준 뿐만 아니라 쥐, 토끼, 햄스터, 시궁쥐, 기니피그 등의 실험 동물을 이용하여 생체 내에서 수행할 수 있다.
본 발명의 상기 단계 (b) 에서, MG53 및 SERCA1a 의 상호작용이 저해되는지 여부는, 단백질-단백질간 또는 단백질-화합물간의 반응 여부를 확인하기 위하여 당업계에서 통상 사용되는 기술들을 적용하여 확인할 수 있다. 예를 들어, 면역학적 분석법, 형광 분석법, 효모 이중 혼성법 (yeast two-hybrid), MG53 또는 SERCA1a에 결합하는 파지 디스플레이 펩티드 클론의 검색, 천연물 및 화학물질 라이브러리 등을 이용한 HTS (high throughput screening), 드럭 히트 HTS 또는 세포 기반 스크리닝 (cell-based screening) 등을 이용하는 스크리닝 방법 등을 사용할 수 있으나, 이러한 방법에 제한되는 것은 아니다.
바람직한 하나의 구현예로, MG53 또는 SERCA1a 에 특이적인 항체를 이용하여 MG53 및 SERCA1a 의 상호작용이 저해되는지 여부를 검출할 수 있다. 예를 들어, 생성된 항원-항체 복합체 형성량을 후보 물질을 처리하지 않은 대조군에서의 항원-항체 복합체 형성량과 비교하여 저해 여부를 결정할 수 있다. 항원-항체 복합체 형성량의 절대적 또는 상대적 차이는 분자생물학적 또는 조직학적 분석으로 확인 가능하며, 이러한 분석법에는 면역탁본, 면역침전 및 면역염색 등이 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 항원-항체 반응을 이용한 검출 방법에서 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨 (detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다. 본 발명에서 용어, "검출 라벨"은 분광분석적 (spectroscopic), 광화학적 (photochemical), 생화학적 (biochemical), 면역화학적 (immunochemical), 화학적 (chemical), 다른 물리화학적 (physical) 수단에 의해 검출될 수 있는 조성물을 말한다. 이러한 검출 표지체에는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자 (microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소 등이 있으며, 이로 제한되는 것은 아니다.
바람직한 또 하나의 구현예로, MG53 또는 SERCA1a 에 각각 리포터 단백질과 연결한 후 상기 리포터 단백질의 신호 크기에 의하여 MG53 및 SERCA1a 의 상호작용이 저해되는지 여부를 검출할 수 있다.
상기 리포터 단백질은 루시퍼라제, 클로람페니콜아세틸트랜스퍼라제, 베타-글루쿠로니다제, 베타-갈락토시다제, 알칼라인 포스파타아제, 또는 형광 단백질일 수 있으며, 이 때 형광 단백질은 녹색 형광 단백질 (green fluorescent protein), 적색 형광 단백질 (red fluorescent protein), 청색 형광 단백질 (blue fluorescent protein), 황색 형광 단백질 (yellow fluorescent protein), 남색 형광 단백질 (cyan fluorescent protein), 증강된 녹색 형광 단백질 (enhanced green fluorescent protein), 증강된 적색 형광 단백질, 증강된 청색 형광 단백질, 증강된 황색 형광 단백질 또는 증강된 남색 형광 단백질일 수 있다.
상기 리포터 단백질을 MG53 및 SERCA1a 과 각각 연결된 형태로 발현시키기 위하여, MG53 를 코딩하는 유전자 및 리포터 유전자가 작동가능하게 연결된 발현 벡터, 그리고 SERCA1a 를 코딩하는 유전자 및 리포터 유전자가 작동가능하게 연결된 발현 벡터를 세포에 공동 트랜스펙션할 수 있다.
리포터 단백질이 형광 단백질일 경우 형광 현미경을 이용하여 리포터 단백질의 형광 크기를 측정함으로써 MG53 및 SERCA1a 의 상호작용이 저해되는지 여부를 확인할 수 있으며, 리포터 단백질로 루시퍼라제와 같은 발광 효소를 사용하는 경우 공지된 루시퍼라제 활성 측정법 내지는 루시퍼라제 발광에 따라 MG53 및 SERCA1a 의 상호작용이 저해되는지 여부를 확인할 수 있다. 또한, 리포터 단백질로 클로람페니콜아세틸트랜스퍼라제, 베타-글루쿠로니다제, 베타-갈락토시다제, 알칼라인 포스파타아제 등과 같이 기질을 검출 가능한 광을 발광하는 발색 산물로 전환시킬 수 있는 효소를 사용하는 경우 발색 기질을 이용한 효소 반응에 의하여 얻어지는 광 신호에 의해 MG53 및 SERCA1a 의 상호작용이 저해되는지 여부를 확인할 수 있다.
한편, 후보 화합물을 분리된 MG53 및 분리된 SERCA1a 의 혼합물에 처리하는 경우, 본 발명은 (a') 분리된 MG53 및 분리된 SERCA1a 의 혼합물에 후보 화합물을 처리하는 단계; 및 (b') MG53 및 SERCA1a 의 상호작용이 저해되는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 근육 질환 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어, "분리된 (isolated)"이란 세포에서 발현되어 분리된 단백질을 의미하고, 당업계에서 공지된 일반적인 분리 기술을 적용하여 분리 가능하다. 세포에서 발현된 단백질을 분리 정제하는 방법은 특별히 제한되지 않는다. 분리된 MG53 및 분리된 SERCA1a 은 세포 내가 아니라 시험관 내에서 후보 화합물과 직접적으로 작용하여 반응할 수 있다.
MG53 및 SERCA1a 의 상호작용이 저해되는지 여부를 확인하는 방법은 상술한 바와 같다.
본 발명의 스크리닝 방법으로 획득된 MG53 및 SERCA1a 의 상호작용을 억제하는 약제는 SERCA1a 의 활성을 증가시켜 골격근의 수축 및 이완을 정상적으로 조절함으로써 브로디병 또는 브로디신드롬 치료제로 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 골격근의 수축과 이완의 이상으로 비롯된 각종 근육 질환, 예를 들어 근육긴장저하, 다운증후군(Nora Shields and Nicholas F Taylor, Journal of Physiotherapy (2010) 56: 187-193), 근이영양증(Rafael-Fortney et al., Circulation (2011) 124:582-588), 뇌성마비(C.L. Chen et al., Research in Developmental Disabilities 33 (2012) 1087-1094), 프레더－윌리 증후군(Prader-Willi syndrome; Edouard et al., J Clin Endocrinol Metab (2012) 97:E275-E281) 또는 테이-샥스병 (Tay-Sachs disease; Shapiro et al., Genetics IN Medicine, (2009) 11 (6): 425-433)등의 치료제로 사용될 수 있다.
본 발명은 브로디병과 브로디신드롬 환자의 치료 및 증상을 개선하는 약제를 제공할 뿐만 아니라, MG53 과 SERCA1a의 상호작용을 이용하여 SERCA1a과 관련된 각종 근육 질환의 치료제를 발굴할 수 있는 신규 스크리닝 시스템을 제공하므로, 의약 산업에 폭넓게 응용될 수 있다.
도 1a는 MG53과 MG53 도메인들에 대한 도식을 나타낸다. MG53은 TRIM 도메인, PRY 도메인, SPRY 도메인으로 이루어져 있고, TRIM 도메인은 Ring 도메인, B-박스, 코일-코일 도메인 (CC1, CC2)으로 이루어져 있다.
도 1b는 E. coli에서 발현되고, 10% SDS-PAGE 젤에서 분리되어 Coomassie Brilliant Blue로 염색된 GST-결합 MG53 단백질들을 나타낸다.
도 1c는 GST-결합 MG53 단백질들 (GST-fused MG53 proteins)과 트라이아드 단백질 샘플 (triad protein sample)과의 결합 반응 (binding assay)을 통해 얻어진 단백질들을 7%, 10%, 12% SDS-PAGE 젤에서 분리하고 Coomassie Brilliant Blue 로 염색한 영상을 나타낸다. 다양한 단백질 질량에 따라서 세가지 다른 젤을 사용하였다. GST 단독은 음성 대조군 (negative control) 을 나타낸다. GST-결합 MG53 단백질들은 흰색 별표로 표시하였다. GST-결합 MG53 단백질들에 결합하여 나타난 단백질들에 대해서는 흰색 점으로 표시하였다. 9개의 새롭게 발견된 밴드는 오른쪽에 표시하였고 qTOF MS 분석에 사용하였다.
도 2a 는 밴드 1 에 대한 qTOF MS 스펙트럼 결과를 나타낸다.
도 2b 는 밴드 2 에 대한 qTOF MS 스펙트럼 결과를 나타낸다.
도 2c 는 밴드 3 에 대한 qTOF MS 스펙트럼 결과를 나타낸다.
도 2d 는 밴드 4 에 대한 qTOF MS 스펙트럼 결과를 나타낸다.
도 2e 는 밴드 5 에 대한 qTOF MS 스펙트럼 결과를 나타낸다.
도 2f 는 밴드 6 에 대한 qTOF MS 스펙트럼 결과를 나타낸다.
도 2g 는 밴드 9 에 대한 qTOF MS 스펙트럼 결과를 나타낸다.
도 3a는 토끼 골격근에서 얻은 트라이드아드 단백질 샘플에서 MG53과 SERCA1a의 공동면역침전을 확인한 결과로, MG53과 SERCA1a이 직접적으로 결합함을 재확인한 결과를 나타낸다.
도 3b는 세포면역화학법 (immunocytochemistry)을 통해, 생쥐 골격근 분화 세포에서 MG53과 SERCA1a의 공존을 확인함으로써 (흰색 화살표 머리로 표시), MG53과 SERCA1a이 세포 상에서 직접적으로 결합함을 재확인한 결과를 나타낸다.
도 4a는 qPCR 을 통해 MG53 넉다운 분화 골격근 세포에서 MG53 mRNA 수준을 확인한 결과를 나타낸다. siRNA #2가 보다 효과적으로 MG53을 넉다운하는 것으로 나타났고, 뒤섞인 siRNA (scrambed siRNA)를 음성대조군 (negative control)으로 사용하였다.
도 4b는 MG53 의 단백질 수준이 siRNA (#2)에 의해서 94 %수준까지 감소함을 면역탁본법 (immunoblot assay)으로 확인한 결과를 나타낸다. 알파-액틴과 Coomassie Brilliant Blue 결과는 동량샘플 적용에 대한 대조군으로 사용하였다.
도 4c는 MG53 넉다운 균질액에서 올살레이트-보조 방사선 45칼슘-유입 (oxalate-supported 45Ca2 +-uptake)을 측정한 결과를 나타낸다. 1μM 45Ca2 + 상태에서 현격히 증가한 방사선 45칼슘-유입이 관찰되었으며, 유의차는 P<0.05 일 경우에 별표로 표시하였다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. GST -결합 MG53 단백질들에 대한 cDNA 제작과 단백질 발현
생쥐 MG53 cDNA (GenBank accession number: NM_001079932)를 견본으로, 표 1에 제시된 PCR 프라이머들을 이용하여 PCR 수행하였다. 얻어진 PCR 합성체는 pGEX-4T-1 에 제한효소 Sal과 NotI 을 이용하여 삽입하고 염기 서열은 단백질 서열기를 통하여 재차 확인하였으며, E.coli (DH5α)를 형질전환하여 각각의 GST 단백질들을 발현하고, GST 구슬 (bead)을 이용하여 단백질을 정제하여, GST-TRIM, GST-PRY, GST-SPRY, GST-PRY-SPRY 및 GST-MG53 단백질을 수득하였다.
PCR 프라이머 서열번호
GST-TRIM 정방향 5'-GCGTCGACTCATGTCGGCTGCACCCGG-3' 4
역방향 5'-TAAAGCGGCCGCTCACAGAGCCCGGAACATC-3' 5
GST-PRY 정방향 5'-GCGTCGACCTATGCCAGCGCTGGAGGAAC-3' 6
역방향 5'-TAAAGCGGCCGCTCACTGTGACAGCAGCTGCTG-3' 7
GST-SPRY 정방향 5'-GCGTCGACTCATGGGCGAGCACTATTGGGAG-3' 8
역방향 5'-TAAAGCGGCCGCTCAGGCCTGTTCCTGCTCC-3' 9
GST-PRY-SPRY 정방향 5'-GCGTCGACCTATGCCAGCGCTGGAGGAAC-3' 10
역방향 5'-TAAAGCGGCCGCTCAGGCCTGTTCCTGCTCC-3' 11
GST-MG53 정방향 5'-GCGTCGACTCATGTCGGCTGCACCCGG-3' 12
역방향 5'-TAAAGCGGCCGCTCAGGCCTGTTCCTGCTCC-3' 13
실시예 2. 트라이아드 샘플 준비와 GST -결합 MG53 단백질들과의 결합 반응
토끼 골격근 (rabbit fast-twitch skeletal muscle (back and leg)) 에서 트라이아드 낭 (triad vesicle)을 얻었고, 용해액 (1% Triton X-100, 10 mM Tris-HCl, 1 mM Na3VO4, 10% glycerol, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, a protease inhibitor cocktail, and pH 7.4) 에 트라이아드 낭을 넣고 4℃ 에서 4시간 동안 용해 (solubilize)하여 트라이아드 단백질 샘플을 얻었다. GST-결합 MG53 단백질들을 GST 구슬에 붙인 후에 이에 트라이아드 단백질 샘플 (150 μg)을 섞어서 4℃ 에서 8시간 동안 결합 반응을 진행하였고, 얻어진 구슬에 붙은 단백질들은 SDS-PAGE 젤에서 분리하고 Coomassie Brilliant Blue 염색을 통해서 가시화하였다.
실시예 3. 젤상태 단백질 분해, 사극자 비행시간 질량분석, 데이터 베이스 탐색
결합 반응에서 얻어진 단백질들은 젤 상태에서 트립신 (trypsin)을 이용하여 분해 (digestion)하여, 사극자 비행시간 질량분석 (quadrupole time-of-flight mass spectrometry; qTOF MS)을 통해 분석하고, 분석 결과를 Mascot 데이터 베이스를 이용하여 탐색하였다.
실시예 4. 골격근 세포의 배양과 분화 유도
생쥐 (mouse)의 골격근에서 일차 골격근 세포 (primary skeletal muscle cell)를 분리하고 세포 배양액 (F10 Nutrient Mixture 조성: 20% FBS, 100 units/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 2 mM L-glutamine, 20 nM basic fibroblast growth factor)을 처리하여 37℃ 조건의 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 사용한 배양 접시로는 용도에 따라서 10-cm 또는 96-well 접시를 사용하였고, 모든 접시는 Matrigel로 코팅하여 사용하였다. 일차 골격근 세포가 배양 접시의 70% 가량을 차지할 정도로 자랐을 때, 세포의 분화 (differentiation)를 유도하였다 (세포 분화액 조성: 세포 배양액에서 20% FBS와 F-10 Nutrient Mixture 대신 5% heat-inactivated horse serum과 low-glucose DMEM을 사용하고, bFGF는 넣지 않음, 18% CO2 인큐베이터를 사용). 분화가 완성된 세포는 분화세포 (myotube)라 하였다.
실시예 5. 공동면역침전법, 면역탁본검사, 면역세포화학법
분화된 골격근 세포는 용해 용액 (lysis buffer 조성: 1% Triton X-100, 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1 mM Na3VO4, 10% glycerol, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, protease inhibitors (1μM pepstatin, 1μM leupeptin, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 20 mg/ml aprotinin, 1μM trypsin inhibitor))을 처리하여 24 시간 동안 4℃에서 용해 (solubilize) 시켰다. 이 때 10-cm 배양 접시에서 자란 세포를 예로 들면, 300 μl의 용해 용액을 세포에 처리하였다. 용해 세포용액 (전체단백질 800 μg)을 SDS-PAGE 젤로 분리한 뒤에 anti-MG53 항체 (10μg/m)를 이용하여 공동면역침전법 (co-immunoprecipitation)을 수행하고 얻어진 샘플은 anti-MG53 항체(1:1000) 와 anti-SERCA1a 항체 (1:1000) 를 이용하여 면역탁본검사 (immunoblot assay)를 수행하였다. 면역세포화학법(immunocytochemistry) 은 anti-MG53 항체 (1:500), anti-SERCA1a 항체 (1:500), Cy-3-conjugated anti-mouse 이차 항체 (1:500), 그리고 FITC-conjugated anti-rabbit 이차 항체(1:500, Sigma)를 이용하여 수행하였다.
실시예 6. MG53 단백질 넉다운과 정량적 실시간 PCR 방법
MG53에 대한 siRNA는 GenBank accession number NM_001079932를 참조하여 siRNA 디자인 프로그램 (Dharmacon RNAi Technologies) 을 이용하여 합성하였다 (표 2).
siRNA 방향 서열 서열번호
Scrambled siRNA 인식서열 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAAUU-3' 14
상보서열 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUUU-3' 15
siRNA #1 인식서열 5'-CCGCAGGCUCUAAGCACUAUU-3' 16
상보서열 5'-UAGUGCUUAGAGCCUGCGGUU-3' 17
siRNA #2 인식서열 5'-CUGUCAAGCCUGAACUCUUUU-3' 18
상보서열 5'-AAGAGUUCAGGCUUGACAGUU-3' 19
PCR 프라이머
(예상 PCR 생성물: 147 bp)		 서열번호
정방향 5'-AACACCTGGATCCACTGAGC-3' 20
역방향 5'-TCTGCTGTGGAAGCTGTGTC-3' 21
분화가 유도된 날로부터 3일째가 되는 골격근 세포에 4시간 동안 표 2에 제시된 siRNA를 처리하고, 분화 5일째가 되는 날에 세포로부터 전체 RNA (total RNA)를 얻어 cDNA로 역전사 한 후에 표 3에 제시된 PCR 프라이머를 통해 정량적 실시간 PCR (quantitative real-time PCR)을 수행하여 MG53 에 대한 mRNA 수준을 확인하였다.
실시예 7. 분화된 세포 균질액 준비와 올살레이트 -보조 방사선 45 Ca 2 + -유입 측정
MG53 넉다운 분화 골격근 세포는 균질화 용액 (50 mM KH2PO4, 10 mM NaF, 1 mM EDTA, 0.3 M sucrose, protease inhibitor cocktail, and 0.5 mM DTT, and pH 7.0)을 이용하여 균질화 되고, 얻어진 분화된 골격근 세포 균질액 (250μg) 은 준비 용액 (40 mM imidazole, 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 5 mM NaN3, 0.5 mM EGTA, and pH 7.0.)과 섞고, 45Ca2 +-유입 측정은 반응 용액 (5 mM MgATP, 5 mM K-oxalate, and 70 nM or 1μM of free 45Ca2 +)의 유입에 의해서 이루어졌으며, 0, 1, 2, 3, 4 분 (min)에 방사능의 변화를 측정하였다.
실시예 8. 데이터 분석
모든 데이터는 다수의 실험을 통해 얻어진 데이터들을 종합하여 ±S.E.M.으로 표현하였다. 대조군 (control)에서 얻어진 수치를 1로 하고 그에 대한 상대적 변화를 표현하는 표준화비율 (normalized ratio) 방식으로 표현하였다. 유의차 (significant differences)는 paired t-test (GraphPad InStat, v2.04)를 이용하여 수행하였고, 유의차는 P<0.05 일 경우에 별표로 표시하였다. 그래프 작성은 Origin v7 프로그램 사용하였다.
실험결과
1. 막복구 과정 외에, 골격근에서 MG53 결합하는 단백질이 SERCA1a 임을 최초로 확인
Mitsugumin 53 (MG53) 단백질은 골격근 (skeletal muscle)과 심근 (heart)에서만 발현되는 특이 단백질로, tripartite motif (TRIM) 도메인, PRY 도메인, SPRY 도메인으로 이루어진 단백질로, TRIM 도메인은 Ring 도메인 (ubiquitin E3 ligase 활성 보유), B-박스 (아연-결합 부위 보유), 코일-코일 도메인으로 이루어져 있는데(도 1a), 이들에 대한 각각의 기능은 잘 알려져 있지 않다. MG53의 세포 내 기능으로는 골격근의 세포막 손상 (injury) 시에 막복구 (membrane repair system)에 참여함이 알려져 있다.
본 발명자들은 MG53의 각 도메인 별로 GST-결합 단백질을 제작하여 E. coli 에서 발현 및 정제하고 (GST-TRIM, GST-PRY, GST-SPRY, GST-PRY-SPRY, GST-MG53 (전체 길이); 도 1b), 이에 골격근의 수축과 이완 (contraction, relaxation)에 관여하는 단백질들인 트라이아드 단백질들 (triad proteins)이 농축된 시료 (triad vesicle sample)를 섞어서 결합 실험 (binding assay)을 진행하여, 각 도메인 별 MG53 단백질들에 결합하는 트라이아드 단백질들을 찾았고(도 1c), 이 단백질들의 정체 (identity)를 quadrupole time-of-flight mass spectrometry (qTOF MS) 분석과 데이터베이스 탐색 (database search)을 수행하여 밝혔다. qTOF MS 스펙트럼 결과를 도 2a 내지 도 2g 에 나타내었고, qTOF MS 를 통해 동정된 단백질 목록을 표 4에 나타내었다.
밴드# 단백질 이름 Mascot# 질량
(Da)		 종 대응점수 대응 펩타이드
1 MG53 gi|45500997 41411 Mouse 65 632.3
RWALGVMAADASRR
2 Chaperone protein htpG HTPG_ECOHS 71378 E. coli 46 635.3
RALSNPDLYEGDGELRVR.V
3 Chain A, Crystal Structure Of C418a,
C419a Mutant Of Pf1		 gi|6730181 85279 E. coli 98 1033.2
KYGYDISGPATNAQEAIQWTYFGYLAAVKS
4 SERCA1a gi|18159010 110787 Rabbit 114 758.9; 781.4
KVGEATETALTTLVEKM
Pyruvate dehydrogenase subunit E1 gi|15799798 99948 E. coli 66 752.4
RAQYLIDQLLAEARK
Bifunctional aconitate hydratase
2/2-methylisocitrate dehydratase		 gi|15602069 95141 Pasteurella 71 841.4
KGFPLAYVGDVVGTGSSRK
5 SERCA1a gi|18159010 110787 Rabbit 82 758.9; 781.4
KVGEATETALTTLVEKM
6 Heat shock protein 90 gi|15800202 71374 E. coli 69 743.4
RGLIDSSDLPLNVSRE
7 현존하는 데이터 베이스에서 검색되지 않는 펩타이드
8 현존하는 데이터 베이스에서 검색되지 않는 펩타이드
9 Tryptophanase gi|41936 53098 E. coli 87 551.3; 993.5; 1103.9
RGIEEVGPNNVPYIVATITSNSAGGQPVSLANLKA
상기 표 4의 단백질들 중, MG53 에 결합하는 단백질로 근세포질세망 ATP-가수분해 단백질 (sarcoplasmic reticulum Ca2 +-ATPase 1a ;SERCA1a)를 밝혔으며, MG53이 막복구에 관여하는 과정을 제외하고는, SERCA1a 이 골격근에서 발견된 첫번째 MG53-결합 단백질임을 확인하였다. 이와 같은 MG53 과 SERCA1a 와의 결합은 MG53의 TRIM 도메인과 PRY 도메인을 통해서 일어나는 것으로 확인되었다. 또한 전체 길이의 MG53 (full-length)과 SERCA1a의 직접적 결합을 토끼 골격근 시료 (vesicle sample from rabbit skeletal muscle)와 분화된 쥐 골격근 세포 (mouse primary skeletal myotube)에서 재 확인하여(도 3a 및 도 3b), 종 (species)에 관계없이 골격근 전반에 적용할 있는 결과임을 확인하였다.
2. 골격근 고유의 기능인 골격근 수축과 이완 ( skeletal muscle contraction and relaxation )에 MG53 이 미치는 영향 확인
골격근에서 SERCA1a 의 역할은 골격근의 이완은 물론 이완 다음에 새로이 발생할 수축을 위해서도 매우 중요하여, 골격근 수축과 이완의 필수 핵심 단백질이다. 현재까지 SERCA1a의 기능을 조절하는 단백질로는 싸르코리핀 (sarcolipin) 이 유일하게 알려져 있다
본 발명자들은 MG53 이 SERCA1a 에 결합 한다는 결과를 바탕으로, SERCA1a 의 기능 또한 MG53에 의해서 SERCA1a 의 활성이 직접적으로 조절되는지를 확인하고자, 생쥐 골격근 (mouse hindlimb)에서 골격근 전구 세포를 분리하여 증식시켜 얻은 세포 (primary skeletal muscle myoblasts)를 분화하여 얻은 분화된 쥐 골격근 세포 (mouse primary skeletal myotube)에서 siRNA 방법을 이용하여 MG53 단백질의 넉다운 (knockdown) 하였고, 정량적 실시간 PCR (quantitative real-teim PCR (qPCR))을 통해서 mRNA 수준에서의 넉다운과 면역탁본법 (immunoblot assay) 을 통해서 단백질 수준에서의 넉다운을 확인하였다(도 4a 및 도 4b). 이 MG53 넉다운 분화 골격근 세포에서 SERCA1a 의 활성을 측정하고자 방사선으로 표식된 45칼슘-유입 실험 (45Ca2 +-uptake experiment)을 수행하였다(도 4c).
그 결과, MG53 넉다운 분화 골격근 세포의 경우에, 정상 골격근 세포에 비해서 현격히 높은 SERCA1a의 활성 (35% 이상 증가)을 확인할 수 있었다. 이는 MG53 이 SERCA1a 에 직접적으로 결합하여 SERCA1a의 활성을 일정 상태로 낮게 유지하는 기능을 함을 의미한다. 결론적으로, 골격근 세포에서 MG53 은 SERCA1a 에 직접적으로 결합하여 SERCA1a 의 활성을 조절하고, 골격근의 수축과 이완에 중요한 역할을 하는 것으로 확인되었다. 따라서, MG53 이 막복구 기능 이외에도 골격근의 고유 기능인 골격근 이완에 매우 중요한 역할을 함을 알 수 있다.
<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Composition for preventing or treating Brody Disease and Brody Syndrome comprising MG53 inhibitor <130> DOO20126803KR <160> 21 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 477 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(477) <223> MG53 (Genbank accession No. NP_001073401) <400> 1 Met Ser Ala Ala Pro Gly Leu Leu Arg Gln Glu Leu Ser Cys Pro Leu 1 5 10 15 Cys Leu Gln Leu Phe Asp Ala Pro Val Thr Ala Glu Cys Gly His Ser 20 25 30 Phe Cys Arg Ala Cys Leu Ile Arg Val Ala Gly Glu Pro Ala Ala Asp 35 40 45 Gly Thr Val Ala Cys Pro Cys Cys Gln Ala Pro Thr Arg Pro Gln Ala 50 55 60 Leu Ser Thr Asn Leu Gln Leu Ser Arg Leu Val Glu Gly Leu Ala Gln 65 70 75 80 Val Pro Gln Gly His Cys Glu Glu His Leu Asp Pro Leu Ser Ile Tyr 85 90 95 Cys Glu Gln Asp Arg Thr Leu Val Cys Gly Val Cys Ala Ser Leu Gly 100 105 110 Ser His Arg Gly His Arg Leu Leu Pro Ala Ala Glu Ala Gln Ala Arg 115 120 125 Leu Lys Thr Gln Leu Pro Gln Gln Lys Met Gln Leu Gln Glu Ala Cys 130 135 140 Met Arg Lys Glu Lys Thr Val Ala Val Leu Glu His Gln Leu Val Glu 145 150 155 160 Val Glu Glu Thr Val Arg Gln Phe Arg Gly Ala Val Gly Glu Gln Leu 165 170 175 Gly Lys Met Arg Met Phe Leu Ala Ala Leu Glu Ser Ser Leu Asp Arg 180 185 190 Glu Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Ala Gly Val Ala Leu Arg Arg Glu 195 200 205 Leu Ser Ser Leu Asn Ser Tyr Leu Glu Gln Leu Arg Gln Met Glu Lys 210 215 220 Val Leu Glu Glu Val Ala Asp Lys Pro Gln Thr Glu Phe Leu Met Lys 225 230 235 240 Phe Cys Leu Val Thr Ser Arg Leu Gln Lys Ile Leu Ser Glu Ser Pro 245 250 255 Pro Pro Ala Arg Leu Asp Ile Gln Leu Pro Val Ile Ser Asp Asp Phe 260 265 270 Lys Phe Gln Val Trp Lys Lys Met Phe Arg Ala Leu Met Pro Ala Leu 275 280 285 Glu Glu Leu Thr Phe Asp Pro Ser Ser Ala His Pro Ser Leu Val Val 290 295 300 Ser Ser Ser Gly Arg Arg Val Glu Cys Ser Asp Gln Lys Ala Pro Pro 305 310 315 320 Ala Gly Glu Asp Thr Arg Gln Phe Asp Lys Ala Val Ala Val Val Ala 325 330 335 Gln Gln Leu Leu Ser Gln Gly Glu His Tyr Trp Glu Val Glu Val Gly 340 345 350 Asp Lys Pro Arg Trp Ala Leu Gly Val Met Ala Ala Asp Ala Ser Arg 355 360 365 Arg Gly Arg Leu His Ala Val Pro Ser Gln Gly Leu Trp Leu Leu Gly 370 375 380 Leu Arg Asp Gly Lys Ile Leu Glu Ala His Val Glu Ala Lys Glu Pro 385 390 395 400 Arg Ala Leu Arg Thr Pro Glu Arg Pro Pro Ala Arg Ile Gly Leu Tyr 405 410 415 Leu Ser Phe Ala Asp Gly Val Leu Ala Phe Tyr Asp Ala Ser Asn Pro 420 425 430 Asp Val Leu Thr Pro Ile Phe Ser Phe His Glu Arg Leu Pro Gly Pro 435 440 445 Val Tyr Pro Ile Phe Asp Val Cys Trp His Asp Lys Gly Lys Asn Ala 450 455 460 Gln Pro Leu Leu Leu Val Gly Pro Glu Gln Glu Gln Ala 465 470 475 <210> 2 <211> 477 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(477) <223> MG53 (Genbank accession No. NP_001008275) <400> 2 Met Ser Ala Ala Pro Gly Leu Leu His Gln Glu Leu Ser Cys Pro Leu 1 5 10 15 Cys Leu Gln Leu Phe Asp Ala Pro Val Thr Ala Glu Cys Gly His Ser 20 25 30 Phe Cys Arg Ala Cys Leu Gly Arg Val Ala Gly Glu Pro Ala Ala Asp 35 40 45 Gly Thr Val Leu Cys Pro Cys Cys Gln Ala Pro Thr Arg Pro Gln Ala 50 55 60 Leu Ser Thr Asn Leu Gln Leu Ala Arg Leu Val Glu Gly Leu Ala Gln 65 70 75 80 Val Pro Gln Gly His Cys Glu Glu His Leu Asp Pro Leu Ser Ile Tyr 85 90 95 Cys Glu Gln Asp Arg Ala Leu Val Cys Gly Val Cys Ala Ser Leu Gly 100 105 110 Ser His Arg Gly His Arg Leu Leu Pro Ala Ala Glu Ala His Ala Arg 115 120 125 Leu Lys Thr Gln Leu Pro Gln Gln Lys Leu Gln Leu Gln Glu Ala Cys 130 135 140 Met Arg Lys Glu Lys Ser Val Ala Val Leu Glu His Gln Leu Val Glu 145 150 155 160 Val Glu Glu Thr Val Arg Gln Phe Arg Gly Ala Val Gly Glu Gln Leu 165 170 175 Gly Lys Met Arg Val Phe Leu Ala Ala Leu Glu Gly Ser Leu Asp Arg 180 185 190 Glu Ala Glu Arg Val Arg Gly Glu Ala Gly Val Ala Leu Arg Arg Glu 195 200 205 Leu Gly Ser Leu Asn Ser Tyr Leu Glu Gln Leu Arg Gln Met Glu Lys 210 215 220 Val Leu Glu Glu Val Ala Asp Lys Pro Gln Thr Glu Phe Leu Met Lys 225 230 235 240 Tyr Cys Leu Val Thr Ser Arg Leu Gln Lys Ile Leu Ala Glu Ser Pro 245 250 255 Pro Pro Ala Arg Leu Asp Ile Gln Leu Pro Ile Ile Ser Asp Asp Phe 260 265 270 Lys Phe Gln Val Trp Arg Lys Met Phe Arg Ala Leu Met Pro Ala Leu 275 280 285 Glu Glu Leu Thr Phe Asp Pro Ser Ser Ala His Pro Ser Leu Val Val 290 295 300 Ser Ser Ser Gly Arg Arg Val Glu Cys Ser Glu Gln Lys Ala Pro Pro 305 310 315 320 Ala Gly Glu Asp Pro Arg Gln Phe Asp Lys Ala Val Ala Val Val Ala 325 330 335 His Gln Gln Leu Ser Glu Gly Glu His Tyr Trp Glu Val Asp Val Gly 340 345 350 Asp Lys Pro Arg Trp Ala Leu Gly Val Ile Ala Ala Glu Ala Pro Arg 355 360 365 Arg Gly Arg Leu His Ala Val Pro Ser Gln Gly Leu Trp Leu Leu Gly 370 375 380 Leu Arg Glu Gly Lys Ile Leu Glu Ala His Val Glu Ala Lys Glu Pro 385 390 395 400 Arg Ala Leu Arg Ser Pro Glu Arg Arg Pro Thr Arg Ile Gly Leu Tyr 405 410 415 Leu Ser Phe Gly Asp Gly Val Leu Ser Phe Tyr Asp Ala Ser Asp Ala 420 425 430 Asp Ala Leu Val Pro Leu Phe Ala Phe His Glu Arg Leu Pro Arg Pro 435 440 445 Val Tyr Pro Phe Phe Asp Val Cys Trp His Asp Lys Gly Lys Asn Ala 450 455 460 Gln Pro Leu Leu Leu Val Gly Pro Glu Gly Ala Glu Ala 465 470 475 <210> 3 <211> 994 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(994) <223> SERCA1a (Genbank accession NO.BX537784.1) <400> 3 Met Glu Ala Ala His Ala Lys Thr Thr Glu Glu Cys Leu Ala Tyr Phe 1 5 10 15 Gly Val Ser Glu Thr Thr Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Lys Arg Asn 20 25 30 Leu Glu Lys Tyr Gly Leu Asn Glu Leu Pro Ala Glu Glu Gly Lys Thr 35 40 45 Leu Trp Glu Leu Val Ile Glu Gln Phe Glu Asp Leu Leu Val Arg Ile 50 55 60 Leu Leu Leu Ala Ala Cys Ile Ser Phe Val Leu Ala Trp Phe Glu Glu 65 70 75 80 Gly Glu Glu Thr Ile Thr Ala Phe Val Glu Pro Phe Val Ile Leu Leu 85 90 95 Ile Leu Ile Ala Asn Ala Ile Val Gly Val Trp Gln Glu Arg Asn Ala 100 105 110 Glu Asn Ala Ile Glu Ala Leu Lys Glu Tyr Glu Pro Glu Met Gly Lys 115 120 125 Val Tyr Gln Ala Asp Arg Lys Ser Val Gln Arg Ile Lys Ala Arg Asp 130 135 140 Ile Val Pro Gly Asp Ile Val Glu Val Ala Val Gly Asp Lys Val Pro 145 150 155 160 Ala Asp Ile Arg Ile Leu Ala Ile Lys Ser Thr Thr Leu Arg Val Asp 165 170 175 Gln Ser Ile Leu Thr Gly Glu Ser Val Ser Val Ile Lys His Thr Glu 180 185 190 Pro Val Pro Asp Pro Arg Ala Val Asn Gln Asp Lys Lys Asn Met Leu 195 200 205 Phe Ser Gly Thr Asn Ile Ala Ala Gly Lys Ala Leu Gly Ile Val Ala 210 215 220 Thr Thr Gly Val Gly Thr Glu Ile Gly Lys Ile Arg Asp Gln Met Ala 225 230 235 240 Ala Thr Glu Gln Asp Lys Thr Pro Leu Gln Gln Lys Leu Asp Glu Phe 245 250 255 Gly Glu Gln Leu Ser Lys Val Ile Ser Leu Ile Cys Val Ala Val Trp 260 265 270 Leu Ile Asn Ile Gly His Phe Asn Asp Pro Val His Gly Gly Ser Trp 275 280 285 Phe Arg Gly Ala Ile Tyr Tyr Phe Lys Ile Ala Val Ala Leu Ala Val 290 295 300 Ala Ala Ile Pro Glu Gly Leu Pro Ala Val Ile Thr Thr Cys Leu Ala 305 310 315 320 Leu Gly Thr Arg Arg Met Ala Lys Lys Asn Ala Ile Val Arg Ser Leu 325 330 335 Pro Ser Val Glu Thr Leu Gly Cys Thr Ser Val Ile Cys Ser Asp Lys 340 345 350 Thr Gly Thr Leu Thr Thr Asn Gln Met Ser Val Cys Lys Met Phe Ile 355 360 365 Ile Asp Lys Val Asp Gly Asp Ile Cys Leu Leu Asn Glu Phe Ser Ile 370 375 380 Thr Gly Ser Thr Tyr Ala Pro Glu Gly Glu Val Leu Lys Asn Asp Lys 385 390 395 400 Pro Val Arg Pro Gly Gln Tyr Asp Gly Leu Val Glu Leu Ala Thr Ile 405 410 415 Cys Ala Leu Cys Asn Asp Ser Ser Leu Asp Phe Asn Glu Ala Lys Gly 420 425 430 Val Tyr Glu Lys Val Gly Glu Ala Thr Glu Thr Ala Leu Thr Thr Leu 435 440 445 Val Glu Lys Met Asn Val Phe Asn Thr Asp Val Arg Ser Leu Ser Lys 450 455 460 Val Glu Arg Ala Asn Ala Cys Asn Ser Val Ile Arg Gln Leu Met Lys 465 470 475 480 Lys Glu Phe Thr Leu Glu Phe Ser Arg Asp Arg Lys Ser Met Ser Val 485 490 495 Tyr Cys Ser Pro Ala Lys Ser Ser Arg Ala Ala Val Gly Asn Lys Met 500 505 510 Phe Val Lys Gly Ala Pro Glu Gly Val Ile Asp Arg Cys Asn Tyr Val 515 520 525 Arg Val Gly Thr Thr Arg Val Pro Leu Thr Gly Pro Val Lys Glu Lys 530 535 540 Ile Met Ala Val Ile Lys Glu Trp Gly Thr Gly Arg Asp Thr Leu Arg 545 550 555 560 Cys Leu Ala Leu Ala Thr Arg Asp Thr Pro Pro Lys Arg Glu Glu Met 565 570 575 Val Leu Asp Asp Ser Ala Arg Phe Leu Glu Tyr Glu Thr Asp Leu Thr 580 585 590 Phe Val Gly Val Val Gly Met Leu Asp Pro Pro Arg Lys Glu Val Thr 595 600 605 Gly Ser Ile Gln Leu Cys Arg Asp Ala Gly Ile Arg Val Ile Met Ile 610 615 620 Thr Gly Asp Asn Lys Gly Thr Ala Ile Ala Ile Cys Arg Arg Ile Gly 625 630 635 640 Ile Phe Gly Glu Asn Glu Glu Val Ala Asp Arg Ala Tyr Thr Gly Arg 645 650 655 Glu Phe Asp Asp Leu Pro Leu Ala Glu Gln Arg Glu Ala Cys Arg Arg 660 665 670 Ala Cys Cys Phe Ala Arg Val Glu Pro Ser His Lys Ser Lys Ile Val 675 680 685 Glu Tyr Leu Gln Ser Tyr Asp Glu Ile Thr Ala Met Thr Gly Asp Gly 690 695 700 Val Asn Asp Ala Pro Ala Leu Lys Lys Ala Glu Ile Gly Ile Ala Met 705 710 715 720 Gly Ser Gly Thr Ala Val Ala Lys Thr Ala Ser Glu Met Val Leu Ala 725 730 735 Asp Asp Asn Phe Ser Thr Ile Val Ala Ala Val Glu Glu Gly Arg Ala 740 745 750 Ile Tyr Asn Asn Met Lys Gln Phe Ile Arg Tyr Leu Ile Ser Ser Asn 755 760 765 Val Gly Glu Val Val Cys Ile Phe Leu Thr Ala Ala Leu Gly Leu Pro 770 775 780 Glu Ala Leu Ile Pro Val Gln Leu Leu Trp Val Asn Leu Val Thr Asp 785 790 795 800 Gly Leu Pro Ala Thr Ala Leu Gly Phe Asn Pro Pro Asp Leu Asp Ile 805 810 815 Met Asp Arg Pro Pro Arg Ser Pro Glu Glu Pro Leu Ile Ser Gly Trp 820 825 830 Leu Phe Phe Arg Tyr Met Ala Ile Gly Gly Tyr Val Gly Ala Ala Thr 835 840 845 Val Gly Ala Ala Ala Trp Trp Phe Leu Tyr Ala Glu Asp Gly Pro His 850 855 860 Val Asn Tyr Ser Gln Leu Thr His Phe Met Gln Cys Thr Glu Asp Asn 865 870 875 880 Thr His Phe Glu Gly Ile Asp Cys Glu Val Phe Glu Ala Pro Glu Pro 885 890 895 Met Thr Met Ala Leu Ser Val Leu Val Thr Ile Glu Met Cys Asn Ala 900 905 910 Leu Asn Ser Leu Ser Glu Asn Gln Ser Leu Leu Arg Met Pro Pro Trp 915 920 925 Val Asn Ile Trp Leu Leu Gly Ser Ile Cys Leu Ser Met Ser Leu His 930 935 940 Phe Leu Ile Leu Tyr Val Asp Pro Leu Pro Met Ile Phe Lys Leu Arg 945 950 955 960 Ala Leu Asp Leu Thr Gln Trp Leu Met Val Leu Lys Ile Ser Leu Pro 965 970 975 Val Ile Gly Leu Asp Glu Ile Leu Lys Phe Val Ala Arg Asn Tyr Leu 980 985 990 Glu Gly <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GST-TRIM forward primer <400> 4 gcgtcgactc atgtcggctg cacccgg 27 <210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GST-TRIM reverse primer <400> 5 taaagcggcc gctcacagag cccggaacat c 31 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GST-PRY forward primer <400> 6 gcgtcgacct atgccagcgc tggaggaac 29 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GST-PRY reverse primer <400> 7 taaagcggcc gctcactgtg acagcagctg ctg 33 <210> 8 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GST-SPRY forward primer <400> 8 gcgtcgactc atgggcgagc actattggga g 31 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GST-SPRY reverse primer <400> 9 taaagcggcc gctcaggcct gttcctgctc c 31 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GST-PRY-SPRY forward primer <400> 10 gcgtcgacct atgccagcgc tggaggaac 29 <210> 11 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GST-PRY-SPRY reverse primer <400> 11 taaagcggcc gctcaggcct gttcctgctc c 31 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GST-MG53 forward primer <400> 12 gcgtcgactc atgtcggctg cacccgg 27 <210> 13 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GST-MG53 reverse primer <400> 13 taaagcggcc gctcaggcct gttcctgctc c 31 <210> 14 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Scrambled siRNA <400> 14 acgugacacg uucggagaau u 21 <210> 15 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Scrambled siRNA <400> 15 uucuccgaac gugucacguu u 21 <210> 16 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA #1 <400> 16 ccgcaggcuc uaagcacuau u 21 <210> 17 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA #1 <400> 17 uagugcuuag agccugcggu u 21 <210> 18 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA #2 <400> 18 cugucaagcc ugaacucuuu u 21 <210> 19 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA #2 <400> 19 aagaguucag gcuugacagu u 21 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR forward primer <400> 20 aacacctgga tccactgagc 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR reverse primer <400> 21 tctgctgtgg aagctgtgtc 20

Claims (11)

  1. 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 MG53 (mitsugumin 53)의 발현을 억제하는, MG53 에 특이적인 siRNA, shRNA 또는 안티센스 핵산을 포함하는,
    브로디병 또는 브로디신드롬의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  2. 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 MG53 의 활성을 억제하는, MG53 에 특이적인 항체를 포함하는,
    브로디병 또는 브로디신드롬의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 MG53 에 특이적인 siRNA 는 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18 또는 서열번호 19 로 표시되는 핵산서열을 가지는 것인 조성물.
  5. (a) MG53 (mitsugumin 53) 및 SERCA1a (sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase 1a)를 발현하는 세포에 후보 화합물을 처리하는 단계; 및
    (b) 상기 세포에서 MG53 및 SERCA1a 의 상호작용이 저해되는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는,
    브로디병, 브로디신드롬, 근육긴장저하, 다운증후군, 근이영양증, 뇌성마비, 프레더－윌리 증후군 및 테이-샥스병에서 선택되는 근육 질환 치료제를 스크리닝하는 방법.
  6. (a') 분리된 MG53 및 분리된 SERCA1a 의 혼합물에 후보 화합물을 처리하는 단계; 및
    (b') MG53 및 SERCA1a 의 상호작용이 저해되는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는,
    브로디병, 브로디신드롬, 근육긴장저하, 다운증후군, 근이영양증, 뇌성마비, 프레더－윌리 증후군 및 테이-샥스병에서 선택되는 근육 질환 치료제를 스크리닝하는 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 MG53 및 SERCA1a 의 상호작용은 MG53 또는 SERCA1a 에 특이적인 항체를 이용하여 검출하는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 MG53 및 SERCA1a 의 상호작용은 면역탁본법, 면역침전법 또는 면역염색법에 의해 검출하는 것인 방법.
  9. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 MG53 및 SERCA1a 는 각각 리포터 단백질 연결된 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, MG53 및 SERCA1a 의 상호작용은 리포터 단백질의 신호 크기에 의해 검출하는 것인 방법.
  11. 삭제
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