CN113584173A - lncRNA SLC25A21-AS1在作为食管鳞癌标志物中的应用 - Google Patents

lncRNA SLC25A21-AS1在作为食管鳞癌标志物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了lncRNA SLC25A21‑AS1在作为食管鳞癌标志物中的应用。本发明提供了检测LncRNA SLC25A21‑AS1表达量的物质在如下至少一种或制备具有如下至少一种功能的产品中的应用：(1)预测食管鳞癌患者预后状态的产品；(2)预测食管鳞癌患者术后无复发生存率的高低；(3)预测食管鳞癌患者术后整体生存率的高低；(4)预测食管鳞癌患者肿瘤分化程度的高低；本发明的实验证明了lncRNA SLC25A21‑AS1作为一种促肿瘤发展的lncRNA,能通过多种途径影响食管鳞癌的进展，提示lncRNA SLC25A21‑AS1的多功能特性，但在高脂饮食或棕榈酸的影响下表达下调。

Description

lncRNA SLC25A21-AS1在作为食管鳞癌标志物中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及lncRNA SLC25A21-AS1在作为食管鳞癌标志物中的应用。
背景技术
食管癌是世界范围内较为常见的恶性肿瘤，我国的食管癌以食管鳞癌最为常见，由于其恶性程度高，患者预后通常较差。因此，明确食管鳞癌的发病机制和影响因素则显得十分必要。近年来，随着生活水平的提高，肥胖和与之相关的代谢综合征的发病率显著升高，且已有报道其与多种肿瘤的发生和发展十分密切，这其中也包括食管鳞癌。
之前的研究虽提示代谢综合征与食管鳞癌患者预后相关，但考虑到代谢综合征的影响因素十分复杂，因此，拟通过高脂饮食来构建肥胖动物模型，进而探索高脂饮食(High-fat diets,HFD)及所形成的高脂微环境对食管鳞癌的影响。
LncRNA是不编码蛋白且转录本长度超过200nt的长链非编码RNA，占总RNA的比例约为4％-9％,具有保守的二级结构，不同的剪切和亚细胞定位。
发明内容
本发明一个目的是提供检测LncRNA SLC25A21-AS1表达量的物质的功能。
本发明提供了检测LncRNA SLC25A21-AS1表达量的物质在如下至少一种或制备具有如下至少一种功能的产品中的应用：
(1)预测食管鳞癌患者预后状态；
(2)预测食管鳞癌患者术后无复发生存率的高低；
(3)预测食管鳞癌患者术后整体生存率的高低；
(4)预测食管鳞癌患者肿瘤分化程度的高低；
所述LncRNA SLC25A21-AS1的核苷酸序列为序列表中序列1。
上述预后状态体现在术后无复发生存率或术后整体生存率。
上述LncRNA SLC25A21-AS1作为标志物在开发预测食管鳞癌预后状态的试剂中的应用也是本发明保护的范围。
上述检测LncRNA SLC25A21-AS1表达量为检测食管鳞癌细胞中LncRNA SLC25A21-AS1表达量；
上述LncRNA SLC25A21-AS1作为标志物为食管鳞癌细胞中的LncRNA SLC25A21-AS1作为标志物。
本发明另一个目的是提供抑制食管鳞癌细胞中LncRNA SLC25A21-AS1表达的物质的应用。
本发明提供的抑制食管鳞癌细胞中LncRNA SLC25A21-AS1表达的物质在如下至少一种或制备具有如下至少一种功能的产品或制备治疗或抑制如下2)-5)任一种导致的疾病中的应用：
1)治疗或抑制食管鳞癌；
2)抑制食管鳞癌细胞增殖；
3)促进食管鳞癌细胞凋亡；
4)抑制食管鳞癌细胞迁移；
5)抑制食管鳞癌细胞在肺组织中的定植。
上述应用中，所述抑制食管鳞癌细胞中LncRNA SLC25A21-AS1表达的物质为高脂饮食、棕榈酸和/或干扰LncRNA SLC25A21-AS1表达的shRNA。
上述抑制食管鳞癌细胞中LncRNA SLC25A21-AS1表达是通过抑制食管鳞癌细胞中LncRNA SLC25A21-AS1的表达。
本发明还有一个目的是提供一种具有如下至少一种功能的产品。
本发明提供的产品，其为干扰LncRNA SLC25A21-AS1表达的shRNA；
所述shRNA的核苷酸序列为序列表中序列2或序列3；
1)治疗或抑制食管鳞癌；
2)抑制食管鳞癌细胞增殖；
3)促进食管鳞癌细胞凋亡；
4)抑制食管鳞癌细胞迁移；
5)抑制食管鳞癌细胞在肺组织中的定植。
高脂饮食或棕榈酸在如下至少一种或制备具有如下至少一种功能的产品中的应用也是本发明保护的范围：
1)治疗或抑制食管鳞癌；
2)抑制食管鳞癌细胞增殖；
3)促进食管鳞癌细胞凋亡；
4)抑制食管鳞癌细胞迁移；
5)抑制食管鳞癌细胞在肺组织中的定植。
上述应用中，所述高脂饮食中60％脂肪供能。
LncRNA SLC25A21-AS1在制备用于筛选食管鳞癌细胞治疗药物的模型中的应用也是本发明保护的范围；
所述LncRNA SLC25A21-AS1的核苷酸序列为序列表中序列1。
LncRNA SLC25A21-AS1能促进NPM1蛋白与c-Myc蛋白存在相互作用，进而促进c-Myc下游靶点的基因转录与活化来参与肿瘤的发展。
本发明的实验证明，高脂饮食能抑制裸鼠中食管鳞癌细胞皮下瘤的生长，且高脂饮食中的棕榈酸能通过下调lncRNA SLC25A21-AS1的表达起到抑制作用。lncRNASLC25A21-AS1作为一种促肿瘤发展的lncRNA,能通过多种途径影响食管鳞癌的进展，能增强细胞核中NPM1/c-Myc蛋白的相互作用，提示lncRNA SLC25A21-AS1的多功能特性，但在高脂饮食或棕榈酸的影响下表达下调。此外，通过数据库分析以及组织芯片验证均证实lncRNA SLC25A21-AS1的表达水平与肿瘤分化、TNM分期和总体生存预后呈显著的相关性，提示其可能作为食管鳞癌的预后标志物以及潜在的治疗靶点。
附图说明
图1为高脂饮食对裸鼠体重及血生化相关指标的影响。
图2为高脂饮食对裸鼠皮下瘤生长的影响。
图3为靶向代谢组学分析和三种脂肪酸对食管鳞癌细胞增殖的影响。
图4为棕榈酸对食管鳞癌细胞迁移、调亡及脂毒性的影响；A图：不同浓度的棕榈酸PA对食管鳞癌细胞迁移能力具有抑制作用，t检验进行统计分析；B图：不同浓度的棕榈酸PA能诱导食管鳞癌细胞发生调亡，实验方法为AnnexinV-FITC/PI，t检验进行统计分析；C图：不同浓度的棕榈酸PA对正常食管上皮细胞系Het1A细胞增殖的影响，实验方法为CCK8，方差分析进行统计分析；D图：不同浓度梯度的棕榈酸PA作用于食管鳞癌细胞后进行检测，实验方法为CCK8，比较不同浓度下OD值的比值比(相较于0μM)，计算细胞活力和IC50。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。
图5为转录组学测序分析联合数据库共同筛选目标lncRNA；A为3种细胞系中下调和上调基因交集的韦恩图；B为三种细胞系和数据库共同取交集的差异基因热图。
图6为SLC25A21-AS1的表达与预后、肿瘤分化分期显著相关，并受棕榈酸的影响；图A:在GSE53625数据库中绘制SLC25A21-AS1高低表达患者的Kaplan-Meier生存曲线。表明SLC25A21-AS1低表达的患者预后要好于SLC25A21-AS1高表达的患者，其中SLC25A21-AS1的高低表达是根据其表达的中位数将患者分为高低表达组；图B:在GSE53625数据库中，SLC25A21-AS1的表达在高脂血症患者中呈现低表达，且SLC25A21-AS1表达升高与肿瘤低分化和较晚的TNM分期显著相关，统计方法选择非参数检验；图C:不同浓度棕榈酸作用24h后检测食管鳞癌细胞系中SLC25A21-AS1的表达情况，表明棕榈酸PA能下调其表达，统计方法选择t检验；统计方法选择t检验。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。
图7为SLC25A21-AS1的表达和预后的相关性；图A:RT-qPCR方法分析食管鳞癌cDNA芯片表明SLC25A21-AS1在配对的食管鳞癌和癌旁组织中无显著差异表达，实验方法是用Delta CT方法，值越高代表表达越低，非参数检验进行统计；图B：在食管鳞癌cDNA芯片患者中，表明SLC25A21-AS1高表达的患者预后差于SLC25A21-AS1低表达的患者，其中SLC25A21-AS1的高低表达是根据其表达的中位数将患者分为高低表达组；图C：在食管鳞癌cDNA芯片患者中，SLC25A21-AS1的高表达与较高的N分期和较差的肿瘤分化显著相关。*p<0.05；**p<0.01。
图8为敲降SLC25A21-AS1抑制细胞增殖、克隆形成和迁移能力；图A：在食管鳞癌细胞系KYSE30和KYSE450中敲降SLC25A21-AS1表达的效率，统计检验方法为t检验；图B：敲降SLC25A21-AS1表达能显著抑制食管鳞癌细胞系KYSE30和KYSE450的细胞增殖，实验方法为CCK8，统计检验方法为方差分析；图C：敲降SLC25A21-AS1表达能抑制食管鳞癌细胞系KYSE30和KYSE450的克隆形成，统计检验方法为t检验；图D：敲降SLC25A21-AS1表达能抑制食管鳞癌细胞系KYSE30和KYSE450的细胞迁移能力，实验方法为Tranwell，统计检验方法为t检验。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。
图9为敲降SLC25A21-AS1的表达抑制裸鼠皮下瘤生长和肺定植能力；图A：裸鼠皮下瘤实验表明敲降SLC25A21-AS1表达和对照组在正常饮食CD和高脂饮食HFD组中的成瘤图片；图B：通过比较皮下瘤生长曲线和成瘤重量，提示在正常饮食CD和高脂饮食HFD组中敲降SLC25A21-AS1表达均可显著抑制细胞系KYSE30的成瘤能力和生长，统计检验方法为非参数检验；图C：敲降SLC25A21-AS1的表达能抑制食管鳞癌细胞系KYSE30在肺组织中定植瘤的数量，统计检验方法为t检验；图D：对皮下瘤组织进行免疫组化分析，结果表明敲降SLC25A21-AS1表达能显著降低Ki67和Vimentin的表达水平，Ki67用来反映肿瘤的增殖能力，Vimentin用来反映肿瘤的迁移侵袭能力，统计检验方法为t检验。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。
图10为在食管鳞细胞系过表达SLC25A21-AS1的表达效率。
图11为过表达SLC25A21-AS1促进细胞增殖、克隆形成、迁移和抗凋亡；图A：在食管鳞癌细胞系KYSE30和KYSE450中上调SLC25A21-AS1的表达，以及在100μM棕榈酸PA的作用下，过表达SLC25A21-AS1均能促进其克隆形成，统计检验方法为t检验；图B：在细胞系KYSE30和KYSE450中上调SLC25A21-AS1的表达，以及在100μM棕榈酸PA的作用下，过表达SLC25A21-AS1均能促进细胞增殖，实验方法为CCK8，统计检验方法为t检验；图C：在细胞系KYSE30和KYSE450中上调SLC25A21-AS1的表达，以及在100μM棕榈酸PA的作用下，过表达SLC25A21-AS1均能促进细胞迁移，统计检验方法为t检验；图D：在100μM棕榈酸PA的作用下，过表达SLC25A21-AS1能部分抵抗棕榈酸PA诱导的调亡，实验方法为AnnexinV-APC/PI，统计检验方法为t检验。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。
图12为过表达SLC25A21-AS1促进裸鼠皮下瘤生长和肺定植能力；图A：裸鼠皮下瘤实验显示过表达SLC25A21-AS1和对照组在正常饮食CD和高脂饮食HFD组中的成瘤图片；图B：通过比较皮下瘤生长曲线和成瘤重量，提示在正常饮食CD和高脂饮食HFD组中过表达SLC25A21-AS1均可显著促进KYSE30细胞系的成瘤和生长，统计检验方法为非参数检验；图C：过表达SLC25A21-AS1能促进细胞系KYSE30的在肺组织中的定植瘤数量，统计检验方法为t检验；图D：皮下瘤组织免疫组化结果表明过表达SLC25A21-AS1能上调Ki67和Vimentin的表达水平，统计检验方法为t检验。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。
图13为LncRNA SLC25A21-AS1在食管鳞癌细胞系中的定位；A:对食管鳞癌细胞系KYSE30和KYSE450进行细胞质、细胞核分别提取RNA，随后进行反转录和RT-qPCR，结果提示SLC25A21-AS1主要在细胞核中表达。GAPDH作为细胞质的内参对照，U99作为细胞核的内参对照；图B:通过RNA-FISH实验表明在食管鳞癌细胞系KYSE30和KYSE450中，SLC25A21-AS1大部分位于细胞核及核周围，DAPI蓝色染细胞核，红色探针标记目标lncRNA SLC25A21-AS1,Merge为合成图。
图14为SLC25A21-AS1影响NPM1与c-Myc的相互作用；图A：洗脱下与SLC25A21-AS1和阴性对照相结合的蛋白后进行银染胶图，箭头标记的为NPM1蛋白位置；图B：切胶后进行蛋白质谱检测的结果，红色字体为接下来选择研究的NPM1蛋白；图C：左图是通过RT-qPCR方法证实NPM1蛋白与SLC25A21-AS1相互作用，右图是通过PCR凝胶电泳方法证实NPM1蛋白与SLC25A21-AS1相互作用，统计检验方法为t检验；图D：过表达SLC25A21-AS1能增强NPM1蛋白与c-Myc蛋白的相互作用，反之c-Myc蛋白在过表达SLC25A21-AS1细胞系中结合NPM1的能力更强。Input为阳性对照，IB为免疫印迹，IP为免疫沉淀。**p<0.01；***p<0.001。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例选择的39例食管鳞癌组织样本，取材于2012年01月到2012年12月，在中国医学科学院肿瘤医院进行外科手术治疗的患者，术前未进行新辅助放化疗。术后均证实为食管鳞癌，规范取材，分别标记，液氮保存，通过医院伦理委员会审批。
下述实施例选择的食管鳞癌cDNA样本芯片(上海芯超HEsoS095Su01)，包含28对配对的癌及癌旁组织及39个单独的癌组织，获取于上海芯超，用于RT-qPCR，用于分析比较lncRNA SLC25A21-AS1在癌及癌旁中表达情况，验证患者整体生存、临床病理特点的关系。
下述实施例所用动物饲养于我院动物实验中心，SPF级饲养室，温度设定为25-27℃，湿度为45％-50％，新鲜过滤空气，定期更换饲养笼。
下述实施例中的总生存期(Overall Survival，OS)定义为从术后至任何原因导致的死亡或末次随访时间。
下述实施例中的无复发生存期(Recurrence free survial,RFS)定义为从术后至出现肿瘤复发的时间，或末次随访仍无复发的时间。
实施例1、高脂饮食抑制裸鼠食管鳞癌皮下瘤的生长
一、高脂饮食抑制裸鼠食管鳞癌皮下瘤的生长
皮下成瘤实验中使用的小鼠为BALB/cA-nu裸鼠(北京华阜康公司)。选择雄性BALB/cA-nu裸鼠，3-4周龄，体重在18-22g之间。
1、高脂诱导肥胖动物模型的构建
选择4周龄大的雄性裸鼠(BALB/cA-nu)，每组10-15只，随机分成2组，分为普通饮食组(Common diet,CD)和高脂饮食组(High fat diet,HFD)，耳钉进行编号，每笼最多放5只。
裸鼠适应性喂养一周后，进行首次称重，记录初始体重情况，耳钉标记。正常饮食组喂养灭菌的普通饲料(13.8％脂肪供能，华阜康产品)，高脂饮食组喂养60％脂肪供能的灭菌高脂饲料(饲料冷藏保存，保质期3个月，每周彻底更换一次饲料，华阜康产品)。其他条件均一致，自由活动，饮水。每周记录裸鼠体重，观察裸鼠精神活动，进食进水情况。连续喂养12周后，比较高脂饮食和正常饮食裸鼠的体重变化情况，然后通过CO2法麻醉随机处死3-5只老鼠，获取全血样本，肝素抗凝，30分钟内于2-8℃3000rpm离心15min，立即检测血糖、甘油三酯、胆固醇等指标。
结果如图1所示，A图：高脂饮食HFD喂养比正常饮食CD喂养的裸鼠生长更快，体重明显增加，秩和检验进行统计分析；B图：从左到右分别比较高脂HFD组和正常CD组间血糖、总胆固醇和甘油三酯的差异水平，表明高脂饮食组能显著提高血浆总胆固醇和甘油三酯，秩和检验进行统计分析。*p<0.05；**p<0.01；高脂饮食组比正常饮食组喂养的裸鼠生长更快(图1A)，喂养完12周后，获取裸鼠的血液样本，分别比较血糖、甘油三酯和总胆固醇的水平，发现高脂饮食喂养的裸鼠血糖水平较正常组稍高，但甘油三酯和总胆固醇的水平在高脂饮食组中显著升高(p<0.05)(图1B)。这些结果表明高脂饮食能成功的构建肥胖动物模型。
上述高脂饲料以富含饱和脂肪酸的猪油作为主要脂肪来源，具体供能情况如下表1：
表1为高脂饲料供能情况
Figure BDA0003208596590000061
Figure BDA0003208596590000071
详细配方参考华阜康网站介绍(http://www.hfkbio.com/cms/item/view？table＝product&id＝50)。
2、高脂饮食抑制裸鼠皮下瘤的生长
(1)动物准备：将上述1制备的连续喂养12周的高脂饮食组裸鼠和普通饮食组裸鼠作为待接种动物。
(2)细胞准备：采用食管鳞癌细胞系KYSE30细胞系(德国DSMZ保藏中心，ACC 351)分别注射到上述高脂饮食组小鼠和普通饮食组小鼠中。每只小鼠注射1.0-1.2×106个细胞。根据需要注射的小鼠数目，准备充足数量的生长状态良好，处于对数期的细胞。胰酶消化后计数，PBS重悬后冰上备用。
(3)接种细胞：接种细胞前再次充分混匀细胞，酒精擦拭，消毒皮肤，使用1ml注射器，每只小鼠背部皮下注射约200μl的细胞悬液(细胞悬液为将细胞悬浮在PBS缓冲液中，得到细胞悬液，浓度为5*106个细胞/mL)，尽量不让细胞悬液漏出，同时也注意避免注射器或细胞悬液喷溅到皮肤等。
(4)测量记录：肿瘤细胞悬液接种后约1-2周左右成瘤，因此在接种1周后，每隔3天左右观察皮下成瘤情况，如已经成瘤，需测量长径和宽径，以及体重情况，间隔3-5天记录一次，最后计算体积的方式为：长径乘以宽径的平方，之后在除以2来计算肿瘤的体积。
(5)解剖：在接种第4-5周左右(肿瘤组织的体积尽量小于2000mm3)。本研究中选择CO2麻醉法处死小鼠，完整解剖皮下肿瘤组织，PBS冲洗干净。
(6)拍照和称重：对解剖出的皮下肿瘤进行拍照和称重。拟提取组织的RNA和蛋白的瘤组织可先-80℃保存，使用福尔马林固定皮下成瘤组织，需尽快进行石蜡包埋，可进行后续的HE染色和免疫组化(IHC)染色。
结果如图2所示，A图：高脂饮食诱导肥胖动物皮下瘤模型构建的示意图；B图：高脂饮食组HFD和正常饮食组CD组裸鼠皮下移植瘤照片，秩和检验进行统计分析；C图：高脂饮食组HFD同正常饮食组CD组裸鼠皮下移植瘤相比，生长速度减慢，且体积和重量明显减小，秩和检验进行统计分析。**p<0.01；***p<0.001；在分别喂养12周后，对高脂饮食组和正常饮食组的裸鼠进行皮下接种人食管鳞癌细胞，细胞选择生长状态良好、且处于对数生长期和已证实可以成瘤的人食管鳞癌细胞系KYSE30，细胞量为每只裸鼠106个细胞，接种在背部皮下构建裸鼠皮下成瘤模型(图2A)。接种后继续喂养4-5周，每周定期测量皮下瘤组织大小，绘制生长曲线。研究结果显示高脂饮食组的裸鼠皮下瘤同正常饮食组相比，生长速度减慢，且体积和重量明显减小(图2B,2C)，表明高脂饮食能够抑制裸鼠食管鳞癌皮下瘤的生长。
二、棕榈酸抑制食管鳞癌
1、靶向代谢组学分析多种中长链脂肪酸在两组间呈显著差异
为明确高脂饮食中脂肪酸对食管鳞癌细胞皮下成瘤的影响，选择靶向中长链脂肪酸代谢组学分析，探索高脂饮食组和正常饮食组小鼠皮下瘤中的中长链脂肪酸浸润水平的差异。
本研究中靶向代谢组学分析委托上海中科新生命生物公司，基于GC-MS靶向代谢组学分析中长链脂肪酸，具体实验方法如下：
(1)样本制备：用NU-CHEK-PREP 37种脂肪酸甲酯混合标准品溶液制成0.5mg/L,1mg/L,5mg/L,10mg/L,25mg/L,50mg/L,100mg/L,250mg/L,500mg/L，1000mg/L十个混合标准浓度梯度,其中浓度为各组分的总浓度。
(2)代谢物提取：取50mg各组皮下瘤样本于2mL玻璃离心管中。加入1mL的氯仿甲醇溶液，超声30min，取上清液，加入1％的硫酸-甲醇溶液2mL，放在80℃水浴上，甲酯化半小时，再加1mL的正己烷萃取，加5mL的纯水洗涤,吸取上清液500μL，加入25μL加入25μL的水杨酸甲酯作为内标，混匀加入进样瓶，进入GC-MS检测，进样量1μL，分流比10:1，分流进样。
(3)色谱-质谱分析：气相色谱采用Agilent DB-WAX毛细管柱气相色谱系统进行分离。质谱分析采用Agilent 7890A/5975C气-质联用仪进行质谱分析。
(4)数据处理：采用MSD ChemStation软件提取色谱峰面积及保留时间。绘制标曲曲线,计算样品中中长链脂肪酸的含量。
结果如图3所示，A图：通过靶向代谢组学分析提示多种饱和或不饱和脂肪酸在高脂饮食组HFD和正常饮食组CD中存在显著差异(p<0.05)，C16:0是棕榈酸，C18:0是硬脂酸，C18:1N9是油酸，t检验进行统计分析；B图：不同浓度的硬脂酸C18:0对食管鳞癌细胞增殖的影响，实验方法为CCK8，方差分析进行统计分析；C图：不同浓度的油酸C18:1N9对食管鳞癌细胞增殖具有抑制作用，实验方法为CCK8，方差分析进行统计分析；D图：不同浓度的棕榈酸C16:0对食管鳞癌细胞增殖有抑制作用，且随浓度依赖，实验方法为CCK8，方差分析进行统计分析；E图：不同浓度的棕榈酸C16:0对食管鳞癌细胞克隆形成有抑制作用，且随浓度依赖，t检验进行统计分析。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)；可以看出，多种饱和或不饱和脂肪酸在高脂饮食组和正常饮食组中存在显著差异(p<0.05；图3A)。其中，发现棕榈酸(C16:0；p＝0.022)、硬脂酸(C18:0；p＝0.023)和油酸(C18:1N9；p＝0.015)在两组间皮下瘤组织中浸润水平较高并呈现显著性差异。
为进一步明确这三种脂肪酸中哪种可能起最主要的作用，使用不同浓度(0，20，50，100和200μM)棕榈酸分别作用于食管鳞癌细胞系KYSE30和KYSE450，通过CCK8细胞增殖实验明确其影响。研究结果发现，低浓度的硬脂酸(20μM)具有促进食管鳞癌细胞增殖作用，但随着浓度升高反而呈现显著的抑制作用(图3B)。不同浓度的油酸均也呈抑制作用但不随浓度梯度改变(图3C)。最后，发现只有棕榈酸能随着浓度依赖的方式对食管鳞癌细胞起显著的抑制作用，CCK8增殖实验和克隆形成实验均证实其影响(图3D，3E)。因此，接下来主要探索棕榈酸对食管鳞癌细胞系中的影响。
2、棕榈酸抑制食管鳞癌细胞的迁移和诱导调亡
1)细胞迁移能力(migration)使用的是Corning 3422transwell小室
(1)水化：细胞操作台中取出小室，上、下室内分别加入200μl和600μl预热的无血清培养基，培养箱内水化1-2小时。
(2)铺板：取出水化好的transwell小室，弃培养基。在上层小室内加入最多200μl的细胞混悬液。在下室内加入600μl含20％FBS的培养基，继续放入培养箱中培养24-36h。
上述细胞混悬液为将食管鳞癌细胞系KYSE30和KYSE450(德国DSMZ保藏中心，ACC351；ACC 387)分别在含有0、50、100μM浓度棕榈酸的培养基中培养至24小时得到的细胞培养液。
(3)细胞固定和染色：4％多聚甲醛中固定15分钟，结晶紫染色30分钟。流水或PBS冲洗，注意水流不宜大，不能直接冲洗小室膜。棉签擦拭干净，室温晾干。
(4)封片和拍照：将小室沿周边切割下，中性树脂和盖玻片封片，避免气泡。倒置显微镜拍照或扫描仪扫描。取上、下、左、右、中视野进行统计。以棕榈酸浓度为0μM作为对照。
相对细胞迁移率＝棕榈酸刺激后细胞迁移视野细胞个数/对照组细胞(不添加棕榈酸)迁移视野细胞个数
结果如图4A所示，发现棕榈酸能抑制食管鳞癌细胞的迁移能力，且随着浓度升高抑制作用更显著。
2)细胞调亡实验
采用凯基生物的AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒检测：
(1)细胞铺板：KYSE30和KYSE450细胞系(德国DSMZ保藏中心，ACC 351；ACC 387)细胞种于10cm培养皿中，做好分类标记。
(2)棕榈酸干预：细胞贴壁后，按照实验目的加含不同浓度(50μM、100μM)棕榈酸的培养基(干预组)以及对照(不添加棕榈酸)，继续培养箱中培养24小时。
(3)细胞收集和染色：用不含EDTA的胰酶消化，800转离心3分钟，弃上清后加入500μl的Binding Buffer重悬细胞。混匀后向每管加5μl Annexin V-APC或Annexin V-FITC(南京凯基生物，KGA105)，仔细吹打混匀后，再加入5μl的PI染液，混合均匀。避光、室温孵育5～15分钟。
(4)调亡检测：细胞最好在1小时内行流式细胞仪检测。
相对凋亡率(简称凋亡率)＝三个复孔的干预组早期凋亡率加晚期凋亡率的平均数/对照组早期凋亡率加晚期凋亡率的平均数
结果如图4B，随着棕榈酸浓度的提高，棕榈酸能呈不同程度诱导食管鳞癌细胞的凋亡。
3)棕榈酸对食管上皮细胞的影响
为了明确棕榈酸对食管上皮细胞可能存在的脂毒性影响，选择永生化人正常食管上皮细胞Het1A，用来分析棕榈酸对其增殖的影响。
将Het1A细胞系(ATCC细胞库,CRL2692)在含有不同浓度的棕榈酸(0,20,50,75,100,200μM)的BEGM培养基中培养24小时，随后通过CCK8对细胞增殖(南京凯基CCK-8法细胞增殖检测试剂盒，KGA317)进行检测。
相对细胞活性＝(不同时间点的实验组OD值-空白孔OD值)/(0时对照组OD值-空白孔OD值)
结果如下，在低浓度条件下(20μM和50μM)能促进Het1A细胞的增殖，随着浓度升高，直到200μM时才出抑制作用(图4C)。
随后，将食管鳞癌细胞系KYSE30和KYSE450在含有不同浓度(0,5,10,20,50,75,100,150,200μM)的棕榈酸的完全1640培养基中培养24小时，采用CCK8细胞增殖检测(南京凯基CCK-8法细胞增殖检测试剂盒，KGA317)，分析棕榈酸对食管鳞癌细胞增殖的半抑制浓度IC50，发现100μM是食管鳞癌细胞系KYSE30和KYSE450的半数抑制浓度(图4D)。
考虑到100μM对正常食管上皮细胞是无脂毒性的，因此，选择100μM作为探索棕榈酸对食管鳞癌细胞的影响是比较合适。
实施例2、高脂相关lncRNA SLC25A21-AS1及其在食管鳞癌术后生存中的应用一、高脂相关lncRNA SLC25A21-AS的筛选和验证
通过转录组测序(RNA-seq)分析来探索棕榈酸影响食管鳞癌细胞的可能作用机制，选择了三种食管鳞癌细胞系KYSE30，KYSE450和KYSE150(德国DSMZ保藏中心，ACC 351；ACC 387；ACC375)，使用100μM棕榈酸作用24小时后提取细胞总RNA送测序。通过细胞系转录组测序结果以及结合数据库GSE53625共同筛选，得到命名为lncRNA SLC25A21-AS1(ENSG00000258708)的lncRNA，其在细胞系转录组测序分析和数据库中均存在显著差异。
图5中棕榈酸100μM作用在食管鳞癌细胞系KYSE30、KYSE450和KYSE150中共同下调和上调的lncRNA的热图，A为3种细胞系中下调和上调基因交集的韦恩图；B为三种细胞系和数据库共同取交集的差异基因热图。其中红色字体标注的是与数据库中差异lncRNA(按有无高脂血症进行分组)有交集的，箭头标注的为接下来要研究的LncRNA SLC25A21-AS1。
LncRNA SLC25A21-AS1(简称为SLC25A21-AS1)是SLC25A21反义RNA，通过RACE实验，结果证实lncRNA SLC25A21-AS1在食管鳞癌细胞系KYSE30中全长为1703bp，其核苷酸序列为序列1。
二、高脂相关lncRNA SLC25A21-AS1与临床特征的相关性
1、高脂相关lncRNA SLC25A21-AS1与食管鳞癌患者术后整体生存率和无复发生存率相关
1)lncRNA SLC25A21-AS1表达量的获得
获来自GEO数据库中的GSE536235数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc＝GSE53625)中179例食管鳞癌患者(术后)的癌组织中的lncRNASLC25A21-AS1表达量、无复发生存期和总生存期(表2所示)。
表2为GSE536235队列179例食管鳞癌患者的表达量的结果
Figure BDA0003208596590000111
Figure BDA0003208596590000121
Figure BDA0003208596590000131
Figure BDA0003208596590000141
Figure BDA0003208596590000151
Figure BDA0003208596590000161
上表中，第3列中复发状态的1表示第2列随访时间内复发，0表示第2列随访时间内无复发或者失访；第5列中死亡状态的1表示第4列随访时间内死亡，0表示第4列随访时间内未死亡或者失访；第8列中的“是”为食管鳞癌患者仅合并高脂血症，“否”为没有并发症的食管鳞癌患者。
2)分组
根据每个患者的lncRNA SLC25A21-AS1表达量将GSE536235训练集的患者(179例患者)依据整体lncRNA SLC25A21-AS1表达量中位数(8.90)分为lncRNA SLC25A21-AS1高表达量组(N＝90)和lncRNA SLC25A21-AS1低表达量组(N＝89)。
3)绘制Kaplan-Meier生存曲线
用R软件将GSE53625数据库中高表达量组和低表达量组中患者的无复发生存率和整体生存率绘制Kaplan-Meier生存曲线。
结果如图6A所示，表明lncRNA SLC25A21-AS1低表达的患者整体生存率和无复发生存率要好于lncRNA SLC25A21-AS1高表达的患者。
因此，可以通过检测待测患者癌组织样本中lncRNA SLC25A21-AS1的表达量来预测或辅助预测待测患者术后预后效果，判断标准如下：
高表达量组中的待测患者的无复发生存率低于或候选低于低表达量组中的待测患者；
和/或，高表达量组中的待测患者的整体生存率低于或候选低于低表达量组中的待测患者。
2、合并高脂血症的食管鳞癌患者的肿瘤组织中lncRNA SLC25A21-AS1的表达
获来自GEO数据库中的GSE536235数据库中179例食管鳞癌患者的癌组织中的lncRNA SLC25A21-AS1表达量、肿瘤TNM分期，肿瘤分化以及患者是否合并高脂血症的临床信息资料(具体如前面表1所示)，其中合并高脂血症食管鳞癌患者为27例，正常食管鳞癌患者(非合并高脂血症)为33例。
结果如图6B所示，在GSE53625数据库中，lncRNA SLC25A21-AS1的表达在合并高脂血症食管鳞癌患者中呈现低表达，且lncRNA SLC25A21-AS1表达升高与肿瘤低分化和较晚的TNM分期显著相关，统计方法选择非参数检验，发现合并高脂血症的食管鳞癌患者的肿瘤组织中lncRNA SLC25A21-AS1的表达同正常食管鳞癌患者(包括高血脂、高血糖、高血压和BMI均在正常范围内，即不合并高脂血症)相比呈显著的低表达。更重要的是，发现lncRNASLC25A21-AS1的表达升高与肿瘤低分化和较晚的TNM分期均呈显著相关(图6B)。
这部分结果提示lncRNA SLC25A21-AS1的低表达与患者的较好的预后显著相关。
3、棕榈酸与lncRNA SLC25A21-AS1的相关性
将食管鳞癌细胞系在含有不同浓度的棕榈酸(0,20,50和100μM)的培养基中培养24小时，随后通过RT-qPCR对细胞中lncRNA SLC25A21-AS1的表达进行检测，提取细胞的cDNA作为模板，用lncRNA SLC25A21-AS1特异性引物进行RT-qPCR扩增，
引物序列为：β-Actin内参引物为β-Actin-F和β-Actin-R；lncRNA SLC25A21-AS1的特异性引物为SLC25A21-AS1-F和SLC25A21-AS1-R；
表3为lncRNA SLC25A21-AS1的引物
β-Actin-F CATGTACGTTGCTATCCAGGC
β-Actin-R CTCCTTAATGTCACGCACGAT
SLC25A21-AS1-F GCCAACCCAAACCCATCC
SLC25A21-AS1-R CGCAGCCTGCACAGCCTACT
GAPDH-F GGACCTGACCTGCCGTCTAG
GAPDH-R GTAGCCCAGGATGCCCTTGA
U99-F CCTCCTTTTCTTGGCGGGGA
U99-R CGTTTGAGGATAGAACCAGC
通过RT-qPCR方法对目标cDNA进行检测，获得其CT值，将目标基因lncRNASLC25A21-AS1的CT值减去内参基因β-Actin的CT值，既为所需要的相对表达量。
结果如图6C所示，证实棕榈酸也能下调lncRNA SLC25A21-AS1的表达，并随浓度依赖。
这部分结果棕榈酸能够下调lncRNA SLC25A21-AS1的表达。
三、验证lncRNA SLC25A21-AS1可作为食管鳞癌患者预后的标志物
1、食管鳞癌cDNA组织芯片验证
1)lncRNA SLC25A21-AS1的表达量的获得
获取了食管鳞癌cDNA组织芯片(上海芯超HEsoS095Su01)，共包含67名患者。提取癌症和癌旁组织的cDNA作为模板，用lncRNA SLC25A21-AS1特异性引物进行RT-qPCR扩增，与上述二中的3的方法相同，得到lncRNA SLC25A21-AS1的相对表达量。
结果如图7A所示，可以看出，提示SLC25A21-AS1在食管鳞癌和癌旁组织中无显著差异，实验方法是计算Delta CT方法，值越高代表表达越低，非参数检验进行统计。
根据相对表达量的高低排序，获取最优的能区分高低表达组生存的表达值(该验证集的最佳区分表达值为4.90)，进行分组，绘制Kaplan-Meier生存曲线。
高表达量组中的待测患者的整体生存率低于或候选低于低表达量组中的待测患者。
高表达量组中的待测患者的肿瘤分化程度低于或候选低于低表达量组中的待测患者。
肿瘤分化程度分为高分化、中分化和低分化
Ⅰ级(G1)，即分化良好者称为高分化，肿瘤细胞接近相应的正常发源组织，恶性程度低；
Ⅲ级(G3)，分化较低的细胞称为低分化，肿瘤细胞与相应的正常发源组织区别大、分化差，为高度恶性；
Ⅱ级(G2)，组织异型性介于Ⅰ级和Ⅲ级之间者，恶性程度居中，称为中分化。
结果如下：在食管鳞癌cDNA芯片患者中，表明lncRNA SLC25A21-AS1高表达的患者预后(整体生存率)差于lncRNA SLC25A21-AS1低表达的患者(图7B)，其中lncRNASLC25A21-AS1的高低表达是根据其表达的中位数将患者分为高低表达组；图C：在食管鳞癌cDNA芯片患者中，lncRNA SLC25A21-AS1的高表达与较高的N分期和较差的肿瘤分化显著相关。*p<0.05；**p<0.01)，癌和癌旁组织之间没有显著差异(图7A)，但lncRNA SLC25A21-AS1的高表达与患者不良预后显著相关(图7B)，同时lncRNA SLC25A21-AS1的高表达也与肿瘤的低分化和较高的N分期显著相关(图7C)。
实施例3、lncRNA SLC25A21-AS1在治疗食管鳞癌细胞中的生物学功能
一、敲降lncRNA SLC25A21-AS1抑制食管鳞癌细胞的增殖和迁移能力
1、细胞水平
1)敲除载体的构建
为了探索lncRNA SLC25A21-AS1对食管鳞癌细胞的影响，使用短发夹RNA(shRNA)在KYSE30和KYSE450细胞系(德国DSMZ保藏中心，ACC 351；ACC387)中敲降lncRNASLC25A21-AS1的表达，具体方法如下：
lncRNA SLC25A21-AS1的shRNA(Short hairpin RNA)构建至GV654敲降载体(元件顺序：hU6-MCS-Ubiquitin-mCherry-IRES-Neomycin)上，靶点区域在lncRNA SLC25A21-AS1和SLC25A21基因的非重叠区域，由北京合生基因合成；分别得到表达NC-shRNA的敲除载体、表达shlncRNA SLC25A21-AS1-2的敲除载体和表达shlncRNA SLC25A21-AS1-3的敲除载体。
表4为靶向lncRNA SLC25A21-AS1的shRNA序列
Figure BDA0003208596590000191
2)慢病毒包装
本研究使用Thermo公司的LipofectamineTM3000进行转染，按照试剂说明书进行操作，具体如下：
(1)细胞准备：按照细胞培养的详细方法复苏、传代293T细胞(中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心，1101HUM-PUMC000091)。293T细胞接种于10cm培养皿，使用DMEM培养基培养，汇合到70％-80％左右时，生长良好，进行后续实验，转染前常规换液。
(2)转染细胞：制备质粒DNA+转染试剂的混合物，即：250μl Opti-MEM培养基+10μlLipofectamine 3000与250μl Opti-MEM培养基+质粒(pLP1、pLP2、pLP/VSVG(ThermoFisherscientific,K497500)和目的质粒各5μg)+10μl P3000。二者室温孵育10分钟。加入到293T细胞中，培养箱中培养。目的质粒分别为表达NC-shRNA的敲除载体、表达shlncRNASLC25A21-AS1-2的敲除载体和表达shlncRNA SLC25A21-AS1-3的敲除载体。
(3)换液：培养箱中转染6-8小时后，可对细胞进行换液，PBS同时轻柔清洗2遍。也可不进行换液。
(4)收集病毒液：分别于换液48小时和72小时后，收集变色的293T培养基。小心将培养基转移新的离心管中，2500转，离心10分钟，上清分别为各种敲降质粒获得的病毒液。
3)慢病毒感染目的细胞系
(1)目的细胞准备：将生长状好，对数生长的食管鳞癌细胞KYSE30和KYSE450(德国DSMZ保藏中心，ACC 351；ACC 387)分别接种于六孔板，继续培养12-24小时，细胞汇合度在40％左右，进行后续操作。
(2)慢病毒感染：弃旧培养基，PBS洗2遍，每孔加入1ml的新培养基+1ml的恢复至室温的上述2)得到的各种敲降质粒获得的病毒液+polybrene 10μg/孔(终浓度为5μg/ml)，轻摇混匀。继续培养12-24小时后，换成完全培养基。
(3)稳定细胞系筛选：适当浓度的嘌呤霉素进行筛选(预实验摸索的浓度在食管鳞癌细胞系中为2μg/ml)。此外，用G418代替新霉素对新霉素抗性的药物进行筛选(预实验摸索的浓度在食管鳞癌细胞系中为300μg/ml)。定时观察细胞死亡情况，注意观察，定时换液。
(4)敲降效率验证：嘌呤霉素筛选1星期后(G418需筛选2周)，细胞趋于稳定，得到表达NC-shRNA的敲除载体敲降后细胞、表达shlncRNA SLC25A21-AS1-2的敲除载体敲降后细胞、表达shlncRNA SLC25A21-AS1-3的敲除载体敲降后细胞。
通过RT-qPCR(同前)表达水平，评估转染效果。
结果如图8A所示，可以看出，表达shlncRNA SLC25A21-AS1-2的敲除载体(敲降质粒Sh2)、表达shlncRNA SLC25A21-AS1-2的敲除载体(敲降质粒Sh3)敲除转染食管鳞癌细胞系KYSE30和KYSE450后，细胞中lncRNA SLC25A21-AS1的相对表达量与转入空载体表达NC-shRNA的敲除载体(对照质粒，含有NC-shRNA)相比降低。表明，敲降效率较好。
5)CCK8细胞增殖实验、细胞迁移实验和克隆形成实验
将上述表达NC-shRNA的敲除载体敲降后细胞、表达shlncRNA SLC25A21-AS1-2的敲除载体敲降后细胞、表达shlncRNA SLC25A21-AS1-3的敲除载体敲降后细胞分别采用CCK8细胞增殖检测(南京凯基CCK-8法细胞增殖检测试剂盒，KGA317，培养细胞后检测)、克隆形成(六孔板)和Tranwell细胞迁移实验(Coring，3422，同实施例1的二的2)。
克隆形成检测方法如下：
(1)生长较好的细胞，胰酶消化计数，梯度稀释细胞，接种于六孔板中，铺匀后放入培养箱中培养。
(2)培养箱中培养，约1-2周，生长至肉眼可见克隆时，停止实验，随后进行固定、染色。
(3)固定和染色：4％多聚甲醛固定，约15-30分钟。结晶紫染色20分钟。最后，PBS或流水冲洗干净，晾干后拍照。
相对细胞克隆形成数目＝实验组6孔板内克隆形成的数目/对照组6孔板内克隆形成的数目
结果如图8B-8D所示，图B：敲降lncRNA SLC25A21-AS1表达能显著抑制食管鳞癌细胞系KYSE30和KYSE450的细胞增殖，实验方法为CCK8，统计检验方法为方差分析；图C：敲降lncRNA SLC25A21-AS1表达能抑制食管鳞癌细胞系KYSE30和KYSE450的克隆形成，统计检验方法为t检验；图D：敲降lncRNA SLC25A21-AS1表达能抑制食管鳞癌细胞系KYSE30和KYSE450的细胞迁移能力，实验方法为Tranwell，统计检验方法为t检验；表明敲降lncRNASLC25A21-AS1的表达能显著抑制食管鳞癌细胞的增殖和克隆形成。通过Tranwell细胞迁移实验，研究结果也表明，敲降lncRNA SLC25A21-AS1表达细胞的迁移能力显著降低。
2、体内实验
1)皮下成瘤
皮下成瘤实验中使用的小鼠为BALB/cA-nu SPF级的裸鼠(北京华阜康公司)。选择雄性BALB/cA-nu裸鼠6-8只/组，3-4周龄，体重在18-22g之间。首选根据实验要求分别予以高脂饮食HFD和正常饮食喂养3周，3周后根据实验目的选择相应的稳定转染细胞株(表达shlncRNA SLC25A21-AS1-3的敲除载体敲降后KYSE30细胞)和空载对照株(表达NC-shRNA的敲除载体敲降后KYSE30细胞)进行实验，每只小鼠注射1.0-1.2×106个细胞右腋窝皮下。接种后约1-2周左右成瘤。
2)肿瘤的体积检测
在接种1周后，每隔3天左右观察皮下成瘤情况，如已经成瘤，需测量长径和宽径，以及体重情况，间隔3-5天记录一次，最后计算体积的方式为：长径乘以宽径的平方，之后在除以2来计算肿瘤的体积。
4)皮下瘤组织的免疫组化分析结果
对上述解剖出的皮下肿瘤进行拍照和称重。拟提取组织的RNA和蛋白的瘤组织可先-80℃保存，使用福尔马林固定皮下成瘤组织，需尽快进行石蜡包埋，可进行后续的HE染色和免疫组化(IHC)染色。
具体评分如下：组织半定量分析方法：阳性综合评分，即目的细胞染色强度与阳性细胞百分比的乘积：0为阴性(-)，1～4分为弱阳性(+)，5～8分为中度阳性(++)，9～12分为强阳性(+++)。其中染色强度以目的细胞呈现染色特性计分：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。细胞阳性比率进行评分如下：0～5％为0分，6％～25％为1分，26％～50％为2分，51％～75％为3分，>75％为4分。
4)尾静脉肺定植的实验
小鼠尾静脉注射肺定植实验目的是通过体内实验目的是观察肿瘤细胞的迁移侵袭定植能力，因此采用NOD-SCID雄性小白鼠(北京华阜康公司)，3-4周龄，体重18-22g；根据实验目的选择相应的稳定转染细胞株(表达shlncRNA SLC25A21-AS1-3的敲除载体敲降后KYSE30细胞)和空载对照株(表达NC-shRNA的敲除载体敲降后KYSE30细胞)进行实验，每只小鼠尾静脉注射1.0-1.2×106个细胞。定期观察动物的生命体征，每周记录小鼠体重，若体重下降过快，动物出现明显的消瘦表达，可提前处死，终止实验；正常尾静脉注射约6-8周后，可以考虑处死小鼠，完成的取出双肺组织，同时观察其他脏器如肝、脾和胸壁等组织有无瘤组织生长；PBS彻底清洗肺组织，尤其是血液，清洗干净后福尔马林固定，固定完成后拍照。最后，进行HE染色，在显微镜下比较各组肿瘤肺定植情况。
结果如图9所示，敲降lncRNA SLC25A21-AS1表达在正常饮食组CD和高脂饮食组HFD中，均表现为肿瘤体积和重量的显著减少(图9A,9B)。在尾静脉肺定植的实验中，lncRNASLC25A21-AS1敲降组的肺定植肿瘤数明显少于对照组(图9C)。最后，皮下瘤组织的免疫组化分析结果也提示，增殖相关指标Ki67和间质表型Vimentin在敲降lncRNA SLC25A21-AS1表达组中均下调(图9D)。
上述结果表明，敲降lncRNA SLC25A21-AS1可以抑制管鳞癌细胞的成瘤、增殖和生长或抑制管鳞癌细胞在肺组织中的定植瘤数量。
二、过表达lncRNA SLC25A21-AS1增强食管鳞癌细胞的增殖和迁移能力
为了进一步明确lncRNA SLC25A21-AS1的功能，构建了过表达lncRNA SLC25A21-AS1细胞系，以探索其对食管鳞癌细胞的影响。
1、细胞水平
1)、过表达质粒
委托上海吉凯基因公司设计并构建过表达lncRNA SLC25A21-AS1质粒。
将lncRNA SLC25A21-AS1构建过表达质粒，载体选择为GV367,原件顺序为Ubi-MCS-SV40-EGFP-IRES-puro，AgeI/NheI酶切,由上海吉凯基因合成，得到过表达lncRNASLC25A21-AS1的质粒。
2)、慢病毒包装
按照一中的方法将过表达lncRNA SLC25A21-AS1质粒进行包装，得到过表达lncRNA SLC25A21-AS1的病毒液。
3)、慢病毒感染目的细胞系
按照一中的方法将lncRNA SLC25A21-AS1病毒液分别感染食管鳞癌细胞系KYSE30和KYSE450，得到转染后细胞，即为过表达lncRNA SLC25A21-AS1载体的KYSE30稳定细胞系和过表达lncRNA SLC25A21-AS1载体的KYSE450稳定细胞系(过表达lncRNA SLC25A21-AS1)；
将GV367载体通过慢病毒包装感染目的细胞系，得到表达空载体转染后KYSE30细胞和表达空载体转染后KYSE450细胞。
通过RT-qPCR表达水平，评估转染效果(方法同敲降验证)。
结果，与表达空载体转染后KYSE30细胞和表达空载体转染后KYSE450细胞相比，过表达lncRNA SLC25A21-AS1的载体转染后KYSE30细胞和过表达lncRNA SLC25A21-AS1的载体转染后KYSE450细胞相对表达量提高(图10)。
4)、CCK8细胞增殖和克隆检测
设定分组：
对照组：分别在培养基中培养24小时表达空载体转染后KYSE30细胞和表达空载体转染后KYSE450细胞；
过表达组：分别在培养基中培养24小时过表达lncRNA SLC25A21-AS1载体的KYSE30稳定细胞系和过表达lncRNA SLC25A21-AS1载体的KYSE450稳定细胞系；
棕榈酸+对照组：分别在含有100uM棕榈酸的完全1640培养基中分别培养过表达对照KYSE30的稳定细胞系和过表达对照KYSE450稳定细胞系，24小时；
棕榈酸+过表达组：分别在含有100uM棕榈酸的完全1640培养基中分别培养过表达lncRNA SLC25A21-AS1载体的KYSE30稳定细胞系和过表达lncRNA SLC25A21-AS1载体的KYSE450稳定细胞系，24小时。
进行CCK8细胞增殖实验、Tranwell细胞迁移、细胞凋亡(采用凯基生物的AnnexinV-APC/PI细胞凋亡检测试剂盒检测)和克隆检测，检测方法同前。
结果如图11所示，
克隆检测结果如图A：在食管鳞癌细胞系KYSE30和KYSE450中上调lncRNASLC25A21-AS1的表达，以及在100μM棕榈酸PA的作用下，过表达lncRNA SLC25A21-AS1均能促进其克隆形成，统计检验方法为t检验；
CCK8检测结果如图B：在细胞系KYSE30和KYSE450中上调lncRNA SLC25A21-AS1的表达，以及在100μM棕榈酸PA的作用下，过表达lncRNA SLC25A21-AS1均能促进细胞增殖，实验方法为CCK8，统计检验方法为t检验；
Tranwell细胞迁移结果如图C：在细胞系KYSE30和KYSE450中上调lncRNASLC25A21-AS1的表达，以及在100μM棕榈酸PA的作用下，过表达lncRNA SLC25A21-AS1均能促进细胞迁移，统计检验方法为t检验；
细胞凋亡实验结果如图D：在100μM棕榈酸PA的作用下，过表达lncRNA SLC25A21-AS1能部分抵抗棕榈酸PA诱导的调亡，实验方法为AnnexinV-APC/PI，统计检验方法为t检验。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。
通过CCK8细胞增殖和克隆形成实验，发现lncRNA SLC25A21-AS1的过表达能促进细胞增殖和克隆形成，同时在100μM棕榈酸的作用下，过表达lncRNA SLC25A21-AS1能部分抵抗棕榈酸的抑制作用(图11A,11B)。不仅如此，在100μM棕榈酸的作用下，过表达lncRNASLC25A21-AS1也能增强细胞迁移能力(图11C)。之前的结果提示棕榈酸能诱导食管鳞癌细胞的调亡，但在过表达lncRNA SLC25A21-AS1的细胞系中，相同浓度的棕榈酸(100μM)所诱发的凋亡率显著降低(图11D)。
2、体内动物实验
方法同敲降，不同的仅为转染细胞为过表达lncRNA SLC25A21-AS1载体的KYSE30稳定细胞系(过表达lncRNA SLC25A21-AS1)，对照细胞为过表达空载体的KYSE30稳定细胞系(空载)。
结果如图12所示，图A：裸鼠皮下瘤实验显示过表达lncRNA SLC25A21-AS1和对照组在正常饮食CD和高脂饮食HFD组中的成瘤图片；图B：通过比较皮下瘤生长曲线和成瘤重量，提示在正常饮食CD和高脂饮食HFD组中过表达lncRNA SLC25A21-AS1均可显著促进KYSE30细胞系的成瘤和生长，统计检验方法为非参数检验；图C：过表达lncRNA SLC25A21-AS1能促进细胞系KYSE30的在肺组织中的定植瘤数量，统计检验方法为t检验；图D：皮下瘤组织免疫组化结果表明过表达lncRNA SLC25A21-AS1能上调Ki67和Vimentin的表达水平，统计检验方法为t检验。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)；过表达lncRNA SLC25A21-AS1的皮下瘤组织生长更快，但在高脂饮食HFD的影响下，仍较对照组明显较小(图12A,12B)。在尾静脉肺定植的实验中，lncRNA SLC25A21-AS1过表达组的肺定植结节数明显大于对照组(图12C)。最后，免疫组化结果也提示，增殖相关指标Ki67和Vimentin在过表达lncRNASLC25A21-AS1组中的表达上调(图12D)。
上述结果表明，过表达lncRNA SLC25A21-AS1均可显著促进KYSE30细胞系的成瘤、增殖和生长或者促进细胞系KYSE30的在肺组织中的定植瘤数量。
实施例4、高脂相关lncRNA SLC25A21-AS1相关研究
一、高脂相关lncRNA SLC25A21-AS1在食管鳞癌细胞内的定位
LncRNA的主要功能与其细胞内的位置关系密切，首先通过细胞质和细胞核RNA分离实验，分别在食管鳞癌细胞系KYSE30和KYSE450中通过RT-qPCR实验，分别检测细胞质和细胞核中lncRNA SLC25A21-AS1的表达情况。
1、RT-qPCT检测
分离提取KYSE30和KYSE450的细胞核和细胞质RNA，采用的是PARISTMProtein andRNA Isolation System试剂盒(AM1921,Thermo)。
RT-qPCR的引物：GAPDH作为细胞质内参引物为GAPDH-F和GAPDH-R；
U99作为细胞核内参引物为U99-F和U99-R；
lncRNA SLC25A21-AS1的特异性引物为SLC25A21-AS1-F和SLC25A21-AS1-R；
2、RNA-FISH
lncRNA SLC25A21-AS1荧光探针序列信息如下：
5‘-CY3-TTCTGATTCCGTTTAGGTCGGGGTGG-CY3-3’，武汉塞维尔公司合成制备。
(1)铺板：细胞培养至生长状态良好，处于对数生长期时，离心消化至接种到玻片小室中，继续培养24-48小时。
(2)固定：细胞状态良好生长至30-50％，PBS洗3次。4％多聚甲醛固定20分钟，后于PBS在摇床上晃动洗涤3次，每次5分钟。
(3)破膜：加入0.1％TritonX-100溶液，在室温下破膜15分钟，吸弃破膜液，PBS漂洗3次，每次5分钟。
(4)封闭：每孔加入5％BSA溶液，室温下封闭30分钟，弃封闭液，加PBS缓冲液，漂洗3次。
(5)杂交：每孔加入探针混合液，避光在37℃培养箱中杂交过夜；
(6)杂交后洗涤：洗去杂交液，2×SSC，37℃洗涤10分钟,1×SSC,37℃洗涤5分钟,洗2次，最后0.5×SSC 37℃洗涤10分钟。
(7)封片：拆玻片架子，去除DAPI溶液，滴防淬灭封片剂30μl，盖玻片封片，避光-20℃短期保存。
(9)镜检拍照：倒置荧光显微镜下观察荧光染色情况并拍照。
结果如图13所示，lncRNA SLC25A21-AS1在细胞质和细胞核中均有表达，但更主要位于细胞核中(图13A)。随后通过RNA-FISH也证实这个结果(图13B)。
这些结果提示lncRNA SLC25A21-AS1在食管鳞癌细胞中更可能在细胞核中发挥功能。
二、lncRNA SLC25A21-AS1在细胞核内通过影响NPM1/c-Myc蛋白发挥作用
lncRNA在细胞中的定位通常与其功能密切相关。之前的研究提示lncRNASLC25A21-AS1在食管鳞癌细胞系中主要位于细胞核中，细胞核中的lncRNA更多的参与调控基因的转录以及与核内蛋白互作起调控作用。
1)RNA-pulldown实验(PierceTM Magnetic RNA-Protein Pull-Down Kit(20164,Thermo))
提取KYSE30细胞的蛋白，将lncRNA SLC25A21-AS1分子采用RNA-pulldown实验与提取的蛋白结合，洗脱下与lncRNA SLC25A21-AS1相结合的蛋白后进行蛋白银染(图14A)。
2)与lncRNA SLC25A21-AS1相结合的蛋白质谱分析
将上述图14A中与lncRNA SLC25A21-AS1相结合的蛋白进行质谱分析(本研究中蛋白质谱委托上海中科新生命生物公司，使用蛋白质内切酶对蛋白质多肽样品进行酶解，然后使用LCMSMS(nanoLC-QE)对酶解后的样品进行分析，最后使用MASCOT等质谱匹配软件对LCMSMS数据进行分析，获得目标蛋白质多肽分子的定性鉴定信息。具体实验方法如下：
(1)样品酶解：经过还原和烷基化处理后，加入Trypsin(质量比1:50),在37℃条件下酶解20小时。酶解产物脱盐后冻干,复溶于0.1％FA溶液中,-20℃保存待用。
(2)质谱分析：液为0.1％甲酸的水溶液,B液为0.1％甲酸的乙腈水溶液(乙腈为84％)。色谱柱以95％的A液平衡后,样品由自动进样器上样至Trap柱。
(3)质谱数据采集：多肽和多肽的碎片的质量电荷比按照下列方法采集:每次全扫描(full scan)后采集20个碎片图谱(MS2 scan)。
(4)数据分析：谱测试原始文件(raw file)用Proteome Discoverer1.4软件检索相应的数据库,最后得到鉴定的蛋白质结果。)
随后对这些蛋白进行质谱分析，筛选和鉴定出与lncRNA SLC25A21-AS1相互作用的蛋白。通过蛋白质谱分析，发现许多蛋白可能与lncRNA SLC25A21-AS1存在相互作用(图14B)。
3)RIP实验
NPM1是一种多功能核蛋白，NPM1可与Myc蛋白相互作用进而调控Myc下游基因转录，同时考虑到NPM1与Myc均在多种肿瘤的发展中起着十分重要的作用。因此，研究主要是探索lncRNA SLC25A21-AS1是否会影响NPM1和Myc之间的相互作用。
采用NPM1蛋白抗体(ab208015,abcam)和lncRNA SLC25A21-AS1通过RIP实验(Magna RIPTM RNA-Binding Protein IP Kit(17-700,Millipore))检测KYSE30和KYSE450细胞蛋白中的NPM1蛋白，证实KYSE30和KYSE450细胞中NPM1蛋白与lncRNA SLC25A21-AS1存在相互作用(图14C)。
4)免疫共沉淀(Co-IP)(PierceTM Classic Magnetic IP/Co-IP Kit(#88804,Thermo))
对KYSE30食管鳞癌细胞采用免疫共沉淀试剂盒进行免疫共沉淀(Co-IP)，抗体为NPM1(ab208015,abcam),c-Myc(Ab32072,abcam)。通过制备免疫复合物及选择相应抗体获得特异性免疫沉淀，然后洗脱下来进行随后的western blot实验。结果证实NPM1蛋白与c-Myc蛋白存在相互作用，过表达lncRNA SLC25A21-AS1会增强NPM1和c-Myc之间的相互作用(图14D)。因此，高表达lncRNA SLC25A21-AS1能促进NPM1蛋白与c-Myc蛋白存在相互作用，进而促进c-Myc下游靶点的基因转录与活化来参与肿瘤的发展。
SEQUENCE LISTING
<110>中国医学科学院肿瘤医院
<120> lncRNA SLC25A21-AS1在作为食管鳞癌标志物中的应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1703
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
aatcaactcc cggcctcctc tgctctcgcg cctctagggg ctcaagcact gctccgggag 60
cgctgaattt tgaggaagag ggcagaactt cagtaaggag acctgtctgg gcaacggttt 120
caggacacgc ggtggggaaa gcgactagcc tccggcgggg cagggcgggc tgtccttacc 180
tgcagaacca ccggccacga tctgccgaga agcctcgcgc actaagctga cttcaggctt 240
ggcggacatc ttcgccaggc gggaggacaa gggagtgggc tgagatgcgt caacgagctc 300
gcagcctgca cagcctactg atccagagag ccccggctgg gctggtcctc aagcgcgttg 360
gctccctgtg gagcagcaat ccggcgactg ctggaaagcg agggttcgag gcgcagattc 420
gtcgcgcgat ctccggcgcg tcggaacctg ttcgcagcgc tctcgcagag gcgccctcgg 480
ctccgaaaat gtctctggaa agaagacccg cggatgggtt tgggttggct caccgcagcg 540
gctcaggctt tgtctcctag attggcgccc acgaccttct ctatcaggag cctccggtag 600
tttgtcaaac tagacggttg cctctgataa ctcaagtgaa gtgacccagg cctggagcgc 660
caagtacaaa gcggggacga cacttgcacc tcctggcaag ccagagcaca gtgaggttca 720
aaagaaggga caagtgaata aattcctcag ttagttgtcc tataattgtg gtctgtagca 780
actaagtcaa agcaaatcta atttacactt accttacaat agagctaagg tagtacttta 840
ccaaaaatgg ttttgattta aggtaaaatc atacctcatc aacttgagtt ttatttacct 900
aaggaccaaa agaagaaaaa gcctggttac aaatagtttc ttctataccc aggtcagtgg 960
ttcttaaaag tggttttagt acccacagca tcagcataat ttgtgaatgt gttaggaagt 1020
caaattcgtg ggtcccaccc cgacctaaac ggaatcagaa tctctgggga tagggcccag 1080
aaacgagttc tctgttgatt gtcatgaact ttaaaggttg tgaaccactg acttaaacaa 1140
ttgaggaaca ttaaggaact taacagtata ttctctcaat aaaatgtttg attattctta 1200
ctagcccctt aggatagtta ccaaaacaaa actactaatt tatactcttt taaaactaca 1260
agttgcctgt gttatgtagg agagatataa gattgtgaaa ttttccaaaa atacctgcca 1320
cacccctaac agacaggaga tgataagagt aaaagagaga attgggaggc tttagaagcc 1380
ctattgtaat atttcttaaa acacattatt tattgctaaa tatatttagt gtgagccatg 1440
taaaaattgc catttttgga ggtcaaaacc gttgaatatc agcaatttag tatggttcaa 1500
tttatgtggt ttctaatcaa atgtacaaag tacaataatt tggtttcata cttgattttt 1560
tatttcttag gctgagtcat taaaagttga tcagtgatat atggcaaaat tatttaaagt 1620
gcttgaggaa ttggggagac ttgctgctta tgtgatcaga tatacaaaaa taaagttttt 1680
catttcgcaa aaaaaaaaaa aaa 1703
<210> 2
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
gcaactaagt caaagcaaat ccgaagattt gctttgactt agttgc 46
<210> 3
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
ggttgtgaac cactgactta acgaattaag tcagtggttc acaacc 46

Claims (7)

1.检测LncRNA SLC25A21-AS1表达量的物质在如下至少一种或制备具有如下至少一种功能的产品中的应用：
(1)预测或辅助预测食管鳞癌患者预后状态；
(2)预测或辅助预测食管鳞癌患者术后无复发生存率的高低；
(3)预测或辅助预测食管鳞癌患者术后整体生存率的高低；
(4)预测或辅助预测食管鳞癌患者肿瘤分化程度的高低；
所述LncRNA SLC25A21-AS1的核苷酸序列为序列表中序列1。
2.LncRNA SLC25A21-AS1作为标志物在开发预测或辅助预测食管鳞癌预后状态的试剂中的应用。
3.抑制食管鳞癌细胞中LncRNA SLC25A21-AS1表达的物质在如下至少一种或制备具有如下至少一种功能的产品或制备治疗或抑制如下2)-5)任一种导致的疾病中的应用：
1)治疗或抑制食管鳞癌；
2)抑制食管鳞癌细胞增殖；
3)促进食管鳞癌细胞凋亡；
4)抑制食管鳞癌细胞迁移；
5)抑制食管鳞癌细胞在肺组织中的定植。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述抑制食管鳞癌细胞中LncRNASLC25A21-AS1表达的物质为高脂饮食、棕榈酸和/或干扰LncRNA SLC25A21-AS1表达的shRNA。
5.一种具有如下至少一种功能的产品，其为干扰LncRNA SLC25A21-AS1表达的shRNA；
所述shRNA的核苷酸序列为序列表中序列2或序列3；
1)治疗或抑制食管鳞癌；
2)抑制食管鳞癌细胞增殖；
3)促进食管鳞癌细胞凋亡；
4)抑制食管鳞癌细胞迁移；
5)抑制食管鳞癌细胞在肺组织中的定植。
6.高脂饮食或棕榈酸在如下至少一种或制备具有如下至少一种功能的产品中的应用：
1)治疗或抑制食管鳞癌；
2)抑制食管鳞癌细胞增殖；
3)促进食管鳞癌细胞凋亡；
4)抑制食管鳞癌细胞迁移；
5)抑制食管鳞癌细胞在肺组织中的定植。
7.LncRNA SLC25A21-AS1在制备用于筛选食管鳞癌细胞治疗药物的模型中的应用；
所述LncRNA SLC25A21-AS1的核苷酸序列为序列表中序列1。
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