CN111096962A - 脂肪酸氧化抑制剂在制备治疗结直肠癌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种脂肪酸氧化抑制剂Etomoxir在制备治疗结直肠癌药物中应用。具体地，所述脂肪酸氧化抑制剂Etomoxir是通过抑制CAFs的脂质代谢而达到是抑制CAFs诱导的结直肠癌腹膜转移的目的。本发明利用蛋白组学对结直肠癌患者中发生腹膜转移和未发生腹膜转移的原发肿瘤组织中蛋白表达进行测定，结果显示腹膜转移的原发肿瘤组织脂质代谢相关蛋白显著降低，尤其是脂肪酸氧化关键酶CPT1A。本发明为结直肠癌的腹膜转移的预防和治疗奠定基础和提供理论依据，同时为临床有效预防及降低腹膜转移发生率提供新的治疗思路，具有重要的潜在应用价值。

Description

脂肪酸氧化抑制剂在制备治疗结直肠癌药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，脂肪酸氧化抑制剂在制备治疗结直肠癌药物中的应用。

背景技术

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)作为一种常见的消化道恶性肿瘤，严重威胁着人类的健康。根据《2018年全球癌症统计数据》显示结直肠癌发病率、死亡率在全部恶性肿瘤中分别位居第三位和第二位，其中新发病例109.66万，死亡病例55.13万。而中国癌症发病率及死亡率均列全球首位，其中结直肠癌发病率、死亡率在全部恶性肿瘤中均位居第4位。结直肠癌常见的远处转移包括肝转移、肺转移以及腹膜转移等，而远隔脏器转移是晚期结直肠癌患者死亡的主要原因之一。腹膜转移是指结直肠癌原发灶癌细胞经血行、淋巴管道或腹膜直接种植生长。然而存在腹膜转移的患者预后差，无疾病进展生存期和总生存期短，且腹膜转移程度越高，生存期越短。据报道，CRC同时合并腹膜转移的概率为13％,而5年生存率仅为20％-25％。恶性肿瘤患者中90％的死亡是由转移导致的，但现在针对肿瘤转移的预防性或治疗性策略仍处于匮乏阶段。目前，结直肠癌腹膜转移的途径主要包含两个方面：一个是肿瘤细胞突破浆膜后脱落至腹腔并抵抗失巢凋亡，继而在腹膜进一步生长；另一方面是医源性因素，即切断的血管及淋巴管瘤栓随血流和淋巴液流入到腹腔内，手术过程中对肿瘤组织牵拉及挤压，以及肿瘤细胞随肠液经肠腔残端流入腹腔等均可导致术中肿瘤细胞在腹腔内的种植。然而，结直肠癌腹膜转移的发生机制尚不完全明确。了解结直肠癌腹膜转移的发生机制，对预防和诊治都有一定的经济和社会意义。

肿瘤细胞的转移是肿瘤研究和诊治中最具挑战性的难题。肿瘤细胞对比于正常细胞，代谢改变是肿瘤的重要特征之一,其与肿瘤的发生发展互为因果。肿瘤代谢调控机制的研究是国际肿瘤研究领域的新热点，被认为是未来十年生物医学领域最具有突破性进展的重要学科之一。癌细胞代谢重编程以最有效地支持生长和增殖，其中有氧糖酵解、氧化磷酸化的减少和细胞增殖所需生物合成中间介质生成的增加。该领域的研究对进一步认识肿瘤的生物学特性和确定关键干预靶点以期更有效防治癌症具有重大意义。除了糖类和氨基酸代谢的变化外，脂质代谢的改变也是肿瘤代谢的一个重要特征。近年来的研究表明，脂肪酸代谢在肿瘤转移过程中也发挥重要作用。脂肪酸参与了肿瘤细胞的多个生物学过程，如脂肪酸是细胞膜重要结构分子磷脂的基本合成组分、某些类型的肿瘤(如前列腺癌)主要依赖脂肪酸β-氧化作为能量的主要来源、参与许多重要的促癌脂质信号分子包括磷酸肌醇、溶血磷脂酸和前列腺素的合成。抗血管生成药物antiangiogenic drug(ADD)治疗的肿瘤在脂肪组织丰富的部位易产生耐药性，进一步研究发现ADD治疗后可以诱导肿瘤缺氧进而使其代谢发生重编程，通过对脂肪酸的摄取和代谢增加为肿瘤细胞的增殖提供能量。这些研究表明，脂质代谢在肿瘤细胞发展中发挥重要作用。

近年来，肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)对肿瘤转移的调控作用引起越来越多的关注。肿瘤细胞代谢受到遗传和微环境因素的双重调节。肿瘤微环境既可以引起基因突变为肿瘤细胞提供条件，又可以协助肿瘤细胞进行信号转导以及侵袭和转移。为了满足恶性肿瘤细胞在快速增殖时对能量和大分子原料的需求，肿瘤微环境会发生代谢重编程(metabolic reprogramming)。肿瘤细胞及肿瘤微环境中发生异常的能量代谢是恶性肿瘤的主要病理特征之一，在恶性肿瘤的发生和发展过程中起着重要的作用。肿瘤相关成纤维细胞(Cancer-associated fibroblasts，CAFs)是肿瘤微环境的重要组成部分。CAFs可以通过快速的脂肪分解及葡萄糖酵解产生酮体及乳酸等物质，并将其分泌到微环境中，而肿瘤细胞可以大量摄取这类营养物质促进增殖。乳腺癌细胞MYC诱导胞外囊泡分泌的miR-105可以激活CAFs的MYC信号通路从而使得其代谢重编程，使CAFs在不同的肿瘤微环境营养条件下调节肿瘤细胞生长。但是结直肠癌肿瘤微环境中CAFs的脂质代谢和肠癌细胞之间能量代谢是否有关联以及在结直肠癌腹膜转移中的作用仍未知。

发明内容

有鉴于此，本发明所解决的技术问题在于提供了一种脂肪酸氧化抑制剂Etomoxir在制备治疗结直肠癌药物中应用，其具体为脂肪酸氧化抑制剂Etomoxir是抑制CAFs诱导的结直肠癌腹膜转移而达到治疗治疗结直肠癌的目的。本发明的方案中，脂肪酸氧化抑制剂Etomoxir对CAFs诱导的结直肠癌腹膜转移的抑制作用是基于肿瘤微环境中CAFs脂质代谢增强对肠癌腹膜转移中的作用以及抑制CAFs脂肪酸氧化可以有效抑制CAFs诱导结直肠癌腹膜转移和腹膜种植生长中的应用。

为此，本发明公开如下技术方案：

一种脂肪酸氧化抑制剂Etomoxir在制备治疗结直肠癌药物中应用，所述脂肪酸氧化抑制剂Etomoxir具有如下结构式：

。

其分子量为：320.74，为市售产品。

具体地，所述脂肪酸氧化抑制剂Etomoxir是通过抑制结直肠癌腹膜转移而达到治疗治疗结直肠癌的目的。

优选地，所述脂肪酸氧化抑制剂Etomoxir是通过抑制CAFs诱导的结直肠癌腹膜转移而达到治疗治疗结直肠癌的目的。

进一步地，所述脂肪酸氧化抑制剂Etomoxir是通过抑制CAFs的脂质代谢而达到是抑制CAFs诱导的结直肠癌腹膜转移的目的。

具体地，所述脂肪酸氧化抑制剂Etomoxir是通过抑制CAFs脂肪酸氧化而达到抑制CAFs诱导结直肠癌腹膜转移和腹膜种植生长的目的。

具体地，所述脂肪酸氧化抑制剂Etomoxir是通过抑制体外水平CAFs诱导的结直肠癌增殖和转移而达到治疗治疗结直肠癌的目的。

具体地，所述脂肪酸氧化抑制剂Etomoxir是通过抑制体内水平CAFs诱导的肠癌皮下瘤的生长和腹膜种植生长而达到治疗治疗结直肠癌的目的。

另外，在本发明的研究中，还发现：

本发明涉及蛋白组学结果证实结直肠癌腹膜转移的原发肿瘤组织中脂肪酸氧化关键酶CPT1A显著低表达，结合临床样本及数据库分析证实CPT1A的低表达是预后不良的高风险因素。

本发明还涉及非靶向脂质组学结果显示结直肠癌腹膜转移和无腹膜转移的原发肿瘤组织中游离脂肪酸无显著差异。

本发明还涉及肿瘤组织免疫荧光、原代分离CAFs进行RT-qPCR和Western blot检测证明转移组肿瘤组织中CAFs的CPT1A表达上调。

本发明还涉及上调CAFs的脂肪酸氧化关键酶CPT1A表达促进其对结直肠癌的增殖、侵袭和转移的作用。

本发明还涉及CAFs上调CPT1A表达促使结直肠癌细胞能量代谢来源发生转变，葡萄糖利用率增加、糖酵解水平增强，从而更有利于肠癌增殖和转移。

本发明还涉及采用脂肪酸氧化抑制剂Etomoxir可以有效抑制体外水平CAFs诱导的肠癌的增殖和转移。

本发明还涉及采用脂肪酸氧化抑制剂Etomoxir可以有效抑制体内CAFs诱导的肠癌皮下瘤的生长和腹膜种植生长。

本发明针对发生腹膜转移的肠癌肿瘤组织进行深入的研究，从蛋白组学、脂质代谢组学等角度研究探索CAFs的脂质代谢对肠癌腹膜转移的影响，以及抑制CAFs的脂质代谢可以有效抑制CAFs脂质代谢上调诱导结直肠癌腹膜转移及腹膜种植生长中的应用。

本发明从肿瘤微环境入手，着重研究CAFs的脂质代谢改变对结直肠癌腹膜转移的促进作用，以及采用脂肪酸氧化抑制剂Etomoxir抑制CAFs脂质代谢可以有效抑制其促进的肠癌的增殖、侵袭和腹膜转移。为预防和治疗奠定基础和提供理论依据，同时为临床有效预防及降低腹膜转移发生率提供新的治疗思路，具有重要的潜在应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例的附图作简单地介绍。

图1结直肠癌腹膜转移肿瘤组织中CPT1A表达显著降低，且CPT1A在肿瘤中低表达是预后不良的高风险因素；

图2腹膜转移的肠癌肿瘤组织中CAFs的CPT1A表达显著上调且代谢特性更依赖于脂肪酸代谢；

图3腹膜转移的肠癌肿瘤组织中CAFs的脂肪酸氧化增加促肠癌侵袭和转移能力增强；

图4上调CAFs的脂肪酸氧化增加其在低糖环境下对肠癌转移和侵袭的促进作用；

图5上调CAFs的脂肪酸氧化促进肠癌在体内外的生长；

图6高表达CPT1A的CAFs通过降低脂联素分泌显著下调肿瘤细胞的CPT1A表达；

图7低表达CPT1A的肠癌细胞克隆形成、增殖ATP产生无显著影响；

图8低表达CPT1A的肠癌细胞能量代谢来源转为糖酵解；

图9上调CAFs脂肪酸氧化其分泌VEGFA、CCL2、MMP2细胞因子能力增强；

图10采用脂肪酸氧化抑制剂Etomoxir显著抑制CAFs对肠癌细胞在腹膜内种植生长的作用。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实施方法，通常按照常规条件，例如细胞培养，western blot操作等。

实施例1

具体操作方法：

1.T4期结直肠癌患者肿瘤组织获取：均来自于中山大学附属第六医院。

实验组入组条件：①我院建院以来结直肠癌数据库所有术后诊断为结直肠肿瘤并腹膜转移患者②年龄18-70岁③临床或者病理诊断为T4患者④病理诊断为腺癌；

排除标准：①合并其他脏器转移(包括术后3月内出现其他脏器转移患者)②家族性腺瘤性息肉病(familialadenomatouspolyposis,FAP)及IBD合并癌变患者③同时合并其他肿瘤④急诊手术⑤术前行新辅助治疗或者因其他疾病接受过放化疗⑥术前合并穿孔⑦结直肠多源性肿瘤；

对照组入组条件：①我院建院以来结直肠癌数据库所有术后诊断为结直肠肿瘤患者②年龄18-70岁③临床或者病理诊断为T4患者④病理诊断为腺癌；

排除标准：①合并腹膜转移或者其他脏器转移(包括术后3月内出现的转移)②家族性腺瘤性息肉病(familialadenomatouspolyposis,FAP)及IBD合并癌变患者③同时合并其他肿瘤④急诊手术⑤术前行新辅助治疗或者因其他疾病接受过放化疗⑥术前合并穿孔⑦结直肠多源性肿瘤；

两组匹配条件：①原发肿瘤部位②淋巴结转移分期③基因检测结果：Kras\Braf④微卫星状态：MSS\MSI。

2.label-free蛋白组学:委托国内知名公司进行检测T4期结直肠癌患者有腹膜转移和无腹膜转移的原发灶肿瘤组织的基因及蛋白表达。并对代谢相关通路，主要包含有葡萄糖、谷氨酰胺、脂质代谢等主要能量代谢相关通路的基因及蛋白的改变情况进行分析。

3.对临床肿瘤组织样本采用RT-qPCR检测CPT1A的表达水平。

4.对The Cancer Genome Atlas(TCGA)和the Gene Expression Omnibus(GEO)数据库进行生物信息学分析CPT1A在肠癌肿瘤组织中的表达和临床预后的关系。

实验结果

结果如图1所示，肠癌腹膜转移组的肿瘤组织中CPT1A显著低表达。(A)Heatmap分析肠癌腹膜转移组脂质代谢酶的表达显著降低；(B)依据label-free蛋白组学分析腹膜转移组CPT1A的表达降低；(C)GEO数据库分析肠癌腹膜转移组CPT1A的mRNA表达水平降低；(D)RT-qPCR检测临床标本中肠癌腹膜转移组CPT1A的mRNA表达水平降低；(E)TCGA数据库分析CPT1A表达水平是预后不良的高风险因素，且低表达和生存期短显著相关；(F)GEO数据库分析CPT1A表达水平是预后不良的高风险因素，且低表达和生存期短显著相关。结果暗示肠癌腹膜转移的肿瘤组织中CPT1A的显著低表达，且是预后不良的高风险因素和生存期短显著相关。

实施例2

具体操作方法：

1.脂质代谢组学：

脂质代谢组学是一种基于高通量分析技术，系统性解析生物体脂质组成与表达变化的研究模式。脂质组学分析，可以高效地研究脂类家族、脂质分子在各种生物过程中的改变与功能，进而阐明相关的生物活动过程与机制。目前，脂质组学分析一般采用液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)，主要分为非靶向分析(untargeted or nontargeted)和靶向分析(targeted)两类。其中，非靶向分析模式能够实现对样本中的各种类型脂质进行无偏向地系统性解析，而靶向分析模式则主要是针对特定的脂质分子进行选择性、特异性的定量分析。本项目采用基于UPLC-Orbitrap质谱系统的非靶向脂质组学分析平台，并结合LipidSearch软件(Thermo Scientific^TM)进行脂质鉴定与数据预处理。LipidSearch^TM软件能够实现原始数据处理、峰提取、脂质鉴定、峰对齐、和定量等的一体化分析。LipidSearch中收录了8大类，300种亚类，约170万种脂质分子的MS2&MS3数据库，并基于Orbitrap^TM质谱仪生成的高分辨率高质量精度数据，通过子离子、母离子和中性丢失扫描的鉴别算法，实现系统地、可靠地脂质定性分析。委托上海中科新生命生物科技有限公司进行检测。

2.组织免疫荧光检测转移组和非转移组肠癌肿瘤组织中CAFs细胞的CPT1A表达：将脱蜡后的肿瘤组织用PBS洗3次，每次3min,用4％的多聚甲醛固定15min，PBS浸洗玻片3次，每次3min；0.5％Triton X-100(PBS配制)室温通透20min；PBS浸洗玻片3次，每次3min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30min；吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜；加荧光二抗：PBST浸洗3次，每次3min，吸水纸吸干玻片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min；注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。复染核：滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBST 5min×4次洗去多余的DAPI；用吸水纸吸干玻片上的液体，在玻片中央滴加一滴50％甘油(与PBS 1:1混合)。于共聚焦显微镜下观察可见红色/绿色荧光和蓝色的DAPI并成像。

3.肿瘤相关成纤维细胞CAFs分离、原代培养

①将新鲜切下来的肠癌组织置于10cm的塑培养皿中，皿中盛有10ml含青霉素/链霉素双抗(5％)的PBS，冲洗5遍；

②将组织样品转移至另一个10cm培养皿中，用无菌的手术刀以及借助镊子将组织切成小块，以便后续的酶消化组织；

③将切碎的组织及培养基转移至无菌的T75培养瓶中，加入18ml 3％BSA以及青霉素/链霉素双抗的DMEM培养基至培养瓶，和剩余的组织碎片一同转移至同一个培养瓶中；

④加入2ml 10×的胶原蛋白酶IV至培养瓶中，即稀释十倍；

⑤将T75培养瓶置于摇床中振荡，100g，37℃，1h，每隔15-20min中显微镜观察，以便及时终止消化。1h后，大部分组织碎片被消化，如果消化不充分，可以增加振荡时间直至消化完全；

⑥将消化后的组织转移至50ml PP管中，离心200g，10min收集细胞；

⑦去掉上清以去除残留的胶原蛋白酶，防止进一步消化细胞，10ml成纤维细胞培养基重悬细胞；

⑧用500um孔径的尼龙网过滤细胞悬液，然后分别滤过100um和40um的细胞过滤器，去除组织残渣；

⑨将最终的滤液转移至10cm的组织培养皿中，在培养箱中培养。

4.肿瘤相关成纤维细胞CAFs脂质代谢关键酶CPT1A基因和蛋白表达分析

①将从有腹膜转移和无腹膜转移的肿瘤组织中分离并原代培养CAFs细胞；具体操作方法同上；

②RT-qPCR检测有腹膜转移和无腹膜转移的肿瘤组织中分离并原代培养CAFs细胞的CPT1A的mRNA水平；

③Western Blot检测有腹膜转移和无腹膜转移的肿瘤组织中分离并原代培养CAFs细胞的CPT1A的蛋白水平。

5.采用Seahorse XF24代谢仪分析CAFs(转移组和未转移组)的线粒体呼吸功能、糖酵解水平：

注：CAFs-non-PM(无腹膜转移的肿瘤组织分离的CAFs)、CAFs-PM(腹膜转移的肿瘤组织分离的CAFs)

Seahorse XFe 24代谢分析仪测量细胞的糖酵解和线粒体功能。

①实验前一天的开机预热、细胞铺板及水化板处理；

②实验当天：配置XF Assay Medium；

③用XF Assay Medium清洗细胞，并在细胞孔中加入XF Assay Medium，最终总体积500μL。将细胞板置于不含CO2的37℃培养箱中1h；

④按说明书配制相应KIT中的试剂用来检测OCR和ECAR。在已水化探针板内的注射孔内加入混合工作溶液；

⑤设置Seahorse软件程序，并依次进行探针板参数校准和细胞板数据监测；

⑥实验结束后，原始数据导出到Seahorse XF Mito Fuel Flex Test ReportGenerator(报告自动生成器)中并进行后续数据分析。

实验结果

结果如图2所示:肠癌腹膜转移组肿瘤组织中CAFs的CPT1A表达上调。(A)脂质代谢组证实肠癌转移组肿瘤组织中脂肪酸无明显变化；(B)免疫荧光染色显示转移组CAFs的CPT1A表达增强；(C)RT-qPCR检测证实有腹膜转移的肿瘤组织中CAFs的CPT1A mRNA表达上调；(D)western blot检测证实有腹膜转移的肿瘤组织中CAFs的CPT1A蛋白表达上调；(E)采用生物能量代谢分析仪检测证实转移组CAFs的糖酵解及葡萄糖利用率低；(F)采用seahorse检测证实转移组CAFs的糖酵解水平降低；(G)采用seahorse检测证实转移组CAFs的线粒体功能增强。结果暗示着肠癌腹膜转移的肿瘤组织中CAFs的CPT1A表达显著上调，且能量来源发生转变：由葡萄糖转为脂肪酸。

实施例3

具体操作方法：

1.Transwell检测转移和侵袭能力：Matrigel体外侵袭实验在Transwell上室的聚碳酸酯膜(直径6.5mm，孔径8μm)上先加入稀释后的Matrigel(DMEM:Matrigel约10:1稀释)60-80μl(注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。在Transwell下室中加入各种CAFs(2000个/孔)；待检细胞无血清培养基制成单细胞悬液，每种细胞做三孔；在上室孔中准确加入细胞5×10⁴个/孔，细胞悬液体积100μl，置于5％CO2培养箱于37℃培养24h。待培养时间结束后，弃去上室液体，小心取出上室，用湿棉签擦去膜上面未穿过膜的细胞。结晶紫染色，冲洗干净后Clearmont双侧封片，80℃烤干。倒置显微镜直接下(200×)观察穿过膜的细胞数。每张膜中央部分和周围部分各随机取3个视野拍照记录。

2.实验结果

结果如图3所示：采用Transwell检测CAFs-non-PM、CAFs-PM和肠癌细胞共培养24h对肿瘤的转移和侵袭能力的影响。结果显示：(A)CAFs-PM显著增强其在低糖环境中对肠癌细胞的转移和侵袭能力；(B)增加CAFs脂质代谢可以显著增强肠癌细胞的侵袭和迁移能力，而这种作用可以被脂肪酸氧化抑制剂(CPT1抑制剂Etomoxir(Ex))抑制。

实施例4

1.构建过表达CPT1A的CAFs细胞：

委托复能基因制备CPT1A的过表达质粒，采用抗性基因为Puromycin标记；对测序结果比对正确的克隆进行质粒抽提，建立慢病毒载体。培养生长状态良好的目的细胞，根据慢病毒感染预实验结果设计各组实验条件，进行正式感染。目的细胞汇合度达80％左右，进行慢病毒转染48h，使用抗生素puromycin进行筛选成功转染的目的细胞，收集细胞进入下游实验。用western blot方法检测目标基因蛋白表达情况，验证基因转染效力。

2.过表达CPT1A的CAFs细胞采用IncuCyte ZOOM检测其在低糖和高糖条件下的增殖能力：

①分别将目的细胞3×103/孔接种在96孔板，加入不同的培养基。

②将板选择合适的Tray,放入IncuCyte ZOOM检测箱中。

③设定Scan Mode:每两小时扫描拍照一次。

④数据处理及分析。

3.Transwell检测肠癌细胞的增殖和侵袭能力：

采用过表达CPT1A及vector control的CAFs细胞和肠癌细胞HCT116及DLD1共培养，采用Transwell检测对肠癌细胞转移能力的影响：操作同实施例3。

4.IncuCyte ZOOM监测过表达CPT1A的CAFs对肠癌细胞的迁移能力的影响：

①采用ibidi的细胞划痕小室粘附后每边接种4×104的肠癌细胞。过夜待细胞贴壁后，轻轻拔掉细胞划痕小室，分别采用不同处理的CAFs、condition medium(CM)共培养。

②将板选择合适的Tray,放入IncuCyte ZOOM检测箱中。

③设定Scan Mode:每两小时扫描拍照一次。

④数据处理及分析。

实验结果：

如图4所示：(A)采用慢病毒转染构建稳定的过表达CPT1A的CAFs细胞株；(B)IncuCyte ZOOM实时监测过表达CPT1A后的CAFs在高糖和低糖条件下的增殖能力，结果显示在低糖环境下过表达CPT1A的CAFs增殖显著增加；(C)Transwell检测过表达CPT1A的CAFs在高糖和低糖条件下处理肠癌细胞24h，对肿瘤对肠癌细胞的转移和侵袭能力的影响，结果显示低糖条件下过表达CPT1A的CAFs对肠癌细胞的促转移能力显著增强；(D)IncuCyte ZOOM监测过表达CPT1A的CAFs在低糖条件下的培养基处理肠癌细胞24h，对肿瘤对肠癌细胞的迁移能力显著增强。结果显示：增强CAFs的脂质代谢在低糖条件下显著增强肿瘤的转移和侵袭能力，而这种作用可以显著被脂肪酸氧化抑制剂Etomoxir抑制。注OA：oleic acid，Ex：Etomoxir。

实施例5

具体操作方法：

1.采用过表达CPT1A/vector control的CAFs细胞条件培养基(ConditionMedium，CM)和肠癌细胞HCT116及DLD1共培养，采用IncuCyte ZOOM检测对肠癌细胞的增殖能力的影响：具体操作同实施例4

2.过表达CPT1A的CAFs细胞在体内对肠癌细胞的生长作用的影响：在BALB/c裸鼠的左右背部两侧分别接种细胞数为1.8^105的DLD1和1.8^105DLD1混合3.6^105CAFs细胞，约12天后记录成瘤率，每隔3天测定肿瘤的最长径和短径，计算肿瘤体积＝0.5*a²*b,a为短径，b为长径。

3.脂质代谢抑制剂对CAFs在体内对肠癌细胞的促生长作用的影响：

1.8^105DLD1混合3.6^105CAFs/OE的Babl/C裸鼠随机分成3组分别给予vectorcontrol,5％OA饮水和40mg/kg的Ex(Etomoxir)，每隔3天测定肿瘤的最长径和短径，计算肿瘤体积。

实验结果：

结果如图5所示：(A)CAFs的条件培养基(CM)有效促进肠癌细胞的生长；(B)CAFs促进肿瘤的生成以及上调CAFs的脂肪酸氧化促进肠癌细胞在体内的生长；(C)脂肪酸氧化抑制剂Etomoxir有效抑制CAFs脂质代谢增强对肠癌细胞体内生长的促进作用。结果显示CAFs的脂质代谢增强可以有效促进肠癌细胞在体内的生长，而这种作用可以有效被脂肪酸代谢抑制剂所抑制。

实施例6

具体操作方法：

1.采用过表达CPT1A/vector control的CAFs和肠癌细胞HCT116及DLD1共培养(在低糖和高糖)，采用western blot检测肠癌细胞的CPT1A的表达。

2.脂肪因子芯片检测肠癌腹膜转移组和非转移组肿瘤组织脂肪因子的表达：

①组织裂解液，提取总蛋白并定量；

②按照说明书操作封闭抗体芯片及样品孵育：吸出封闭液，在wells中加入等蛋白量的待测样品，室温孵育。

③抗体结合及二抗标记。芯片进行清洗后，加入抗体并室温孵育，清洗后再加入HRP标记的链霉亲和素，室温孵育。

④介入化学发光试剂、化学发光仪对芯片进行显影和拍照及数据分析，并提取数据进行分析。

3.Luminex液相悬浮芯片检测：

①样品准备：人肿瘤组织匀浆，蛋白定量，取50μg进行检测；

②样品孵育

1)取微珠在振荡器上振荡30s，超声30s，使用Assay Diluent RD1W稀释微珠；

2)稀释后的微珠用振荡器，震荡30s，超声30s，每孔50μL加入96孔板中，使用洗板机洗涤3次；

3)取50μl准备好的标准品与Background加入96孔板中。

4)取25μl样品加入96孔板中，并加入25μl Calibrator Diluent RD6-52稀释样品，使其达到2倍稀释度。

5)贴上封口膜，放置在平板振荡器上800rpm振荡，避光，室温，孵育120min。

③孵育检测抗体

1)弃去样品，洗涤3次；

2)使用Assay Diluent RD1W按说明书要求稀释Detection Antibody；

3)每孔加入50μL稀释好的Detection Antibody，贴上封口膜，放置在平板摇床上800rpm振荡，室温避光孵育60min。

④显色

1)弃去检测抗体，洗涤3次；

2)使用Wash Buffer按说明书要求稀释Streptavidin-PE；

3)每孔加入50μL稀释好的Streptavidin-PE，贴上封口膜，放置在平板摇床上850rpm振荡，室温避光孵育30min；

4)洗涤3次；

5)每孔加入100μL Wash Buffer重悬，贴上封口膜，放置在平板摇床上850rpm，室温避光振荡2min；

6)送入已校正的Luminex 200机器中读值。

⑤数据结果：本次实验检测的样品与标准品经Luminex 200检测仪检测后，获得的荧光由软件自动计算与优化，形成Excel格式的输出文件并对结果进行分析和处理。

实验结果：

结果如图6所示：(A)在高糖培养环境下高表达CPT1A的CAFs或其条件培养CM和肿瘤细胞共培养抑制肠癌CPT1A蛋白的表达。(B)在低糖培养环境下高表达CPT1A的CAFs或其条件培养CM和肿瘤细胞共培养度肠癌的CPT1A蛋白的表达无影响。(C)脂肪因子蛋白芯片检测转移组和非转移组肿瘤组织的因子表达显示脂联素Adiponectin在转移组显著降低。(D)Luminex液相悬浮芯片检测高表达CPT1A的CAFs和肠癌共培养后细胞上清中脂联素的水平显著降低。(E)Luminex液相悬浮芯片检测转移组肿瘤组织中脂联素的水平显著降低。结果显示：过表达CPT1A的CAFs通过降低脂联素表达下调肿瘤细胞的CPT1A水平而这种作用只有在肿瘤细胞处于高糖的环境中，暗示着在肿瘤微环境营养竞争下，CAFs通过上调脂质代谢的关键酶CPT1A使其能量来源有由葡糖糖转为脂肪酸，而通过降低脂联素表达降低肿瘤细胞对脂肪酸的摄取，促使肠癌细胞能量来源更依赖于葡萄糖且由糖酵解提供能量。

实施例7

具体操作方法：

1.慢病毒转染shRNA构建knockdown CPT1A的稳定细胞株：具体操作方法同实施例4。

2.克隆形成实验：取构建的knockdown CPT1A蛋白表达的稳定肠癌细胞株(CTR、sh1、sh2)进行克隆形成实验：取对数期细胞，胰酶消化计数，6孔板每孔接种1000个细胞。每3天换一次液，15天后采用结晶紫染色，拍照，记录细胞克隆数。

3.Incucyte ZOOM检测细胞增殖：具体操作方法同实施例4。

4.检测ATP产生：根据ATP试剂盒操作说明进行：

①裂解细胞，裂解后4℃12000g离心5分钟，取上清，用于后续的测定；

②按照说明制备标准曲线；

③配制ATP检测工作液的；按照每个样品或标准品需100微升ATP检测工作液的比例配制适当量的ATP检测工作液，把待用试剂在冰浴上溶解。

④ATP浓度的测定：加100微升ATP检测工作液到检测孔或检测管内。室温放置3-5分钟，以使本底性的ATP全部被消耗掉，从而降低本底。可以一次性把10-20个检测孔或检测管分别加上100微升ATP检测工作液。在检测孔或检测管内加上20微升样品或标准品，迅速用枪(微量移液器)混匀，至少间隔2秒后，用luminometer或液闪仪测定RLU值或CPM。

⑤数据结果处理。

实验结果

结果如图7所示：(A)敲低CPT1A后的肠癌细胞克隆形成无显著差异。(B)敲低CPT1A后的肠癌细胞后增殖曲线无显著差异。(C)Incucyte Zoom实时监测证实敲低CPT1A后的肠癌细胞增殖无显著差异。(D)敲低CPT1A后的肠癌细胞ATP产生总量无显著差异。结果显示：敲低CPT1A后的肠癌细胞克隆形成、增值及ATP产生均无显著变化，暗示着其他能量通路发生代偿性激活。

实施例8

具体操作方法：

1.能量代谢物分析：基于MRM方法的靶向代谢组学分析，委托上海中科新生命生物科技有限公司测定。

2.Seahorse能量代谢分析仪检测Knockdown CPT1A后的肠癌细胞的糖酵解水平：详见实施例2

3.Knockdown CPT1A的肠癌细胞和CAFs混合后在体内的生长：具体方法见实施例5

实验结果：

结果如图8所示：(A)Knockdown CPT1A后的肠癌细胞能量代谢来源发生改变：转向葡萄糖代谢，糖酵解通路的代谢产物显著增加。(B)Seahorse能量代谢分析仪检测Knockdown CPT1A后的肠癌细胞的糖酵解水平显著升高。(C)低表达CPT1A的肠癌细胞和CAFs混合后接种小鼠形成的皮下瘤生长速度显著增强。结果显示了低表达CPT1A的肠癌细胞其他能量代谢通路被激活，能量代谢的来源发生改变：转向葡萄糖代谢-糖酵解通路的代谢产物显著增加、糖酵解水平显著升高，且者更有利于肠癌细胞在体内的生长。

实施例9

具体操作方法：

1.Luminex液相悬浮芯片检测VEGF、MMP2、CCL2表达水平：详见实施例6

实验结果：

结果如图9所示：(A)过表达CPT1A的CAFs和肠癌细胞共培养后细胞因子CCL2、VEGF、MMP2表达均上调；(B)转移组肠癌肿瘤组织中CCL2、VEGF、MMP2表达均上调；(C)蛋白组学结果证实转移组肠癌肿瘤组织中MMP2表达上调，注：蛋白组学未检测到VEGFA和CCL2蛋白；(D)采用脂肪酸氧化抑制剂Etomoxir显著降低过表达CPT1A的CAFs和肠癌细胞HCT116共培养后CCL2、VEGF、MMP2的表达水平；(E)采用脂肪酸氧化抑制剂Etomoxir显著降低过表达CPT1A的CAFs和肠癌细胞DLD1共培养后CCL2、VEGF、MMP2的表达水平。结果显示了CAFs脂肪酸氧化增强，其分泌促肿瘤生长和转移的因子水平也显著增强，且这种作用可以被脂肪酸氧化抑制剂Etomoxir有效抑制。

实施例10

具体操作方法：

1.含有luciferase酶表达的肠癌稳定细胞株HCT116的构建：复能基因合成含有luciferase酶的质粒，采用慢病毒转染构建稳定的表达luciferase的肠癌细胞株HCT116(HCT116-Luc+)，具体操作同实施例4。

2.构建小鼠腹膜细胞癌模型：

①HCT116-Luc+体外培养及预处理：分别为Control，CAFs/VC的condition medium(CM)，CAFs/OE的condition medium(CM)培养48h。

②小鼠分为4组：分别腹腔注射5X10^6的HCT116-Luc+(control)、HCT116-Luc采用CAFs/VC CM预处理、HCT116-Luc采用CAFs/OE CM预处理、HCT116-Luc采用CAFs/OE CM预处理+脂肪酸氧化抑制剂Etomoxir处理。

③分别在接种后1周和2周用小动物活体成像仪观察肠癌细胞腹膜种植及生长情况。

3.小动物活体成像仪观察肠癌细胞腹膜种植及生长情况：

①用无菌的PBS配制D-荧光素(钾盐)储存液，0.2μm滤膜过滤除菌。混匀后立即使用或分装于-20℃或-80℃冻存，避免反复冻融。一旦使用，放到4℃解冻，保持冰冷且避光。

②小鼠腹腔注射150mg/kg的D-荧光素。

③采用异氟烷进行小鼠麻醉，注射D-荧光素后5-15min按照小动物活体成像仪进行成像拍照。

结果显示：

结果如图10所示：(A)腹腔注射肠癌细胞1周后小动物活体成像仪显示CAFs脂肪酸氧化增强其对肠癌的腹膜种植及生长作用显著增强，且可以有效被脂肪酸氧化抑制剂Etomoxir抑制。(B)腹腔注射肠癌细胞2周后小动物活体成像仪显示CAFs脂肪酸氧化增强其对肠癌的腹膜种植及生长作用显著增强，且可以有效被脂肪酸氧化抑制剂Etomoxir抑制。结果显示CAFs脂质代谢增强其对肠癌的腹膜种植及生长作用显著增强，但这种作用可以有效被脂质代谢抑制剂Etomoxir抑制。

综上所述，肿瘤微环境中营养有限的条件下，CAFs通过减少脂联素的分泌降低肠癌细胞的CPT1A的表达，并且上调自身脂肪酸氧化基因的表达，从而将能量来源由葡萄糖转为脂肪酸，使微环境中更多的葡萄糖被肿瘤细胞摄取利用。同时CAFs的脂肪酸氧化上调其分泌细胞因子能力增强，促进肠癌细胞的增殖、转移和侵袭能力，以及促使肠癌腹膜转移及腹膜种植生长。基于此，采用脂肪酸氧化抑制剂Etomoxir可以有效抑制CAFs的功能，以及抑制CAFs通过增加脂肪酸氧化所促进的肠癌腹膜转移后在腹腔的种植生长。本课题的成功实施为该疾病的潜在预防措施和治疗方法奠定基础和提供理论依据，同时为临床有效预防及降低腹膜转移发生率提供新的治疗思路。

以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

Claims (7)

1.一种脂肪酸氧化抑制剂Etomoxir在制备治疗结直肠癌药物中应用，所述脂肪酸氧化抑制剂Etomoxir具有如下结构式：

。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述脂肪酸氧化抑制剂Etomoxir是通过抑制结直肠癌腹膜转移而达到治疗结直肠癌的目的。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述脂肪酸氧化抑制剂Etomoxir是通过抑制CAFs诱导的结直肠癌腹膜转移而达到治疗治疗结直肠癌的目的。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述脂肪酸氧化抑制剂Etomoxir是通过抑制CAFs的脂质代谢而达到是抑制CAFs诱导的结直肠癌腹膜转移的目的。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述脂肪酸氧化抑制剂Etomoxir是通过抑制CAFs脂肪酸氧化而达到抑制CAFs诱导结直肠癌腹膜转移和腹膜种植生长的目的。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述脂肪酸氧化抑制剂Etomoxir是通过抑制体外水平CAFs诱导的结直肠癌增殖和转移而达到治疗治疗结直肠癌的目的。

7.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述脂肪酸氧化抑制剂Etomoxir是通过抑制体内水平CAFs诱导的肠癌皮下瘤的生长和腹膜种植生长而达到治疗治疗结直肠癌的目的。

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