CN116637123B - 敲降或下调C15orf39基因表达的试剂在制备治疗胃癌的药物中的应用 - Google Patents

敲降或下调C15orf39基因表达的试剂在制备治疗胃癌的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了敲降或下调C15orf39基因表达的试剂在制备治疗胃癌的药物中的应用，属于医药技术领域。本发明首次发现C15orf39在胃癌中的表达情况，并通过细胞生物学的研究手段证明C15orf39促进胃癌细胞的增殖和/或迁移，是一个潜在的致癌基因。本发明通过敲降或下调C15orf39基因表达的试剂可以抑制胃癌细胞增殖，降低胃癌细的迁移能力，抑制胃癌细胞在裸鼠皮下的成瘤能力。本发明通过敲降或下调C15orf39基因表达的试剂可作为制备治疗胃癌的分子药物，提供新的胃癌治疗途径。

Description

敲降或下调C15orf39基因表达的试剂在制备治疗胃癌的药物 中的应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及敲降或下调C15orf39基因表达的试剂在制备治疗胃癌的药物中的应用。
背景技术
胃癌是一种高度异质性疾病，发病部位、病理类型、年龄、性别不同，治疗和预后转归也会不同。胃癌发生过程涉及多种遗传和表观遗传改变，如致癌基因的激活、抑癌基因的失活、细胞黏附分子和DNA错配修复基因的突变等。根据目前的临床调查研究，胃癌的发生可能与地理位置(胃癌的发病有明显的地域差异性，不同国家、不同地域的胃癌发病率都不相同)、饮食生活因素(长期食用腌制、烧烤、熏制及日常饮食中食用较少的水果、蔬菜等高纤维食物的人群，胃癌发病率明显升高)、幽门螺旋杆菌(Hp)感染、慢性疾病及癌前病变(如胃息肉、慢性萎缩性胃炎、肠上皮化生或术后的残胃等)、遗传的因素、长期服用阿司匹林或他汀类等药物等有关。
手术切除是治愈胃癌的唯一有效方法，早期胃癌术后5年生存率高达90.9％～100％。而进展期患者需要根据胃癌病理学类型及临床分期，采用以手术治疗为主，联合围手术期化疗、放疗、生物靶向治疗等手段的综合治疗，以达到延长患者生存期限，改善患者的生存质量。进展期胃癌治疗的重点是强调根治性手术的规范性及相关辅助治疗的合理性。目前对进展期胃癌的治疗仍未达到理想效果。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的提供敲降或下调C15orf39基因表达的试剂在制备治疗胃癌的药物中的应用，通过敲降或下调C15orf39基因表达的试剂可以抑制胃癌细胞增殖、降低胃癌细的迁移能力、抑制小鼠胃癌细胞皮下成瘤能力。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了敲降或下调C15orf39基因表达的试剂在制备治疗胃癌的药物中的应用。
优选的，所述胃癌包括胃腺癌。
优选的，所述应用包括以下(1)～(4)中的一种或两种以上：
(1)抑制胃癌细胞增殖；
(2)抑制胃癌细胞迁移；
(3)促进胃癌细胞凋亡；
(4)降低致瘤能力。
本发明提供了一种治疗胃癌的药物组合物，包括敲降或下调C15orf39基因表达的试剂和药学上可接受的辅料。
优选的，所述敲降C15orf39基因表达的试剂包括沉默C15orf39基因表达的siRNA、敲降C15orf39基因的载体或C15orf39敲降慢病毒。
优选的，所述药物组合物包括口服制剂或注射制剂。
本发明提供了一种靶向抑制C15orf39基因表达的siRNA，所述siRNA包括siRNA2和siRNA3的一种或两种；所述siRNA2由序列为SEQ ID NO.3的正义链和序列为SEQ ID NO.4的反义链组成；所述siRNA3由序列为SEQ ID NO.5的正义链和序列为SEQ ID NO.6的反义链组成。
本发明提供了一种靶向抑制C15orf39基因表达的siRNA质粒，所述质粒包括上述技术方案所述siRNA。
本发明提供了一种基于上述技术方案所述靶向抑制C15orf39基因表达的siRNA质粒构建得到的C15orf39敲降慢病毒。
本发明还提供了一种C15orf39基因的检测试剂在制备胃癌诊断工具中的应用。
本发明的有益效果：
本发明提供了敲降或下调C15orf39基因表达的试剂在制备治疗胃癌的药物中的应用。本发明首次发现C15orf39在胃癌中的表达情况，并通过细胞生物学的研究手段证明C15orf39促进胃癌细胞的增殖和/或迁移，是一个潜在的致癌基因。本发明通过敲降或下调C15orf39基因表达的试剂可以抑制胃癌细胞增殖、降低胃癌细的迁移能力、抑制小鼠胃癌细胞皮下成瘤能力。本发明通过敲降或下调C15orf39基因表达的试剂可作为制备治疗胃癌的分子药物，提供新的胃癌治疗途径。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实时定量PCR检测C15orf39基因在40对胃癌病人癌组织和癌旁组织中的表达情况图；
图2为C15orf39基因在40对胃癌病人癌组织和癌旁组织中的表达数据绘制的箱线图；
图3为AGS胃癌细胞中siRNA1、siRNA2和siRNA3对C15orf39相对mRNA表达量的影响图；
图4为SGC7901胃癌细胞siRNA1、siRNA2和siRNA3对C15orf39相对mRNA表达量的影响图；
图5为siRNA2和siRNA3对胃癌细胞AGS细胞生长的影响图；
图6为siRNA2和siRNA3对胃癌细胞SGC7901细胞生长的影响图；
图7为Western blot检验AGS-LV3-shC15orf39-2、AGS-LV3-shC15orf39-3以及SGC7901-LV3-shC15orf39-2、SGC7901-LV3-shC15orf39-3稳转株检测结果图；
图8为C15orf39敲降慢病毒感染的胃癌细胞的细胞克隆染色结果图；
图9为C15orf39敲降慢病毒感染的胃癌细胞的细胞克隆计数结果图；
图10为C15orf39敲降慢病毒感染的胃癌细胞的细胞迁移实验结果图；
图11为C15orf39敲降慢病毒感染的胃癌细胞的细胞迁移实验迁移细胞数量统计结果图；
图12为Western blot检测C15orf39过表达质粒转染胃癌细胞中C15orf39的表达水平图；
图13为C15orf39过表达质粒对胃癌细胞AGS细胞生长的影响图；
图14为C15orf39过表达质粒对胃癌细胞SGC7901细胞生长的影响图；
图15为C15orf39过表达质粒对胃癌细胞的细胞迁移实验结果图；
图16为C15orf39过表达质粒对胃癌细胞的细胞迁移实验迁移细胞数量统计结果图；
图17为沉默C15orf39的表达抑制胃癌细胞对肿瘤大小的影响图；
图18为沉默C15orf39的表达对肿瘤重量的影响图。
具体实施方式
本发明提供了一种敲降或下调C15orf39基因表达的试剂在制备治疗胃癌的药物中的应用。
本发明首次发现C15orf39在胃癌中的表达情况并通过细胞生物学的研究手段证明C15orf39促进胃癌细胞的增殖和/或迁移，是一个潜在的致癌基因。本发明通过敲降或下调C15orf39基因表达的试剂可以抑制胃癌细胞增殖、降低胃癌细的迁移能力、抑制小鼠胃癌细胞皮下成瘤能力。本发明通过敲降或下调C15orf39基因表达的试剂可作为制备治疗胃癌的分子药物，提供新的胃癌治疗途径。
在本发明中，所述C15orf39基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示：
ATGTTGACTGGACTCTGGCGACTGGGCCCCTGTTGCCCTCAGCTGACCCACCCTGCTCTCTGGCCCCAGCTCCTAGCAAGGGCCAGACTCTGGATGGCACCTTCTTGCGGGGGGTGCCAGCTGAGGGGTCCAGTAAAGACTCCTCAGGGAGCTTCTCCCCATGCCAGCCCTTCCTGGAGAAATATCAGACCATCCACAGCACGGGCTTCCTGGCCTCCAGCACCCTCTCCAGGCCTCAAGCTGGAGCCGCCTCTCACTCCACGGTGCCCATTGGACTTTGCCCCCCAGACACTGAGTTTTCCTTATGCCCGGGATGACCTCTCTCTCTATGGAGCATCCCCTGGGCTTGGAGGGACACCACCTTCCCAGAACAATGTGAGGGCTGTGCCACAGCCCGGTGCCTTCCAGAGGGCATGCCAGCCTTTGCCAGCGAGCCAGCCCTGCTCAGAGCCTGTGAGGCCTGCACAGGAAGCCGAAGAGAAGACCTGGCTGCCCAGCTGCAGGAAAGAGAAGCTCCAGCCCCGGCTCAGTGAGCACTCTGGGCCGCCCATCGTCATCCGAGACAGTCCAGTTCCCTGTACCCCCCCAGCACTGCCCCCCTGTGCCCGGGAGTGCCAGTCTCTTCCACAGAAGGAGGACGCAAGGCCACCCAGCTCTCCACCAATGCCTGTCATTGACAATGTCTTCAGCCTGGCCCCCTACCGTGACTATCTGGATGTGCCGGCACCCGAGGCCACAACTGAGCCTGACTCTGCCACAGCTGAGCCTGACTCAGCCCCAGCCACCAGTGAAGGTCAGGACAAAGGCTGCAGGGGGACCCTGCCTGCCCAGGAGGGCCCCTCAGGGAGTAAACCCCTAAGGGGCTCACTTAAGGAGGAGGTAGCCCTGGATTTGAGTGTGAGGAAGCCCACAGCAGAGGCTCCCCTGTCAAGGCTTCCCGTTCTGTGGAGCATGCCAAGCCTACTGCAGCCATGGATGTGCCAGATGTGGGCAACATGGTGTCAGATCTGCCAGGCCTGAAAAAGATAGACACAGAAGCACCAGGCTTGCCTGGGGTGCCAGTGACCACAGATGCCATGCCAAGGACCAACTTCCACAGCTCTGTGGCCTTCATGTTCCGAAAGTTCAAGATCCTCCGTCCGGCACCTTTGCCTGCAGCCGTGGTCCCGTCCACGCCCACCTCAGCTCCTGCTCCCACACAGCCTGCACCCACCCCCACATCTGGGCCCATTGGACTGCGGATTCTCGCTCAACAGCCCTTGTCTGTGACCTGCTTCAGCCTGGCACTGCCCAGCCCTCCAGCCGTAGCTGTGGCCTCCCCTGCCCCTGCTCCAGCTCCATCCCCTGCTCCGGCTCGAGCTCAGGCTCCAGCTTCAGCCCGGGATCCAGCTCCAGCTCCAGCTCCAGTTGCAGGCCCTGCTCCAGCATCTACTTCAGCCCCAGGGGACTCCCTGGAGCAGCATTTTACAGGACTACATGCGTCCCTGTGTGATGCTATTTCTGGCTCCGTCGCCCACTCTCCTCCAGAGAAGCTTCGCGAGTGGCTAGAGACGGCTGGGCCCTGGGGCCAGGCTGCGTGGCAGGACTGCCAGGGTGTGCAGGGGCTGCTGGCCAAGCTGCTGTCTCAGCTGCAGCGCTTCGATCGCACCCACCGGTGCCCCTTCCCCCATGTGGTGCGAGCTGGCGCCATCTTCGTGCCCATTCACCTGGTGAAGGAGCGGCTCTTCCCTCGGCTGCCACCCGCTTCTGTGGACCATGTGCTGCAGGAGCATCGTGTGGAGCTGCGGCCCACCACGCTGTCGGAGGAGCGGGCACTGCGGGAGCTCGCCCTGCCAGGCTGCACCTCACGCATGCTGAAGTTACTGGCGCTGCGCCAGCTGCCGGACATTTACCCCGACCTTCTCGGCCTGCAGTGGCGCGACTGTGTACGCCGCCAGCTGGGTGACTTTGACACTGAGGCTGGAGCTGTGTCCTCCTCAGAGCCCACTGTGGCCAGAGATGAGCCAGAGAGCCTAGCCCTGGCTCAGAAGTCACCGGCCCCCAAGGTCAGGAAGCCAGGCAGGAAGCCACCAACCCCTGGCCCGGAGAAAGCAGAGGCAGCTGCTGGGGAAGAGTCCTGTGGTGCCTCCCCTACCCCTGCTACCAGTGCCAGCCCACCTGGCCCCACACTGAAGGCCCGCTTCCGCAGTCTGCTGGAGACCGCCTGGCTCAATGGCCTGGCTCTGCCCACCTGGGGCCACAAGTCCTCAAGACCAGACCAGCCCTCACCCTGCCCACAGCTGCTGGACAGCCAGAGCCATCACCTGTAG。
在本发明中，C15orf39蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示：
MLTGLWRLGPCCPQLTHPALWPQLLARARLWMAPSCGGCQLRGPVKTPQGASPHASPSWRNIRPSTARASWPPAPSPGLKLEPPLTPRCPLDFAPQTLSFPYARDDLSLYGASPGLGGTPPSQNNVRAVPQPGAFQRACQPLPASQPCSEPVRPAQEAEEKTWLPSCRKEKLQPRLSEHSGPPIVIRDSPVPCTPPALPPCARECQSLPQKEDARPPSSPPMPVIDNVFSLAPYRDYLDVPAPEATTEPDSATAEPDSAPATSEGQDKGCRGTLPAQEGPSGSKPLRGSLKEEVALDLSVRKPTAEASPVKASRSVEHAKPTAAMDVPDVGNMVSDLPGLKKIDTEAPGLPGVPVTTDAMPRTNFHSSVAFMFRKFKILRPAPLPAAVVPSTPTSAPAPTQPAPTPTSGPIGLRILAQQPLSVTCFSLALPSPPAVAVASPAPAPAPSPAPARAQAPASARDPAPAPAPVAGPAPASTSAPGDSLEQHFTGLHASLCDAISGSVAHSPPEKLREWLETAGPWGQAAWQDCQGVQGLLAKLLSQLQRFDRTHRCPFPHVVRAGAIFVPIHLVKERLFPRLPPASVDHVLQEHRVELRPTTLSEERALRELALPGCTSRMLKLLALRQLPDIYPDLLGLQWRDCVRRQLGDFDTEAGAVSSSEPTVARDEPESLALAQKSPAPKVRKPGRKPPTPGPEKAEAAAGEESCGASPTPATSASPPGPTLKARFRSLLETAWLNGLALPTWGHKSSRPDQPSPCPQLLDSQSHHL。
在本发明中，所述胃癌优选包括胃腺癌。
在本发明中，所述治疗胃癌优选包括抑制胃癌细胞增殖。本发明通过敲降或下调C15orf39基因表达的试剂可以显著抑制胃癌细胞AGS和SGC7901的增殖能力，使细胞克隆的形成数目和大小明显减少。
在本发明中，所述治疗胃癌优选包括抑制胃癌细胞迁移。本发明通过敲降或下调C15orf39基因表达的试剂可以显著抑制胃癌细胞AGS和SGC7901的迁移能力。
在本发明中，所述治疗胃癌优选包括促进胃癌细胞凋亡。
在本发明中，所述治疗胃癌优选包括降低致瘤能力。本发明通过小鼠体内成瘤实验结果表明，通过敲降或下调C15orf39基因表达的试剂相对于对照组可显著降低瘤的体积和重量，抑制小鼠胃癌细胞皮下成瘤能力。
本发明提供了一种治疗胃癌的药物组合物，包括敲降或下调C15orf39基因表达的试剂和药学上可接受的辅料。
本发明对药学上可接受的辅料没有特殊限制，采用本领域常规辅料均可。在本发明中，所述敲降或下调C15orf39基因表达的试剂优选包括沉默C15orf39基因表达的siRNA、敲降C15orf39基因的质粒或C15orf39敲降慢病毒。
在本发明中，所述siRNA优选包括siRNA2和siRNA3的一种或两种，更优选为siRNA3。在本发明中，所述siRNA2的正义链如SEQ ID NO.3(5’-GCCUCAUUUAAGGGAUUCUdTdT-3’)所示，或者siRNA2的正义链如SEQ ID NO.3(5’-GCCUCAUUUAAGGGAUUCU-3’)所示，所述SEQ ID NO.3的3’端dTdT悬垂；所述siRNA2的反义链如SEQ ID NO.4(5’-AGAAUCCCUUAAAUGAGGCdTdT-3’)所示，或者siRNA2的反义链如SEQ ID NO.4(5’-AGAAUCCCUUAAAUGAGGC-3’)所示，所述SEQ ID NO.4的3’端dTdT悬垂。在本发明中，所述siRNA3的正义链如SEQ ID NO.5(5’-GGGUCUUUAUUGGAUAGGAdTdT-3’)所示，或者所述siRNA3的正义链如SEQ ID NO.5(5’-GGGUCUUUAUUGGAUAGGA-3’)所示，所述SEQ ID NO.5的3’端dTdT悬垂；所述siRNA3的反义链如SEQ ID NO.6(5’-UCCUAUCCAAUAAAGACCCdTdT-3’)所示，或者所述siRNA3的反义链如SEQ ID NO.6(5’-UCCUAUCCAAUAAAGACCC-3’)所示，所述SEQ IDNO.6的3’端dTdT悬垂。在本发明中，所述siRNA1的正义链如SEQ ID NO.1(5’-GCCUUCAUGUUCCGAAAGUdTdT-3’)所示，或者所述siRNA1的正义链如SEQ ID NO.1(5’-GCCUUCAUGUUCCGAAAGU-3’)所示，所述SEQ ID NO.1的3’端dTdT悬垂；所述siRNA1的反义链如SEQ ID NO.2(5’-ACUUUCGGAACAUGAAGGCdTdT-3’)所示，或者所述siRNA1的反义链如SEQID NO.2(5’-ACUUUCGGAACAUGAAGGC-3’)所示，所述SEQ ID NO.2的3’端dTdT悬垂。siRNA1作为干扰RNA对C15orf39基因的表达没有显著影响。本发明siRNA在3’端悬挂由脱氧核苷组成的碱基T，用于提高基因沉默效率以及增强siRNA化合物的稳定性。
本发明提供了一种靶向抑制C15orf39基因表达的siRNA，所述siRNA包括siRNA2和siRNA3的一种或两种；所述siRNA2由序列为SEQ ID NO.3的正义链和序列为SEQ ID NO.4的反义链组成；所述siRNA3由序列为SEQ ID NO.5的正义链和序列为SEQ ID NO.6的反义链组成。
本发明提供了一种靶向抑制C15orf39基因表达的siRNA质粒，所述质粒包括上述技术方案所述siRNA。在本发明中，所述质粒优选包括LV3-shC15orf39-2质粒和LV3-shC15orf39-3质粒。在本发明中，所述LV3-shC15orf39-2质粒中优选包括上述技术方案所述siRNA2。在本发明中，所述LV3-shC15orf39-3质粒优选包括上述技术方案所述siRNA3。在本发明中，所述LV3-shC15orf39-2质粒可以达到表达siRNA2的目的；所述LV3-shC15orf39-3质粒可以达到表达siRNA3的目的。
本发明对siRNA质粒的构建方法没有特殊限制，采用本领域常规质粒构建方法均可。
本发明提供了一种基于上述技术方案所述靶向抑制C15orf39基因表达的siRNA质粒构建得到的C15orf39敲降慢病毒。
本发明对C15orf39敲降慢病毒的构建方法没有特殊限定，采用本领域常规方法，能够使目的基因表达即可。
本发明还提供了一种C15orf39敲降慢病毒的制备方法，包括：
将上述技术方案所述siRNA质粒、pMD2.G质粒和psPAX2质粒转染293FT细胞获得。
本发明对所述转染的方法没有特殊限定，采用本领域常规转染方法均可。将所述敲降C15orf39基因的载体、pMD2.G质粒和psPAX2质粒转染293FT细胞后，本发明优选对所得细胞进行培养后，收集上清离心，取上清获得C15orf39敲降慢病毒。
本发明还提供了一种C15orf39基因的检测试剂在制备胃癌诊断工具中的应用。在本发明中，所述C15orf39基因在胃癌组织中的表达明显高于癌旁组织。检测C15orf39基因的试剂可应用于胃癌的早期筛查、高危人群监测、预后评估。在本发明中，所述C15orf39基因可作为诊断胃癌的特异性标志基因，使胃癌诊断更加准确、快速。
在本发明中，所述C15orf39基因的检测方法优选包括采用PCR方法进行检测，更优选为采用qRT-PCR方法进行检测。
在本发明中，所述检测试剂优选包括用于检测C15orf39基因的引物对和PCR反应液。
本发明用于检测C15orf39基因的引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7(5’-CTGCACCTCACGCATGCTG-3’)所示；本发明用于检测C15orf39基因的引物对的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8(5’-TGTCAAAGTCACCCAGCTG-3’)所示。
本发明用于检测C15orf39基因的引物对优选还包括检测β-actin基因的上游引物和检测β-actin基因的下游引物。本发明检测β-actin基因的上游引物的核苷酸序列如SEQID NO.9(5’-AGAGCCTCGCCTTTGCCGATCC-3’)所示；检测β-actin基因的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.10(5’-CTGGGCCTCGTCGCCCACATA-3’)所示。所述β-actin基因主要作为内参基因，对目的基因的相对表达量进行计算。
在本发明中，采用所述检测试剂检测上述C15orf39基因的方法，优选包括以下步骤：
提取待测样品中的总RNA；
将总RNA逆转录成cDNA；
将cDNA进行实时荧光定量PCR反应；
反应结束后检测样品中C15orf39基因的相对表达水平，并使用2-△△Ct公式来对C15orf39基因进行定量分析。
本发明对提取总RNA和将总RNA逆转录成cDNA的方法没有特殊限定，采用本领域常规方法均可。本发明进行实时荧光定量PCR反应的反应体系优选包括：TB GreenPremix ExTaq5μL，浓度为10μM的上游引物0.25μL，浓度为10μM的下游引物0.25μL，cDNA模板1μL，50×ROX Reference Dye II 0.2μL和ddH2O 3.3μL。
在本发明中，所述PCR反应的程序包括：1：预变性：1cycle，95℃，10min；2：PCR反应：40cycles，95℃，15s，60℃，30s；3：溶解曲线，95℃，15s，60℃，1min。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
C15orf39在临床胃癌样本中的表达模式
本发明前期通过大量实验研究，发现C15orf39在胃癌组织中明显上升。进一步对40对临床样本的胃癌组织和癌旁组织进行实时定量PCR，检测胃癌组织和癌旁组织中C15orf39的表达量。
(1)临床组织样本的获取
胃癌及癌旁组织取自手术治疗的胃癌患者，在获取样本前均与患者签订了知情同意书。手术切除的胃癌组织一经离体，迅速切取肿瘤原发灶及周围5cm以外的癌旁组织，投入液氮中速冻并移至-80℃冰箱保存，运输时储存于液氮中。癌与癌旁组织均通过病理专家做出最终诊断。
(2)组织及细胞RNA抽提
采用TRIzol Reagent(Invitrogen)试剂抽提RNA，具体操作如下：
1)研钵、碾杵和匀浆器等器皿洗净，分别再用ddH2O和DEPC H2O冲洗，然后在180℃烘箱中烘约4h，以去除RNA酶；
2)在研钵中加入适量液氮使之预冷，将组织从液氮中迅速取出，切取约50～100mg大小，在研钵中研磨成粉末；
3)用刮匙将研磨好的组织粉末尽可能完全的移至无RNA酶的EP管中，EP管被预先加入适量体积(1mL)TRIzol试剂，充分匀浆；
4)室温放置5min，按比例向离心管中加入氯仿(200μL/1mL TRIzol)，迅速剧烈振荡15秒，室温静置2-3min，4℃，12000×g条件下离心15min；
5)将上层水相尽可能地转移至新的无RNA酶的EP管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀5次，室温静置10min，4℃，12000×g条件下离心10min，此时可见RNA沉淀；
6)将上清倒掉，加入75％乙醇(1mL/1mL TRIzol)，混匀，洗涤RNA，离心4℃，7500×g条件下离心5min；
7)弃上清，尽可能除尽残留乙醇，沉淀自然干燥5-10min(注意切勿完全干燥)；加入30-50μL DEPC H2O，吹吸几次，溶解RNA沉淀；
8)酶标仪测定RNA浓度及纯度OD260/280(1.8～2.0)；凝胶电泳观察有无降解，-80℃保存。
9)细胞株RNA抽提，取对数生长期的细胞，吸取培养液，根据培养皿的面积加入相应量的TRIzol试剂(1mL TRIzol/10cm2)裂解细胞，吹打几次，将裂解下来的细胞收集至无RNA酶的EP管中，其余按照上述步骤4)–8)完成氯仿–异丙醇法分离纯化RNA。
(4)RNA的逆转
1)本实验采用的是日本Takara公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNAEraser试剂盒。
第一步需去除gDNA，按照表1所述体系在冰上配制反应液I：
表1反应液I组成
试剂 用量
gDNA Eraser 1μL
5×gDNA Eraser buffer 2μL
RNA 1μg
RNase Free dH2O 加至10μL
2)室温5min后进行反转录，在冰上配制反转录体系如表2所示。
表2反转录体系组成
试剂 用量(μL)
RT Primer Mix 4 1
Prime Script RT Enzyme Mix I 1
5×Prime Script Buffer 2 4
反应液I 10
RNase FreedH2O 加至20μL
3)于37℃恒温水浴锅中水浴15min，取出放置在冰上3～5min后，加入20μL RNaseFree H2O稀释，-80℃冰箱保存备用。
(5)实时定量PCR
本实验采用的是日本Takara生物公司的TBPremix Ex TaqTM试剂盒。
1)将反转录的cDNA按照下列体系在冰上配置PCR反应液如表3所示。
表3PCR反应液组成
试剂 用量
TB GreenPremix Ex Taq 5μL
Forward primer(10μM) 0.25μL
Reverse primer(10μM) 0.25μL
cDNA模板 1μL
50×ROX Reference Dye II 0.2μL
ddH2O 3.3μL
用于扩增C15orf39基因的引物对的上游引物如SEQ ID NO.7所示；用于检测C15orf39基因的引物对的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
用于检测β-actin基因的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；用于检测β-actin基因的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。所述β-actin基因主要作为内参基因，对目的基因的相对表达量进行计算。C15orf39与β-actin的rt-qPCR引物由上海华津生物科技有限公司合成。
2)将配制好的反应液加入384孔板，每个样品需要设置3个复孔。
3)利用Q6荧光定量PCR系统进行操作，按照如下条件设置：1：预变性Reps：1cycle，95℃，10min；2：PCR反应，Reps：40cycles，95℃，15s，60℃，30s；3：溶解曲线，95℃，15s，60℃，1min。
4)目的基因相对表达量计算：β-actin为内参，使用2-ΔΔCt法进行计算。
癌与癌旁C15orf39 mRNA相对比值如表4所示。实时定量PCR检测C15orf39基因在40对胃癌病人癌组织和癌旁组织中的表达情况示意图如图1所示；C15orf39基因在40对胃癌病人癌组织和癌旁组织中的表达数据绘制的箱线图如图2所示。
表4癌与癌旁C15orf39 mRNA相对比值
由表4、图1和图2可得，在40对临床样本中，通过实时定量PCR检测发现有26例样本胃癌组织中C15orf39的表达明显高于相应的癌旁组织，上调率达到65％(癌组织对比癌旁组织相对表达量比值≥1.5)，统计学分析表明p<0.01(图1中A与B)，说明结果的可靠性。
实施例2
沉默C15orf39的表达抑制胃癌细胞生长与迁移
(1)为了验证C15orf39在胃癌发生中的功能，本发明利用人工合成的C15orf39的小干扰RNA(siRNA)感染胃癌细胞以降低C15orf39的表达。
本发明设计得到的干扰C15orf39表达的siRNA为siRNA1、siRNA2和siRNA3。
siRNA1序列的正义链如SEQ ID NO.1所示，反义链如SEQ ID NO.2所示；siRNA2序列的正义链如SEQ ID NO.3所示，反义链如SEQ ID NO.4所示；siRNA3序列的正义链如SEQID NO.5所示，反义链如SEQ ID NO.6所示。
通过实时定量PCR实验检测C15orf39的表达量，验证siRNA的效果。
委托上海吉码制药技术有限公司合成siRNA1、siRNA2和siRNA3，同时设计合成作为干扰对照的NC非特异性核苷酸序列siNC的正义链如SEQ ID NO.11(5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3’)所示，或是所述siNC的正义链如SEQ ID NO.11(5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’)所示，所述SEQ ID NO.11的3’端dTdT悬垂，反义链如SEQ IDNO.12(5’-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3’)所示，或者所述反义链如SEQ ID NO.12(5’-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3’)所示，所述SEQ ID NO.12的3’端dTdT悬垂。
(2)AGS、SGC7901胃癌细胞来自中国科学院上海细胞库。采用含10％胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中培养胃癌细胞。0.25％的胰蛋白酶(含EDTA)用于消化细胞。
(3)使用C15orf39小干扰RNA转染胃癌细胞
1)采用步骤(2)中的培养方法培养细胞至30％～40％汇合度时进行转染。
2)每孔按照以下体系进行转染
将125μL Opti-MEM和4μL LipofectamineTM 3000进行柔和混匀，得到A液。
将125μL Opti-MEM和8μL步骤(1)中的siRNA进行柔和混匀，得到B液。
3)将A液和B液各自混匀充分后，孵育5min。
4)将A液与B液充分混匀，室温孵育20min，在胃癌细胞中轻轻滴入混合液。
5)37℃孵育细胞48h，然后分析转染细胞。
(4)对转染细胞按照实施例1中所述方法进行细胞RNA的提取，RNA逆转获得cDNA，进行实时荧光定量PCR检测，检测siRNA1、siRNA2和siRNA3对C15orf39相对mRNA表达量的影响。
AGS胃癌细胞中siRNA1、siRNA2和siRNA3对C15orf39相对mRNA表达量的影响如图3所示。
SGC7901胃癌细胞siRNA1、siRNA2和siRNA3对C15orf39相对mRNA表达量的影响如图4所示。
由图3和图4可得，通过实时定量PCR实验检测显示干扰C15orf39表达的siRNA中siRNA2和siRNA3位点有效。
(5)将分别转染siNC和siRNA2和siRNA3位点的胃癌细胞AGS与SGC7901以每孔3×103个细胞接种于96孔板中，在含10％胎牛血清的DMEM培养基中置于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中进行培养，利用CCK8试剂盒检测5天胃癌细胞AGS与SGC7901的细胞生长情况。
siRNA2和siRNA3对胃癌细胞AGS细胞生长的影响如图5所示；siRNA2和siRNA3对胃癌细胞SGC7901细胞生长的影响如图6所示。
由图5和图6可得，沉默C15orf39表达明显抑制胃癌细胞的增殖。
(6)依据siRNA2、siRNA3位点，构建C15orf39敲降慢病毒。
1)构建敲降C15orf39基因的载体。以siRNA2为目的基因，将其克隆入载体中，得到LV3-shC15orf39-2质粒；以siRNA3为目的基因，将其克隆入载体中，得到LV3-shC15orf39-3质粒。
2)将处于对数生长期的293FT细胞按照大盘70％～80％的密度传代，贴壁后进行转染，转染前需将培养基换成无血清DMEM，按照以下体系进行转染。
将250μL Opti-MEM和32μL LipofectamineTM 3000进行柔和混匀，得到A液。
将250μL Opti-MEM、40μL P3000TM、7μg步骤1)中的LV3-shC15orf39-2质粒或LV3-shC15orf39-3质粒、1.5μgpMD2.G和4.5μgpsPAX2辅助质粒进行柔和混匀，得到B液。
3)A液与B液充分混匀，室温孵育20min，在293FT细胞中轻轻滴入混合液。将细胞放置于培养箱培养6～8h后更换成完全培养基。48h后收集上清到15mL管，室温4000rpm，离心5min，分装至无菌EP管中，4℃，12000rpm离心后取上清，上清液即为C15orf39敲降慢病毒，-80℃冰箱保存。
(7)C15orf39敲降慢病毒感染胃癌细胞
选择对数生长期的胃癌细胞按照30％的密度传代至小盘中，胃癌细胞贴壁后将步骤3)制备的C15orf39敲降慢病毒加入细胞中，同时加入polybrene(2μL/mL)，轻轻晃动混匀。细胞贴壁后加入1.5μg/mL的嘌呤霉素来筛选细胞。得到AGS与SGC7901胃癌细胞C15orf39表达下调的稳转株LV3-shC15orf39-2与LV3-shC15orf39-3，即AGS-LV3-shC15orf39-2、AGS-LV3-shC15orf39-3以及SGC7901-LV3-shC15orf39-2、SGC7901-LV3-shC15orf39-3。
对AGS-LV3-shC15orf39-2、AGS-LV3-shC15orf39-3以及SGC7901-LV3-shC15orf39-2、SGC7901-LV3-shC15orf39-3分别抽提其蛋白质，经过Western blot检验证实稳转株构建情况。
Western blot试验过程如下：
(1)制备SDS-PAGE电泳凝胶，选择适当的上样孔中加入3μL预染蛋白marker，其余上样孔中加入10μL蛋白样品。
(2)电泳，浓缩胶电压80V，分离胶电压150V，直至溴酚蓝到达胶的底端。
(3)结束电泳，将胶浸泡在转膜缓冲液中，在夹子上依次铺上海绵，滤纸、凝胶、NC膜、滤纸、海绵，用玻璃棒赶走气泡，250mA恒流湿转1h。
(4)转膜结束后，将硝酸纤维膜放在封闭液中室温温和振荡1h。
(5)将膜按照将要孵育的一抗的蛋白分子量剪开。
(6)将膜放入一抗中，以PBST缓冲液作为稀释液，对抗体C15orf39(Invitrogen，PA5-65318)按照体积比1:1000进行稀释，对抗体β-actin(Proteintech，20536-1-AP)按照体积比为1:3000进行稀释，得到一抗稀释液配好后，分别放入湿盒中室温孵育1h 30min。
(7)一抗孵育结束后，用PBST温和振荡洗膜3次，每次5min。
(8)以PBST缓冲液作为稀释液，对羊来源的抗兔二抗或抗鼠二抗按照体积比为1:3000进行稀释后，放入湿盒中室温孵育1h。
(9)二抗结束后，用PBST缓冲液温和振荡洗膜3次，每次5min。
(10)配制化学发光液，进行曝光。
Western blot检验AGS-LV3-shC15orf39-2、AGS-LV3-shC15orf39-3以及SGC7901-LV3-shC15orf39-2、SGC7901-LV3-shC15orf39-3稳转株检测结果如图7所示。
由图7可得，AGS-LV3-shC15orf39-2、AGS-LV3-shC15orf39-3以及SGC7901-LV3-shC15orf39-2、SGC7901-LV3-shC15orf39-3稳转株构建成功。随后将稳转株进行传代并冻存。
(8)C15orf39敲降慢病毒感染的胃癌细胞的细胞克隆形成实验
1)将AGS-LV3-shC15orf39-2、AGS-LV3-shC15orf39-3以及SGC7901-LV3-shC15orf39-2、SGC7901-LV3-shC15orf39-3作为试验组，同时将AGS-LV3-shNC和SGC7901-LV3-shNC分别作为对照组，将上述试验组和对照组细胞以1×103个/孔的对数生长期细胞接种于六孔板中，行平板克隆形成实验，每组实验进行三组平行实验，每孔加入1.5mL含10％胎牛血清的DMEM培养基，轻轻晃动，使细胞均匀铺开后放入培养箱。
2)培养2-3周，期间每3～5天进行一次换液。
3)待肉眼可见克隆时，吸去培养基，PBS缓冲液清洗2次，吸净PBS；每孔加入1mL4％多聚甲醛，放置于摇床上，固定30min。
4)吸去4％多聚甲醛溶液，继续PBS清洗2次，向每孔中加入1mL 0.5％结晶紫试剂，染色。
5)克隆形成染色结果进行拍照，如图8所示，按照相同的标准(细胞克隆大小)对每个培养皿上的细胞克隆进行计数，统计结果如图9所示。
由图8和图9可得，沉默C15orf39表达明显抑制胃癌细胞的克隆形成能力。
(9)C15orf39敲降慢病毒感染的胃癌细胞的细胞迁移实验
1)将AGS-LV3-shC15orf39-2、AGS-LV3-shC15orf39-3以及SGC7901-LV3-shC15orf39-2、SGC7901-LV3-shC15orf39-3作为试验组，同时将AGS-LV3-shNC和SGC7901-LV3-shNC分别作为对照组，将上述试验组和对照组细胞用胰酶消化，加培养基吹打为单个细胞，转移至1.5mL EP管中，1000rpm离心3min，弃上清；加入1mLPBS 1000rpm离心3min，弃上清。再加入1mL PBS 1000rpm离心3min，弃上清，在管中加入1mL无血清的DMEM培养基，吹打细胞至密度均匀，并使用细胞计数板计数。
2)向Transwell小室的孔内加入试验组和对照组胃癌细胞3×104个，补加无血清的DMEM至总体积400μL，同时下层加入800μL含有含10％胎牛血清的DMEM培养基。轻轻拍打侧壁混匀后放入37℃培养箱继续培养48h后将小室取出，弃培养基，用甲醇固定15min，将小室放入0.01％的结晶紫溶液中染色20min。用棉棒刮去小室内面的细胞，于显微镜下观察将小室并拍照如图10所示。
在200X倍数下，取“左上、右上、左下、右下、中”五个视野，分别对迁移细胞进行计数，并取其平均值作为细胞迁移数。每组实验均设置三个重复孔，每组实验重复三次。细胞迁移数统计结果如图11所示。
由图10和图11可得，沉默C15orf39表达明显抑制胃癌细胞的迁移能力
实施例3
过表达C15orf39促进胃癌细胞生长与迁移
(1)为了验证C15orf39在胃癌发生中的功能，进一步通过瞬时转染C15orf39质粒上调AGS与SGC7901中C15orf39的表达水平。
构建C15orf39过表达质粒pENTER-C15orf39质粒，委托由山东维真生物科技有限公司合成。
(2)AGS、SGC7901胃癌细胞来源和培养方法同实施例2。
(3)使用C15orf39过表达质粒转染胃癌细胞。
1)采用步骤(2)中的培养方法培养细胞至60％～70％汇合度时进行转染。
2)每孔按照以下体系进行转染
将125μLOpti-MEM和4μLLipofectamineTM 3000进行柔和混匀，得到A液。
将125μLOpti-MEM和5μLP3000TM和1.5～2.5μg C15orf39过表达质粒进行柔和混匀，得到B液。
3)将A液和B液各自混匀充分后，孵育5min。
4)将A液与B液充分混匀，室温孵育20min，在胃癌细胞中轻轻滴入混合液。
5)37℃孵育细胞24h，然后分析转染胃癌细胞。
(4)Westernblot检测转染胃癌细胞中C15orf39的表达水平。
分别提取转染胃癌细胞中的蛋白质，经过Westernblot检验转染胃癌细胞中C15orf39的表达水平。
Westernblot检测方法同实施例2。
Westernblot检测C15orf39过表达质粒转染胃癌细胞中C15orf39的表达水平如图12所示。
由图12可得，C15orf39过表达质粒在胃癌细胞中过表达成功。
(5)C15orf39过表达质粒转染胃癌细胞的细胞生长试验
将分别转染pENTER-C15orf39质粒和对照质粒pENTER的胃癌细胞AGS与SGC7901以每孔3×103个细胞接种于96孔板中，在含10％胎牛血清的DMEM培养基中置于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中进行培养，利用CCK8试剂盒检测了5天胃癌细胞AGS与SGC7901的细胞生长情况。
C15orf39过表达质粒对胃癌细胞AGS细胞生长的影响如图13所示；C15orf39过表达质粒对胃癌细胞SGC7901细胞生长的影响如图14所示。
由图13和图14可得，上调C15orf39表达明显促进了胃癌细胞的增殖。
(6)C15orf39过表达质粒转染胃癌细胞的细胞迁移实验
1)将分别转染pENTER-C15orf39质粒和对照质粒pENTER的胃癌细胞AGS与SGC7901用胰酶消化，加培养基吹打为单个细胞，转移至1.5mLEP管中，1000rpm离心3min，弃上清；加入1mLPBS 1000rpm离心3min，弃上清。再加入1mLPBS 1000rpm离心3min，弃上清，在管中加入1mL无血清的DMEM培养基，吹打细胞至密度均匀，并使用细胞计数板计数。
2)向Transwell小室的孔内加入试验组和对照组胃癌细胞3×104个，补加无血清的DMEM至总体积400μL，同时下层加入800μL含有含10％胎牛血清的DMEM培养基。轻轻拍打侧壁混匀后放入37℃培养箱继续培养48h后将小室取出，弃培养基，用甲醇固定15min，将小室放入0.01％的结晶紫溶液中染色20min。用棉棒刮去小室内面的细胞，于显微镜下观察将小室并拍照如图15所示。
在200X倍数下，取“左上、右上、左下、右下、中”五个视野，分别对迁移细胞进行计数，并取其平均值作为细胞迁移数。每组实验均设置三个重复孔，每组实验重复三次。细胞迁移数统计结果如图16所示。
由图15和图16可得，上调C15orf39表达明显促进了胃癌细胞的迁移能力。
实施例4
沉默C15orf39的表达抑制胃癌细胞在裸鼠皮下的成瘤能力
体外实验已经表明C15orf39促进胃癌细胞的增殖，进一步利用荷瘤裸鼠模型来研究C15orf39的表达对胃癌细胞裸鼠皮下成瘤能力的影响。
(1)品系：Balb/c裸鼠，性别：雄性，周龄：4周，购买自上海杰思捷实验动物有限公司。
(2)饲养环境：SPF级别动物实验室，温度：20℃～26℃；日温差：≤4℃；相对湿度约为70％；换气次数：20次/h；气流速度(笼具处)，≤0.2m/s；最小静压差：≥15Pa；空气洁净度：7级；落下菌数：≤3个/皿；胺浓度：≤14mg/M3；噪声：≤60dB；工作照度：200Lx；动物照度：15～20Lx；昼夜明暗交替时间：12/12h。
(3)将SGC7901-LV3-shNC胃癌细胞和沉默表达C15orf39的SGC7901-LV3-shC15orf39-3细胞接种于100mm细胞培养皿，于37℃恒温培养箱中培养。按照所需细胞细胞数目对其进行增殖传代，以满足小鼠皮下成瘤实验所需。
(4)将培养的胃癌细胞使用胰酶消化，微量移液器吹散细胞，制备成细胞悬液，转移至15mL无菌离心管中。
(5)1200rpm离心3min，弃上清，加入5mLPBS缓冲液，使用微量移液器吹散细胞沉淀以洗涤细胞。
(6)1200rpm离心3min，弃上清，加入5mLPBS缓冲液，重复洗涤三次，保留细胞沉淀。
(7)向离心管中加入1mLPBS缓冲液重悬细胞，并进行细胞计数。
(8)根据细胞悬液浓度，使用PBS缓冲液将细胞悬液浓度最终调整为1×106个/mL。
(9)使用一次性无菌胰岛素注射器分别将SGC7901-LV3-shNC胃癌细胞和沉默表达C15orf39的SGC7901-LV3-shC15orf39-3细胞对称注射入裸鼠腹部皮下，每只小鼠注射100μL细胞悬液。
(10)观察瘤体的生长情况，并用游标卡尺记录下每隔3天的瘤体长度和宽度。1个月后，杀死裸鼠取出瘤体称重。
沉默C15orf39的表达抑制胃癌细胞对肿瘤大小的影响如图17所示；试验结束时，沉默C15orf39的表达对肿瘤重量的影响如图18所示。
由图17和图18可得，C15orf39的下调有效的抑制了SGC7901细胞裸鼠皮下成瘤的能力。
综上，本发明通过敲降或下调C15orf39基因表达的试剂可以抑制胃癌细胞增殖、降低胃癌细的迁移能力、抑制小鼠胃癌细胞皮下成瘤能力。本发明通过敲降或下调C15orf39基因表达的试剂可作为制备治疗胃癌的分子药物，提供新的胃癌治疗途径。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (13)

1.敲降或下调C15orf39基因表达的试剂在制备治疗胃癌的药物中的应用；
所述敲降C15orf39基因表达的试剂为沉默C15orf39基因表达的siRNA、敲降C15orf39基因的质粒或C15orf39敲降慢病毒；
所述质粒为靶向抑制C15orf39基因表达的siRNA质粒；
所述慢病毒为靶向抑制C15orf39基因表达的siRNA质粒构建得到的C15orf39敲降慢病毒；
所述siRNA为siRNA2和siRNA3的一种或两种；所述siRNA2由序列为SEQ ID NO.3的正义链和序列为SEQ ID NO.4的反义链组成；所述siRNA3由序列为SEQ ID NO.5的正义链和序列为SEQ ID NO.6的反义链组成。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述胃癌为胃腺癌。
3.一种治疗胃癌的药物组合物，其特征在于，包括权利要求1所述应用中所述的敲降或下调C15orf39基因表达的试剂和药学上可接受的辅料。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为口服制剂或注射制剂。
5.一种靶向抑制C15orf39基因表达的siRNA，其特征在于，所述siRNA为siRNA2和siRNA3的一种或两种；所述siRNA2由序列为SEQ ID NO.3的正义链和序列为SEQ ID NO.4的反义链组成；所述siRNA3由序列为SEQ ID NO.5的正义链和序列为SEQ ID NO.6的反义链组成。
6.一种靶向抑制C15orf39基因表达的siRNA质粒，其特征在于，所述质粒包括权利要求5所述siRNA。
7.根据权利要求6所述的质粒，其特征在于，所述质粒包括LV3-shC15orf39-2质粒和LV3-shC15orf39-3质粒；所述LV3-shC15orf39-2质粒中包括siRNA2；所述LV3-shC15orf39-3质粒包括-所述siRNA3。
8.一种基于权利要求6或7所述靶向抑制C15orf39基因表达的siRNA质粒构建得到的C15orf39敲降慢病毒。
9.权利要求8所述C15orf39敲降慢病毒的制备方法，其特征在于，步骤如下：
将所述siRNA质粒、pMD2.G质粒和psPAX2质粒转染293FT细胞获得。
10.一种C15orf39基因的检测试剂在制备胃癌诊断工具中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，检测C15orf39基因的试剂在胃癌的早期筛查和/或高危人群监测中的应用。
12.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述检测试剂包括用于检测C15orf39基因的引物对和PCR反应液。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，用于检测C15orf39基因的引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；用于检测C15orf39基因的引物对的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
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