CN114540502A

CN114540502A - 胃癌化疗药物敏感性的检测方法、试剂盒及nsun2检测的应用

Info

Publication number: CN114540502A
Application number: CN202210378685.8A
Authority: CN
Inventors: 樊红; 沈小慧; 李懿萍
Original assignee: Southeast University
Current assignee: Southeast University
Priority date: 2022-04-12
Filing date: 2022-04-12
Publication date: 2022-05-27

Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其是胃癌化疗药物敏感性的检测方法、试剂盒及NSUN2检测的应用，现提出如下方案，胃癌化疗药物敏感性检测试剂盒包括针对NSUN2基因的扩增引物和NSUN2基因的干扰序列，试剂盒中的试剂还包括顺铂和/或检测NSUN2的试剂；胃癌化疗药物敏感性的检测方法利用小干扰RNA慢病毒载体感染胃癌组织细胞，敲低胃癌组织细胞中NSUN2表达含量，得到第一组织细胞，再利用所述化疗药物处理第一组织细胞得到第二组织细胞，培育第二组织细胞，通过检测第二组织细胞的增值能力来判断胃癌化疗药物敏感性。本发明可以并利用shRNA干扰实验敲低NSUN2的表达水平，并结合该分子对胃癌预后的预测，评估胃癌患者顺铂治疗疗效和预后情况，整个评估流程简便易行，可行性高。

Description

胃癌化疗药物敏感性的检测方法、试剂盒及NSUN2检测的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是胃癌化疗药物敏感性的检测方法、试剂盒及NSUN2检测的应用。

背景技术

胃癌是最具有侵袭和转移特性的恶性肿瘤之一，顺铂等化疗药物治疗是临床治疗胃癌的重要手段之一，对于组织学证实的晚期胃癌且未接受过化疗的患者来说，基于顺铂(cisplatin，CDDP)的化疗被视为一线治疗，尽管多年研究使得胃癌病因方面取得了进展，但许多患者的化疗效果仍然欠佳，究其原因，胃癌细胞对药物敏感性或药物耐受性不清楚，导致无法合理应用化疗药物，无效化疗；现有技术中的对胃癌细胞对顺铂药物的耐受性的检测尚无良好的方法。本申请提出了利用检测胃癌细胞中的NSUN2的表达量评估胃癌对顺铂的耐药性，NSUN2表达量越高，顺铂治疗约不敏感，通过检测胃癌患者NSUN2表达水平，以确定是否需要使用顺铂药物来化疗。

为此，本发明提出了胃癌化疗药物敏感性的检测方法、试剂盒及NSUN2检测的应用。

发明内容

为解决现有技术中的问题，本发明提出了胃癌化疗药物敏感性的检测方法、试剂盒及NSUN2检测的应用。

经研究发现，NSUN2在胃癌组织中呈现高水平表达，且高表达与患者的预后不良密切相关。通过2条NSUN2的慢病毒shRNA干扰序列敲低胃癌NSUN2的表达水平后，明显抑制了胃癌细胞的生长，且最为重要的是，抑制NSUN2表达后，胃癌细胞对顺铂治疗的敏感性提高了，提示小干扰RNA敲低NSUN2的表达有望成为提高胃癌化疗敏感性方案；据此，我们提出：检测NSUN2基因表达量之后，敲低NSUN2的表达进而应用顺铂药物治疗胃癌的方案，，降低胃癌死亡率。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种胃癌化疗药物敏感性检测试剂盒，包括如下试剂：针对NSUN2基因的扩增引物和NSUN2基因的干扰序列。

进一步地，所述试剂盒中的试剂还包括顺铂和/或检测NSUN2的试剂。

进一步地，所述NSUN2基因的干扰序列包括：干扰序列1：5’-GAGCGAUGCCUUAGGAUAUUA-3’；干扰序列2：5’-CCCAAGAAUGAACGGCUUCAU-3’。

进一步地，所述NSUN2基因的扩增引物包括上游引物：5’-AUCUUGAGAAAAUCGCCACAC-3’；下游引物：5’-AUCAUUCGCAAUAACAAAUCCCU-3’。

一种NSUN2基因的干扰序列在制备用于评估胃癌顺铂化疗药物敏感性的试剂盒中的应用。

NSUN2用作胃癌化疗药物敏感性评估标记物，所述化疗药物包括顺铂。

NSUN2的检测在胃癌化疗耐药评估中的应用或NSUN2的检测在在制备用于评估胃癌顺铂化疗药物敏感性的试剂盒中的应用。

一种胃癌化疗药物敏感性的检测方法，利用小干扰RNA慢病毒载体感染胃癌组织细胞，敲低胃癌组织细胞中NSUN2表达含量，得到第一组织细胞，再利用所述化疗药物处理第一组织细胞得到第二组织细胞，培育第二组织细胞，通过检测第二组织细胞的增值能力来判断胃癌化疗药物敏感性。

进一步地，所述化疗药物包括顺铂，所述小干扰RNA的序列包括：干扰序列1：5’-GAGCGAUGCCUUAGGAUAUUA-3’；干扰序列2：5’-CCCAAGAAUGAACGGCUUCAU-3’。

本发明的有益效果：

1、本发明通过检测胃癌细胞中NSUN2的表达量，先应用小干扰RNA敲低胃癌细胞中NSUN2的表达量，再应用化疗药物顺铂处理胃癌细胞，通过细胞生长曲线分析检测药物敏感性；

2、采用本发明公开的技术方案后，可以并利用shRNA干扰实验敲低NSUN2的表达水平，并结合该分子对胃癌预后的预测，评估胃癌患者顺铂治疗疗效和预后情况，整个评估流程简便易行，可行性高。

附图说明

图1为本发明的为2条NSUN2 shRNA干扰序列对胃癌细胞(shCtrl)HGC27的敲低效率图；

图2为本发明的胃癌细胞HGC27(shCtrl)对照组(未敲出NSUN2表达)、胃癌细胞HGC27顺铂单药处理组(shCtrl+CDDP)、敲低NSUN2表达后胃癌细胞增殖(shNSUN2)和敲低NSUN2表达后胃癌细胞增殖顺铂单药处理组(shNSUN2+CDDP)的增值效率折线图；

图3为本发明的胃癌细胞HGC27(shCtrl)对照组(未敲出NSUN2表达)、胃癌细胞HGC27顺铂单药处理组(shCtrl+CDDP)、敲低NSUN2表达后胃癌细胞增殖(shNSUN2)和敲低NSUN2表达后胃癌细胞增殖顺铂单药处理组(shNSUN2+CDDP)的增值效率柱状图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

本发明所用试剂和原料均市售可得或者可以按照文献方法制备。本发明实施例中未注明的具体条件的试验方法均按照常规条件，或者按照制造厂商所建议的条件。

在本发明中：检测试剂是由NSUN2基因表达的引物、NSUN2基因的shRNA干扰序列组成。

试剂盒均为由qPCR试剂、CCK-8增殖实验检测试剂盒。

胃癌的生物样品为胃癌患者手术切除的离体胃癌组织。

在本发明中公开了抑制NSUN2表达的2条shRNA序列，及其对胃癌细胞生长的抑制作用。

该序列为干扰RNA序列，用于抑制肿瘤细胞中信使RNA NSUN2(NSUN2)的表达,属于RNA序列。

实施例1：胃癌组织中NSUN2表达量的测定

实时定量PCR的方式进行胃癌组织中NSUN2转录水平的检测。

组织总RNA的提取

1)从液氮中取出冻存的胃癌组织和对应的癌旁组织，用剪刀剪下约绿豆粒大小的组织块置于1.5ml无RNA酶的EP管中，管中加入1ml Trizol和3粒DEPC-ddH2O浸泡后的钢珠，用组织破碎仪充分破碎(55Hz,30s,3次)，于冰上静置5min，4℃，12000g离心10min，吸取上清液转移至新的无RNA酶的EP管。

2)加入200μl三氯甲烷，轻轻颠倒混匀，冰上放置10min，待液体分层后4℃，12000g离心15min，小心吸出上清(约400μl)并转移至新的无RNA酶的EP管。

3)加入0.5μl异丙醇，轻轻颠倒混匀，冰上放置10min，4℃，12000g离心10min。

4)弃去上清，管底可见白色沉淀，加入1ml70％乙醇，轻轻震荡EP管使沉淀悬浮，冰上静置3min，4℃，7500g离心5min，弃去上清。

5)瞬时离心，用移液枪吸出残留的乙醇，晾干3-5min使乙醇全部挥发，根据沉淀的量加入20-50μl无RNase水，冰上静置30min充分溶解。

6)取1μlRNA，1％琼脂糖凝胶电泳观察RNA完整性，One DropOD-1000型分管光度计测定RNA的浓度和纯度以评估RNA的质量，分装后可于-80℃长期保存。

RNA逆转录为cDNA

1)取1μg总RNA,按如下反应体系依次加入并混匀：

2)42℃温育2min；

3)配制反转录反应体系MIXⅡ

4)将MIXⅡ加入MIXⅠ中；

5)42℃温育15min；

6)85℃灭活，5sec。

荧光实时定量PCR

表qPCR反应体系(10μl)

qPCR反应每个样本需要3个复孔，每个复孔为10μl反应体系。qPCR反应参数具体为：95℃预热10min；95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃退火30sec，共40个循环。利用StepOne^TM软件的输出功能导出每个样本的Ct值，以β-actin为内参，用2^-ΔΔCt法计算NSUN2基因的相对表达量。

实施例2：对NSUN2采用慢病毒感染细胞的实验方法敲低NSUN2表达

1)第一天将处于对数生长期的细胞接种到6孔板培养板里，制备密度为4×10⁴个/ml，37℃培养16-24h，至细胞汇合度为20-30％。

2)第二天弃去旧培养基，更换1ml不含血清和抗生素的培养基(双无培养基)，在每孔中加入2μl滴度为1×10⁹TU/ml的病毒浓缩液，40μl的25×HiTransGP感染液，轻轻混匀，放入37℃，5％CO2培养箱静置培养。

3)细胞与慢病毒孵育约12h后用PBS清洗细胞3次，更换为含有10％胎牛血清的完全培养基，于37℃，5％CO2培养箱继续培养。

4)慢病毒感染后48h将细胞置于荧光显微镜下观察，根据荧光强度判断细胞感染效率。

5)慢病毒感染后48h后，更换为含有嘌呤霉素(终浓度为2μg/ml)的完全培养基筛选稳定株细胞，之后每1-2d换液，持续14天。

6)转染2w后的稳定细胞株一部分提取RNA用于检测目的基因的表达水平，一部分冻存留种。

检测结果如下：

图1为2条shRNA干扰序列的敲低效率；图2和图3为体外实验：敲低NSUN2后细胞增殖能力下降。利用CCK-8细胞增殖检测试剂盒，用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

实施例3：NSUN2敲低表达后顺铂处理胃癌细胞，并检测其对胃癌细胞的抑制效率

实验分组

CCK-8实验选择顺铂处理各细胞的工作浓度为I C50，设置如下分组：

对照组、顺铂单药处理组、敲低NSUN2组、敲低NSUN2后顺铂处理组。

给药

1)取对数生长期的胃癌细胞以每孔4000个细胞的密度接种于96孔中，每孔加入100μl RPMI-1640培养液

2)待细胞贴壁生长后，按照实验分组进行以药物的工作浓度IC50处理；

3)每24h取3个实验孔、对照孔及空白对照孔(连取4d)，分别在培养孔加入10μlCCK-8溶液，然后放置于孵箱孵育3h；

4)将变色的培养基转移到酶标条中，用microplate reader检测在450nm的吸光值，每孔实测OD值需减去空白对照OD值，取3复孔平均值；

5)每个细胞系重复3次实验，取平均值，做生长曲线。

统计学分析

所有实验至少重复3次，数据表示为平均值±标准偏差(mean±SD)，并使用SPSS软件版本18.0(SPSS Inc.，Chicago，IL)进行分析。分析多组间差异使用单因素方差分析(one-way ANOVA)和Dunnett检验，两组之间的差异性使用Student's t检验。P<0.05被认为具有统计学意义。

图2和图3为体外实验：敲低NSUN2后顺铂单药处理，利用CCK-8细胞增殖检测试剂检测胃癌活细胞数量。与对照组细胞相比，顺铂单药处理组、敲低NSUN2组、敲低NSUN2后顺铂处理组均能降低胃癌细胞HGC27的增殖能力(*P-value＜0.05；**P-value＜0.01，***P-value<0.001)，与单独使用顺铂相比，敲低NSUN2后顺铂处理组更能显著降低HGC27细胞增殖能力(^#P-value＜0.05；^##P-value＜0.01)，由此，敲低NSUN2后顺铂处理组的胃癌细胞HGC27的增值细胞对顺铂的药物敏感性高，且对照组胃癌细胞HGC27顺铂单药处理组(shCtrl+CDDP)对顺铂的药物敏感性也较高，说明敲低NSUN2后胃癌细胞HGC27的增值细胞对顺铂的药物敏感性具可用来判断胃癌细胞HGC27对顺铂化疗药物的敏感性；可以通过检测胃癌患者NSUN2的表达水平指导临床胃癌化疗用药，提高疗效。

基于上述实施例的验证以及结论，本发明提出了一种胃癌化疗药物敏感性检测试剂盒，包括如下试剂：针对NSUN2基因的引物和NSUN2基因的干扰序列，检测NSUN2的试剂；

NSUN2基因的扩增引物，例如，可以是，上游引物5’-AUCUUGAGAAAAUCGCCACAC-3’；下游引物:5’-AUCAUUCGCAAUAACAAAUCCCU-3’

NSUN2基因的干扰序列，例如，可以是干扰序列1：5’-GAGCGAUGCCUUAGGAUAUUA-3’；干扰序列2：5’-CCCAAGAAUGAACGGCUUCAU-3’；

在一种实施方式中，为了验证胃癌细胞对顺铂的敏感性，可以加入顺铂；

上述一种胃癌化疗药物敏感性检测试剂盒的检测方法包括如下步骤：

基于本发明的探究过程及得出的相关结论：NSUN2在胃癌组织中呈现高水平表达，且高表达与患者的预后不良密切相关。通过设计2条NSUN2的慢病毒shRNA干扰序列敲低胃癌NSUN2的表达水平后，明显抑制了胃癌细胞的生长，且最为重要的是，抑制NSUN2表达后，提高了胃癌细胞对顺铂治疗的敏感性，提示该分子有望成为胃癌化疗敏感性评估标记物；

由于胃癌组织NSUN2高表达，且该表达模式与患者预后和化疗药物敏感性密切相关，因此，可以通过检测胃癌患者该基因的表达水平指导临床胃癌化疗用药，提高疗效。据此，我们提出：NSUN2基因检测可以应用于胃癌化疗耐药评估，进而基于患者NSUN2水平对化疗药物敏感性的预测，建立最佳的个体治疗方案，降低胃癌死亡率。

为此，下述的NSUN2基因的干扰序列或检测NSUN2的表达量评估顺铂治疗疗效的方案均应该属于本发明的保护范围：

本发明还提出了NSUN2基因的干扰序列在制备用于评估胃癌顺铂化疗药物敏感性的试剂盒中的应用，NSUN2基因的干扰序列。

本发明还提出了NSUN2用作胃癌化疗药物敏感性评估标记物，所述化疗药物包括顺铂。

本发明还提出了NSUN2的检测在胃癌化疗耐药评估中的应用或NSUN2的检测在在制备用于评估胃癌顺铂化疗药物敏感性的试剂盒中的应用。

一种胃癌化疗药物敏感性的检测方法，利用慢病毒感染胃癌组织细胞，所述慢病毒的序列可以是：上游引物5’-GAGCGAUGCCUUAGGAUAUUA-3’；下游引物5’-CCCAAGAAUGAACGGCUUCAU-3’；

敲低胃癌组织细胞中NSUN2表达含量，得到第一组织细胞，再利用所述化疗药物处理第一组织细胞得到第二组织细胞，培育第二组织细胞，通过检测第二组织细胞的增值能力来判断胃癌化疗药物敏感性，例如，可以检测单位之间内第二组织细胞的增值的数量来进行判断；

所述化疗药物可以是顺铂。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<120> 胃癌化疗药物敏感性的检测方法、试剂盒及NSUN2检测的应用

<141> 2022-04-12

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

gagcgaugcc uuaggauauu a 21

<210> 2

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 2

cccaagaaug aacggcuuca u 21

<210> 3

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 3

aucuugagaa aaucgccaca c 21

<210> 4

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 4

aucauucgca auaacaaauc ccu 23

Claims

1.一种胃癌化疗药物敏感性检测试剂盒，其特征在于，包括如下试剂：针对NSUN2基因的扩增引物和NSUN2基因的干扰序列。

2.根据权利要求1所述的一种胃癌化疗药物敏感性检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中的试剂还包括顺铂和/或检测NSUN2的试剂。

3.根据权利要求1所述的一种胃癌化疗药物敏感性检测试剂盒，其特征在于，所述NSUN2基因的干扰序列包括：干扰序列1：5’-GAGCGAUGCCUUAGGAUAUUA-3’；干扰序列2：5’-CCCAAGAAUGAACGGCUUCAU-3’。

4.根据权利要求1所述的一种胃癌化疗药物敏感性检测试剂盒，其特征在于，所述NSUN2基因的扩增引物包括上游引物：5’-AUCUUGAGAAAAUCGCCACAC-3’；下游引物：5’-AUCAUUCGCAAUAACAAAUCCCU-3’。

5.一种NSUN2基因的干扰序列在制备用于评估胃癌顺铂化疗药物敏感性的试剂盒中的应用。

6.NSUN2用作胃癌化疗药物敏感性评估标记物，所述化疗药物包括顺铂。

7.NSUN2的检测在胃癌化疗耐药评估中的应用或NSUN2的检测在在制备用于评估胃癌顺铂化疗药物敏感性的试剂盒中的应用。

8.一种胃癌化疗药物敏感性的检测方法，其特征在于，利用小干扰RNA慢病毒载体感染胃癌组织细胞，敲低胃癌组织细胞中NSUN2表达含量，得到第一组织细胞，再利用所述化疗药物处理第一组织细胞得到第二组织细胞，培育第二组织细胞，通过检测第二组织细胞的增值能力来判断胃癌化疗药物敏感性。

9.根据权利要求8所述的一种胃癌化疗药物敏感性的检测方法，其特征在于，所述化疗药物包括顺铂，所述小干扰RNA的序列包括：干扰序列1：5’-GAGCGAUGCCUUAGGAUAUUA-3’；干扰序列2：5’-CCCAAGAAUGAACGGCUUCAU-3’。