CN115786504B - Hspa4抑制剂在治疗黑素瘤中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医学领域，具体涉及HSPA4抑制剂在治疗黑素瘤中的应用。具体地，本发明通过细胞实验证明了敲降HSPA4可以抑制黑素瘤细胞的增殖，同时，提供了检测HSPA4表达量的试剂在制备诊断黑素瘤、预测黑素瘤患者的预后的产品中的应用。

Description

HSPA4抑制剂在治疗黑素瘤中的应用

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及HSPA4抑制剂在治疗黑素瘤中的应用。

背景技术

热休克蛋白Heat Shock Proteins(HSPs)是一种应激蛋白，是细胞在氧化应激、缺氧和热应激等环境刺激下产生的一种功能高度保守的蛋白质，广泛存在于原核及真核生物中。热休克蛋白可以作为分子伴侣，协助蛋白质的正确折叠，保护细胞适应外界环境的刺激，参与到细胞的生长、代谢及信号转导等过程中。HSP首先是在果蝇体内发现的。果蝇幼虫唾液腺的多线染色体比一般染色体粗1～2千倍，故有利于在光学显微镜下进行观察研究。HSP的生成，不仅见于果蝇，而且是普遍存在于从细菌直至人类的整个生物界(包括植物和动物)的一种现象。绝大部分生物细胞生成的HSP分子量都在80～110kD、68～74kD和18～30kD之间。按照蛋白的大小，热休克蛋白共分为五类，分别为HSP110、HSP90、HSP70、HSP60以及小分子热休克蛋白small Heat Shock Proteins(sHSPs)。

黑素瘤一般指恶性黑素瘤，恶性黑素瘤是由皮肤和其他器官黑素细胞产生的肿瘤。皮肤黑素瘤表现为色素性皮损在数月或数年中发生明显改变。恶性黑素瘤大多发生于成人，巨大性先天性色素痣继发癌变的病例多见于儿童。黑素瘤的病因学尚未完全阐明。一些研究资料提示，其发生与下列危险因素有关：基因、环境及基因/环境共同因素。比如不典型(发育不良)痣或黑色素瘤家族史、光导致色素沉着的皮肤、不容易晒黑皮肤、红色头发人种、强的间断日光暴露、日晒伤、多发黑色素细胞痣等。虽其发病率低，但其恶性度高，转移发生早，死亡率高。

黑素瘤患者中局部、无淋巴结及远处转移者预后较好。Ⅰ/Ⅱ期女性生存率高于男性，躯干、头颈部原发黑色素瘤比四肢的差。高龄与黑色素瘤存活率成反比，Ⅲ期黑色素瘤具有明显不同的预后：溃疡和淋巴结转移数量多提示预后差，Ⅳ期黑色素瘤重要的预后因素是远处转移的位置，内脏转移比非内脏(皮肤及远端淋巴结)转移预后差。

综上，黑素瘤的早期诊断、早期治疗尤为重要。

发明内容

黑素瘤发病率低，但其恶性度高，转移发生早，死亡率高；所以早期诊断、早期治疗尤为重要。因此本发明要解决的技术问题是，如何诊断黑素瘤、如何预测黑素瘤患者的预后、如何治疗黑素瘤。

为了解决上述技术问题，本发明通过细胞实验首先验证了敲降HSPA4可以抑制黑素瘤细胞的增殖，也就代表了HSPA4可作为黑素瘤的治疗靶点。

同时，本发明通过测序信息验证了HSPA4在黑素瘤中的表达量显著的高于健康对照，且接受者操作特征(ROC曲线)发现HSPA4可以较为准确的诊断黑素瘤；并且，高HSPA4表达量与黑素瘤的预后相关，HSPA4高表达者的生存率低于HSPA4低表达者，高低HSPA4表达量患者之间存在统计学差异。

基于上述研究发现，本公开提出了如下技术方案：

应用

一方面，本发明提供了HSPA4的抑制剂在制备治疗黑素瘤的产品中的应用。

具体地，所述HSPA4的抑制剂即降低HSPA4表达量的物质。

优选地，所述HSPA4的抑制剂包括针对HSPA4或其表达产物的shRNA、反义寡核苷酸(ASO)、抗体、拮抗剂、阻断剂、siRNA、miRNA。

更优选地，所述HSPA4的抑制剂是特异性靶向HSPA4的siRNA。

更优选地，所述特异性靶向HSPA4的siRNA是本发明具体实施例中所使用的siRNA2。

具体地，所述siRNA(Small interfering RNA，小干扰RNA)主要参与RNA干扰，其亦称为短干扰RNA(short interfering RNA)或沉默RNA(silencing RNA)。

另一方面，本发明提供了检测HSPA4表达量的试剂在制备诊断黑素瘤、预测黑素瘤患者的预后的产品中的应用。

优选地，所述受试者是黑素瘤患者或疑似黑素瘤患者。

优选地，所述检测是针对来自于受试者的样本进行的检测。

如本发明所使用，所述样本示例性的包括外周血、组织、血液、血清、血浆、尿液、唾液、精液、乳汁、脑脊髓液、泪液、痰等。

最优选地，本发明所述样品是细胞和/或组织。

本发明通过研究发现，HSPA4在患者体内的表达量显著高于健康对照，高表达HSPA4的癌症患者相对于低表达HSPA4者预后更差。

本发明所述“黑素瘤”即皮肤恶性黑色素瘤，cutaneous malignantmelanoma，CMM。本发明所述“健康对照”是指不患有黑素瘤的受试者，其可能有痣，但HSPA4在黑素瘤细胞中的表达量相对于痣细胞依然是具有统计学意义的高表达，本发明具体实施例中记载了HSPA4在痣细胞和黑素瘤患者之间的表达量差异(图7)，也即证明了本发明所提供的HSPA4在诊断黑素瘤时可以区分普通痣细胞和黑素瘤细胞，也即不受痣细胞的影响。

本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因的表达量。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。

优选地，所述检测HSPA4表达量的试剂包括检测HSPA4蛋白表达量和/或HSPA4mRNA表达量的试剂。

优选地，所述检测HSPA4mRNA表达量的试剂包括但不限于以下方法中使用到的试剂：基于PCR的检测方法、Southern杂交方法、Northern杂交方法、点杂交方法、荧光原位杂交方法、DNA微阵列方法、ASO法、高通量测序平台方法。

具体地，所述试剂可以包括但不限于特异性结合目标序列的特异性探针、扩增目标序列的特异性引物等。

本发明所述“特异性探针”可以为单标记的核酸探针，例如放射性核素(如32P、3H、35S等)标记探针、生物素标记探针、辣根过氧化物酶标记探针、地高辛标记探针或荧光基团(如FITC、FAM、TET、HEX、TAMRA、Cy3、Cy5等)标记探针；本发明所述“特异性探针”也可以为双标记的核酸探针，例如Taqman探针、分子信标、置换探针、QUAL探针、FRET探针等。

本发明所述“特异性引物”可以在核酸扩增反应中结合目标核酸用于初期核酸合成和模板处理。所述核酸扩增反应包括PCR，具体地，包括反转录PCR(RT-PCR)、原位PCR、连接酶链反应(Ligase chain reaction，LCR)、标记PCR(Labeled primers，LP-PCR)、反向PCR(reverse PCR，扩增两引物外侧未知序列)、不对称PCR(asymmetric PCR)、降落PCR(touchdown PCR)、重组PCR(recombinant PCR)、巢式PCR(nest PCR)等。

优选地，所述试剂还可以包括提取DNA的试剂、提取RNA并进行反转录的试剂。

本发明所述“预后”是指对病人病程发展情况，和它是否有一个恢复机会的预测。所述预后的指标包括但不限于总体存活率(Overall survival rate，Overall survival，OS)、客观缓解率(Objective Response Rate，ORR)、无进展生存期(progression-freesurvival，PFS)、疾病进展时间(time to progress，TTP)、无病生存期(Disease-freesurvival，DFS)、治疗失败时间(time to treatment failure，TTF)、应答率(RR)、完全应答(CR)、部分应答(PR)。

产品

另一方面，本发明提供了治疗黑素瘤的药物组合物，所述药物组合物中包括HSPA4的抑制剂。

优选地，所述药物组合物中还可以包括其他黑素瘤的治疗药物，例如以下单抗药物：康奈非尼(Encorafenib)、比美替尼(Binimetinib)、达拉非尼(dabrafenib)、曲美替尼(TRAMETINIB)、维莫非尼(vemurafenib)、考比替尼(cobimetinib)、伊马替尼(Imatinib)、尼洛替尼(Nilotinib)、帕博利珠单抗(Pembrolizuma)、阿替利珠单抗(atezolizumab)、纳武利尤单抗(Nivolumab)、伊匹单抗(Ipilimumab)等；或以下化疗药物：紫杉醇、顺铂、替莫唑胺、达卡巴嗪、卡铂尼莫司汀、博来霉素、伊利替康等。

优选地，所述HSPA4的抑制剂和其他黑素瘤的治疗药物可以同时或顺序施用。

如本文所用，“同时施用”可以是HSPA4的抑制剂和其他黑素瘤的治疗药物同时施用，优选地，在少于15分钟的时间间隔内施用HSPA4的抑制剂和其他黑素瘤的治疗药物，更优选地，在小于5分钟的时间间隔内施用。“顺序施用”可以是HSPA4的抑制剂在其他黑素瘤的治疗药物之前或之后施用，优选地，间隔至少1天、2天、3天、7天、30天、或更长的时间施用HSPA4的抑制剂和其他黑素瘤的治疗药物。

优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

优选地，所述药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂包括但不限于已经由美国食品和药品管理局或中国食品药品监督管理局批准可用于人或家畜的任何佐剂、载体、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、增味剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、溶剂、表面活性剂或乳化剂。

本发明的药物可根据需要制备成各种剂型。所述剂型包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。

同时，本发明还提供了以上药物组合物在制备治疗黑素瘤的产品中的应用。

另一方面，本发明还提供了预测黑素瘤患者预后的系统，所述系统中包括根据以下信息预测患者预后的计算装置：

1)HSPA4表达量，

2)HAPA4表达量和TMM分级。

优选地，所述系统还可以包括检测HAPA4表达量的检测装置和/或确定黑素瘤患者TNM分级的诊断装置。

优选地，所述系统还可以包括HAPA4表达量检测结果和/或黑素瘤患者TNM分级结果的收集装置。

优选地，所述系统还可以包括患者预后的预测结果的输出装置。

优选地，所述系统还可以包括预测结果的发送装置，所述发送装置可以将患者预后的预测结果发送到患者或医护人员可以查阅的信息通信终端装置。

优选地，所述计算装置中的运行可以如本发明所提供的诺莫图所示例的进行计算。

本发明所述“诺莫图(Nomogram图)”，又称列线图(Alignment Diagram)，诺莫图将复杂的回归方程，转变为了可视化的图形，使预测模型的结果更具有可读性，方便对患者进行评估。所述诺莫图上包括对应若干个变量的分值标尺、总分值标尺以及预测结果在列线图中各占一行。使用诺莫图时，根据患者信息在每个变量在变量分值标尺上取一个分值，所述将每个变量的分值相加可以得到总分值。每个总分值都对应于相应的预测结果。根据患者信息计算总分值后，即可预测受试者的预后情况。

更具体地，所述预后情况是1、3、5年的生存概率(survivalprobability)。

本发明所提供的方法和/或系统的实施可包括手动地、自动地、或它们组合地来执行或完成所选任务。而且，根据本发明方法和/或系统的实施方式的实际仪器和设备，可通过硬件、通过软件、或通过固件或通过它们的组合使用操作系统来实施多个所选任务。

方法

另一方面，本发明提供了一种在体外抑制黑素瘤细胞增殖的方法，所述方法包括将HSPA4的抑制剂导入黑素瘤细胞。

优选地，所述黑素瘤细胞包括来自于患者的原代细胞或商业化的成品细胞系。所述成品细胞系可以如本发明具体实施例所使用的是A375细胞(人恶性黑色素瘤细胞)。

优选地，所述导入可以考虑本领域中任何已知的方法向细胞内递送遗传物质。非限制性的实例包括病毒转导、电穿孔转染、脂质体递送(脂质体转染)、聚合物载体、化学载体、脂质复合物、聚合复合物、树枝状聚合物、纳米粒子、天然内吞或吞噬途径、细胞穿透肽、显微注射法、微针递送法、粒子轰击法等。

另一方面，本发明提供了诊断、预测黑素瘤预后的方法，所述方法包括检测受试者HSPA4的表达量。

在诊断癌症时，HSPA4的表达量高则诊断为患病；在预测患者预后时，HSPA4的表达量高则预后较差。

另一方面，本发明提供了治疗黑素瘤的方法，所述方法包括对受试者施用HSPA4的抑制剂、或前述药物组合物。

本发明所使用的，术语“优选”、“更优选”、“最优选”、“特别地”、“更特别地”、“具体地”、“更具体地”或类似术语与任选特征结合使用，而不限制其他可能性。

本发明所述术语“治疗”是指在显著程度上改善本文提及的疾病或病症或伴随其的症状。

附图说明

图1是siRNA敲降HSPA4后，HSPA4表达量的检测结果图。

图2是HSPA4敲降的细胞进行CCK-8实验的检测结果图。

图3是TCGA数据库中HSPA4高表达组与低表达组的全因死亡率(OverallSurvival)的生存曲线。

图4是TCGA数据库中HSPA4高表达组与低表达组的疾病特异性生存率(DiseaseSpecific Survival)的生存曲线。

图5是HSPA4结合TNM分级结果预测黑素瘤患者预后的列线图。

图6是HSPA4在健康对照和黑素瘤患者之间的表达量差异。

图7是HSPA4在痣细胞和黑素瘤患者之间的表达量差异。

图8是HAPA4在诊断黑素瘤时的ROC曲线。

图9是GEO数据库GSE65904中HSPA4高表达组与低表达组的全因死亡率(OverallSurvival)的生存曲线。

图10是GEO数据库GSE65904中HSPA4高表达组与低表达组的疾病特异性生存率(Disease Specific Survival)的生存曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

通用实验方法

1.细胞复苏

1)将恒温水浴锅中的水预热到37℃；

2)准备一支15ml离心管，加入5ml含10％FBS的完全培养基，放入37℃水浴锅中预热；

3)戴上护目镜，厚毛线手套后，从液氮罐中取出要复苏的细胞，尽快转入37℃恒温水浴锅中复温晃动冻存管以提高复温速率；

4)将融化了的冻存管中的细胞吸入事先准备的离心管中，混匀后，1000rpm离心5min；

5)准备一个直径10cm培养皿，写上细胞名称、日期，再加入10ml完全培养基；

离心完成后弃去上清，用1ml完全培养基重悬细胞后，转入培养皿中，混匀后转入CO₂培养箱中培养静置。

注意：从液氮中取出细胞冻存管时，若冻存管内有液氮进入，需拧松冻存管，排出内部残留的液氮，之后拧紧冻存管，置于干冰上，然后放入37℃水浴中，避免温差太大造成液氮快速气化而爆炸。

2.细胞传代

1)当细胞汇合度达到85％以上时，可进行传代。

2)在生物安全柜内，打开培养皿，弃去皿内的培养基；

3)向培养皿内加入2.5ml无菌的1×PBS后，水平放置培养皿，使PBS能够浸润到培养皿底面上所有的面积，吸弃PBS；

4)向皿内加入消化液1.5ml，浸润底面后放入37℃CO₂培养箱中孵育1～2min；

5)孵育完成后在倒置显微镜下观察细胞是否变圆飘起，若全部消化下来则直接向培养皿内加入3ml含10％FBS的完全培养基中，将悬液吸入15ml离心管；

注：如还有部分细胞未消化下来，可采用分步消化：

①准备一个无菌的15ml离心管，加入2ml含10％FBS的完全培养基；

②将消化下来的细胞吸入①中的离心管内中和(避免吹打)；

③向之前消化的培养皿中加入1ml胰酶继续消化2min左右，轻拍培养瓶，95％左右细胞脱落后加入2ml含10％FBS的完全培养基中和，中和后的细胞悬液移入①中的离心管内

6)1000rpm离心5min；

7)准备两个新的10cm培养皿，各加入10ml完全培养基。

8)离心完成后，弃上清，用1ml完全培养基重悬离心细胞，将重悬后的细胞转入2个10cm培养皿，每个培养皿各0.5ml细胞悬液；

9)水平放置培养皿，混匀后，将培养瓶置于37℃，5％CO₂培养箱中静置培养。

3.细胞冻存

1)～6)参照传代步骤，离心完成后，弃上清，用1mL冻存液重悬细胞沉淀，然后转入2ml冻存管中；将冻存管转入填充满异丙醇的程序降温盒中，之后转入-80℃冰箱中过夜降温；第二天，取出降温完成的序降温盒中的冻存管，尽快转入液氮罐中保存。

4.细胞转染(以6孔板为例)

1)转染前一天，在1.5ml无抗生素培养基中接种1×10⁶个细胞，转染时细胞融合度为50％。(注：铺板时要将细胞消化完全混合，避免细胞堆积生长)

2)转染试剂与siRNA的稀释，下表为使用的转染试剂盒siRNA的用量，siRNA初始储存液浓度为20μM；

表1、转染试剂盒siRNA的用量

培养板	每孔总体积(V1+V2+V2)	终浓度	siRNA/孔	Lipo8000/孔
					96孔板	100μl(50μl+25μl+25μl)	50nM	0.25μl	0.3μl
24孔板	500μl(400μl+50μl+50μl)	50nM	1.25μl	1.2μl
					6孔板	2ml(1500μll+250μl+250μl)	50nM	5μl	6μl
10cm培养皿	10ml(7500μl+1250μl+1250μl)	50nM	25μl	30μl

其中V1为完全或不完全培养基，铺细胞时使用；V2为转染专用，无血清、无抗生素的培养基，一部分加转染试剂，一部分加siRNA。稀释好后，吸吹混匀，室温静置5min。

3)混合转染试剂和siRNA稀释液，轻轻吸吹3-5次混匀，室温下静置20min。

4)转染复合物加到6孔板中，500μl/孔，前后轻摇细胞板混合均匀。

5)细胞培养板置于37℃、5％CO₂培养箱中培养24h。转染4h后可换新鲜培养基。

5.PCR实验

根据实验要求分组进行细胞铺板和细胞转染，到达预定时间后收集细胞沉淀。

5.1提取细胞总RNA

1)将1mL TRIzol在超净台里加入至15ml含有细胞沉淀的离心管中，吹打混合均匀，并转移至1.5ml离心管中。

2)将加入TRIzol的细胞在室温(15-30℃)放置10min，使核酸蛋白复合物完全分离。

3)1mL TRIzol加入200μL氯仿，剧烈振荡2min，每隔1分钟再晃动两下，5-6次后，再静止7min。

4)4℃，12000rpm，离心15min。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol的60％。

5)把上层水相转移到新的EP管中(约400μl，尽量不要吸取到中间层以免污染)。加入500μL异丙醇，室温放置10min。

6)制备75％乙醇，置于冰盒中预冷。

7)4℃，12000rpm，离心15min，离心后在管底出现白色沉淀。用移液器小心移去上清。

8)加入1mL75％冷乙醇，震荡洗涤沉淀。4℃，7500rpm，离心5min，小心弃掉上清。

9)将EP管倒扣于滤纸上吸去多余的水分，并用10μL枪头小心吸取管内的液体(枪头不要接触RNA)，将EP管室温放置5min(时间太久，过于干燥会使RNA活性降低)，RNA变透明；

10)加入40μL无RNase的水(DEPC水)，用nanodrop检测OD值与浓度，在管上做好标记；

11)置于-80℃冰箱保存。

5.2逆转录合成mRNA、cDNA

采用FastKing cDNA第一链合成试剂盒(货号：KR116)进行mRNA反转录，首先去除基因组DNA反应，在试管中加入5×gDNA Buffer 2.0μl，TotalRNA 1μg，加Rnase FreeddH₂O使总体积至10μl，水浴锅中42℃加热3min，再将10×King RT Buffer 2.0μL，FastKing RT Enzyme Mix 1.0μL，FQ-RT Primer Mix 2.0μL，RNase Free ddH₂O 5.0μL，混合后加入上述试管中一起混合共20μL，水浴锅中42℃加热15min，95℃加热3min，合成的cDNA需要长期保存时，请于-20℃或更低温度保存。

5.3RealTimePCR

5.3.1仪器及分析方法

用ABI StepOne Plus型荧光定量PCR仪，采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。

5.3.2操作过程如下：

(一)反应体系：用SuperRealPreMix Plus(SYBR Green)(货号：FP205)，进行扩增，实验操作按产品说明书进行。RealTime反应体系如表2所示。

表2、RealTime反应体系

试剂	使用量
		2×SuperReal PreMix Plus	10μl
上游引物(10μM)	0.6μl
		下游引物(10μM)	0.6μl
50×ROX Reference Dye△	2μl
		DNA模板	2μl
灭菌蒸馏水	4.8μl

扩增程序为：95℃15min，(95℃10sec，55℃30sec，72℃32sec)×40个循环，(95℃15sec，60℃60sec，95℃15sec)。

(二)引物筛选

将各样本cDNA混合后，以此为模板进行10倍梯度稀释，稀释后样品各取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增，同时在60-95℃进行溶解曲线分析，根据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行引物筛选。

(三)样品RealTime PCR检测

将各样品cDNA10倍稀释后取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60℃-95℃进行溶解曲线分析。

6.CCK-8实验

(1)细胞正常培养至90％，胰酶消化细胞，计数后，调整细胞浓度为1×104个/ml；根据实验分组，每组设置3个复孔，96孔板每孔加入调整好的细胞悬液100μL，37℃5％CO₂培养箱中培养1天、2天、3天、4天后进行后续检测(检测几个时间铺几块96孔板)；

(2)到达培养时间后，取出培养板，将试剂盒中的CCK-8溶液取10μl加入96孔细胞培养板(注意不要再孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数)，在37℃培养箱中继续孵育4小时。

(3)用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

实施例1、HSPA4敲降靶点选择及对黑素瘤细胞的影响

培养A375细胞，对细胞内HSPA4基因进行敲低处理后，设计不同的siRNA序列(候选siRNA序列如表3所示)，测序对HSPA4的表达量影响，siRNA2对HSPA4的表达量抑制效果最好，所述siRNA2的序列如SEQ ID NO.:1和SEQ IDNO.:2所示。因此使用siRNA2进行下一步实验，siRNA2敲降后HSPA4的基因表达如图1所示，可见HSPA4的表达量显著降低。

表3、候选siRNA的序列

对野生型A375细胞和HSPA4敲降的A385细胞分别进行CCK-8实验，验证HSPA4敲降对黑素瘤细胞增殖产生的影响。持续4天从CCK-8实验的结果如图2所示。根据数据统计的结果显示在HSPA4敲降的细胞中，培养至第4天时，细胞增殖能力明显受到抑制。

该结果显示HSPA4可以作为潜在的黑素瘤治疗靶点。

实施例2、HSPA4在黑素瘤中的诊断和预测预后作用

我们从TCGA(TCGA，https://portal.gdc.cancer.gov/)和GTEx数据库中提取了33种包括CMM(皮肤恶性黑色素瘤，cutaneous malignantmelanoma，CMM)在内的人类癌症数据。其中CMM数据中包括469例黑素瘤组织、1例癌旁组织和812例正常皮肤组织的mRNA表达水平及患者临床信息。另外我们在GEO(GEO，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)数据库中下载了GSE3189数据集(包括18例痣细胞组织、45例黑素瘤组织)mRNA表达数据资料，比较了HSPA4在该数据集中CMM和正常皮肤及痣细胞之间的表达差异情况。

1.2HSPA4与CMM预后和诊断的相关性研究

为了研究HSPA4在CMM中的预后价值，进行了生存期分析。应用survival、survminer包做Kaplan-Meier图，并进行了log-rank检验。应用pROC包和survival包，分析HSPA4对于CMM的诊断能力及预后判断，以p＜0.05具有统计学意义。利用GEO数据集GSE65094(150例黑素瘤组织)验证HSPA4对CMM的预后分析。

1.3统计方法：

我们应用R(v.3.6.3)平台实施统计分析。两组间差异比较应用非参数秩和检验(Wilcox Test)；相关性分析应用Person或Spearman相关检验；生存分析应用Kaplan-Meier曲线表示，组间生存率采用log-rank检验。以上均以α＝0.05，为检验水准，p＜0.05具有统计学意义。

Claims (6)

1.HSPA4的抑制剂在制备抑制黑素瘤细胞增殖的产品中的应用，所述HSPA4的抑制剂是特异性靶向HSPA4的siRNA，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.:1和SEQ ID NO.:2所示。

2.药物组合物在制备抑制黑素瘤细胞增殖的产品中的应用，所述药物组合物中包括特异性靶向HSPA4的siRNA，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.:1和SEQ ID NO.:2所示。

3.如权利要求2所述应用，所述药物组合物中还包括以下任意一种或多种药物：康奈非尼、比美替尼、达拉非尼、曲美替尼、维莫非尼、考比替尼、伊马替尼、尼洛替尼、帕博利珠单抗、阿替利珠单抗、纳武利尤单抗、伊匹单抗、紫杉醇、顺铂、替莫唑胺、达卡巴嗪、卡铂尼莫司汀、博来霉素或伊利替康。

4.一种在体外抑制黑素瘤细胞增殖的方法，所述方法包括将HSPA4的抑制剂导入黑素瘤细胞，所述HSPA4的抑制剂是特异性靶向HSPA4的siRNA，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.:1和SEQ ID NO.:2所示。

5.如权利要求4所述方法，所述黑素瘤细胞包括来自于患者的原代细胞或商业化的成品细胞系。

6.如权利要求4所述方法，所述导入的方法包括病毒转导、电穿孔转染、脂质体递送、聚合物载体、化学载体、脂质复合物、聚合复合物、树枝状聚合物、纳米粒子、天然内吞或吞噬途径、细胞穿透肽、显微注射法、微针递送法或粒子轰击法。