CN107012256A

CN107012256A - 腹主动脉瘤诊治标志物

Info

Publication number: CN107012256A
Application number: CN201710407771.6A
Authority: CN
Inventors: 李曙光; 孙锦云
Original assignee: Beijing Medintell Bioinformatic Technology Co Ltd
Current assignee: Qingdao Yangshen Biomedical Co Ltd
Priority date: 2017-06-02
Filing date: 2017-06-02
Publication date: 2017-08-04

Abstract

本发明公开了GBP5基因及其表达产物可以作为腹主动脉瘤诊治的分子标志物。通过检测受试者腹主动脉瘤组织中GBP5基因及其表达产物的含量可以判断受试者是否患有腹主动脉瘤或者诊断受试者是否存在患有腹主动脉瘤的风险。本发明通过研究体外培养的平滑肌细胞的凋亡情况发现干扰GBP5基因表达能够抑制细胞凋亡，上述研究结果表明GBP5基因及其表达产物是治疗腹主动脉瘤的一个潜在的药物靶点。

Description

腹主动脉瘤诊治标志物

技术领域

本发明涉及肿瘤诊断、治疗领域，更具体地，本发明涉及以检测GBP5异常为手段的肿瘤诊断方法；及抑制GBP5基因或蛋白质的肿瘤治疗剂。

背景技术

腹主动脉瘤(abdominal aortic aneutysm，AAA)是指由于腹主动脉壁的病变或损失，造成腹主动脉的局限性扩张、膨出，以搏动性肿块为主要症状的疾病。通常将腹主动脉段动脉壁三层结构持续性扩张至肾动脉处腹主动脉直径1.5倍以上即定义为AAA，是一种常见的高病死率动脉退行性疾病。目前，对于腹主动脉瘤具体发病机制尚不完全清楚，已有的报道显示其发病与遗传因素、炎症、蛋白酶降解、平滑肌细胞凋亡等因素密切相关，其发病与其他肿瘤因化学辐射、基因突变等不同。人腹主动脉平滑肌细胞(HVSMCs)作为腹主动脉中膜的主要构成成分，对维持动脉壁结构和功能的完整性起到重要作用。近年来，一些报道显示腹主动脉瘤组织中VSMC数量的减少是其形成过程中一个关键因素。如何有效抑制VSMC的凋亡有望为延缓AAA的形成、发展提供新的治疗思路。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种通过检测GBP5基因或蛋白表达差异来诊断腹主动脉瘤的方法。

本发明的目的之二在于提供一种通过抑制GBP5基因或GBP5蛋白来治疗腹主动脉瘤的方法。

本发明的目的之三在于提供一种用于筛选腹主动脉瘤治疗药物的方法。

本发明的目的之四在于提供一种用于治疗腹主动脉瘤的药物。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提供了检测GBP5的产品在制备腹主动脉瘤诊断工具中的应用。

进一步，所述检测GBP5的产品包括检测GBP5基因表达量的产品。

更进一步，所述检测GBP5的产品包括能够定量GBP5基因mRNA的产品，和/或能够定量GBP5蛋白的产品。

本发明的定量GBP5基因mRNA的产品可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能：如PCR、如Southern杂交、Northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(FISH)、DNA微阵列、ASO法、高通量测序平台等。使用该产品可以定性地、定量地、或半定量地实施分析。

包含在上述产品中的核酸可以通过化学合成来获得，或通过从生物材料制备含有期望核酸的基因，然后使用设计用于扩增期望核酸的引物扩增它来获得。

进一步，所述PCR方法为已知方法，例如，ARMS(Amplification RefractoryMutation System，扩增不应突变系统)法、RT-PCR(逆转录酶-PCR)法、嵌套PCR法等等。扩增的核酸可以通过使用点印迹杂交法、表面等离子共振法(SPR法)、PCR-RFLP法、原位RT-PCR法、PCR-SSO(序列特异性寡核苷酸)法、PCR-SSP法、AMPFLP(可扩增片段长度多态性)法、MVR-PCR法、和PCR-SSCP(单链构象多态性)法来检测。

所述能够定量GBP5基因mRNA的产品包括实时定量PCR中使用的特异扩增GBP5基因的引物，所述引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

产品中包括的引物可以通过通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。

上面所述的核酸还可包括探针，所述探针可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增它来制备。

本发明的定量GBP5蛋白的产品可基于使用抗体的已知方法来发挥其功能：例如，可以包括ELISA、放射免疫测定法、免疫组织化学法、Western印迹等。

本发明的定量GBP5蛋白的产品包括特异性结合GBP5蛋白的抗体或其片段。可以使用任何结构、尺寸、免疫球蛋白类别、起源等的抗体或其片段，只要它结合靶蛋白质即可。本发明的检测产品中包括的抗体或其片段可以是单克隆的或多克隆的。抗体片段指保留抗体对抗原的结合活性的抗体一部分(部分片段)或含有抗体一部分的肽。抗体片段可以包括F(ab′)₂、Fab′、Fab、单链Fv(scFv)、二硫化物键合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V区(双抗体)、或含有CDR的肽。本发明的定量GBP5蛋白的产品可以包括编码抗体或编码抗体片段的氨基酸序列的分离的核酸，包含该核酸的载体，和携带该载体的细胞。

抗体可以通过本领域技术人员公知的方法来获得。例如，制备保留整个或部分靶蛋白质的多肽或整合编码它们的多核苷酸的哺乳动物细胞表达载体作为抗原。使用抗原免疫动物后，从经过免疫的动物获得免疫细胞并融合骨髓瘤细胞以获得杂交瘤。然后从杂交瘤培养物收集抗体。最后可以通过使用被用作抗原的GBP5蛋白或其部分对获得的抗体实施抗原特异性纯化来获得针对GBP5蛋白的单克隆抗体。可以如下制备多克隆抗体：用与上文相同的抗原免疫动物，从经过免疫的动物收集血液样品，从血液中分离出血清，然后使用上述抗原对血清实施抗原特异性纯化。可以通过用酶处理获得的抗体或通过使用获得的抗体的序列信息来获得抗体片段。

标记物与抗体或其片段的结合可以通过本领域普遍知道的方法来实施。例如，可以如下荧光标记蛋白质或肽：用磷酸盐缓冲液清洗蛋白质或肽，添加用DMSO、缓冲剂、等准备的染料，然后混合溶液，再于室温放置10分钟。另外，标记可使用商品化的标记试剂盒，诸如生物素标记试剂盒，如生物素标记试剂盒-NH2、生物素标记试剂盒-SH(DojindoLaboratories)；碱性磷酸酶标记试剂盒诸如碱性磷酸酶标记试剂盒-NH2、碱性磷酸酶标记试剂盒-SH(Dojindo Laboratories)；过氧化物酶标记试剂盒诸如过氧化物酶标记试剂盒-NH2、过氧化物酶标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；藻胆蛋白标记试剂盒诸如藻胆蛋白标记试剂盒-NH2、藻胆蛋白标记试剂盒-SH、B-藻红蛋白标记试剂盒-NH2，B-藻红蛋白标记试剂盒-SH、R-藻红蛋白标记试剂盒-NH2、R-藻红蛋白标记试剂盒SH(DojindoLaboratories)；荧光标记试剂盒诸如荧光素标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)555标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)647标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；及DyLight 547和DyLight647(Techno Chemical Corp.)、Zenon(TM)、Alexa Fluor(TM)抗体标记试剂盒、Qdot(TM)抗体标记试剂盒(Invitrogen Corporation)和EZ-标记物蛋白质标记试剂盒(Funakoshi Corporation)。为了正确标记，可以使用适宜的仪器来检测经过标记的抗体或其片段。

作为依照本发明的检测产品的样品，可以使用例如自活检受试者获得的组织样品或流体。样品不受特别限制，只要它适于本发明的测定；例如，它可以包括组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的材料。

在本发明的具体实施方案中，所述样品来自受试者的组织。本领域技术人员公知，肿瘤组织的细胞会脱落到体液中，这些脱落的细胞称之为循环肿瘤细胞，循环肿瘤细胞的性质同肿瘤组织中肿瘤细胞的性质相同，因此检测体液中尤其是血液中循环肿瘤细胞的性质就可以代表肿瘤组织的性质。就本发明而言，通过检测肿瘤组织中GBP5基因表达可以用于诊断腹主动脉瘤，可以容易得出也可以通过检测循环肿瘤细胞中GBP5基因表达来诊断腹主动脉瘤。

进一步，所述定量GBP5基因或GBP5蛋白的产品可以是检测GBP5基因或GBP5蛋白的试剂、也可以是包含所述试剂的试剂盒、芯片、试纸等，也可以是使用所述试剂的高通量测序平台。

本发明还提供了一种诊断腹主动脉瘤的工具，所述工具能够检测GBP5基因表达量。

进一步，所述工具包括包括能够定量GBP5基因mRNA的试剂，和/或能够定量GBP5蛋白的试剂。

更进一步，所述能够定量GBP5基因mRNA的试剂是实时定量PCR中使用的特异扩增GBP5基因的引物，所述引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

进一步，所述诊断腹主动脉瘤的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断腹主动脉瘤的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知GBP5基因的异常与腹主动脉瘤相关也属于GBP5的用途，同样在本发明的保护范围之内。

本发明的检测产品、诊断工具中使用的抗GBP5抗体或其片段所识别的氨基酸的数目没有特别限制，只要抗体能够结合GBP5即可。

本发明还提供了一种诊断腹主动脉瘤的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)获取受试者的样品；

(2)检测受试者样品中GBP5基因或蛋白的表达水平；

(3)将测得的GBP5基因或蛋白的表达水平与受试者的患病与否关联起来。

(4)与对照相比，GBP5基因或蛋白的表达水平升高，则该受试者被判断患有腹主动脉瘤或者具有患有腹主动脉瘤的风险、或者腹主动脉瘤患者被判断为复发、或者腹主动脉瘤患者被判断为预后不良。

本发明还提供了一种腹主动脉瘤的治疗方法，所述方法包括抑制GBP5基因或GBP5蛋白。

进一步，所述方法包括抑制GBP5基因的表达，或抑制GBP5蛋白的表达或抑制GBP5蛋白的活性。

本发明还提供了一种肿瘤药物的筛选方法，可以通过在对癌细胞添加测试药物后或在对肿瘤模型动物施用测试药物后的某个时期测量GBP5基因或者GBP5蛋白的表达水平来测定肿瘤药物改善肿瘤预后的效果。更具体地说，当GBP5基因或者GBP5蛋白的表达水平在添加或施用测试药物后降低时或者恢复正常水平时，可选择该药物作为改善肿瘤预后的治疗药物。

本发明还提供了一种治疗腹主动脉瘤的药物，所述药物包含GBP5的抑制剂。

本发明的GBP5的抑制剂不受限制，只要所述抑制剂能够抑制GBP5或涉及GBP5上游或下游途径的物质的表达或活性，且对于治疗肿瘤有效的药物即可。

本发明还提供了上述抑制剂在制备治疗腹主动脉瘤的药物中的应用。

进一步，所述抑制剂包括针对GBP5基因表达的干扰RNA，或者负调控miRNA、负调控型的转录调控因子、或抑制型靶向小分子化合物。

本发明的抑制剂可以通过本领域任何已知的方式配制药物组合物来使用。这种组合物包含活性成分，加上一种或多种药物可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂，这依赖于给药方式及所设计的剂量形式。本领域枝术人员已知的治疗惰性的无机或有机的载体包括(但不限于)乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、植物油、蜡、脂肪、多羟基化合物例如聚乙二醇、水、蔗糖、乙醇、甘油，诸如此类，各种防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味剂。保湿剐、抗氧化剂、甜味剂、着色剂、稳定剂、盐、缓冲液诸如此类也可加入其中，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味，在这种组合物中可以使用的制剂可是其原始化合物本身的形式，或任选地使用其药物学可接受的盐的形式，本发明的抑制剂可以单独给药，或以各种组合给药，以及与其它治疗药剂一起结合形式给药。如此配制的组合物根据需要可选择本领域技术人员已知的任何适当的方式把抑制剂进行给药。使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的抑制剂施用于人，其中口服安全有效量通常至少约100微克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明的药物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。

本发明的药物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即可，包括但不限于静脉内，腹膜内，眼内，动脉内，肺内，口服，小泡内，肌肉内，气管内，皮下的，通过皮肤，通过胸膜，局部的，吸入，通过粘膜，皮肤，肠胃，关节内，心室内，直肠，阴道，颅骨内，尿道内，肝内，瘤内。在某些情况下，可以系统地给药。在某些情况下是局部地给药。

本发明的药物的剂量不受限制，只要获得期望的治疗效果或者预防效果即可，可以依据症状、性别、年龄等来恰当的确定。本发明的治疗药物或预防药物的剂量可以使用例如对疾病的治疗效果或者预防效果作为指标来确定。

在本发明的上下文中，“诊断腹主动脉瘤”包括判断受试者是否已经患有腹主动脉瘤、判断受试者是否存在患有腹主动脉瘤的风险、判断腹主动脉瘤患者是否已经复发与转移、判断腹主动脉瘤患者对药物治疗的反应性、或者判断腹主动脉瘤患者的预后情况。

本文所用的“治疗”涵盖患有相关疾病或病症的哺乳动物例如人类中治疗相关的疾病或疾病状态，并且包括：

(1)预防疾病或疾病状态在哺乳动物中发生，尤其是当该哺乳动物易感于所述疾病状态，但尚未被诊断出患有这种疾病状态时；

(2)抑制疾病或疾病状态，即阻止其发生；或者

(3)缓解疾病或疾病状态，即使疾病或疾病状态消退。

术语“治疗”通常涉及治疗人类或动物(例如，被兽医所应用)，其中可达到某些预期的治疗效果，例如，抑制病症的发展(包括降低发展速度、使发展停止)、改善病症和治愈病症。还包括作为预防措施(例如预防)的治疗。对还没有发展为病症但有发展为该病症危险的患者的用途，也包括在术语“治疗”中。

本发明的优点和有益效果：

本发明的发现了一种诊断腹主动脉瘤的分子标志物，使用该分子标志物可以在腹主动脉瘤发生的早期即可作为判断，提供了患者的生存率。

本发明的包括GBP5基因或蛋白的抑制剂的治疗药物可用作新的腹主动脉瘤的治疗药物。

附图说明

图1显示利用QPCR检测GBP5基因在腹主动脉瘤组织与正常对照组织中的差异表达；

图2显示利用Western blot实验检测GBP5蛋白在腹主动脉瘤组织与正常对照组织中的差异表达；

图3显示利用Western blot实验检测GBP5基因表达抑制率。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1基因芯片筛选差异表达基因

1、组织获取和处理：收集AAA动脉壁中层活体标本2份及肾下正常主动脉对照组织2份，在无菌、无RNA酶条件下，于平肾动脉下方约4cm处切取主动脉壁，灭菌生理盐水冲洗去血迹，将所取组织除去动脉内外膜，迅速(<5min)冻存在液氮中备用。

2、RNA提取、cDNA合成

将液氮保存的动脉瘤组织分别放在陶瓷研钵中液氮低温环境下碾碎成粉末,加入Trizol试剂匀浆，离心后取上清液经1∶1酸性酚-氯仿两次抽提后再经醋酸钠和5∶1酸性酚-氯仿抽提，等体积异丙醇沉淀，离心后用Milli-Q水溶解沉淀，紫外分光光度仪测定OD值(A260/A280)，甲醛变性凝胶电泳检测28S、18S rRNA条带。

3、芯片处理

HGEC40s型表达谱芯片由上海博星基因芯片有限公司制作。用载体两端通用引物对4 096条全长基因行聚合酶联反应(PCR)扩增，产物长度为1 000～3000bp，应用琼脂糖电泳检验PCR产物,浓缩后的扩增产物作为靶基因溶解于3×SSC点样液中用CartesianPixsys 7500点样仪在18mm×18mm玻片上按0.28mm间距点样。点样后玻片经水合、室温干燥、UV交联，再用0.2％SDS、水及0.2％硼氢化钠溶液处理10min，晾干备用。

4、探针制备

Oligolex mRNA Midi Kits(Qiagen公司，美国)纯化mRNA，据RNA溶液的浓度取适量总RNA，用Oligod T亲和柱纯化，得到纯mRNA。参照文献[SchenaM,Shalon D,Davis RW,etal.Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementaryDNA microarray.Science,1995,270:467-470]的方法逆转录合成及纯化cDNA探针，Cy3-dUTP标记正常组织mRNA，用Cy5-dUTP标记AAA组织mRNA。乙醇沉淀后将Cy3-dUTP和Cy5-dUTP标记的探针混合溶解在20μl 5×SSC+0.2％SDS杂交液中。

5、杂交和洗涤：将HGEC40s表达谱芯片和杂交探针分别做95℃变性后置于杂交舱内，加入混合探针，用杂交密封舱加以密闭，不留有气泡。于恒湿杂交箱内60℃杂交16h。

6、差异基因的检测与分子生物学信息分析：用GenePix 4000B荧光扫描仪扫描芯片后，GenePix Pro3.0软件分析2种荧光信号的强度和比值。用40个管家基因进行Cy3和Cy5的均衡。先将所有数据的前景值与背景值相减，得出Cy3、Cy5标记的强度值，根据总数为n的有效基因的Cy5/Cy3的自然对数值lnRi＝lnCy5/Cy3，以Ri值在0.1～10.0之间的有效基因作为均一化依据，算出这些基因Cy5/Cy3自然对数平均值即均一化系数。将所有数据项的Cy3标记强度乘上均一化系数，得出调整后的Cy3值。将所有Cy3值小于200的强度值以200取代生物信息学分析结果：用GenePix Pro 3.0软件分析2种荧光信号的强度和比值。

7、生物信息学分析结果

用GenePix Pro 3.0软件分析2种荧光信号的强度和比值。结果显示差异表达基因为432个，其中上调基因为278个，下调基因为154个。

实施例2差异表达基因在大样本中的验证

选择在腹主动脉瘤组织的表达选择基因芯片提示差异表达的GBP5为研究目标进行反向验证。

1、组织获取和处理：按照实施例1的方法收集AAA动脉壁中层活体标本30份及肾下正常主动脉对照组织40份。

2、RNA提取

按照实施例1的方法进行RNA提取。

3、逆转录

用逆转录缓冲液对lμg总RNA进行逆转录合成cDNA。采用25μl反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：DEPC水，5×逆转录缓冲液，10mmol/L dNTP，0.1mmol/l DTT，30μmmol/l Oligo dT，200U/μl M-MLV，模板RNA。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。

4、QPCR

采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管。配制以下反应体系：SYBR Green聚合酶链式反应体系 12.5μl，正向引物(5μM)1μl，反向引物(5μM)1μl，模板cDNA 2.0μl，无酶水8.5μl；扩增GBP5基因的正向引物序列为5’-GCCATAATCTCTTCATTCA-3’(SEQ ID NO.1)，反向引物序列为 5’-CTTCTTCAGCCTGTATTC-3’(SEQ ID NO.2)；扩增GAPDH基因的正向引物序列为5’-AAAGGGTCATCATCTCTG-3’(SEQ ID NO.3)，反向引物序列为5’-GCTGTTGTCATACTTCTC-3’(SEQ ID NO.4)，各项操作均于冰上进行。扩增程序为：95℃5min，(95℃5s，60℃60s)*40个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

5、Western blot检测

剪碎组织后机械匀浆，4℃12 000r min离心10min。考马氏亮蓝R250染色测总蛋白浓度，将各组蛋白浓度调到同一水平。制备10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶,每孔加蛋白样品100μg，电泳后通过半干式电转移仪(美国Bio-Rad公司)将蛋白转到硝酸纤维素滤膜。丽春红S染色确定转膜情况并标记蛋白Marker位置。5％脱脂奶粉TBS缓冲液封闭4℃冰箱过夜；一抗1∶1 000稀释，室温下摇2h后TBS洗膜3次；按1∶1 000加入过氧化物酶标记羊抗兔IgG-HRP60min，TBS洗3次后加入ECL 2-3min，暗室显影2min后冲洗胶片。凝胶成像分析系统摄像分析。

将蛋白条带的灰度值使用Image J软件进行分析，以β-actin为内参，将GBP5蛋白条带的灰度值进行归一化处理。结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

6、结果

(1)QPCR结果

如图1所示，与正常对照组织相比，腹主动脉瘤组织中GBP5基因mRNA水平显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。

(2)Western blot结果

如图2所示，与正常对照组织相比，腹主动脉瘤组织中GBP5蛋白水平显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例3干扰GBP5基因表达

1、干扰RNA设计合成

根据GBP5基因序列由上海吉玛制药技术有限公司设计合成siRNA。上海吉玛制药技术有限公司同时提供与GBP5基因无序列同源性的阴性对照siRNA(siRNA-NC)。

siRNA-GBP5：

正义链为5’-AACUAAUGUGUGAUUUGGCCA-3’(SEQ ID NO.5)；

反义链为5’-GCCAAAUCACACAUUAGUUCU-3’(SEQ ID NO.6)，

2、人主动脉平滑肌细胞的培养

T/G HA-VSMC细胞(简称HVSMC细胞)用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM高糖培养基加青霉素100units/ml、链霉素100μg/ml，置37℃，5％CO₂的培养箱内培养，每隔24h换1次培养液，48h传代1次。取对数生长期的细胞进行后续实验。

3、细胞转染

采用脂质体Lipofectamine2000为转染试剂。实验分2组：阴性对照组(转染siRNA-NC)；实验组(转染siRNA-GBP5)。取对数生长期的HVSMC细胞细胞，接种于6孔细胞培养板。24h后细胞培养板覆盖率约为70％-80％。转染方式参照Lipofectamine2000说明书进行。

4、Western blot实验检测siRNA-GBP5的干扰效率

步骤同实施例2。

5、结果

如图3所示，与阴性对照组(转染siRNA-NC)相比，实验组(转染siRNA-GBP5)细胞中GBP5蛋白表达量显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例4GBP5基因的表达对人主动脉平滑肌细胞凋亡的影响

利用Annexin V-PE/7-AAD凋亡检测试剂盒(购自北京科悦生物科技有限公司，KTK102-020)检测GBP5基因表达对平滑肌细胞凋亡的影响。

1、细胞培养与转染

按照实施例3的方法进行。

2、细胞凋亡诱导与检测

细胞转染24小时后，各组细胞分别换用无血清的DMEM培养基培养，以诱导凋亡。48小时后胰酶消化收集细胞，用PBS洗2遍，按照说明分析加入binding buffer(200μl)、Annexin V-PE(10μl)和7-AAD(5μl)避光孵育15min，最后加入300μl ending buffer，上机检测细胞凋亡的变化。

3、结果

结果显示，各组细胞无血清培养基饥饿刺激48h后，流式细胞仪检测细胞凋亡率显示siRNA-GBP5转染组细胞凋亡率为(19.156±1.472)％；而阴性对照组细胞凋亡率为(31.714±1.203)％；siRNA-GBP5转染组细胞凋亡率较阴性对照组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，上述结果表明，抑制GBP5基因表达可以抑制人主动脉平滑肌细胞的凋亡。由于人主动脉平滑肌细胞的凋亡增加导致了腹主动脉瘤的发生，因此抑制GBP5基因表达可以实现治疗腹主动脉瘤的目的。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京泱深生物信息技术有限公司

<120> 腹主动脉瘤诊治标志物

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gccataatct cttcattca 19

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cttcttcagc ctgtattc 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aaagggtcat catctctg 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gctgttgtca tacttctc 18

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 5

aacuaaugug ugauuuggcc a 21

<210> 6

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 6

gccaaaucac acauuaguuc u 21

Claims

1.检测GBP5的产品在制备诊断腹主动脉瘤工具中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测GBP5的产品包括检测GBP5基因表达量的产品。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述检测GBP5的产品包括能够定量GBP5基因mRNA的产品，和/或能够定量GBP5蛋白的产品。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述能够定量GBP5基因mRNA的试剂包括实时定量PCR中使用的特异扩增GBP5基因的引物，所述引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示；所述能够定量GBP5蛋白的试剂包括特异性结合GBP5蛋白的抗体。

5.一种诊断腹主动脉瘤的工具，其特征在于，所述工具包括能够检测GBP5基因表达量的工具。

6.根据权利要求5所述的工具，其特征在于，所述工具包括包括能够定量GBP5基因mRNA的试剂，和/或能够定量GBP5蛋白的试剂。

7.根据权利要求6所述的工具，其特征在于，所述能够定量GBP5基因mRNA的试剂是实时定量PCR中使用的特异扩增GBP5基因的引物，所述引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

8.一种治疗腹主动脉瘤的药物，其特征在于，所述药物包含GBP5的抑制剂。

9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述抑制剂能够抑制GBP5或涉及GBP5上游或下游途径的物质的表达或活性。

10.权利要求8或9所述的抑制剂在制备治疗腹主动脉瘤的药物中的应用。