CN111235277A - 诊治腹主动脉瘤的生物标志物 - Google Patents

诊治腹主动脉瘤的生物标志物 Download PDF

Info

Publication number
CN111235277A
CN111235277A CN202010233046.3A CN202010233046A CN111235277A CN 111235277 A CN111235277 A CN 111235277A CN 202010233046 A CN202010233046 A CN 202010233046A CN 111235277 A CN111235277 A CN 111235277A
Authority
CN
China
Prior art keywords
otub2
abdominal aortic
aortic aneurysm
biomarker
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010233046.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111235277B (zh
Inventor
张慧
李方达
陈思良
杨丹
郑月宏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Original Assignee
Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences filed Critical Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Priority to CN202010233046.3A priority Critical patent/CN111235277B/zh
Publication of CN111235277A publication Critical patent/CN111235277A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111235277B publication Critical patent/CN111235277B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了诊治腹主动脉瘤的生物标志物，所述生物标志物是OTUB2。本发明通过QPCR实验证明了OTUB2在腹主动脉瘤患者中存在差异表达，为了进一步验证OTUB2与腹主动脉瘤的相关性，构建了AAA细胞模型，证明干扰OTUB2表达可逆转血管紧张素II对细胞的损伤作用，故OTUB2可以成为诊治腹主动脉瘤的生物标志物。本发明的研究成果为临床诊断或治疗腹主动脉瘤提供了新的方法和策略。

Description

诊治腹主动脉瘤的生物标志物
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及一种诊治腹主动脉瘤的生物标志物。
背景技术
腹主动脉瘤(abdominal aortic aneurysm，AAA)为一种多发于中年或老年人的腹主动脉的局限性、永久性扩张病变，与邻近的腹主动脉对比扩张50％以上或腹主动脉的直径大于3cm为其诊断标准。随着CT，MRI等医学检查手段的普及，AAA发病率在全球范围内有不断增加的趋势，发病率在近30年增加了7倍，成为临床上最常见的主动脉疾病之一。我国目前缺乏全面的有关AAA的流行病学资料，在美国65岁以上人群AAA的患病率为8％，位居美国第13号疾病杀手。然而，很多AAA患者由于缺乏及时诊断和干预，动脉瘤持续发展并最终破裂危及生命，因此，AAA仍有相对较高的死亡率。特别是当AAA已经破裂(出现腹痛、血压下降、休克)或先兆破裂(出现腹痛、动脉瘤快速扩张等表现)，其治疗风险和难度将大大增加，预后极差。目前临床上己将AAA破裂或先兆破裂列为极其凶险的血管疾病之一，和急性主动脉夹层、急性心梗、急性肺动脉栓塞等疾病一起，成为需要重症监护强化治疗的重大高危疾病，若不能及时治疗，常常可导致死亡，有着极高的死亡率。
目前对于AAA的治疗方式主要是通过临床外科技术干预，防止动脉瘤的发展和破裂，手术成为其主要治疗手段，其中近15年间逐渐发展成熟的微创腔内治疗技术，使得其手术创伤和风险较以往有了很大的改善。AAA可以通过手术治疗(腔内隔绝术或主动脉重建术)来降低破裂死亡率和改善预后，却还没有针对性的药物治疗方式。无论是以前传统的治疗方法：开腹手术切除及人工血管移植术，还是近15年发展迅速的介入腔内覆膜支架治疗，均存相对较高的手术风险和总体治疗费用巨大的缺点，而且有相当比例的患者因合并心、肝、脑、肺、肾等重要器官病变而不能或不宜进行手术干预。因此，鉴于AAA的高危险性，如能对其早预防、早诊断，监控高危人群，适时干预治疗，则能减少发病率及病死率。所以科研工作者以及医务人员一直努力研究，期望能够发现与AAA发病机制相关的关键分子，从而可以采用靶向药物或是分子生物学等手段干预治疗AAA患者，达到延缓动脉瘤发生发展、预防其破裂的目的。
发明内容
本申请实验证明相比健康对照，腹主动脉瘤患者中OTUB2基因表达上调，提示OTUB2可能作为诊断腹主动脉瘤的生物标志物，为了进一步研究OTUB2基因与腹主动脉瘤的相关性，进行了体外细胞实验，通过构建AAA细胞模型，观察OTUB2基因表达被抑制对AAA细胞模型凋亡的影响，结果显示抑制OTUB2基因表达逆转了血管紧张素II诱导的细胞凋亡，表明OTUB2是腹主动脉瘤的关键基因，可以成为腹主动脉瘤的诊治标志物。根据上述研究成果，本申请保护内容如下：
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种诊治腹主动脉瘤的生物标志物，所述生物标志物是OTUB2基因或其表达产物。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了检测前面所述的生物标志物的试剂。
进一步，所述试剂包括检测OTUB2基因mRNA水平的试剂，或检测OTUB2蛋白水平的试剂。
更进一步，检测OTUB2基因mRNA水平的试剂包括针对OTUB2基因mRNA的引物和/或探针；检测OTUB2蛋白水平的试剂包括针对OTUB2蛋白的抗体。
根据本发明的又一个方面，本发明提供了前面所述的生物标志物在制备腹主动脉瘤的诊断工具中的应用。
根据本发明的又一个方面，本发明提供了前面所述的试剂在制备腹主动脉瘤的诊断工具中的应用。
进一步，所述工具包括芯片、试剂盒、试纸、高通量测序平台、腹主动脉瘤诊断系统。
更进一步，所述腹主动脉瘤诊断系统包括诊断模块，所述诊断模块根据受试者的OTUB2基因或其表达产物的表达水平判断受试者是否患有腹主动脉瘤。
根据本发明的又一个方面，本发明提供了前面所述的生物标志物在制备治疗腹主动脉瘤的药物中的应用。
进一步，所述药物包括抑制所述生物标志物表达的试剂。
更进一步，所述试剂包括但不限于siRNA、shRNA。
本发明所述药物还包括药物学上可接受的载体。通过常规制药工艺将有效成分-抑制所述生物标志物表达的试剂与药物学上可接受的载体制备成本发明的药物。
根据本发明的又一个方面，本发明提供一种治疗腹主动脉瘤的方法，所述方法包括施用抑制前面所述生物标志物表达的试剂或施用前面所述的包括抑制前面所述生物标志物表达的试剂的药物。
附图说明
图1显示利用QPCR检测OTUB2基因表达抑制程度的统计图。
具体实施方式
核酸和蛋白
本文中的“OTUB2基因”，指编码所有或部分OTUB2蛋白或与所有或部分的核酸序列或其类似物大致相同的核酸。
“大致相同”表示多肽或核酸展示与参考氨基酸或核酸序列至少75％，85％，90％，95％或甚至99％同一性。对于多肽，比对序列长度通常为至少35个氨基酸、45个氨基酸、55个氨基酸或甚至70个氨基酸。对于核酸，比对序列长度通常为至少60个核苷酸、90个核苷酸或甚至120个核苷酸。
通常使用公开可获得的计算机程序测定序列同一性。测定两条序列间同一性的计算机程序方法包括但不限于GCG程序包(Devereux等，NucleicAcids Research 12：387，1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等，J.Mol.Biol.215：403，1990)。熟知的SmithWaterman算法也可用来确定同一性。BLAST程序可从NCBI和其它来源(如，BLAST手册，Altschul等，NCBI NLM NIH，Bethesda，MD20894)公开获得。这些软件程序通过对各种置换、缺失和其它修改指定同源程度来匹配相似序列。氨基酸比对的保守置换通常包括在以下组中的置换：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。
如本文所使用的，当涉及蛋白质(如在“给定的蛋白的部分”中)时，术语“部分”是指该蛋白质的片段。所述片段可在大小上在从4个氨基酸残基至整个氨基酸序列减去一个氨基酸的范围内变化(例如，4、5、6、......、n-1)。
检测
本文使用的术语"检测蛋白表达水平"意指检测和鉴定生物样品中腹主动脉瘤的诊断标志物(蛋白)或编码其的基因的存在和表达水平。用于检测或比较分析蛋白的方法的实例包括但不限于：蛋白芯片测定、免疫测定、配体结合测试、MALDI-T0F(基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱)、SELDI-T0F(表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱)、放射免疫测定、放射免疫扩散、双向免疫扩散(Ouchterlony immunodiffusion)、火箭免疫电泳、免疫组化染色、补体结合试验、2-D电泳、液相色谱-质谱(LC-MS)、液相色谱-质谱/质谱(LC-MS/MS)、免疫印迹、和ELISA(酶联免疫吸附试验)。
在本公开内容中，用于检测的蛋白表达水平的试剂可包含可特异性结合至OTUB2蛋白的抗体、寡肽、配体、PNA(肽核酸)或适体。
本文使用的术语“抗体”是指特异性结合抗原以引发抗原-抗体反应的物质。出于本公开内容的目的，术语“抗体”意指特异性结合至OTUB2蛋白的抗体。落入本公开内容的抗体的范围的是多克隆抗体、单克隆抗体和重组抗体。使用本领域熟知的技术可容易地制备这些抗体。此外，可用于本公开内容的抗体可以是由两条全长轻链和两条全长重链组成的完整抗体、或是完整抗体分子的功能片段。术语抗体分子的“功能片段”意指保留抗体结合功能的片段，例如Fab、F(ab')、F(ab')2和Fv。
本文使用的术语“PNA(肽核酸)”是指与DNA或RNA相似的人工合成的聚合物，1991年由Nielsen、Egholm、Berg和Buchardt(哥本哈根大学，丹麦)教授首次引入。DNA具有磷酸-核糖骨架，而PNA的骨架由通过肽键连接的重复的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元构成。由于这种结构，PNA显著增强DNA或RNA的亲合力及稳定性，因此有效地用于分子生物学研究、诊断、和反义疗法。对于PNA的详细说明，可参考文献[Nielsen PE,EgholmM,BergRH,Buchardt0(1991年12月)·”Sequence-selectiverecognition ofDNAbystranddisplacementwithathymine-substitutedpolyamide".Science254(5037):1497-1500]。
本文使用的“适体”是结合至特定靶分子的寡核苷酸或肽分子。对于适体的详细说明，可参考文献[BockLCetal·，Nature355(6360):5646(1992)；Hoppe-Seyler F,ButzK〃Peptideaptamers:powerfulnewtoolsformolecularmedicine".JMol Med.78(8):42630(2000)；CohenBA,ColasP，BrentR."Anartificialcell-cycle inhibitorisolatedfromacombinatoriallibrary.ProcNatlAcadSci USA.95(24):142727(1998)]。
本文使用的术语"检测mRNA表达水平"意指检测和鉴定生物样品中编码诊断标记物(蛋白)的基因的mRNA的存在和表达水平。在本公开内容中，可用于检测mRNA表达水平的分析方法的实例包括反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、竞争性RT-PCR、实时RT-PCR、核糖核酸酶保护测定(RPA)、RNA印迹和DNA芯片，但不限于此。
在本公开内容中，用于检测编码OTUB2的基因的mRNA表达水平的试剂包含特异性结合至编码OTUB2的基因的mRNA的引物、探针或反义核苷酸。关于OTUB2蛋白的信息可通过UniProt获得，本领域技术人员可基于该信息设计特异性结合至编码该蛋白的基因的mRNA的引物、探针或反义核苷酸。
本文使用的术语“引物”是识别靶基因序列的短核酸序列的链，其包括一对正反向引物。具体地，所述“引物”包括一对提供特异性和灵敏度的分析结果的引物。引物被认为在用于扩增靶基因序列时提供高度特异性，但它不引起与靶基因序列不一致或互补的非靶序列的扩增。
本文使用的术语“探针”是指特异性结合至样品中待检测的靶标的物质。通过所述结合，探针可确定样品中靶标的存在。只要它通常用于本领域中，任何探针都可用于本公开内容。特别地，所述探针可以是PNA(肽核酸)、LNA(锁核酸)、肽、多肽、蛋白、RNA或DNA，最优选PNA。具体地，所述探针是一种生物材料，其可以来自有机体或可以体外合成、或是其模拟物。例如，所述探针可以是酶、蛋白、抗体、微生物、动物或植物细胞或器官、神经元、DNA或RNA。DNA可包括cDNA、基因组DNA和寡核苷酸。同样地，基因组RNA、mRNA和寡核苷酸可落入RNA的范围内。蛋白的实例包括抗体、抗原、酶和肽。
本文使用的术语“反义”是指具有核苷酸碱基序列和亚基-亚基骨架的寡聚体，所述骨架允许反义寡聚体通过Watson-Crick碱基配对与RNA中的靶序列杂交以在靶序列中形成RNA：寡聚体异源双链核酸分子。
试剂盒
此外，本公开内容提供了用于诊断腹主动脉瘤的试剂盒，其包含用于诊断腹主动脉瘤的组合物。例如，所述试剂盒可以是RT-PCR试剂盒、DNA芯片试剂盒、ELISA试剂盒、蛋白芯片试剂盒、快速试剂盒、或MRM(多反应监测)试剂盒。
例如，所述诊断试剂盒可进一步包含反转录聚合酶链式反应所必需的元件。RT-PCR试剂盒包含一对特异性针对编码标记物蛋白的基因的引物。各引物是具有特异性针对所述基因的核酸序列的序列的核苷酸，其长度可为约7至50bp，更特别为约10至39bp。此外，所述试剂盒可进一步包含特异性针对对照基因的核酸序列的引物。此外，所述RT-PCR试剂盒可包含测试管或合适的器皿、反应缓冲液(不同pH值和镁浓度)、脱氧核苷酸(dNTP)、酶(例如Taq聚合酶和反转录酶)、脱氧核糖核酸酶抑制剂、核糖核酸酶抑制剂、DEPC-水、和无菌水。
此外，本公开内容的诊断试剂盒可包含用于操作DNA芯片所必需的元件。所述DNA芯片试剂盒可包含与基因或cDNA或相当于其片段的寡核苷酸结合的底物、及用于构建荧光标记的探针的试剂、药剂和酶。此外，所述底物可包含对照基因或cDNA或相当于其片段的寡核苷酸。
在一些实施方案中，本公开内容的诊断试剂盒可包含用于进行ELISA所必需的元件。所述ELISA试剂盒可包含特异性针对蛋白的抗体。所述抗体具有针对标记物蛋白的高选择性和亲合力，与其他蛋白无交叉反应性，并且可以是单克隆抗体、多克隆抗体或重组抗体。此外，所述ELISA试剂盒可包含特异性针对对照蛋白的抗体。此外，所述ELISA试剂盒可进一步包含能够检测被结合的抗体的试剂，例如，标记的第二抗体、发色团、酶(例如，与抗体缀合)、及其底物或能够结合所述抗体的物质。
与检测结合使用的术语“样品”是指随着腹主动脉瘤的发病，蛋白或基因表达水平不同的生物样品，样品的实例包括组织、细胞、血清、血浆、唾液、脑脊液和尿，优选血液、血清或血浆。
药物
短语“药学上可接受的载体”是本领域认可的并且包括例如参与从身体的一个器官或部分携带或运输任何主题组合物至身体的另一个器官或部分的药学上可接受的材料、组合物或赋形剂，如液体或固体填充剂、稀释剂、溶剂或包囊材料。每种载体必须在与主题组合物的其他成分相容的意义上是“可接受的”并且对患者无害。在某些实施方案中，药学上可接受的载体是无热原的。可以用作药学上可接受的载体的材料的一些例子包括：(1)糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；(4)粉末状黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石粉；(8)可可脂和栓剂蜡；(9)油，如花生油、棉籽油、葵花籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇，如丙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨醇、甘露糖醇和聚乙二醇；(12)酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原的水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲液；和(21)药物制剂中使用的其他无毒的相容物质。
“施用”表示将剂量药物给患者的方法。在本发明方法中使用的组合物可通过选自但不限于如下途径施用：吸入、眼部、肠胃外、皮肤、经皮、口腔、直肠、舌下、舌周(Perilingual)、鼻、局部给药和口服给药。肠胃外给药包括静脉内、腹膜内、皮下和肌内给药。优选的给药方法可根据多种因素变化，如，被施用的组合物的组分和被治疗的病症的严重度。
以本领域熟练技术人员已知的方式制备本发明的药物，如通过常规的溶解、冻干、混合、制粒或成型方法。制造制剂的本领域熟知方法示于如Remington：The Science andPractice of Pharmacy，第20版，A.R.Gennaro编，2000，Lippincott Williams&Wilkins，Philadelphia，和Encyclopedia of Pharmaceutical Technology(制药技术百科)，J.Swarbrick和J.C.Boylan编，1988-1999，Marcel Dekker，New York。
本领域熟练技术人员可容易地确定在本发明药物中使用的任何试剂的剂量。希望地，本发明药物中的试剂的剂量会足以缓解患者的腹主动脉瘤的症状。可选择性地，所述剂量会足以抑制患者细胞中的OTUB2。
其他术语
本文使用的术语"诊断"旨在涵盖确定受试者对某种疾病或病症的易感性、确定受试者是否患有某种疾病或病症、确定患有某种疾病或病症的受试者的预后或度量疗法(therametrics)(例如，监测受试者的状态以提供关于治疗功效的信息)。特别地，本文使用的诊断意指确定腹主动脉瘤的发病或发病的可能性(风险)。
术语“治疗”是本领域公知的，并且包括预防疾病、失调或病症在可能有出现疾病、失调和/或病症的倾向但还没有被诊断患有所述疾病、失调和/或病症的动物中发生；抑制疾病、失调或病症，例如，阻碍其进展；并缓解疾病、失调或病症，例如，引起疾病、失调和/或病症的消退。治疗疾病或病状包括改善特定疾病或病状的至少一种症状，即便基础病理生理学不受影响，如通过施用药剂治疗受试者的神经系统病状如多发性硬化和与氧化应激相关的其他疾病如肾脏疾病，尽管这种药剂不治疗该病状的病因。如本文所用的术语“治疗(treating)”、“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”包括治愈性疗法、预防性(例如，预防疾病的)疗法、辅助疗法和姑息疗法。
本文使用的术语“标志物”、“生物标志物”或“诊断标志物”意指允许区分正常和疾病状态、或能够使治疗结果被预测或客观测量的标签。具体地，在与腹主动脉瘤相关的情况下，标志物意指在患腹主动脉瘤或有腹主动脉瘤发病风险的受试者中，相比于正常对照(未患腹主动脉瘤的受试者)，其蛋白或基因表达水平显著升高或降低的有机生物分子，例如多肽或核酸(例如mRNA等)、脂质、糖脂、糖蛋白、糖(单糖、二糖、寡糖等)。
如本文所使用的，术语“受试者”和“患者”是指任何生物，包括植物、微生物和动物(例如，哺乳动物例如狗、猫、家畜和人)。
下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 OTUB2基因表达与腹主动脉瘤的关联性研究
1、动物与处理
雄性野生型C57BL/6J获自杰克逊实验室(Bar Harbor,Me)。在无病原体的隔离笼中饲养所有小鼠作为同窝仔对照。小鼠接受正常的实验室饮食。将10-12周龄的小鼠使用Alzet渗透微型泵(2004年，Durect Corporation)皮下注射生理盐水或血管紧张素II(AngII)，注射剂量为1000ng.kg-1.min-1(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)。将AAA小鼠和正常对照小鼠采用10％水合氯醛麻醉，75％酒精浸泡2min消毒。打开胸腔、腹腔，将脏器推至一边，暴露出心脏和主动脉，用纱布吸走血液。小心将心脏和主动脉全长剪下直至腹主动脉分叉处，立即放入0.01M PBS缓冲液中。分离脂肪组织及结缔组织，小心剪掉心脏，其间采用0.01M PBS缓冲液冲洗三次。将分离好的透明的主动脉纵向剪开，刮去内膜，获得主动脉组织。
所有动物实验方案均经首都医科大学动物护理和使用委员会批准(20120109)，并且实验符合《实验室动物的护理和使用指南》(美国国立卫生研究院出版号85-23，1996)。
2、RNA分离
按照产品说明书使用TRIzol试剂(Invitrogen，Life Technologies)分离总RNA。使用Nanodrop 2000分光光度计(Thermo Scientific)、2100生物分析仪(RNA6000NanoLabChip；安捷伦科技公司，Santa Clara,CA)、琼脂糖凝胶电泳来评估RNA的纯度，浓度和完整性。
3、实时定量PCR(RT-qPCR)分析
使用TaqMan Gold RT-PCR试剂盒(Applied Biosystems)以500ng总RNA为模板合成cDNA(具体步骤参见产生说明书)。
使用iCycler IQ系统(Bio-Rad)进行定量实时PCR(qPCR)。将cDNA样品稀释20倍，使用SYBR green JumpStart Taq ReadyMix(Sigma-Aldrich)和100μM引物进行了实时PCR反应。然后，在ABI Prism 7000序列检测系统(Applied Biosystems)中扩增了上述产物。扩增条件是：50℃，2分钟；95℃，10分钟；95℃，15秒，共40次循环，然后59℃，1分钟。β-actin作为参考基因以标准化所有样品。
引物序列如下：
OTUB2上游引物：5’-CAGTTCTTACGCCTCCTC-3’(SEQ ID NO.1)；下游引物：5’-ATGTCCATCTCCTCATCAAT-3’(SEQ ID NO.2)；
β-actin上游引物：5’-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3’(SEQ ID NO.3)；下游引物：5’-ATGTCACGCACGATTTCCC-3’(SEQ ID NO.4)。
4、统计分析
应用SPSS 20.0统计软件分析，计量数据以均数±标准差表示，两两比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
5、结果
结果显示，50只AAA小鼠中有90％的小鼠OTUB2基因表达上调；50只对照组有16％的小鼠OTUB2基因表达上调，统计结果显示，相比对照组，AAA组小鼠OTUB2基因表达显著上调，设定对照组相对表达量为1，2-△△CT法计算的AAA组OTUB2基因相对表达量的平均值约为50.57，组间差异有统计学意义(P<0.05)。ROC曲线分析显示，OTUB2基因在区分AAA患者和正常对照时，其AUC值是0.924。统计结果见表1。
表1 ROC结果统计
Figure BDA0002430003030000101
实施例2 OTUB2基因表达对主动脉平滑肌细胞功能的影响
一、干扰基因表达
1、人主动脉平滑肌细胞的培养
T/G HA-VSMC细胞(简称HVSMC细胞)用含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基置于37℃、5％CO2、饱和湿度的孵箱中进行培养，取对数生长期细胞进行实验。
2、细胞转染
针对OTUB2区域选择作用靶点，根据确定序列的原则设计，委托上海吉玛制药技术有限公司选择合成3对siRNA，预实验结果显示以下OTUB2-siRNA效率最高：其正义链为5’-UCUGAUAUUAGGUUGAAAGAU-3’(SEQ ID NO.5)，反义链为5’-CUUUCAACCUAAUAUCAGAAA-3’(SEQID NO.6)。确定该序列用于本研究。同时合成含荧光标志的通用随机阴性序列(NC-siRNA)用于计算转染率。将稀释后的LipofectamineTM 2000室温放置5min后与稀释的siRNA混合并室温放置20min形成转染复合物。转染前取对数生长期细胞悬浮于无抗生素培养基，转染时细胞密度达到(8～16)×105/ml，接种于96孔板，每孔2×104个细胞，终体积为100μl。对照组未加转染复合物，实验组分别加入不同浓度转染复合物使siRNA终浓度分别为60nmol/L。每组设6个平行孔，每孔终体积为2ml。转染后置37℃、5％CO2、饱和湿度的孵箱中继续培养48h。
3、实时定量PCR(RT-qPCR)分析
步骤基本同实施例1，根据CT值通过公式2-ΔΔCt进行相对定量分析计算得mRNA相对表达量。
引物序列：
OTUB2上游引物：5’-GAGGAGCACAAGTTCAGAA-3’(SEQ ID NO.7)；下游引物：5’-ACACTGAGCCATCCTTCT-3’(SEQ ID NO.8)；
β-actin上游引物：5’-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3’(SEQ ID NO.9)，下游引物：5’-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3’(SEQ ID NO.10)。
4、结果
结果如图1所示，siRNA的抑制率约78％。
二、基因对平滑肌细胞凋亡的影响
1、步骤
使用血管紧张素II(A9525，购自SIGMA)诱导平滑肌细胞凋亡。
按照前面的步骤培养和转染，转染24小时后，加入血管紧张素II(终浓度为10μM)刺激细胞24h后，之后使用碧云天公司的TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(显色法)(货号：C1091)测定细胞凋亡情况，按照操作说明书进行。
2、结果
10μM血管紧张素II刺激组TUNEL染色阳性细胞百分数为(32.8±4.3)％，与未刺激对照组(11.2±1.9)％相比差异具有统计学意义(P<0.05)。在10μM血管紧张素II刺激的条件下，NC-siRNA组TUNEL染色阳性细胞百分数为(34.2±3.1)％，而OTUB2-siRNA组TUNEL染色阳性细胞百分数为(14.8±1.4)％，差异具有统计学意义(P<0.05)。上述结果表明，干扰基因表达可以有效抑制平滑肌细胞凋亡，故基因可成为治疗AAA的药物靶标。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国医学科学院北京协和医院
<120> 诊治腹主动脉瘤的生物标志物
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cagttcttac gcctcctc 18
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgtccatct cctcatcaat 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gagaccttca acaccccagc 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgtcacgca cgatttccc 19
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ucugauauua gguugaaaga u 21
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cuuucaaccu aauaucagaa a 21
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gaggagcaca agttcagaa 19
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acactgagcc atccttct 18
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgacgtggac atccgcaaag 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctggaaggtg gacagcgagg 20

Claims (10)

1.一种诊治腹主动脉瘤的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物是OTUB2基因或其表达产物。
2.检测权利要求1所述的生物标志物的试剂。
3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述试剂包括检测OTUB2基因mRNA水平的试剂，或检测OTUB2蛋白水平的试剂。
4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于，检测OTUB2基因mRNA水平的试剂包括针对OTUB2基因mRNA的引物和/或探针；检测OTUB2蛋白水平的试剂包括针对OTUB2蛋白的抗体。
5.权利要求1所述的生物标志物在制备腹主动脉瘤的诊断工具中的应用。
6.权利要求2-4中任一项所述的试剂在制备腹主动脉瘤的诊断工具中的应用。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述工具包括芯片、试剂盒、试纸、高通量测序平台、腹主动脉瘤诊断系统。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述腹主动脉瘤诊断系统包括诊断模块，所述诊断模块根据受试者的OTUB2基因或其表达产物的表达水平判断受试者是否患有腹主动脉瘤。
9.检测权利要求1所述的生物标志物在制备治疗腹主动脉瘤的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述药物包括抑制所述生物标志物表达的试剂。
CN202010233046.3A 2020-03-28 2020-03-28 诊治腹主动脉瘤的生物标志物 Active CN111235277B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010233046.3A CN111235277B (zh) 2020-03-28 2020-03-28 诊治腹主动脉瘤的生物标志物

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010233046.3A CN111235277B (zh) 2020-03-28 2020-03-28 诊治腹主动脉瘤的生物标志物

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111235277A true CN111235277A (zh) 2020-06-05
CN111235277B CN111235277B (zh) 2021-07-30

Family

ID=70873843

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010233046.3A Active CN111235277B (zh) 2020-03-28 2020-03-28 诊治腹主动脉瘤的生物标志物

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111235277B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116519952A (zh) * 2023-06-26 2023-08-01 中国医学科学院北京协和医院 颈动脉体瘤术前筛查及诊断的标志物及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107012256A (zh) * 2017-06-02 2017-08-04 北京泱深生物信息技术有限公司 腹主动脉瘤诊治标志物
CN107177673A (zh) * 2017-06-02 2017-09-19 北京泱深生物信息技术有限公司 腹动脉瘤诊治相关基因

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107012256A (zh) * 2017-06-02 2017-08-04 北京泱深生物信息技术有限公司 腹主动脉瘤诊治标志物
CN107177673A (zh) * 2017-06-02 2017-09-19 北京泱深生物信息技术有限公司 腹动脉瘤诊治相关基因

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GERARD TROMP: "GDS2838/222878_s_at", 《NCBI GEO PROFILES》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116519952A (zh) * 2023-06-26 2023-08-01 中国医学科学院北京协和医院 颈动脉体瘤术前筛查及诊断的标志物及其应用
CN116519952B (zh) * 2023-06-26 2023-08-29 中国医学科学院北京协和医院 颈动脉体瘤术前筛查及诊断的标志物及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN111235277B (zh) 2021-07-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3156074B1 (en) Composition for preventing or treating fracture or osteoporosis using slit-robo system
CA2819378A1 (en) Irak-related interventions and diagnosis
JP2021043216A (ja) 疾患の診断用組成物
CN111235277B (zh) 诊治腹主动脉瘤的生物标志物
JP2021524285A (ja) 疾患の診断用組成物
CN110904221A (zh) 帕金森病的诊断标志物和药物靶标
CN112877440B (zh) 生物标志物在预测肝癌复发中的应用
CN107022635B (zh) Acadl基因及其表达产物在制备腹主动脉瘤诊治产品中的应用
CN111197088B (zh) Adamtsl3作为腹主动脉瘤诊治标志物的应用
CN111154863B (zh) lncRNA在制备诊断和/或治疗骨关节炎的产品中的应用
KR102475257B1 (ko) 당뇨병 치료제에 대한 약물반응성 예측용 마이크로 rna 바이오마커 및 이의 용도
KR102475261B1 (ko) 당뇨병 치료제에 대한 약물반응성 예측용 마이크로 rna 바이오마커 및 이의 용도
CN107177674B (zh) Sphar作为腹主动脉瘤的诊治靶标
CN110872623A (zh) 作为诊治帕金森病的分子标志物基因-blm
CN111254200B (zh) Gal3st3基因的新用途
CN110878354A (zh) 诊治帕金森病的生物标志物
WO2017026733A1 (ko) Fgf12를 이용한 혈관 평활근세포 증식성 질환의 진단, 예방 또는 치료용 조성물
KR20210133136A (ko) SARS-CoV-2-유도성 패혈증의 진단 또는 예후 예측용 바이오마커
CN111254201B (zh) Dennd1c作为诊治腹主动脉瘤的分子标志物的应用
CN112430663A (zh) 一种用于膀胱癌诊治的生物标志物及其应用
CN113388682B (zh) 基于基因的诊断胃癌的产品及其应用
KR102436301B1 (ko) 섬유증의 진단 또는 치료용 조성물
CN113999848B (zh) 一种tsRNA分子及其应用
KR102624632B1 (ko) SARS-CoV-2 감염 질환 중증도 진단 또는 예후 예측용 바이오마커
KR102475259B1 (ko) 당뇨병 치료제에 대한 약물반응성 예측용 마이크로 rna 바이오마커 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant