WO2017026733A1 - Fgf12를 이용한 혈관 평활근세포 증식성 질환의 진단, 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Fgf12를 이용한 혈관 평활근세포 증식성 질환의 진단, 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a composition for the treatment of vascular smooth muscle cell proliferative disease, a diagnostic composition, a method for detecting a diagnostic marker, and more particularly, to a recombinant expression vector or a FGF12 protein or fragment thereof comprising a polynucleotide encoding FGF12.
  • composition for the diagnosis of smooth muscle cell proliferative disease comprising the active ingredient
  • composition for diagnosing the smooth muscle cell proliferative disease comprising an agent for measuring the expression level of FGF12 raRNA or FGF12 protein and a marker for smooth muscle cell proliferative disease using the same It is about how to detect.
  • Vascular smooth muscle cells form and support the structure of blood vessels, and are controlled by the autonomic nervous system and hormonal control to relax and contract.
  • Vascular smooth muscle cells express high levels of smooth muscle-specific genes such as SMA, SM22 ⁇ , SM-MHC, SM-calponin, and desmin in healthy normal state, and do not proliferate almost all of the cells, but the blood vessel wounds.
  • smooth muscle-specific genes such as SMA, SM22 ⁇ , SM-MHC, SM-calponin, and desmin in healthy normal state, and do not proliferate almost all of the cells, but the blood vessel wounds.
  • cell proliferation and migration occurs actively as part of the remodeling process to repair vascular damage. . If the proliferation of these vascular smooth muscle cells is not normally controlled and occurs excessively due to abnormal signal transmission or repeated damage, the smooth muscle cells are transferred from the median layer of the blood vessel to the int ima layer.
  • vascular narrowing and pulmonary hypertension in which the neoimal layer continues to form, and when inflammation or blood clot is formed, the walls of the vessel become thick and the vascular lumen narrows.
  • vascular stenosis is mainly due to surgical procedures such as stent surgery or angioplasty, and these procedures also have high recurrence because of damage to blood vessels.
  • an antiplatelet agent, an anti-ungergic agent, an antiallergic agent, or a drug-treated stent treatment that inhibits tissue regeneration has been clinically attempted, but it has not been given a therapeutic effect.
  • pulmonary arterial hypertension is difficult to diagnose early and progresses slowly because there are no characteristic symptoms or signs that distinguish it from other diseases. It is a disease that takes a long time to develop after initial symptoms and has a high mortality rate.
  • Pulmonary hypertension is a disease in which the blood pressure in the pulmonary arteries increases due to increased blood pressure in the pulmonary arteries that supply blood from the heart to the lungs, and is defined as an average pulmonary artery pressure of 25 mmHg or more.
  • the inventors of the present invention while studying the proliferation process of smooth muscle cells, found that the expression level of FGF12 is closely related to the proliferation of vascular smooth muscle cells, in particular The expression of FGF12 is reduced in damaged blood vessels in which proliferation of active muscle cells is active, and the overexpression of FGF12 in damaged blood vessels confirmed that the proliferation of smooth muscle cells was completed. Therefore, the object of the present invention
  • composition for the treatment of smooth muscle cell proliferative disease comprising as an active ingredient a recombinant expression vector comprising a polynucleotide encoding FGF12.
  • composition for the treatment of smooth muscle cell proliferative disease comprising the FGF12 protein or a fragment thereof as an active ingredient.
  • composition for diagnosing smooth muscle cell proliferative disease comprising an agent for measuring the expression level of FGF12 mRNA or FGF12 protein.
  • compositions for treating smooth muscle cell proliferative diseases comprising a recombinant expression vector comprising a polynucleotide encoding FGF12 as an active ingredient is required. It provides a method for treating smooth muscle cell proliferative disease, characterized in that administered to an individual. Another object of the present invention
  • It provides a method for treating smooth muscle cell proliferative disease comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of a composition for treating smooth muscle cell proliferative disease comprising FGF12 protein or a fragment thereof as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a use of the agent for measuring the expression level of FGF12 m NA or FGF12 protein for the preparation of a diagnostic agent for smooth muscle cell proliferative disease.
  • the present invention provides a method for diagnosing smooth muscle cell proliferative disease, comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of a composition for diagnosing smooth muscle cell proliferative disease, including an agent for measuring the expression level of FGF12 mRNA or FGF12 protein.
  • the present invention to achieve the above object
  • compositions for the treatment of smooth muscle cell proliferative disease comprising as an active ingredient a recombinant expression vector comprising a polynucleotide encoding FGF12.
  • composition for the treatment of smooth muscle cell proliferative disease comprising FGF12 protein or a fragment thereof as an active ingredient.
  • a rating comprising an agent that measures the expression level of FGF12 mRNA or FGF12 protein
  • a composition for diagnosing myocyte proliferative disease Provided is a composition for diagnosing myocyte proliferative disease.
  • the present invention to achieve another object of the present invention
  • a recombinant expression vector comprising a polynucleotide encoding FGF12 for preparing an agent for the treatment of smooth muscle cell proliferative disease.
  • a method for treating smooth muscle cell proliferative disease comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of a composition for treating smooth muscle cell proliferative disease comprising a recombinant expression vector comprising a polynucleotide encoding FGF12 as an active ingredient. to provide.
  • an FGF12 protein or fragment thereof for the manufacture of a formulation for the treatment of F smooth muscle cell proliferative diseases.
  • It provides a method for treating smooth muscle cell proliferative disease comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of a composition for treating smooth muscle cell proliferative disease comprising FGF12 protein or a fragment thereof as an active ingredient.
  • FGF12 mRNA for the preparation of a diagnostic agent for smooth muscle cell proliferative disease or Provided is the use of an agent to measure the expression level of FGF12 protein.
  • a composition for diagnosing smooth muscle cell proliferative disease including an agent for measuring the expression level of FFGF12 mRNA or FGF12 protein, to a subject in need thereof.
  • an agent for measuring the expression level of FFGF12 mRNA or FGF12 protein to a subject in need thereof.
  • the present invention provides a composition for treating smooth muscle cell proliferative disease comprising a recombinant expression vector comprising a polynucleotide encoding FGF12 as an active ingredient.
  • the inventors found for the first time in a series of experiments that FGF12 plays an important role in inhibiting cell proliferation in smooth muscle cells via the p53 signaling system.
  • the composition of the present invention can be used as a gene therapy for treating smooth myocyte proliferative diseases.
  • Gene therapy means treating a disease by delivering a gene having a therapeutic effect to a cell or tissue that is to be treated (or target) and expressing it.
  • Electronic therapeutics can be applied topically to cells or tissues with pathological phenomena, and can be expected to have therapeutic effects due to gene expression for a relatively long time.
  • composition of the present invention is a recombinant expression vector comprising a polynucleotide encoding FGF12 as an active ingredient, and is intended to inhibit the proliferation of smooth muscle cells by delivering and overexpressing the FGF12 gene to proliferating smooth muscle cells.
  • 'treatment' refers to inhibiting the occurrence or recurrence of the disease, alleviating the symptoms, reducing the direct or indirect pathological consequences of the disease, decreasing the rate of disease progression, improving the disease state, improving, alleviating or improving the prognosis. do.
  • the term 'prevention' means any action that inhibits the onset or delays the progression of a disease.
  • 'Smooth musc le cel l refers to muscle cells of smooth muscle.
  • 'Smooth muscle' is a muscle without horizontal pattern, also called a min muscle.
  • the muscle walls of the visceral muscles other than the heart such as the gastrointestinal tract, respiratory tract, blood vessels, bladder and uterus, are all smooth muscles. Smooth muscle cannot move consciously, and the contraction of smooth muscle is directly controlled by the autonomic nervous system and is affected by hormones.
  • the smooth muscle cell of the present invention may be preferably vascular smooth muscle cel l (VSMC).
  • VSMC vascular smooth muscle cel l
  • Vascular smooth muscle cells are the cells that make up the smooth muscles of blood vessels.
  • vascular smooth muscle cells express high levels of contractile le genes such as SMA, SM22 ⁇ , SM-MHC, and SM-calponin in healthy normal state, and rarely proliferate them. .
  • cell proliferation and migration become active, The synthesis and secretion of matr ix) increases, and so on.
  • the smooth muscle cell proliferative disease in the present invention refers to a disease caused by excessive proliferation of smooth muscle cells.
  • the smooth muscle cell proliferative disease in the present invention may be preferably a vascular smooth muscle cell proliferative disease.
  • the vascular smooth muscle cell proliferative diseases include stenosis is, stenosis, pulmonary hypertension, arteriosclerosis, and atherosclerosis, which are directly caused by the proliferation of vascular smooth muscle cells.
  • Cardiovascular diseases that are secondary or aggravated by symptoms include heart failure, myocardial infarction, angina pectoris, arrhythmia, congenital heart disease, stroke, and peripheral vascular stenosis.
  • Vascular smooth muscle cell proliferative disease in the present invention is preferably vascular stenosis, vascular restenosis, pulmonary hypertension, arteriosclerosis, atherosclerosis.
  • Stenosi s is an abnormal narrowing of blood vessels and reduced blood flow due to inflammation, thrombosi s, and excessive proliferation of smooth muscle cells after damage to the vessel wall. It is a disease. Restenosi s is a recurrence of vascular stenosis, which often occurs after vascular stenosis, such as expanding the lumen or passing a blocked vessel to resolve vascular stenosis.
  • Angioplasty such as stent / bal loon angioplasty
  • vascular bypass surgery such as coronary artery bypass surgery (vascular bypass or vascular graft) may damage the blood vessels by the procedure itself. Or .. Knowing inflammation causes vascular stenosis.
  • Atherosclerosis is a disease in which fat is deposited or fibrosis on the inner layer of arteries.
  • Vascular restenosis which occurs after stent insertion for progression of arteriosclerosis and expansion of blood vessels, is associated with the proliferation, migration and extracellular matrix secretion of vascular smooth muscle cells. It is known to be caused by.
  • the smooth muscle cells move to the inner membrane to proliferate and It is a state characterized by the secretion of matrix, such as collagen, and results in neointimal hyperplasia, which forms a neointimal layer and continues to proliferate.
  • matrix such as collagen
  • pulmonary arterial hypertension is a disease in which the blood pressure of the pulmonary arteries, which supplies blood from the heart to the lungs, increases, which impedes blood circulation in the lungs.
  • Pulmonary hypertension is diagnosed when pulmonary artery pressure is more than 25mmHg in stable state and / or 30mmHg in exercise state, and confirmed by echocardiography, electrocardiogram, ECG, and foot test.
  • Pulmonary hypertension is divided into idiopathic, with no separate causative disease, and secondary, resulting from primary causative disease.
  • the main cause of pulmonary hypertension is abnormal proliferation of smooth muscle cells that make up pulmonary artery vessels, resulting in enlarged vascular walls, narrowing of the vascular lumen, narrowing of the vascular lumen, and vascular remodeling such as vasoconstriction. The function is further degraded. If it continues, blood clots may develop inside the blood vessels, and the blood vessels are released through the narrowed pulmonary arteries, causing an overload of the heart, which causes symptoms such as difficulty breathing, chronic fatigue, and chest pain. Heart attack may occur.
  • Hereditary pulmonary hypertension (her i table PAH), which accounts for about 15-20% of pulmonary hypertension, is associated with autosomal dominant mutations in TGF-beta superfami ly genes such as BMPR2 and ALK1. Mutations in these genes are also found in many non-hereditary patients with pulmonary hypertension.
  • pulmonary hypertension treatments for pulmonary hypertension include endothel in receptor antagonists such as Bosentan and Ambrisentan, which act on vascular endothelial cells to inhibit vascular expansion or inhibit contraction, and phosphodiesterases such as Sildenafil and Tadalaf i 1.
  • Prostacyclin receptor agonists such as the -5 inhibitor, I loprost and Treprost ini 1 Epoprostonol, have been developed, but more than 80% of patients with pulmonary hypertension have been reported not to respond to vasodilation therapy (Archer SL et al., Circulation (2010), 121: 2045-2066). In these non-responders, blood vessel dilation and blood pressure drop lower the risk of worsening of cardiac output.
  • 'FGF12' means fibroblast growth factor 12, and may also be referred to as FGF12, FGF12B, FHF1, and the like.
  • FGF12 fibroblast growth factor 12
  • FGF12B fibroblast growth factor 12
  • FGF12B fibroblast growth factor 12
  • FGF12B fibroblast growth factor 12
  • FGF12B fibroblast growth factor 12
  • FGF12B fibroblast growth factor 12
  • FGF12B FGF12B
  • FHF1 fibroblast growth factor 12
  • FGF12 is similar in sequence and structure to other fibroblast growth factors (FGFs), but lacks the N-terminal secretion signal sequence. It exists in the cytoplasm and does not activate the FGF receptor on the cell surface. FGF12 is thus classified as a fibroblast growth factor (FGF homologous factor, FHF). Little is known about the biological function of FHF to which FGF12 belongs. High levels of FHF are expressed in developing, mature, and nervous systems of humans, mice, and chickens. Impaired function of FHF has been reported to cause neurological and behavioral abnormalities (Pablo JL et al., Neuroscientist pi i : 1073858414562217.) Very little research has been conducted on the function of FHF or related signaling systems outside the nervous system.
  • FGF homologous factor FGF homologous factor
  • FGF12 performs an important function in inhibiting the proliferation of smooth muscle cells. Smooth muscle cell proliferation inhibitory effect by the FGF12 It is in stark contrast to other previously known FGFs that promote the division and proliferation of various cells.
  • FGFs of FGF fami ly other than FHF for example FGF1, and also called bFGF (basi c FGF) have been shown to promote vascular smooth muscle cell proliferation through various signaling systems (Nabel EG et al. , Nature 362: 844-6, Reidy MA et al., Circulation 86: 11143-6). Specific functions of the FGF12 revealed by the inventors are as follows.
  • FGF12 is reduced by factors that promote the proliferation of smooth muscle cells. Stimulation of smooth muscle cells with platelet-derived growth factor subunit B homodimer, PDGF-BB; 50ng / ml) BB or serum (FBS; 10%) increased smooth muscle cell division. , Expression of FGF12 was significantly decreased. Signaling inhibition experiments showed that the decrease in FGF12 expression by PDGF-BB was mediated by the PI3 kinase signaling system. In another embodiment of the present invention it was confirmed that FGF12 inhibits the division of smooth muscle cells. FGF12 inhibits the proliferation of smooth muscle cells is an unexpected effect that other members of the FGF family, such as FGF1 or FGF2 is known to promote cell proliferation in a variety of cells.
  • FGF12 inhibited the expression of genes such as CDKl, CDK2, CCNA2, CDC6, CDC20 which are involved in cell cycle progression. Also, in the smooth muscle cells transformed with pCMV6 recombinant expression vector containing FGF12 operably linked, the cell cycle did not progress and the proportion of cells in the G1 phase was significantly higher than that of the control group.
  • FGF12 is overexpressed in smooth muscle cells stimulated with PDGF-BB or FBS, which are proliferation promoters of smooth muscle cells, it was confirmed that the proliferation of smooth muscle cells induced by the growth promoters is inhibited. The inhibitory effect of FGF12 on smooth muscle cell proliferation was also confirmed by FGF12 siRNA inhibition experiment.
  • the present inventors found that the effect of the above-described FGF12 on smooth muscle cells in another embodiment is mediated by the p53 signaling system.
  • Analysis of genes differentially expressed in smooth muscle cells overexpressing FGF12 revealed a number of genes whose transcription is regulated by p53, and phosphorylated P53 is very similar to FGF12 in damaged arterial tissues that overexpress FGF12. It was observed to be expressed in a similar pattern.
  • siRNA or inhibitor compounds pi fi thrin; ⁇ ⁇
  • Ad-FGF12 adenovirus
  • FGF12 has a therapeutic effect of inhibiting the proliferation of vascular smooth muscle cells.
  • Inflammatory catheter in the common carotid artery caused vascular damage and infection with adenovirus to overexpress FGF12, resulting in neoin imal area and intima-medial area rat IoM, I / M), luminal stenosis, etc. were significantly decreased.
  • the present inventors also showed that the effects of FGF12 on cell division and proliferation were smooth muscle cell-specific and did not affect endothelial cells.
  • vascular smooth muscle cells or vascular endothelial cells were infected with Ad-FGF12 and overexpressed FGF12, vascular smooth muscle cells expressing Ki67, a marker of cell proliferation, were markedly reduced, but not in HUVEC cells expressing Ki67. There was no change in numbers.
  • the inhibitory effect of FGF12 on cell proliferation is specific to smooth muscle cells, and does not affect endothelial cells closely located to smooth muscle cells in blood vessels. Therefore, using the present invention, it is expected to develop a therapeutic agent for smooth muscle cell proliferative diseases which can minimize side effects in neighboring cells and differentiate from other smooth muscle cell proliferation inhibitors that inhibit the proliferative activity of existing vascular endothelial cells. can do.
  • the composition for treatment of smooth muscle cell proliferative disease of the present invention comprises a recombinant expression vector comprising a polynucleotide encoding FGF12 as an active ingredient.
  • a 'polynucleotide' or 'nucleic acid' is a deoxyribonucleotide (DNA) or ribonucleotide in the form of a single- or double-stranded strand. (RNA).
  • DNA deoxyribonucleotide
  • RNA ribonucleotide
  • known analogues of natural nucleotides are also included that are localized to nucleic acids in a manner similar to naturally occurring nucleotides.
  • the polynucleotide encoding the FGF12 of the present invention may be derived from a mammal, and preferably may be derived from a human.
  • the polynucleotide encoding the FGF12 may include a sequence of human FGF12 mRNA, and most preferably, may include a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3.
  • the polynucleotide encoding FGF12 also includes a sequence showing substantial identity with the sequence of human FGF12 mRNA, preferably the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3.
  • "Substantial identity" means at least 70 when aligning any other sequence to be compared with the human FGF12 mRNA sequence to the maximum, and comparing the sequences using analysis methods and algorithms commonly used in the art. By a sequence showing at least% homology.
  • the protein encoded by the base sequence substantially the same as the FGF12 mRNA base sequence may be a FGF12 protein, preferably a protein comprising an amino acid represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, or may be a functional equivalent of the FGF12 protein.
  • a 'functional equivalent' is a polypeptide that has at least 70%, preferably at least 80%, more preferably at least 90% sequence homology (ie, identity) with the amino acid sequence of the FGF12 of the present invention, substantially with FGF12 Refers to a polypeptide exhibiting homogeneous physiological activity.
  • Substantially homogeneous physiological activity refers to activity that induces and maintains smooth muscle cell normal traits by a mechanism such as inhibiting smooth muscle cell proliferation and migration by being expressed in smooth muscle cell.
  • 'expression' refers to the production of a protein or nucleic acid in a cell
  • a recombinant expression vector is a vector capable of expressing a target protein or nucleic acid (RNA) in a suitable host cell, wherein the polynucleotide (gene) Gene constructs comprising essential regulatory elements operably linked to express an insert.
  • "Operably l inked” means that the nucleic acid expression sequence and the nucleic acid sequence encoding the protein or RNA of interest are functionally linked to perform a general function.
  • Genes can be expressed by sequence It is also meant to be connected.
  • An expression control sequence refers to a DNA sequence that controls the expression of a polynucleotide sequence operably linked in a particular host cell.
  • Such regulatory sequences include promoters for performing transcription, any operator sequence for controlling transcription, sequences encoding suitable mRNA ribosomal binding sites, sequences controlling termination of transcription and translation, initiation codons, termination codons, polyadenylation Signal and enhancer.
  • Recombinant expression vector of the present invention is a vector commonly used in the field of cloning, in particular in the field of gene therapeutics, if one of ordinary skill in the art can be selected is not particularly limited, such as plasmid vector, cosmid vector, bacterio Phage vectors and viral vectors, and the like.
  • Recombinant vectors can be prepared using genetic recombination techniques well known in the art, and site-specific DNA cleavage and ligation uses enzymes commonly known in the art.
  • the recombinant expression vector according to the present invention is a gene construct that includes all of the polynucleotides encoding FGF12 and essential expression control sequences for expressing FGF12 in smooth muscle cells and is operably functionally linked thereto.
  • the recombinant expression vector of the present invention may include a selection marker and / or a rep icat ion origin for selecting a recombinant expression vector producer host cell, and the expression vector may further include an expression control sequence, It includes signal sequence, leader sequence, etc. for membrane targeting or secretion, and includes a reporter or marker gene sequence for showing and confirming smooth muscle cell specific contractility. Can be prepared.
  • the recombinant expression vector according to the present invention may be a recombinant viral vector.
  • the recombinant viral vector of the present invention may be used without limitation as long as it is a viral vector commonly used for delivering genes in the field of gene therapy.
  • the recombinant viral vector may be selected from the group consisting of adenovirus vector, adeno-associated virus (AAV) vector, retrovirus vector, herpesvirus vector, lentivirus vector, vaccinia virus vector and poxvirus vector.
  • the recombinant viral vector in the present invention is preferably an adenovirus vector Can be.
  • Adenoviruses are widely used in the field of gene therapy because of their medium genome size, ease of genetic manipulation and manufacturing, ease of production and isolation due to high titers, and a wide range of target cells and high infection efficiency. It is widely used as a carrier for delivering therapeutic genes.
  • Adenoviruses which lack the ability to self-replicate and produce viruses, are widely used for gene therapy.
  • composition for the treatment of smooth muscle cell proliferative disease comprising a recombinant expression vector comprising a polynucleotide encoding the FGF12 of the present invention as an active ingredient may be applied in vivo through various transportation methods known in the field of gene therapy. For example, naked DNA inj ect ion, electroporat ion, gene gun, sonoporat ion using ultrasonic waves, magnetofect ion using electromagnetic fields, liposomes (1 gene delivery using a structure such as iposome) or nanoparticles (nanopart ic le), gene delivery using a virus, etc.
  • the composition of the present invention is preferably a smooth muscle cell using a virus, most preferably an adenovirus.
  • compositions according to the invention take into account various factors such as the formulation method, mode of administration, age, weight, sex of the patient, severity of the disease, food, time of administration, route of administration, duration of treatment, rate of excretion and response sensitivity. Can be adjusted appropriately. One skilled in the art can determine and prescribe a therapeutically effective dosage in view of these factors.
  • the composition of the present invention may contain, for example, 1 X 10 5 to 1 X 10 15 pfu / adenovirus comprising a polynucleotide encoding FGF12.
  • adenovirus comprising a polynucleotide encoding FGF12 in a rat model of vascular injury due to balloon injury is injected once into the damaged blood vessel site at a concentration of IX 10 7 pfu / m, and treated by FGF12 expression after 2 weeks. The effect was confirmed.
  • the composition according to the invention may be administered orally or parenterally but preferably may be administered parenterally.
  • Parenteral administration methods include, but are not limited to, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intradural, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, topical, sublingual, or rectal administration And preferably intravascular Yes you can.
  • the composition of the present invention may be formulated in various ways according to the route of administration by a method known in the art together with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • 'Pharmaceutically acceptable' is a non-toxic drug that is physiologically acceptable and, when administered to humans, does not inhibit the action of the active ingredient and does not normally cause allergic reactions such as gastrointestinal disorders, dizziness or similar reactions. Refers to the composition.
  • Such carriers include all kinds of solvents, dispersion media, oil-in-water or water-in-oil emulsions, aqueous compositions, liposomes, microbeads and microsomes.
  • the composition of the present invention may be formulated according to methods known in the art in the form of injections, transdermal and nasal inhalants with suitable parenteral carriers. Injectables must be sterilized and protected from contamination of microorganisms such as bacteria and fungi.
  • suitable carriers for injectables include, but are not limited to, solvents comprising water, ethanol, poly (e.g., glycerol, propylene glycol and liquid polyethylene glycols, etc.), combinations thereof and / or vegetable oils, or It may be a dispersion medium. More preferably, suitable carriers include Hanks' solution, Ringer's solution, PBS (hosphate buffered saline) containing triethanol amine or sterile water for injection, isotonic solution such as 10% ethanol, 40% propylene glycol and dextrose, and the like. Can be used.
  • solvents comprising water, ethanol, poly (e.g., glycerol, propylene glycol and liquid polyethylene glycols, etc.), combinations thereof and / or vegetable oils, or It may be a dispersion medium. More preferably, suitable carriers include Hanks' solution, Ringer's solution, PBS (hosphate buffered saline) containing triethanol amine or ster
  • transdermal administrations ointments, creams, lotions, gels, external preparations, pasta preparations, liniment preparations, aerosol preparations and the like are included.
  • transdermal administration means that the composition of the present invention is administered locally to the skin so that an effective amount of the active ingredient contained in the composition is delivered into the skin.
  • composition of the present invention may be prepared into an injectable formulation, which may be administered by lightly pricking or directly applying the skin with a 30 gauge thin needle.
  • injectable formulation which may be administered by lightly pricking or directly applying the skin with a 30 gauge thin needle.
  • these formulations are formulated generally in pharmaceutical chemistry (Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edison, 1975, Mack Publishing Company, East on, Pennsylvania.
  • the compounds used according to the invention may be prepared by pressurized packs or by means of suitable propellants, for example dichlorofluoromethane, trichlorofluoromethane, dichlorotetrafluoroethane, carbon dioxide or other suitable gas. It can be delivered conveniently from the nebulizer in the form of an aerosol spray.
  • the dosage unit can be determined by providing a valve to deliver a metered amount.
  • gelatin capsules and cartridges for use in inhalers or blowers may be formulated to contain a compound and a powdered mixture of suitable powder based such as lactose or starch.
  • suitable powder based such as lactose or starch.
  • Other pharmaceutically acceptable carriers may be referred to those described in Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, East on, PA, 1995.
  • the compositions according to the invention may also contain one or more complete agents (e.g. saline or PBS), carbohydrates (e.g. glucose, mannose, sucrose or dextran), antioxidants, bacteriostatic agents, chelating agents (e.g.
  • compositions of the present invention may be formulated in various ways using methods known in the art to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to a mammal.
  • the composition of the present invention can be administered in combination with a known compound that is effective in treating smooth muscle cell proliferative diseases.
  • the composition of the present invention can be administered in the same manner as a conventional vascular procedure.
  • the present invention provides a composition for the treatment of smooth muscle cell proliferative disease comprising the FGF12 protein or a fragment thereof as an active ingredient.
  • FGF12 protein is compatible with 'polypeptide' or 'peptide tide' Used sexually, for example, it refers to polymers of amino acid residues as are commonly found in natural proteins.
  • a 'fragment' of FGF12 protein refers to a peptide of a portion of the FGF12 protein.
  • the FGF12 protein may be derived from a mammal, and may preferably be derived from a human.
  • the FGF12 protein of the present invention may include an amino acid sequence of human FGF12 protein, that is, an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4.
  • FGF12 protein included in the composition of the present invention refers to a protein having a physiological activity substantially equivalent to the FGF12 protein.
  • Proteins having substantially equivalent physiological activity include funct ional equivalents and functional derivatives of the FGF12 protein.
  • the "functional equivalent” refers to a polypeptide that exhibits physiological activity substantially equivalent to that of the FGF12 protein, and also includes fragments of the FGF12 protein.
  • Substantially equivalent physiological activity refers to activity that inhibits the division and proliferation of smooth muscle cells when delivered into smooth muscle cells.
  • the functional equivalent is at least 70%, preferably at least 80% , more preferably at least 90% sequence homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4
  • the functional equivalent may be a polypeptide having a homology.
  • the functional equivalent may be, for example, a polymorphi sm protein of FGF12, such as SNKsmal l nucleotide polymorphism, which has a substantially equivalent physiological activity to the FGF12 protein.
  • the functional equivalent may be generated as a result of addition, substitution or deletion of part of the amino acid sequence of the FGF12 protein of the present invention. Substitution of the amino acid in the above is preferably a conservative substitution.
  • amino acids examples include conservative substitutions of naturally occurring amino acids as follows: aliphatic amino acids (Gly, Ala, Pro), hydrophobic amino acids (l ie, Leu, Val), aromatic amino acids (Phe, Tyr, Trp), acidic amino acids ( Asp, Glu), basic amino acids (Hi s, Lys, Arg, Gin, Asn) and sulfur containing amino acids (Cys, Met).
  • the functional equivalents also include variants in which some of the amino acids are deleted on the amino acid sequence of the FGF12 protein of the invention. Deletion or substitution of the amino acid is preferably located in a region not directly related to the physiological activity of the protein of the invention. In addition, deletion of amino acids is preferably not directly involved in the physiological activity of the FGF12 protein of the present invention.
  • the FGF12 protein of the present invention may further include a chemical functional group or a cell-penetrating peptide (cel l-penetrating peptide) (CPP) for effective delivery into smooth muscle cells while maintaining the basic skeleton and physiological activity.
  • CPP cell-penetrating peptide
  • the cell permeable peptide is a peptide having an amino acid sequence which can itself pass through the phospholipid bilayer structure of the cell membrane or promote endocytosis, for example, a TAT-derived peptide of the HIV virus, VP22, peptides derived from transport an, penetrat in and the like, cell membrane permeable signal sequences, peptides containing a large amount of positively charged amino acids such as arginine / lysine, amphipathic peptide carriers, etc.
  • the FGF12 protein of the present invention can be constructed by genetic engineering methods. First, a DNA sequence encoding the FGF12 protein is constructed according to a conventional method. DNA sequences can be constructed by amplification by PCR using appropriate primers.
  • the constructed DNA sequence is inserted into a vector comprising one or more expression control sequences (eg, promoters, enhancers, etc.) that are operably linked to the DNA sequence to regulate expression of the DNA sequence.
  • expression control sequences eg, promoters, enhancers, etc.
  • the resulting transformants are cultured under media and conditions suitable for the DNA sequence to be expressed to recover substantially pure polypeptides encoded by the DNA sequences from the culture.
  • the recovery can be carried out using methods known in the art (eg chromatography).
  • substantially pure polypeptide means that the polypeptide according to the present invention does not substantially contain any other protein derived from a host cell.
  • FGF12 protein of the invention may be ⁇ you combine chemically with techniques known in the art (Creighton, Proteins: Structures and Molecular Principles, WH Freeman and Co., NY (1983 )). That is, the FGF12 protein of the present invention can be prepared using conventional stepwise liquid or solid phase synthesis, fragment condensation, F-M0C or T-B0C chemistry (Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et. al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, (1997); A Practical Approach, Atherton & Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, (1989).
  • Recombinant peptides or chemically synthesized peptides prepared by genetic engineering methods are for example extracted, recrystallized, various chromatographic (gel filtration, subsequent exchange, precipitation, adsorption, reverse phase), electrophoresis, countercurrent distribution. It can be separated and purified by methods known in the art, such as.
  • the composition according to the invention can be used on its own or in the form of a salt, preferably a pharmaceutically acceptable salt.
  • 'pharmaceutically acceptable' refers to a physiologically acceptable and normally does not cause an allergic reaction or the like when administered to a human, and the salt may be used as a pharmaceutically acceptable free acid. Acid addition salts formed by acid) are preferred.
  • Organic acids and inorganic acids may be used as the free acid.
  • the organic acid is not limited thereto, citric acid, acetic acid, lactic acid, tartaric acid, maleic acid, fumaric acid, formic acid, propionic acid, oxalic acid, trifluoroacetic acid, benzoic acid, gluconic acid, metasulfonic acid, glycolic acid, succinic acid, 4-lluene Sulfonic acid, glutamic acid and aspartic acid.
  • the inorganic acid includes, but is not limited to, hydrochloric acid, bromic acid, sulfuric acid and phosphoric acid.
  • composition of the present invention may be formulated in various ways according to the route of administration by a method known in the art together with a pharmaceutically acceptable carrier to produce the proliferation inhibitory effect of smooth muscle cells.
  • a pharmaceutically acceptable carrier include all kinds of solvents, dispersion media, oil-in-water or water-in-oil emulsions, aqueous compositions, liposomes, microbeads and microsomes.
  • the pharmaceutical Specific examples of the carrier are as described elsewhere in the specification.
  • the route of administration may be administered orally or parenterally.
  • Parenteral administration methods include, but are not limited to, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intradural, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, topical, sublingual or rectal administration Can be. Specific examples of such routes of administration are as described elsewhere in the specification.
  • the composition comprising the FGF12 protein or a fragment thereof according to the present invention may be administered to a patient in an amount exhibiting a therapeutic effect. Typical daily doses may be administered in the range of about 0.0001 to 100 mg / kg.
  • the composition of the present invention may be administered once or in divided doses within the desired dosage range.
  • the dosage of the composition according to the present invention may be appropriately selected depending on the route of administration, administration target, age, gender weight, individual difference and disease state.
  • the present invention provides a composition for diagnosing smooth muscle cell proliferative disease, including an agent for measuring the expression level of FGF12 mRNA or FGF12 protein.
  • FGF12 mRNA or FGF12 protein.
  • High levels of FGF12 are expressed in smooth muscle cells of healthy blood vessels, but the expression of FGF12 is significantly reduced in smooth muscle cells proliferating in blood vessels that are damaged by vascular procedures or undergo arteriosclerosis.
  • the expression level of FGF12 is greatly reduced by PDGF-BB which promotes the proliferation of smooth muscle cells.
  • Diagnosis' means identifying the presence or characteristic of a pathological condition. Diagnosis in the present invention is to determine the presence or absence of the pathology of the smooth muscle cell proliferative disease to determine whether or not the onset.
  • the agent for measuring the expression level of FGF12 mRNA in the diagnostic composition of the present invention may be a probe or primer set that specifically binds to FGF12 mRNA.
  • the FGF12 mRNA may preferably include a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3.
  • a 'primer' is a single stranded oligonucleotide that acts as a starting point for DNA synthesis.
  • the primer specifically binds to a polynucleotide that is template at appropriate buffer and temperature conditions, and the DNA polymerase is linked to the primer by adding a nucleoside triphosphate having a base complementary to the template DNA. Is synthesized.
  • the primer is generally composed of 15 to 30 base sequences, and the melting temperature (T) is different depending on the base composition and length.
  • the sequence of the primer does not need to have a sequence that is completely complementary to some nucleotide sequences of the template, and is sufficient as long as it has sufficient complementarity within a range that can be hybridized with the template to perform a primer-specific function. Therefore, in the present invention, the primer for measuring the expression level of FGF12 mRNA does not need to have a sequence that is perfectly complementary to the FGF12 gene sequence, and amplifies a specific section of FGF12 mRNA or FGF12 cDNA through DNA synthesis to FGF12 mRNA. It is sufficient to have a length and complementarity suitable for the purpose of measuring the amount of.
  • the primer for the amplification reaction is composed of a set (pair) of complementary binding to the template (or sense) and the opposite (antisense, ant isense) at both ends of a specific section of the FGF12 mRNA to be amplified .
  • Primers can be easily designed by those skilled in the art by referring to FGF12 mRNA or cDNA sequences.
  • the FGF12 mRNA in the present invention preferably comprises a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3
  • the primer of the present invention is preferably specific to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: It may be one set or a pair, and most preferably, a set of base sequences represented by SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16.
  • Probes are short to several hundred base pairs in length that can specifically bind mRNA or cDNA (compIementary DNA) of specific genes.
  • a probe complementary to FGF12 mRNA can be used for the diagnosis of smooth muscle cell proliferative disease by measuring the expression level of FGF12 mRNA by performing a hybridization reaction with a sample of a subject.
  • the choice and probe conditions of the probe may be appropriately selected according to techniques known in the art. Primers or probes of the present invention can be chemically synthesized using phosphoramidite solid support synthesis or other well known methods.
  • primers or probes can be variously modified according to methods known in the art within a range that does not prevent the hybridization with FGF12 mRNA.
  • modifications include methylation, encapsulation, substitution of one or more homologs of natural nucleotides and modifications between nucleotides, such as uncharged linkages (e.g., methyl phosphonates, phosphorus esters, phosphoramidates, Carbamate, etc.) or charged connectors (eg, phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.), and binding of labeling materials using fluorescence or enzymes.
  • uncharged linkages e.g., methyl phosphonates, phosphorus esters, phosphoramidates, Carbamate, etc.
  • charged connectors eg, phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.
  • the agent for measuring the expression level of the FGF12 protein in the diagnostic composition of the present invention may be an antibody that specifically binds to the FGF12 protein.
  • the FGF12 protein may preferably include an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4.
  • the antibody in the present invention is an antibody that specifically binds only to FGF12 protein without reacting with other proteins including FGF other than FGF12.
  • FGF12 antibodies can be prepared by cloning the FGF12 gene in an expression vector to obtain a protein encoded by the gene, and from the protein obtained according to conventional methods in the art.
  • the antibody includes a polyclonal ant ibody or a monoclonal ant ibody, and includes all immunoglobulin antibodies that specifically bind to FGF12.
  • the FGF12 protein preferably comprises an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, and is specific for the FGF12 protein in the present invention.
  • the antibody that binds to may be an antibody that specifically binds to a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4.
  • the present invention to provide information necessary for the diagnosis of smooth muscle cell proliferative disease,
  • Step (c) of the method of the present invention is a step of providing a sample of a subject.
  • the sample of the subject of step (a) may be smooth muscle cells or tissues or blood containing smooth muscle cells, preferably vascular smooth muscle cells or blood vessels.
  • the sample of the present invention may be derived from a mammal, and preferably may be derived from a human.
  • Samples of the subject may be collected and provided according to techniques known in the art, and for example, blood vessels or blood resected during a vascular procedure may be provided as a sample.
  • the sample of the subject may be appropriately pretreated as known in the art according to the method of measuring the expression level of FGF12.
  • the sample of the subject may be fixed in a fixed solution such as formalin or fixed, or may be rapidly frozen with liquid nitrogen and frozen at -20 ° C or -701C. Tissue sections can also be made and stored from fixed or immobilized samples.
  • Step (b) of the method of the present invention is a step of measuring the expression level of FGF12 in the sample provided in step (a). Measuring the expression level of FGF12 in step (b) may be to measure the expression level of FGF12 mRNA.
  • the expression level of FGF12 mRNA was measured by amplifying FGF12 mRNA or cDNA from a sample of a subject using a primer set or a probe that specifically binds to FGF12 mRNA, or by using a hybridization reaction with a probe. The presence and expression of FGF12 mRNA in the sample can be measured.
  • the primer and probe are as described in the diagnostic composition of the present invention.
  • Determination of FGF12 mRNA expression level can be used without limitation to the conventional expression level confirmation method in the art, and examples of analytical methods such as reverse transcription polymerase chain react ion (RT-PCR), competitive RT ⁇ PCR (competitive) RT-PCR, real-time RT-PCR, RNase protection assay (RPA), Northern blotting, DNA microarray chip, RNA sequencing RNA sequencing, nanostring, and in situ hybridization of tissue sections, but are not limited thereto.
  • step (b) may be to measure the expression level of the FGF12 protein.
  • the expression level of FGF12 protein can be detected or measured using an antibody that specifically binds to FGF12 protein.
  • the antibody is as described in the diagnostic composition of the present invention.
  • Method for measuring the expression level of FGF12 protein can be used without limitation methods known in the art, such as western blotting, dot blotting, enzyme immunoassay (enzyme— 1 inked immunosorbent assay) ), Radioimmunoassay (RIA), radioimmunoassay, oukteroni immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, immunohistochemical staining, immunoprecipitation, complement fixation assay, flow cytometry (FACS) or protein Chip method and the like, but is not limited to these.
  • step (c) of the method of the present invention the level of FGF12 expression in the sample measured in step (b) is compared with a normal person, and a subject with reduced FGF12 expression level compared to a normal person has a smooth muscle cell proliferative disease or This is a step of determining that there is a possibility of getting caught.
  • the expression level of FGF12 of the subject was measured by the method of step (b), and the expression level of FGF12 of the normal subject was measured by the same method, and the expression level of FGF12 of the subject and the normal subject were compared.
  • healthy normal smooth muscle cells hardly proliferate and express high levels of FGF12, but the expression level of FGF12 in smooth muscle cells proliferating due to vascular damage or disease is significantly lowered. Therefore, it can be determined that smooth muscle cells proliferate when the expression level of FGF12 in the subject decreases compared to the normal subject.
  • the decrease in the expression level of FGF12 it may be determined that there is a possibility of developing smooth muscle cell proliferative disease, or the disease is already in progress or intensified.
  • the degree of decrease in the expression level of FGF12 which is a standard of diagnosis, may be determined by dividing the grade of expression according to a technique known in the art for a specific expression level measurement method.
  • the normal and smooth muscle cell proliferative disease categories are measured according to the level of FGF12 expression level by accumulating and analyzing data by measuring the expression level of FGF12 in a sample of a large number of normal people and patients.
  • the criteria for diagnosis may be divided into categories of the likelihood of occurrence. Specifically the method of the present invention is well illustrated in the Examples.
  • a diminished smooth muscle cell expressing Ki67 is significantly increased in the general carotid artery of the rat injured with a balloon bale embolectomy catheter as compared to a normal artery intact. It was confirmed by immunofluorescence staining that the protein expression level of FGF12 was greatly reduced. As vascular damage recovered, the number of dividing smooth muscle cells decreased and the level of FGF12 protein expression increased to a level similar to that of the normal state. The trend of decreasing and increasing FGF12 expression level by vascular injury and recovery was also confirmed by mRNA level by RT-PCR.
  • the present invention provides the use of a recombinant expression vector comprising a polynucleotide encoding FGF12 for the preparation of a formulation for the treatment of smooth muscle cell proliferative diseases.
  • the present invention provides a smooth muscle cell proliferative effect, comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of a composition for treating smooth muscle cell proliferative disease comprising a recombinant expression vector comprising a polynucleotide encoding FGF12 as an active ingredient.
  • Provide disease treatment provides the use of the FGF12 protein or fragment thereof for the preparation of a preparation for the treatment of smooth muscle cell proliferative disease.
  • the present invention provides a method for treating smooth muscle cell proliferative disease comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of a composition for treating smooth muscle cell proliferative disease comprising FGF12 protein or a fragment thereof as an active ingredient. .
  • the present invention provides the use of an agent for measuring the expression level of FGF12 mRNA or FGF12 protein for the preparation of a diagnostic agent for smooth muscle cell proliferative disease.
  • the present invention provides a method for diagnosing smooth muscle cell proliferative disease comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of a composition for diagnosing smooth muscle cell proliferative disease, including an agent for measuring the expression level of FGF12 mRNA or FGF12 protein. .
  • smooth muscle cell proliferation Improvement, treatment, prevention, of disease refers to an amount that exhibits a detection or diagnostic effect
  • the term 'individual' may be an animal, preferably a mammal, particularly an animal including a human, or may be a cell, tissue, organ or the like derived from an animal.
  • the subject may be a patient in need of treatment.
  • treatment' of the present invention refers generically to ameliorating the symptoms of smooth muscle cell proliferative diseases, which may include treating, substantially preventing, or ameliorating the condition, and smooth muscle cells. Ameliorating, healing or preventing one symptom or most symptoms resulting from a proliferative disease, including but not limited to.
  • the present invention provides a composition for the prevention, treatment, and diagnosis of smooth muscle cell proliferative disease using FGF12 and a diagnostic marker detection method for smooth muscle cell proliferative disease using the same.
  • polynucleotides encoding FGF12 can be used to induce overexpression of FGF12 in smooth muscle cells or to deliver FGF12 protein or fragment thereof to smooth muscle cells to effectively inhibit the proliferation of smooth muscle cells.
  • the diagnostic composition and diagnostic marker detection method for measuring the expression level of FGF12 of the present invention is useful for diagnosing smooth muscle cell proliferative diseases such as vascular narrowing, restenosis, pulmonary hypertension and atherosclerosis due to vascular procedures.
  • FIG. 1 shows the results of experiments confirming the expression trend of FGF12 over time after injury in the rat carotid artery injured by bal loon injury.
  • 1A shows the results of immunofluorescence staining of carotid arteries of damaged rats against Ki67 (red), FGF12 (green), and ⁇ -SMA (red). Cell nuclei were stained with DAPI blue), NC indicated negative control and scale bar was 50 ⁇ .
  • 1B shows RT-PCR results showing mRNA levels of FGF12 and smooth muscle cell (SMC) marker genes (SM-MHC, SM22 ⁇ , SRF). GAPDH is a loading control.
  • Figure 2 shows the results of experiments confirming the trend of FGF12 expression in the arteries and human arteries undergoing atherosclerosis.
  • FIG. 2A shows ApoE_ / given 12 weeks of normal diet (ND) or high fat diet (HFD)
  • ND normal diet
  • HFD high fat diet
  • FIG. 2B shows the results of immunofluorescence staining stained human normal artery (Normal) and atherosclerotic artery (Pat ient) tissue for FGF12 green), ⁇ -SMA (red).
  • NC indicates negative ive control
  • scale bar is ⁇ ⁇ ⁇ .
  • Figure 3 shows the results of experiments confirmed the trend of FGF12 expression in pulmonary vascular smooth muscle cells of the pulmonary arterial hypertension animal model prepared by injecting monocrotalin (monocrotal in, MCT) in the rat.
  • FIG. 3A shows immunofluorescence staining for FGF12 in lung tissue 5 weeks after sal ine or monochromatin (MCT) injection.
  • Figure 3B is a result of analyzing the mRNA expression of FGF12 in pulmonary hypertension animal model via RT-PCR, showing that the expression of FGF12 in pulmonary arterial hypertension animal model markedly decreased as in immunofluorescence staining.
  • 4 is an experimental result showing that the expression of FGF12 is regulated by PDGF-BB.
  • the left panel of FIG. 4A shows RT-PCR results showing trends in FGF12, CDK1, SM-MHC raRNA expression in human smooth muscle cells (HASMC) stimulated with PDGF-BB (50ng / ml) for 3 or 24 hours.
  • the right panel of FIG. 4A shows RT-PCR results showing trends in expression of FGF12, SM-MHC mRNA in human pulmonary vascular smooth muscle cells (HPASMC) stimulated with PDGF-BB (50 ng / ml) for 3 or 24 hours.
  • HPASMC human pulmonary vascular smooth muscle cells
  • FIG. 4B is an immunofluorescent staining picture of incubation for one day in basal medium with or without PDGF-BB (50ng / ml) and staining HASMC for FGF12 green). Cell nuclei were stained with DAPI (blue) and the scale bar was 50 ⁇ .
  • the right panel of FIG. 4B is an immunofluorescence staining image incubated for one day in basal medium with or without PDGF-BB (50ng / ml) and staining HPASMC for FGF12 (green). Cell nuclei were stained with DAPI (blue) and the scale bar was 50 ⁇ .
  • 4D shows RT-PCR results showing FGF12 and CDK1 mRNA expressed in HASMC stimulated with PDGF-BB (50 ng / ml) and treated with signaling inhibitors (LY294002, PD98059, U0126, SB203580, BIRB796).
  • 5 shows experimental results showing the analysis of genes regulated by FGF12 in HASMC.
  • 5A shows the number of DEGs derived from multiple comparisons of untransformed normal (WT) HASMC, HASMC transformed with pCMV6-Entry (pEntry), HASMC transformed with pCMV6-FGF12 (pFGF12) Represent the diagram (Ve ⁇ di agram).
  • 5B shows gene ontology (GO) terms of 362 DEGs derived using funct ional annotat ion clustering of DAVID. Z 7 values are expressed as -log.
  • 5C shows the results of RT-PCR showing the expression patterns of FGF12 and cell cycle related genes. 6 shows experimental results showing the effect of FGF12 on the cell cycle.
  • FIG. 6A shows FACS results for analyzing the cell cycle of normal HASMC (WT), free-transformed HASMC (pEntry), FGF12 overexpressing HASMC (pFGF12).
  • FIG. 6B is a bar graph quantitatively illustrating the cell cycle distribution of cells derived from FIG. 6A.
  • FIG. 6E shows the results of an MTS experiment showing the effect of FGF12 on cell proliferation of HPASMC induced by PDGF-BB (50ng / ml).
  • Figure 8 shows the experimental results showing the functional relationship between the inhibition of FGF12-induced HASMC proliferation and p53.
  • 8B shows Western blot results showing the levels of FGF12, p53, phosphorylated p53 (p- p53) proteins expressing normal or transformed HASMC. ⁇ -act in is the loading control.
  • FIG. 8C shows the results of immunofluorescence staining of 3 ⁇ 4 carotid arteries damaged by balloon injury for FGF12 (green) and p-p53 (red). Cell nuclei were stained with DAPI (blue) and the scale bar was 50 ⁇ .
  • Figure 9 shows the experimental results showing the effect of the expression or degradation of ⁇ 53 on the proliferation of HASMC.
  • FIG. 9A is RT- confirming p53 expression in HASMC 24 hours after infection with adenovirus (Ad-FGF12) for overexpressing FGF12 and transfected with p53 siRNA (25 nM or 50 nM) or control siRNA (Cont siRNA). PCR results are shown. GAPDH stands for loading control.
  • FIG. 9B shows cell proliferation trends analyzed by Ki67 staining after transfection of adenovirus infected (Ad-LacZ, Ad_FGF12) or uninfected (WT) HASMC with siRNA (Cont siRNA, p53 siRNA).
  • FIG. 9B shows cell proliferation trends analyzed by Ki67 staining after transfection of adenovirus infected (Ad-LacZ, Ad_FGF12) or uninfected (WT) HASMC with siRNA (Cont siRNA, p53 siRNA).
  • FIG. 10A shows H & E staining of 3 ⁇ 4 common carot id artery infected with adenovirus (Ad-LacZ or Ad_FGF12) and 2 weeks after balloon injury.
  • the scale bar is 200 ⁇ ⁇ .
  • Figure 10C shows the expression pattern of FGF12 (green) and Ki67 (red) staining in a balloon injured rat common carotid artery with adenovirus (Ad-LacZ, Ad-FGF12). The trend of cell proliferation through is shown by immunofluorescence staining. In the left panel of FIG. 10C, a portion indicated by a white dotted line represents an enlarged region. White arrow marks in the right panel of FIG. 10C indicate proliferating cells expressing high levels of Ki67. Scale bar is 200 ⁇ . 11 shows experimental results showing the effect of overexpression of FGF12 on the proliferation of human vascular smooth muscle cells and vascular endothelial cells.
  • FIG. 11A shows the results of immunofluorescence staining of HUVEC cells or hASMC cells that were not transformed with Ad-FGF12 or treated with virus against FGF12 green) and Ki67 (red). Cell nuclei were stained with DAPI (blue).
  • HUVEC Ad-FGF12 In the figure, a white * indicates cells expressing FGF12 and Ki67 simultaneously in HUVEC cells transfected with Ad-FGF12. The white arrows in the hASMC Ad-FGF12 plots indicate cells expressing Ki67 without expressing FGF12 in hAMSC cells transfected with Ad-FGF12.
  • FIG. 11B shows a bar graph quantifying the Ki67 staining results of FIG. 11A by the percentage of cells stained with Ki67.
  • mice Animal experiments were performed using male Sprague-Dawley (SD) rats; or ipoprotein E knockout mice (ApoE — / _ mice; Japan SIX). Rats provided a normal chow diet / unlimited water (libitum). ApoE _ / " mice were fed a normal diet (ND) or Western-type high fat diet (HFD; 42% of total calror ies from fat, 0.1% cholesterol; REsearch Diets) for 4 weeks. Animals used in the experiments were handled in accordance with the Guide for the Care and Use of Labor tory Animals of the United States National Institute for Health Care. The animal testing protocol is also approved by the Inst i tut ional Animal Care and Use Committee.
  • SD Sprague-Dawley
  • HFD Western-type high fat diet
  • mice and rats were anesthetized by intraperitoneal injection of ketamine (mouse, 79.5 mg / kg; rat, 80 mg / kg) and xylazine (mouse 9.1 mg / kg; rat, 5 mg / kg). Proper anesthesia level was confirmed by pedal withdrawal reflex response.
  • Rat carotid artery injury model
  • the carotid artery was fixed, dehydrated and embedded in paraffin for morphometric analysis.
  • Carotid tissue sections (5 ⁇ ) were stained with hematoxylin & eosin (VII). Morphological analysis of the central sections of three separate injured arteries was conducted by a bl inded investigator.
  • NIS Elements Imaging Software (Nikon) is used to measure the ratio of intimal to medial area ratios (I / M), luminal stenosis (%) and neointimal area. It was.
  • Immunofluorescent staining may be used to treat tissue sections or cells with Ki67 (Dako Inc.), FGF12 (Abcam), phospho-p53 (p-p53; Cell Signaling Technology), ⁇ -smooth muscle act in, a— SMA; Sigma) or SM22 a (Abeam) and staining with appropriate fluorescent labeled secondary antibody (Molecular Probes).
  • Cell nuclei were stained with 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Stained cells were observed with a fluorescence microscope (Nikon), the figure is shown as a photograph representing three separate experiments.
  • RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction
  • Trizol reagent Invitrogen
  • cDNA was synthesized using the gene-specific primer and the Superscript first-strand synthesis kit (Invitrogen), and amplified by PCR for 30-35 cycles.
  • Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was used as the loading control.
  • Real-time PCR was performed using SYBR—Green PCR master mix (Appl ied biosystems) and StepOnePlus TM Real Time PCR System (Ap ied Biosystems). Data was analyzed according to the AACt method and normalized to GAPDH. Primers used for PCR reactions are listed in Table 1 below. [Table 1]
  • HASMC Human aortic vascular smooth muscle cells
  • HPASMC human pulmonary aortic vascular smooth muscle cells
  • SMGM medium muscle growth medium
  • HASMC and HPASMC were selected from pif ithrin (10yM; Sigma), LY294002 (20 M; Cell Signaling Technology), PD98059 (50 ⁇ ; Cell Signaling Technology), UO 126 (10 ⁇ M; Cel l Signaling Technology), SB203580 (50 ⁇ M; Cel l Signaling Technology), BIRB796 (10 ⁇ M; Me rck), pretreated at 37 ° C for 24 hours (pretreatraent). Transformation
  • Transformation for overexpressing FGF12 is an expression vector (c-terminal Myc-) that encodes a human homologous gene ( ⁇ r igene) with 100% amino acid sequence homology with human FGF12 cDNA.
  • PCMV6-Entry labeled with DDK was used.
  • HPASMC were transformed into pCMV6- FGF12 (pFGF12) or p CMV6-Entry (pEntry) control vectors using Lipofectamien 2000 and subjected to selection using G418 (Sigma) for 2 weeks.
  • pFGF12 p CMV6-Entry
  • pEntry p CMV6-Entry
  • Subconf luent HASMC was transformed with sma ii interfering RNA (siRNA; GE Healthcare) specific or non-specific to the gene using Lipofectamien 2000.
  • siRNA sequences are shown in Table 2.
  • cDNA microarrays were performed according to the manufacturer's protocol (Af fymetrix Genchi Human Gene 1.0 ST oligonucleotide array). Briefly, bio Chi-labeled cDNA was synthesized from the same amount of total RNA using the RNeasy Mini Kit column (Qiagen Inc.). Gene Chip Whole Transcript Sense Target Labeling Assay Manual (Affymetrix) followed by cDNA probe hybr idizat ion followed by scanning the chip using Genechip Array scanner 3000 7G (Af fymetrix). Analysis was performed using Affymetrix command console software (version 1.1).
  • Probes with p values ⁇ 0.05 (/? ⁇ 0.05) were used for analysis and normalized according to the Robust Mult i-array Average no rmal iat ion method. Transcripts with more than twofold differences in expression levels were defined as differentially expressed genes (DEGs).
  • the derived DEGs performed gene ontology (GO) term enrichment analysis using Database for Annotat ion, Visual izat ion and Integrated Dicovery (DAVID). Cell cycle analysis
  • Cells were serum deficient (serum starvat ion) and stimulated with SMGM for 24 hours for cell cycle analysis. After trypsinized and washed it was fixed with -20 ° C 70% ethane. Cells are redispersed in propidium iodine (PI) buffer (50 ⁇ g / ml PI, 0.1% Triton-X, 0.1 mM EDTA, 0.05 mg / ml RNase) and using BD FACSCal ibur (Becton, Dickinson and Company) Analyzed. Cell cycle distribution was analyzed by software. Cell proliferation assay
  • PI propidium iodine
  • luciferase reporter assay The 5-UTR of the base pair of FGF12 gene was cloned into a firefly lucif erase reporter vector (pBL3-phFGF12). HASMC was transformed with either pGL3-basic or pBL3-phFGFl 2 along with the cont i tively active ⁇ -galactosidase reporter plasmid as a transformation control. After 48 hours, luciferase and galactosidase activity was analyzed using the luciferase and galactosidase experiment kit (Stratagene).
  • Luciferase activity was normalized to galactosidase activity, and was determined for luciferase activity measured in HASMC transformed with pGL3—basic and cultured for one day in a medium containing PDGF-BB (50 ng / ml). Relative values are shown.
  • Adenovirus production was normalized to galactosidase activity, and was determined for luciferase activity measured in HASMC transformed with pGL3—basic and cultured for one day in a medium containing PDGF-BB (50 ng / ml). Relative values are shown.
  • human FGF12 cDNA was subcloned into a pShuttle-CMV vector and a recombinant adenovirus plasmid was constructed using the pAdEasy-1 vector (Qbiogene). Recombinant adenoviruses used in the experiments were ViraQuest Inc. It was manufactured and separated from the company. Western Blotting
  • FGF12 is expressed at high levels in (a -SMC +) smooth muscle cells (SMC) expressing ⁇ -SMC in the medial layer of normal rat aorta (FIG. 1A, Day 0), but balloon injury (bal After 7 days of loon injury, the expression of FGF12 was significantly decreased in the proliferating neointimal lyaer (Ki67 +) and non-a contractile smooth muscle cells that do not express ⁇ -SMC. The level of FGF12 was increased again in a -SMC + smooth muscle cells of neovascular endothelial on day 15 of balloon injury, where partial recovery to injury occurred. The change in the expression level of FGF12 due to vascular injury was confirmed by RT-PCR in parallel with the expression of smooth muscle cell contractile marker genes such as SM-MHC, SM22 a, SRF (FIG. 1B).
  • smooth muscle cell contractile marker genes such as SM-MHC, SM22 a, SRF
  • FGF12 The expression pattern of FGF12 was found to almost match the expression pattern of ⁇ -SMC in aort ic plaque (FIG. 2A).
  • FGF12 was selectively expressed in a— SMC + mesenchymal smooth muscle cells and significantly decreased in a -SMC- smooth muscle cells at the site of arteriosclerosis. Consistent results with animal models were confirmed (FIG. 2B).
  • the expression pattern of FGF12 was confirmed in pulmonary hypertension animal model.
  • FGF12 was significantly decreased in the pulmonary arterial hypertension animal model prepared by monochromatin injection (FIG. 3A, MCT), and high in the normal rat (FIG. 3A, sal ine). As a result of confirming the pattern, it was confirmed that the expression of FGF12 was significantly decreased in the group injected with MCT than the group injected with sal ine (FIG. 3B).
  • FGF12 is closely related to the proliferation of vascular smooth muscle cells.
  • FGF12 is expressed at high levels in non-proliferating smooth muscle cells, and the level of FGF12 is significantly decreased in proliferating smooth muscle cells. So.
  • FGF12 is regulated by PDGF-BB, a potent mitogen of vascular smooth muscle cells.
  • FGF12 human aort ic smooth muscle cells (HASMC) and human pulmonary aort ic smooth muscle cells (HPASMC) 3 hours after PDGF-BB was added to basal medium
  • HASMC human aort ic smooth muscle cells
  • HPASMC human pulmonary aort ic smooth muscle cells
  • HASMCs transformed to overexpress FGF12 had a significantly higher percentage of cells in the G1 phase compared to the control group (FIGS. 6A-B).
  • MTS cell proliferation experiments also showed that cell proliferation induced by serum or PDGF-BB was significantly inhibited in HASMC cells overexpressing FGF12 (FIG. 6C-D).
  • the cell proliferation induced by PDGF-BB was also significantly inhibited in HPASMC transformed to overexpress FGF12 (FIG. 6E).
  • Example ⁇ 3-1> revealed that genes (CDKN1A, CDK1, CCNE, BRCAl, CCNBl, MDM2) whose transcription is regulated by p53 in the DEG of HASMC overexpressing FGF12 Many have been suggested, suggesting that the p53 signaling system is activated by FGF12 overexpression.
  • RT-PCR showed that in HASMC, which overexpresses FGF12, the levels of p53 and p21 mRNA that regulate p53 is directly increased compared to HASMC transformed with normal (WT) or pEntry (Figure 8A).
  • p53 siRNA and p53 inhibitor compounds were used to inhibit p53 signaling system and to investigate the effects on HASMC and HPASMC cell proliferation.
  • HASMC infected with adenovirus (Ad—FGF12) containing FGF12 was transformed with p53 siRNA, and it was confirmed that p53 mRNA levels were significantly reduced by p53 siRNA (FIG. 9A).
  • the effect of inhibiting cell proliferation due to FGF12 was greatly reduced (FIG. 9B).
  • the p53 inhibitor pi fi thr in also suppressed the cell proliferation of HASMC infected with Ad-FGF12. The effect was greatly improved (FIG. 9C).
  • p53 inhibitor pi fi thr in HPASMC infected with Ad-FGF12 The cell proliferation of was also shown to significantly improve the effect (Fig. 9D).
  • FGF12 inhibits the proliferation of HASMC and HPASMC by promoting the expression and activation of p53.
  • Carotid balloon injury model was used to determine whether overexpression of FGF12 can inhibit neointima formation due to vascular injury.
  • the vessels infected with Ad-FGF12 adenovirus had a significantly thinner vessel wall compared to control vessels infected with Ad-LacZ adenovirus (FIG. 10A), and the neovascular membrane portion (neointima 1).
  • FGF12 was overexpressed (Ad-FGF12) using adenovirus in huraan umbilical vein endothelial cells (HUVEC) or human aortic smooth muscle cell (hASMC) cells, and immunofluorescent staining was performed for Ki67 protein, a marker of cell proliferation.
  • HAVEC huraan umbilical vein endothelial cells
  • hASMC human aortic smooth muscle cell
  • HUVEC cells were transformed with Ad-FGF12 and overexpressed FGF12, there was no significant difference in the number of Ki67-expressing cells compared with cells not infected with virus.
  • Ad-FGF12 cells expressing high levels of both FGF12 and Ki67 (FIG. 11A, HUVEC_ Ad-FGF12, cells marked with white * in the figure) were observed. It is clearly shown that it does not affect the cleavage of.
  • FGF12 specifically inhibits cell proliferation only in vascular smooth muscle cells and does not inhibit the division and proliferation of vascular endothelial cells.
  • the composition of the present invention comprising the polynucleotide encoding FGF12 or FGF12 protein as an active ingredient.
  • the composition of the present invention does not affect endothelial cells adjacent to smooth muscle cells in blood vessels, vascular smooth muscle cell-specific and low side effects can be developed.
  • the diagnostic composition and diagnostic marker detection method for measuring the expression level of FGF12 of the present invention is developed as a diagnostic reagent or kit for smooth muscle cell proliferative diseases such as vascular narrowing, restenosis, pulmonary hypertension and atherosclerosis due to vascular procedures, etc. It can be usefully used.

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Abstract

본 발명은 평활근세포 증식성 질환의 치료용 조성물, 진단용 조성물 및 진단 마커 검출 방법에 대한 것으로, 보다 상세하게는 FGF12를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 백터 또는 FGF12 단백질 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 평활근세포 증식성 질환의 치료용 조성물, FGF12 mRNA 또는 FGF12 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 평활근세포 증식성 질환 진단용 조성물과 이를 이용한 평활근세포 증식성 질환의 마커를 검출하는 방법에 대한 것이다. 본 발명의 FGF12를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물은 FGF12를 과발현함으로써 평활근세포의 증식을 효과적으로 억제할 수 있고 FGF12 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 조성물 역시 유사한 효과를 기대할 수 있어, 평활근세포 증식성 질환을 예방하거나 치료하기 위한 효과적인 유전자 또는 단백질 치료제를 개발할 수 있다. 또한 본 발명의 FGF12의 발현 수준을 측정하기 위한 진단용 조성물과 진단 마커 검출 방법은 혈관 시술 등으로 인한 혈관 협착, 재협착, 폐동맥 고혈압 그리고 동맥경화 등 평활근세포 증식성 질환을 진단하는데 유용하다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
FGF12를 이용한 혈관 평활근세포 증식성 질환의 진단, 예방 또는 치료용 조 성물 【기술분야】
본 출원은 2015년 8월 12일에 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2015-0113727 호를 우선권으로 주장하고， 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다. 본 발명은 혈관 평활근세포 증식성 질환의 치료용 조성물, 진단용 조성물， 진단 마커 검출 방법에 대한 것으로， 보다 상세하게는 FGF12를 암호화하는 폴리뉴 클레오티드를 포함하는 재조합 발현 백터 또는 FGF12 단백질 또는 이의 단편을 유 효성분으로 포함하는 평활근세포 증식성 질환의 치료용 조성물, FGF12 raRNA 또는 FGF12 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 평활근세포 증식성 질환 진 단용 조성물과 이를 이용한 평활근세포 증식성 질환의 마커를 검출하는 방법에 대 한 것이다.
【배경기술】
혈관 평활근세포는 혈관의 구조를 형성하고 지지하며， 자율신경계와 호르몬 의 조절을 받아 이완과 수축을 반복하여 혈액의 순환이 원활하게 이루어지도톡 하 는데 매우 중요하다. 혈관 평활근세포는 건강한 정상상태에서는 SMA, SM22 α , SM- MHC, SM-calponin, desmin 등 평활근 특이적인 유전자를 높은 수준으로 발현하고， 세포 증식 (prol i ferat ion)은 거의 하지 않지만 혈관의 상처， 죽상동맥경화， 염증， 다른 혈관 질환 등으로 인한 손상을 복구해야 하는 상황에서는 혈관 손상을 회복하 기 위한 리모델링 (remodel l ing) 과정의 일부로서， 세포의 증식과 이동 (migrat ion) 이 활발하게 일어난다. 이러한 혈관 평활근세포의 증식이 정상적으로 조절되지 않 고 이상 신호 전달이나 반복적인 손상으로 인해 과다하게 일어나면， 평활근세포들 은 원래의 위치인 혈관의 중간막 (medi a layer)으로부터 내막 ( int ima layer )으로 이 동하고 증식을 계속하여 혈관신생내막 (neoint imal layer )올 형성하며， 염증이나 혈 전 형성 등이 동반되면 결과적으로는 혈관의 벽은 두꺼워지고 혈관 내강은 협소해 지는 혈관 협착 및 폐동맥 고혈압과 같은 질환을 알으킨다. 현재 혈관 협착의 치료는 주로 스텐트 시술이나 혈관 성형술 등의 외과적 시 술에 의한 것으로， 이러한 시술 역시 혈관에 손상을 가하는 것이기 때문에 재발 확 를이 높다. 혈관 협착을 예방하거나 치료하기 위하여 항혈소판제， 항웅고제, 항알 레르기제 또는 조직재생을 억제하는 약물 처리한 스텐트 시술 등의 방법이 임상적 으로 시도되고 있으나 층분한 치료 효과를 내지 못하고 있다. 따라서 평활근세포의 증식을 억제하여 혈관 협착을 치료할 수 있는 근본적인 치료제， 그리고 질환과 치 료의 예후를 진단할 수 있는 진단용 시약의 개발이 필요한 실정이다. 또한 상기 예시한 평활근세포 증식을 동반하는 질환 중， 특히 폐동맥 고혈압 (pulmonary arter i al hypertensi on, PAH)은 다른 질환과 구분되는 특징적인 증상이 나 징후가 없기 때문에 초기 진단이 어렵고， 천천히 진행되기 때문에 초기 증상 발 생 이후 확진까지 시간이 오래 걸리며 치사율이 높은 질환이다. 폐동맥 고혈압은 심장으로부터 폐로 혈액을 공급하는 폐동맥의 혈압이 높아져 폐의 혈액 순환이 나 빠지는 질환으로, 평균 폐동맥압이 25mmHg 이상인 경우로 정의된다. 질환 초기 증 상이 없으나， 진행될수톡 좁아진 폐혈관을 통해 폐로 혈액을 방출해야 하는 심장에 과부하가 걸리면서 심박출량은 감소하고， 그 결과 운동시 호흡곤란， 피로감， 전신 무력감， 현기증 등이 나타나며， 객혈, 협심증， 흉통， 다리 부종 등의 증상이 생기 기도 하고， 심한 경우 실신하거나 심장마비로까지 이어질 수 있다. 인구 100만 명 당 2~10명의 비율로 발생하는 회귀질환이지만， 진단이 어려운 점을 감안하면 실제 환자 수는 더 많을 것으로 예상되며， 또한 폐동맥 고혈압은 확진 후 1년 이내 사망 률이 15%， 5년 후 사망률이 50% 이상에 달하는 난치성 질환이다. 이에 반하여， 치 료법은 증상 완화를 위한 대증요법에 머물러 있으며 효과적인 치료제와 치료방법은 매우 미미한 상태이다. 이에 따라 폐동맥 고혈압을 비롯한 평활근 세포의 과다 증식으로 유발되는 질환을 조기 진단할 수 있는 효과적인 진단 시약과 치료제의 개발이 시급한 상황이 다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
이에 본 발명자들은 평활근세포의 증식 과정에 대하여 연구하던 중, FGF12의 발현 수준과 혈관 평활근세포의 증식이 밀접한 관련이 있음을 발견하였고， 특히 평 활근세포의 증식이 활발하게 일어나는 손상된 혈관에서는 FGF12의 발현이 감소하 며, 손상된 혈관에서 FGF12를 과발현하면 평활근세포의 증식이 억제되는 것을 확인 하여 본 발명을 완성하였다. 따라서 본 발명의 목적은
FGF12를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 백터를 유효 성분으로 포함하는 평활근세포 증식성 질환의 치료용 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은
FGF12 단백질 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 평활근세포 증식성 질환의 치료용 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은
FGF12 mRNA 또는 FGF12 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 평 활근세포 증식성 질환 진단용 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은
평활근세포 증식성 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여
(a) 피검체의 시료를 제공하는 단계; 및
(b) 상기 시료에서 FGF12의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 FGF12의 발현 수준을 정상인과 비교하고， 정상인에 비해 FGF12의 발현 수준이 감소한 피검체를 평활근세포 증식성 질환에 걸렸거나 걸릴 가능성이 있는 것으로 판정하는 단계를 포함하는 평활근세포 증식성 질환의 마커를 검출하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은
평활근세포 증식성 질환의 치료용 제제를 제조하기 위한 FGF12를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 백터의 용도를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은
FGF12를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 백터를 유효 성분으로 포함하는 평활근세포 증식성 질환의 치료용 조성물의 유효량을 이를 필요 로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 평활근세포 증식성 질환 치료방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은
평활근세포 증식성 질환의 치료용 제제를 제조하기 위한 FGF12 단백질 또는 이의 단편의 용도를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은
FGF12 단백질 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 평활근세포 증식성 질환의 치료용 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하 는 평활근세포 증식성 질환의 치료방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은
평활근세포 증식성 질환 진단용 제제를 제조하기 위한 FGF12 m NA 또는 FGF12 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제의 용도를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은
FGF12 mRNA 또는 FGF12 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 평 활근세포 증식성 질환 진단용 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하 는 것을 포함하는 평활근세포 증식성 질환 진단 방법을 제공하는 것이다.
【기술적 해결방법】
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은
FGF12를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 백터를 유효 성분으로 포함하는 평활근세포 증식성 질환의 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은
FGF12 단백질 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 평활근세포 증식성 질환의 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은
FGF12 mRNA 또는 FGF12 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 평 활근세포 증식성 질환 진단용 조성물을 제공한다. 본 발명의 또 다른 목적올 달성하기 위하여 본 발명은
평활근세포 증식성 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여
(a) 피검체의 시료를 제공하는 단계; 및
(b) 상기 시료에서 FGF12의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 FGF12의 발현 수준을 정상인과 비교하고， 정상인에 비해 FGF12의 발현 수준이 감소한 피검체를 평활근세포 증식성 질환에 걸렸거나 걸릴 가능성이 있는 것으로 판정하는 단계를 포함하는 평활근세포 증식성 질환의 마커를 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은
평활근세포 증식성 질환의 치료용 제제를 제조하기 위한 FGF12를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 백터의 용도를 제공한다. 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은
FGF12를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 백터를 유효 성분으로 포함하는 평활근세포 증식성 질환의 치료용 조성물의 유효량을 이를 필요 로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 평활근세포 증식성 질환 치료방법을 제공한다. 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은
F평활근세포 증식성 질환의 치료용 제제를 제조하기 위한 FGF12 단백질 또는 이의 단편의 용도를 제공한다. 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은
FGF12 단백질 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 평활근세포 증식성 질환의 치료용 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하 는 평활근세포 증식성 질환의 치료방법을 제공한다. 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은
평활근세포 증식성 질환 진단용 제제를 제조하기 위한 FGF12 mRNA 또는 FGF12 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제의 용도를 제공한다. 본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은
FFGF12 mRNA 또는 FGF12 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 평 활근세포 증식성 질환 진단용 조성물의 유효량올 이를 필요로 하는 개체에 투여하 는 것을 포함하는 평활근세포 증식성 질환 진단 방법을 제공한다. 이하 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은 FGF12를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 백 터를 유효성분으로 포함하는 평활근세포 증식성 질환의 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명자들은 일련의 실험을 통해 FGF12가 p53 신호전달계를 통해 평활근세 포에서 세포 증식을 억제하는데 중요한 기능을 수행함을 처음으로 밝혔다. 특히 평 활근세포 증식이 촉진되는 조건 (PDGF— BB 또는 FBS에 의한 자극 등)에서도 FGF12을 과발현함으로써 상기 인자로 인한 평활근세포의 증식을 억제할 수 있음을 확인하였 다. 본 발명자들이 밝힌 FGF12의 기능을 이용하여 본 발명의 상기 조성물은 평활 근세포 증식성 질환을 치료하는 유전자 치료제로서 이용될 수 있다. '유전자 치료 제 (gene therapy) '는 치료 효과를 갖는 유전자를 치료 대상 (또는 표적， target )인 세포 또는 조직에 전달하고， 발현되도록 하여 질환을 치료는 것을 의미한다. 전 자 치료제는 병리 현상이 있는 세포 또는 조직에 국소적으로 적용할 수 있고, 비교 적 오랜 기간 동안 유전자 발현으로 인한 치료 효과를 기대할 수 있는 장점이 있 다. 본 발명의 조성물은 FGF12를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 백터를 유효성분으로 하는 것으로서， 증식 중인 평활근세포에 FGF12 유전자를 전달하고 과발현되도톡 함으로써 평활근세포의 증식을 억제하도록 한 것이다. 본 명세서에서 '치료' 는 질환의 발생 또는 재발 억제， 증상의 완화， 질병의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 질병 진행 속도의 감소， 질병 상태의 개선, 호전， 완화 또는 개선된 예후를 의미한다. 본 발명에서 사용되는 용어 '예 방' 은 질환의 발병을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다. '평활근세포 (smooth musc le cel l , SMC) '는 평활근의 근육 세포를 의미한다. '평활근'은 가로무늬가 없는 근육으로 민무늬근이라고도 불리기도 한다. 척추동물 에서 심장 이외의 내장의 근육벽, 즉 위장관， 호흡기의 기도， 혈관， 방광， 자궁 등 의 내부 근육벽을 구성하는 근육은 모두 평활근으로 되어 있다. 평활근은 의식적으 로 움직일 수 없으며， 평활근의 수축은 자율신경계에 의해 직접 조절되고, 호르몬 의 영향을 받는다. 본 발명의 평활근세포는 바람직하게는 혈관 평활근세포 (vascular smooth muscle cel l , VSMC)일 수 있다. '혈관 평활근세포'는 혈관의 평활근을 구성하는 세 포로, 혈관계의 구조를 형성하고 지지하며， 신경계와 호르몬의 조절을 통해 수축 이완하여 혈압과 혈류를 조절한다. 혈관 평활근세포는 건강한 정상 상태에서는 SMA, SM22 α , SM-MHC, SM-calponin 등 평활근 특이적인 유전자 (contract i le gene) 를 높은 수준으로 발현하고, 세포 증식 (prol i ferat ion)은 거의 하지 않는다. 한편 혈관의 상처， 죽상동맥경화， 염증， 다른 혈관 질환 등의 상황에서는 혈관 손상을 회복하기 위한 리모델링 (remodel l ing) 과정의 일부로서， 세포의 증식과 이동 (migrat ion)이 활발해지며， 기질 (matr ix)의 합성과 분비는 증가하는 등의 변화가 일어난다. 본 발명에 따른 '평활근세포 증식성 질환'은 평활근세포의 과도한 증식에 의 해 발생하는 질환을 의미한다. 본 발명에서의 평활근세포 증식성 질환은 바람직하 게는 혈관 평활근세포 증식성 질환일 수 있다. 상기 혈관 평활근세포 증식성 질환 은 혈관 평활근세포의 증식에 의해 직접적으로 발생하는 혈관협착증 (stenos i s) , 혈 관재협착증 (restenosi s) , 폐동맥 고혈압， 동맥경화증， 아테롬성 동맥경화증 뿐 아 니라， 이들 질환에 의해 이차적으로 유발되거나 증상이 심화되는 심혈관계 질환인 심부전증， 심근경색증， 협심증, 부정맥증， 선천성 심장질환증， 뇌졸중， 말초혈관협 착증 등을 포함한다. 본 발명에서의 혈관 평활근세포 증식성 질환은 바람직하게는 혈관협착증， 혈 관재협착증， 폐동맥 고혈압， 동맥경화증， 아테롬성 동맥경화증일 수 있다.
'혈관협착증 (stenosi s) '은 혈관벽이 손상된 후 염증， 혈전 (thrombosi s)， 평 활근세포의 과도한 증식 등으로 혈관 내부가 비정상적으로 좁아지고 혈류량이 감소 하는 질환이다. '혈관재협착증 (restenosi s) '은 혈관협착증이 재발하는 것으로， 주 로 혈관 협착을 해결하기 위해 혈관 내강 ( lumen)을 확장하거나 막힌 혈관을 통하게 하는 등와 혈관 시술 이후에 발생하는 경우가 많다. 스텐트 (stent ) /혈관 풍선 성 형술 (bal loon angioplasty)과 같은 혈관 성형술， 관동맥 문합술 (coronary artery bypass surgery)과 같은 혈관우회술 (vascular bypass 또는 vascular graft ) 등의 혈관 시술은 시술 자체로 혈관에 손상을 가하거나.， 염증을 알으키면서 혈관협착을 일으킨다. 동맥경화증은 동맥의 내층에 지방이 침착되거나 섬유화되어 있는 질환으 로, 동맥경화의 진행과 혈관 확장을 위해 스텐트 삽입 후 발생하는 혈관재협착증은 모두 혈관 평활근세포의 증식, 이동， 세포외 기질 분비에 의한 것으로 알려져 있 다.
상기 시술이나 염증， 혈관의 상처 등으로 인하여 혈관 내막 ( int ima layer)의 내피세포 (endothel ium)나 평활근세포가 존재하는 혈관 중간막 (media layer)이 손상 되면 평활근세포는 내막으로 이동하여 세포 증식과 콜라겐 등의 기질 분비로 특징 지어지는 상태가 되며， 혈관신생내막 (neoint imal layer)을 형성하고 증식을 계속하 는 신생내막 과다증식 (neoint imal hyperplasia)을 초래한다. 결과적으로 혈관벽은 두꺼워지고 혈관 내강 ( lumen)은 협소해진다. 또한 '폐동맥 고혈압 (pulmonary arterial hypertension, PAH) '은 심장으로 부터 폐로 혈액을 공급하는 폐동맥의 혈압이 상승하여 폐의 혈액 순환이 저해되는 질환이다. 폐동맥 압력이 안정한 상태에서 25mmHg 이상 및 /또는 운동 상태에서 30mmHg 이상인 경우를 폐동맥 고혈압으로 진단하며， 심초음파， 심전도， 심도자술， 도보검사 등을 통해 확진하게 된다.
폐동맥 고혈압은 별도의 원인 질환이 없는 특발성과 1차적인 원인 질환으로 부터 발생하는 이차성으로 나뉜다. 폐동맥 고혈압의 주된 원인은 폐동맥 혈관을 구 성하는 평활근세포의 비정상적인 증식으로서， 결과적으로 혈관벽이 비대해지고, 폐 혈관 내강이 협소해지는 혈관 폐색， 혈관 수축 등의 혈관 remodel ing을 동반하며， 혈관 내피세포의 기능은 더욱 저하된다. 계속 진행되면 혈관 내부에 혈전이 발생하 기도 하며， 협소해진 폐동맥을 통해 혈관을 방출하게 되므로 심장에 과부하가 오게 되어 질환이 진행되면서 호흡곤란, 만성피로， 흉통 등의 증상이 나타나며， 심한 경 우 실신하거나 심장마비가 발생할 수도 있다. 폐동맥 고혈압의 약 15-20%를 차지하 는 유전성 폐동맥 고혈압 (her i table PAH)의 경우에는 BMPR2, ALK1 등 TGF-beta superfami ly 유전자의 상염색체 우성 돌연변이가 연관된 것으로 알려져 있으며， 이 들 유전자의 돌연변이는 유전성이 아닌 폐동맥 고혈압 환자의 상당수에서도 발견되 고 있다.
현재 폐동맥 고혈압의 치료제로는 혈관 내피세포에 작용하여 혈관의 확장을 촉진하거나 수축을 억제하는 Bosentan, Ambrisentan 등의 엔도셀린 수용체 길항제 (endothel in receptor antagonist) , Sildenafil, Tadalaf i 1 등의 Phosphodiesterase(PDE)-5 억제제， I loprost , Treprost ini 1 Epoprostonol 등의 프 로스타사이클린 수용체 작용제 (Prostacyclin receptor agonist) 등이 개발되었지 만， 폐동맥 고혈압 환자의 80% 이상이 혈관 확장 요법에 반웅하지 않는 것으로 보 고되었다 (Archer SL et al . , Circulation (2010), 121:2045-2066). 이들 무반응군 환자에서 혈관을 확장하여 혈압올 강하시키면 오히려 심박출량이 감소하여 증상이 더욱 악화되는 위험성이 따른다. 폐동맥 고혈압을 조기 진단하기 위한 효과적인 진 단 시약과 치료제는 매우 미비한상태이다. 본 발명에서 'FGF12'는 섬유아세포 성장인자 12(fibroblast growth factor 12)를 의미하며， FGF12, FGF12B, FHF1 등으로 불리기도 한다. 인간 FGF12는 두 가 지 아형 (isoform)이 알려져 있으며， 이들의 mRNA 서열 또는 아미노산 서열은 匪 _021032.4(FGF12 isoform 1， mRNA), NP_066360. KFGF12 isoform 1， protein), NM_004113.5(FGF12 isoform 2, mRNA), NP_004104.3(FGF12 isoform 2, protein) 등 의 Genebank accession number로 공지되어 있다. FGF12는 다른 섬유아세포 성장인 자 (fibroblast growth factor, FGF)들과 서열과 구조가 유사하지만， N-말단의 분비 신호 서열 (N-terminal secretion signal sequence)이 없어 세포 외부로 분비되지 않고 주로 핵이나 세포질에 존재하며， 세포 표면의 FGF 수용체를 활성화시키지 않 는 등 생화학적으로 구분되는 특징이 있다. 때문에 FGF12는 섬유아세포 성장인자 유사인자 (FGF homologous factor, FHF)로 분류되기도 한다. FGF12가 속한 FHF의 생 물학적 기능에 대해서는 현재까지 거의 알려진 것이 없다. 인간， 마우스， 닭 등의 발달 중이거나 성숙한 신경계에서 FHF가 높은 수준으로 발현되며, FHF의 기능이 손 상되면 신경계와 행동 이상을 일으키는 것으로 보고된 바 있으나 (Pablo JL et al., Neuroscientist pi i： 1073858414562217. ) , 신경계 이외의 부분에서 FHF의 기능이나 관련 신호전달체계에 대해서는 연구가 매우 미흡한 상황이다. 본 명세서에서 발명자들은 FGF12가 평활근세포의 증식을 억제하는데 중요한 기능을 수행함을 처음으로 공개한다. 상기 FGF12에 의한 평활근세포 증식 억제 효 과는 기존에 알려진 다른 FGF들이 다양한 세포의 분열과 증식을 촉진하는 것과는 전혀 상반되는 것이다. FHF가 아닌 다른 FGF fami ly의 FGF들, 예를 들어 FGF1 , 그 리고 bFGF(basi c FGF)로도 불리는 FGF2는 다양한 신호전달계를 통해 혈관 평활근세 포의 증식을 촉진하는 것으로 밝혀져 있다 (Nabel EG et al . , Nature 362 : 844-6 , Reidy MA et al . , Circulation 86 : 11143-6) . 본 발명자들이 밝힌 FGF12의 구체적인 기능은 다음과 같다.
본 발명의 일실시예에서는 FGF12가 평활근세포의 증식을 촉진하는 인자들에 의하여 발현이 감소함을 발견하였다. 평활근세포를 혈소판유래 성장인자 동종이합 체 (plateletᅳ der ived growth factor subuni t B homodimer , PDGF-BB； 50ng/ml ) BB 또는 혈청 (FBS ; 10%)으로 자극하면 평활근세포의 분열은 증가하였으며, FGF12의 발 현은 현저하게 감소하였다. 신호전달계 억제 실험 결과, PDGF-BB에 의한 FGF12 발 현의 감소는 PI3 kinase 신호전달계에 의해 매개되는 것으로 나타났다. 본 발명의 다른 일실시예에서는 FGF12는 평활근세포의 분열을 억제하는 것을 확인하였다. FGF12가 평활근세포의 증식을 억제하는 것은 FGF fami ly의 다른 구성 원들， 예를 들어 FGF1이나 FGF2가 다양한 세포에서 세포 증식을 촉진하는 것으로 알려진 것과는 전혀 예상할 수 없었던 효과이다.
구체적으로 FGF12는 세포 주기 진행에 연관된 CDKl , CDK2 , CCNA2 , CDC6 , CDC20 등의 유전자의 발현을 억제하였다. 또한 작동가능하게 연결된 FGF12를 포함 하는 pCMV6 재조합 발현백터로 형질전환하여 FGF12를 과발현하는 평활근세포에서는 세포 주기가 진행되지 않고 G1 단계에 있는 세포의 비율이 대조군에 비해 현저하게 높았다. 평활근세포의 증식 촉진인자인 PDGF-BB나 FBS로 자극한 평활근세포에서도 FGF12가 과발현되면， 상기 증식 촉진인자로 유도되는 평활근세포의 증식이 억제되 는 것을 확인하였다. FGF12의 평활근세포 증식 억제 효과는 FGF12 siRNA를 이용한 FGF12 활성 억제 실험을 통해서도 확인할 수 있었다. 또한 본 발명자들은 다른 일실시예서 상술한 FGF12가 평활근세포에서 갖는 효과는 p53 신호전달계에 의해 매개됨을 밝혔다. FGF12를 과발현하는 평활근세포에 서 차별적으로 발현되는 유전자 (DEG)를 분석한 결과, p53에 의해 전사가 조절되는 유전자들이 다수 포함되어 있었으며， FGF12를 과발현하는 손상된 동맥 조직에서도 인산화된 P53이 FGF12와 매우 유사한 패턴으로 발현되는 것을 관찰하였다. 또한 FGF12를 과발현하는 아데노바이러스 (Ad-FGF12)로 형질전환된 평활근세포에서 siRNA 나 억제제 화합물 (pi f i thrin; ΙΟ μ Μ)을 통해 ρ53의 기능을 억제하면， FGF12로 인 산 평활근세포 증식 억제 효과가 상쇄되었다. 이에 따라 본 발명의 다른 일실시예에서는 FGF12의 과발현이 혈관 평활근세 포의 증식을 억제하는 치료 효과가 있음을 체내에서 확인하였다. 랫 총경동맥에 풍 선 색전제거용 카테터로 혈관 손상을 일으키고 아데노바이러스로 감염하여 FGF12를 과발현하도록 한 결과， 혈관신생내막 부분 (neoint imal area) , 내막-중간막 부분의 비율 ( int imal to medial area rat ios , I/M) , 관강내 협착 ( luminal stenosis , ) 등 혈관 협착의 지표가 크게 감소한 것을 관찰하였다. 본 발명자들은 또한 FGF12에 의한 세포 분열과 증식 억제 효과는 평활근세포 특이적인 것으로서 내피세포 (endothel ial cel l )에는 영향을 미치지 않음을 보였다. 인간 혈관 평활근세포 또는 혈관 내피세포 (HUVEC 세포)를 Ad-FGF12로 감염시켜 FGF12를 과발현시켰을 때, 세포 증식의 마커인 Ki67을 발현하는 혈관 평활근세포는 현저하게 감소하였으나, Ki67을 발현하는 HUVEC 세포의 수에는 변함이 없었다. 본 발명자들이 규명한 상기 FGF12의 세포 증식 억제 효과와 작용기전을 바탕 으로 FGF12를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 백터를 이용하 여 평활근세포에서 FGF12의 과발현을 유도함으로써 평활근세포의 증식을 예방하거 나 치료하는데 이용할 수 있음을 예상할 수 있다. 특히 FGF12의 상기 세포 증식 억 제 효과는 평활근세포에 특이적인 것으로， 혈관에서 평활근세포와 밀접하게 위치한 내피세포에는 영향을 미치지 않는다. 따라서 본 발명을 이용하면, 인접 세포에서의 부작용은 최소화할 수 있어 기존의 혈관 내피세포의 증식 활성도 억제하는 다른 평 활근세포 증식 억제제와는 차별되는 평활근세포 증식성 질환의 치료제를 개발할 수 있음을 예상할 수 있다. 본 발명의 평활근세포 증식성 질환의 치료용 조성물은 FGF12를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 백터를 유효성분으로 포함한다. 본 명세서에서 '폴리뉴클레오티드 (polynucleot ide) ' 또는 '핵산 '은 단일-또 는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오티드 (DNA) 또는 리보뉴클레오티드 (RNA)를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷 한 방법으로 핵산에 흔성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된 다. 본 발명의 FGF12를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 포유류에서 유래한 것일 수 있으며， 바람직하게는 인간에서 유래한 것일 수 있다. 상기 FGF12를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 인간 FGF12 mRNA의 서열을 포함하는 것일 수 있으며, 가장 바 람직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한 FGF12를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 인간 FGF12 mRNA의 서열, 바람 직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열과 실질적인 동일성을 나타내는 서열도 포함한다. '실질적인 동일성 '은 인간 FGF12 mRNA 서열과 비교 대 상이 되는 임의의 다른 서열을 최대한 대웅되도록 정렬하고, 당해 기술분야에서 통 상적으로 이용되는 분석 방법과 알고리즘을 이용하여 서열을 비교 분석하는 경우， 최소 70% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 상기 FGF12 mRNA 염기서열과 실질적으로 동일한 염기서열에 의해 암호화되는 단백질은 FGF12 단백질， 바람직하 게는 서열번호 2 또는 서열번호 4로 표시되는 아미노산을 포함하는 단백질이거나， FGF12 단백질의 기능적 동등물일 수 있다. '기능적 동등물 '은 본 발명의 FGF12의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상， 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성 (즉， 동일성)을 갖는 폴리펩티드로서, FGF12와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 실질적으로 동질의 생리활성이 란, 평활근세포에서 발현되어 평활근세포와 증식과 이동을 억제하는 등의 기작으로 평활근세포 정상적 형질을 유도하고 유지하는 활성을 의미한다. 본 명세서에서 '발현 (expression) '은 세포에서 단백질 또는 핵산의 생성을 의미하며， 재조합 발현 백터란 적합한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 핵산 (RNA)을 발현할 수 있는 백터로서, 폴리뉴클레오티드 (유전자) 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. '작 동가능하게 연결된 (operably l inked) '이란 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조 절서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결 (funct ional l inkage)되어 있는 것으로， 발현조절서열에 의해 유전자가 발현될 수 있도특 연결된 것을 의미한다. '발현조절서열 (expression control sequence) '이란 특정한 숙주세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절 하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터， 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열 , 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열， 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열， 개시코돈， 종결코돈, 폴리 아데닐화 시그널 및 인핸서 등을 포함한다. 본 발명의 재조합 발현 백터는 클로닝 분야에서 통상적으로 사용되는 백터， 특히 유전자 치료제 분야에서 사용되는 것으 로서 당업자가 선택할 수 있는 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으며， 그 예 로는 플라스미드 백터， 코즈미드 백터， 박테리오파아지 백터 및 바이러스 백터 등 을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 재조합 백터는 당업계에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며， 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다. 따라서 본 발명에 따른 재조합 발현 백터는 FGF12를 암호화하는 폴리뉴클레 오티드와， 평활근세포에서 FGF12를 발현하기 위한 필수적인 발현조절서열을 모두 포함하고 이들이 작동가능하게 기능적으로 연결된 유전자 작제물이다. 본 발명의 재조합 발현 백터는 재조합 발현 백터 제작사 숙주세포를 선택하기 위한 선택 마커 및 /또는 복제 기원 (repl icat ion origin)을 포함하고 있을 수 있으며， 또한 상기 발 현 백터는 필요에 따라 발현조절서열, 막표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열，리 더 서열 등을 포함하며， 평활근세포 특이적 수축성을 나타내고 확인하기 위한 리포 터 (reporter) 또는 마커 (marker) 유전자의 서열 등을 포함하여 목적에 따라 다양하 게 제조될 수 있다. 또한 본 발명에 따른 재조합 발현 백터는 재조합 바이러스 백터일 수 있다. 본 발명의 재조합 바이러스 백터는 유전자 치료제 분야에서 유전자를 전달하 기 위하여 통상적으로 사용되는 바이러스 백터라면 제한 없이 사용될 수 있다. 상 기 재조합 바이러스 백터는 아데노바이러스 백터, 아데노연관바이러스 (AAV) 백터， 레트로바이러스 백터, 허피스비이러스 백터， 렌티바이러스 백터， 백시니아바이러스 백터 및 폭스바이러스 백터로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다. 본 발명에서의 재조합 바이러스 백터는 바람직하게는 아데노바이러스 백터일 수 있다. 아데노바이러스는 바이러스 중에서 중간 정도의 유전체 (genome)의 크기， 유전자 조작과 제조의 편의성， 높은 타이터로 인한 생산과 분리의 용이성， 광범위 한 표적 세포 (target )와 높은 감염 효율 등으로 유전자 치료 분야에서 치료용 유전 자를 전달하기 위한 운반체로 널리 이용되고 있다. 유전자 치료용으로는 바이러스 의 자가 복제와 생산 능력이 결여된 아데노바이러스가 많이 이용되고 있다. 본 발명의 FGF12를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 백 터를 유효성분으로 포함하는 평활근세포 증식성 질환의 치료용 조성물은 유전자 치 료 분야에 공지된 다양한 운반 방법을 통하여 생체 내에 적용될 수 있다. 예를 들 어 , naked DNA inj ect ion, 전기천공법 (electroporat ion)， 유전자 총 (gene gun) , 초 음파를 이용한 유전자 전달 (sonoporat ion) , 전자기장을 이용한 유전자 전달 (magnetofect ion) , 리포좀 ( 1 iposome)이나 나노파티클 (nanopart i c le) 등의 구조물을 이용한 유전자 전달， 바이러스를 이용한 유전자 전달 등의 방법이 있으며， 본 발명 의 조성물은 바람직하게는 바이러스， 가장 바람직하게는 아데노바이러스를 이용하 여 평활근세포에 전달할 수 있다. 본 발명에 따른 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식， 환자의 연령, 체중, 성별, 질병의 중증도， 음식, 투여 시간， 투여 경로， 치료 기간， 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 다양한 요인을 고려하여 적절하게 조정할 수 있다. 당 업자는 치료에 효과적인 투여량을 상기 요인을 고려하여 결정하고 처방할 수 있다. 본 발명의 조성물이 평활근세포 증식성 질환을 위한 유전자 치료제로 사용될 때， 본 발명의 조성물은， 예를 들어 FGF12를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 아데노바이러스를 1 X 105내지 1 X 1015 pfu/ ^의 농도로 포함하며 , 1회 내지 수회 투 여될 수 있다. 본 발명에서는 풍선 손상으로 인한 혈관 손상의 랫 모델에서 FGF12 를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 아데노바이러스를 I X 107 pfu/m 농도 로 손상 혈관 부위에 1회 주입하고， 2주 후 FGF12 발현에 의한 치료 효과를 확인한 바 있다. 본 발명에 따른 조성물은 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있으나 바람 직하게는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지 는 않으나 정맥내， 근육내, 동맥내， 골수내， 경막내， 심장내， 경피， 피하， 복강내， 비강내， 장관, 국소， 설하 또는 직장내 투여일 수 있으며， 바람직하게는 혈관내 투 여할 수 있다. 본 발명의 조성물은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법 으로 투여경로에 따라 다양하게 제형화될 수 있다. '약학적으로 허용되는'이란 생 리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때， 활성성분의 작용을 저해하지 않으며 통 상적으로 위장 장애， 현기증과 같은 알레르기 반웅 또는 이와 유사한 반웅을 일으 키지 않는 비독성의 조성물을 말한다. 상기 담체로는 모든 종류의 용매， 분산매질， 수중유 또는 유중수 에멀젼， 수성 조성물, 리포좀， 마이크로비드 및 마이크로좀이 포함된다. 본 발명의 조성물을 비경구적으로 투여하는 경우 본 발명의 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 주사제, 경피 투여제 및 비강 흡입제의 형태로 당해 기술분 야에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균 되어야하며 박테리아， 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사 제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리을 (예 를 들어， 글리세를， 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등)， 이들의 흔합 물 및 /또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는， 적합한 담체로는 행크스 용액， 링거 용액， 트리에탄올 아민이 함유된 PBS( hosphate buffered sal ine) 또는 주사용 멸균수， 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올， 페놀， 소르빈산， 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한， 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가 로 포함할 수 있다. 경피 투여제의 경우 연고제, 크림제， 로션제， 겔제, 외용액제， 파스타제， 리 니멘트제， 에어롤제 등의 형태가 포함된다. 상기에서 경피 투여는 본 발명의 조성 물을 국소적으로 피부에 투여하여 조성물에 함유된 유효한 양의 활성성분이 피부 내로 전달되는 것을 의미한다. 예컨대， 본 발명의 조성물을 주사형 제형으로 제조 하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자 (prick)하거나 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다. 이들 제형은 제약 화학에 일반적으 로 공지된 처방서인 문헌 (Remington' s Pharmaceut ical Science, 15th Edi t ion, 1975, Mack Publ ishing Company, East on, Pennsylvania)에 기술되어 있다. 흡입 투여제의 경우， 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 적합한 추진제， 예 를 들면， 디클로로플루오로메탄， 트리클로로플루오로메탄， 디클로로테트라플루오로 에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달 할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우， 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면， 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물 및 락토오즈 또는 전분 과 같은 적합한 분말 기제의 분말 흔합물을 함유하도록 제형화할 수 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다 (Remington ' s Pharmaceut ical Sciences , 19th ed. , Mack Publ ishing Company, East on, PA, 1995) . 또한 본 발명에 따른 조성물은 하나 이상의 완층제 (예를 들어， 식염수 또는 PBS) , 카보하이트레이트 (예를 들어， 글루코스, 만노즈， 슈크로즈 또는 덱스트란)， 항산화제， 정균제, 킬레이트화제 (예를 들어， EDTA 또는 글루타치온)， 아쥬반트 (예 를 들어, 알루미늄 하이드록사이드) , 현탁제， 농후제 및 /또는 보존제를 추가로 포 함할 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또 는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 다양하게 제 형화될 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 평활근세포 증식성 질환을 치료하는 효과가 있는 공지의 화합물과 병용하여 투여할 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 통상의 혈관 시술과 같이 투여할 수도 있다. 또한본 발명은 FGF12 단백질 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 평활 근세포 증식성 질환의 치료용 조성물을 제공한다.
'단백질'은 '폴리펩타이드 (polypept ide) ' 또는 '펩타이드 (p印 t ide) '와 호환 성 있게 사용되며， 예컨대, 자연 상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같 이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다. FGF12 단백질의 '단편 (fragment ) '은 FGF12 단백질의 일부분의 펩타이드를 말한다. 본 발명에서 상기 FGF12 단백질은 포유류에서 유래한 것일 수 있으며， 바람 작하게는 인간에서 유래한 것일 수 있다. 본 발명의 FGF12 단백질은 가장 바람직하 게는 인간 FGF12 단백질의 아미노산 서열， 즉 서열번호 2 또는 서열번호 4로 표시 되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 본 발명의 조성물에 포함되는 FGF12 단백질은 FGF12 단백질과 실질적으 로 동등한 생리 활성을 갖는 단백질을 말한다. 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖 는 단백질에는 FGF12 단백질의 기능적 동등물 ( funct ional equivalent ) 및 기능적 유도체 (funct ional derivat ive)가 포함된다. 본 발명에서 '기능적 동등물 '이란 FGF12 단백질과 실질적으로 동등한 생리 활성을 나타내는 폴리펩티드를 말하며 FGF12 단백질의 단편도 포함한다. 실질적으로 동등한 생리 활성은 평활근세포 안에 전달되었을 때 평활근세포의 분열과 증식은 억제하는 활성을 말한다. 상기 기능적 동등물은 서열번호 2 또는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이 상， 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성
(homology)을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 기능적 동등물은 예를 들어 FGF12 단백질과 실질적으로 등등한 생리 활성을 갖는, SNKsmal l nucleot ide polymorphism) 등의 FGF12의 다형성 (polymorphi sm) 단백질일 수도 있다. 또한 상기 기능적 동등물은 본 발명의 FGF12 단백질의 아미노산 서열 중 일 부가 부가， 치환 또는 결실의 결과 생성될 것일 수 있다. 상기에서 아미노산의 치 환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다: 지방족 아미노산 (Gly, Ala, Pro) , 소수성 아미노산 ( l ie , Leu, Val ) , 방향족 아미노산 (Phe, Tyr , Trp) , 산성 아미노산 (Asp, Glu) , 염기성 아미노 산 (Hi s , Lys , Arg, Gin, Asn) 및 황 함유 아미노산 (Cys , Met ) . 또한 상기 기능적 동등물에는 본 발명의 FGF12 단백질의 아미노산 서열상에서 아미노산의 일부가 결 실된 변형체도 포함된다. 상기 아미노산의 결실 또는 치환은 바람직하게는 본 발명 의 단백질의 생리활성에 직접적으로 관련되지 않은 영역에 위치해 있다. 또한 아미 노산의 결실은 바람직하게는 본 발명의 FGF12 단백질의 생리활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다. 아을러 상기 FGF12 단백질의 아미노산 서열의 양 말단 또는 서열 내에 몇몇의 아미노산이 부가된 변형체도 포함된다. 본 발명의 기능적 동등물의 범위에는 본 발명의 FGF12 단백질의 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하면서 단백질의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유 도체도 포함된다. 예를 들어， 본 발명의 FGF12 단백질의 안정성， 저장성 , 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조 변경이 이에 포함된다. 또한 본 발명의 FGF12 단백질은 기본 골격과 생리 활성은 유지하면서 평활근세포 내부로 효과적으 로 전달되도록 하기 위한 화학적 .작용기나 세포 투과성 펩타이드 (cel l-penetrat ing pept ide, CPP)를 추가적으로 포함하는 것일 수도 있다. 상기 세포 투과성 펩타이드 는 그 자체로 세포막의 인지질 이중막 구조를 통과할 수 있거나, 세포내이입 (endocytosis)을 촉진시킬 수 있는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드로， 예를 들어 HIV 바이러스의 TAT 유래 펩타이드， VP22, transport an, penetrat in 등에서 유래한 펩타이드， 세포막 투과성 시그널 서열， 알지닌 /라이신 등 양전하를 띠는 아미노산 을 다량 함유하는 펩타이드， 양친매성 펩타이드 운반체 (amphipathic pept ide carrier) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다 본 발명의 FGF12 단백질은 유전공학적 방법에 의해 작제될 수 있다. 우선， 통상적인 방법에 따라 상기 FGF12 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 작제한다. DNA 서열은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭하여 작제될 수 있다. 작제된 DNA 서열은 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어 (operat ively l inked) 그 DNA 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열 (예: 프로모터， 인핸서 등)을 포함하는 백터에 삽입하고， 이로부터 형성된 재조합 발현 백터로 숙주세포를 형질 전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되기 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여 , 배양물로부터 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 실질적으로 순수한 폴리펩티드를 회수한다. 상기 회수는 당업계에 공지된 방법 (예컨대， 크로마토그래 피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 '실질적으로 순수한 폴리펩티드'라 함은 본 발명에 따른 폴리펩티드가 숙주세포 로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질 적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 폴리펩티드 합성을 위한 유전공학 적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniat is et al . , Molecular Cloning; A laboratory Manual , Cold Spring Harbor laboratory, 1982； Sambrook et al . , supra; Gene Expression Technology, Method in Enzyraology, Genet ics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie & Fink (eds. ) , Academic Press, San Diego, Calif, 1991； 및 Hitzeman et al . , J. Biol. Chem. , 255:12073— 12080， 1990. 또한, 본 발명의 FGF12 단백질은 당해 분야에 공지된 기술로 화학적으로 합 성할 수 ■있다 (Creighton, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., NY (1983)). 즉， 본 발명의 FGF12 단백질은 통상의 단계적인 액 체 또는 고체상 합성， 단편 응축， F-M0C 또는 T-B0C 화학법을 이용하여 제조할 수 있다 (Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al . , Eds. , CRC Press, Boca Raton Florida, (1997)； A Practical Approach, Atherton & Sheppard, Eds. , IRL Press, Oxford, England, (1989)). 유전공학적 방법에 의해 제조된 재조합 펩타이드 또는 화학적으로 합성된 펩 타이드는 예를 들면 추출법， 재결정법, 다양한 크로마토크래피 (겔 여과법， 이은 교 환， 침전， 흡착， 역전상), 전기영동， 역류 분배법 등 당업계에 공지된 방법으로 분 리 및 정제할 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 그 자체 또는 염, 바람직하게는 약학적으로 허용가 능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명에서 '약학적으로 허용가능한'이란 생리 학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때， 통상적으로 알레르기 반응 또는 이와 유사 한 반응을 일으키지 않는 것을 말하며， 상기 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리 산 (free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하다. 상기 유리산으로는 유기 산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나， 구연 산, 초산， 젖산， 주석산， 말레인산， 푸마르산， 포름산， 프로피온산， 옥살산, 트리 플로오로아세트산, 벤조산， 글루콘산， 메타술폰산， 글리콜산， 숙신산， 4-를루엔술 폰산， 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나， 염산， 브롬산， 황산 및 인산을 포함한다. 본 발명의 조성물은 평활근세포의 증식 억제 효과를 내기 위해 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법으로 투여경로에 따라다양하게 제형화 될 수 있다. 상기 담체로는 모든 종류의 용매， 분산매질, 수중유 또는 유중수 에멀 젼, 수성 조성물, 리포좀， 마이크로비드 및 마이크로좀이 포함된다. 상기 약학적 담체의 구체적인 예는 명세서 다른 곳에 기재된 바와 같다. 투여 경로로는 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구적인 투여 방법으로는 이에 한정되지는 않으나 정맥내， 근육내, 동맥내, 골수내， 경막내, 심 장내, 경피， 피하， 복강내， 비강내， 장관, 국소， 설하 또는 직장내 투여일 수 있 다. 상기 투여 경로의 구체적인 예는 명세서 다른 곳에 기재된 바와 같다. 상기 본 발명에 따른 FGF12 단백질 또는 그 단편을 포함하는 조성물은 치료 효과를 나타내는 양으로 환자에게 투여될 수 있다. 일반적인 1일 투여량으로는 약 0.0001 내지 100mg/kg의 범위로 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 바람직한 투 여량 범위 내에서 1회 또는 수회로 분할 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명에 따른 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상， 연령， 성별 체중， 개인차 및 질병 상태 에 따라 적절히 선택할 수 있다. 본 발명은 FGF12 mRNA또는 FGF12 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포 함하는 평활근세포 증식성 질환 진단용 조성물을 제공한다. 본 발명자들은 FGF12의 발현이 평활근세포의 증식과 높은 상관관계가 있음을 발견하였다. 건강한 혈관의 평활근세포에서는 FGF12가 높은 수준으로 발현되지만， 혈관 시술로 손상되거나， 동맥경화가 진행 중인 혈관에서 증식 중인 평활근세포에 서는 FGF12의 발현이 크게 감소되어 있다. 또한 평활근세포의 증식을 촉진하는 PDGF-BB에 의하여 FGF12의 발현 수준은 크게 감소한다. 이와 같은 FGF12와 평활근 세포 증식의 기능적 상관관계를 이용하여 FGF12의 발현 수준을 측정함으로써 평활 근세포 증식성 질환의 진단에 이용할 수 있다.
'진단 '은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명에 서의 진단은 평활근세포 증식성 질환의 병리 상태의 유무를 파악하여 발병 또는 발 병 가능성 여부를 확인하는 것이다. 본 발명의 진단용 조성물에서 FGF12 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 FGF12 mRNA에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 프라이머 세트일 수 있다. 본 발명에서 FGF12 mRNA는 바람직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 3으로 표 시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.
'프라이머 (primer ) '는 DNA 합성의 개시점 (start ing point )으로 작용하는 짧 은 단일가닥 올리고뉴클레오티드 (single strand ol igonucleot ide)이다. 프라이머는 적합한 완충액 (buffer)와 온도 조건에서 주형 (template)인 폴리뉴클레오티드에 특 이적으로 결합하고， DNA 중합효소가 프라이머에 주형 DNA에 상보적인 염기를 갖는 뉴클레오사이드 트리포스페이트를 추가하여 연결함으로써 DNA가 합성된다. 프라이 머는 일반적으로 15 내지 30개의 염기서열로 이루어져 있으며, 염기 구성과 길이에 따라주형 가닥에 결합하는 온도 (melt ing temperature , T 가 달라진다.
프라이머의 서열은 주형의 일부 염기 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며， 주형과 흔성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에 서의 충분한 상보성을 가지면 층분하다. 따라서 본 발명에서 FGF12 mRNA의 발현 수 준을 측정하기 위한 프라이머는 FGF12 유전자 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가 질 필요는 없으며， DNA 합성을 통해 FGF12 mRNA 또는 FGF12 cDNA의 특정 구간을 증 폭하여 FGF12 mRNA의 양을 측정하려는 목적에 맞는 길이와 상보성올 갖는 것이면 충분하다. 상기 증폭 반응을 위한 프라이머는 증폭하고자 하는 FGF12 mRNA의 특정 구간의 양쪽 끝부분의 주형 (또는 센스， sense)과 반대편 (안티센스， ant isense)에 각각 상보적으로 결합하는 한 세트 (쌍)로 구성된다. 프라이머는 당업자라면 FGF12 mRNA또는 cDNA 염기서열을 참조하여 용이하게 디자인할 수 있다. 본 발명에서 FGF12 mRNA는 바람직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 3으로 표 시되는 염기서열을 포함하는 것이므로, 본 발명의 프라이머는 바람직하게는 서열번 호 1 또는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열에 특이적으로 결합하는 한 세트 또는 한 쌍일 수 있으며， 가장 바람직하게는 서열번호 15와 서열번호 16으로 표시되는 염기서열의 세트일 수 있다.
'프로브 (probe) '는 특정 유전자의 mRNA나 cDNA(compIementary DNA)에 특이적 으로 결합할 수 있는 짧게는 수개 내지 길게는 수백 개의 염기 (base pair) 길이의
RNA 또는 DNA 등 폴리뉴클레오티드의 단편을 의미하며， 표지 ( label ing)되어 있어서 결합하는 대상 mRNA나 cDNA의 존재 유무, 발현양 등을 확인할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해서는 FGF12 mRNA에 상보적인 프로브를 피검체의 시료와 흔성화 반응 (hybr idizat ion)을 수행하여 FGF12 mRNA의 발현양을 측정함으로써 평활근세포 증식 성 질환의 진단에 이용할 수 있다. 프로브의 선택 및 흔성화 조건은 당업계에 공지 된 기술에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트 (phosphoramidite) 고체 지지체 합성법이나 기타 널리 공지 된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있 다. 또한 프라이머 또는 프로브는 FGF12 mRNA와의 흔성화를 방해하지 않는 범위에 서 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 다양하게 변형시킬 수 있다. 이러한 변형 의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클 레오티드 간의 변형， 예를 들면 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포 스포트리에스테르， 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트， 포스포로디티오에이트 등) , 그리고 형광 또는 효소를 이용한 표지물질 ( label ing material )의 결합 등이 있다. 본 발명의 진단용 조성물에서 FGF12 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 FGF12 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다. 본 발명에서 FGF12 단백질은 바람직하게는 서열번호 2또는 서열번호 4로 표 시되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
'항체 (ant ibody) '는 항원성 부위에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 ( i誦 unoglobul in)을 의미한다. 본 발명에서의 항체는 FGF12 이외의 다른 FGF를 포 함하는 다른 단백질에는 반웅하지 않고， FGF12 단백질에만 특이적으로 결합하는 항 체이다. FGF12 항체는 FGF12 유전자를 발현백터에 클로닝하여 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 수득하고， 수득한 단백질로부터 당해 기술분야의 통상적인 방 법에 따라 제조할 수 있다. 상기 항체는 다클론항체 (polyclonal ant ibody) 또는 단 일클론항체 (monoclonal ant ibody)를 포함하며， FGF12에 특이적으로 결합하는 모든 면역글로불린 항체가 포함된다. 본 발명에서 FGF12 단백질은 바람직하게는 서열번호 2 또는 서열번호 4로 표 시되는 아미노산 서열을 포함하는 것으로서， 본 발명에서 FGF12 단백질에 특이적으 로 결합하는 항체는 바람직하게는 서열번호 2 또는 서열번호 4로 표시되는 아미노 산 서열을 갖는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다. 또한 본 발명은 평활근세포 증식성 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여，
(a) 피검체의 시료를 제공하는 단계; 및
(b) 상기 시료에서 FGF12의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
( c) 상기 FGF12의 발현 수준을 정상인과 비교하고， 정상인에 비해 FGF12의 발현 수준이 감소한 피검체를 평활근 증식 질환에 걸렸거나 걸릴 가능성이 있는 것 으로 판정하는 단계를 포함하는 평활근세포 증식성 질환의 마커를 검출하는 방법을 제공한다. 이하 단계에 따라 본 발명의 방법을 설명한다. 본 발명의 방법의 (a) 단계는 피검체의 시료를 제공하는 단계이다. 상기 (a) 단계의 피검체의 시료는 평활근세포 또는 평활근세포를 포함하는 조직 또는 혈액일 수 있으며， 바람직하게는 혈관 평활근세포 또는 혈관일 수 있다. 본 발명의 시료는 포유류에서 유래한 것일 수 있으며， 바람직하게는 인간에서 유래 한 것일 수 있다. 피검체의 시료는 당해 기술분야에 공지된 기술에 따라 채취하여 제공할 수 있으며, 예를 들어 혈관 시술 중 절제된 혈관 조직 또는 혈액을 시료로 제공할 수 있다. 또한 피검체의 시료는 FGF12의 발현 수준을 측정하는 방법에 따라 당해 기술 분야에 공지된 대로 적절하게 전처리할 수 있다. 예를 들어 피검체의 시료를 포르 말린 ( formal in) 등의 고정액 (f ixat ive)에 넣어 고정하거나， 액체 질소 등으로 급속 냉동하여 -20°C 나 -701C에서 냉동 보관할 수 있다. 고정되거나 넁동된 시료로부터 조직 절편을 만들어 넁동 보관할 수도 있다. 본 발명의 방법의 (b) 단계는 (a) 단계에서 제공한 시료에서 FGF12의 발현 수준을 측정하는 단계이다. 상기 (b) 단계의 FGF12의 발현 수준을 측정하는 단계는 FGF12 mRNA의 발현 수준을 측정하는 것일 수 있다.
FGF12 mRNA의 발현 수준은 FGF12 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 나 프로브를 이용하여 피검체의 시료로부터 FGF12의 mRNA나 cDNA를 증폭하거나， 프 로브와의 흔성화 (hybridization) 반옹을 이용하여 피검체 시료 내 FGF12 mRNA의 존 재와 발현량을 측정할 수 있다. 상기 프라이머와 프로브는 본 발명의 진단용 조성 물에서 기재한 바와 같다.
FGF12 mRNA 발현 수준의 측정은 당업계에서 통상적인 발현 수준 확인 방법 을 제한 없이 사용할 수 있으며， 분석 방법의 예로 역전사중합체연쇄반웅 (reverse transcription polymerase chain react ion, RT-PCR) , 경쟁적 RTᅳ PCR( competitive RT-PCR) , 실시간 RT-PCR(real-time RT-PCR) , RNase 보호 분석법 (RPA:RNase protection assay) , 노던 블랏팅 (northern blotting), DNA 마이크로어레이 칩 (microarray chip), RNA 염기서열분석 (RNA sequencing) , 나노스트링 (nanostring)을 이용한 흔성화 방법, 조직 절편의 인시투 흔성화 방법 (/? situ hybridization) 등 이 있으나， 이들에 한정되는 것은 아니다. 또한 상기 (b) 단계는 FGF12 단백질의 발현 수준을 측정하는 것일 수 있다.
FGF12 단백질의 발현 수준은 FGF12 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이 용하여 검출하거나 측정할 수 있다. 상기 항체는 본 발명의 진단용 조성물에서 기 재한 바와 같다.
FGF12 단백질의 발현 수준 측정 방법은 당업계에서 공지되어 있는 방법은 제 한없이 사용할 수 있으며， 그 예로 웨스턴 블랏팅 (western blotting), 닷 블랏팅 (dot blotting) , 효소면역분석법 (enzyme— 1 inked immunosorbent assay) , 방사능 면 역분석법 (RIA), 방사면역확산법, 오우크테로니 면역 확산법， 로케트 면역 전기영 동, 면역조직화학염색, 면역침전법 (imraunoprecipitation), 보체 고정 분석법, 유세 포 분석법 (FACS) 또는 단백질 칩 (chip) 방법 등이 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 방법의 (c) 단계는 (b) 단계에서 측정한 시료의 FGF12의 발현 수 준을 정상인과 비교하고， 정상인에 비해 FGF12의 발현 수준이 감소한 피검체를 평 활근세포 증식 질환에 걸렸거나 걸릴 가능성이 있는 것으로 판정하는 단계이다. 상기 (b) 단계의 방법으로 피검체의 FGF12의 발현 수준을 측정하고 동일한 방법으로 정상인의 FGF12의 발현 수준을 측정한 후， 피검체와 정상인의 FGF12의 발 현 수준을 비교한다. 본 발명에 따르면 건강한 정상 상태의 평활근세포는 거의 증 식하지 않고， FGF12를 높은 수준으로 발현하지만， 혈관 손상이나 질환 등으로 증식 하는 중인 평활근세포의 FGF12의 발현 수준은 현저하게 낮아진다. 따라서 피검체의 FGF12 발현 수준이 정상인에 비해 감소한 경우 평활근세포가 증식하는 것으로 판단 할 수 있다. 또한 FGF12의 발현 수준이 감소한 정도에 따라 평활근세포 증식성 질환의 발 병 가능성이 있거나， 질환이 이미 진행 중이거나 심화되는 등으로 판단할 수 있다. 진단의 기준이 되는 FGF12의 발현 수준 감소의 정도에 대하여서는 특정 발현 수준 측정 방법에 맞게 당업계에 공지된 기술에 따라 발현 정도의 등급을 나누어 결정할 수 있다. 예를 들어， 다수의 정상인과 환자의 시료에서 FGF12의 발현 수준을 측정 하여 데이터를 축적하고 분석함으로써 FGF12의 발현 수준의 정도에 따라 정상 범 주， 평활근세포 증식성 질환 범주 (또는 질환 중증도의 범주) 또는 발병 가능성의 범주 등으로 구분하여 적절한 진단의 기준을 제공할 수도 있다. 구체적으로 본 발명의 방법은 실시예에 잘 나타나 있다.
본 발명의 일실시예에서는 풍선 색전 제거용 카테터 (bal loon embolectomy catheter)로 손상을 입힌 랫의 총경동맥에서는 손상을 입지 않은 정상 동맥에 비하 여 Ki67을 발현하는 분열하는 평활근세포가 현저하게 증가하고， FGF12의 단백질 발 현 수준은 크게 감소하였음을 면역형광염색으로 확인하였다. 한편 혈관 손상이 회 복되면서 분열하는 평활근세포의 수는 감소하고 FGF12의 단백질 발현 수준은 정상 상태와 비슷한 수준으로 증가하였다. 혈관 손상과 회복에 따른 FGF12 발현 수준의 감소와 증가 경향은 RT— PCR을 통해 mRNA 수준으로도 확인하였다. 본 발명의 다른 일실시예에서는 정상 상태의 마우스 동맥의 평활근세포에서 는 FGF12 단백질을 높은 수준으로 발현하는 반면， 고지방식이를 제공한 Apo 마우 스의 동맥에서는 평활근세포 증식이 증가하였고, FGF12 단백질의 발현은 크게 감소 한 것을 확인하였다. 인간의 동맥경화 동맥 조직에서도 동물 실험에서와 마찬가지 로 FGF12의 단백질 발현이 크게 감소한 것을 면역형광염색실험으로 확인하였다. 본 발명의 또 다른 일실시예에서는 monocrotal ine(MCT)을 주사하여 폐동맥 고혈압을 유도한 실험군 랫에서는 sal ine을 투여한 대조군과 비교하여 폐동맥 혈관 평활근세포에서 FGF12의 단백질 발현이 크게 감소하였고 유전자 발현 또한 크게 감 소한 것을 면역형광염색과 RT-PCR을 통해 확인하였다. 본 발명은 평활근세포 증식성 질환의 치료용 제제를 제조하기 위한 FGF12를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 백터의 용도를 제공한다. 본 발명은 FGF12를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 백 터를 유효성분으로 포함하는 평활근세포 증식성 질환의 치료용 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 평활근세포 증식성 질환 치 료방법을 제공한다. 본 발명은 평활근세포 증식성 질환의 치료용 제제를 제조하기 위한 FGF12 단 백질 또는 이의 단편의 용도를 제공한다. 본 발명은 FGF12 단백질 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 평활근세 포 증식성 질환의 치료용 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것 을 포함하는 평활근세포 증식성 질환의 치료방법을 제공한다. 본 발명은 평활근세포 증식성 질환 진단용 제제를 제조하기 위한 FGF12 mRNA 또는 FGF12 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제의 용도를 제공한다. 본 발명은 FGF12 mRNA 또는 FGF12 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포 함하는 평활근세포 증식성 질환 진단용 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체 에 투여하는 것을 포함하는 평활근세포 증식성 질환 진단 방법을 제공한다. 본 발명의 상기 '유효량' 이란 개체에게 투여하였을 때， 평활근세포 증식성 질환의 개선， 치료, 예방,. 검출 또는 진단 효과를 나타내는 양을 말하며， 상기 '개 체' 란 동물, 바람직하게는 포유동물， 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며， 동 물에서 유래한 세포， 조직， 기관 등일 수도 있다. 상기 개체는 치료가 필요한 환자 (pat ient ) 일 수 있다.
본 발명의 상기 '치료' 는 평활근세포 증식성 질환의 증상을 개선시키는 것 을 포괄적으로 지칭하고， 이는 이러한 질환을 치유하거나， 실질적으로 예방하거나， 또는 상태를 개선시키는 것을 포함할 수 있으며, 평활근세포 증식성 질환으로부터 비롯된 한 가지 증상 또는 대부분의 증상을 완화시키거나， 치유하거나 예방하는 것 을 포함하나， 이에 제한되는 것은 아니다.
【유리한 효과】
따라서 본 발명은 FGF12를 이용한 평활근세포 증식성 질환의 예방， 치료， 진 단용 조성물과 이를 이용한 평활근세포 증식성 질환의 진단 마커 검출 방법을 제공 한다. 본 발명에 따라 FGF12를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 이용하여 평활근세 포에서 FGF12의 과발현을 유도하거나， FGF12 단백질 또는 이의 단편을 평활근세포 로 전달하여 평활근세포의 증식을 효과적으로 억제할 수 있다. 또한 본 발명의 FGF12의 발현 수준을 측정하기 위한 진단용 조성물과 진단 마커 검출 방법은 혈관 시술 등으로 인한 혈관 협착， 재협착, 폐동맥 고혈압 그리고 동맥경화 등 평활근세 포 증식성 질환을 진단하는데 유용하다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 풍선 손상 (bal loon injury)으로 손상된 랫 경동맥에서 손상 후 시간 경과에 따른 FGF12의 발현 경향을 확인한 실험 결과를 나타낸다.
도 1A은 손상된 랫의 경동맥을 Ki67(적색) , FGF12(녹색)， α -SMA (적색)에 대 해 염색한 면역형광염색 실험 결과를 나타낸다. 세포핵은 DAPI 청색)로 염색하였 고， NC는 음성대조군 (negat ive control )를 표시하며， scale bar는 50 μ ηι이다. 도 1B는 FGF12와 평활근세포 (SMC) 마커 유전자 (SM-MHC, SM22 α， SRF)의 mRNA 수준을 보여주는 RT-PCR 결과를 나타낸다. GAPDH는 로딩 콘트를이다. 도 2는 동맥경화가 진행 중인 마우스와 인간 동맥에서의 FGF12 발현 경향을 확인한 실험 결과를 나타낸다.
도 2A는 정상 식이 (ND) 또는 고지방 식이 (HFD)를 12주 동안 제공한 ApoE_/ 마우스의 동맥을 FGF12(녹색)， α -SRiA (적색)에 대해 염색한 면역형광염색 실험 결 과를 나타낸다. 세포핵은 DAPK청색)로 염색하였고， scale bar는 50 μ ηι이다. 도 2Β 는 인간의 정상 동맥 (Normal )과 동맥경화 동맥 (Pat ient ) 조직을 FGF12 녹색)， α - SMA (적색)에 대해 염색한 면역형광염색 실험 결과를 나타낸다. NC는 음성대조군 (negat ive control )을 표시하며， scale bar는 ΙΟΟ μ ηι이다. 도 3은 랫에 모노크로탈린 (monocrotal in, MCT)을 주사하여 제작한 폐동맥 고 혈압 동물 모델의 폐혈관 평활근세포에서의 FGF12 발현을 경향을 확인한 실험 결과 를 나타낸다.
도 3A는 sal ine 또는 모노크로탈린 (MCT) 주사 5주 후 폐 조직에서 FGF12에 대한 면역형광염색을 나타낸다. 도 3B는 RT-PCR을 통해 폐동맥 고혈압 동물 모델에 서 FGF12의 mRNA 발현을 분석한 결과로, 면역형광염색과 마찬가지로 폐동맥 고혈압 동물 모델에서 FGF12의 발현이 현저히 감소한 것을 보여준다. 도 4는 FGF12의 발현이 PDGF-BB에 의해 조절되는 것을 나타내는 실험 결과이 다.
도 4A의 왼쪽 패널은 PDGF-BB(50ng/ml )로 3시간 또는 24시간 동안 자극한 인 간 평활근세포 (HASMC)에서의 FGF12 , CDK1 , SM-MHC raRNA 발현 경향을 보여주는 RT- PCR 결과를 나타낸다. 도 4A의 오른쪽 패널은 PDGF-BB(50ng/ml )로 3시간 또는 24시 간 동안 자극한 인간 폐동맥 혈관 평활근세포 (HPASMC)에서의 FGF12, SM-MHC mRNA 발현 경향을 보여주는 RT-PCR 결과를 나타낸다. 도 4B의 왼쪽 패널은 PDGF- BB(50ng/ml )를 포함하거나 포함하지 않는 기본 배지에서 1일 동안 배양하고 HASMC 를 FGF12 녹색)에 대해 염색한 면역형광염색 사진이다. 세포핵은 DAPI (청색)로 염 색하였고, scale bar는 50 μ ηι이다. 도 4Β의 오른쪽 패널은 PDGF-BB(50ng/ml )를 포 함하거나 포함하지 않는 기본 배지에서 1일 동안 배양하고 HPASMC를 FGF12(녹색)에 대해 염색한 면역형광염색 사진이다. 세포핵은 DAPI (청색)로 염색하였고， scale bar는 50 μ ιη이다. 도 4C는 FGF12 프로모터로 조절되는 루시페라제 리포터 백터 (PGL3-FGF12) 또는 대조군 백터 (pGL3-basic)로 형질전환된지 48시간 후 측정한 루 시페라제 효소 활성을 나타낸다. *는 /? 0.05이고 n=5이다. 도 4D는 PDGF- BB(50ng/ml )으로 자극하고， 신호전달 억제제 (LY294002， PD98059, U0126, SB203580, BIRB796) 처리한 HASMC에서 발현되는 FGF12와 CDK1 mRNA를 나타내는 RT-PCR 결과를 나타낸다. 도 5는 HASMC에서 FGF12에 의해 발현이 조절되는 유전자에 대한 분석을 보여 주는 실험 결과를 나타낸다.
도 5A는 형질전환되지 않은 정상형 (WT) HASMC, pCMV6-Entry로 형질전환된 HASMC(pEntry) , pCMV6-FGF12로 형질전환된 HASMC(pFGF12)의 다중비교를 통해 도출 된 DEG의 숫자를 표시한 벤 다이어그램 (Ve皿 di agram)을 나타낸다. 도 5B는 DAVID 의 funct ional annotat ion cluster ing를 이용하여 도출된 362개 DEG의 gene ontology(GO) term을 나타낸다. Z7수치는 -log로 표시하였다. 도 5C는 FGF12와 세 포 주기 관련 유전자들의 발현 양상을 보여주는 RT-PCR 결과를 나타낸다. 도 6은 FGF12가 세포 주기에 미치는 영향을 보여주는 실험 결과를 나타낸다. 도 6A는 정상형 HASMC(WT) , 공백터 형질전환된 HASMC(pEntry) , FGF12 과발현 하는 HASMC(pFGF12)의 세포 주기를 분석하기 위한 FACS 결과를 나타낸다. 도 6B는 도 6A에서 도출된 세포들의 세포 주기 분포를 정량적으로 나타낸 막대그래프이다. 도 6C는 FGF12가 FBS( IOT)로 유도되는 HASMC 세포 증식에 미치는 영향을 보여주는 MTS 실험 결과를 나타낸다. WT, pEntry에 대하여 *는 ? 0.05를 나타내고 n=5이다. 도 6D는 FGF12가 PDGF-BB(50ng/ml )로 유도되는 HASMC의 세포 증식에 미치는 영향을 보여주는 MTS 실험 결과를 나타낸다. WT, pEntry에 대하여 *는 /? 0.05를 나타내고 n=5이다. 도 6E는 FGF12가 PDGF-BB(50ng/ml )로 유도되는 HPASMC의 세포 증식에 미 치는 영향을 보여주는 MTS 실험 결과를 나타낸다. WT, pEntry에 대하여 *는 ^0.05 를 나타내고 n=6이다. 도 7은 정상형 (WT) 또는 siRNA 형질전환한 HASMC(Cont siRNA, FGF12 siRNA) 를 세포 증식 마커인 Ki67(녹색)에 대하여 염색한 면역형광염색 실험 결과를 나타 낸다. 세포핵은 DAPI (청색)로 염색하였고， scale bar는 50 μ πι이다. 각각의 HASMC에 서 Ki67으로 염색된 세포들에 대한 정량 분석은 하단의 막대 그래프로 표시하였다. 訂， pEntry에 대하여 *는 ?<0.05를 나타내고， n=5이다. 도 8은 FGF12가 유도하는 HASMC의 증식 억제와 p53의 기능적 관계를 보여주 는 실험 결과를 나타낸다.
도 8A는 정상형 또는 형질전환 (pEntry, pFGF!2)된 HASMC에서 발현하는 p53과 p21 mRNA 수준을 보여주는 RT-PCR 결과를 나타낸다. 형질전환된 HASMC mRNA 수준은 WT HASMC의 mRNA에 대한 상대값으로 표시하였다. *는 ^0.05를 나타내고， n=4이다. 도 8B는 정상형 또는 형질전환된 HASMC가 발현하는 FGF12, p53, 인산화된 p53(p- p53) 단백질의 수준을 보여주는 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다. β -act in은 로딩 콘 트를이다. 도 8C는 풍선 손상으로 손상된 ¾ 경동맥을 FGF12(녹색)과 p-p53(적색) 에 대하여 염색한 면역형광염색 실험 결과를 나타낸다. 세포핵은 DAPI (청색)로 염 색하였고， scale bar는 50 μ ηι이다. 도 9는 ρ53의 발현 또는 기능 저하가 HASMC의 증식에 미치는 영향을 보여주 는 실험 결과를 나타낸다.
도 9A는 FGF12를 과발현하기 위한 아데노바이러스 (Ad-FGF12)로 감염되고, p53 siRNA(25nM 또는 50nM) 또는 대조군 siRNA(Cont siRNA)로 형질감염된 후 24시 간째의 HASMC에서 p53 발현을 확인하는 RT-PCR 결과를 나타낸다. GAPDH는 로딩 콘 트를를 나타낸다. 도 9B는 아데노바이러스 감염되거나 (Ad-LacZ, Ad_FGF12) 감염되 지 않은 (WT) HASMC를 siRNA(Cont siRNA, p53 siRNA)로 형질전환시킨 후 Ki67 염색 을 통해 분석한 세포 증식 경향을 나타낸다. 도 9C는 아데노바이러스 감염되가나 감염되지 않은 HASMC를 p53 억제제 (p53 inhibi tor)인 pi f ithrin(lO y M) 또는 PBS 처리한 후 Ki67 염색을 통해 분석한 세포 증식 경향을 나타낸다. 대조군에 대하여 *는 0.05를 나타내고， n=4이며， NS는 유의하지 않음을 나타낸다. 도 9D는 아데노 바이러스 감염되거나 감염되지 않은 HPASMC를 p53 억제제인 pi f i thrin(10 μ Μ) 또는 PBS 처리한 후 Ki67 염색을 통해 분석한 세포 증식 경향을 나타낸다. 대조군에 대 하여 *는 ?<0.05를 나타내고， n=6이며 , NS는 유의하지 않음올 나타낸다. 도 10은 FGF12의 과발현이 혈관신생내막 (neoint ima) 형성에 미치는 영향을 보여주는 실험 결과를 나타낸다.
도 10A는 아데노바이러스 (Ad-LacZ 또는 Ad_FGF12)로 감염되고 풍선 손상을 가한지 2주 경과한 ¾ 총경동맥 (common carot id artery)의 H&E 염색 사진을 나타낸 다. scale bar는 200 μ ιη이다. 도 10B는 풍선 손상된 랫 총경동맥에 대한 형태 분석 (morphoraetric analysis) 결과를 나타낸다. 혈관신생내막 부분 (neoint imal area) , 내막-중간막 부분의 비율 ( int ima to medial area rat ios , I/M) , 관강내 협착 ( luminal stenosi s , %)에 대한 정량 분석 결과를 막대 그래프로 표시하였다. *는?<0.05를 나타내고， n=5이다. 도 10C는 아데노바이러스 (Ad-LacZ, Ad-FGF12)로 감염 되고 풍선 손상된 랫 총경동맥에서 FGF12(녹색)의 발현 양상과 Ki67(적색) 염색을 통한 세포 증식 경향을 면역형광염색을 통해 나타낸다. 도 10C의 왼쪽 패널에서 흰 색 점선으로 표시된 부분은 확대하여 도시한 영역을 나타낸다. 도 10C의 오른쪽 패 널에서 흰색 화살표 표시는 Ki67을 높은 수준으로 발현하는 증식 중인 세포를 표시 한다. Scale bar는 200 μ πι이다. 도 11은 FGF12의 과발현이 인간 혈관 평활근세포와 혈관 내피세포의 증식에 미치는 영향을 보여주는 실험 결과를 나타낸다.
도 11A는 Ad-FGF12로 형질전환하거나 바이러스 처리하지 않은 HUVEC 세포 또 는 hASMC 세포를 FGF12 녹색)， Ki67(적색)에 대하여 면역형광염색한 결과를 나타낸 다. 세포핵은 DAPI (청색)으로 염색하였다. HUVEC Ad-FGF12 도면에서 흰색 * 표시는 Ad-FGF12로 형질감염된 HUVEC 세포에서 FGF12와 Ki67를 동시에 발현하는 세포를 표 시한 것이다. hASMC Ad-FGF12 도면에서 흰색 화살표 표시는 Ad-FGF12로 형질감염된 hAMSC 세포에서 FGF12를 발현하지 않으면서 Ki67을 발현하는 세포를 표시한 것이 다. 도 11B는 도 11A의 Ki67 염색 결과를 Ki67로 염색된 세포의 비율 (%)로 정량화 한 막대 그래프를 나타낸다.
【발명의 실시를 위한 형태】
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명올 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실 시예에 한정되는 것은 아니다.
<실험방법 >
동물 실험
동물 실험은 9-10주령 수컷 Sprague-Dawley(SD) 랫 (rat ; Or ient ) , apo l ipoprotein E 넉아웃 마우스 (ApoE— /_ mice ; Japan SIX)를 이용하였다. 랫은 정 상 식이 (normal chow diet )와 물을 무제한 제공하였다 ( / libitum) . ApoE_/" 마우스 는 4주간 정상 식이 (normal diet , ND) 또는 서구 고지방식이 (western-type high fat diet , HFD; 42% of total calror ies from fat , 0. 15% cholesterol； REsearch Diets)를 공급하였다. 실험에 사용한 동물들은 미국 국립보건원 (Uni ted States Nat ional Inst i tute of Heal th)의 실험 동물의 관리와 이용에 대한 지침 (guide for the Care and Use of Labor tory Animal s)에 따라 다루었다. 또한 동물 실험 프로토 콜은 기관동물관리이용위원회 ( Inst i tut ional Animal Care and Use Commi ttee)의 허 가를 받았다. 수술 절차를 위해서는 마우스와 랫은 케타민 (ketamine; 마우스， 79.5mg/kg; 랫， 80mg/kg)과 자일라진 (xylazine; 마우스 9.1mg/kg; 랫， 5mg/kg)을 복강 주사하여 마취하였다. 적정 마취 수준은 페달 회피 반사 반웅 (pedal withdrawal reflex response)으로 확인하였다 . - 랫 경동맥 손상 모델
¾ 경동맥 손상모델 (rat carotid injury model)을 위하여 SD 랫은 마취하고 경부 중앙을 절개하여 총경동맥 (common carotid artery)을 노출하였다. 2F Fogarty 풍선 색전제거용 카테터 (2F Fogarty balloon embolectomy catheter, Baxter)를 경 동맥 외부에서 삽입하여 흉부 대동맥까지 진입시켜서 부풀린 뒤, 삽입 부위까지 빼 내는 과정을 세 번 반복하였다. 아데노바이러스를 이용한 유전자 전달은 lxlO9 플라 크 형성단위 (plaque forming unit )/100ml 농도의 아데노바이러스를 총경동맥을 묶 은 부위 (ligated segment)에 30분 동안 주입하였다. 이후 외부 경동맥을 영구하게 묶고 총경동맥의 혈류를 회복시켰다. 풍선 손상 (ballon injury) 2주 후에 총경동맥 을 채취하여 조직학적으로 검사하였다. 형태적 특성 분석
형태적 특성 분석 (morphometric analysis)을 위하여 경동맥을 고정시키고， 탈수시킨 후 파라핀에 내장하였다. 경동맥 조직 절편 (5μιη)는 헤마특실린 에오신 (hematoxylin & eosin, 廳)으로 염색하였다. 실험 조건을 알지 못하는 (bl inded) 연구자에 의해 3개의 별개의 손상 동맥의 중심부 절편에 대한 형태적 분석을 실시 하였다. NIS Elements Imaging Software(Nikon)를 이용하여 내막-중간막 부분의 비 율 (intimal to medial area ratios, I/M) , 관강내 협착 (luminal stenosis, %) 그리 고 신생혈관내막 부분 (neointimal area)을 측정하였다. 인간 동맥경화 조직
임상 연구 프로토콜 (clinical research protocol)은 지역윤리위원회 (local ethical committee, I RB2014-04-077, 삼성의료원)의 허가를 받았으며， 모든 환자들 은 고지에 입각하여 동의하였다. 인간의 동맥경화 조직은 경동맥내막절제술 (carotid endarterectomy)을 받은 환자로부터 채취하였다. 면역조직학적 분석을 위 하여 채취한 조직은 포르말린으로 고정하고 파라핀에 내장하였다. 폐동맥 고혈압 동물 모델
랫 폐동맥 고혈압 동물 모델을 제작하기 위하여 SD 랫을 대조군， 모노크로탈 린군 (monocrotaline)으로 나누었다. 모노크로탈린 (300mg; monocrotal ine, MCT)은 1M HC1을 1.8 ml에 녹인 후 증류수 3~4 ml올 추가한 후， 1M NaOH를 이용하여 pH 7.4로 맞추고 증류수를 추가하여 15ml의 수용액으로 만들었다. 모노크로탈린군에는 모노크로탈린 수용액 (60mg/kg)을 1회 피하 주사하였고 대조군은 동량의 생리식염수 를 피하 주사하였다. 실험은 모노크로탈린 주사 후 5주 째 동물을 회생시켜 실험하 였다. 면역형광염색
면역형광염색 (i隱 unofhiorescent staining)은 조직 절편 또는 세포를 Ki67(Dako Inc.), FGF12(Abcam) , phospho-p53(p-p53； Cell Signaling Technology), α-평활근액틴 (smooth muscle act in, a— SMA; Sigma) 또는 SM22 a (Abeam)에 대한 1 차 항체와 적절한 형광표지된 2차 항체 (Molecular Probes)로 염색하여 실시하였다. 세포핵은 4,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)으로 염색하였다. 염색된 세포는 형 광현미경 (Nikon)으로 관찰하였으며， 도면은 3번의 별도의 실험을 대표하는 사진으 로 도시하였다. 역전사중합효소 연쇄반웅
역전사중합효소 연쇄반응 (reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)을 위한 세포나 조직의 총 알엔에이 (total R A)는 Trizol reagent (Invitrogen)를 이용하여 분리하였다. 총 알엔에이로부터 해당 유전자 특이 적 프라이머와 Superscript first-strand synthesis kit (Invitrogen)를 이용하여 cDNA를 합성하고， PCR로 30-35사이클 증폭하였다. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)를 로딩 콘트를로 이용하였다. 실시간 중합효소 연쇄반웅 (real-time PCR)은 SYBR— Green PCR master mix(Appl ied biosystems)와 StepOnePlus ™ Real Time PCR System(Ap l ied Biosystems)을 이용하여 실시하였다. 데이터는 AACt 방법에 따라 분석하고， GAPDH에 대하여 표준화하였다. PCR 반웅에 사용한 프라이머는 하기 표 1에 기재하였다. 【표 1]
Figure imgf000036_0001
세포 배양
인간 대동맥 혈 관 평활근세포 (human aortic vascular smooth muscle cell, HASMC; ScienCe 11 Research laboratories) 및 인 간 폐동맥 혈관 평활근 세포 (human pulmonary aortic vascular smooth muscle cell, HPASMC , Sc i enCe 11 Re search laboratories)는 평활근 증식 배지 (smooth muscle growth medium, SMGM; ScienCe 11 Research labor a tories) 또는 기본 배지에서 배양하였다. 화합물 억제 제 실험을 위해서는 HASMC 및 HPASMC는 pif ithrin(10yM; Sigma), LY294002(20 M; Cell Signaling Technology), PD98059(50 μΜ; Cell Signaling Technology), UO 126(10 μ Μ; Cel l Signal ing Technology) , SB203580(50 μ Μ; Cel l Signal ing Technology) , BIRB796(10 μ M; Me rck)로 24시간 동안 37°C에서 전처리하였다 (pretreatraent ) . 형질전환
FGF12를 과발현하기 위한 형질전환 (또는 형질감염; transfect ion)은 인간 FGF12 cDNA와 100% 아미노산 서열 상동성을 갖는 쥐의 상동유전자 (◦ r igene)를 암 호화하는 발현 백터 (c-말단이 Myc-DDK로 표지된 pCMV6-Entry)를 이용하였다. HASMC
TM
및 HPASMC는 Lipofectamien 2000을 이용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 pCMV6- FGF12(pFGF12) 또는 p CMV6-Entry(pEntry) 대조군 백터로 형질전환하고， 2주 동안 G418(Sigma)를 이용한 선택 과정을 거쳤다. FGF 12나 p53의 발현 억제 실험에서는
TM
subconf luent HASMC를 Lipofectamien 2000을 이용하여 해당 유전자에 특이적 또 는 비특이적인 smai i interfering RNA(siRNA; GE Healthcare)로 형질전환하였다. s iRNA 염기서열은 표 2에 나타내었다.
【표 2]
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Figure imgf000037_0001
cDNA 마이크로어레이
cDNA 마이크로어레이 (microarray)는 제조자 프로토콜에 따라 수행하였다 (Af fymetrix Genchi Human Gene 1.0 ST ol igonucleot ide array) . 간략히， 바이오 틴 표지된 cDNA는 RNeasy Mini Ki t column(Qiagen Inc . )을 이용하여 동량의 총 RNA로부터 합성하였다. Gene Chip Whole Transcript Sense Target Label ing Assay 매뉴얼 (Affymetrix)에 따 라 cDNA 프로브를 흔성화 (hybr idizat ion)한 뒤， Genechip Array scanner 3000 7G(Af fymetrix)를 이용하여 칩 을 스캔하고， 스캔된 이미지는 Affymetrix command console 소프트웨어 (version 1.1)를 이용하여 분석하였다 . p 수치가 0.05 미만 (/?<0.05)인 프로브를 분석에 사용하고， Robust Mult i-array Average no rmal iat ion 방법에 따라 표준화하였다. 발현 수준이 2배 이상 차이가 나는 전사물 (transcript )을 차별적으로 발현되는 유전자 (di f ferent ial ly expressed genes , DEGs)로 정의하였다. 도출된 DEG들은 Database for Anno tat ion, Visual izat ion and Integrated Di scovery(DAVID)를 이용하여 gene ontology(GO) term enr ichment 분석을 수행하였다. 세포 주기 분석
세포 주기 분석 (cel l cycle analysi s)을 위하여 세포를 혈청 결핍 (serum starvat ion)시키고， SMGM으로 24시간 동안 자극하였다. 이후 트립신 처리하고 세척 한 후 -20°C의 70% 에탄을로 고정하였다. 세포는 propidium iodine(PI ) 버퍼 (50 μ g/ml PI , 0.1% Triton-X, 0.1 mM EDTA, 0.05 mg/ml RNase)에 재분산시키고, BD FACSCal ibur(Becton, Dickinson and Company)를 이용하여 분석하였다. 세포 주기 분포는 소프트웨어로 분석하였다. 세포 증식 분석
세포 증식 (cel l prol i ferat ion analysis) 분석을 위해 세포들은 24웰 플레 이트에 3세트로 접종하고 (tripl icate) , 50ng/ml platelet derived growth factor— BBCPDGF-BB; R&D systems) 또는 10% FBS를 포함하는 기본 배지에서 배 양하였다. 세포 증식은 MTS 실험 (MTS assay; Promega) 또는 항 -Ki67 IgG(Dako)를 이용한 면역 형광실험으로 확인하였다. Ki67으로 염색된 세포 (Ki67+ 세포)의 정량분석을 위해 서는 샘플당 다섯 개의 대표적인 칼라 이 미지를 무작위로 촬영하고， 각 이미지 상 의 총 세포 수에 대한 Ki67+ 세포 수의 평균을 Ki67+ 세포의 백분율 로 표시하였 다. 루시퍼라제 리포터 실험
루시퍼라제 리포터 실험 ( luci f erase report er assay)을 위하여 약 2000 base pair의 FGF12 유전자의 5-UTR을 반딧불 발광 효소 리포터 백터 (firefly 1 ucif erase reporter vector, pBL3-phFGF12)에 클로닝하였다. HASMC는 공백터 (pGL3- basic) 또는 pBL3-phFGFl 2를 형질전환 대조군인 활성 지속형 (const i tut ively active) β-갈락토시다제 (galactosidase) 리포터 플라스미드와ᅳ함께 형질전환하였 다. 48시간 후 루시퍼라제와 갈락토시다제 활성을 루시퍼라제와 갈락토시다제 실험 키트 (Stratagene)를 이용하여 분석하였다. 루시페라제 활성은 갈락토시다제 활성에 대하여 표준화하고， pGL3— basic으로 형질전환하고 PDGF-BB(50ng/ml )을 포함하는 배 지에서 1일 동안 배양한 HASMC에서 측정된 루시퍼라제 활성에 대한 상대값으로 나 타내었다. 아데노바이러스 제작
아데노바이러스 생산 (adenovirus production)을 위하여 인간의 FGF12 cDNA 를 pShuttle-CMV 백터에 서브클로닝하고， pAdEasy-1 백터 (Qbiogene)를 이용하여 재 조합 아데노바이러스 플라스미드를 제작하였다. 실험에 사용한 재조합 아데노바 이 러스는 ViraQuest Inc. 사에서 제작 분리하였다. 웨스턴 블랏팅
세포 용해물 (lysate)은 SDS-PAGE로 분리하고， 단백질 밴드는 블랏으로 옮겼 다. 블랏은 FGF12(Abcam)， p-p53(Cell Signal in g Technology), p53(BD Biosciences) , p-actin(Santa Cruz biotechnology) 등 적절한 1차 항체와 horserad is peroxidase 결합된 2차 항체로 반응시켰다. 항체와 반응한 단백질 밴 드는 화학발광시약 (chemi luminescen t reagent； Amersham Biosciences)으로 확인하 였다. 통계 분석
모든 데이터는 평균士표준오차 (means土 SEM)로 표시하였다. 통계적 유의성은 one way analysis of variance 이푸 Bonferroni ' s post hoc multiple comparison test를 실시하였다. ?<0.05인 수치를 통계적으로 유의한 것으로 판단하였다. 표본 (sample)의 수는 n으로 표시하였다.
<실시예 1>
손상된 동맥에서의 FGF12 차등 발현 경향 <1-1> 풍선 부상 동맥에서의 FGF12 발현 저하
손상된 동맥에서의 FGF12의 발현 양상을 확인하였다.
정상인 랫 (rat )의 대동맥의 중간막 (medial layer)에서 α -SMC를 발현하는 ( a -SMC+) 평활근세포 (SMC)에서는 FGF12가 높은 수준으로 발현되지만 (도 1A, Day 0) , 풍선 손상 (bal loon injury) 7일 후의 신생혈관내막 (neoint imal lyaer)의 증식 중이 고 (Ki67+) , α -SMC를 발현하지 않는 ( a -SMC-) 비수축성 평활근세포에서는 FGF12의 발현이 현저하게 감소하였다. 손상에 대한 부분적인 회복이 일어나는 풍선 부상 15 일째 신생혈관내막의 a -SMC+ 평활근세포에서는 FGF12의 수준이 다시 증가하였다. 혈관 손상으로 인한 FGF12의 발현 수준의 변화는 SM-MHC, SM22 a , SRF 등의 평활근 세포 수축성 마커 유전자의 발현과 시기적으로 병행하여 일어나는 것을 RT-PCR을 통해 확인할 수 있었다 (도 1B) .
<1-2> 동맥경화에서의 FGF12 발현 저하
동맥경화가 진행 중인 동맥에서의 FGF12의 발현 양상을 확인하였다.
동맥경화의 동물 모델인 고지방 식이를 제공한 ApoE_/— 마우스의 동맥에서
FGF12의 발현 패턴은 대동맥 플라크 (aort ic plaque)에서 α -SMC의 발현 패턴과 거 의 일치하는 것으로 나타났다 (도 2A) . 인간 동맥경화 환자의 경동맥 환자 조직 표 본에 대한 면역조직학적 분석에서도 FGF12는 a— SMC+ 중간막 평활근세포에서 선택 적으로 발현되고 동맥경화로 손상된 부위의 a -SMC- 평활근세포에서는 그 발현이 크게 감소하여 동물 모델에서와 일관된 결과를 확인하였다 (도 2B) .
<1-3> 폐동맥 고혈압에서의 FGF12 발현 저하
폐동맥 고혈압 동물 모델에서 FGF12의 발현 양상을 확인하였다.
모노크로탈린을 주사하여 만든 폐동맥 고혈압 동물 모델에서 FGF12의 발현은 현저히 감소하였고 (도 3A, MCT) , 정상 랫에서는 높은 발현 양상을 나타내었다 (도 3A, sal ine) RT-PCR을 통해 FGF12의 발현 패턴을 확인한 결과에서도 sal ine을 주사 한 그룹보다 MCT를 주사한 그룹에서 FGF12의 유전자 발현이 현저히 감소한 것을 확 인하였다 (도 3B) .
이상의 실험 결과는 FGF12의 발현 수준이 혈관 평활근세포의 증식과 밀접하 게 연관되어 있음을 보여준다. 즉 증식하지 않는 평활근세포에서는 FGF12가 높은 수준으로 발현되고， 증식 중인 평활근세포에서는 FGF12의 발현 수준이 현저하게 감 소한다.
<실시예 2>
혈관 평활근세포 증식 촉 ᅵ인자 PDGF-BB에 의한 FGF12 발현 조절
FGF12의 발현이 혈관 평활근세포의 강력한 분열촉진물질 (mi togen)인 PDGF-BB 에 의해 조절되는지 확인하였다.
PDGF-BB를 기본 배지에 첨가한지 3시간 후 인간 대동맥 평활근세포 (human aort ic smooth muscle cel l , HASMC) 및 인간 폐동맥 평활근세포 (human pulmonary aort i c vascular smooth muscle cel l , HPASMC)에서 FGF12의 mRNA 수준이 크게 감소 하는 것을 RT-PCR로 확인하였다 (도 4A) . PDGF-BB로 자극한 지 24시간 뒤에는 FGF12 의 mRNA 수준은 더욱 감소하고， 증식 마커 유전자인 CDK1은 증가하였으며 수축성 유전자인 SM-HMC는 감소하였다. PDGF-BB로 처리한 HASMC 및 HPASMC에서의 FGF12의 발현 수준이 감소했음은 면역형광염색 실험으로도 확인할 수 있었다 (도 4B) . FGF12 의 프로모터를 이용한 리포터 실험 결과에서는 기본 배지에서 PDGF-BB를 제거하였 을 때 FGF12 프로모터의 전사 활성 (transcr ipt ional act ivi ty)를 현저하게 증가하 는 것을 관찰하였으며 (도 4C) , 이는 PDGF-BB가 FGF12의 발현을 전사 수준에서 억제 하는 것을 보여준다.
PDGF-BB 신호 전달계에 의한 FGF12의 발현 조절 기작을 알아보기 위하여 다 양한 신호 전달 억제제 ( inhibi tor)를 처리하고 RT-PCR로 FGF12의 발현 양상을 확인 하였다 (도 4D) . PI3 kinase (PI3K) 억제제인 LY294002는 HASMC에서 PDGF—BB로 인한 FGF12의 발현 억제 효과를 소멸시켰다. 그러나 MEK, ERK 또는 p38 MAPK 신호전달 억제제들은 FGF12의 발현에 아무 영향을 미치지 않았다. 즉, PDGF-BB가 FGF12 유전 자의 전사를 PI3K 신호전달을 통해 억제하는 것을 보여준다. 유사하게 혈관 평활근 세포의 증식을 촉진하는 FBS로 자극한 HASMC 및 HPASMC에서 FGF12의 발현이 크게 감소한 것을 확인하였다 (데이터 미도시) .
<실시예 3>
FGF12에 의하 혈관 평활근세포 증식 억제 <3-1> FGF12에 의한 유전자 발현 조절
FGF12가 혈관 평활근세포의 증식을 조절할 수 있는지 여부를 HASMC에서 FGF12를 과발현하는 기능획득실험 (gain of funct ion)과 마이크로어레이 (mi croarray)를 통한 유전자 분석 경향 분석을 통해 알아보았다.
유전자 발현 경향에 대한 비교 분석 결과， FGF12를 과발현하는 HASMC(pFGF12)와 2종류의 대조군 (정상형 (WT) HASMC와 공백터 (pEntry)로 형질전환된 HASMC) 간에 362가지 유전자가 공통적으로 차별적으로 발현되는 유전자 (di f ferent ial ly expressed genes , DEG)임을 확인하였다 (도 5A) . 362개의 DEG에 대 한 GO enr ichment 분석 결과, FGF12를 과발현하는 HASMC에서는 세포 주기 DNA 손 상에 대한 반응， 미세관 세포골격 조직 (mi crotubule cytoskeleton organi zat ion) 그리고 염색질 형성과 분해 (chromat i c assembly and di sassembly) 등의 생물학적 과정이 크게 변경되어 있음을 알 수 있었다 (도 5B) . 특히 세포 주기 진행에 연관된 유전자 (CDKl , CDK2 , CCNA2 , CDC6 , CDC20)의 발현이 FGF12를 과발현하는 HASMC에서 현저하게 감소한 것을 RT-PCR을 통해 확인하였다 (도 5C) .
<3-2> FGF12에 의한 세포 분열 억제
FGF12의 발현이 세포 주기에 미치는 영향을 더욱 분석하였다.
세포들의 세포 주기 상태를 분석한 결과， FGF12를 과발현하도록 형질전환된 HASMC들은 대조군에 비하여 G1 단계에 있는 세포들의 비율이 현저히 높았다 (도 6A- B) . MTS 세포 증식 실험 결과 역시 FGF12를 과발현하는 HASMC 세포에서 혈청 (serum) 또는 PDGF-BB에 의하여 유도되는 세포 증식이 현저하게 억제되는 것으로 나타났다 (도 6C-D) . 또한 FGF12를 과발현하도록 형질전환된 HPASMC에서도 PDGF-BB 가유도하는 세포 증식이 현저하게 억제되는 것으로 나타났다 (도 6E) .
이상의 실험 결과는 FGF12의 과발현이 혈청 또는 PDGF-BB가 유도하는 HASMC 및 HPASMC의 증식을 억제하는 데 층분함을 보여준다. 또한， FGF12의 발현이 HASMC의 휴지기의 세포 분열 억제에 필수적인지 알아 보았다. HASMC를 혈청이나 PDGF-BB를 포함하지 않는 기본 배지에서 3일 동안 배양 하였다. 상기 결핍 (starvat ion) 조건에서 FGF12 siRNA를 이용하여 FGF12의 발현을 억제하고 Ki67 염색한 결과， FGF12 siRNA 처리한 HASMC에서는 세포 증식이 크게 증 가한 것으로 나타났다 (도 7) .
이상의 결과는 결핍 상태에 있는 HASMC의 휴지기 세포 분열 억제에 FGF12의 발현이 필수적임을 보여준다.
<실시예 4> FGF12에 의한 평활근세포 증식 억제에서 D53 신호전달의 활성화 <4-1> FGF12에 의한 p53의 발현 조절
FGF12가 HASMC의 세포 증식을 억제하는 분자적 기작을 밝히기 위하여 FGF12 와 p53의 기능적 관계를 알아보았다.
먼저 실시예 <3-1>의 마이크로어레아 결과를 심층 분석한 결과, FGF12를 과 발현하는 HASMC의 DEG 중에 p53에 의해 전사가 조절되는 유전자 (CDKN1A, CDK1 , CCNE, BRCAl , CCNBl , MDM2)들이 다수 포함되어, FGF12 과발현에 의해 p53 신호전달 계가 활성화되어 있을 가능성이 제시되었다. RT-PCR 결과， 실제로 FGF12를 과발현 하는 HASMC에서는 p53이 작접 전사를 조절하는 p53과 p21 mRNA 수준이 정상형 (WT) 이나 공백터 (pEntry)로 형질전환된 HASMC에 비해 크게 증가하였다 (도 8A) . FGF12를 과발현하는 HASMC에서 p53 단백질과 인산화된 p53 단백질 (phosphorylated p53 , p- p53) 수준이 크게 증가한 것을 웨스턴 블랏으로도 확인하였다 (도 8B) . 랫의 경동맥 손상 조직 표본에서도 FGF12와 p-p53의 발현 경향이 매우 유사한 것으로 나타났다( 도 8C) . 정상 상태 (Day 0)의 랫 대동맥 중간막에 존재하는 FGF12를 발현하는 SMC에 서 p-p53이 높은 수준으로 감지되었으나， 혈관신생내막 (neoint imal l ayer , Day 7) 의 FGF12를 발현하지 않는 대부분의 SMC에서는 p-p53가 감지되지 않았다. 한편 혈 관신생내막에서 SMC가 FGF12 발현하는 15일째 (Day 15)에는 혈관신생내막에서 FGF12 를 발현하는 많은 SMC들에서 p-p53가 감지되었다.
이상의 실험 결과는 FGF12의 발현과 혈관 평활근세포에서의 p53의 발현 사이 에 밀접한 관련이 있음을 보여준다.
<4-2> FGF12로 인한 세포 증식 억제에서 p53의 역할
FGF12가 유도하는 HASMC의 세포 증식 억제에서 p53의 기능을 밝히기 위하여 p53 siRNA와 p53 억제화합물을 이용하여 p53 신호전달계를 억제하고 HASMC 및 HPASMC 세포 증식에 미치는 영향을 알아보았다.
FGF12를 포함하는 아데노바이러스 (Ad— FGF12)로 감염된 HASMC를 p53 siRNA로 형질전환하고, p53 siRNA에 의해 p53 mRNA 수준이 현저히 감소하는 것을 확인하였 다 (도 9A) . p53 siRNA에 의하여 p53의 발현이 저해 (knockdown)된 HASMC에서는 FGF12로 인한 세포 증식 억제 효과도 크게 감소하였으며 (도 9B) , 마찬가지로 p53 억제제인 pi f i thr in 또한 Ad-FGF12로 감염된 HASMC의 세포 증식을 크게 향상시키는 효과를 보였다 (도 9C) . 또한 p53 억제제인 pi f i thr in은 Ad-FGF12로 감염된 HPASMC 의 세포 증식도 크게 향상시키는 효과를 보였다 (도 9D).
이상의 실험 결과는 FGF12는 p53의 발현과 활성화를 촉진함으로써 HASMC 및 HPASMC의 증식을 억제하는 것임을 보여준다.
<실시예 5>
FGF12 과발현에 의한 체내 혈관 손상 치료 효과
FGF12의 과발현이 혈관 손상으로 인한 혈관신생내막 (neointima)의 형성을 억 제할 수 있는지 경동맥 풍선 손상 모델을 이용하여 알아보았다.
경동맥에 풍선 부상을 일으킨 랫에 아데노바이러스를 이용하여 FGF12를 과발 현하고, 손상된 혈관의 변화를 면역조직학적으로 분석하였다 (도 10). 풍선 손상 14 일 후， Ad-FGF12 아데노바이러스로 감염시킨 혈관은 Ad-LacZ 아데노바이러스로 감 염시킨 대조군 혈관과 비교하여 혈관 벽이 현저하게 얇았으며 (도 10A), 신생혈관내 막 부분 (neointima 1 area), 내막-중간막 부분의 비율 (intima/media ratio, I/M), 관강내 협착 (luminal stenosis, %) 등 혈관 손상의 지표가 모두 현저하게 감소하였 고， 혈관신생내막 형성이 전체적으로 약 50% 감소한 것으로 나타났다 (도 10B). 또 한 Ad-FGF12 아데노바이러스로 감염시킨 혈관에서는 대조군과 비교하여 Ki67을 발 현하는 세포의 수가 크게 낮아, 세포 분열과 증식의 정도가 대조군보다 크게 낮음 을 보여주었다 (도 10C).
이상의 결과는 체내 혈관에서 FGF12를 과발현함으로써 손상된 혈관의 혈관신 생내막 형성을 억제할 수 있음을 보여준다.
<실시예 6>
FGF12 과발현이 혈관 내피세포 증식에 미치는 영향
FGF12가 혈관 내피세포 (vascular endothelial cell)의 증식에 미치는 영향을 알아보았다.
HUVEC(huraan umbilical vein endothelial cell) 또는 인간 대동맥 평활근세 포 (hASMC) 세포에서 아데노바이러스를 이용하여 FGF12를 과발현하고 (Ad-FGF12)， 세 포 증식의 마커인 Ki67단백질에 대하여 면역형광염색하였다.
그 결과， 인간 대동맥 평활근세포 (hASMC)에서는 앞선 실시예에서 확인한 바 와 같이， FGF12를 과발현하면 세포의 분열과 증식이 현저하게 감소하는 것을 관찰 하였다 (도 11). 각각의 세포에서 Ki67을 발현하는 분열 중인 세포의 수는 도 11B에 도시한 바와 같다. Ad— FGF12로 감염된 hASMC에서는 바이러스 감염하지 않은 세포에 비하여 Ki 67을 발현하는 세포의 수가 현저하게 줄었을 뿐만 아니라， Ki 67를 발현하 는 세포들은 대부분 FGF12를 발현하지 않는 세포임을 알 수 있었다 (도 11A, MSMC Ad-FGF12 , 도면에서 흰색 화살표로 표시한 세포) . 이에 반하여 HUVEC 세포에서는 Ad-FGF12로 형질전환하여 FGF12를 과발현하더라도， 바이러스 감염하지 않은 세포와 비교하여 Ki67를 발현하는 세포의 숫자에는 큰 차이가 없었다. 특히 Ad-FGF12로 형 질전환한 HUVEC 세포에서는 FGF12와 Ki67을 모두 높은 수준으로 발현되는 세포 (도 11A, HUVEC_ Ad-FGF12 , 도면에서 흰색 *로 표시한 세포)들이 관찰되어 FGF12의 발 현이 내피세포의 분열에 영향을 미치지 않음을 분명하게 나타내었다.
이상의 실험 결과는 FGF12는 혈관 평활근세포에서만 특이적으로 세포 증식 억제 효과를 나타내며， 혈관 내피세포의 분열과 증식을 억제하는 효과가 없음을 보 여준다.
【산업상 이용가능성】
이상 살펴본 바와 같이 FGF12를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 FGF12 단 백질을 유효성분으로 하는 본 발명의 조성물을 이용하여 평활근세포의 증식을 효과 적으로 억제할 수 있는 유전자 또는 단백질 치료제로 개발할 수 있다. 특히 본 발 명의 조성물은 혈관에서 평활근세포에 인접한 내피세포에는 영향을 미치지 않기 때 문에 혈관 평활근세포 특이적이고 부작용이 적은 치료제를 개발할 수 있다. 또한 본 발명의 FGF12의 발현 수준을 측정하기 위한 진단용 조성물과 진단 마커 검출 방 법은 혈관 시술 등으로 인한 혈관 협착， 재협착, 폐동맥 고혈압 그리고 동맥경화 등 평활근세포 증식성 질환의 진단 시약이나 키트로 개발하는데 유용하게 이용할 수 있다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
FGF12를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 백터를 유효 성분으로 포함하는 평활근세포 증식성 질환의 치료용 조성물.
【청구항 2】
제 1항에 있어서， 상기 FGF12를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 또는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 3]
제 1항에 있어서， 상기 평활근세포 증식성 질환은 혈관협착증ᅳ 혈관재협착증, 폐동맥 고혈압， 동맥경화증， 아테롬성 동맥경화증， 심부전증， 심근경색증， 협심증, 부정맥증, 선천성 심장질환증， 뇌졸중 및 말초혈관협착증으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
[청구항 4】
제 1항에 있어서， 상기 재조합 발현 백터는 재조합 바이러스 백터인 것을 특 징으로 하는 조성물.
【청구항 5】
제 4항에 있어서, 상기 재조합 바이러스 백터는 아데노바이러스 백터， 아데노 연관바이러스 (AAV) 백터， 레트로바이러스 백터， 허피스바이러스 백터， 렌티바이러 스 백터， 백시니아바이러스 백터 및 폭스바이러스 백터로 이루어진 군에서 선택되 는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 6】
FGF12 단백질 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 평활근세포 증식성 질환의 치료용 조성물.
【청구항 7】
제 6항에 있어서， FGF12 단백질은 서열번호 2 또는 서열번호 4로 표시되는 아 미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 8]
FGF12 mRNA 또는 FGF12 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 평 활근세포 증식성 질환 진단용 조성물.
【청구항 9]
제 8항에 있어서， 상기 제제는 FGF12 mRNA에 특이적으로 결합하는 프로브 또 는 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 10]
제 9항에 있어서 , 상기 FGF12 mRNA는 서열번호 1 또는 서열번호 3으로 표시되 는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 11】
제 9항에 있어서， 상기 프라이머 세트는 서열번호 15 및 서열번호 16으로 표 시되는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 12]
제 8항에 있어서， 상기 제제는 FGF12 단백질에 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 13]
제 12항에 있어서， 상기 FGF12 단백질은 서열번호 2 또는 서열번호 4로 표시 되는 아미노산서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 14]
평활근세포 증식성 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여
(a) 피검체의 시료를 제공하는 단계; 및
(b) 상기 시료에서 FGF12의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 FGF12의 발현 수준을 정상인과 비교하고， 정상인에 비해 FGF12의 발현 수준이 감소한 피검체를 평활근세포 증식성 질환에 걸렸거나 걸릴 가능성이 있는 것으로 판정하는 단계를 포함하는 평활근세포 증식성 질환의 마커를 검출하는 방법
【청구항 15]
제 14항에 있어서， 상기 (a) 단계의 시료는 혈관 평활근세포 또는 혈액인 것 을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 16]
제 14항에 있어서， 상기 (b) 단계의 FGF12의 발현 수준은 FGF12 mRNA의 발현 수준인 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 17】
제 14항에 있어서， 상기 (b) 단계의 FGF12의 발현 수준은 FGF12 단백질의 발현 수준 인 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 18】
평활근세포 증식성 질환의 치료용 제제를 제조하기 위한 FGF12를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 백터의 용도.
【청구항 19】
FGF12를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 백터를 유효 성분으로 포함하는 평활근세포 증식성 질환의 치료용 조성물의 유효량을 이를 필요 로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 평활근세포 증식성 질환 치료방법.
【청구항 20】
평활근세포 증식성 질환의 치료용 제제를 제조하기 위한 FGF12 단백질 또는 이의 단편의 용도.
【청구항 21]
FGF12 단백질 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 평활근세포 증식성 질환의 치료용 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하 는 평활근세포 증식성 질환의 치료방법.
【청구항 22]
평활근세포 증식성 질환 진단용 제제를 제조하기 위한 FGF12 m NA 또는 FGF12 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제의 용도.
【청구항 23]
FGF12 mRNA 또는 FGF12 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 평 활근세포 증식성 질환 진단용 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하 는 것을 포함하는 평활근세포 증식성 질환 진단 방법 .
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