KR20160062517A - Ｄｐｐ­４ 저해제를 유효성분으로 함유하는 혈관 석회화 억제용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 DPP-4(dipeptidyl peptidase-4) 저해제를 유효 성분으로 함유하는 혈관 석회화(Vascular calcification) 억제용 조성물, DPP-4를 포함하는 혈관 석회화 억제제 스크리닝용 조성물 및 이를 이용한 혈관 석화화 억제제의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, DPP-4 저해제는 혈관 석회화를 효과적으로 억제할 수 있으므로 이를 혈관 석회화와 관련된 심혈관 질환, 신장 질환 및 노화 등의 각종 성인병을 예방 또는 치료할 수 있는 치료제로서 적용할 수 있으며, DPP-4 단백질과 유전자는 혈관 석회화 억제를 위한 신규한 약물의 개발을 위한 스크리닝 용도로서 효과적으로 이용될 수 있다.

Description

ＤＰＰ­４ 저해제를 유효성분으로 함유하는 혈관 석회화 억제용 약학적 조성물{A PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR INHIBITION OF VASCULAR CALCIFICATION COMPRISING DPP-4 INHIBITOR AS AN EFFECTIVE COMPONENT}

본 발명은 DPP-4(dipeptidyl peptidase-4) 저해제를 유효 성분으로 함유하는 혈관 석회화(Vascular calcification) 억제용 조성물, DPP-4를 포함하는 혈관 석회화 억제제 스크리닝용 조성물 및 이를 이용한 혈관 석화화 억제제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

혈관 석회화는 동맥경화증을 비롯한 심혈관 질환에서 나타나는 병리학적 특징 중 하나이다[Wexler, L. et al. Coronary artery calcification: pathophysiology, epidemiology, imaging methods, and clinical implications. A statement for health professionals from the American Heart Association. Writing Group. Circulation 94, 1175-1192 (1996); Eggen, D.A. Relationship of calcified lesions to clinically significant atherosclerotic lesions. Annals of the New York Academy of Sciences 149, 752-767 (1968)]. 혈관에서의 석회화는 물리적인 손상, 감염 및 염증반응에 의해 유발되며 동맥경화증의 진행에 관계된 여러 가지 세포들 즉, 대식세포(macrophage), 비만세포(mast cell), 평활근세포가 관여하는 것으로 밝혀져 있다[Mohler, E.R., 3rd, et al. Bone formation and inflammation in cardiac valves. Circulation 103, 1522-1528 (2001); Demer, L.L., Tintut, Y. & Parhami, F. Novel mechanisms in accelerated vascular calcification in renal disease patients. Current opinion in nephrology and hypertension 11, 437-443 (2002); Vattikuti, R. & Towler, D.A. Osteogenic regulation of vascular calcification: an early perspective. American journal of physiology 286, E686-696 (2004)]. 특히, 혈관 평활근세포의 증식 및 이주는 동맥경화증의 진행에 중요하게 작용한다. 혈관 평활근세포의 석회화는 인산 칼슘(calcium phosphate)이 세포외기질(extracellular matrix)에 결정 형태로 침착이 되는 것에 기인한다. 하지만, 이 과정의 정확한 메커니즘은 아직 밝혀 지지 않은 상태이다. 다만, 혈관 평활근세포의 석회화 과정 동안 평활근세포가 조골세포(osteoblast)로 분화되는 것이 하나의 특징이며, 이것은 bone morphogenic protein 2(BMP2), runt-related transcription factor 2(RUNX2), osterix 등의 뼈 형성 마커(marker)들의 발현이 증가하는 것으로 알 수 있다[Johnson, R.C., Leopold, J.A. & Loscalzo, J. Vascular calcification: pathobiological mechanisms and clinical implications. Circulation research 99, 1044-1059 (2006)].

한편, DPP-4는 신장을 포함하여 다양한 세포에서 발현되며, 다양한 기질과 관련되어 혈당 조절, 염증, 세포 이동, 세포 분화 등과 관련이 있으며[Mentlein R. Dipeptidyl peptidase Ⅳ (CD26) - role in the inactivation of regulatory peptidases. Regul Pept 1999: 85: 9~24], 최근 보고에서는 DPP-4 억제가 신장에서의 급성 허혈-재관류 손상을 보호한다고 보고되어 있고[Glorie LL. et al. DPP4 inhibition improves functional outcome after renal ischemiareperfusion injury. Am J Physio Renal Physio 2012: 303: F681-8], DPP-4의 억제제로서 게미글립틴은 글루카곤 유사 펩타이드-1(glucagon-like peptide-1, GLP-1)의 분해를 억제함으로써 췌장에서 분비되는 인슐린의 양을 조절하는 기전을 바탕으로 개발된 당뇨병 치료제로 알려져 있다[Kim SH. et al. Gemigliptin, a novel dipeptidyl peptidase 4 inhibitor: first new anti-diabetic drug in the history of Korean pharmaceutical industry. Arch Pharm Res 2013, 36: 1185-8].

KR 10-2012-0115169 A KR 10-2010-0024182 A

본 발명의 발명자들은 혈당 조절 등의 기능에 대하여 알려진 바 있는 DPP-4가 혈관 석회화에 관여할 수 있음을 최초로 발견하였고, 나아가, DPP-4 활성의 저해는 혈관 석회화를 억제할 수 있음을 확인하였다.

따라서, 본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 DPP-4 저해제를 유효 성분으로 함유하는 혈관 석회화 억제용 약학적 조성물을 제공하고자 하는 것이다.

또한, 본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 DPP-4를 포함하는 혈관 석회화 억제제 스크리닝용 조성물 및 이를 이용한 혈관 석회화 억제제의 스크리닝 방법을 제공하고자 하는 것이다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 DPP-4 저해제를 유효 성분으로 함유하는 혈관 석회화 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 DPP-4 저해제는 게미글립틴(Gemigliptin), 시타글립틴(Sitagliptin), 빌다글립틴(Vildagliptin), 삭사글립틴(Saxagliptin), 리나글립틴(Linagliptin) 및 알로글립틴(Alogliptin)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

상기 DPP-4 저해제는 DPP-4 유전자의 발현을 억제하는 것이 바람직하다.

상기 DPP-4 저해제는 DPP-4 mRNA와 상보적으로 결합하는 siRNA(small interfering RNA)인 것이 바람직하다.

상기 DPP-4 저해제는 DPP-4 단백질의 활성을 억제하는 것이 바람직하다.

상기 DPP-4 저해제는 DPP-4 단백질에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머(RNA aptamer) 또는 항체(Antibody)인 것이 바람직하다.

상기 약학적 조성물은 동맥경화(Arteriosclerosis), 신부전증(Renal failure), 만성 신장병(Chronic kidney disease), 고혈압(Hypertension), 고지혈증(Hyperlipidemia) 및 노화(Aging)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 질환의 예방 또는 치료용인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 DPP-4 단백질을 포함하는 혈관 석회화 억제제 스크리닝용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 DPP-4 유전자를 포함하는 혈관 석회화 억제제 스크리닝용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 후보물질에 본 발명의 혈관 석회화 억제제 스크리닝용 조성물을 노출시킨 후, DPP-4의 활성 감소 여부를 확인하는 단계를 포함하는 혈관 석회화 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, DPP-4 저해제는 혈관 석회화를 효과적으로 억제할 수 있으므로 이를 혈관 석회화와 관련된 심혈관 질환, 신장 질환 및 노화 등의 각종 성인병을 예방 또는 치료할 수 있는 치료제로서 적용할 수 있으며, DPP-4 단백질과 유전자는 혈관 석회화 억제를 위한 신규한 약물의 개발을 위한 스크리닝 용도로서 효과적으로 이용될 수 있다.

도 1은 DPP-4 저해제인 게미글립틴 처리에 의한 인체 혈관 평활근 세포에서의 칼슘 축적 감소를 보여주는 그래프이다.
도 2는 DPP-4 저해제인 리나글립틴 처리에 의한 인체 혈관 평활근 세포에서의 칼슘 축적 감소를 보여주는 그래프이다.
도 3은 DPP-4 저해제인 시타글립틴 처리에 의한 인체 혈관 평활근 세포에서의 칼슘 축적 감소를 보여주는 그래프이다.
도 4는 DPP-4 저해제인 빌다글립틴 처리에 의한 인체 혈관 평활근 세포에서의 칼슘 축적 감소를 보여주는 그래프이다.
도 5는 DPP-4 저해제인 게미글립틴 처리에 의한 인체 혈관 평활근 세포에서의 칼슘 축적 감소를 von-Kossa staining을 통하여 보여주는 결과이다.
도 6은 DPP-4 저해제인 게미글립틴, 시타글립틴, 리나글립틴 및 빌다글립틴 처리에 의한 인체 혈관 평활근 세포에서의 칼슘 축적의 농도 의존적 감소를 보여주는 von-Kossa staining 결과이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 발명자들은 혈당 조절, 염증, 세포 이동, 세포 분화 등과 관련이 있는 것으로 알려져 있는 DPP-4가 혈관 석회화에 관여하며, 특히, DPP-4 저해제에 의하여 인체 혈관 평활근 세포의 석회화가 현저히 감소될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 DPP-4 저해제를 유효 성분으로 함유하는 혈관 석회화 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 DPP-4는 GenBank Accession No. BC065265인 인간 디펩티딜-펩티다아제 4의 유전자 또는 단백질을 의미한다. 상기 DPP-4의 염기 서열은 아래 표 1과 같은 서열번호 1로서 나타내었으며, 아미노산 서열은 아래 표 2와 같은 서열번호 2로서 나타내었다.

[표 1] DPP -4 염기 서열

[표 2] DPP -4 아미노산 서열

상기 DPP-4 저해제는 DPP-4 단백질의 효소적 특성을 저해할 수 있는 공지의 유기 화합물을 포함하며, 예를 들어, 게미글립틴, 시타글립틴, 빌다글립틴, 삭사글립틴, 리나글립틴 및 알로글립틴으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

또한, 상기 DPP-4 저해제는 DPP-4 유전자의 발현을 억제하는 것이 바람직하다. 상기 DPP-4 유전자는 상기 표 1에 나타난 바와 같은 서열번호 1의 염기 서열을 갖는 DPP-4의 유전자를 의미한다.

바람직한 구체예로서, 상기 DPP-4 저해제는 서열번호 1로 표시되는 DPP-4 유전자의 mRNA와 상보적으로 결합하는 siRNA인 것이 바람직하다. DPP-4 유전자의 mRNA와 상보적으로 결합하는 siRNA는 DPP-4 유전자의 mRNA의 센스 서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 서열로 구성되며, 상기 센스 서열은 19~21개의 염기 서열로 구성되는 것이 바람직하다. 상기 siRNA는 통상의 올리고뉴클레오티드 합성기를 이용하여 합성할 수 있다. 상기 siRNA는 재조합 발현벡터를 통하여 발현된다. 상기 발현벡터는 특별히 제한되지는 않으나, 예를 들어, 통상적인 siRNA 발현용 벡터인 psiRNA(Invitrogen, USA), pRNA(GenScript, USA), psiLentGene(Promega, USA), pSIREN(Clontech, USA), pSilencer(Ambion, USA) 또는 pU6shX(VectorCoreA, 대한민국)일 수 있으며, 상기 발현벡터에 상기 siRNA에 대응하는 DNA 염기서열을 삽입하여 원하는 재조합 발현벡터를 제조할 수 있다.

상기 DPP-4 저해제는 DPP-4 단백질의 활성을 억제하는 것이 바람직하다. 상기 DPP-4 단백질은 상기 표 2에 나타난 바와 같은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 DPP-4 효소를 의미한다.

바람직한 구체예로서, 상기 DPP-4 저해제는 DPP-4 단백질에 특이적으로 결합하는 앱타머인 것이 바람직하다. 상기 앱타머는 DPP-4 단백질에 친화성을 갖는 핵산 올리고머를 의미한다. 상기 앱타머는 무작위적으로 합성된 약 60 염기로 이루어지는 DNA 올리고머를 합성하고, 이들 중에서 DPP-4 단백질과 결합하는 DNA 올리고머를 친화성 컬럼으로 분리하고, 이를 증폭 및 상기 분리 과정을 반복하여 DPP-4에 친화성을 갖는 앱타머를 제조할 수 있다.

바람직한 구체예로서, 상기 DPP-4 저해제는 DPP-4 단백질에 특이적으로 결합하는 항체인 것이 바람직하다. 상기 항체는 DPP-4 단백질에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 다클론 항체, 단일클론 항체, 재조합 항체 및 항체 단편 등을 포함할 수 있다. 상기 항체는 상업적으로 구입하여 사용할 수 있으며, 상기 기술한 바와 같이 DPP-4 단백질의 아미노산 서열이 공지되어 있으므로, 상기 아미노산 서열을 이용하여 항체를 직접 제조하여 사용할 수도 있다. 항체 제조 방법은 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에 공지된 다양한 항체 생산 기술을 이용할 수 있으며, 예컨대, 다클론 항체의 경우에는 DPP-4 항원을 동물에 주사하고, 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있으며, 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조가능하다. 단일클론 항체의 경우에는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마(hybridoma) 방법(Kohler et al., European Jounral of Immunology, 6, 511-519, 1976)을 이용하여 제조할 수 있거나 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352, 624-628, 1991, Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 항체 단편은 항체 분자의 기능적인 단편을 의미하며, 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 항체 단편으로서, 예를 들어, Fab, F(ab'), F(ab')₂ 및 Fv 등이 있다. 상기 항체 단편의 제조 방법은 본 기술 분야에 공지되어 있다.

상기 약학적 조성물은 혈관 석회화와 관련된 질환들, 예를 들어, 동맥경화(Arteriosclerosis), 신부전증(Renal failure), 만성 신장병(Chronic kidney disease), 고혈압(Hypertension), 고지혈증(Hyperlipidemia) 및 노화(Aging)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 질환의 예방 또는 치료용인 것이 바람직하다.

본 발명의 약학적 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사용액의 주사제 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구 투여하거나 정맥 내, 복강 내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다.

이러한 약학적 조성물에는 추가적으로 담체, 부형제 또는 희석제 등이 더 포함될 수 있으며, 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리쓰리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 비정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 더 포함할 수도 있다.

바람직한 구체예로서, 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 혼합하여 제형화한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 등과 같은 윤활제가 사용될 수도 있다.

바람직한 구체예로서, 경구용 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 예시될 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

바람직한 구체예로서, 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액제, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 좌제 등을 예시할 수 있다. 비수성용제, 현탁제에는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 포함될 수 있다. 주사제에는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제, 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가 포함될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용이 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

바람직한 구체예로서, 본 발명의 약학적 조성물에서 DPP-4 저해제의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중당 1 내지 5,000mg, 바람직하게는 100 내지 3,000mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 다양한 경로를 통하여 대상에 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에서 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 유효성분을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 장치를 이용해 투여될 수도 있다.

본 발명에서 "대상"은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 인간, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함하고, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 인간을 의미한다.

또한, 본 발명은 후보물질들로부터 DPP-4의 신규 저해제를 스크리닝하기 위한 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 DPP-4 단백질을 포함한다. 본 발명의 스크리닝용 조성물이 포함하는 DPP-4 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖거나, 또는 서열번호 1의 염기서열, 서열번호 1의 다형현상을 포함하는 염기서열 중 선택된 하나로부터 발현된 단백질 및 DPP-4와 동등한 생리적 활성을 나타내는 DPP-4 폴리펩티드 단편 중에서 선택될 수 있다. 이러한 경우, 본 발명의 조성물은 DPP-4 단백질 외에도 단백질의 구조를 안정하게 유지시키는 완충액 등을 더 포함할 수 있다.

또한, 상기 조성물은 DPP-4 유전자를 포함한다. 본 발명의 조성물이 포함하는 DPP-4 유전자 서열은 서열번호 1의 일부 또는 전체염기서열, 서열번호 1의 다형현상을 포함하는 염기서열 중 선택된 하나 이상이 될 수 있으며, 원핵생물 또는 진핵생물 발현벡터 시스템 내에 포함된 형태로 혈관 석회화 억제제 스크리닝 조성물에 포함될 수 있다. 이러한 경우, 본 발명의 조성물은 DPP-4 유전자 외에도 유전자의 구조를 안정하게 유지시키는 완충액 등을 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 설명된 DPP-4 저해제 스크리닝용 조성물을 이용하여 후보물질로부터 DPP-4에 대한 신규 저해제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.

바람직한 구체예로서, 본 발명의 스크리닝 방법은 상기 DPP-4 단백질을 포함하는 혈관 석회화 억제제 스크리닝용 조성물과 후보물질을 접촉시킨 후, 그들 사이의 반응을 확인하여, 후보물질이 상기 조성물에 포함된 단백질의 기능을 억제하는 활성을 나타내는지를 결정하는 단계로 이루어진다.

본 발명의 스크리닝 방법에서 DPP-4 단백질을 포함하는 조성물과 후보물질 간의 반응 확인은 단백질-단백질, 단백질-화합물 간의 반응 여부를 확인하는데 사용되는 통상적인 방법들을 사용할 수 있다. 예를 들면, DPP-4 단백질과 후보물질을 반응시킨 후 활성을 측정하는 방법, DPP-4 단백질에 결합하는 파지 디스플레이 펩티드 클론(phage-displayed peptide clone)의 검색, 천연물 및 화학물질 라이브러리(chemical library) 등을 이용한 HTS(high throughput screening), 드럭 히트 HTS(drug hit HTS), 세포 기반 스크리닝(cell-based screening)을 이용하는 스크리닝법 등을 사용할 수 있다. 이러한 경우, 본 발명의 조성물은 DPP-4로부터 발현된 단백질 외에도, 단백질의 구조 또는 생리 활성을 안정하게 유지시키는 완충액 또는 반응액을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 생체 내(in vivo) 실험을 위해, 상기 단백질을 발현하는 세포, 또는 전사율을 조절할 수 있는 프로모터 하에 상기 단백질을 발현하는 플라스미드를 함유하는 세포 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 스크리닝 방법에서, 후보물질은 통상적인 선정방식에 따라 혈관 석회화 억제제로서의 가능성을 지닌 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 기타 추출물 또는 천연물, 화합물 등이 될 수 있다.

바람직한 구체예로서, 본 발명의 스크리닝 방법은 상기 DPP-4 유전자를 포함하는 혈관 석회화 억제제 스크리닝용 조성물과 후보물질을 접촉시킨 후, 그들 사이의 반응을 확인하여, 후보물질이 상기 조성물에 포함된 유전자의 발현을 억제하는 활성을 나타내는지를 결정하는 단계로 이루어진다.

본 발명의 스크리닝 방법에서 PDK4 유전자를 포함하는 조성물과 후보물질 간의 반응 확인은 DNA-DNA, DNA-RNA, DNA-단백질, DNA-화합물 간의 반응 여부를 확인하는데 사용되는 통상적인 방법들을 사용할 수 있다. 예를 들면, 시험관 내(in vitro)에서 상기 유전자와 후보물질 사이의 결합 여부를 확인하기 위한 혼성화 시험, 포유류세포와 후보물질을 반응시킨 후 노던 분석, 정량적 PCR, 정량적 실시간 PCR 등을 통한 상기 유전자의 발현율 측정 방법, 또는 상기 유전자에 리포터 유전자를 연결시켜 세포 내로 도입한 후 후보물질과 반응시키고, 리포터 단백질의 발현율을 측정하는 방법 등을 사용할 수 있다. 이러한 경우, 본 발명의 조성물은 PDK4 유전자 외에도 핵산의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법을 통해 얻은 DPP-4 단백질의 기능을 억제하는 활성을 나타내거나, DPP-4 유전자 발현을 억제하는 활성을 나타내는 후보물질은 혈관 석회화 억제제로서의 후보물질이 될 수 있다. 이와 같은 혈관 석회화 억제제 후보물질은 이후의 혈관 석회화 억제제 개발 과정에서 선도물질(leading compound)로서 작용하게 되며, 선도물질이 DPP-4 유전자 또는 그로부터 발현되는 단백질의 기능 억제효과를 나타낼 수 있도록 그 구조를 변형시키고 최적화함으로써, 새로운 혈관 석회화 억제제를 개발할 수 있다. 이렇게 하여 얻어진 물질은 DPP-4 유전자 또는 그로부터 발현되는 단백질에 대해 부분적 또는 완전한 활성 억제 효과를 나타내게 되므로, DPP-4 유전자 발현 억제 또는 그로부터 발현되는 단백질의 기능 저하에 의한 혈관 석회화 및 그로부터 유발되는 질환들, 예를 들어, 동맥경화, 신부전증, 만성 신장 질환 및 노화 등을 억제할 수 있다.

본 발명에서 유전공학적 기술과 관련된 사항은 샘브룩 등의 문헌(Sambrook, et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001)) 및 프레드릭 등의 문헌 (Frederick M. Ausubel et al., Current protocols in molecular biology volume 1, 2, 3, John Wiley & Sons, Inc. (1994))에 개시되어 있는 내용에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예를 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라, 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 하기의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

이하에서는, 구체적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

[ 실시예 ]

1. 인체 혈관 평활근세포의 분리 및 배양

기증자로부터 얻은 인체 대동맥으로부터 외부 결합 조직(external connective tissue)와 내피세포를 제거하고, 남은 평활근세포를 약 3mm²의 작은 조각으로 자른 다음, 1mM 소듐 피루베이트(sodium pyruvate)와 20% 우태아혈청(fetal bovine serum), 그리고 100U/mL 페니실린(penicillin)과 100mg/mL 스트렙토마이신(streptomycin)이 포함된 DMEM 배지(1g/L glucose)에서 세포가 자라나올 때까지 37℃ 배양기(95% air와 5% CO₂)에서 배양하였다. 여기서 얻은 혈관 평활근 세포를 1mM 소듐 피루베이트(sodium pyruvate)와 10% 우태아혈청(fetal bovine serum), 그리고 100U/mL 페니실린(penicillin)과 100mg/mL 스트렙토마이신(streptomycin)이 포함된 DMEM 배지(1g/L glucose)에서 계대 배양하였다. 세포는 5-6번까지 계대 배양한 것을 이후 실험에 사용하였다.

2. 혈관 평활근세포의 석회화 유도

무기 포스페이트(inorganic phosphate, Pi)를 이용한 석회화 유도를 위해 실험 이틀 전에 혈관 평활근세포를 배양접시에 80%가 되도록 깔아서 준비하였다. 이틀 후에 혈관 평활근세포가 배양접시 바닥에 모두 붙은 것을 확인하고, 배지를 제거한 다음, Hank's 완충액으로 세포를 세척하고 3ml의 석회화 배지[DMEM 배지 (high glucose, 4.5g/L) 15% FBS, antibiotics (100U/mL penicillin, 100mg/mL streptomycin), 2.6mmol Pi(NaH2PO4/Na2HPO4, pH 7.4)]로 교체하였다. 8일간 석회화 배지에서 배양하며, 배지는 2일에 한 번씩 갈아주었다.

3. DPP-4 저해제에 의한 석회화 억제 확인

Pi 처리에 의해 석회화가 유도된 혈관 평활근 세포에 DPP-4 저해제로 알려진 게미글립틴, 리나글립틴, 시타글립틴 및 빌다글립틴을 처리하고 석회화 정도를 비교하기 위하여 칼슘 침착(calcium deposition)을 확인하였다. 먼저, 배지를 제거하고, 세포를 PBS로 세척한 다음 4℃에서 24시간 동안 0.6N HCl을 처리하여 탈칼슘화(decalcification)시켰다. 다음으로, 상층액을 회수하여 칼슘 정량에 사용하고, 0.1N NaOH/0.1%SDS를 이용하여 세포로부터 단백질을 회수하여 BCA 방법으로 정량하였다. 칼슘 정량을 위해, Quantichrom^TMCalciumAssayKit(DICA-500)(Bioassay system)를 이용하여 612nm에서 값을 읽고 단백질 량을 이용하여 보정하였다. 도 1 내지 도 4에 나타난 바와 같이, DPP-4 저해제로서 게미글립틴, 리나글립틴, 시타글립틴 및 빌다글립틴가 각각 처리된 실험군에서의 칼슘 침착은 현저히 감소함을 확인할 수 있었다.

또한, Pi 처리에 의해 석회화가 유도된 혈관 평활근 세포에 DPP-4 저해제로 알려진 게미글립틴, 리나글립틴, 시타글립틴 및 빌다글립틴을 처리하고 석회화 정도를 비교 분석하기 위하여 Von-kossa 염색법을 수행하였다. Von-kossa 염색을 위해, DPP-4 저해제로 처리한 혈관 평활근세포를 먼저 PBS로 세척한 다음, 4% PFA에서 고정시켰다. 멸균수로 3회 세척한 다음, 5% 질산은(silver nitrate)으로 처리하고 UV를 조사하였다. 1시간 정도 UV 하에 두었다가 육안으로 색깔이 갈색으로 변하는 것이 보이면 증류수로 세척한 후, 5% 싸이오황산나트륨(sodium thiosulfate)으로 2분 정도 반응시켜 비선택적 염색을 제거한 다음 증류수로 다시 세척한 후, 광학현미경으로 관찰하였다. 도 5에서 볼 수 있는 바와 같이, Pi를 이용하여 석회화를 유도시킨 것에 비하여 게미글립틴을 처리한 실험군에서는 Pi가 존재함에도 불구하고 석회화가 상당히 억제되는 것을 Von-kossa 염색을 통하여 확인할 수 있었다. 이러한 결과는, 도 6에 나타난 바와 같이, 농도 의존적인 억제 효과를 나타내었으며, 게미글립틴 이외의 DPP-4 저해제인 시타글립틴, 리나글립틴 및 빌다글립틴의 경우에도 동일하였다.

<110> Kyungpook National University Hospital Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> A PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR INHIBITION OF VASCULAR CALCIFICATION COMPRISING DPP-4 INHIBITOR AS AN EFFECTIVE COMPONENT <130> YP14-0008 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 3913 <212> DNA <213> DPP-4 nucleotide sequences <400> 1 ctttcactgg caagagacgg agtcctgggt ttcagttcca gttgcctgcg gtgggctgtg 60 tgagtttgcc aaagtcccct gccctctctg ggtctcggtt ccctcgcctg tccacgtgag 120 gttggaggag ctgaacgccg acgtcatttt tagctaagag ggagcagggt ccccgagtcg 180 ccggcccagg gtctgcgcat ccgaggccgc gcgccctttc ccctccccca cggctcctcc 240 gggccccgca ctctgcgccc cggctgccgc ccagcgccct acaccgccct cagggggccc 300 tcgcgggctc cccccggccg ggatgccagt gccccgcgcc acgcgcgcct gctcccgcgc 360 cgcctgccct gcagcctgcc cgcggcgcct ttatacccag cgggctcggc gctcactaat 420 gtttaactcg gggccgaaac ttgccagcgg cgagtgactc caccgcccgg agcagcggtg 480 caggacgcgc gtctccgccg cccgcggtga cttctgcctg cgctccttct ctgaacgctc 540 acttccgagg agacgccgac gatgaagaca ccgtggaagg ttcttctggg actgctgggt 600 gctgctgcgc ttgtcaccat catcaccgtg cccgtggttc tgctgaacaa aggcacagat 660 gatgctacag ctgacagtcg caaaacttac actctaactg attacttaaa aaatacttat 720 agactgaagt tatactcctt aagatggatt tcagatcatg aatatctcta caaacaagaa 780 aataatatct tggtattcaa tgctgaatat ggaaacagct cagttttctt ggagaacagt 840 acatttgatg agtttggaca ttctatcaat gattattcaa tatctcctga tgggcagttt 900 attctcttag aatacaacta cgtgaagcaa tggaggcatt cctacacagc ttcatatgac 960 atttatgatt taaataaaag gcagctgatt acagaagaga ggattccaaa caacacacag 1020 tgggtcacat ggtcaccagt gggtcataaa ttggcatatg tttggaacaa tgacatttat 1080 gttaaaattg aaccaaattt accaagttac agaatcacat ggacggggaa agaagatata 1140 atatataatg gaataactga ctgggtttat gaagaggaag tcttcagtgc ctactctgct 1200 ctgtggtggt ctccaaacgg cactttttta gcatatgccc aatttaacga cacagaagtc 1260 ccacttattg aatactcctt ctactctgat gagtcactgc agtacccaaa gactgtacgg 1320 gttccatatc caaaggcagg agctgtgaat ccaactgtaa agttctttgt tgtaaataca 1380 gactctctca gctcagtcac caatgcaact tccatacaaa tcactgctcc tgcttctatg 1440 ttgatagggg atcactactt gtgtgatgtg acatgggcaa cacaagaaag aatttctttg 1500 cagtggctca ggaggattca gaactattcg gtcatggata tttgtgacta tgatgaatcc 1560 agtggaagat ggaactgctt agtggcacgg caacacattg aaatgagtac tactggctgg 1620 gttggaagat ttaggccttc agaacctcat tttacccttg atggtaatag cttctacaag 1680 atcatcagca atgaagaagg ttacagacac atttgctatt tccaaataga taaaaaagac 1740 tgcacattta ttacaaaagg cacctgggaa gtcatcggga tagaagctct aaccagtgat 1800 tatctatact acattagtaa tgaatataaa ggaatgccag gaggaaggaa tctttataaa 1860 atccaactta gtgactatac aaaagtgaca tgcctcagtt gtgagctgaa tccggaaagg 1920 tgtcagtact attctgtgtc attcagtaaa gaggcgaagt attatcagct gagatgttcc 1980 ggtcctggtc tgcccctcta tactctacac agcagcgtga atgataaagg gctgagagtc 2040 ctggaagaca attcagcttt ggataaaatg ctgcagaatg tccagatgcc ctccaaaaaa 2100 ctggacttca ttattttgaa tgaaacaaaa ttttggtatc agatgatctt gcctcctcat 2160 tttgataaat ccaagaaata tcctctacta ttagatgtgt atgcaggccc atgtagtcaa 2220 aaagcagaca ctgtcttcag 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<211> 766 <212> PRT <213> DPP-4 amino acid sequence <400> 2 Met Lys Thr Pro Trp Lys Val Leu Leu Gly Leu Leu Gly Ala Ala Ala 1 5 10 15 Leu Val Thr Ile Ile Thr Val Pro Val Val Leu Leu Asn Lys Gly Thr 20 25 30 Asp Asp Ala Thr Ala Asp Ser Arg Lys Thr Tyr Thr Leu Thr Asp Tyr 35 40 45 Leu Lys Asn Thr Tyr Arg Leu Lys Leu Tyr Ser Leu Arg Trp Ile Ser 50 55 60 Asp His Glu Tyr Leu Tyr Lys Gln Glu Asn Asn Ile Leu Val Phe Asn 65 70 75 80 Ala Glu Tyr Gly Asn Ser Ser Val Phe Leu Glu Asn Ser Thr Phe Asp 85 90 95 Glu Phe Gly His Ser Ile Asn Asp Tyr Ser Ile Ser Pro Asp Gly Gln 100 105 110 Phe Ile Leu Leu Glu Tyr Asn Tyr Val Lys Gln Trp Arg His Ser Tyr 115 120 125 Thr Ala Ser Tyr Asp Ile Tyr Asp Leu Asn Lys Arg Gln Leu Ile Thr 130 135 140 Glu Glu Arg Ile Pro Asn Asn Thr Gln Trp Val Thr Trp Ser Pro Val 145 150 155 160 Gly His Lys Leu Ala Tyr Val Trp Asn Asn Asp Ile Tyr Val Lys Ile 165 170 175 Glu Pro Asn Leu Pro Ser Tyr Arg Ile Thr Trp Thr Gly Lys Glu Asp 180 185 190 Ile Ile Tyr Asn Gly Ile Thr Asp Trp Val Tyr Glu Glu Glu Val Phe 195 200 205 Ser Ala Tyr Ser Ala Leu Trp Trp Ser Pro Asn Gly Thr Phe Leu Ala 210 215 220 Tyr Ala Gln Phe Asn Asp Thr Glu Val Pro Leu Ile Glu Tyr Ser Phe 225 230 235 240 Tyr Ser Asp Glu Ser Leu Gln Tyr Pro Lys Thr Val Arg Val Pro Tyr 245 250 255 Pro Lys Ala Gly Ala Val Asn Pro Thr Val Lys Phe Phe Val Val Asn 260 265 270 Thr Asp Ser Leu Ser Ser Val Thr Asn Ala Thr Ser Ile Gln Ile Thr 275 280 285 Ala Pro Ala Ser Met Leu Ile Gly Asp His Tyr Leu Cys Asp Val Thr 290 295 300 Trp Ala Thr Gln Glu Arg Ile Ser Leu Gln Trp Leu Arg Arg Ile Gln 305 310 315 320 Asn Tyr Ser Val Met Asp Ile Cys Asp Tyr Asp Glu Ser Ser Gly Arg 325 330 335 Trp Asn Cys Leu Val Ala Arg Gln His Ile Glu Met Ser Thr Thr Gly 340 345 350 Trp Val Gly Arg Phe Arg Pro Ser Glu Pro His Phe Thr Leu Asp Gly 355 360 365 Asn Ser Phe Tyr Lys Ile Ile Ser Asn Glu Glu Gly Tyr Arg His Ile 370 375 380 Cys Tyr Phe Gln Ile Asp Lys Lys Asp Cys Thr Phe Ile Thr Lys Gly 385 390 395 400 Thr Trp Glu Val Ile Gly Ile Glu Ala Leu Thr Ser Asp Tyr Leu Tyr 405 410 415 Tyr Ile Ser Asn Glu Tyr Lys Gly Met Pro Gly Gly Arg Asn Leu Tyr 420 425 430 Lys Ile Gln Leu Ser Asp Tyr Thr Lys Val Thr Cys Leu Ser Cys Glu 435 440 445 Leu Asn Pro Glu Arg Cys Gln Tyr Tyr Ser Val Ser Phe Ser Lys Glu 450 455 460 Ala Lys Tyr Tyr Gln Leu Arg Cys Ser Gly Pro Gly Leu Pro Leu Tyr 465 470 475 480 Thr Leu His Ser Ser Val Asn Asp Lys Gly Leu Arg Val Leu Glu Asp 485 490 495 Asn Ser Ala Leu Asp Lys Met Leu Gln Asn Val Gln Met Pro Ser Lys 500 505 510 Lys Leu Asp Phe Ile Ile Leu Asn Glu Thr Lys Phe Trp Tyr Gln Met 515 520 525 Ile Leu Pro Pro His Phe Asp Lys Ser Lys Lys Tyr Pro Leu Leu Leu 530 535 540 Asp Val Tyr Ala Gly Pro Cys Ser Gln Lys Ala Asp Thr Val Phe Arg 545 550 555 560 Leu Asn Trp Ala Thr Tyr Leu Ala Ser Thr Glu Asn Ile Ile Val Ala 565 570 575 Ser Phe Asp Gly Arg Gly Ser Gly Tyr Gln Gly Asp Lys Ile Met His 580 585 590 Ala Ile Asn Arg Arg Leu Gly Thr Phe Glu Val Glu Asp Gln Ile Glu 595 600 605 Ala Ala Arg Gln Phe Ser Lys Met Gly Phe Val Asp Asn Lys Arg Ile 610 615 620 Ala Ile Trp Gly Trp Ser Tyr Gly Gly Tyr Val Thr Ser Met Val Leu 625 630 635 640 Gly Ser Gly Ser Gly Val Phe Lys Cys Gly Ile Ala Val Ala Pro Val 645 650 655 Ser Arg Trp Glu Tyr Tyr Asp Ser Val Tyr Thr Glu Arg Tyr Met Gly 660 665 670 Leu Pro Thr Pro Glu Asp Asn Leu Asp His Tyr Arg Asn Ser Thr Val 675 680 685 Met Ser Arg Ala Glu Asn Phe Lys Gln Val Glu Tyr Leu Leu Ile His 690 695 700 Gly Thr Ala Asp Asp Asn Val His Phe Gln Gln Ser Ala Gln Ile Ser 705 710 715 720 Lys Ala Leu Val Asp Val Gly Val Asp Phe Gln Ala Met Trp Tyr Thr 725 730 735 Asp Glu Asp His Gly Ile Ala Ser Ser Thr Ala His Gln His Ile Tyr 740 745 750 Thr His Met Ser His Phe Ile Lys Gln Cys Phe Ser Leu Pro 755 760 765

Claims (10)

1. DPP-4(dipeptidyl peptidase-4) 저해제를 유효 성분으로 함유하는 혈관 석회화(Vascular calcification) 억제용 약학적 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 DPP-4 저해제는 게미글립틴(Gemigliptin), 시타글립틴(Sitagliptin), 빌다글립틴(Vildagliptin), 삭사글립틴(Saxagliptin), 리나글립틴(Linagliptin) 및 알로글립틴(Alogliptin)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 DPP-4 저해제는 DPP-4 유전자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
4. 제 3항에 있어서, 상기 DPP-4 저해제는 DPP-4 mRNA와 상보적으로 결합하는 siRNA(small interfering RNA)인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
5. 제 1항에 있어서, 상기 DPP-4 저해제는 DPP-4 단백질의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
6. 제 5항에 있어서, 상기 DPP-4 저해제는 DPP-4 단백질에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머(RNA aptamer) 또는 항체(Antibody)인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
7. 제 1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 동맥경화(Arteriosclerosis), 신부전증(Renal failure), 만성 신장병(Chronic kidney disease), 고혈압(Hypertension), 고지혈증(Hyperlipidemia) 및 노화(Aging)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 질환의 예방 또는 치료용인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
8. DPP-4(dipeptidyl peptidase-4) 단백질을 포함하는 혈관 석회화(Vascular calcification) 억제제 스크리닝용 조성물.
9. DPP-4(dipeptidyl peptidase-4) 유전자를 포함하는 혈관 석회화(Vascular calcification) 억제제 스크리닝용 조성물.
10. 후보물질에 제 8항 또는 제 9항의 조성물을 노출시킨 후, DPP-4(dipeptidyl peptidase-4)의 활성 감소 여부를 확인하는 단계를 포함하는 혈관 석회화 억제제의 스크리닝 방법.

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