KR20210133136A - SARS-CoV-2-유도성 패혈증의 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 - Google Patents

SARS-CoV-2-유도성 패혈증의 진단 또는 예후 예측용 바이오마커 Download PDF

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Abstract

본 발명자들은 COVID-19 환자 중 패혈증이 진행된 중증 환자에서 혈액 내 cfDNA 수준이 증가하고, DNase-1 수준은 감소한 것을 확인하였다. 따라서 cfDNA 또는 DNase-1을 이용하면, 혈액 등을 이용한 비침습적 방법을 통해 비교적 간단하고 신속하게 SARS-CoV-2 감염에 의한 패혈증을 조기에 진단할 수 있다. 또한, 본 발명자들은 COVID-19 패혈증 환자의 혈액에 본 발명에 따른 외인성 DNase-1의 처리시 cfDNA 수준이 감소하고 내인성 DNase-1의 활성이 증가하며, 염증 관련 인자들의 수준이 감소한다는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 외인성 DNase-1는 SARS-CoV-2 감염에 의한 패혈증을 치료하기 위한 조성물로 다양하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

SARS-CoV-2-유도성 패혈증의 진단 또는 예후 예측용 바이오마커{Biomarkers for diagnosing or predicting prognosis of SARS-CoV-2-induced sepsis}
본 발명은 SARS-CoV-2-매개 패혈증의 진단 또는 예후 예측을 위한 바이오마커 및 이의 용도 등에 관한 것이다.
중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)는 2019년에 발생한 신종 코로나바이러스(coronavirus)로서, 이의 감염으로 인한 코로나바이러스 질환-2019(COVID-19)의 대유행은 전세계적으로 공중 보건에 심각한 위협이 되고 있다. 최근 통계에 따르면, 전세계 180개국에서 10만명 이상의 사망자와 약 2,000,000명 이상의 확진자가 발생했다. 확진자 수는 계속해서 증가하고 있으며, 전문가들은 전세계적으로 수십만명의 사망자가 발생할 것으로 예측하고 있다.
SARS-CoV-2 감염은 비정상적인 적응성 면역 반응(adaptive immune responses) 및 염증성의 선천성 면역 반응(inflammatory innate immune responses) 모두와 관련이 있으며, 이는 국소 및 전신 조직의 손상을 초래하는 것으로 알려져 있다(Lancet, 28 March 2020). 급격한 면역 반응은 패혈성 쇼크(septic shock)를 유발하여 환자의 사망 가능성을 높일 수 있다. 따라서, SARS-CoV-2의 감염으로 인한 패혈증의 진행을 억제할 수 있는, 새로운 치료 전략의 개발이 시급하다.
수많은 연구팀 및 글로벌 제약 회사가 SARS-CoV-2 치료 후보제에 대해 임상 시험을 수행하고 있다. 그러나, 이들 약물의 대부분은 SARS-CoV-2 감염의 치료를 위해 개발된 것이 아니라, 에볼라 바이러스(Ebola virus), 인체 면역 결핍 바이러스(human immunodeficiency virus, HIV), 중증 급성 호흡기 증후군(severe acute respiratory syndrome, SARS) 바이러스, 중동 호흡기 증후군(Middle East respiratory syndrome, MERS) 바이러스, 인플루엔자 A 바이러스(Influenza A virus), 및 ZIKA 바이러스 등 종래의 바이러스 치료를 위해 개발된 것에 불과하다.
다양한 임상 연구에 따르면 COVID-19 환자는 특히 사이토카인 방출 증후군(cytokine release syndrome, CRS) 및 심각한 호흡기 손상을 극복하는 것이 상당히 어려운 것으로 알려져 있다(Med, (2020) April 6 2020 및 Med, 6 April 2020 참조). 최근 미국의 생명공학 기업 Genentech가 중증 SARS-CoV-2 폐렴으로 입원한 환자를 치료하기 위한 Tocilizumab (Actemra)의 3상 임상 시험에 대한 FDA의 승인을 발표했다. 그러나, 바이러스의 감염이 해결되더라도 환자의 조직 손상은 완전히 회복되지 않을 뿐만 아니라, 급성 호흡 곤란 증후군(acute respiratory distress syndrome, ARDS) 또는 패혈증(sepsis)과 같은 더 심각한 질병이 발생할 수 있고, 심각한 경우 사망에 이를 수 있다.
현재 세계 보건 기구(World Health Organization, WHO)는 COVID-19 환자의 치료에 코르티코스테로이드(corticosteroid)의 사용을 권장하지 않는데, 이는 코르티코스테로이드가 SARS-CoV-2-관련 급성 호흡기 감염을 악화시킬 수 있기 때문이다(Lancet 395, 473-475 (2020)). SARS-CoV-2는 급성 합병증 및 사망을 유발할 수 있기 때문에, 급격한 호흡-관련 염증 반응을 신속하게 해결하기 위한 새로운 전략이 시급한 실정이다.
호중구 세포외 트랩(neutrophil extracellular traps, NET)은 DNA 골격(DNA backbone)과 NETosis라고 알려진 세포사멸 과정을 통해 형성되는, 여러 기능성 단백질로 구성된 망상 구조이다. NET은 바이러스를 포함한 병원성 미생물을 포획하고 이들의 확산을 방지하며, 병원성 요인을 비활성화함으로써 항-감염 활성을 발휘한다. 그러나, NETosis로 인한 과도한 면역 반응 또한 조직 손상을 유발할 수 있는 것으로 보고되었다(JCI Insight 3, 98178 (2018)). SARS-CoV-2 감염은 적응성 면역 반응을 손상시킬 뿐만 아니라, 비정상적인 염증성의 선천성 면역 반응을 유도하여 국소 및 전신의 조직 손상을 유발할 수 있다. 이러한 현상은 일반적으로 골수세포형 과산효소(Myeloperoxidase, MPO), 및 호중구 엘라스타아제(Neutrophil elastase, NE)와 같은 NETosis 마커의 증가와 관련이 있다. 상기 인자들은 질병의 중증도 증가 및 좋지 않은 임상 결과와 관련이 있으며, 높은 수준의 NETosis를 나타내는 환자를 치료하는 것은 특히 어려운 것으로 알려져 있다.
SARS-CoV-2 감염에 의해 패혈증이 진행된 환자의 경우, 조기 대처 및 초기 치료가 예후를 결정하지만, 신속한 조기 진단법이 없으며 복잡한 바이러스 검출 시험에 의존하고 있는 실정이다. 따라서, 신속하게 SARS-CoV-2 감염에 의한 패혈증을 조기 진단할 수 있는 새로운 바이오마커의 발굴이 시급하다.
대한민국 등록특허 제10-1863335호
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 SARS-CoV-2 감염에 의한 패혈증의 초기 진단 및 치료 전략에 사용할 수 있는 바이오마커를 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 SARS-CoV-2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) 감염에 의한 패혈증 진단 또는 이의 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 SARS-CoV-2 감염에 의한 패혈증 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 SARS-CoV-2 감염에 의한 패혈증 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 하기 단계를 포함하는, SARS-CoV-2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) 감염에 의한 패혈증 진단 또는 이의 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다:
(a) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 cell-free DNA(cfDNA) 또는 deoxyribonuclease-1(DNase-1)의 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 단계 (a)에서 측정된 cfDNA 수준이 대조군에 비해 증가되어 있는지 여부, 또는 단계 (a)에서 측정된 DNase-1의 수준이 대조군에 비해 감소되어 있는지 여부를 확인하는 단계.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 정보제공방법은 하기 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다:
(c) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 citrullinated histone H3(Cit-histone H3) 수준을 측정하는 단계; 및
(d) 단계 (c)에서 측정된 Cit-histone H3 수준이 대조군에 비해 증가되어 있는지 여부를 확인하는 단계.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 시료는 혈액, 혈장, 또는 혈청일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또다른 구현예에서, 상기 대조군은 정상인 또는 패혈증을 동반하지 않은 SARS-CoV-2 감염 환자로부터 분리된 생물학적 시료일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또다른 구현예에서, 상기 피검체는 SARS-CoV-2 감염에 의한 패혈증을 진단받은 적이 없는 피검체일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또다른 구현예에서, 상기 정보제공방법은 SARS-CoV-2 감염에 의한 패혈증 진단 또는 이의 예후 예측과 함께 피검체의 폐렴 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 cfDNA 또는 DNase-1 단백질의 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는, SARS-CoV-2 감염에 의한 패혈증 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 DNase-1 단백질의 수준을 측정하는 제제는 DNase-1의 단백질에 특이적인 항체일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또다른 구현예에서, 상기 cfDNA 또는 DNase-1 단백질의 수준은 혈액, 혈장, 또는 혈청 내 cfDNA 또는 DNase-1 단백질의 수준일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 SARS-CoV-2 감염에 의한 패혈증 진단 또는 예후 예측용 조성물을 포함하는, SARS-CoV-2 감염에 의한 패혈증 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, SARS-CoV-2 감염에 의한 패혈증 치료 물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) SARS-CoV-2 감염에 의한 패혈증 환자로부터 분리된 생물학적 시료에 시험물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 시험물질을 처리한 시료와 처리하지 않은 대조군 시료에서 cfDNA 수준 또는 DNase-1 단백질 활성을 측정하는 단계; 및
(c) 대조군 시료와 비교해 상기 cfDNA 수준을 감소시키거나, 또는 상기 DNase-1 단백질 활성을 증가시킨 시험물질을 SARS-CoV-2 감염에 의한 패혈증 치료 물질로 선별하는 단계.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 시료는 혈액, 혈장, 또는 혈청일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 DNase-1 단백질을 유효성분으로 포함하는, SARS-CoV-2 감염에 의한 패혈증 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 DNase-1 단백질을 포함하는 나노입자를 유효성분으로 포함하는, SARS-CoV-2 감염에 의한 패혈증 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 나노입자는 poly(lactic-co-glycolic acid)(PLGA) 나노입자일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 나노입자는 표면이 폴리도파민(polydopamine, PD)으로 코팅되어 있고, 상기 DNase-1 단백질은 폴리도파민을 통해 나노입자의 표면에 고정화된 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또다른 구현예에서, 상기 나노입자는 poly(ethylene glycol)(PEG)를 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또다른 구현예에서, 상기 약학적 조성물은 하기 특징 중 하나 이상을 만족하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다:
(a) cfDNA 수준을 감소시킴;
(b) 내인성(endogenous) DNase-1 활성을 증가시킴;
(c) 골수세포형 과산효소(Myeloperoxidase, MPO)의 활성을 억제함;
(d) 호중구 엘라스타아제(Neutrophil elastase, NE)의 활성을 억제함;
(e) 호중구의 세포외 트랩(neutrophil extracellular traps, NET) 형성(NETosis)을 억제함;
(e) 호중구의 NF-κb의 활성을 억제함;
(f) 호중구에 의한, IL-1β, IL-6, IFN-γ, 및 TNF-α로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 수준을 감소시킴; 또는
(g) 호중구의 복강 내 침윤을 억제함.
또한, 본 발명은 cfDNA 또는 DNase-1 단백질의 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는 조성물의 SARS-CoV-2 감염에 의한 패혈증의 진단 또는 예후 예측 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 DNase-1 단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물의 SARS-CoV-2 감염에 의한 패혈증 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 DNase-1 단백질이 결합된 나노입자를 유효성분으로 포함하는 조성물의 SARS-CoV-2 감염에 의한 패혈증 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, SARS-CoV-2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) 감염에 의한 패혈증 진단 또는 이의 예후 예측 방법을 제공한다:
(a) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 cell-free DNA(cfDNA) 또는 deoxyribonuclease-1(DNase-1)의 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 단계 (a)에서 측정된 cfDNA 수준이 대조군에 비해 증가되어 있는 경우, 또는 단계 (a)에서 측정된 DNase-1의 수준이 대조군에 비해 감소되어 있는 경우 SARS-CoV-2 감염에 의한 패혈증으로 진단하거나 이의 예후가 좋지 않은 것으로 판단하는 단계.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 패혈증 진단 또는 이의 예후 예측 방법은 하기 단계를 더 포함하는 것일 수 있다:
(c) 단계 (a)에서 측정된 cfDNA 수준이 대조군에 비해 증가되어 있는 경우, 또는 단계 (a)에서 측정된 DNase-1의 수준이 대조군에 비해 감소되어 있는 경우 폐렴에 걸린 것으로 진단하거나, 폐렴에 걸릴 가능성이 높은 것으로 판단하는 단계.
또한, 본 발명은 DNase-1 단백질을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, SARS-CoV-2 감염에 의한 패혈증 예방 또는 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 DNase-1 단백질을 포함하는 나노입자를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, SARS-CoV-2 감염에 의한 패혈증 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명자들은 COVID-19 환자 중 패혈증이 진행된 중증 환자에서 혈액 내 cfDNA 수준이 증가하고, DNase-1 수준은 감소한 것을 확인하였다. 따라서 cfDNA 또는 DNase-1을 이용하면, 혈액 등을 이용한 비침습적 방법을 통해 비교적 간단하고 신속하게 SARS-CoV-2 감염에 의한 패혈증을 조기에 진단할 수 있다. 또한, 본 발명자들은 COVID-19 패혈증 환자의 혈액에 본 발명에 따른 외인성 DNase-1의 처리시 cfDNA 수준이 감소하고 내인성 DNase-1의 활성이 증가하며, 염증 관련 인자들의 수준이 감소한다는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 외인성 DNase-1는 SARS-CoV-2 감염에 의한 패혈증을 치료하기 위한 조성물로 다양하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1a 내지 1b는 SARS-CoV-2-감염 비패혈증 환자(SARS-CoV-2) 및 SARS-CoV-2-감염 패혈증 환자(SARS-CoV-2 sepsis)의 호중구 수준(%) 또는 절대 호중구 수(ANC)를 비교한 그래프이다.
도 1c 내지 1d는 정상(Normal), SARS-CoV-2-감염 비패혈증 환자, 및 SARS-CoV-2-감염 패혈증 환자의 NET 수준(%) 및 MPO 활성을 비교한 그래프이다.
도 1e는 SARS-CoV-2-감염 비패혈증 환자 및 SARS-CoV-2-감염 패혈증 환자의 CT 스캔 사진이다.
도 1f는 SARS-CoV-2-감염 비패혈증 환자 및 SARS-CoV-2-감염 패혈증 환자의 폐렴 증상 유무를 확인하기 위해 LDH 수준을 비교한 그래프이다.
도 2a는 정상, SARS-CoV-2-감염 비패혈증 환자, 및 SARS-CoV-2-감염 패혈증 환자의 cfDNA 수준(μg/mL)을 비교한 그래프이다.
도 2b는 정상, SARS-CoV-2-감염 비패혈증 환자, 및 SARS-CoV-2-감염 패혈증 환자의 DNase-1 수준(μg/mL)을 비교한 그래프이다.
도 2c는 정상, SARS-CoV-2-감염 비패혈증 환자, 및 SARS-CoV-2-감염 패혈증 환자의 Cit-Histone H3 수준(μg/mL)을 비교한 그래프이다.
도 2d는 정상, SARS-CoV-2-감염 비패혈증 환자, 및 SARS-CoV-2-감염 패혈증 환자의 Histone H3 단백질 및 Cit-Histone H3 단백질의 수준을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과이다.
도 2e는 COVID-19 환자의 예후에 따른 혈중 cfDNA, DNase-1, 및 Cit-histone H3 수준을 나타낸 그래프이다.
도 3a는 본 발명에 따른 long-acting DNase-1, 즉, DNase-1 단백질을 포함하는 나노입자의 모식도이다.
도 3b는 SARS-CoV-2-감염 패혈증 환자의 혈장에서, 본 발명에 따른 외인성 DNase-1의 혈장 내 cfDNA 억제 효과 및 혈장 DNase-1 (plasma DNase-1)의 활성 증가 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3c는 SARS-CoV-2-감염 패혈증 환자로부터 분리한 PBMC에서, 본 발명에 따른 외인성 DNase-1의 NET 수준, MPO 활성 및 NE 수준의 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3d는 SARS-CoV-2-감염 패혈증 환자로부터 분리한 PBMC에서, 본 발명에 따른 외인성 DNase-1의 NF-κB의 활성화 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3e는 SARS-CoV-2-감염 패혈증 환자로부터 분리한 PBMC에서, 본 발명에 따른 외인성 DNase-1의 IL-1β, IL-6, IFN-γ, 및 TNF-α 수준의 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 4a는 본 발명에 따른 외인성 DNase-1 처리 후 시간에 따른 CLP-마우스 모델의 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 4b는 in vivo 모델에서 본 발명에 따른 외인성 DNase-1의 복강 내 호중구 수준 감소 효과를 나타낸 그래프이다.
도 4c는 in vivo 모델에서 본 발명에 따른 외인성 DNase-1의 호중구 침윤 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 4d는 in vivo 모델에서 본 발명에 따른 외인성 DNase-1의 폐조직 회복 효과를 나타낸 그래프이다.
도 4e는 in vivo 모델에서 본 발명에 따른 외인성 DNase-1의 cfDNA 억제, 내인성 DNase-1 활성 증가, NET 억제, MPO 활성 억제, 및 NE 활성 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 4f는 in vivo 모델에서 본 발명에 따른 외인성 DNase-1 처리에 의한 조직 손상 마커의 변화를 나타낸 그래프이다.
본 발명자들은 COVID-19 환자 중 패혈증이 진행된 중증 환자에서 특이적으로 혈액 내 cfDNA 수준이 증가하고, DNase-1 수준은 감소한 것을 확인하였다. 또한, 본 발명자들은 COVID-19 패혈증 환자의 혈액에 본 발명에 따른 외인성 DNase-1의 처리시 cfDNA 수준이 감소하고 내인성 DNase-1의 활성이 증가하며, 염증 관련 인자들의 수준이 감소한다는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, SARS-CoV-2 (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) 감염에 의한 패혈증 진단 또는 이의 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다:
(a) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 cell-free DNA (cfDNA) 또는 deoxyribonuclease-1 (DNase-1)의 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 단계 (a)에서 측정된 cfDNA 수준이 대조군에 비해 증가되어 있는지 여부, 또는 단계 (a)에서 측정된 DNase-1의 수준이 대조군에 비해 감소되어 있는지 여부를 확인하는 단계.
본 명세서에 있어서, "SARS-CoV-2"는 2019년 12월에 발생한 신종 코로나바이러스(coronavirus)인 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)를 지칭하며, "COVID-19"는 SARS-CoV-2 바이러스 감염으로 인한 호흡기 감염질환을 지칭한다. 본 명세서에 있어서 "SARS-CoV-2 감염" 및 "COVID-19"는 호환되어 사용될 수 있다.
또한, 본 명세에 있어서 "SARS-CoV-2 패혈증(SARS-CoV-2 sepsis)" 또는 "COVID-19 패혈증(COVID-19 sepsis)"이란 SARS-CoV-2 감염에 의해 발달한 패혈증을 지칭하며, 상기 용어들은 호환되어 사용될 수 있다. 본 명세서에 있어서, "패혈증(sepsis)"이란 조직이나 기관에 상처가 생겼을 때 미생물, 바이러스 등의 감염이 일어나 이에 대한 면역 반응이 강하게 나타나는 증상을 말한다. 상기 패혈증은 급성 패혈증을 포함한다.
본 명세서에 있어서, “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 패혈증 상태의 동정, 패혈증의 단계 결정 또는 치료에 대한 패혈증의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)를 포함한다.
특히, 본 명세서에 있어서, “예후”는 병의 발생, 진행, 회복, 재발, 및 약물 내성 등에 관한 예측을 의미하는 것으로, 전망 내지는 예비적 평가를 말한다. 본 발명에서 예후는 패혈증의 발생, 재발, 패혈증으로 인한 사망, 패혈증으로부터의 생존(overall survival), 또는 무병생존(disease-free survival)을 의미할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에 있어서, “생물학적 시료”는 SARS-CoV-2 감염에 의한 패혈증을 진단하거나 상기 질병의 치료 반응성을 예측하고자 하는 피검체로부터 채취된 것이라면 제한없이 사용할 수 있으며, 예를 들어 생검 등으로 얻어진 세포나 조직, 혈액, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액, 각종 분비물, 소변, 대변 등일 수 있다. 바람직하게는 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 비액, 객담, 복수, 질 분비물 및 소변으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 혈액, 혈장, 또는 혈청일 수 있다. 혈액과 같은 액체 생검(liquid biopsy)을 이용하면, 조직검사와 같은 침습적인 방법과 달리 검사자에게 고통을 주지 않으면서 질병의 진단이 가능하다. 또한, 액체 생검을 이용하는 경우 질환이 발병하지 않은 잠재적 환자를 대상으로 조기 진단을 실시하거나, 이미 발병한 환자의 치료 경과를 주기적으로 관찰하는데 있어 조직검사에 비하여 큰 이점을 가진다. 상기 시료는 검출 또는 진단에 사용하기 전에 전처리할 수 있다. 예를 들어, 균질화(homogenization), 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다.
본 명세서에 있어서, “cfDNA (cell-free DNA)”란 세포 안에 존재하지 않고 혈류를 자유롭게 순환하는 다양한 형태의 DNA 조각을 의미한다. cfDNA의 종류에는 cell-free fetal DNA, cell-free tumour DNA, 및 cell-free circulating mitochondrial DNA 등이 포함될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. cfDNA는 체액 내에 단독으로 존재할 수 있으며, 세포외 소포체(exosome)에 포함되어 존재할 수도 있다.
또한, 본 발명에 있어서 cfDNA의 길이(base pairs)는 약 50 내지 60bp, 60 내지 70bp, 70 내지 80bp, 80 내지 90bp, 90 내지 100 bp, 100 내지 110bp, 110 내지 120bp, 120 내지 130bp, 130 내지 140bp, 140 내지 150bp, 150 내지 160bp, 160 내지 170bp, 170 내지 180bp, 180 내지 190bp, 190 내지 200bp, 200 내지 210 bp, 210 내지 220bp, 220 내지 230bp, 230 내지 240bp, 240 내지 250bp일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 본 발명에 있어서 cfDNA는 단일-가닥 DNA 또는 이중-가닥 DNA일 수 있다.
cfDNA 수준의 측정은 생물학적 시료 내의 cfDNA의 양을 측정하는 것을 의미한다. 생물학적 시료로부터의 cfDNA의 분리는 당업계에 알려진 통상의 방법(예컨대, 원심분리)을 통해 이루어질 수 있다. 분리된 cfDNA의 수준을 측정하는 방법은 당 기술분야에 잘 알려져 있다. 예컨대 분리된 cfDNA의 수준은 분광광도계, 분자 프로브(molecular probe), 및 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 등을 이용하여 측정할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에 있어서, “DNase-1(deoxyribonuclease-1)”는 DNA 분자 사슬 내부의 인산디에스테르 결합(phosphodiester bond)을 가수분해하는 엔도뉴클레아제(endonuclease)를 지칭한다. 특히, 본 발명에 따른 약학적 조성물을 제조하기 위한 DNase-1으로 Roche 사의 DNase-1을 사용하였으나, 이는 DNase-1 효소의 대표예로 사용된 것일 뿐 이에 한정되는 것은 아니며, 기타 상용화된 DNase-1은 물론, 천연(native) DNase-1, 유전공학적 방법으로 제조된 재조합 DNA로부터 발현시킨 DNase-1, 또는 화학 합성 DNase-1 등이 본 발명에 적용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 DNase-1 효소는 isoform 1 또는 isoform 2일 수 있다. DNase-1에 관한 구체적인 정보는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에서 확인할 수 있다(Gene ID: 1773).
대표적인 예로, DNase-1은 서열번호 1(NCBI Reference sequence: NG_009285.1)로 나타낸 염기서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의　서열　상동성을 가지는 염기서열로 암호화되는 것일 수 있다. 즉, DNase-1은 서열번호 1로 나타낸 염기서열과 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,　99%, 또는 100%의　서열　상동성을　갖는 염기서열로 암호화되는 것일 수 있다.
또다른 예로, DNase-1은 NCBI의 Gene ID: 1773에 제시된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 것일 수 있다. 구체적인 예로, DNase-1는 서열번호 2 내지 6으로 나타낸 아미노산 서열 중 하나 이상과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의　서열　상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 즉, DNase-1은 서열번호 2 내지 6으로 나타낸 아미노산 서열 중 하나 이상과 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,　99%, 또는 100%의　서열　상동성을　갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 그러나 상술한 바와 같이, 이는 DNase-1의 대표적 예시일 뿐이며, 상기 서열에 의해 DNase-1의 종류가 한정되는 것은 아니다.
DNase-1 수준의 측정은 생물학적 시료 내에 존재하는 DNase-1 양을 측정하는 것을 의미하며. 이는 DNase-1의 mRNA의 양 및/또는 DNase-1의 단백질의 양을 측정하는 것을 포함한다.
mRNA 수준의 측정 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예컨대 RT-PCR, 정량적 또는 반정량적 RT-PCR(Quantitative or semi-Quantitative RT-PCR), 정량적 또는 반정량적 리얼 타임 RT-PCR(Quantitative or semi-Quantitative real-time RT-PCR), 노던 블롯(northern blot) 및 DNA 또는 RNA 칩(chip) 등을 이용하여 측정할 수 있다.
단백질 수준의 측정 방법 또한 당업계에 잘 알려져 있으며, 예컨대 웨스턴 블롯, ELISA과 같은 면역학적 분석법, 방사선면역분석법, 방사면역확산법, 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전분석, 보체고정분석, FACS 및 단백질 칩, 분광광도계 등을 이용하여 측정할 수 있다.
본 명세서에 있어서, “수준이 증가되어 있다”는 것은, 검출되지 않던 것이 검출된 것, 또는 정상적인 수준보다 상대적으로 검출량이 많아지는 것을 의미한다. 이의 반대적 용어의 의미는 당업자라면 상기 정의에 준하여, 반대 의미를 가지는 것으로 이해 가능하다.
수준이 “증가”되어 있다는 것은, 예를 들어 실험군의 수준이 대조군의 그것에 비교하여 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10% 또는 그 이상, 예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상 높은, 및/또는 0.5배, 1.1배, 1.2배, 1.4배, 1.6배, 1.8배 또는 그 이상 높은 것을 의미한다. 구체적으로는, 대조군의 그것에 비해 1 내지 1.5배, 1.5 내지 2배, 2 내지 2.5배, 2.5 내지 3배, 3 내지 3.5배, 3.5 내지 4배, 4 내지 4.5배, 4.5 내지 5배, 5 내지 5.5배, 5.5 내지 6배, 6 내지 6.5배, 6.5 내지 7배, 7 내지 7.5배, 7.5 내지 8배, 8 내지 8.5배, 8.5 내지 9배, 9 내지 9.5배, 9.5 내지 10배, 또는 10배 이상 증가한 것을 의미할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
반대로, 수준이 “감소”되어 있다는 것은, 실험군의 수준이 대조군의 그것에 비교하여 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10% 또는 그 이상 낮은, 예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상 낮은, 및/또는 0.9배, 0.8배, 0.6배, 0.4배, 0.2배, 0.1배 이하로 낮은 것을 의미한다. 구체적으로, 수준이 감소했다는 것은 대조군에 비해 1 내지 1.5배, 1.5 내지 2배, 2 내지 2.5배, 2.5 내지 3배, 3 내지 3.5배, 3.5 내지 4배, 4 내지 4.5배, 4.5 내지 5배, 5 내지 5.5배, 5.5 내지 6배, 6 내지 6.5배, 6.5 내지 7배, 7 내지 7.5배, 7.5 내지 8배, 8 내지 8.5배, 8.5 내지 9배, 9 내지 9.5배, 9.5 내지 10배, 또는 10배 이상 감소한 것을 의미할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 방법으로 측정한 피검체의 cfDNA 또는 DNase-1 수준을 동일한 방법으로 측정한 대조군의 cfDNA 또는 DNase-1 수준과 비교하였을 때, cfDNA 수준이 증가되어 있고/있거나 DNase-1 수준이 감소되어 있는 경우, 상기 피검체를 SARS-CoV-2 감염에 의해 패혈증에 걸린 것으로 진단하거나 SARS-CoV-2 감염에 의한 패혈증의 예후가 좋지 않은 것(poor prognosis)으로 예측할 수 있다. “예후가 좋지 않은 것(poor prognosis)으로 예측하는 것”에서, “예후”의 의미는 위에서 정의한 바와 같다. 따라서, 예후가 좋지 않다는 것은, 예를 들면, 패혈증 발병 가능성이 높은 것, 패혈증 증상이 심각해지는 것, 패혈증으로 인한 사망 가능성이 높은 것, 또는 패혈증 재발 가능성이 높은 것 등을 의미할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 정보제공방법은 하기 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다:
(c) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 citrullinated histone H3 (Cit-histone H3) 수준을 측정하는 단계; 및
(d) 단계 (c)에서 측정된 Cit-histone H3 수준이 대조군에 비해 증가되어 있는지 여부를 확인하는 단계.
본 명세서에 있어서, “citrullinated histone H3 (Cit-histone H3)”란 시트르린화된 히스톤 단백질 H3 패밀리(histone H3 family)를 지칭하는 것으로서, Cit-histone H3에 속하는 단백질이라면 제한 없이 포함될 수 있다. Cit-histone H3에 속하는 단백질들의 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있다(UniProtKB: P68431 등). 대표적인 예로, Cit-histone H3는 서열번호 7로 나타낸 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 즉, Cit-histone H3은 서열번호 7로 나타낸 아미노산 서열 중 하나 이상과 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. Cit-histone H3는 호중구에 의한 NET 형성의 바이오마커로 알려져 있다. Cit-histone H3 수준의 측정은 생물학적 시료 내에 존재하는 Cit-histone H3 family 단백질의 양을 측정하는 것을 의미하며. 이는 Cit-histone H3의 mRNA의 양 및/또는 DNase-1의 단백질의 양을 측정하는 것을 포함한다.
본 발명에 따른 정보제공방법에 있어서, 상기 대조군은 정상인 또는 패혈증을 동반하지 않은 SARS-CoV-2 감염 환자로부터 분리된 생물학적 시료일 수 있다.
본 발명의 또다른 구현예에서, 상기 정보제공방법은 SARS-CoV-2 감염에 의한 패혈증의 조기 진단을 위한 것임을 특징으로 하는 것일 수 있다.
본 명세서에 있어서, “조기 진단”은 병이 많이 진행되지 않은 상태에서 병 발병 여부, 발병 가능성 유무 등을 판단하는 것을 의미한다. 즉 본 발명에서 조기 진단이란 패혈증이 아직 진행되지 않았거나 패혈증이 많이 진행되지 않은 SARS-CoV-2 감염 환자에서 패혈증의 발병 여부, 발병 가능성 유무를 판단하는 것을 의미하는 것일 수 있다.
본 발명의 또다른 구현예에서, 상기 피검체는 SARS-CoV-2 감염에 의한 패혈증을 진단받은 적이 없는 피검체인 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
본 발명의 또다른 구현예에서, 상기 정보제공방법은 SARS-CoV-2 감염에 의한 패혈증 진단 또는 이의 예후 예측과 함께 피검체의 폐렴 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 것일 수 있다.
예를 들어, 상기 방법으로 측정한 피검체의 cfDNA 또는 DNase-1 수준을 동일한 방법으로 측정한 대조군의 cfDNA 또는 DNase-1 수준과 비교하였을 때, cfDNA 수준이 증가되어 있고/있거나 DNase-1 수준이 감소되어 있는 경우, 상기 피검체가 폐렴에 걸린 것으로 진단하거나, 폐렴에 걸릴 가능성이 높은 것으로 판단할 수 있다.
또한, 본 발명은 cfDNA, DNase-1 단백질, 및 DNase-1 mRNA로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는, SARS-CoV-2 감염에 의한 패혈증 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 DNase-1 mRNA의 수준을 측정하는 제제는 DNase-1의 mRNA에 특이적으로 결합하는 분자 프로브 또는 프라이머일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 DNase-1 단백질의 수준을 측정하는 제제는 DNase-1의 단백질에 특이적인 항체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
“프라이머(primer)”란 DNA 합성의 개시점(starting point)으로 작용하는 짧은 단일가닥 올리고뉴클레오티드(single strand oligonucleotide)를 의미한다. 프라이머는 적합한 완충액(buffer)와 온도 조건에서 주형(template)인 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하고, DNA 중합효소가 프라이머에 주형 DNA에 상보적인 염기를 갖는 뉴클레오사이드 트리포스페이트를 추가하여 연결함으로써 DNA가 합성된다. 프라이머는 일반적으로 15 내지 30개의 염기서열로 이루어져 있으며, 염기 구성과 길이에 따라 주형 가닥에 결합하는 온도(melting temperature, Tm)가 달라진다. 프라이머의 서열은 주형의 일부 염기 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서 상기 DNase-1 mRNA의 발현 수준을 측정하기 위한 프라이머는 각 유전자 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, DNA 합성을 통해 mRNA 또는 cDNA의 특정 구간을 증폭하여 mRNA의 양을 측정하려는 목적에 맞는 길이와 상보성을 갖는 것이면 충분하다. 상기 증폭 반응을 위한 프라이머는 증폭하고자 하는 mRNA의 특정 구간의 양쪽 끝부분의 주형(또는 센스, sense)과 반대편(안티센스, antisense)에 각각 상보적으로 결합하는 한 세트(쌍)으로 구성된다. 프라이머는 당업자라면 DNase-1의 mRNA 또는 cDNA 염기서열을 참조하여 용이하게 디자인할 수 있다.
상기 '분자 프로브(molecular probe)'는 특정 유전자의 mRNA나 cDNA(complementary DNA)에 특이적으로 결합할 수 있는 짧게는 수개 내지 길게는 수백 개의 염기(base pair) 길이의 RNA 또는 DNA 등 폴리뉴클레오티드의 단편을 의미하며, 표지(labeling)되어 있어서 결합하는 대상 mRNA나 cDNA의 존재 유무, 발현양 등을 확인할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해서는 DNase-1 mRNA에 상보적인 분자 프로브를 피검체의 시료와 혼성화 반응(hybridization)을 수행하여 DNase-1 mRNA의 발현양을 측정함으로써 SARS-CoV-2 감염에 의한 패혈증 진단 또는 예후 예측에 이용할 수 있다. 분자 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 기술에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 본 발명에서 상기 프라이머 또는 분자 프로브는 포스포아미다이트(phosphoramidite) 고체지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 또한 프라이머 또는 분자 프로브는 DNase-1 mRNA와의 혼성화를 방해하지 않는 범위에서 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 다양하게 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 그리고 형광 또는 효소를 이용한 표지 물질(labeling material)의 결합 등이 있다.
상기 항체란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명에 사용되는 항체는 단클론 또는 다클론 항체, 면역학적으로 활성인 단편(예를 들어, Fab 또는 (Fab)2 단편), 항체 중쇄, 인간화 항체, 항체 경쇄, 유전자 조작된 단일쇄 Fν 분자, 키메릭 항체 등일 수 있다.
DNase-1 단백질은 공지된 단백질이므로 본 발명에 사용되는 항체는 단백질을 항원으로 하여 면역학 분야에서 널리 알려져 있는 통상의 방법으로 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 항체의 항원으로서 사용되는 DNase-1 단백질은 천연에서 추출하거나 합성될 수 있으며 DNA 서열을 기초로 하여 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다. 유전자 재조합 기술을 이용할 경우 DNase-1 단백질을 코딩하는 핵산을 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체에서 DNase-1 단백질이 발현되도록 숙주 세포를 배양한 후 형질전환체로부터 DNase-1 단백질을 회수함으로써 수득될 수 있다.
예를 들어, 다클론 항체는 DNase-1 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 항체는 말, 소, 염소, 양, 개, 닭, 칠면조, 토끼, 마우스 또는 래트와 같은 여러 온혈 동물을 이용하여 제조할 수 있다.
단클론 항체도 공지된 융합방법(fusion method)(Kohler and Milstein, European J. Immnunol. 6:511-519, 1976), 재조합 DNA 방법(미국특허 제4816567호) 및 파지 항체 라이브러리(Clackson et al., Nature, 352, 624-628, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 58:1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다.
본 발명의 또다른 구현예에서, 상기 cfDNA 또는 DNase-1 단백질의 수준은 혈액, 혈장, 또는 혈청 내 cfDNA 또는 DNase-1 단백질의 수준일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또다른 구현예에서, 상기 조성물은 SARS-CoV-2 감염에 의한 패혈증의 조기 진단을 위한 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또다른 구현예에서, 상기 조성물은 SARS-CoV-2 감염에 의한 패혈증 발병 위험군을 선별 검사하기 위한 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 cfDNA, DNase-1 단백질, 및 DNase-1 mRNA로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는 조성물을 포함하는, SARS-CoV-2 감염에 의한 패혈증 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 DNase-1의 단백질 항체 이외에 면역학적 분석에 사용되는 당 업계에 공지된 도구 및/또는 시약을 추가로 포함할 수 있다.
상기 면역학적 분석은 항원과 항체의 결합을 측정할 수 있는 있는 방법이라면 모두 포함될 수 있다. 이러한 방법들은 당 분야에 공지되어 있으며 예를 들어, 면역세포화학 및 면역조직화학, 방사선 면역 분석법(radioimmunoassay), 효소결면역흡착검사법(ELISA: Enzyme Linked Immunoabsorbent assay), 면역 블롯(immunoblotting), 파아르 분석법(Farr assay), 면역침강, 라텍스 응집, 적혈구 응집, 비탁계법, 면역확산법, 카운터-전류 전기영동법, 단일 라디칼 면역확산법, 단백질 칩 및 면역형광법이 있다.
면역학적 분석에 사용되는 도구 및/또는 시약으로는 적합한 담체 또는 지지체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제가 포함된다. 또한, 표지물질이 효소인 경우에는 효소활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다.
본 발명의 진단 또는 예후 예측용 키트에 포함되는 DNase-1는 바람직하게는 적합한 담체 또는 지지체에 문헌에 개시된 바와 같은 다양한 방법을 이용하여 고정될 수 있으며(Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow ＆ Lane; Cold SpringHarbor, 1988), 적합한 담체 또는 지지체의 예로는 아가로스, 셀룰로즈, 니트로셀룰로즈, 덱스트란, 세파덱스, 세파로즈, 리포솜, 카복시메틸 셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 폴리스테린, 반려암, 여과지, 이온교환수지, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 유리, 폴리아민-메틸 비닐-에테르-말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 컵, 플랫 팩(flat packs) 등이 포함된다. 그 외의 다른 고체 기질로는 세포 배양 플레이트, ELISA 플레이트, 튜브 및 폴리머성 막이 있다. 상기 지지체는 임의의 가능한 형태, 예를 들어 구형(비드), 원통형(시험관 또는 웰 내면), 평면형(시트, 시험 스트립)을 가질 수 있다.
검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지는 항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정 가능하게 하며, 이의 예로는 효소, 형광물질, 리간드, 발광물질, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사성 동위원소 등을 사용할 수 있다. 효소로는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라아제, 글리코즈 옥시다아제, 헥소키나제, 말레이트 디하이드로게나아제, 글루코스-6-인산디하이드로게나아제, 인버타아제 등을 사용할 수 있다. 형광물질로는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, 플루오르신이소티옥시아네이트 등을 사용할 수 있다. 리간드로는 바이오틴 유도체 등이 있으며, 발광물질로는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있다. 미소입자로는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있고 레독스 분자로는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 등이 있다. 그러나 상기 예시된 것들 외에 면역학적 분석법에 사용할 수 있은 것이라면 어느 것이라도 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, SARS-CoV-2 감염에 의한 패혈증 치료 물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) SARS-CoV-2 감염에 의한 패혈증 환자로부터 분리된 생물학적 시료에 시험물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 시험물질을 처리한 시료와 처리하지 않은 대조군 시료에서 cfDNA 수준 또는 DNase-1 단백질 활성을 측정하는 단계; 및
(c) 대조군 시료와 비교해 상기 cfDNA 수준을 감소시키거나, 또는 상기 DNase-1 단백질 활성을 증가시킨 시험물질을 SARS-CoV-2 감염에 의한 패혈증 치료 물질로 선별하는 단계.
상기 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어, “시험물질”은 생물학적 시료 내의 cfDNA 또는 DNase-1의 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시험물질은 siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 재조합 플라스미드(recombinant plasmid), 나노입자(nanoparticle), 단백질, 올리고펩타이드, 항체, 앱타머, 천연추출물 또는 화학물질을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에 있어서, “활성이 증가” 되었다는 것은, 단백질, 예컨대 효소의 기능이 상대적으로 회복, 개선, 또는 증가되었다는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명에 있어서 DNase-1의 활성이 증가되었다는 것은 상기 시험물질을 처리하지 않은 대조군 시료에 비해 상기 시험물질을 처리한 시료 내의 DNase-1의 기능, 예컨대 cfDNA 분해 기능 또는 NET 형성 억제 기능 등이 회복, 개선, 또는 증가되었다는 것을 의미한다. 단백질 활성을 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 ELISA 등을 이용하여 측정할 수 있다.
상기 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어, “대조군”은 시험물질을 처리하지 않은 시료일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 DNase-1 단백질을 유효성분으로 포함하는, SARS-CoV-2 감염에 의한 패혈증 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 DNase-1 단백질을 포함하는 나노입자를 유효성분으로 포함하는, SARS-CoV-2 감염에 의한 패혈증 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에 있어서, “외인성(exogenous) DNase-1”은 특정 개체의 외부에서 기원된 DNase-1을 지칭하며, free DNase-1 및 long-acting DNase-1가 이에 포함된다. 즉, 본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함된 DNase-1 단백질은 외인성 DNase-1에 해당한다. 본 명세서에 있어서, “내인성(endogenous) DNase-1”은 개체가 자연적으로 가지고 있는 DNase-1을 지칭하며, 본 발명에 따른 생물학적 시료에 본래 존재하는 DNase-1도 이에 포함된다.
본 명세서에 있어서, “free DNase-1”는 단리된 상태의(isolated) DNase-1 단백질을 의미한다. 구체적으로 free DNase-1은 나노입자 또는 기타 담체 등에 고정화되지 않고 독립된 상태로 기능하는 DNase-1 단백질을 의미하며, 따라서 천연의 DNase-1 단백질은 물론 인공적으로 합성된 DNase-1도 이에 해당할 수 있다.
본 명세서에 있어서, “long-acting DNase-1”은 지속성이 높은 DNase-1, 예컨대 서방형의 DNase-1을 의미한다. 즉, Long-acting DNase-1은 free DNase-1에 비해 반감기(half-life)가 더 긴 것을 특징으로 한다. 예를 들어, long-acting Dnase-1은 담체에 고정화된(immobilized) 상태의 DNase-1일 수 있다. 바람직하게는, 상기 담체는 나노입자일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, "나노입자"는 코폴리머(copolymer) 나노입자일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 나노입자는 (poly(lactic-co-glycolic acid)(PLGA) 나노입자일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 나노입자는 표면이 카테콜 유도체로 코팅된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 즉, 나노입자를 코팅하는 물질은 DNase-1(예컨대, free DNase-1)을 나노입자에 고정화시키는 목적을 달성할 수 있으면 족하고, 카테콜 유도체에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 상기 나노입자는 표면이 폴리도파민(polydopamine, PD)으로 코팅된 것일 수 있다.
본 발명의 또다른 구현예에서, 상기 나노입자는 폴리에테르 화합물(polyether compound)을 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 나노입자는 poly(ethylene glycol)(PEG)를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 또다른 구현예에서, 상기 DNase-1 단백질은 나노입자에 코팅된 카테콜 유도체를 통해 나노입자의 표면에 고정화될 수 있다. 바람직하게는, 상기 DNase-1 단백질은 폴리도파민을 통해 나노입자의 표면에 고정화될 수 있다.
본 발명의 또다른 구현예에서, 상기 약학적 조성물은 하기 특징 중 하나 이상을 만족하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다:
(a) cfDNA 수준을 감소시킴;
(b) 내인성(endogenous) DNase-1 활성을 증가시킴;
(c) 골수세포형 과산효소(Myeloperoxidase, MPO)의 활성을 억제함;
(d) 호중구 엘라스타아제(Neutrophil elastase, NE)의 활성을 억제함;
(e) 호중구의 세포외 트랩(neutrophil extracellular traps, NET) 형성(NETosis)을 억제함;
(e) 호중구의 NF-κb의 활성을 억제함;
(f) 호중구에 의한, IL-1β, IL-6, IFN-γ, 및 TNF-α로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 생성을 감소시킴; 및/또는
(g) 호중구의 복강 내 침윤을 억제함.
본 발명의 조성물 내의 상기 DNase-1 단백질 또는 DNase-1 단백질이 고정화된 나노입자의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9중량%, 또는 0.001 내지 50중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 함량비는 용매를 제거한 건조량을 기준으로 한 값이다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
본 발명에 따른 정제, 산제, 과립제, 캡슐제, 환제, 트로키제의 첨가제로 옥수수전분, 감자전분, 밀전분, 유당, 백당, 포도당, 과당, 디-만니톨, 침강탄산칼슘, 합성규산알루미늄, 인산일수소칼슘, 황산칼슘, 염화나트륨, 탄산수소나트륨, 정제 라놀린, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 알긴산나트륨, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 카올린, 요소, 콜로이드성실리카겔, 히드록시프로필스타치, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC) 1928, HPMC 2208, HPMC 2906, HPMC 2910, 프로필렌글리콜, 카제인, 젖산칼슘, 프리모젤 등 부형제; 젤라틴, 아라비아고무, 에탄올, 한천가루, 초산프탈산셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 포도당, 정제수, 카제인나트륨, 글리세린, 스테아린산, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 히드록시셀룰로오스, 히드록시프로필스타치, 히드록시메칠셀룰로오스, 정제쉘락, 전분호, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제가 사용될 수 있으며, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 옥수수전분, 한천가루, 메칠셀룰로오스, 벤토나이트, 히드록시프로필스타치, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 알긴산나트륨, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 구연산칼슘, 라우릴황산나트륨, 무수규산, 1-히드록시프로필셀룰로오스, 덱스트란, 이온교환수지, 초산폴리비닐, 포름알데히드처리 카제인 및 젤라틴, 알긴산, 아밀로오스, 구아르고무(Guar gum), 중조, 폴리비닐피롤리돈, 인산칼슘, 겔화전분, 아라비아고무, 아밀로펙틴, 펙틴, 폴리인산나트륨, 에칠셀룰로오스, 백당, 규산마그네슘알루미늄, 디-소르비톨액, 경질무수규산 등 붕해제; 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘, 스테아린산, 수소화식물유(Hydrogenated vegetable oil), 탈크, 석송자, 카올린, 바셀린, 스테아린산나트륨, 카카오지, 살리실산나트륨, 살리실산마그네슘, 폴리에칠렌글리콜(PEG) 4000, PEG 6000, 유동파라핀, 수소첨가대두유(Lubri wax), 스테아린산알루미늄, 스테아린산아연, 라우릴황산나트륨, 산화마그네슘, 마크로골(Macrogol), 합성규산알루미늄, 무수규산, 고급지방산, 고급알코올, 실리콘유, 파라핀유, 폴리에칠렌글리콜지방산에테르, 전분, 염화나트륨, 초산나트륨, 올레인산나트륨, dl-로이신, 경질무수규산 등의 활택제;가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 액제의 첨가제로는 물, 묽은 염산, 묽은 황산, 구연산나트륨, 모노스테아린산슈크로스류, 폴리옥시에칠렌소르비톨지방산에스텔류(트윈에스텔), 폴리옥시에칠렌모노알킬에텔류, 라놀린에텔류, 라놀린에스텔류, 초산, 염산, 암모니아수, 탄산암모늄, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 프롤아민, 폴리비닐피롤리돈, 에칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 시럽제에는 백당의 용액, 다른 당류 혹은 감미제 등이 사용될 수 있으며, 필요에 따라 방향제, 착색제, 보존제, 안정제, 현탁화제, 유화제, 점조제 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 유제에는 정제수가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 유화제, 보존제, 안정제, 방향제 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 현탁제에는 아카시아, 트라가칸타, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 미결정셀룰로오스, 알긴산나트륨, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC) 1828, HPMC 2906, HPMC 2910 등 현탁화제가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 계면활성제, 보존제, 안정제, 착색제, 방향제가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 주사제에는 주사용 증류수, 0.9% 염화나트륨주사액, 링겔주사액, 덱스트로스주사액, 덱스트로스+염화나트륨주사액, 피이지(PEG), 락테이티드 링겔주사액, 에탄올, 프로필렌글리콜, 비휘발성유-참기름, 면실유, 낙화생유, 콩기름, 옥수수기름, 올레인산에칠, 미리스트산 이소프로필, 안식향산벤젠과 같은 용제; 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 요소, 우레탄, 모노에칠아세트아마이드, 부타졸리딘, 프로필렌글리콜, 트윈류, 니정틴산아미드, 헥사민, 디메칠아세트아마이드와 같은 용해보조제; 약산 및 그 염(초산과 초산나트륨), 약염기 및 그 염(암모니아 및 초산암모니움), 유기화합물, 단백질, 알부민, 펩 톤, 검류와 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 등장화제; 중아황산나트륨(NaHSO3) 이산화탄소가스, 메타중아황산나트륨(Na2S2O5), 아황산나트륨(Na2SO3), 질소가스(N2), 에칠렌디아민테트라초산과 같은 안정제; 소디움비설파이드 0.1%, 소디움포름알데히드 설폭실레이트, 치오우레아, 에칠렌디아민테트라초산디나트륨, 아세톤소디움비설파이트와 같은 황산화제; 벤질알코올, 클로로부탄올, 염산프로카인, 포도당, 글루콘산칼슘과 같은 무통화제; 시엠시나트륨, 알긴산나트륨, 트윈 80, 모노스테아린산알루미늄과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 좌제에는 카카오지, 라놀린, 위텝솔, 폴리에틸렌글리콜, 글리세로젤라틴, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 스테아린산과 올레인산의 혼합물, 수바날(Subanal), 면실유, 낙화생유, 야자유, 카카오버터+콜레스테롤, 레시틴, 라네트왁스, 모노스테아린산글리세롤, 트윈 또는 스판, 임하우젠(Imhausen), 모놀렌(모노스테아린산프로필렌글리콜), 글리세린, 아뎁스솔리두스(Adeps solidus), 부티룸 태고-G(Buytyrum Tego-G), 세베스파마 16 (Cebes Pharma 16), 헥사라이드베이스 95, 코토마(Cotomar), 히드록코테 SP, S-70-XXA, S-70-XX75(S-70-XX95), 히드록코테(Hydrokote) 25, 히드록코테 711, 이드로포스탈 (Idropostal), 마사에스트라리움(Massa estrarium, A, AS, B, C, D, E, I, T), 마사-MF, 마수폴, 마수폴-15, 네오수포스탈-엔, 파라마운드-B, 수포시로(OSI, OSIX, A, B, C, D, H, L), 좌제기제 IV 타입 (AB, B, A, BC, BBG, E, BGF, C, D, 299), 수포스탈 (N, Es), 웨코비 (W, R, S, M ,Fs), 테제스터 트리글리세라이드 기제 (TG-95, MA, 57)와 같은 기제가 사용될 수 있다.
경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.
경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 DNase-1 단백질을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, SARS-CoV-2 감염에 의한 패혈증 예방 또는 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 DNase-1 단백질을 포함하는 나노입자를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, SARS-CoV-2 감염에 의한 패혈증 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.
본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명에서 “투여”란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명에서 "예방"이란 목적하는 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, “개선"이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실험예]
실험예 1. 혈장 샘플의 준비
SASS-CoV-2 감염으로 진단받은 환자로부터 초기 혈액(whole blood) 샘플을 확보하였다. COVID-19 패혈증(COVID-19 sepsis)을 앓고 있는 환자는 Sepsis Consensus Conference Committee의 지침을 따라 분류하였다. 특히, 적격인(eligible) 환자는 하기 조건을 만족한다: (1) 18세 이상일 것; (2) 하기 조건 중 적어도 하나를 만족하는 급성 발병(acute onset) 상태일 것: 열(고막 체온이 38℃ 이상일 것), 전신 감염 의심, SIRS 기준에 따른 하나 이상의 전신 염증 반응 증후군 증상, 저혈압(수축기 혈압＜90 mmHg), 및/또는 쇼크(shock). 건강한 환자의 샘플은 대조군으로 사용하였으며, 모든 환자에 대한 임상 데이터를 수집하였다. 혈액 샘플을 확보한 후 12 시간 이내로 2000 ×g로 5분 동안 원심분리하여 혈장 샘플을 확보하였다.
실험예 2. COVID-19 환자의 호중구 수 계측
환자의 정맥혈 샘플로부터 전체 혈구 수를 계측하였다. 환자 입원 후 24시간 이내에 분석하였으며, 호중구 수 계측은 Sysmex XE-2100 Automated Hematology System을 이용하여 수행하였다.
실험예 3. NET 효소-결합면역흡착검사(NET enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)
새로 분리한 호중구(1×105개 세포)를 25nM의 phorbol-myristate acetate(PMA; Sigma-Aldrich) 또는 대조 배지(글루타민, 페니실린, 및 스트렙토마이신이 첨가된 RPMI 1640)와 함께 배양하여 호중구가 NET를 형성하도록 자극하고, 형광 측정 기법(fluorometric technique)으로 평가하였다. NET 생성량은 임의 형광 단위(arbitrary fluorescent units, AFUs)로 측정하였다.
실험예 4. MPO ELISA
SARS-CoV-2-감염 환자 및 마우스의 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)의 탈과립(degranulation)에 따른 granule matrix protein(MPO)의 방출을 정량화하기 위해, human MPO ELISA 키트(BMS2038INST, Invitrogen) 또는 mouse myeloperoxidase ELISA 키트(MBS700747, MyBioSource)를 각각 사용하여 혈장 샘플을 분석하였다.
실험예 5. Cit-histone H3의 ELISA 및 웨스턴 블롯 분석
세포 배양 배지 또는 패혈증 환자 혈청 내의 Cit-histone H3의 농도는 human citrullinated histone H3 ELISA 키트(MBS7254090, MyBioSource)를 이용하여 측정하였다. 알부민이 제거된 혈장 단백질(lane 당 약 20μg)은 8%의 폴리아크릴아마이드 젤 상에서 SDS-PAGE로 전기영동하였으며, 니트로셀룰로오스 막(Bio-Rad Laboratories)에 트랜스퍼(transfer)하였다. 상기 막은 5%의 소혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)를 함유한 0.05% PBS-Tween(PBST)로 블로킹(blocking)하였으며, 그 후 1차 항체(항-histone H3(citrulline R2 + R8 + R17)항체)와 함께 4℃에서 밤새 배양하였다. 이어서 horseradish peroxidase(HRP)가 결합된 2차 항체와 2시간 동안 실온에서 배양하였으며, Western Lighting Chemiluminescence Reagent Plus (PerkinElmer LAS, Inc.)를 사용하여 화학발광을 이용해 막에 결합된 1차 항체를 검출하였다. 사용한 제품 정보는 다음과 같다: human citrullinated histone H3 ELISA Kit (MBS7254090, MyBioSource).
실험예 6. 혈장 cfDNA의 정량화
SARS-CoV-2-감염된 환자의 혈장 또는 마우스 혈장으로부터 cfDNA를 분리하기 위해, 혈장 샘플을 16,800×g에서 10분 동안 원심분리한 후, 제조사의 설명에 따라 Qiagen QIAamp DNA Mini Blood Mini 키트(Qiagen)를 사용하였다. 분리 및 정제된 cfDNA는 NanoDrop 분광 광도법으로 정량화하였다.
실험예 7. DNase-1 활성 측정을 위한 ELISA
혈청 샘플을 1μg/ml의 이중가닥 DNA이 섞인(spiked) digestion buffer와 1:50의 비율로 희석하였다. 샘플은 제조사의 설명에 따라 PicoGreen(Invitrogen)으로 염색하였으며, 37℃에서 5시간 동안 배양하였다. PicoGreen 염색(형광 방출(fluorescence emission, Em))의 감소는 형광 광도계로 측정하였다.
실험예 8. Long-acting DNase-1의 제조
실험예 8-1. Long-acting DNase-1의 제조과정
Long-acting DNase-1(도 3a)은 Science 361, eaao4227 (2018) 및 Sci Transl Med 8, 361ra138-361ra138 (2016)를 참고하여 제조하였다. 통상적인 단일 유화법(single mulsification method)을 이용하여, FDA의 승인을 받은 생분해성 폴리머인 poly (lactic-glycolic acid)(PLGA)(lactic acid:glycolic acid = 1:1, 점성 0.55-0.75 DL/g, Part#: B6013-2P, Durect Corporation)를 사용해 제조했다. Long-acting DNase-1 제조에 사용된 DNase-1은 free-DNase-1과 동일한 것으로서, Roche사의 DNase-1을 사용하였다(10104159001, Roche).
먼저, 기초 나노입자(bare nanoparticle)의 제조를 위해 5 mL의 dichloromethane (DCM)에 400 mg의 PGLA를 용해시킨 후, 혼합물을 20 mL의 1% poly(vinyl alcohol)(PVA)(Sigma-Aldrich) 용액에 부었다. 생성된 폴리머 용액은 Q700 sonicator(Qsonica)를 사용하여 40% amplitude에서 1초마다 on/off를 하며 10분 동안 초음파처리(sonicated)하였다. 제조된 에멀젼(emulsion)은 5 mL의 탈이온수(DI water)에 붓고, 실온에서 밤새 자기 교반하여 잔류 DCM이 증발하게 하였다. PGLA NP (400 mg)은 10 mM, pH 8.5의 Tris buffer (Sigma-Aldrich)에 현탁시키고, 폴리도파민(polydopamine, PD)(물 1 mL당 100 mg의 폴리도파민)으로 만들어진 생체-접착제(bio-adhesive)과 함께 4 ℃에서 격렬히 교반시켜 PGLA NP가 폴리도파민으로 코팅되게 하였다. 제조된 생체-접착성 나노입자(bio-adhesive nanoparticles, PGLA-PD NPs)를 20분 동안 17,000 rpm에서 원심분리하여 모으고, 50 mg의 DNase-1(Roche) 및 50 mg의 poly(ethylene glycol)(PEG, 4 arm-amine termini, HCL salt)(JenKem) 함유한 5 mL의 Tris buffer (10 mM, pH 8.5)에 재현탁시킨 후, 4 ℃에서 3시간 동안 교반시켰다. 생성된 DNase-1-코팅 나노입자(DNase-1-coated NPs)를 모아 탈이온수로 워싱하여, PGLA-PD-PEG-DNase-1 NPs (long-acting DNase-1)을 완성하였다.
완성된 long-acting DNase-1은 Milli-Q water에 희석하고, 용액 한 방울을 구리 그리드(copper grid)상에 올려 둔 후, 진공 챔버에서 건조시켰다. 건조된 후, 그리드를 조심스럽게 샘플 홀더에 올려 두고, JEM-7500F (Akishima) scanning electron microscope (SEM)으로 분석했다. 상기 나노입자의 크기 및 zeta potential은 Malvern Zetasizer Nano ZS system (Malvern Instruments)으로 측정했다.
실험예 8-2. Free-DNase-1 및 long-acting DNase-1의 활성 측정
DNase-1 endodeoxyribonuclease 활성 분석을 위해, 1 kb의 이중-가닥 DNA(dsDNA) ladder (New England Biolabs)를 기질(즉, 분해 타겟)로 사용하였다. 효소 활성 분석은 2 μg의 dsDNA를 함유한 20 μL의 buffer (100 mM 아세트산 나트륨, 6.25 mM 황산마그네슘, pH 5.0)으로 수행하였는 바, 상기 buffer에 대조군 효소(1 unit), free DNase-1 (1 unit), 다양한 농도의 long-acting DNase-1 (0.1 내지 10 μL), 또는 코팅되지 않은 대조군 나노입자(표면에 DNase-1가 고정화되지 않은 PD-PEG NP)(10 μL)를 첨가한 후, 37 ℃에서 10분 동안 배양하였다. 배양을 마친 후, 샘플을 1% agarose gel에서 전기영동 하고, ethidium-bromide (EtBr, 0.5 μg/mL)로 35분 동안 염색시켰다. 염색된 DNA 밴드는 표준 여기 및 방출 필터(excitation and emission filters)가 장착된 Bio-Rad Chemi Doc XRS+(Hercules)로 관측하였다. 상기 실험 과정은 Human Deoxyribonuclease I ELISA Kit(MBS729766, MyBioSource), 및 DNase I Assay Kit (Fluorometric) (ab234056, abcam)를 사용하여 진행했으며, 제조사의 설명서를 참고하였다.
실험예 9. 호중구의 분리
PBMC는 Blood. 2014 Jan 9;123(2):239-48를 참고하여 Percoll 밀도 구배(density gradient)(pH 8.5-9.5; Sigma-Aldrich)를 이용해 분리했다. 분리된 PBMC는 RPMI 1640 배지(Sigma-Aldrich)에 현탁시켰다.
호중구는 1-step Polymorphs (Axis-Shield) 상에서 불연속적 밀도 구배 원심분리를 통해 분리하였다. 순도를 높이기 위해, 분리된 호중구는 CD45 항체-접합 자성 비즈(beads) 및 magnetic-activated cell sorting (MACS)를 사용하여 더욱 정제하였다. 트리판 블루 염색법으로 확인하였을 때, 호중구의 viability는 일반적으로 95% 이상이었다. 사이토카인 생성 저해에 대한 long-acting DNase-1의 효과를 확인하기 위해, SARS-CoV-2-감염 환자로부터 호중구를 분리한 후 long-acting DNase-1을 처리하였다. 또한, 패혈증 CLP 마우스 모델에도 Long-acting DNase-1을 투여하였다. 상층액을 확보하여 ELISA를 통해 사이토카인을 분석하였으며, 세포 용해물(cell lysates)는 NF-κB 활성 분석을 위해 사용하였다.
실험예 10. NF-κB 활성 분석
핵 추출물(nuclear extracts)의 준비 및 TransAM 분석은 Mol Med 92, 77-92 (2014)를 참고하여 수행하였다. 각각의 NF-κB 단위체의 활성은 EISA-기반 NF-κB Family Transcription Factor Assay Kit (43296; Active Motif)를 사용하여 측정했다. 핵 추출물(2 μg)을 NF-κB 공통 올리고뉴클레오타이드(NF-κB consensus oligonucleotides)로 코팅된 96-well plate에서 배양하였다. 포획된 복합체는 NF-κB 1차 항체와 함께 배양하였으며, 이어서 HRP-결합 2차 항체와 배양하였다. Tecan Spark microplate reader(Tecan)를 사용해 450 nm에서 광밀도(optical density, OD)를 측정함으로써 항체를 검출하였다.
실험예 11. 사이토카인 ELISA
Human ELISA kit (Quantikine ELISA, R&D Systems)를 제조사의 설명에 따라 사용하여 SARS-CoV-2-감염 환자 및 퇴원환 환자의 혈청 내 염증성 사이토카인(IL-1β, IL-6, IFN-γ, 및 TNF-α) 및 LDN 수준을 측정하였다. 결과는 pg/mL로 나타냈다.
실험예 12. 마우스 모델의 준비 및 사육
C57BL/6 수컷 마우스(6주 내지 7주령, 무게는 18-20g)를 Orient Bio에서 구입하였으며, 12일의 순응 기간이 지난 후 사용하였다. 케이지당 5마리의 마우스를 온도 20-25℃, 습도 40-45%의 환경에서 12:12시간의 명암 주기(lignt/dark cycle)로 사육하였다. 마우스에게는 보통의 설치류 사료를 지급하였으며, 물을 자유롭게 공급하였다(ad libitum). 모든 동물은 KRIBB 제1305021호에서 발행한 실험실 동물의 관리 및 사용에 관한 지침에 따라 다루었다.
실험예 13. 맹장 결찰 및 천공(Cecal ligation and puncture, CLP)
CLP-유도 패혈증 마우스 모델은 Nat Protoc 4, 31-36 (2009)을 참고하여 제조하였다. 2cm의 중간선 절개(midline incision)를 만들어 맹장 및 이와 인접한 소장을 노출시켰다. 그 후 맹장 끝에서부터 5.0 mm의 3.0-실크 봉합사(suture)를 사용해 단단히 결찰(ligated)시켰고, 22-게이지 바늘로 천공(punctured)을 만든 다음, 천공 부위에서 대변을 부드럽게 압출 시켰다. 맹장은 복강 내로 되돌려 놓고, 4.0-실크 봉합사를 사용해 개복술 부위를 봉합하였다. 모의 수술(sham operations)을 위해 마우스의 맹장을 외과적으로 노출시켰으나, 결찰이나 천공은 내지 않고 복강으로 되돌려 놓았다.
실험예 14. 유세포 분석기(flow cytometry)를 이용한 세포 분석
복막강으로 이동한 호중구 및 대식세포를 분석하기 위해, MACS로 CD45-양성 PBMC를 분리하였다. 모의 그룹(sham group)에서는 침윤된 호중구 및 대식세포의 수를 최소화하여, 그룹당 5마리의 마우스로부터 PBMC를 모았다. CD45-양성 PBMC는 FITC-결합된 항-Ly6G 항체(호중구 표면 마커) FITC 및 APC-결합된 항-F4/80 항체(대식세포 표면 마커)로 염색하였다. 염색된 세포는 1 mL의 PBS에 현탁시켰고, FACS 유세포 분석기(BD Bioscience)를 사용해 형광을 정량화하였다.
실험예 15. Hematoxylin & Eosin(H&E) 염색법 및 병리조직학적 시험
수컷 C57BL/6 마우스에 CLP를 진행하고 12시간 또는 24시간 후에 DNase-1 또는 long-acting DNase-1 (100 units)을 정맥 투여하였다. 마우스는 CLP 처리하고 72시간 후에 안락사 시켰다. 마우스의 폐의 표현형의 변화를 분석하기 위해, 각 마우스로부터 폐를 분리하였다. H&E 염색법은 통상적인 프로토콜에 따라 수행하였다.
실험예 16. 패혈증 마우스의 혈장의 임상 화학(clinical chemistry) 및 사이토카인 수준 측정
생화학 키트(MyBioSource)를 사용해 신선한 혈청의 AST, ALT, BUN, 크레아티닌(creatinine), 및 LDH 수준을 측정하였다. 수치는 ELISA plate reader(Tecan)을 사용하여 측정했다.
실험예 17. 통계적 분석
모든 실험은 독립적으로 세 번씩 반복하여 수행했다. 통계적으로 유의한 차이는 unpaired t-test로 확인하였다. 통계적 분석을 분석을 위해 Graphpad Prism 소프트웨어를 사용하였다. 데이터는 평균±SEM으로 나타냈으며 P＜0.05를 통계적으로 유의한 것으로 보았다.
[실시예]
실시예 1. COVID-19 패혈증 환자의 호중구 수준, NET 형성, MPO 발현 및 패혈증 증상 확인
실시예 1-1. COVID-19 패혈증 환자의 호중구 수 확인
SARS-CoV-2에 감염된 환자로부터 환자 정보 및 혈액 샘플을 확보한 후 혈액을 분석하였다. 먼저, SAR-CoV-2 감염에 의한 패혈증이 림프구(lymphocyte) 수준에 변화를 유도하는지 확인하기 위해, SARS-CoV-2-감염 패혈증 환자 샘플에서 특이적으로 호중구 수가 증가하였는지 확인하였다. 실험예 2에 따라 환자들의 샘플 내의 호중구 수를 측정 및 비교하였으며, 그 결과 패혈증을 앓지 않는 SARS-CoV-2-감염 환자에 비해 패혈증을 앓는 SARS-CoV-2-감염 환자에서 호중구의 수 및 절대 호중구 수(absolute neutrophil count, ANC)가 증가한 것을 확인하였다(도 1a 및 1b). 즉, 이로부터 COVID-19 패혈증 환자에서 호중구의 증가가 특징적으로 나타난다는 것을 알 수 있었다.
실시예 1-2. COVID-19 패혈증 환자의 NET 형성 및 MPO 발현 확인
호중구는 세포외 트랩(neutrophil extracellular traps, NET)이라고 하는 세포외 섬유 및 골수세포형 과산효소(Myeloperoxidase, MPO)라고 하는 효소를 생성하며, 두 인자 모두 염증반응을 유발하는 것으로 알려져 있다. 상술한 바와 같이 COVID-19 패혈증 환자에서 혈중 호중구 수가 증가한 것을 확인하였는 바, 상기 환자들에서 NET 형성 및 MPO 발현 또한 증가하였는지 확인하였다.
실험예 3에 따라 NET 효소-결합면역흡착검사를, 실험예 4에 따라 MPO ELISA를 수행하였으며, 그 결과, 정상인에 비해 패혈증이 동반된 SARS-CoV-2 감염 환자에서 NET 형성 및 MPO 발현이 증가한 것으로 나타났다(도 1c 및 1d). 이와 같은 결과는 COVID-19 환자에서 호중구 수준의 증가 및 이에 따른 NET 형성 및 MPO 발현 증가가 패혈증과 관련이 있음을 시사한다.
실시예 1-3. COVID-19 패혈증 환자의 폐조직 표현형 확인
과도한 NETosis는 과염증 반응(hyperinflammatory response)를 유발하여 장기 손상 및 다발성 장기 부전의 원인이 되는 것으로 알려져 있으며(Nat Med 23, 279-287 (2017); PLoS One 11, e0148142 (2016)), 노인 환자 및 기저 질환이 있는 환자의 대부분은 패혈증이 진행되는 것으로 알려져 있다. 따라서 컴퓨터 단층 촬영(CT) 영상을 이용해 패혈증이 아닌 SARS-CoV-2 환자와 패혈증을 앓는 SARS-CoV-2 환자의 폐조직을 검사하였다. 그 결과, 비정상적인 호중구 수 증가를 보인 SARS-CoV-2 패혈증 환자는 심각한 폐조직 손상을 보여, 패혈증 증상이 심각한 것으로 나타났다(도 1e).
실시예 1-4. COVID-19 패혈증 환자의 폐렴 여부 확인
COVID-19 환자가 패혈증을 앓는 겨우 폐렴 증상도 동반하는지 확인하였다. COVID-19 패혈증 환자의 폐렴 여부는 젖산탈수소효소(lactate dehydrogenase, LDH) 수준을 기반으로 확인하였다. COVID-19 패혈증 환자와 패혈증을 앓지 않는 COVID-19 환자의 LDH 수준을 비교한 결과, COVID-19 패혈증 환자에서 LDH가 유의하게 증가한 것으로 나타났는 바(도 1f), COVID-19로 인해 패혈증을 앓는 환자가 폐렴 증상도 보일 수 있음을 확인하였다.
실시예 2. COVID-19 패혈증 환자의 cfDNA, DNase, Cit-histone H3 수준 확인
실시예 2-1. COVID-19 패혈증 환자의 cfDNA 수준 확인
COVID 감염에 의한 패혈증과 혈액 내 cfDNA 수준의 연관관계를 확인하기 위해 20명의 패혈증 환자를 포함한 80명의 COVID-19 환자로부터 혈액 샘플을 확보하여 실험예 6에 따라 cfDNA의 수준을 측정하였다. 또한, 대조군으로 건강한 지원자(정상 그룹) 20명의 혈액 샘플의 cfDNA 수준도 확인하였다. 그 결과, 정상 그룹의 혈청 내 cfDNA 수준의 중앙값은 0.41 (0.25-0.6) μg/mL인 반면, 60명의 SARS-CoV-2-감염 환자의 cfDNA 수준의 중앙값은 0.85 (0.46-1.42) μg/mL로 증가되어 있었으며, 특히 20명의 COVID-19 패혈증 환자는 cfDNA 수준의 중앙값이 2.83 (2.14-3.39) μg/mL로 나타나 매우 크게 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 2a). 이와 같은 결과는 COVID-19에 의한 패혈증에서 cfDNA가 치료 타겟이 될 수 있다는 것을 암시한다.
실시예 2-2. COVID-19 패혈증 환자의 DNase-1 수준 확인
다음으로, DNA의 인산디에스테르 결합 (phophodiester bond)을 절단하여 DNA를 분해하는 것으로 알려진 DNase-1 수준을 그룹별로 비교하였다. 그 결과, 패혈증을 앓지 않는 COVID-19 환자의 DNase-1 수준 중앙값은 3.11(2.08-6.78) μg/mL로 정상 그룹(2.11(1.59-2.77) μg/mL)에 비해 다소 증가된 것으로 나타났으나, 패혈증을 앓는 COVID-19 환자의 경우 상기 두 그룹에 비해 DNase-1 수준이 유의하게 감소(0.97(0.52-1.44) μg/mL)한 것으로 나타났다(도 2b). 이와 같은 결과는 COVID-19으로 인해 패혈증이 진행될수록, DNA 분해효소인 DNase-1의 혈중 수준이 감소한다는 것을 보여준다.
실시예 2-3. COVID 19 감염 패혈증 환자의 Cit-histone H3 수준 확인
시트르린화 히스톤 H3(Citrullinated hitone H3, Cit-hitone H3)는 호중구의 NET 형성 및 혈중 cfDNA의 바이오마커로 알려져 있는 바, 그룹별로 Cit-histone H3의 수준을 비교하였다. 그 결과, 정상그룹의 Cit-histone H3 수준의 중앙값은 0.046 (0.025-0.067) μg/mL에 불과한 반면, 패혈증을 앓지 않는 COVID-19 환자의 Cit-histone H3 수준은 0.304 (0.033-0.971) μg/mL로 증가하였으며, 특히 패혈증을 앓는 COVID-19 환자의 경우 Cit-histone H3 수준이 17.735 (12.307-22.525) μg/mL로 나타나 정상 그룹 및 비패혈증 COVID-19 환자 그룹에 비해 급격히 증가한 것으로 나타났다(도 2c).
이어서 실험예 5에 따라 그룹간 혈장 내 histone H3 및 Cit-histone H3의 단백질 수준을 비교한 바, 앞서 살펴본 결과와 마찬가지로 정상 그룹 및 비패혈증 COVID-19 환자 그룹에 비해 COVID-19 패혈증 환자 그룹에서 상기 두 단백질의 발현이 현저하게 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 2d). 상술한 결과들은 패혈증이 진행된 중증 COVID-19 환자일수록 Cit-histone H3 수준이 증가한다는 것을, 즉, 호중구의 NET 형성 및 혈중 cfDNA가 증가한다는 것을 보여준다.
실시예 2-4. COVID-19 환자의 예후에 따른 DNase-1, cfDNA, 및 Cit-histone H3 수준 비교
추가 검증을 위해 80명의 COVID-19 환자의 혈중 cfDNA, DNase-1, 및 Cit-histone H3 수준을 환자의 예후(생존자 수: 69명, 사망자 수: 11명)에 따라 비교분석 하였다. 그 결과, 도 2e에 나타낸 바와 같이, 그룹간 혈중 cfDNA, DNase-1, 및 Cit-histone H3 수준의 차이는 환자 예후에 따라 훨씬 두드러지게 나타났다. 혈중 cfDNA 수준 및 Cit-Histone H3 수준은 생존자 그룹에 비해 사망한 COVID-19 환자 그룹에서 현저하게 증가하였으며, 혈중 DNase-1는 사망한 COVID-19 환자 그룹에서 유의하게 감소되어 있었다. 이와 같은 결과는 COVID-19의 중증도가 커질수록, 즉 예후가 좋지 않을수록, cfDNA 및 Cit-histone H3는 증가하고 DNase-1 수준은 감소한다는 것을 증명한다.
실시예 3. COVID-19 패혈증 환자의 혈장에서 외인성 DNase-1 처리에 따른 효과 확인
실시예 3-1. 외인성 DNase-1 처리에 따른 COVID-19 패혈증 환자의 혈중 cfDNA 수준 및 DNase-1 활성 변화
COVID-19 환자에서 NETosis는 증가하고 내인성(endogenous) DNase-1의 양은 감소한 것을 확인하였으므로, 외인성(exogenous) DNase-1의 투여가 COVID-19 환자의 DNase-1 상실을 보완하고 호중구의 NETosis를 억제할 수 있는지 확인하였다. 또한, 혈액 내에서의 DNase-1의 반감기를 증가시키기 위해, DNase-1가 나노입자(nanoparticle)의 표면 위에 고정(immobilization)된 상태인 지속형 DNase-1 (long-acting DNase-1)를 제조하였다(실험예 8 및 도 3a).
DNA 분해에 대한 DNase-1의 효과를 검증하기 위해, 패혈증을 앓는 COVID-19 환자의 혈장에 free DNase-1 또는 long-acting DNase-1을 처리하였다. 그 결과, 두 가지 형태의 DNase-1 모두 혈장 내 cfDNA 수준을 현저하게 감소시키는 것을 확인하였으며, 혈장 DNase-1의 활성(즉, cfDNA 분해 활성 또는 NET 억제 활성 등)을 증가시킨다는 것을 확인하였다(도 3b).
실시예 3-2. 외인성 DNase-1 처리에 따른 COVID-19 패혈증 환자의 NETosis 관련 인자의 변화
이어서, DNase-1 처리에 따른 NET 생성, MPO 활성, 및 NE 활성의 변화를 확인하기 위해 SARS-CoV-2 감염 패혈증 환자의 혈액(whole blood)으로부터 분리한 PBMC를 free DNase-1 또는 long-acting DNase-1과 6시간 동안 배양한 후 상기 마커들의 변화를 측정하였다. 그 결과, free DNase-1 또는 long-acting DNase-1을 처리하였을 때, 대조군에 비해 NET 생성 정도가 확연히 감소한 것을 확인하였으며, MPO 및 NE의 활성도 두드러지게 감소한 것을 확인하였다(도 3c). 즉, 상기 결과는 long-lasting DNase-1이 MPO 및 NE 활성을 억제하여 NETosis를 효과적으로 억제할 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 3-3. 외인성 DNase-1 처리에 따른 NF-κB 및 사이토카인 분비 변화 확인
이어서, DNase-1의 처리가 NF-κB 활성 및 호중구의 사이토카인(IL-1β, IL-6, IFN-γ, 및 TNF-α)의 분비에 영향을 미치는지 확인하였다(실험예 9 내지 11 참조). 그 결과, free DNase-1의 처리에 따라 NF-κB 활성 및 사이토카인 IL-1β, IL-6, IFN-γ, 및 TNF-α의 분비가 대조군에 비해 감소하였으며, long-acting DNase-1를 처리한 경우 감소폭이 더욱 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 3d 및 3e).
상기와 같은 결과는, long-acting DNase-1은 예후가 심각한 COVID-19 환자에서도 사이토카인 방출을 효과적으로 억제할 수 있음을 증명하며, 증상이 심하지 않은 COVID-19 환자에서만 효과가 있는 기존의 항바이러스제와 달리 본 발명에 따른 long-acting DNase-1는 중증 환자에서도 효과적인 치료제로 사용될 수 있음을 시사한다.
실시예 4. 패혈증 마우스 모델에서 long-acting DNase-1 처리에 따른 효과 확인
실시예 3에서 DNase-1 처리가 항-패혈증 활성을 나타내고 호중구의 NETosis가 감소한 것을 확인하였으므로, 실제 환자에서도 DNase-1을 이용한 치료가 효과가 있을지 확인하기 위해 DNase-1의 in vivo 효과를 확인하였다.
맹장 결찰 및 천공(cecal ligation and puncture, CLP) 모델은 Netosis, CRS, 및 다발성 장기 부전(multiple organ failure, MOF) 증후군이 유발될 수 있는 in vivo 모델이다. 상기와 같은 표현형은 SARS-CoV-2-감염에 의한 중증 환자에서도 관찰되기 때문에, COVID-19 환자의 SARS-CoV-2-유도성 패혈증 증상을 나타내기 위해 CLP 모델을 사용하였다.
실시예 4-1. 외인성 DNase-1 처리에 따른 마우스 모델의 생존율 비교
호중구 활성의 감소가 환자 생존율을 높이고 패혈증의 예방 또는 개선을 위한 유효한 표적이 될 것이라는 가정하에, 실험예 13에 따라 CLP-유도 패혈증 마우스 모델을 제작하고 외인성 DNase-1 투여에 의한 효과를 확인하였다. 구체적으로, 마우스에 CLP 처리 후 12시간 및 24시간이 지났을 때 Phosphate-buffered saline (PBS; 대조군), free DNase-1 (100 units), 또는 long-acting DNase-1 (100 units)을 정맥투여 하였다. 도 4a에 나타난 바와 같이, DNase-1이 처리되지 않은 마우스 모델은 모두 CLP 처리 후 78 시간 이내에 사망한 바, CLP가 매우 치명적이라는 것을 보여주었다. 또한 free DNase-1을 처리한 경우 생존 시간은 CLP 처리 후 96 시간으로 다소 증가하였으나, 해당 시간에서 생존율은 0% 였다. 반면, long-acting DNase-1을 처리한 그룹의 경우 CLP 처리 후 96 시간이 되었을 때 50%의 생존율을 보여, 마우스가 회복된 것을 증명하였다. 이와 같은 결과는 외인성 DNase-1을 투여하는 것이 패혈증 진행을 억제할 수 있다는 것을 암시한다.
실시예 4-2. 외인성 DNase-1 처리에 따른 마우스 모델의 복강 내 호중구 수준 비교
이어서 마우스 모델의 복강 내에 존재하는 호중구의 수를 측정하였다. 그 결과, 대조군 또는 free DNase-1 처리 그룹에 비해 long-acting DNase-1을 처리한 그룹에서 복막 호중구 (peritoneal neutrophils)의 수가 절반 가까이 감소한 것으로 나타났다(도 4b).
또한, long-acting DNase-1의 항-패혈증 효과를 더욱 검증하기 위해, DNase-1 처리가 Ly6G+ 호중구의 복막강으로의 침윤을 특이적으로 억제할 수 있는지 확인하였다. 구체적으로는, CLP 처리 후 12시간이 되었을 때 free DNase-1 또는 long-acting DNase-1을 처리하였으며, 2시간 후에 복막액을 확보하고 실험예 14에 따라 호중구의 침윤 정도를 확인하였다. 그 결과, 대조군에서는 Ly6G+ 호중구가 증가하였으나 free DNase-1 또는 long-acting DNase-1을 처리한 그룹에서는 침윤한 Ly6G+ 호중구의 수가 상당히 감소한 것으로 나타났다(도 4c). 이와 같은 결과는 외인성 DNase-1이 CLP-마우스 모델의 염증 반응을 억제하는 효과가 있음을 보여준다.
실시예 4-3. 외인성 DNase-1 처리에 따른 마우스 모델의 폐조직 표현형 변화 확인
또한 실험예 15에 따라 DNase-1 처리에 따른 폐조직의 변화를 확인한 바, 모의 그룹(Sham)에 비해 CLP 유도 모델(Control)에서 심각하게 나타난 폐부종, 출혈, 폐포 붕괴, 염증 세포 침윤 등이 long-acting DNase를 처리한 그룹에서는 확연히 감소한 것을 확인할 수 있었다(도 4d).
실시예 4-4. 외인성 DNase-1 처리에 따른 마우스 모델의 혈장 내 COVID-19 패혈증 마커 변화 확인
이어서, CLP 패혈증 마우스 모델을 사용하여 DNase-1 투여에 따른 혈장 내 DNA 분해의 변화를 확인하였다. 그 결과, COVID-19 패혈증 환자의 혈장과 마찬가지로, long-acting DNase-1의 처리에 따라 DNase-1 활성은 증가한 반면 cfDNA 수준은 현저히 감소하였으며, NET 비율, MPO 활성 및 NE 활성 또한 두드러지게 감소한 것을 확인할 수 있었다(도 4e).
실시예 4-5. 외인성 DNase-1 처리에 따른 조직 손상 마커 변화 확인
다음으로, 패혈증에서 염증 반응 조절에 대한 long-acting DNase-1의 효과를 검증하고자 하였다. 패혈증과 관련된 전신 염증은 신장과 간을 주요 표적으로 하는 다발성 장기 부전을 유발하는 것으로 알려져 있다(JAMA 316, 1555-1564 (2016)). 예상한 바와 같이, 모의 그룹에 비해 CLP 처리 모델에서 간 손상 마커인 아스파트산 아미노기 전달효소(aspartate transaminase, AST) 및 알라닌 전달효소(alanine transferase, ALT)가 증가하였으며, 신장 손상 마커인 크레아티닌(creatinie) 및 혈중 요소 질소(blood urea nitrogen, BUN)가 증가하고, 조직 손상 마커인 젖산탈수소효소(lactate dehydrogenase, LDH) 및 폐렴과 패혈증 마커인 C-반응성 단백질(C-reactive protein, CRP) 수준도 증가했다. 그러나, long-lasting DNase-1을 처리한 경우, 상기 조직 손상 마커들의 혈청 내 수준이 유의하게 감소된 것을 확인한 바(도 4f), long-lasting DNase-1이 조직 손상을 억제할 수 있다는 것을 확인하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.
<110> Research & Business Foundation SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY <120> Biomarkers for diagnosing or predicting prognosis of SARS-CoV-2-induced sepsis <130> MP20-069P1 <150> KR 10-2020-0051741 <151> 2020-04-28 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 5157 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNase-1_DNA sequence <400> 1 acgtgcaggg ctgtccttgg agggccagca cagccccttc caagtgggca agacccaggg 60 gtggctcaaa agatagctgt gccctagccc tggaacctct gaatgttgat ttttgtagca 120 aaaaaggact tgcagatgtg agtaaaggct gttgagataa ggacatcctc cctgctctct 180 gggaggaccc caaatgcagg tgcacagatc ttaagaagaa gaggcagaga ctggggtgat 240 gcagccacaa ctaaggaaag ccaaggattg ctggcagcct gcagaaactg gagggcaagg 300 agcatccccc aaccgcccgg agcctccagg aggcgcaagg tcctactgac tccctgactt 360 cagacgtcca gtctccggaa ttttgagagg atccatttct gttattttaa gcaaccaaac 420 ttgtggtagt ttcaccagtc tcaggaaatg aatacgaatg gaaagtcaaa gattccaaga 480 aatgagtggc ggggtgcggt ggctcacact tgtaatccca gcatttgcgg gaagattgct 540 tgggctcagg acttggagac cttgtgtctg 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125 His Ala Ala Pro Gly Asp Ala Val Ala Glu Ile Asp Ala Leu Tyr Asp 130 135 140 Val Tyr Leu Asp Val Gln Glu Lys Trp Gly Leu Glu Asp Val Met Leu 145 150 155 160 Met Gly Asp Phe Asn Ala Gly Cys Ser Tyr Val Arg Pro Ser Gln Trp 165 170 175 Ser Ser Ile Arg Leu Trp Thr Ser Pro Thr Phe Gln Trp Leu Ile Pro 180 185 190 Asp Ser Ala Asp Thr Thr Ala Thr Pro Thr His Cys Ala Tyr Asp Arg 195 200 205 Ile Val Val Ala Gly Met Leu Leu Arg Gly Ala Val Val Pro Asp Ser 210 215 220 Ala Leu Pro Phe 225 <210> 6 <211> 187 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DNase-1_amino acid sequence (isoform 2) <400> 6 Met His Gln Thr Pro Ile Thr Thr Trp Ser Val Ser His Trp Asp Gly 1 5 10 15 Thr Ala Ile Arg Ser Ala Thr Cys Ser Cys Thr Gly Leu Thr Arg Cys 20 25 30 Leu Arg Trp Thr Ala Thr Thr Thr Met Met Ala Ala Ser Pro Ala Gly 35 40 45 Thr Thr Pro Ser Thr Glu Ser Gln Pro Leu Ser Gly Ser Ser Pro Gly 50 55 60 Ser Gln Asp Val Met Leu Met Gly Asp Phe Asn Ala Gly Cys Ser Tyr 65 70 75 80 Val Arg Pro Ser Gln Trp Ser Ser 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Ala Leu Gln Glu Ala 85 90 95 Cys Glu Ala Tyr Leu Val Gly Leu Phe Glu Asp Thr Asn Leu Cys Ala 100 105 110 Ile His Ala Lys Arg Val Thr Ile Met Pro Lys Asp Ile Gln Leu Ala 115 120 125 Arg Arg Ile Arg Gly Glu Arg Ala 130 135

Claims (18)

  1. 하기 단계를 포함하는, SARS-CoV-2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) 감염에 의한 패혈증 진단 또는 이의 예후 예측을 위한 정보제공방법:
    (a) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 cell-free DNA(cfDNA) 또는 deoxyribonuclease-1(DNase-1)의 수준을 측정하는 단계; 및
    (b) 단계 (a)에서 측정된 cfDNA 수준이 대조군에 비해 증가되어 있는지 여부, 또는 단계 (a)에서 측정된 DNase-1의 수준이 대조군에 비해 감소되어 있는지 여부를 확인하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    하기 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법:
    (c) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 citrullinated histone H3(Cit-histone H3) 수준을 측정하는 단계; 및
    (d) 단계 (c)에서 측정된 Cit-histone H3 수준이 대조군에 비해 증가되어 있는지 여부를 확인하는 단계.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 시료는 혈액, 혈장, 또는 혈청인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 대조군은 정상인 또는 패혈증을 동반하지 않은 SARS-CoV-2 감염 환자로부터 분리된 생물학적 시료인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 피검체는 SARS-CoV-2 감염에 의한 패혈증을 진단받은 적이 없는 피검체인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 정보제공방법은 SARS-CoV-2 감염에 의한 패혈증 진단 또는 이의 예후 예측과 함께 피검체의 폐렴 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 것인, 정보제공방법.
  7. cfDNA 또는 DNase-1 단백질의 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는, SARS-CoV-2 감염에 의한 패혈증 진단 또는 예후 예측용 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 DNase-1 단백질의 수준을 측정하는 제제는 DNase-1의 단백질에 특이적인 항체인 것을 특징으로 하는, 진단 또는 예후 예측용 조성물.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 cfDNA 또는 DNase-1 단백질의 수준은 혈액, 혈장, 또는 혈청 내 cfDNA 또는 DNase-1 단백질의 수준인 것인, 진단 또는 예후 예측용 조성물.
  10. 제7항 내지 제9항의 조성물을 포함하는, SARS-CoV-2 감염에 의한 패혈증 진단 또는 예후 예측용 키트.
  11. 하기 단계를 포함하는, SARS-CoV-2 감염에 의한 패혈증 치료 물질의 스크리닝 방법:
    (a) SARS-CoV-2 감염에 의한 패혈증 환자로부터 분리된 생물학적 시료에 시험물질을 처리하는 단계;
    (b) 상기 시험물질을 처리한 시료와 처리하지 않은 대조군 시료에서 cfDNA 수준 또는 DNase-1 단백질 활성을 측정하는 단계; 및
    (c) 대조군 시료와 비교해 상기 cfDNA 수준을 감소시키거나, 또는 상기 DNase-1 단백질 활성을 증가시킨 시험물질을 SARS-CoV-2 감염에 의한 패혈증 치료 물질로 선별하는 단계.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 시료는 혈액, 혈장, 또는 혈청인 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법.
  13. DNase-1 단백질을 유효성분으로 포함하는, SARS-CoV-2 감염에 의한 패혈증 치료용 약학적 조성물.
  14. DNase-1 단백질을 포함하는 나노입자를 유효성분으로 포함하는, SARS-CoV-2 감염에 의한 패혈증 치료용 약학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 나노입자는 poly(lactic-co-glycolic acid)(PLGA) 나노입자인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 나노입자는 표면이 폴리도파민(polydopamine, PD)으로 코팅되어 있고, 상기 DNase-1 단백질은 폴리도파민을 통해 나노입자의 표면에 고정화된 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  17. 제14항에 있어서,
    상기 나노입자는 poly(ethylene glycol)(PEG)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  18. 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 하기 특징 중 하나 이상을 만족하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물:
    (a) cfDNA 수준을 감소시킴;
    (b) 내인성(endogenous) DNase-1 활성을 증가시킴;
    (c) 골수세포형 과산효소(Myeloperoxidase, MPO)의 활성을 억제함;
    (d) 호중구 엘라스타아제(Neutrophil elastase, NE)의 활성을 억제함;
    (e) 호중구의 세포외 트랩(neutrophil extracellular traps, NET) 형성(NETosis)을 억제함;
    (e) 호중구의 NF-κb의 활성을 억제함;
    (f) 호중구에 의한, IL-1β, IL-6, IFN-γ, 및 TNF-α로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 생성을 감소시킴; 또는
    (g) 호중구의 복강 내 침윤을 억제함.
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