ES2939299T3 - Un biomarcador para diagnosticar una enfermedad vascular y los usos del mismo - Google Patents

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Abstract

Se proporciona una composición para diagnosticar enfermedades vasculares que incluye un agente que mide el nivel de proteína β2 del receptor de interleucina 12 en la sangre, y un kit para diagnosticar enfermedades vasculares que incluye el mismo. Además, se proporciona un método para proporcionar información para diagnosticar enfermedades vasculares, incluyendo el método el paso de medir un nivel de proteína β2 del receptor de interleucina 12 en una muestra de sangre separada de un individuo sospechoso de tener una enfermedad vascular. Además, se proporciona una composición para prevenir o tratar la enfermedad vascular que incluye un inhibidor de la actividad del receptor β2 de la interleucina 12 y un método para seleccionar un agente terapéutico para la enfermedad vascular, incluyendo el método el paso de tratar las células del músculo liso con un agente de prueba para la enfermedad vascular. tratamiento y medir un nivel de expresión del receptor β2 de interleucina 12. De acuerdo con la presente invención, cuando se utiliza el receptor β2 de la interleucina 12 como biomarcador de enfermedad vascular, en particular, infarto de miocardio o angina inestable, la enfermedad vascular, cuyo diagnóstico se ha realizado únicamente mediante angiografía, puede diagnosticarse utilizando sangre de forma rápida. forma económica no invasiva. Por consiguiente, es posible el diagnóstico precoz de la enfermedad vascular, ya que la enfermedad se ha diagnosticado basándose en síntomas subjetivos después de la aparición de síntomas isquémicos con el desarrollo de la enfermedad. La promesa del diagnóstico temprano, la prevención y el tratamiento se hace realidad. se puede diagnosticar utilizando sangre de una manera rápida, no invasiva y económica. Por consiguiente, es posible el diagnóstico precoz de la enfermedad vascular, ya que la enfermedad se ha diagnosticado basándose en síntomas subjetivos después de la aparición de síntomas isquémicos con el desarrollo de la enfermedad. La promesa del diagnóstico temprano, la prevención y el tratamiento se hace realidad. se puede diagnosticar utilizando sangre de una manera rápida, no invasiva y económica. Por consiguiente, es posible el diagnóstico precoz de la enfermedad vascular, ya que la enfermedad se ha diagnosticado basándose en síntomas subjetivos después de la aparición de síntomas isquémicos con el desarrollo de la enfermedad. La promesa del diagnóstico temprano, la prevención y el tratamiento se hace realidad. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Un biomarcador para diagnosticar una enfermedad vascular y los usos del mismo
Campo técnico
La presente invención se refiere a una composición para diagnosticar una enfermedad vascular que incluye un agente que mide un nivel de proteína p2 del receptor de interleucina-12 en la sangre, y un kit para diagnosticar una enfermedad vascular que incluye la misma. Además, la presente invención se refiere a un método para proporcionar información para diagnosticar una enfermedad vascular, incluyendo el método la etapa de medir un nivel de proteína p2 del receptor de interleucina-12 en una muestra de sangre obtenida de un individuo del que se sospecha tiene una enfermedad vascular.
Técnica anterior
La ateroesclerosis es la causa principal de la enfermedad arterial coronaria y de la enfermedad cerebrovascular, ambas enfermedades son responsables en aproximadamente un 50 % de todas las muertes en los países occidentalizados. Las lesiones tempranas de la ateroesclerosis incluyen acumulaciones subendoteliales de macrófagos inflamados con lípidos (células espumosas), que se representan como lesiones de “estría grasa” . Las estrías grasas no son clínicamente dañinas, pero pueden ser las precursoras de lesiones fibrosas y de tipo placa más avanzadas caracterizadas por la acumulación de restos necróticos ricos en lípidos y células de músculo liso (CML).
Durante la progresión de la enfermedad, la pared arterial se engrosa y endurece gradualmente para formar una placa ateroesclerótica, dando lugar al estrechamiento de la luz arterial. Cuando tal engrosamiento de la íntima de la arteria desarrolla además el estrechamiento de la luz arterial y las placas se vuelven frágiles, viene acompañado de angina inestable. Posteriormente, se rompen bruscamente y provocan síntomas isquémicos o un coágulo sanguíneo, y a menudo infarto de miocardio o ataque cardíaco. Sin embargo, dado que el engrosamiento de la íntima debido a la ateroesclerosis progresa durante muchas décadas sin síntomas subjetivos claros, el engrosamiento de la íntima no puede diagnosticarse fácilmente antes de la aparición de los síntomas isquémicos.
Cuando se encuentra una lesión estenótica por engrosamiento de la íntima, se lleva a cabo de forma general la intervención vascular por angioplastia con stents o una angioplastia coronaria percutánea para eliminar el estrechamiento luminal y ensanchar el vaso. Sin embargo, este procedimiento de angioplastia da lugar a una erosión endotelial, y posteriormente, a un engrosamiento de la íntima del vaso sanguíneo debido a la hiperproliferación de las células de músculo liso vasculares, que lleva a la reestenosis. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar un método para un diagnóstico rápido y fácil no invasivo del engrosamiento de la íntima del vaso sanguíneo en el campo relacionado.
Levula A.M. y col., PLoS ONE, vol. 7, n.° 4, artículo n.° e33787, 11 de abril de 2012, páginas 1-10 describe que la expresión de IL-12Rp1 -2 en la placa ateroesclerótica de pacientes con ateriosclerosis aumenta considerablemente y que dicho aumento en la expresión está implicado en la regulación de la vía de quimiocinas de linfocitos T en las placas ateroescleróticas. w O 2013/134786 describe IL12Rp2, PDGFRp, actina muscular lisa y CD9, CD63 y CD81 como antígenos de la superficie de microvesículas, y que pueden utilizarse como biomarcadores para el diagnóstico de diversas enfermedades, incluida una enfermedad cardiovascular.
Hasta ahora se han realizado muchos intentos para identificar los biomarcadores de diagnóstico temprano para ateroesclerosis en muestras obtenidas de seres humanos y modelos animales. Los datos clínicos de un estudio de seguimiento de 3.209 participantes en el Framingham Heart Study durante más de 7 años revelaron varios biomarcadores valiosos [proteína C reactiva, péptido natriurético de tipo B (PNB), renina, albúmina urinaria y homocisteína]. También se han realizado activamente experimentos de proteómica y metabolómica en suero durante muchos años para buscar biomarcadores circulantes que muestren una correlación con la progresión de la enfermedad. Sin embargo, no ha habido biomarcadores clínicamente aplicables, en particular, biomarcadores obtenidos de plasma, debido a los problemas de la variabilidad entre individuos y de inaccesibilidad de tejidos humanos con engrosamiento vascular.
Descripción de la invención
Problema técnico
En este contexto, los presentes inventores adaptaron una estrategia de proteómica diferencial utilizando los vasos carotídeos lesionados con globo de ratas genéticamente congénicas y filtraron las proteínas irrelevantes para la hiperplasia de las células de músculo liso mediante una validación in vitro utilizando células de músculo liso de aorta humana (HASMC). En consecuencia, identificaron proteínas candidatas mediante validación in vitro e in vivo, la mayoría de las cuales son funcionalmente novedosas en relación con la hiperplasia neointimal de CML. Como resultado de ello, descubrieron que la aparición en plasma de la proteína p2 del receptor de interleucina-12 muestra una correlación con la severidad de las manifestaciones clínicas como resultado de la inestabilidad de la placa, y la proteína p2 del receptor de interleucina-12 en la sangre puede utilizarse como biomarcador de una enfermedad vascular, completando de este modo la presente invención.
Solución al problema
Un objeto de la presente invención es utilizar una composición para diagnosticar una enfermedad vascular, incluyendo la composición un agente que mide un nivel de proteína (32 del receptor de interleucina-12 en la sangre como se define en la reivindicación 1.
Otro objeto de la presente invención es utilizar un kit para diagnosticar una enfermedad vascular, incluyendo el kit la composición para diagnosticar una enfermedad vascular como se define en la reivindicación 6.
Otro objeto más de la presente invención es proporcionar un método para proporcionar información para diagnosticar una enfermedad vascular, incluyendo el método la etapa de medir un nivel de proteína p2 del receptor de interleucina-12 en una muestra de sangre obtenida de un individuo con sospecha de tener una enfermedad vascular, como se define en la reivindicación 8.
Efectos ventajosos de la invención
Según la presente invención, cuando la p2 del receptor de interleucina-12 se utiliza como biomarcador de una enfermedad vascular, en particular de infarto de miocardio o angina inestable, la enfermedad vascular, cuyo diagnóstico se ha llevado a cabo únicamente mediante angiografía, puede diagnosticarse utilizando sangre de forma rápida, económica y no invasiva. Por lo tanto, es posible el diagnóstico temprano de una enfermedad vascular, ya que la enfermedad se ha diagnosticado basándose en síntomas subjetivos después de la aparición de síntomas isquémicos con desarrollo de la enfermedad. Se cumple la promesa de un diagnóstico temprano, prevención y tratamiento.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es el resultado de la tinción de tejido neointimal que muestra la cinética de un engrosamiento de la neoíntima durante el tiempo de recuperación en una arteria carótida lesionada con globo;
la Figura 2a ilustra un procedimiento experimental para el análisis de la proteómica en el que se preparó un modelo de lesión por globo de la arteria carótida, y las proteínas se extrajeron de la arteria carótida lesionada, y una posterior electroforesis bidimensional diferencial en gel (2D-DIGE);
la Figura 2b es el resultado de analizar los fraccionamientos subcelulares obtenidos de la arteria carótida lesionada del modelo de lesión por globo de la arteria carótida mediante el uso de marcadores;
la Figura 2c muestra las expresiones diferenciales de las proteínas identificadas en las soluciones de extracción de las arterias carótidas obtenidas durante el tiempo de recuperación después de la lesión, que se evaluaron mediante Western blot utilizando sus anticuerpos específicos;
la Figura 3a muestra imágenes de fluorescencia representativas de electroforesis bidimensional diferencial en gel (2D-DIGE) de proteínas citosólicas (fracciones S-100) que se extrajeron de arterias carótidas lesionadas obtenidas después de la preparación de modelos de lesión por globo de la arteria carótida;
la Figura 3b muestra el resultado de identificar la proteína p2 del receptor de interleucina-12 en los puntos de proteína obtenidos del análisis de la proteómica mediante electroforesis bidimensional diferencial en gel (2D-DIGE) de las proteínas que se extrajeron de arterias carótidas lesionadas obtenidas después de la preparación de modelos de lesión por globo de la arteria carótida, en la que el gráfico muestra una mayor expresión de la proteína p2 del receptor de interleucina-12 cuantificada por análisis de imágenes de fluorescencia, a lo largo del tiempo de recuperación después de la lesión;
la Figura 4 muestra el efecto de la inactivación de IL-12Rp2 en tres actividades de las células CML (proliferación y migración quimiotáctica de las células de músculo liso de aorta humana y adhesión de monocitos a las células de músculo liso);
la Figura 5 muestra la comparación del nivel de expresión de IL-12Rp2 después del suministro de ARNip de IL-12Kp2 a una arteria carótida lesionada con globo (a en la Figura 5), y el resultado de la tinción con hematoxilina y eosina de tejidos para analizar el grosor del tejido neointimal (b en la Figura 5);
la Figura 6a muestra el resultado de una inmunotransferencia para analizar la especificidad antigénica del anticuerpo anti-IL-12Rp2 utilizado en la presente invención utilizando la proteína IL-12Rp2 expresada de forma endógena en la línea celular U937;
la Figura 6b muestra la eliminación de abundantes proteínas plasmáticas que incluyen albúmina e inmunoglobulinas de las muestras de plasma del paciente utilizando un kit de eliminación albúmina/IgG de Pierce para mejorar la detección de proteínas poco abundantes, en la que el filtrado 2 es una muestra utilizada en la Figura 7;
la Figura 7 muestra el resultado del análisis de Western blot de muestras de plasma obtenidas de un grupo normal y de pacientes con angina estable o infarto agudo de miocardio utilizando la proteína IL-12Kp2 (a en la Figura 7), y el resultado del análisis de Western blot de muestras de plasma obtenidas de un grupo normal y de pacientes con angina estable o infarto agudo de miocardio utilizando la proteína IL-12Rp2 (b en la Figura 7), y c en la Figura 7 muestra el resultado del análisis de Western blot de muestras de plasma obtenidas de un grupo normal y de pacientes con angina inestable utilizando la proteína IL-12Rp2, en los que se aseguran cantidades iguales de carga de proteínas mediante tinción de Pon S, y la punta de flecha indica la posición de la proteína IL-12Kp2;
la Figura 8a es un gráfico que muestra la cuantificación y el análisis estadístico de las bandas de proteína IL-12Rp2 de la Figura 7, indicando las bandas los niveles de expresión de la proteína IL-12Rp2 en muestras de plasma obtenidas de un grupo normal y de pacientes con angina estable (AE), angina inestable (AI) o infarto agudo de miocardio (IAM);
la Figura 8b muestra el resultado de la tinción de IL-12Rp2 en los vasos carotídeos de pacientes humanos (n=3) con engrosamiento patológico de la íntima;
la Figura 9a muestra el resultado del análisis de Western blot de IL-12Rp2 y CD9 y CD81 como marcadores exosómicos en fracciones de vesículas extracelulares aisladas por ultracentrifugación de las muestras de plasma obtenidas de pacientes con infarto agudo de miocardio y angina inestable;
la Figura 9b muestra el resultado del análisis de Western blot de I IL-12Rp2, CD81 como marcador exosómico, y PDGFRp como marcador muscular liso en fracciones de vesículas extracelulares aisladas por precipitación basada en polímeros de las muestras de plasma obtenidas de pacientes con infarto agudo de miocardio y angina inestable; y
la Figura 9c muestra el resultado del análisis de Western blot de IL-12Rp2 en inmunoprecipitados obtenidos por inmunoprecipitación de PDGFRp en las muestras de plasma obtenidas de pacientes con infarto agudo de miocardio y angina inestable.
Mejor modo para llevar a cabo la invención
En un aspecto para lograr los objetos anteriores, la presente invención se refiere al uso de una composición para diagnosticar una enfermedad vascular, incluyendo la composición un agente que mide un nivel de proteína p2 del receptor de interleucina-12 en la sangre como se define en la reivindicación 1.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “enfermedad vascular” se refiere a una enfermedad que implica daños en los tejidos de los vasos sanguíneos y síntomas presentes de un engrosamiento de su neoíntima, sin limitación. Como para la enfermedad vascular de la presente invención, la progresión del engrosamiento de la neoíntima puede causar estenosis y disminución de la elasticidad en la pared del vaso, dando lugar a una hemorragia por ruptura vascular. En la presente invención, la enfermedad vascular puede ser un engrosamiento de la íntima, un angina inestable, un infarto de miocardio (tal como un infarto agudo de miocardio), ateroesclerosis o reestenosis intraprotésica, aunque no se limita a las mismas.
En la presente invención, se confirma que la p2 del receptor de interleucina-12 en una vesícula extracelular derivada de células de músculo liso en la sangre es un biomarcador de daño y engrosamiento vascular, y puede utilizarse para el diagnóstico de un grupo de enfermedades con riesgo de ataque cardíaco, tal como una angina inestable, un infarto de miocardio (infarto agudo de miocardio), etc. Por lo tanto, puede medirse el nivel de proteína p2 del receptor de interleucina-12 en una vesícula extracelular derivada de células de músculo liso en la sangre, es decir, la composición para predecir o diagnosticar una enfermedad vascular de la presente invención puede utilizarse para lograr el diagnóstico temprano del riesgo de ataque cardíaco.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “ p2 del receptor de interleucina-12 (IL-12Rp2)” se refiere a una subunidad p2 de una proteína del receptor que se une al ligando de interleucina-12. Se sabe que la proteína correspondiente participa en la vía JAK2/STAT4, y funciona para promover la proliferación de linfocitos T y linfocitos NK, en particular, una diferenciación de linfocitos T a linfocitos Th1. La información sobre este gen o proteína puede estar disponible en la base de datos conocida y estar ejemplificada en el NCBI GenBank, entre otras. En la presente invención, la proteína p2 del receptor de interleucina-12 puede ser una proteína p2 del receptor de interleucina-12 humana de longitud completa y tiene una secuencia de aminoácidos de SEC ID N.°: 1.
La composición para diagnosticar una enfermedad vascular de la presente invención puede incluir un anticuerpo o aptámero específico para la proteína p2 del receptor de interleucina-12. En la presente invención, el anticuerpo específico para la proteína p2 del receptor de interleucina-12 puede ser, especialmente, Clone E-20, n.° de catálogo sc-18648 de Santa Cruz Biotech. y/o el n.° de producto HPA024168 de Atlas antibodies.
En una realización específica de la presente invención, se utilizaron Clone E-20, n.° de catálogo sc-18648 de Santa Cruz Biotech. y/o el n.° de producto HPA024168 de Atlas antibodies como el anticuerpo específico para la proteína p2 del receptor de interleucina-12, midiendo de este modo el nivel de proteína p2 del receptor de interleucina-12.
La composición para diagnosticar una enfermedad vascular de la presente invención se utiliza para medir el nivel en sangre de la proteína p2 del receptor de interleucina-12 obtenido de células de músculo liso
La proteína p2 del receptor de interleucina-12 corresponde a una subunidad de la proteína del receptor que se une al ligando de interleucina-12. En particular, la proteína p2 del receptor de interleucina-12 es una proteína transmembrana que se encuentra de forma general en la membrana celular, y no se ha informado de la presencia de la proteína correspondiente en la sangre. En la presente invención, los presentes inventores demostraron por primera vez que el nivel de proteína p2 del receptor de interleucina-12 puede medirse en una vesícula extracelular procedente de células de músculo liso en la sangre, y la proteína p2 del receptor de interleucina-12 muestra una correlación con una enfermedad vascular, por ejemplo, angina inestable, infarto de miocardio, etc.
En la presente invención, la proteína p2 del receptor de interleucina-12 encontrada en una vesícula extracelular obtenida de células de músculo liso en la sangre procedentes de células endoteliales vasculares, concretamente, células de músculo liso (CML) que son dañadas por un engrosamiento vascular. En otras palabras, la proteína p2 del receptor de interleucina-12 se sobreexpresa en células endoteliales vasculares dañadas por engrosamiento vascular, y la proteína de membrana, la proteína p2 del receptor de interleucina-12, puede estar presente en vesículas extracelulares (exosomas, etc.) procedentes del tejido dañado. Las vesículas extracelulares pueden estar presentes en la sangre y, por lo tanto, puede medirse el nivel en sangre de la proteína p2 del receptor de interleucina-12.
La composición para diagnosticar una enfermedad vascular de la presente invención incluye un agente que mide el nivel de proteína p2 del receptor de interleucina-12 que muestra un nivel diferencial en una vesícula extracelular procedente de células de músculo liso en la muestra de sangre de un individuo que tiene una enfermedad vascular, por ejemplo, infarto de miocardio o angina inestable, en comparación con una vesícula extracelular procedente de células de músculo liso en la muestra de sangre de un grupo de control normal y, por lo tanto, la composición puede utilizarse para diagnosticar una enfermedad vascular del individuo. Es decir, cuando el nivel de proteína (32 del receptor de interleucina-12 en una vesícula extracelular procedente de células de músculo liso en la sangre del individuo, que se mide mediante la composición de la presente invención, es mayor que el nivel de proteína p2 del receptor de interleucina-12 en una vesícula extracelular procedente de células de músculo liso en la sangre del grupo de control normal, puede diagnosticarse que el individuo correspondiente tiene una enfermedad vascular.
Los niveles de proteína p2 del receptor de interleucina-12 se midieron en muestras de sangre de un grupo de control normal, en un grupo de pacientes con angina estable con bajo riesgo de engrosamiento de la íntima o ataque cardíaco, en un grupo de pacientes con angina inestable y en un grupo de pacientes con infarto de miocardio. Como resultado de ello, se observaron niveles notablemente altos de proteína IL-12Rp2 en las muestras de grupos de pacientes, en comparación con la muestra del grupo normal (Figuras 7 y 8a).
En la presente invención, la composición para medir el nivel de proteína p2 del receptor de interleucina-12 obtenida de células de músculo liso puede incluir i) un anticuerpo o aptámero específico para la proteína p2 del receptor de interleucina-12 como agente que mida el nivel de proteína p2 del receptor de interleucina-12; y ii) un anticuerpo o aptámero que se una específicamente a un marcador muscular liso. La composición de la presente invención puede incluir además iii) un anticuerpo o aptámero que se una específicamente a un marcador de vesículas extracelulares, además de i) y ii).
Específicamente, el marcador muscular liso o marcador de células endoteliales vasculares puede ser un receptor del factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGFR), aunque no limitado al mismo.
Según la presente invención, para medir el nivel en sangre de la proteína (32 del receptor de interleucina-12 procedente de células de músculo liso, primero se separan de la sangre las vesículas extracelulares que contienen el marcador de células de músculo liso utilizando el anticuerpo o aptámero que se une específicamente a los marcadores correspondientes, y a continuación puede medirse el nivel de proteína p2 del receptor de interleucina-12 en las vesículas extracelulares.
En una realización específica de la presente invención, un anticuerpo (clone P-20, n.° de catálogo sc-339 de Santa Cruz Biotech) que se une específicamente a un marcador muscular liso, PDGFR, se utilizó para separar exosomas y luego se midió el nivel de proteína p2 del receptor de interleucina-12 en los exosomas separados (Figura 9c).
En la presente invención, medir el nivel en sangre de la proteína p2 del receptor de interleucina-12 es medir el nivel de proteína p2 del receptor de interleucina-12 en vesículas extracelulares presentes en la sangre, y la vesícula extracelular puede ser, especialmente, un exosoma, aunque no está limitado al mismo.
Para ello, la composición de la presente invención puede incluir un anticuerpo o aptámero específico para un marcador de vesículas extracelulares, en particular, un marcador exosómico, y el marcador exosómico puede ser CD81, CD9 o CD63. El anticuerpo específico para el marcador exosómico puede ser un anticuerpo (n.° de catálogo EXOAB-CD63A-1 de System Biosciences Inc.) que se una específicamente a CD63, un anticuerpo (n.° de catálogo EXOAB-CD9A-1 de System Biosciences Inc.) que se una específicamente a CD9 y/o un anticuerpo (n.° de catálogo EXOAB-CD81A-1 de System Biosciences Inc.) que se una específicamente a CD81. Con respecto a los objetos de la presente invención, la vesícula extracelular, el exosoma, etc., en los que se mide el nivel de proteína p2 del receptor de interleucina-12, pueden obtenerse de vasos sanguíneos, en particular, endotelio dañado. En una realización específica de la presente invención, como el anticuerpo específico para el marcador exosómico se utilizó un anticuerpo (n.° de catálogo EXOAB-CD63A-1 de System Biosciences Inc.) que se une específicamente a CD63, un anticuerpo (n.° de catálogo EXOAB-CD9A-1 de System Biosciences Inc.) que se une específicamente a CD9 y/o un anticuerpo (n.° de catálogo EXOAB-CD81A-1 de System Biosciences Inc.) que se une específicamente a CD81.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “ marcador” se refiere a una sustancia capaz de diagnosticar una enfermedad vascular distinguiendo a un individuo que tiene una enfermedad vascular, en particular infarto de miocardio o angina inestable, de un individuo normal o de un individuo con bajo riesgo de ataque cardíaco, y el marcador incluye todas las moléculas biológicas orgánicas, cuyas cantidades aumentan o disminuyen en un individuo que tiene una enfermedad vascular de la presente invención, tales como polipéptidos, proteínas o ácidos nucleicos, lípidos, glucolípidos, glucoproteínas, azúcares, etc. En la presente invención, el marcador puede ser específicamente una proteína que se incrementa en un individuo que tenga una enfermedad vascular de la presente invención, pero sin limitarse a la misma.
Como se utiliza en la presente memoria, “ medir el nivel de proteína” es un proceso para evaluar la presencia y el nivel de expresión de la proteína marcadora en una muestra biológica (por ejemplo, sangre entera, plasma, suero, una fracción de la misma, etc.) para diagnosticar la enfermedad vascular de la presente invención. En particular, un anticuerpo o aptámero que se une específicamente a la proteína puede utilizarse para examinar la cantidad de la proteína. La muestra biológica puede ser una muestra biológica obtenida de un individuo.
Los métodos de análisis de las mismas pueden incluir, aunque no de forma limitativa, Western blotting, ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), radioinmunodifusión, inmunodifusión doble de Ouchterlony, inmunoelectroforesis de cohete, tinción inmunohistoquímica, ensayo de inmunoprecipitación, ensayo de fijación del complemento, clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS), un chip de aptámero, una micromatriz, un chip de proteína, etc. Con los métodos de análisis, la cantidad de complejo antígeno-anticuerpo formado en un paciente con sospecha de tener una enfermedad vascular puede compararse con la de un grupo de control normal, diagnosticándose de este modo si la enfermedad vascular aparece realmente en el paciente con sospecha de tener una enfermedad vascular.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “anticuerpo” se refiere a una molécula de proteína específica que indica una región antigénica. Con respecto a los objetos de la presente invención, el anticuerpo puede ser un anticuerpo que se una específicamente a una proteína marcadora, e incluye todos los anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos recombinantes y fragmentos de unión al antígeno del mismo, siempre que conserven una función de unión al antígeno. Además, el anticuerpo de la presente invención incluye anticuerpos especializados, tales como anticuerpos humanizados, etc.
La producción del anticuerpo específico para la proteína p2 del receptor de interleucina-12, que es una proteína marcadora para una enfermedad vascular de la presente invención, en particular infarto de miocardio o angina inestable, puede llevarse a cabo fácilmente utilizando técnicas muy conocidas en la técnica. Los anticuerpos policlonales pueden producirse mediante un método muy conocido en la técnica que incluye inyectar el antígeno de proteína p2 del receptor de interleucina-12 (longitud completa o un fragmento) en un animal y recoger muestras de sangre del animal para obtener suero que contenga anticuerpos. Dichos anticuerpos policlonales pueden prepararse a partir de un determinado hospedador animal, tal como cabras, conejos, ovejas, monos, caballos, cerdos, vacas y perros. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse mediante un método muy conocido en la técnica, tal como un método de obtención de hibridomas (véase el método de obtención de hibridomas) (Kohler y Milstein (1976) European Journal of Immunology 6:511 -519) o una técnica de biblioteca de anticuerpos de bacteriófagos (Clackson y col., Nature, 352:624-628, 1991; Marks y col., J. Mol. Biol.,222:58, 1 -597, 1991). Los anticuerpos preparados por los métodos anteriores pueden separarse y purificarse utilizando electroforesis en gel, diálisis, desalinización, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad o similares.
Además, los anticuerpos de la presente invención incluyen no solo formas completas que tienen dos cadenas ligeras de longitud completa y dos cadenas pesadas de longitud completa, sino también fragmentos funcionales de moléculas de anticuerpo. Los fragmentos funcionales de las moléculas de anticuerpos se refieren a fragmentos que retienen al menos una función de unión al antígeno, e incluyen Fab, F(ab'), F(ab” )2 , Fv y similares.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “aptámero” se refiere a un oligonucleótido monocatenario de aproximadamente 20-60 nucleótidos y una molécula de ácido nucleico con actividad de unión a una molécula diana específica. Los aptámeros tienen diversas estructuras terciarias según sus secuencias y alta afinidad a una sustancia particular, como en una reacción antígeno-anticuerpo. Al unirse a una molécula diana específica, el aptámero puede detectar la molécula diana o inhibir su actividad. El aptámero de la presente invención puede ser a Rn , ADN, ácido nucleico modificado o una mezcla de los mismos, y puede estar en forma de cadena lineal o con forma angular. Preferiblemente, el aptámero puede unirse a la p2 del receptor de interleucina-12 para detectar la p2 del receptor de interleucina-12 o para inhibir su actividad. Los expertos en la técnica pueden preparar el aptámero a partir de la secuencia de p2 del receptor de interleucina-12 utilizando un método conocido.
Por otra parte, como se utiliza en la presente memoria, el término “complejo antígeno-anticuerpo (o aptámero)” se refiere a un producto de unión de la proteína p2 del receptor de interleucina-12 y un anticuerpo o aptámero específico para la misma. La cantidad de complejo antígeno-anticuerpo formado puede determinarse cuantitativamente midiendo el tamaño de la señal de un marcador de detección.
Este marcador de detección puede seleccionarse del grupo que consiste en enzimas, sustancias fluorescentes, ligandos, sustancias luminiscentes, micropartículas, moléculas de redox e isótopos radiactivos, pero no se limita a las mismas. Ejemplos de enzimas disponibles como marcadores de detección incluyen, aunque no de forma limitativa, pglucuronidasa, p-D-glucosidasa, p-D-galactosidasa, ureasa, peroxidasa o fosfatasa alcalina, acetilcolinesterasa, glucosa-oxidasa, hexoquinasa y GDPasa, RNasa, glucosa-oxidasa y luciferasa, fosfofructocinasa, fosfoenolpiruvato carboxilasa, aspartato aminotransferasa, fosfoenolpiruvato descarboxilasa, p-lactamasa, etc. Ejemplos de sustancias fluorescentes incluyen, aunque no de forma limitativa, ITCF, RITC, fluoresceína, isotiocianato, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftalaldehído, fluorescamina, etc. Ejemplos de los ligandos incluyen, aunque no de forma limitativa, derivados de biotina, etc. Ejemplos de sustancias luminiscentes incluyen, aunque no de forma limitativa, ésteres de acridinio, luciferina, luciferasa, etc. Ejemplos de micropartículas incluyen, aunque no de forma limitativa, oro coloidal, látex coloreado, etc. Ejemplos de moléculas de reducción y oxidación incluyen, aunque no de forma limitativa, ferroceno, complejos de rutenio, viológeno, quinona, iones de Ti, iones de Cs, diimida, 1,4-benzoquinona, hidroquinona, K4W(CN)8, [Os(bpy)3]2+, [RU(bpy)3]2+ y [MO(CN)8]4, etc. Ejemplos de isótopos radiactivos incluyen, aunque no de forma limitativa, 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 9oY 125I, 131I, 186Re, etc.
Preferiblemente, los niveles de expresión de proteínas se miden mediante ELISA. El ELISA incluye una variedad de métodos ELISA, incluido el ELISA directo utilizando un anticuerpo marcado o aptámero que reconoce un antígeno inmovilizado en un soporte sólido, el ELISA indirecto utilizando un anticuerpo marcado que reconoce un anticuerpo de captura o complejos formadores de aptámeros con un antígeno inmovilizado en un soporte sólido, el ELISA de tipo sándwich directo utilizando otro anticuerpo marcado que reconoce un antígeno en un complejo antígeno o aptámeroanticuerpo inmovilizado en un soporte sólido, y el ELISA de tipo sándwich indirecto en el que se hace reaccionar otro anticuerpo marcado que reconoce un antígeno en un complejo antígeno-anticuerpo o aptámero inmovilizado en un soporte sólido, y a continuación se utiliza un anticuerpo secundario marcado que reconoce al otro anticuerpo marcado.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “diagnóstico” se refiere a la evaluación de la presencia o propiedades de estados patológicos. Con respecto a los objetos de la presente invención, el diagnóstico es determinar la incidencia de una enfermedad vascular, en particular infarto de miocardio o angina inestable, progresión de la enfermedad y riesgo de ataque cardíaco causado por la misma.
En otro aspecto, la presente invención se refiere al uso de un kit para diagnosticar una enfermedad vascular, incluyendo el kit la composición para diagnosticar una enfermedad vascular de la presente invención como se define en la reivindicación 6.
El kit de la presente invención puede utilizarse para determinar el nivel de proteína p2 del receptor de interleucina-12 como marcador para una enfermedad vascular, en particular infarto de miocardio o angina inestable, detectando de este modo el marcador. El kit para detectar el marcador de la presente invención puede seleccionarse del grupo que consiste en una micromatriz, un kit con genochip de aptámero, un kit de ELISA (inmunoensayo por adsorción ligado a enzimas), un kit de transferencia, un kit de inmunoprecipitación, un kit de ensayo de inmunofluorescencia, un kit con chip de proteína, y una combinación de los mismos, que sean capaces de detectar la proteína p2 del receptor de interleucina-12.
El kit para detectar el marcador de la presente invención puede incluir un aptámero o anticuerpo para detectar la proteína p2 del receptor de interleucina-12 y determinar el nivel de proteína p2 del receptor de interleucina-12.
En otra realización específica, el kit para determinar el nivel de proteína p2 del receptor de interleucina-12 en la presente invención puede incluir un sustrato para la detección inmunológica del aptámero o anticuerpo, un tampón adecuado, un anticuerpo o aptámero marcado con un marcador de detección y/o un sustrato de desarrollo de color. Como sustrato, puede utilizarse una membrana de nitrocelulosa, una placa de 96 pocillos hecha de resina de polivinilo, una placa de 96 pocillos hecha de resina de poliestireno y un portaobjetos de vidrio. El marcador de detección es el mismo que el descrito anteriormente. Como agente de sustrato para el desarrollo de color puede utilizarse, dependiendo del marcador de detección, cualquier sustrato, tal como ABTS [ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico)], OPD (o-fenilenediamina) o TMB (tetrametilbencidina), conocidos para los expertos en la técnica.
En otro aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para proporcionar información para diagnosticar una enfermedad vascular, incluyendo el método la etapa de medir un nivel de proteína p2 del receptor de interleucina-12 en una muestra de sangre obtenida de un individuo con sospecha de tener una enfermedad vascular, como se define en la reivindicación 8.
Concretamente, la presente invención proporciona un método para proporcionar información para diagnosticar una enfermedad vascular, incluyendo el método las etapas de (a) medir un nivel de proteína (32 del receptor de interleucina-12 en una vesícula extracelular procedente de células de músculo liso en la muestra de sangre obtenida de un individuo con sospecha de tener una enfermedad vascular; y (b) comparar el nivel de proteína (32 del receptor de interleucina-12 medida en la etapa (a) con el de una muestra de un grupo de control normal.
En la presente invención, la enfermedad vascular, diagnóstico, p2 del receptor de interleucina-12, etc. son los mismos que los descritos anteriormente.
La muestra de sangre se refiere a una muestra de sangre (por ejemplo sangre completa, plasma, suero, una fracción de los mismos, etc.) recogida para diagnosticar una enfermedad vascular en un individuo con sospecha de tener una enfermedad vascular, en particular, puede ser una muestra de plasma o una fracción de vesículas extracelulares, aunque no se limita a las mismas. La vesícula extracelular puede ser un exosoma.
El método para proporcionar información para diagnosticar una enfermedad vascular de la presente invención puede caracterizarse porque cuando el nivel de proteína p2 del receptor de interleucina-12 medida en una vesícula extracelular derivada de células de músculo liso en la muestra de sangre obtenida de un individuo con sospecha de tener una enfermedad vascular es mayor que el de la muestra del grupo de control normal, se diagnostica que el individuo tiene una enfermedad vascular.
En el método para proporcionar información para diagnosticar una enfermedad vascular de la presente invención, medir el nivel de proteína p2 del receptor de interleucina-12 en la muestra de sangre obtenida de un individuo con sospecha de tener una enfermedad vascular es medir el nivel de proteína (32 del receptor de interleucina-12 procedente de células de músculo liso presentes en la muestra de sangre, y la medición se realiza separando o extrayendo vesículas extracelulares (por ejemplo exosomas) procedentes de células de músculo liso en la muestra de sangre, y medir a continuación el nivel de proteína p2 del receptor de interleucina-12 presente en las mismas.
Para medir el nivel de proteína p2 del receptor de interleucina-12 procedente de células de músculo liso en la sangre, las vesículas extracelulares que contienen el marcador de células de músculo liso se separan primero de la sangre utilizando un anticuerpo o aptámero que se une específicamente al marcador correspondiente, y a continuación se mide el nivel de proteína p2 del receptor de interleucina-12 en las vesículas extracelulares correspondientes.
En una realización específica de la presente invención, se utilizó un anticuerpo que se une específicamente a un marcador muscular liso, PDGFRp, y el nivel de proteína p2 del receptor de interleucina-12 se midió en exosomas que se separan utilizando el anticuerpo (Figura 9c).
En la presente memoria se describe en detalle, pero sin formar parte de la invención, una composición para prevenir o tratar enfermedades vasculares, incluyendo la composición un inhibidor de la actividad de la p2 del receptor de interleucina-12.
La enfermedad vascular, la p2 del receptor de interleucina-12, etc., son los mismos que los descritos anteriormente.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “ inhibidor de la actividad de la p2 del receptor de interleucina-12” se refiere a cualquier agente capaz de reducir la expresión o actividad de la p2 del receptor de interleucina-12 y, específicamente, puede incluir todos los agentes capaces de reducir el nivel de expresión o la actividad de la p2 del receptor de interleucina-12 al reducir la expresión de la p2 del receptor de interleucina-12 a un nivel transcripcional o interrumpir su actividad.
El inhibidor de la actividad de la p2 del receptor de interleucina-12 puede ser un compuesto, un ácido nucleico, un péptido, un virus o un vector que contenga el ácido nucleico, que tiene como objetivo que la p2 del receptor de interleucina-12 inhiba la expresión o actividad de la p2 del receptor de interleucina-12, sin limitación en la forma. El inhibidor de la actividad de la p2 del receptor de interleucina-12 puede ser preferiblemente, aunque no de forma limitativa, un oligonucleótido que inhiba la expresión del ARNm de la p2 del receptor de interleucina-12, un anticuerpo que inhiba la actividad de la proteína p2 del receptor de interleucina-12, o un fragmento de unión a su antígeno. En particular, el oligonucleótido que inhibe la expresión del ARNm de la p2 del receptor de la interleucina-12 puede ser un oligonucleótido antisentido, un aptámero o ARNip específico para la p2 del receptor de interleucina-12. Es decir, el inhibidor de la actividad de la p2 del receptor de interleucina-12 de la presente invención puede seleccionarse del grupo que consiste en un anticuerpo de proteína p2 del receptor anti-interleucina-12, y un oligonucleótido antisentido, ARNip, ARNhc y micro-ARN específico para el gen de la p2 del receptor de interleucina-12. El ARNip específico para el gen de la p2 del receptor de interleucina-12 puede prepararse mediante un método conocido en la técnica con referencia a la secuencia base de la p2 del receptor de interleucina-12.
Se trataron 4 tipos de ARNip específicos para el gen de la p2 del receptor de interleucina-12 para modelos de lesión por globo de la arteria carótida, con el resultado de la reducción significativa del engrosamiento de la neoíntima.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “oligonucleótido antisentido” se refiere a ADN, ARN o su derivado que contiene una secuencia de ácido nucleico complementaria a la secuencia de un ARNm particular, y el oligonucleótido antisentido actúa para inhibir la traducción del ARNm a una proteína uniéndose a la secuencia complementaria en el ARNm. La secuencia del oligonucleótido antisentido significa una secuencia del ADN o ARN que sea complementaria, y se una, al ARNm de la p2 del receptor de interleucina-12 y sea capaz de inhibir la traducción, translocación al citoplasma, maduración u otras actividades esenciales para funciones biológicas generales. El oligonucleótido antisentido puede tener de 6 a 100 bases de longitud, preferiblemente de 8 a 60 bases de longitud, y más preferiblemente de 10 a 40 bases de longitud. El oligonucleótido antisentido puede sintetizarse in vitro y administrarse alorganismo o puede sintetizarse in vivo. Un ejemplo de síntesis del oligonucleótido antisentido in vitro es utilizar ARN polimerasa I. Un ejemplo de síntesis del ARN antisentido in vivo es utilizar un vector que tenga el origen del sitio de clonación múltiple (SMC) en dirección opuesta para que el ARN antisentido se transcriba. Preferiblemente, el ARN antisentido puede tener un codón de terminación de la traducción dentro de su secuencia para impedir que se traduzca a una secuencia peptídica.
El diseño del oligonucleótido antisentido se realiza fácilmente según un método conocido en la técnica con referencia a la secuencia base de la p2 del receptor de interleucina-12.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “ARNip” se refiere a una molécula de nucleótidos capaz de actuar como mediador en la interferencia por el ARN o el silenciamiento génico. Dado que el ARNip puede suprimir la expresión del gen diana, proporciona una forma eficaz de atenuación génica o terapia genética. El ARNip es un fragmento de ARN pequeño con un tamaño de 21-25 nucleótidos que se genera cortando ARN bicatenario con Dicer. El ARNip se une específicamente al ARNm que tenga una secuencia complementaria al mismo para suprimir su expresión. El ARNip actúa específicamente sobre la p2 del receptor de interleucina-12 para escindir la molécula (32 del receptor de interleucina-12, dando lugar a la inducción de la interferencia por ARN (iARN). En consecuencia, puede suprimirse la (32 del receptor de interleucina-12. El ARNip puede sintetizarse de forma química o enzimática. El método de preparación de ARNip no está especialmente limitado, y puede utilizarse cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, el método puede incluir síntesis química directa del ARNip, síntesis del ARNip mediante transcripción in vitro, escisión enzimática del ARN largo bicatenario sintetizado mediante transcripción in vitro, expresión mediante la transferencia de un plásmido que expresa ARNhc o vector viral a células, y expresión mediante la transferencia del casete de expresión de ARNip obtenido de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) a las células, entre otros.
Para examinar los efectos se utilizaron los productos con n.° de referencia M_007932-00, que suprime específicamente la p2 del receptor de interleucina-12 humana, y con n.° de referencia M_095069-01, que suprime específicamente la p2 del receptor de interleucina-12 de rata, (fabricados por GE Dharmacon).
Como se utiliza en la presente memoria, el término “tratamiento” se refiere a una intervención clínica en un intento de alterar el curso natural del individuo o la célula que se está tratando, y puede realizarse para la profilaxis o durante el curso de la patología clínica. Efectos terapéuticos deseables incluyen prevenir la aparición o recurrencia de la enfermedad, alivio de los síntomas y disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, prevenir la metástasis, reducir la velocidad de progresión de la enfermedad, mejora o paliación del estado patológico y remisión o mejora del pronóstico. El tratamiento significa preferiblemente que se han modificado favorablemente todas las acciones en las que los síntomas de una enfermedad vascular, en particular engrosamiento vascular, infarto de miocardio o angina inestable mediante la administración de la composición que incluye el inhibidor de p2 del receptor de interleucina-12. Además, la “ prevención” significa todas las acciones en las que la aparición de una enfermedad vascular, en particular se restringe o retrasa el engrosamiento vascular, infarto de miocardio o angina inestable, administrando la composición que incluye el inhibidor de (32 del receptor de interleucina-12 según la presente invención.
La composición farmacéutica puede incluir además vehículos, excipientes o diluyentes apropiados, generalmente utilizados en la preparación de una composición farmacéutica. La composición que incluye el vehículo farmacéuticamente aceptable puede tener diversas formulaciones para administración oral o parenteral. La formulación de la composición puede implicar el uso de diluyentes o excipientes generales tales como cargas, espesantes, aglutinantes, agentes humectantes, desintegrantes, tensioactivos, etc. Las formulaciones sólidas para administración oral pueden incluir comprimidos, pastillas, polvos, gránulos, cápsulas, etc. Las formulaciones sólidas pueden prepararse mezclando uno o más compuestos con al menos un excipiente, por ejemplo almidón, carbonato de calcio, sacarosa, lactosa, gelatina, etc. Además de tales excipientes simples, también pueden utilizarse lubricantes tales como estearato de magnesio o talco. Las formulaciones líquidas para administración oral pueden incluir suspensiones, soluciones para uso interno, emulsiones, jarabes, etc. Además de diluyentes generales tales como agua y parafina líquida, también pueden utilizarse distintos excipientes, por ejemplo agentes humectantes, sabores, fragancias, conservantes, etc. Las formulaciones para administración parenteral pueden incluir soluciones acuosas estériles, disolventes no acuosos, suspensiones, emulsiones, preparaciones liofilizadas o supositorios. Las soluciones no acuosas y las suspensiones pueden incluir propilenglicol, polietilenglicol, aceite vegetal tal como aceite de oliva, éster inyectable tal como oleato de etilo, etc. La base para supositorios puede incluir witepsol, macrogol, tween 61, manteca de cacao, manteca de laurina, glicerogelatina, etc.
Además, la composición farmacéutica puede tener, aunque no de forma limitativa, cualquier formulación seleccionada del grupo que consiste en un comprimido, pastilla, polvo, gránulo, cápsula, suspensión, solución para uso interno, emulsión, jarabe, solución acuosa estéril, disolvente no acuoso, suspensión, emulsión, preparación liofilizada y un supositorio.
En la presente memoria se describe además, pero sin que forme parte de la invención, un método para tratar una enfermedad vascular, incluyendo el método la etapa de administrar a un individuo la composición farmacéutica que incluye el inhibidor de p2 del receptor de interleucina-12 como ingrediente activo.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “ individuo” significa todos los animales, incluidos seres humanos, que tienen la posibilidad de tener una enfermedad vascular, en particular engrosamiento vascular, infarto de miocardio o angina inestable, o que ya han tenido la enfermedad. La enfermedad vascular, en particular engrosamiento vascular, infarto de miocardio o angina inestable, puede aliviarse o tratarse mediante la administración al individuo de la composición farmacéutica. El alivio significa todas las acciones en las que una enfermedad vascular, en particular engrosamiento vascular, infarto de miocardio o angina inestable, ha cambiado para mejor o se ha modificado favorablemente mediante la administración de la composición.
La composición farmacéutica puede administrarse en una cantidad farmacéuticamente eficaz.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “administración” se refiere a la introducción de la composición farmacéutica en un sujeto por una vía adecuada. Siempre que permita que la composición llegue a un tejido de destino, puede utilizarse cualquier vía oral o parenteral.
La composición farmacéutica puede administrarse adecuadamente a un individuo según un método, una vía de administración y una dosis de administración utilizados generalmente en la técnica, dependiendo del propósito o la necesidad. La vía de administración puede ilustrarse mediante administración oral, parenteral, subcutánea, intraperitoneal, intrapulmonar, tópica e intranasal. La administración parenteral puede incluir la administración tópica (utilizando un stent), intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. Además, una dosis de administración y frecuencia adecuadas pueden seleccionarse según un método conocido en la técnica, y la dosis y la frecuencia de administración de la composición farmacéutica administrada prácticamente pueden determinarse adecuadamente mediante diversos factores tales como el tipo de síntomas a tratar, la ruta de administración, el género, las afecciones de salud, la dieta, la edad de un individuo y el peso corporal, y la severidad de la enfermedad.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “cantidad farmacéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad suficiente para inhibir o aliviar el aumento de la permeabilidad vascular en una relación razonable de beneficio/riesgo aplicable a cualquier uso médico. El nivel de dosificación eficaz puede determinarse dependiendo del tipo de individuo, severidad, edad, género, actividad del fármaco, sensibilidad al fármaco, tiempo de administración, ruta de administración y velocidad de eliminación, duración del tratamiento, fármacos utilizados simultáneamente y otros factores conocidos en el campo médico. La composición puede administrarse sola o en combinación con otros agentes terapéuticos, y puede administrarse de forma secuencial o simultánea con agentes terapéuticos convencionales. La composición puede administrarse en una forma de dosificación única o múltiple. Es importante administrar la composición en la cantidad mínima que pueda mostrar el efecto máximo sin causar efectos secundarios, a la vista de todos los factores descritos anteriormente, y los expertos en la técnica pueden determinarla fácilmente.
En la presente memoria se describe en detalle, pero sin formar parte de la invención, un método para seleccionar un agente terapéutico para una enfermedad vascular, incluyendo el método las etapas de tratar células de músculo liso que expresan la p2 del receptor de interleucina-12 con un agente de prueba para el tratamiento de la enfermedad vascular; y medir un nivel de expresión de la p2 del receptor de interleucina-12.
En detalle, según el método de selección, cuando el nivel de expresión de la p2 del receptor de interleucina-12 se reduce por el tratamiento del agente de prueba para el tratamiento de la enfermedad vascular, el agente de prueba puede determinarse como un agente terapéutico para la enfermedad vascular.
El “ agente de prueba” incluye cualquier sustancia, molécula, elemento, compuesto, entidad o una combinación de los mismos. El agente de prueba incluye, aunque no de forma limitativa, p. ej., una proteína, un polipéptido, una molécula orgánica pequeña, un polisacárido, un polinucleótido y similares. Puede ser un producto natural, un compuesto sintético, o un compuesto químico, o una combinación de dos o más sustancias. A menos que se especifique lo contrario, los términos “agente” , “sustancia” y “compuesto” pueden utilizarse indistintamente.
Agentes de prueba que pueden seleccionarse o identificarse incluyen polipéptidos, miméticos de giro beta, polisacáridos, fosfolípidos, hormonas, prostaglandinas, esteroides, compuestos aromáticos, compuestos heterocíclicos, benzodiacepinas, glicinas oligoméricas N-sustituidas, oligocarbamatos, sacáridos, ácidos grasos, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estructurales o combinaciones de los mismos. El agente de prueba puede obtenerse a partir de una amplia variedad de fuentes que incluyen colecciones de compuestos sintéticos o naturales.
Modo de la invención
A continuación, en la memoria, la presente invención se describirá con más detalle con referencia a los ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos son con fines ilustrativos únicamente y la invención no pretende estar limitada por estos ejemplos.
Ejemplo 1: Preparación del modelo de lesión inducida por globo de la arteria carótida de ratas
Los estudios en animales se realizaron de conformidad con las directrices del Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales (CICUA) de la Ewha Womans University y se ajustaron a la norma de la “Guide for Care and Use of Laboratory Animals” publicado por US National Institutes of Health (The National Academes Press, 8a edición, 2011).
Se utilizaron ratas Sprague-Dawley macho de diez semanas de edad para un modelo de lesión inducida por globo de la arteria carótida de ratas, y se preparó el modelo de lesión inducida por globo de la arteria carótida de ratas como se ha descrito anteriormente (DH Kang, y col., Circulation 2013;128:págs. 834-844). Primero, las ratas se anestesiaron mediante la inhalación de gas isoflurano (N2O:O2/70 %:30 %).
Para los análisis proteómicos, se dejó a las ratas recuperarse en las jaulas durante distintos tiempos (18 horas, 3 días, 5 días y 7 días) después de una operación quirúrgica. El tamaño de cada grupo experimental fue de 8 ratas y se utilizó la operación simulada para el control del punto de tiempo cero.
Para los análisis histológicos e inmunológicos, se dejó a las ratas recuperarse durante 10 días. Los tamaños de grupo en cada experimento se describen en las leyendas de las figuras. Todos los experimentos con animales se repitieron tres veces.
Ejemplo 2: Administración intramural con catéter de ARNip en la arteria carótida
Para examinar los cambios biológicos moleculares tras la administración de ARNip a las arterias carótidas lesionadas del modelo animal lesionado en la arteria carótida preparado en el Ejemplo 1, se llevó a cabo una administración intramural con catéter de ARNip.
En detalle, los grupos SMART de ARNip específicos de rata (GE Healthcare Dharmacon, n.° de catálogo M_095069-01,200 nM) se premezclaron con el reactivo siPORTTM NeoFXTM siguiendo las instrucciones del fabricante (Ambion). Inmediatamente después de la lesión por globo, las arterias carótida primitivas se lavaron con Opti-MEM y la premezcla de transfección (200 pl) se administró a través del catéter. El vaso se incubó durante 15 minutos para permitir la transfección eficiente y luego se ligó. Se usó un ARNip de control conjugado con tinte fluorescente denominado siGLO-Red (Dharmacon) para confirmar la transfección intramural de ARNip.
Ejemplo 3: Análisis histológico
Para el análisis histológico, las ratas se anestesiaron mediante la inhalación de gas isoflurano (N2O:O2/70 %:30 %), como se describe en el Ejemplo 1, y las arterias carótidas primitivas se cortaron después de la fijación por perfusión transcardíaca con solución salina heparinizada que contenía formaldehído al 3,7 %. Las arterias carótidas escindidas se incluyeron en parafina y se seccionaron mediante micrótomo giratorio (Leica RM2255). Las dos secciones de tejido en serie (4 pm de espesor) se obtuvieron del área media de las arterias carótidas primitivas y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E). Se midieron las áreas del lumen, de la lámina elástica interna y de la lámina elástica externa utilizando NIH Image v 1.62. Las áreas íntima y medial se determinaron mediante la sustracción del área luminal y el área elástica externa del área elástica interna. Los valores de dos secciones en serie por rata se promediaron para su análisis.
Ejemplo 4: Análisis del espécimen de sangre humana
Se recogieron muestras de sangre de controles sanos normales y los pacientes con enfermedad de la arteria coronaria confirmada angiográficamente, conforme a lo aprobado por el Comité de Revisión Institucional del Centro Médico de la Universidad de Mujeres Ewa (Seúl, Corea).
Entre los pacientes con enfermedad de arteria coronaria, aquellos que tenían síntomas isquémicos se clasificaron como angina estable, angina inestable e infarto agudo de miocardio según criterios clínicos. Todos los voluntarios participaron en este estudio después de dar su consentimiento informado.
Las muestras de sangre entera recogidas se centrifugaron y las muestras de plasma se clarificaron adicionalmente utilizando un kit de eliminación de albúmina/IgG Pierce® según el protocolo del fabricante.
Ejemplo 5: Análisis estadístico
Los datos se analizaron con la prueba de la t de Student para comparaciones entre dos grupos o ANOVA unidireccional con una prueba post-hoc de Tukey “ ligeramente significativa” para múltiples grupos (SPSS 12.0K para Windows, SPSS, Chicago, IL, EE. UU.). Un valor de P < 0,05 se consideró estadísticamente significativo. Los datos que utilizan muestras de sangre se analizaron con dos pruebas no paramétricas: la prueba de suma de rangos de Kruskal-Wallis y la prueba de suma de rangos de Wilcoxon.
Ejemplo Experimental 1: Análisis del cambio proteómico en vasos carotídeos de rata por una lesión física
Una lesión inducida por globo de la arteria carótida en las ratas implica la activación inducida por trombosis de la hiperplasia de CML (célula muscular lisa) después de la erosión endotelial, que induce un engrosamiento típico de la neoíntima y, por lo tanto, se asemeja a la lesión física de los vasos arteriales utilizando un catéter de embolectomía con globo. Este modelo in vivo es suficiente para estudios histológicos y bioquímicos relacionados con la hiperplasia de CML.
Primero se examinó la cinética del engrosamiento neointimal en las arterias carótidas lesionadas por globo. Como se ha indicado anteriormente, la lesión por globo indujo un aumento gradual del grosor de la neoíntima en el lado del lumen de la lesión producida (Figura 1). Basándose en esta cinética, se eligieron los cinco puntos temporales en serie (control simulado y 18 horas, 3 días, 5 días y 7 días después de la lesión) para el análisis proteómico mediante electroforesis en gel diferencial bidimensional (2D-DIGE) (Figura 2a).
Para obtener una cantidad suficiente de proteínas para el análisis DIGE, se realizó la extracción de proteínas de un total de 8 fragmentos carotídeos lesionados recogidos en cada punto de tiempo y se realizó el fraccionamiento subcelular para la separación (Figura 2b). Las fracciones de proteína se tiñeron con fluorescencia Cy3/Cy5, seguido de electroforesis en gel diferencial bidimensional, y se analizó la expresión de más de 2.100 manchas de proteína. Al representar gráficamente la expresión de proteínas en cada muestra lesionada frente al estándar interno (marcado con Cy2), se encontró que aproximadamente 140 manchas de proteína mostraron el cambio de expresión dependiente del tiempo. Entre las 140 proteínas, 44 proteínas se identificaron con éxito mediante espectrometría de masas. La expresión diferencial de las proteínas identificadas se confirmó mediante inmunotransferencia con anticuerpos específicos (anticuerpo específico de IL- 12Rp2; Santa Cruz Biotech. Clon E-20, n.° de catálogo sc-18648/Atlas antibodies. N.° de producto HPA024168), respaldando así que los análisis proteómicos eran cuantitativos y exactos (Figura 2c).
Ejemplo Experimental 2 : Ensayos in vitro e in vivo para validar la función de la p2 del receptor de interleucina-12
Poniendo el foco en el cambio de la p2 del receptor de interleucina-12 entre 44 proteínas identificadas en el Ejemplo Experimental 1, su función celular se validó en células de músculo liso aórticas humanas (HASMC).
En detalle, la expresión de IL-12Rp2 (p2 del receptor de interleucina-12) se inactivó en células de músculo liso aórticas humanas mediante tratamiento con una mezcla de cuatro IL-12Rp2 ARN interferentes pequeños específicos (ARNip) (GE Healthcare Dharmacon, n.° de catálogo M_007932-00). Dado que el factor de crecimiento procedente de plaquetas (PDGF) y TNF-a son los principales factores producidos por plaquetas/macrófagos en las lesiones producidas por globo, la proliferación y la migración quimiotáctica de las células de músculo liso aórticas fueron inducidas por PDGF-BB y la adhesión de monocitos a las células de músculo liso fue inducida por el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a).
Como resultado de ello, la inactivación del receptor de interleucina-12 redujo significativamente tres tipos de actividades celulares (Figura 4).
Además, cuando se llevó a cabo la transfección mediada por catéter de ARNip de IL-12Rp2 (receptor de interleucina-12) específico de rata a las arterias carótidas lesionadas por globo, como se describe en el Ejemplo 2, la inactivación de IL-12Rp2 se estableció con éxito (a en la Figura 5), y se redujo notablemente el engrosamiento de la neoíntima, en comparación con un ARNip de control (b en la Figura 5), lo que indica que IL-12Rp2 se expresa en las células de músculo liso vasculares y que está implicada en la hiperplasia de las células de músculo liso.
Ejemplo Experimental 3: IL-12Rp2 como posible biomarcador del engrosamiento vascular
Debido a que las células que crecen rápidamente o dañadas liberan las proteínas celulares o microARN en forma de exosomas, los presentes inventores determinaron que la proteína IL-12Rp2 con alta expresión puede aparecer en la sangre de pacientes con enfermedad de la arteria coronaria, especialmente pacientes con síntomas inestables tales como infarto agudo de miocardio o angina inestable.
Para ello, se utilizaron anticuerpos (Santa Cruz Biotech. Clon E-20, n.° de catálogo sc-18648; Atlas antibodies. N.° de producto HPA024168) que reconocían específicamente la proteína IL-12Rp2 expresada endógenamente en las líneas celulares (Figura 6a). Para mejorar la detección de proteínas de baja abundancia, se eliminaron las proteínas plasmáticas abundantes, que incluyen albúmina e inmunoglobulinas, de las muestras de plasma del paciente (Figura 6b).
Se realizó un análisis con Western blot de las muestras de plasma obtenidas de pacientes sometidos a angiografía coronaria con síntomas de angina, y se comparó con las muestras normales. Como resultado de ello, se observó un nivel de expresión significativamente mayor de la proteína IL-12Rp2 en las muestras de pacientes que en la muestra normal (Figura 7).
Como se muestra en la Figura 8a, el análisis cuantitativo y estadístico indicó que el nivel plasmático de IL-12-Rp2 estaba muy correlacionado con la severidad de la enfermedad en los pacientes humanos (P=3,448 x 10-6 entre 4 grupos).
Para apoyar que la IL-12p2 plasmática está asociada al estrechamiento vascular, la expresión de IL-12Rp2 se examinó mediante tinción tisular en los vasos carotídeos de pacientes humanos (n=3) con engrosamiento patológico de la íntima. Como resultado de ello, la expresión de IL-12pR2 fue significativamente mayor en las lesiones de la íntima engrosada, en comparación con la de la pared del vaso arterial normal (Figura 8b).
Dado que el tamaño molecular de la IL-12Rp2 detectada en el plasma correspondía a la forma de longitud completa, se supuso que la IL-12Rp2 podría liberarse en forma de exosomas, no por degradación proteolítica. Para confirmarlo, los presentes inventores aislaron las vesículas extracelulares de las muestras de plasma por ultracentrifugación y precipitación con polímeros. De hecho, la IL-12Rp2 estaba presente en los precipitados junto con marcadores exosómicos CD9 y CD81 (Figura 9a y Figura 9b). Con respecto a los marcadores exosómicos, se usó el anticuerpo con n.° de catálogo EXOAB-CD63A-1 de System Biosciences Inc. como un anticuerpo que se une específicamente a CD63, se usó el anticuerpo con n.° de catálogo EXOAB-CD9A-1 de System Biosciences Inc. como un anticuerpo que se une específicamente a CD9, y se usó el anticuerpo con n.° de catálogo EXOAB-CD81A-1 de System Biosciences Inc. como un anticuerpo que se une específicamente a CD81. Además, también se detectó PDGFRp como marcador de células de músculo liso en la fracción exosómica, lo que indica la presencia de exosomas derivados de células de músculo liso en las muestras de plasma del paciente.
Por último, para examinar si IL-12Rp2 y PDGFRp se localizan en los mismos exosomas, PDGFRp se inmunoprecipitó del plasma del paciente utilizando un anticuerpo (clon P-20. N° de catálogo sc-339 de Santa Cruz Biotech.) que se une específicamente a PDGFRp, seguido de la detección de IL-12Rp2. Como resultado de ello, como se muestra en la Figura 9c, se detectó IL-12Rp2 en los inmunoprecipitados de PDGFRp, confirmando la colocalización de ambas proteínas en exosomas derivados de células de músculo liso.
Tomados en conjunto, se confirmó que la expresión de IL-12Rp2 se induce en los vasos aórticos que se engrosan, y la IL-12Rp2 se libera en la sangre de los pacientes debido a la inestabilidad de las placas. Por lo tanto, se confirmó que IL-12Rp2 se utilizó como marcador para medir la severidad de la enfermedad en términos de las enfermedades vasculares en vesículas extracelulares derivadas de células de músculo liso
Basándose en la descripción anterior, los expertos en la técnica entenderán que la realización anterior no es limitativa, sino ilustrativa en todos los aspectos. El ámbito de la invención está definido por las reivindicaciones adjuntas y no por la descripción que las precede y, por lo tanto, todos los cambios y modificaciones dentro de los límites de las reivindicaciones, o equivalentes de tales límites, se entienden incluidos en las reivindicaciones.

Claims (9)

  1. REIVINDICACIONES
    i. Uso de una composición para diagnosticar una enfermedad vascular en una vesícula extracelular procedente de células de músculo liso recogidas o aisladas utilizando un marcador de células de músculo liso de una muestra de sangre,
    en donde la enfermedad vascular es aterosclerosis, reestenosis intraprotésica, infarto de miocardio o angina inestable,
    comprendiendo la composición un agente que mide un nivel de proteína p2 del receptor de interleucina-12,
    en donde el agente comprende un anticuerpo o un aptámero específico para la proteína p2 del receptor de interleucina-12.
  2. 2. El uso de la reivindicación 1, en donde la composición para diagnosticar una enfermedad vascular comprende además un anticuerpo o aptámero que se une específicamente a un anticuerpo o aptámero que se une específicamente al marcador de músculo liso que es un receptor de factor de crecimiento procedente de plaquetas-p (PDGFRp) o una actina alfa de células de músculo liso.
  3. 3. El uso de la reivindicación 1, en donde la composición comprende además un anticuerpo o un aptámero específico para un marcador exosómico CD81, CD9 o CD63, en donde la vesícula extracelular es un exosoma.
  4. 4. El uso de la reivindicación 1, en donde la proteína p2 del receptor de interleucina-12 es una proteína p2 del receptor de interleucina-12 de longitud completa.
  5. 5. El uso de la reivindicación 1, en donde la composición se utiliza para el diagnóstico temprano de un grupo de enfermedades con riesgo de ataque cardíaco.
  6. 6. Uso de un kit para diagnosticar enfermedades vasculares en una vesícula extracelular derivada de células de músculo liso recogidas o aisladas utilizando un marcador de células de músculo liso de una muestra de sangre,
    en donde la enfermedad vascular es aterosclerosis, reestenosis intraprotésica, infarto de miocardio o angina inestable,
    comprendiendo el kit la composición como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 -5.
  7. 7. El uso de la reivindicación 6, en donde el kit se selecciona del grupo que consiste en una micromatriz, un kit con chip de aptámero, un kit ELISA (ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas), un kit de transferencia, un kit de inmunoprecipitación, un kit de ensayo de inmunofluorescencia, un kit con chip de proteína y una combinación de los mismos.
  8. 8. Un método in vitro para diagnosticar enfermedades vasculares, comprendiendo el método las etapas de: (a) medir un nivel de proteína p2 del receptor de interleucina-12 en una vesícula extracelular procedente de células de músculo liso recogidas o aisladas usando un marcador de células de músculo liso de una muestra de sangre obtenida de un individuo con sospecha de tener una enfermedad vascular; y (b) comparar el nivel de proteína p2 del receptor de interleucina-12 medida en la etapa (a) con la de una muestra de un grupo de control normal, en donde la enfermedad vascular es aterosclerosis, reestenosis intraprotésica, infarto de miocardio o angina inestable.
  9. 9. El método in vitro de la reivindicación 8, en donde cuando el nivel de proteína p2 del receptor de interleucina-12 medida en la muestra de sangre obtenida de un individuo con sospecha de tener una enfermedad vascular es mayor que la de la muestra del grupo de control normal, el individuo es diagnosticado con una enfermedad vascular.
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