WO2016186173A1 - 劇症肝不全の診断方法、及び予防又は治療剤 - Google Patents

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WO2016186173A1 PCT/JP2016/064903 JP2016064903W WO2016186173A1 WO 2016186173 A1 WO2016186173 A1 WO 2016186173A1 JP 2016064903 W JP2016064903 W JP 2016064903W WO 2016186173 A1 WO2016186173 A1 WO 2016186173A1
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cathepsin
fulminant
antibody
liver failure
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小林　健一郎
群生 笠原
温子 中澤
信敬 清河
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国立研究開発法人国立成育医療研究センター
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Definitions

  • the present invention relates to a method and a diagnostic agent for fulminant liver failure using a biomarker for fulminant liver failure; a prophylactic or therapeutic agent for fulminant liver failure; It relates to methods.
  • Childhood fulminant hepatic failure unlike adults, is rarely associated with hepatitis virus, and there are still many unclear points about its pathology. Although multidisciplinary treatment with blood purification therapy and liver transplantation is being actively addressed for this disease, the survival rate in infants is still low at 54%. This is because the pathological mechanism of pediatric fulminant liver failure remains unclear, the severity classification based on objective indicators has not been established, and pathological-specific treatment intervention has been insufficient. Can be mentioned.
  • Non-Patent Documents 1 to 3 There are already reports of functional analysis of inflammatory chemokines and cytokines such as CXCL6, CXCL8, and TNF- ⁇ in animal models of alcoholic liver disease, HCV cirrhosis, and liver failure in adults. No opinion has been obtained (Non-Patent Documents 1 to 3).
  • the object of the present invention is to provide a technique for diagnosing the severity of fulminant liver failure based on objective indicators. Another object of the present invention is to provide a preventive or therapeutic agent for fulminant liver failure based on a new mechanism of action.
  • CXCL8 has different physiological activity on hepatocytes for each isotype. That, CXCL8 77 is to induce cell apoptosis, CXCL8 72 (72 amino-acids ) is a growth factor. 2) cathepsin L cleaves 5 amino acid residues of the CXCL8 77 N-terminal, converts the isotype CXCL8 72.
  • the present inventors made further studies based on the above findings and completed the present invention. That is, the present invention relates to the following.
  • Method for testing fulminant liver failure including the following steps: (1) in a biological sample isolated from a subject, CXCL8 77 and possible to measure each protein expression level of cathepsin L; and (2) the expression level measured in (1) and, possibility of onset of fulminant liver failure And / or correlate with severity. [2] Correlation of (2), each expression amount measured in (1), CXCL8 77 expression level is relatively high, and cathepsin L expression level, if relatively low, fulminant The method according to [1], comprising comparing with a criterion that the possibility of developing liver failure is high.
  • the correlation in (2) includes comparing the CXCL8 77 expression level measured in (1) with a criterion that the higher the CXCL8 77 expression level, the higher the severity of fulminant liver failure. [1] or [2]. [4] The method according to any one of [1] to [3], wherein the expression level of CXCL8 77 is measured by an immunological assay. [5] immunoassay comprises some or all of the 5 N-terminal amino acids of CXCL8 77 in epitopes is performed using an antibody that specifically binds to CXCL8 77, [4] The method according . [6] The method according to any one of [1] to [5], wherein the biological sample is liver tissue.
  • Kit for diagnosis of fulminant liver failure including the following substances: (1) CXCL8 77 with an antibody that specifically binds, and (2) cathepsin L to an antibody that specifically binds, or cathepsin L substrate.
  • an antibody that specifically binds to CXCL8 77 comprises a part or all of the 5 N-terminal amino acids of CXCL8 77 within epitope, [7] the diagnostic agent according.
  • a prophylactic or therapeutic agent for fulminant hepatic failure comprising cathepsin L or an expression vector thereof.
  • a screening method for a candidate substance for a prophylactic or therapeutic agent for fulminant liver failure comprising the following steps: (1) Evaluating whether the test substance promotes the expression of cathepsin L, and (2) The test substance that promotes the expression of cathepsin L as a candidate substance for the prevention or treatment of fulminant liver failure. To choose as. [11] Combinations including (1) and (2) below for use in the diagnosis of fulminant liver failure: (1) CXCL8 77 with an antibody that specifically binds, and (2) cathepsin L to an antibody that specifically binds, or cathepsin L substrate.
  • [12] Use of a combination comprising (1) and (2) below for the manufacture of a diagnostic agent for fulminant liver failure: (1) CXCL8 77 with an antibody that specifically binds, and (2) cathepsin L to an antibody that specifically binds, or cathepsin L substrate.
  • a method for preventing or treating fulminant hepatic failure in a subject human comprising administering an effective amount of cathepsin L or an expression vector thereof to the subject human.
  • Casceptin L or an expression vector thereof for use in the prevention or treatment of fulminant liver failure.
  • fulminant liver failure can be diagnosed based on an objective index. Even in chronic liver failure, the concentration of CXCL8 77 in liver tissue is higher than that in healthy individuals, but in fulminant liver failure, the concentration of CXCL8 77 in liver tissue is even higher than in chronic liver failure. On the other hand, in chronic liver failure, the concentration of Kaceptin L in the liver is higher than that in healthy subjects, but in fulminant liver failure, the concentration of Kaceptin L in the liver is rather lower than that in healthy subjects. Based on such criteria, patients with fulminant liver failure can be distinguished from healthy individuals and chronic liver failure.
  • the higher the severity of fulminant liver failure since high CXCL8 77 concentration in liver tissue, based on these criteria, it is possible to diagnose the severity of fulminant hepatic failure. Since the present invention enables early diagnosis of fulminant liver failure, it is determined that the subject has a high possibility of developing fulminant liver failure or the severity of fulminant liver failure is high. In this case, preparation of liver transplantation such as emergency transportation of the subject to the liver transplantation facility and securing of donor for liver transplantation can be started immediately. Moreover, the prognosis of fulminant liver failure can be greatly improved by promptly performing liver transplantation on the subject. Further, the present invention can be expected to be used not only for acute liver failure but also for acute severity of chronic liver failure, and for diagnosis of the severity of graft failure after liver transplantation.
  • the present invention supplemented with cathepsin L in patients with fulminant hepatic failure, to facilitate the conversion of CXCL8 72 of CXCL8 77, prevention or treatment technique fulminant hepatic failure based on a new mechanism is provided that
  • the Cathepsin L supplementation for hepatopathy cytokines that is a pathogen of (CXCL8 77) can be converted to liver regeneration factor (CXCL8 72), an innovative therapy in fulminant hepatic failure.
  • the protease activity of cathepsin L is specific to the amino acid sequence, which is also advantageous in the development of molecular targeted therapeutics.
  • CXCL8 77 specific detection assay system (1) Western blotting, (2) ELISA, (3) immunohistochemistry. (3) shows a normal (A, B), biliary atresia (C, D), and fulminant hepatic failure (E, F) Expression of CXCL8 77 in liver. Clv, central vein; PV, portal vein; A, artery. Increased CXCL8 77 concentration and decreased Casceptin L concentration in liver tissue with fulminant liver failure.
  • the left and middle graph shows healthy liver, CXCL8 77 concentration in liver tissue in chronic liver failure and fulminant hepatic failure (left) and cathepsin L concentration (right).
  • Right graph shows fulminant hepatic failure (hyperacute, subacute, acute) and a distribution of the CXCL8 77 concentration and cathepsin L concentration in liver tissue of chronic liver failure.
  • CXCL8 77, CXCL8 72, and CXCL8 77 hepatocytes proliferation of products treated with cathepsin L (1) and the effect on apoptosis (2).
  • the present invention provides a method for examining fulminant liver failure comprising the following steps: (1) in a biological sample isolated from a subject, CXCL8 77 and possible to measure each protein expression level of cathepsin L; and (2) content measured in (1) and, possibility of onset of fulminant liver failure And / or correlate with severity.
  • Hyperacute type Onset of encephalopathy within 7 days after the appearance of jaundice.
  • Acute type Encephalopathy appears 8 to 28 days after the appearance of jaundice.
  • Subacute Encephalopathy appears after 4 weeks of onset.
  • the acute degree of fulminant hepatic failure (that is, the speed of progression of the disease) increases in the order of hyperacute type> acute type> subacute type.
  • the severity of fulminant hepatic failure increases as the degree of acuteness increases and the need for liver transplantation increases. In this sense, the terms “acuteness” and “severity” are used interchangeably herein.
  • the subject in the method of the present invention is a human.
  • humans suspected of suffering from fulminant liver failure and / or humans suffering from fulminant liver failure can be subjects.
  • Humans suspected of suffering from fulminant hepatic failure include, specifically, humans with symptoms of hepatic failure or hepatitis, hepatitis virus infected patients, patients with acute exacerbations during the course of chronic liver failure, suddenly Examples include humans who have developed symptoms of fulminant liver failure.
  • liver tissue examples include, but are not limited to, liver tissue, bile, peritoneal fluid, blood, serum, plasma, bone marrow, and the like.
  • liver tissue is used.
  • Liver tissue can be easily isolated from a subject by a known method such as biopsy.
  • step (1) in a biological sample isolated from a subject, measuring each protein expression levels of CXCL8 77 and cathepsin L (step (1)).
  • CXCL8 77 is one of the known isotypes of chemokine CXCL8 (also referred to as IL-8) and consists of 77 amino acids. Representative amino acid sequences of human CXCL8 77, shown in SEQ ID NO: 1. Another isotype of CXCL8 is CXCL8 72 consisting of 72 amino acids. Representative amino acid sequences of human CXCL8 72, shown in SEQ ID NO: 2. CXCL8 77 is in that has 5 amino acids (AVLPR, SEQ ID NO: 3) which is not present in the CXCL8 72 additional sequence consisting of the N-terminus, differs from the CXCL8 72.
  • Casceptin L is a known cysteine protease.
  • a typical amino acid sequence of human caseceptin L is shown in SEQ ID NO: 5, and a typical cDNA sequence of human caseceptin L is shown in SEQ ID NO: 4, respectively.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 is a preproprotein of human cathepsin L, and is cleaved from the signal sequence consisting of the first to 17 amino acids, from preprocaceptin L to procaceptin L (18th to 333 amino acids in SEQ ID NO: 5) By conversion and further autocatalytic processing (intramolecular cleavage including cleavage of the pro region), the heavy chain (114-288 amino acids in SEQ ID NO: 5) and light chain (292-333 in SEQ ID NO: 5) from procaceptin L Converted into mature cathepsin L.
  • the method for measuring the expression level of each protein of CXCL8 77 and caseceptin L is not particularly limited.
  • an antibody that specifically binds to each marker protein an antibody that specifically binds to CXCL8 77 , specifically binds to caseceptin L
  • the like for example, MALDI-TOF MS, etc.
  • endopeptidases such as trypsin and mass spectrometry, and the like, but are not limited thereto.
  • the amount of antibody-antigen complex corresponding to the amount of antigen in a test sample is detected by chemical or physical means, and this is prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. By comparing with a standard curve, the amount of antigen in the test sample is calculated.
  • the immunological technique include a sandwich method, a competition method, an immunometric method, a nephometry method, a Western blotting method, an agglutination method, and the like.
  • the sandwich method is a method that uses two types of antibodies that specifically bind to the antigen to be measured.
  • the sample solution is reacted with one antibody immobilized on a solid phase such as a plate or bead, After binding the antigen in it to the antibody on the solid phase, the other antibody labeled with enzyme, biotin, radioisotope, fluorescent substance, etc. is reacted to further bind the antigen bound to the antibody on the solid phase.
  • a labeled antibody is bound, the binding amount of the labeled antibody is measured using a labeling substance, and the antigen is quantified from the binding amount.
  • an antigen solution with a concentration of 5 to 10 points is prepared, and when this solution is used as a sample solution, the binding amount to the labeled antibody is measured, and the antigen concentration and the binding amount of the label are plotted.
  • the antigen in the sample solution can be quantified.
  • the antigen in the test sample and the labeled antigen are reacted competitively with the antibody, and then the unreacted labeled antigen (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody are separated.
  • B / F separation measure the amount of either B or F, and quantify the amount of antigen in the test sample.
  • a soluble antibody is used as an antibody
  • B / F separation is performed using polyethylene glycol
  • a solid-phased antibody is used as the first antibody
  • the first antibody is soluble and the second antibody is a solid phase method using a solid phase antibody.
  • the antigen of the test sample and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction with a certain amount of labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated, or the antigen in the test sample is separated from the antigen. After reacting with an excess amount of labeled antibody and then adding a solid phased antigen to bind unreacted labeled antibody to the solid phase, the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the amount of label in any phase is measured to quantify the amount of antigen in the test sample.
  • the amount of insoluble precipitate produced as a result of antigen-antibody reaction in gel or solution is measured.
  • laser nephrometry using laser scattering is preferably used.
  • proteins and peptides contained in a sample are separated by SDS-polyacrylamide gel, and then the proteins and peptides are blotted from the gel onto polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane, nitrocellulose membrane, etc.
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • the antibody is detected using a labeling substance to detect an antigen on the membrane.
  • particles such as latex with immobilized antibodies are reacted with a sample solution, and the aggregation of particles caused by binding of antibodies on the particles to antigens in the sample is detected or quantified by measuring absorbance. It is a method to do.
  • K D values for binding affinity for the antigen Ag antibody of 1 ⁇ 10 -7 M or less (preferably, 1 ⁇ 10 ⁇ 8 M or less, 1 ⁇ 10 ⁇ 9 M or less, 1 ⁇ 10 ⁇ 10 M or less, 1 ⁇ 10 ⁇ 11 M or less).
  • K D values for binding affinity for the antigen Ag antibody 1 ⁇ 10 -5 M or more (preferably Means 1 ⁇ 10 ⁇ 4 M or more, 1 ⁇ 10 ⁇ 3 M or more, 1 ⁇ 10 ⁇ 2 M or more, 1 ⁇ 10 ⁇ 1 M or more).
  • Each marker protein that specifically binds to antibodies is a polyclonal antibody may be either monoclonal antibodies, well known methods Can be created.
  • the antibody includes not only a complete antibody molecule but also a binding fragment thereof.
  • binding fragment is meant a partial region of the aforementioned antibody having specific binding activity. Examples of the binding fragment include F (ab ′) 2 , Fab ′, Fab, Fv, sFv, dsFv, sdAb and the like.
  • the polyclonal antibody is a commercially available adjuvant using the above protein or a partial peptide thereof (if necessary, a complex cross-linked to a carrier protein such as bovine serum albumin or KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin)) as an antigen.
  • a carrier protein such as bovine serum albumin or KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin)
  • complete or incomplete Freund's adjuvant and administered subcutaneously or intraperitoneally 2-4 times every 2 to 3 weeks (measure the antibody titer of partially collected serum by a known antigen-antibody reaction, It can be obtained by collecting the whole blood about 3 to about 10 days after the final immunization and purifying the antiserum.
  • animals to which the antigen is administered include mammals such as rats, mice, rabbits, goats, guinea pigs, and hamsters.
  • a monoclonal antibody can be prepared by a cell fusion method or the like.
  • each marker protein or a partial peptide thereof is administered to a mouse subcutaneously or intraperitoneally 2-4 times together with a commercially available adjuvant, and about 3 days after the final administration, the spleen or lymph node is collected and white blood cells are collected.
  • This leukocyte and myeloma cells (for example, NS-1, P3X63Ag8, etc.) are fused to obtain a hybridoma that produces a monoclonal antibody against the peptide.
  • Cell fusion can be performed by the PEG method, the voltage pulse method, or the like.
  • a hybridoma producing a desired monoclonal antibody can be selected by detecting an antibody that specifically binds to an antigen from the culture supernatant using a known EIA or RIA method or the like.
  • the culture of the hybridoma producing the monoclonal antibody can be performed in vitro or in vivo such as mouse or rat, or preferably mouse ascites, and the antibody can be obtained from the culture supernatant of the hybridoma and the ascites of the animal, respectively.
  • a monoclonal antibody is preferably used.
  • CXCL8 77 when the measurement of CXCL8 protein expression level of 77, a distinction between CXCL8 77 and CXCL8 72, rather than the total value of CXCL8 77 and CXCL8 72 protein expression levels, (without protein expression levels of CXCL8 72) It is important to measure the protein expression level of CXCL8 77 alone.
  • CXCL8 77 and CXCL8 72 have different physiological activities on hepatocytes, and CXCL8 77 induces apoptosis of hepatocytes, whereas CXCL8 72 induces cell proliferation, which is fulminant with CXCL8 77 , which is an inducer of hepatocyte apoptosis. This is because the likelihood and severity of liver failure correlate.
  • the immunoassay when measuring the protein expression level of CXCL8 77, as the antibody which specifically binds to CXCL8 77 used for the measurement, using an antibody which specifically binds to both CXCL8 72 and CXCL8 77 even only specifically bind to CXCL8 77, antibodies may be employed that does not specifically bind to the CXCL8 72.
  • CXCL8 Antibodies that specifically bind to 72 and CXCL8 77 both, antibodies with epitopes in the CXCL8 72 and CXCL8 77 both common to the region of (i.e., comprising the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 2 area) Can be mentioned.
  • CXCL8 77 only to specifically bind to, antibodies that do not specifically bind to the CXCL8 72, a portion of the 5 N-terminal amino acids of CXCL8 77 (i.e., a region consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3) Or the antibody which contains all within an epitope can be mentioned.
  • An antibody having such a specific epitope can be obtained by performing the above-described antibody production process using an antigen containing a desired epitope as an immunogen.
  • an antibody that specifically binds only to CXCL8 77 and does not specifically bind to CXCL8 72 (for example, CXCL8 containing part or all of the N-terminal 5 amino acids of CXCL8 77 within the epitope. 7 antibodies that specifically bind to 7 ) are preferably used in immunoassays.
  • CXCL8 only specifically binds to the 77, when the to CXCL8 72 using antibodies does not specifically bind, may be used in combination of antibodies that specifically bind to both CXCL8 72 and CXCL8 77. It is possible to measure the amount of antigen with high specificity by performing immunoassay using a combination of antibodies that recognize different epitopes for antigen capture and detection of the captured antigen. is there.
  • CXCL8 77 trapped in only specifically bind to CXCL8 77
  • CXCL8 72 does not specifically bind to the antibody
  • CXCL8 72 and CXCL8 77 either antibodies to both the antibody that specifically binds using, by the use of other antibody in the detection of the captured antigen it is possible to measure the protein expression level of CXCL8 77 with high specificity.
  • pre-procasceptin L and pro-casceptin L contain mature caseceptin L therein
  • antibodies having epitopes within mature caseceptin L typically specifically bind to pre-procaseceptin L, procaseceptin L, and mature caseceptin L . Therefore, when measuring the protein expression level of casceptin L by immunoassay, it is specific for preprocaseceptin L, procaseceptin L, and mature caseceptin L, which have an epitope in mature caseceptin L, as an antibody used for the measurement.
  • the total amount of preprocaceptin L, procaceptin L, and mature cathepsin L can be measured by using antibodies that bind to each other.
  • an antibody having an epitope within mature cathepsin L which is masked by preprocaceptin L and procaceptin L by the pro region, and that has an epitope that appears only in mature cathepsin L due to maturation, is only in mature cathepsin L. It binds specifically and does not specifically bind to preprocaceptin L and procaceptin L. Therefore, when measuring the protein expression level of caseceptin L by immunoassay, the expression level of mature caseceptin L alone can be obtained by using an antibody that specifically binds only to mature caseceptin L as the antibody used for the measurement. Can be measured.
  • Maturation results in an antibody that specifically binds to mature caseceptin L at an epitope that appears only in mature caseceptin L, and specifically binds to preprocaseceptin L, procaseceptin L, and mature caseceptin L at an epitope within mature caseceptin L
  • antibodies that specifically bind to mature caseceptin L, and in epitopes within mature caseceptin L, to pre-procaseceptin L, procaseceptin L, and mature caseceptin L It is possible to measure the protein expression level of mature Kaceptin L alone with high specificity by using one of the antibodies that specifically bind and using the other antibody to detect the captured antigen. is there.
  • the protein expression level of caseceptin L may be quantified by measuring the physiological activity (ie, protease activity) of caseceptin L. Since pre-procasceptin L and procasceptin L are inactive, the protein expression level of mature caseceptin L alone can be measured by measuring the physiological activity (ie, protease activity) of capecsin L.
  • Physiological activity of cathepsin L is such that a sample containing cathepsin L can be colored, fluorescent, or luminescent by digestion with cathepsin L on a substrate of cathepsin L (eg, peptide substrate of cathepsin L (eg, FR, HRYR)) Reaction with synthetic substrates (eg, Ac-FR-AFC, Ac-HRYR-ACC), CXCL8 77 ) to which coloring, fluorescent, or luminescent dyes are bound, and the amount of degradation products of the substrate is measured using coloring as an indicator By doing so, it can be quantified.
  • a substrate of cathepsin L eg, peptide substrate of cathepsin L (eg, FR, HRYR)
  • synthetic substrates eg, Ac-FR-AFC, Ac-HRYR-ACC
  • CXCL8 77 e.g, CXCL8 77
  • the content measured in the step (1) is correlated with the onset possibility and / or severity of fulminant hepatic failure of the subject.
  • a biological sample has a large variation in the total protein concentration between samples, and therefore, it is preferable to correct the protein expression level measured in step (1) for correlation.
  • correction standards include (i) total protein concentration, (ii) weight of biological sample, (iii) volume of biological sample, and the like.
  • correction is performed based on the total protein concentration. For example, each protein expression levels of CXCL8 77 and cathepsin L in a biological sample measured in step (1), by dividing by the total protein concentration of the sample was calculated relative expression amount per unit protein amount, Correlate this relative content with the likelihood and / or severity of fulminant liver failure in the subject. Therefore, when correcting based on the total protein concentration, in the step (1), it is preferable to measure the total protein concentration of each biological sample together.
  • each protein expression level of the measured CXCL8 77 and cathepsin L compared with healthy subjects and / or expression level of the marker proteins in chronic liver failure patients.
  • the measured protein expression levels of CXCL8 77 and Casceptin L were determined in advance, and the average expression level of the marker protein in healthy subjects and / or patients with chronic liver failure was determined in advance.
  • the comparison of the expression level of each marker protein is preferably performed based on the presence or absence of a significant difference.
  • CXCL8 77 and the protein expression level of cathepsin L was measured in the step (1), CXCL8 77 expression level is relatively high, and cathepsin L expression level, if relatively low, Gekishokimo Compare to the criterion that you are more likely to develop failure.
  • CXCL8 77 expression level in a subject is relatively high, and cathepsin L expression level, if relatively low, the subject can be determined to be likely that developed fulminant hepatic failure.
  • the expression level of CXCL8 77 in a subject is relatively higher than that in patients with chronic liver failure and the expression level of cathepsin L is relatively lower than that in healthy subjects, it is not chronic liver failure but fulminant liver failure. It is possible to determine that there is a high possibility of developing.
  • the expression level of CXCL8 77 in the test subject is higher than that in healthy subjects, but the expression level of cathepsin L is also higher than that in healthy subjects, chronic liver failure has occurred instead of fulminant liver failure. It can be determined that the possibility is high.
  • fulminant liver failure In addition to fulminant liver failure, it can also be applied to early diagnosis of acute exacerbation of chronic liver failure and graft rejection after liver transplantation.
  • CXCL8 77 and cathepsin previously set the cut-off value of each protein expression amount of L, the cut-off value and the measured expression amount. For example, if the expression level of CXCL8 77 exceeds the cut-off value and the expression level of cathepsin L is lower than the cut-off value, it is determined that the subject is highly likely to develop fulminant liver failure. I can do it.
  • the cutoff value of CXCL8 77 is set to a value that enables discrimination between fulminant liver failure and chronic liver failure, the expression level of CXCL8 77 exceeds the cutoff value, and the expression of cathepsin L If the amount is below the cut-off value, the subject can be determined to be more likely to develop fulminant liver failure rather than chronic liver failure.
  • the “cut-off value” is a value that can satisfy both high diagnostic sensitivity and high diagnostic specificity when a disease is diagnosed based on the value. For example, it shows a high positive rate in patients with fulminant hepatic failure, and show a high negative rate in patients with healthy subjects and / or chronic liver failure, set each protein expression levels of CXCL8 77 and cathepsin L as a cut-off value I can do it.
  • the calculation method of the cut-off value is well known in this field. For example, fulminant hepatic failure patients, and healthy subjects and / or chronic liver failure patient, measuring the respective protein expression levels of CXCL8 77 and cathepsin L, determine the diagnostic sensitivity and diagnostic specificity of the measured values, these Based on the value, create a ROC (Receiver Operating Characteristic) curve using commercially available analysis software. Then, a value when the diagnostic sensitivity and diagnostic specificity are as close to 100% as possible is obtained, and the value can be used as a cutoff value.
  • ROC Receiveiver Operating Characteristic
  • the diagnostic efficiency in the detected value (cases in which fulminant liver failure patients are correctly determined as “fulminant liver failure” with respect to the total number of cases, and healthy subjects (or chronic liver failure patients) are “healthy” ( Or the ratio of the total number of cases correctly determined as chronic liver failure), and the value at which the highest diagnostic efficiency is calculated can be used as the cutoff value.
  • CXCL8 77 cut-off value is CXCL8 77 average protein expression level + SD to average + 3SD (eg, mean value + 2SD) in healthy subjects
  • Kaceptin L cut-off value is set in healthy subjects
  • CXCL8 77 cutoff value CXCL8 77 protein expression level in chronic liver failure + SD ⁇ average value + 3SD (eg, average value + 2SD), and as a cut off value of Kaceptin L, Set the mean -SD to mean -3SD (eg, mean -2SD) of the protein expression level of cathepsin L in chronic liver failure. If the expression level of CXCL8 77 exceeds the cut-off value and the expression level of cathepsin L is lower than the cut-off value, the subject may have fulminant hepatic failure instead of chronic liver failure. It can be determined that the price is high.
  • the CXCL8 77 cutoff value for CXCL8 77 is set as the mean value of protein expression of CXCL8 77 in chronic liver failure + SD to the mean value + 3SD (eg, mean value + 2SD).
  • the mean value + 3SD eg, mean value + 2SD.
  • an average value -SD to an average value -3SD (eg, average value -2SD) of the protein expression level of cathepsin L in healthy subjects. If the expression level of CXCL8 77 exceeds the cutoff value and the expression level of cathepsin L is lower than the cutoff value, the subject has developed fulminant hepatic failure, not healthy or chronic liver failure It can be determined that the possibility is high.
  • CXCL8 77 concentration is high. Therefore, for patients who were determined to have a high possibility of developing fulminant liver failure in the above-mentioned determination, and for patients with fulminant liver failure, such a correlation (CXCL8 77 concentration and severity of fulminant liver failure
  • the severity of fulminant liver failure can be determined based on the positive correlation between the two. For example, the protein expression levels of CXCL8 77 and caseceptin L measured in step (1) are compared with a criterion that the severity of fulminant liver failure is high when the expression level of CXCL8 77 is relatively high. If the CXCL8 77 expression level in the subject is relatively high, the severity of the subject's fulminant liver failure is high, and conversely, if the CXCL8 77 expression level is relatively low, It can be determined that the severity is low.
  • Chronic liver failure and fulminant liver failure can be classified on the basis of conventional serum biochemical tests and changes in clinical symptoms, etc., but when such conventional tests require urgent situations that are difficult to apply, for example, sudden In patients who developed symptoms of fulminant hepatic failure or who had chronic liver failure turned fulminant, by examining the expression levels of cathepsin L and CXCL8 77 , Clinical diagnosis of severity is possible.
  • the subject is likely to have fulminant liver failure or the subject's severity of fulminant liver failure is determined to be high, emergency transport to the subject's liver transplant facility, liver transplant donor
  • the preparation for liver transplantation such as securing can be started immediately.
  • the prognosis of fulminant liver failure can be greatly improved by promptly performing liver transplantation on the subject. Therefore, according to the present invention, it is possible to determine a treatment policy with high accuracy (necessity of liver transplantation, etc.).
  • Kit for diagnosing fulminant liver failure provides a kit for diagnosing fulminant liver failure comprising the following substances: (1) CXCL8 77 with an antibody that specifically binds, and (2) cathepsin L to an antibody that specifically binds, or cathepsin L substrate.
  • each term including each marker protein and antibody is the same as described in 1 above unless otherwise specified.
  • the epitope recognized by each antibody is not particularly limited as long as the marker protein can be quantified by an immunological method.
  • the antibody that specifically binds to CXCL8 77 in (1) includes an antibody that specifically binds to both CXCL8 72 and CXCL8 77 (eg, a region common to both CXCL8 72 and CXCL8 77 (ie, SEQ ID NO: 2 in even using an antibody) having an epitope in the amino acid sequence consisting of area) represented only specifically bound to the CXCL8 77, antibodies (example not specifically bind to the CXCL8 72, CXCL8 77 N-terminal of 5 (that is, an antibody containing a part or all of the region consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3) within the epitope).
  • an antibody that specifically binds to both CXCL8 72 and CXCL8 77 eg, a region common to both CXCL8 72 and CXCL8 77 (ie, SEQ ID NO: 2 in even using an antibody) having an epitope in the amino acid sequence consisting of area) represented only specifically bound to the C
  • the antibody of (1) preferably binds specifically to CXCL8 77 only, is to 72 do not specifically bind to the antibody is (eg, an antibody comprising in the epitope some or all of the 5 N-terminal amino acids of CXCL8 77).
  • the antibodies that specifically bind to cathepsin L it is preferable to use a combination of a plurality of antibodies that recognize different epitopes.
  • the antibody of (1) only specifically binds to the CXCL8 77, comprising the CXCL8 72 does not specifically bind to the antibodies (e.g., within an epitope some or all of the 5 N-terminal amino acids of CXCL8 77 Antibody) and an antibody that specifically binds to both CXCL8 72 and CXCL8 77 (eg, a region common to both CXCL8 72 and CXCL8 77 (ie, a region consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2)) A combination with an antibody having an epitope).
  • a combination it is possible to measure with high specificity protein expression level of CXCL8 77.
  • the antibody contained in the diagnostic kit of the present invention may be labeled with a labeling agent.
  • the labeling agent include radioisotopes, enzymes, fluorescent substances, luminescent substances, biotin, and the like.
  • the radioisotope for example, 125 I, 131 I, 3 H, 14 C and the like are used.
  • the enzyme is preferably stable and has a large specific activity.
  • ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used.
  • the fluorescent substance for example, fluorescamine, fluorescein isothiocyanate and the like are used.
  • the luminescent substance for example, luminol, luminol derivatives, luciferin, lucigenin and the like are used.
  • the antibody may be provided by immobilizing it on an appropriate support.
  • the support is not particularly limited as long as it is a support usually used in the art, and examples thereof include a microplate (eg, 96-well plate), beads, a membrane (eg, nylon membrane), and an array chip. It is done.
  • the diagnostic kit of the present invention may further include a needle used for biopsy of liver tissue.
  • the diagnostic kit of the present invention can further contain a labeled secondary antibody, a chromogenic substrate, a blocking solution, a washing buffer, an ELISA plate, a blotting membrane, and the like depending on the type of immunological measurement method.
  • Each component included in the diagnostic kit of the present invention is appropriately separated (or mixed if possible) at an appropriate concentration in water or an appropriate buffer (eg, TE buffer, PBS, etc.). Or dissolved in a lyophilized state and placed in a suitable container.
  • an appropriate buffer eg, TE buffer, PBS, etc.
  • cathepsin L cleaves CXCL8 77, converted into CXCL8 72.
  • CXCL8 77 induces apoptosis in hepatocytes but, CXCL8 72 acts as a growth factor rather against hepatocytes.
  • the expression level of cathepsin L in liver tissue is extremely low, which leads to a decrease in CXCL8 77 clearance (conversion to CXCL8 72 ) and exacerbates liver damage. It is a factor.
  • the present invention provides a preventive or therapeutic agent for fulminant liver failure, which contains an effective amount of cathepsin L or an expression vector thereof.
  • Procasceptin L is converted to mature caseceptin L by autocatalytic processing. Therefore, when administering caseceptin L (protein), any form selected from procaseceptin L and mature caseceptin L is used as the caseceptin L to be administered. Preferably, however, mature cathepsin L is used. On the other hand, since mature Kaceptin L is a heterodimer, it is technically possible to express both chains separately or in the same vector to form a heterodimer in vivo. Since the expression system becomes complicated, it is preferable to administer preprocaceptin L or a procaceptin L expression vector containing preprocaceptin L or a polynucleotide encoding procaceptin L. The expressed pre-procasceptin L or procasceptin L is converted to mature caseceptin L by cleavage of the signal sequence and / or autocatalytic processing.
  • a polynucleotide preferably DNA
  • a nucleotide sequence for example, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4
  • cathepsin L preferably preprocaceptin L or procaceptin L
  • a promoter capable of exhibiting promoter activity in the target human cells (preferably hepatocytes).
  • a polII promoter is usually used as the promoter used in the expression vector.
  • SV40-derived early promoters include SV40-derived early promoters, viral promoters such as cytomegalovirus LTR, mammalian constituent protein gene promoters such as ⁇ -actin gene promoter, and the like.
  • viral promoters such as cytomegalovirus LTR
  • mammalian constituent protein gene promoters such as ⁇ -actin gene promoter, and the like.
  • hepatocyte-specific promoter it is possible to express hepatic cell specifically in hepatocytes and supplement it specifically in liver tissue.
  • hepatocyte-specific promoters include albumin promoter.
  • the expression vector preferably contains a transcription termination signal, that is, a terminator region, downstream of the polynucleotide containing the nucleotide sequence encoding cathepsin L.
  • a selection marker gene for selecting transformed cells a gene that imparts resistance to drugs such as tetracycline, ampicillin, and kanamycin, a gene that complements an auxotrophic mutation, and the like.
  • the type of vector used for the expression vector is not particularly limited, and examples of vectors suitable for human administration include viral vectors such as retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, and plasmid vectors.
  • viral vectors such as retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, and plasmid vectors.
  • adenovirus has advantages such as extremely high gene transfer efficiency and can be introduced into non-dividing cells.
  • transgene integration into the host chromosome is extremely rare, gene expression is transient and usually lasts only about 4 weeks.
  • the use of an adeno-associated virus that is relatively high in gene transfer efficiency, can be introduced into non-dividing cells, and can be integrated into the chromosome via an inverted terminal repeat (ITR) Also preferred.
  • ITR inverted terminal repeat
  • the prophylactic or therapeutic agent of the present invention can be used orally or parenterally so that an effective amount of cathepsin L or an expression vector capable of expressing it can reach liver tissue (preferably, a disease site of fulminant liver failure).
  • it is administered to the administration subject in need thereof.
  • administration subjects include patients with fulminant liver failure, patients suspected of developing fulminant liver failure (for example, in the above-described test method of the present invention, fulminant liver failure may have occurred. Patients who are judged to be high), humans who are likely to develop fulminant hepatic failure (for example, patients with hepatic failure that is not fulminant hepatic failure, hepatitis virus infected), and the like.
  • Parenteral administration is usually performed by intravenous, intraarterial, subcutaneous, intradermal, intramuscular or intraperitoneal administration in the form of an injection or the like.
  • Caseceptin L or an expression vector capable of expressing it may be administered directly or locally into liver tissue (preferably, the site of fulminant liver failure).
  • the preventive or therapeutic agent of the present invention can contain any carrier, for example, a pharmaceutically acceptable carrier, in addition to cathepsin L or an expression vector capable of expressing it.
  • Examples of pharmaceutically acceptable carriers include excipients such as sucrose and starch, binders such as cellulose and methylcellulose, disintegrants such as starch and carboxymethylcellulose, lubricants such as magnesium stearate and aerosil, citric acid, Fragrances such as menthol, preservatives such as sodium benzoate and sodium bisulfite, stabilizers such as citric acid and sodium citrate, suspensions such as methylcellulose and polyvinylpyrrolidone, dispersants such as surfactants, water, physiological Although diluents, such as salt solution, base wax, etc. are mentioned, it is not limited to them.
  • excipients such as sucrose and starch
  • binders such as cellulose and methylcellulose
  • disintegrants such as starch and carboxymethylcellulose
  • lubricants such as magnesium stearate and aerosil
  • citric acid Fragrances such as menthol
  • preservatives such as sodium benzoate and sodium bisulfite
  • stabilizers
  • the preventive or therapeutic agent of the present invention can further contain a reagent for nucleic acid introduction.
  • the expression vector is a viral vector, particularly a retroviral vector, retronectin, fibronectin, polybrene or the like can be used as a gene introduction reagent.
  • the expression vector is a plasmid vector, a positive such as Lipofectin, Lipofectamine, DOGS (Transfectum), DOPE, DOTAP, DDAB, DHDEAB, HDEAB, Polybrene, or Poly (ethyleneimine) (PEI) Ionic lipids can be used.
  • Preparations suitable for oral administration include liquids, capsules, sachets, tablets, suspensions, emulsions and the like.
  • Formulations suitable for parenteral administration include aqueous and non-aqueous isotonic sterile injection solutions, which include antioxidants Further, a buffer solution, an antibacterial agent, an isotonic agent and the like may be contained. Aqueous and non-aqueous sterile suspensions are also included, which may contain suspending agents, solubilizers, thickeners, stabilizers, preservatives and the like.
  • the preparation can be enclosed in a container in unit doses or multiple doses like ampoules and vials.
  • the active ingredient and a pharmaceutically acceptable carrier can be lyophilized and stored in a state that may be dissolved or suspended in a suitable sterile vehicle immediately before use.
  • the content of the above-described polynucleotide in the pharmaceutical composition is, for example, about 0.001 to 100% by weight of the whole pharmaceutical composition.
  • the dose of the preventive or therapeutic agent of the present invention varies depending on the activity and type of the active ingredient, the severity of the disease, the animal species to be administered, the drug acceptability of the administration subject, body weight, age, etc.
  • the amount of active ingredient per day for an adult is about 0.001 to about 500 mg / kg.
  • Cathepsin L is a CXCL8 77 is an apoptosis inducing factor for hepatocytes, by converting the CXCL8 72 is a growth factor, since suppressing the disorder of hepatocytes in fulminant hepatic failure, prophylactic or therapeutic agents of the present invention
  • a patient with fulminant hepatic failure, a patient suspected of developing fulminant hepatic failure (for example, in the test method of the present invention described above, the possibility of developing fulminant hepatic failure is high
  • To prevent fulminant liver failure by administering it to humans eg, patients with hepatic failure that is not fulminant liver failure, hepatitis virus infected), etc. Can be treated.
  • the present invention provides a screening method for a candidate substance for a prophylactic or therapeutic agent for fulminant liver failure, comprising the following steps: (1) Evaluating whether the test substance promotes the expression of cathepsin L, and (2) The test substance that promotes the expression of cathepsin L as a candidate substance for the prevention or treatment of fulminant liver failure. To choose as.
  • the screening method of the present invention comprises the following steps (a) to (c): (A) contacting the test substance with a cell capable of measuring the expression of cathepsin L; (B) measuring the expression level of casceptin L in cells contacted with the test substance, and comparing the expression level with the expression level of casceptin L in control cells not contacted with the test substance; and (c) above ( A step of selecting, based on the comparison result of b), a test substance that promotes the expression of cathepsin L as a candidate substance for a prophylactic or therapeutic agent for fulminant liver failure.
  • test substance to be used for the screening method may be any known compound or novel compound, for example, nucleic acid, carbohydrate, lipid, protein, peptide, organic low molecular weight compound, prepared using combinatorial chemistry technology Examples thereof include a compound library, a random peptide library prepared by solid phase synthesis or a phage display method, or natural components derived from microorganisms, animals and plants, marine organisms, and the like.
  • the test substance is placed in contact with cells capable of measuring the expression of cathepsin L in vitro or in vivo.
  • the test substance can be contacted with cells capable of measuring the expression of cathepsin L by culturing cells capable of measuring the expression of cathepsin L in the presence of the test substance.
  • the contact of a test substance with a cell capable of measuring the expression of cathepsin L is performed by a non-human animal (preferably a mouse, rat, hamster, guinea pig, rabbit) containing a cell capable of measuring the expression of cathepsin L. , Non-human mammals such as dogs and monkeys).
  • the cell capable of measuring the expression of cathepsin L refers to a cell capable of directly or indirectly evaluating the expression level of a product of the cathepsin L gene, for example, a transcription product or a translation product.
  • a cell that can directly evaluate the expression level of the product of the cathepsin L gene can be a cell that can naturally express the cathepsin L (eg, a cell that naturally expresses the cathepsin L), while the cathepsin L gene.
  • a cell capable of indirectly assessing the expression level of the product of can be a cell that allows a reporter assay for the cathepsin L gene transcription regulatory region.
  • the cells capable of measuring the expression of cathepsin L can be animal cells, for example, mammalian cells such as mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits, dogs, monkeys, humans, and avian cells such as chickens.
  • mammalian cells such as mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits, dogs, monkeys, humans, and avian cells such as chickens.
  • the cells that can naturally express capecsin L are not particularly limited as long as they can potentially express capecsin L.
  • Such cells can be easily identified by those skilled in the art, and primary cultured cells, cell lines derived from the primary cultured cells, commercially available cell lines, cell lines available from cell banks, and the like can be used.
  • Examples of cells that naturally express the cathepsin L gene include hepatocytes, blood cells, and cell lines of these cells (HepG2, Huh7, K562, etc.).
  • cells that contribute to the expression of cathepsin L in the liver such as hepatocytes, and cell lines of these cells (HepG2, Huh7, etc.) are preferred. Used for.
  • a cell that enables a reporter assay for the cathepsin L gene transcriptional regulatory region is a cell that contains a cathepsin L gene transcriptional regulatory region and a reporter gene operably linked to the region.
  • the cathepsin L gene transcription regulatory region and reporter gene can be inserted into an expression vector.
  • the cathepsin L gene transcription regulatory region is not particularly limited as long as it can control the expression of the cathepsin L gene.
  • the region from the transcription start point to about 2 kbp upstream, or one or more bases in the base sequence of the region Include a region consisting of a nucleotide sequence deleted, substituted or added and having the ability to control transcription of the cathepsin L gene.
  • the reporter gene may be any gene that encodes a detectable protein or an enzyme that produces a detectable substance.
  • a GFP green fluorescent protein
  • GUS ⁇ -glucuronidase
  • LUC luciferase
  • CAT Chloramphenicol acetyltransferase
  • the cell into which the reporter gene operably linked to the capsepsin L gene transcription regulatory region can be evaluated, so that the expression level of the reporter gene can be quantitatively analyzed as long as the cathepsin L gene transcription regulatory function can be evaluated.
  • the cathepsin L gene transcription regulatory function There is no particular limitation as long as it is. However, it expresses a physiological transcriptional regulatory factor for the cathepsin L gene and is considered to be more appropriate for the evaluation of the expression regulation of the cathepsin L gene. Possible cells (eg, cells that naturally express cathepsin L) are preferred.
  • the culture medium in which the test substance is contacted with the cells capable of measuring the expression of cathepsin L is appropriately selected depending on the type of cells used, and includes, for example, about 5 to 20% fetal bovine serum.
  • the culture conditions are also appropriately determined according to the type of cells to be used. For example, the pH of the medium is about 6 to about 8, the culture temperature is usually about 30 to about 40 ° C., and the culture time is About 12 to about 72 hours.
  • step (b) of the above method first, the expression level of cathepsin L in the cells contacted with the test substance is measured.
  • the expression level can be measured by a method known per se in consideration of the type of cells used. For example, when a cell capable of measuring the expression of cathepsin L is used as a cell capable of measuring the expression of cathepsin L, the expression level is known per se for products of the cathepsin L gene, such as transcripts or translation products. It can be measured by the method.
  • the expression level of the transcript can be measured by preparing total RNA from cells and performing RT-PCR, Northern blotting, or the like.
  • the expression level of the translation product can be measured by preparing an extract from the cells and using an immunological technique.
  • immunological techniques include those described above.
  • a cell capable of performing a reporter assay for the transcriptional regulatory region of the cathepsin L gene is used as a cell capable of measuring the expression of cathepsin L
  • the expression level can be measured based on the signal intensity of the reporter.
  • the expression level of caseceptin L in the cells contacted with the test substance is compared with the expression level of caseceptin L in the control cells not contacted with the test substance.
  • the comparison of expression levels is preferably performed based on the presence or absence of a significant difference.
  • the expression level of cathepsin L in the control cells not contacted with the test substance is the expression level measured at the same time, even if the expression level was measured in advance, compared with the measurement of the expression level of cathepsin L in the cells contacted with the test substance.
  • it may be an amount, it is preferably an expression amount measured simultaneously from the viewpoint of the accuracy and reproducibility of the experiment.
  • step (c) of the above method the test substance that promotes the expression of cathepsin L is selected as a candidate substance for the prevention or treatment of fulminant liver failure.
  • the effect of the obtained candidate substance may be confirmed in vivo.
  • the candidate substance is administered to a fulminant liver failure model non-human mammal (for example, a non-human mammal transplanted with an adhesive cancer cell whose growth inhibitory activity has been confirmed by an in vitro method), Symptoms of fulminant hepatic failure are compared with control non-human mammals (with the same breeding conditions as non-human mammals with fulminant hepatic failure to which the candidate substance is administered) except for the administration of the candidate substance.
  • a fulminant liver failure model for example, the ConA-induced hepatitis model described in BMC Genomics 2010, 11: 240, etc. is known.
  • the candidate substance that suppresses the symptoms of fulminant liver failure in the non-human mammal can be selected as a prophylactic or therapeutic agent for fulminant liver failure whose in vivo efficacy has been confirmed.
  • chemokines with high levels of fulminant liver failure Using RayBiotech's protein array system (Human Cytokine Antibody Array 3), 3 groups of normal liver (living liver donor), pediatric chronic liver failure, and pediatric fulminant liver failure A comprehensive analysis of inflammatory cytokines was performed in liver tissues. As a result, three chemokines (CXCL8, GRO, MCP-1) that showed high levels in fulminant liver failure were identified, and a correlation was found between the expression level of CXCL8 and clinical acuteness (rate of progression) (Fig. 1). ).
  • the CXCL8 77 and CXCL8 72 of two kinds of recombinant proteins was separated by SDS electrophoresis, blotted to PVDF membranes and incubated with monoclonal antibodies to the C-terminus of the monoclonal antibodies and CXCL8 against the N-terminal of the CXCL8 77, with a secondary antibody Detected.
  • the results are shown in Fig. 2 (1).
  • CXCL8 77 could be specifically detected.
  • Enzyme immunoassay 96-well plates, monoclonal antibodies against the N-terminus of CXCL8 77 described above, immobilized with monoclonal antibodies to the C-terminus of CXCL8, were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) by the sandwich method. That is, mouse monoclonal antibodies against the N-terminus and C-terminus of CXCL8 were added to a NUNC Maxisorp 96-well plate at 2.5 ⁇ g / ml (100 ⁇ l; 50 mM carbonate buffer pH 9.5) per well, respectively. Turned into. After washing, the protein lysate and standard recombinant protein were reacted at room temperature for 2 hours.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • the detection signal was determined using detection reagents (IL-8 conjugate, substrate, amplifier, etc.) of R & D Human CXCL8 / IL-8 Quantikine HS ELISA Kit (HS800).
  • detection reagents IL-8 conjugate, substrate, amplifier, etc.
  • R & D Human CXCL8 / IL-8 Quantikine HS ELISA Kit HS800
  • liver tissue of children fulminant hepatic failure patient liver tissue was suspended in Cell Lysis Buffer fine cut into RayBiotech proteins were extracted. The protein concentration in the supernatant was quantified by the BCA method, and the protein concentration was adjusted to 0.1 mg / ml. Using the same sample, to derive the CXCL8 77 protein amount contained in 1 g liver protein by ELISA. CXCL8 77 in liver tissue showed lower or lower sensitivity than that in healthy liver (donor for living liver transplantation), but increased slightly in chronic liver failure, with an average value of 236 ng (23-670 ng) ( Figure 3-1 left).
  • liver tissue CXCL8 77 concentrations were analyzed fulminant liver failure cases.
  • the table below shows the ages (months) of pediatric fulminant hepatic failure patients and chronic hepatic failure (biliary atresia) patients entered in this study.
  • CXCL8 recombinant protein conversion per lane 2 ⁇ g to CXCL8 72 of CXCL8 77 by cathepsin L CXCL8 77 and CXCL8 72 controls, as well as cathepsin L incubated with CXCL8 77 30 minutes), SDS-polyacrylamide gel (15%) They were separated by electrophoresis, transferred to a PVDF membrane, and stained with Coomassie Brilliant Blue.
  • cathepsin L cleaves the 5 th arginine CXCL8 77, it was confirmed that by converting the CXCL8 77 to CXCL8 72 (CXCL8 77 is first N-terminal is converted into CXCL8 72 starting with Ser) ( Figure 4 bottom).
  • CXCL8 77 and CXCL8 72 of bioactive comparison CXCL8 77 using HepG2 cells, CXCL8 72, and the impact of the CXCL8 77 on cell proliferation of products treated with cathepsin L were bioassays. Specifically, CXCL8 of each isotype was added to the cell culture supernatant, and the cell growth rate after 3 days was determined as a relative growth rate with respect to the CXCL8 non-added control. Furthermore, using Caspase-Glo3 / 7 from Promega, the caspase 3/7 activity of cells treated with CXCL8 at a final concentration of 1 ng / ml was determined as a relative activity to the control without CXCL8.
  • CXCL8 72 is to induce cell proliferation in a concentration-dependent to suppress Caspase- activity (cell apoptosis), CXCL8 77 inhibited cell proliferation rather induces cell apoptosis (Fig. 5).
  • CXCL8 77 which has received the cathepsin L treatment suppresses the caspase 3 activity induced cell proliferation. Therefore, cathepsin L process, by converting CXCL8 77 (apoptosis-inducing factor) on CXCL8 72 (hepatocyte growth factor), has been suggested to inhibit apoptosis of liver cells by CXCL8 77.
  • CXCL8 77 and caseceptin L concentrations in liver tissue in adult fulminant liver failure Expression analysis of CXCL8 77 and caseceptin L was also performed in 10 patients with adult fulminant liver failure. As a result, similar to the children, it showed reduced expression of expression localization and cathepsin L of strong CXCL8 77 to perivascular connective tissue. Therefore, expression analysis of the CXCL8 77 and cathepsin L in adults fulminant hepatic failure are useful in disease progression grasp was suggested.
  • Fulminant liver failure is a syndrome that presents severe liver dysfunction and multiple organ failure due to rapid hepatocyte death.
  • the present inventors have found that in this test, CXCL8 77 fibroblasts produced was found to be hepatocyte disorder factor.
  • CXCL8 77 was weakly expressed in the connective tissue in the portal vein region, but the average CXCL8 77 concentration in the liver tissue was 236.3 ng / g / liver protein.
  • fulminant hepatic failure it was strongly expressed in the vascular wall of the central hepatic vein and the surrounding connective tissue, and its expression correlated with the severity of vascular injury.
  • CXCL8 77 concentration of liver tissue had increased markedly and 3537.5 ng / g / liver protein (distribution 350-8,250).
  • Cathepsin L is an exploded enzyme of CXCL8 77 is, in the chronic liver failure is higher as compared to healthy subjects, had Hesi Cho in fulminant hepatic failure. This also, in fulminant hepatic failure was considered one of the causes that shows the abnormally high is not decomposed CXCL8 77.
  • fulminant hepatic failure has clinical diversity, it seems that there is a certain correlation between the time course (acute course) leading to the onset and its severity.
  • the disease type is classified based on the time course from the onset of jaundice to hepatic encephalopathy. Based on the period of childhood fulminant hepatic failure and the time from the onset of liver transplantation (0-7 days, 8-28 days, 29-72 days), the disease type and CXCL8 77 concentration in liver tissue Correlation analysis was performed. As a result, it showed a strong correlation between the severity and CXCL8 77 concentration.
  • This disease also has a poor life prognosis, and assessing the severity based on objective indicators is a life-saving chain (e.g., explaining the medical condition to the patient's family, emergency transport to a liver transplant facility, securing a donor for liver transplant ( Chain of survival) may be smooth, and the prognosis of this disease may be greatly improved.
  • a life-saving chain e.g., explaining the medical condition to the patient's family, emergency transport to a liver transplant facility, securing a donor for liver transplant ( Chain of survival) may be smooth, and the prognosis of this disease may be greatly improved.
  • the present invention it is possible to diagnose fulminant liver failure and determine the severity based on an objective index. Further, the present invention, supplemented with cathepsin L in patients with fulminant hepatic failure, to facilitate the conversion of CXCL8 72 of CXCL8 77, prevention or treatment technique fulminant hepatic failure based on a new mechanism is provided that The

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Abstract

被験者から単離された生体試料における、CXCL877及びカセプシンLの各タンパク質発現量を測定し、測定された発現量に基づき、被験者における、劇症肝不全の発症可能性及び／又は急性度を判定する。また、カセプシンL又はその発現ベクターを投与し、カセプシンLの発現が低下した劇症肝不全の肝臓にカセプシンLを補充することにより、劇症肝不全を予防又は治療する。

Description

劇症肝不全の診断方法、及び予防又は治療剤
　本発明は、劇症肝不全のバイオマーカーを用いた、劇症肝不全の診断方法及び診断薬；劇症肝不全の予防又は治療剤；劇症肝不全の予防又は治療剤の候補物質のスクリーニング方法等に関する。
　小児劇症型肝不全は、成人と異なり肝炎ウイルスの関与がまれであり依然としてその病態には不明な点が多い。本症に対して血液浄化療法と肝移植との集学的治療が積極的に取り組まれているが、乳児症例での救命率は54%と依然として低い。この理由として、小児劇症肝不全の病態メカニズムが依然と不明であること、客観的指標に基づく重症度分類が確立されていないこと、病態特異的な治療介入が不十分であったこと等が挙げられる。
　成人のアルコール肝障害やHCV肝硬変、肝不全動物モデルでは、すでに炎症性ケモカインやサイトカインであるCXCL6、CXCL8、TNF-α等の機能解析の報告が散見されるが、その臨床的意義には一定の見解を得ていない（非特許文献1～3）。
Simpson KJ, et al. Chemokines in the pathogenesis of liver disease: so many players with poorly defined roles. Clin Sci. 2003; 104: 47-63. Kuboki S, et al. Hepatocyte signaling through CXC chemokine receptor-2 is detrimental to liver recovery after ischemia/reperfusion in mice. Hepatology. 2008; 48: 1213-1223. Hogaboam CM, et al. Novel CXCR2-dependent liver regenerative qualities of ELR-containing CXC chemokines. FASEB J. 1999; 13: 1565-1574.
　本発明は、客観的指標に基づく劇症肝不全の重症度の診断技術を提供することを目的とする。また、本発明は、新たな作用機序に基づく劇症肝不全の予防又は治療剤を提供することを目的とする。
　本発明者らは上記課題を解決すべく、鋭意検討の結果、小児劇症肝不全の肝組織を用いたサイトカインアレイ解析で、症状の進展とCXCL8の特定のアイソタイプであるCXCL877(77 amino-acids)の発現レベルとが相関することを見出した。さらに解析を進めることにより、以下の2点を見出した。
1)CXCL8はアイソタイプ毎に肝細胞への生理活性が異なる。すなわち、CXCL877は細胞アポトーシスを誘導するが、CXCL872(72 amino-acids)は細胞増殖因子である。
2)カセプシンLはCXCL877N末端の5アミノ酸残基を切断し、アイソタイプをCXCL872に変換する。
　また、劇症肝不全では、肝組織中のカセプシンLの発現レベルが極低値であり、このことがCXCL877のクリアランス低下を招き、肝障害を増悪させる要因となっていることが示唆された。以上のことから、肝細胞障害性ケモカインCXCL877とその制御因子であるカセプシンLを測定することにより、劇症肝不全の重症度の予測が可能であることが示された。また、カセプシンL補充療法によりCXCL877の肝再生因子(CXCL872)への変換を促進することで、劇症肝不全を予防又は治療できる可能性が示された。
　本発明者らは、上記知見に基づき更に検討を加え、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は以下に関する。
［1］以下の工程を含む、劇症肝不全の検査方法：
（1）被験者から単離された生体試料における、CXCL877及びカセプシンLの各タンパク質発現量を測定すること；並びに
（2）（1）において測定した発現量と、劇症肝不全の発症可能性及び／又は重症度とを相関付けること。
［2］（2）における相関付けが、（1）において測定した各発現量を、CXCL877発現量が、相対的に高く、且つカセプシンL発現量が、相対的に低い場合には、劇症肝不全を発症している可能性が高いという基準と比較することを含む、［1］記載の方法。
［3］（2）における相関付けが、（1）において測定したCXCL877発現量を、CXCL877発現量が高い程、劇症肝不全の重症度が高いという基準と比較することを含む、［1］又は［2］記載の方法。
［4］CXCL877発現量の測定を、免疫学的測定法により行う、［1］～［3］のいずれかに記載の方法。
［5］免疫学的測定法が、CXCL877のN末端の5アミノ酸の一部又は全部をエピトープ内に含む、CXCL877に特異的に結合する抗体を用いて行われる、［4］記載の方法。
［6］生体試料が肝組織である、［1］～［5］のいずれかに記載の方法。
［7］以下の物質を含む、劇症肝不全の診断用キット：
（1）CXCL877に特異的に結合する抗体、及び
（2）カセプシンLに特異的に結合する抗体、又はカセプシンLの基質。
［8］CXCL877に特異的に結合する抗体が、CXCL877のN末端の5アミノ酸の一部又は全部をエピトープ内に含む、［7］記載の診断薬。
［9］カセプシンL又はその発現ベクターを含む、劇症肝不全の予防又は治療剤。
［10］以下の工程を含む、劇症肝不全の予防又は治療剤の候補物質のスクリーニング方法：
（1）被検物質が、カセプシンLの発現を促進するか否か評価すること、及び
（2）カセプシンLの発現を促進した被検物質を、劇症肝不全の予防又は治療剤の候補物質として選択すること。
［11］劇症肝不全の診断において使用するための、以下の（1）及び（2）を含む組み合わせ：
（1）CXCL877に特異的に結合する抗体、及び
（2）カセプシンLに特異的に結合する抗体、又はカセプシンLの基質。
［12］劇症肝不全の診断薬を製造するための、以下の（1）及び（2）を含む組み合わせの使用：
（1）CXCL877に特異的に結合する抗体、及び
（2）カセプシンLに特異的に結合する抗体、又はカセプシンLの基質。
［13］対象ヒトに対して、カセプシンL又はその発現ベクターの有効量を投与することを含む、該対象ヒトにおける劇症肝不全の予防又は治療方法。
［14］劇症肝不全の予防又は治療において使用するための、カセプシンL又はその発現ベクター。
［15］劇症肝不全の予防又は治療用医薬を製造するための、カセプシンL又はその発現ベクターの使用。
　本発明により、客観的な指標に基づく、劇症肝不全の診断が可能となる。慢性肝不全においても、健常者と比較して、肝組織中のCXCL877濃度が高いが、劇症肝不全では、慢性肝不全よりも肝組織中のCXCL877濃度が更に高い。一方、慢性肝不全においては、健常者と比較して、肝臓中のカセプシンL濃度が高いが、劇症肝不全では、健常者よりも肝臓中のカセプシンL濃度はむしろ低い。このような基準に基づき、劇症肝不全の患者を、健常者や慢性肝不全から識別することが可能である。また、劇症肝不全の重症度が高い程、肝組織中のCXCL877濃度が高いので、このような基準に基づき、劇症肝不全の重症度の診断が可能となる。本発明により、劇症肝不全の早期診断が可能となるので、被験者が劇症肝不全を発症している可能性が高い、或いは、被験者の劇症肝不全の重症度が高いと判定された場合、該被験者の肝移植施設への救急搬送、肝移植のドナー確保等の肝移植の準備に早急に着手することができる。また、当該被験者に、早急に肝移植を施すことにより、劇症肝不全の予後を大きく改善することができる。また、本発明を、被験者が急性の肝不全のみならず慢性肝不全の急性増悪、肝移植後の移植片不全症例でもその重症度診断に用いることも期待できる。
　また、本発明により、劇症肝不全の患者にカセプシンLを補充し、CXCL877のCXCL872への変換を促進する、という新たな機序に基づく劇症肝不全の予防又は治療技術が提供される。カセプシンL補充は、病因物質である肝障害性サイトカイン（CXCL877）を肝再生因子(CXCL872)に変換できるため、劇症肝不全における革新的な治療となる。カセプシンLのプロテアーゼ活性はアミノ酸配列に特異的であり、このことは分子標的治療薬の開発の点でも有利である。
劇症肝不全の肝組織におけるCXCL8、GRO及びMCP-1のタンパク質発現上昇。 CXCL877特異的な検出アッセイシステムの確立。（1）ウェスタンブロッティング、（2）ELISA、（3）免疫組織化学。（3）は正常（A、B）、胆道閉鎖症（C、D）、及び劇症肝不全（E、F）の肝臓におけるCXCL877の発現を示す。Clv、中心静脈；PV、門脈；A、動脈。 劇症肝不全の肝組織におけるCXCL877濃度の上昇及びカセプシンL濃度の低下。左及び真ん中のグラフは、健常肝、慢性肝不全及び劇症肝不全の肝組織中のCXCL877濃度（左）及びカセプシンL濃度（右）を示す。右のグラフは、劇症肝不全（超急性、亜急性、急性）及び慢性肝不全の肝組織におけるCXCL877濃度及びカセプシンL濃度の分布を示す。 劇症肝不全（超急性、亜急性、急性）及び慢性肝不全の肝組織におけるCXCL877濃度及びカセプシンL濃度の分布の模式図。 カセプシンLによるCXCL877のCXCL872への変換。 CXCL877、CXCL872、及びCXCL877をカセプシンLで処理した産物の肝細胞の細胞増殖（1）及びアポトーシス（2）に対する効果。
1．劇症肝不全の検査方法
　本発明は、以下の工程を含む、劇症肝不全の検査方法を提供するものである：
（1）被験者から単離された生体試料における、CXCL877及びカセプシンLの各タンパク質発現量を測定すること；並びに
（2）（1）において測定した含有量と、劇症肝不全の発症可能性及び／又は重症度とを相関付けること。
超急性型：黄疸出現から7日以内に脳症発症。
急性型：黄疸出現から8～28日に脳症が出現。
亜急性型：発症4週以降に脳症が出現。
超急性型＞急性型＞亜急性型の順で劇症肝不全の急性度（即ち、疾患の進行の速さ）が高い。劇症肝不全は、急性度が高い程、肝移植の必要性が高くなるため、その重症度も高くなる。この意味で、本明細書において用語「急性度」と「重症度」とは相互に置換可能に使用される。
　本発明の方法における被験者は、ヒトである。特に、劇症肝不全に罹患していることが疑われるヒト及び／又は劇症肝不全に罹患しているヒトが、被験者となり得る。劇症肝不全に罹患していることが疑われるヒトとしては、具体的には、肝不全又は肝炎の症状を呈するヒト、肝炎ウイルス感染者、慢性肝不全の経過中に急性増悪した患者、突然に劇症肝不全の症状を発症したヒト等が挙げられる。
　本発明の方法において使用する生体試料としては、肝組織、胆汁、腹腔液、血液、血清、血漿、骨髄等を挙げることができるが、これらに限定されない。好ましくは、肝組織を用いる。肝組織は、バイオプシー等の周知の方法により、容易に被験者から単離することが出来る。
　本発明の方法においては、被験者から単離された生体試料における、CXCL877及びカセプシンLの各タンパク質発現量を測定する（工程（1））。
　CXCL877は、公知のケモカインCXCL8（IL-8ともいう）のアイソタイプの1つであり、77アミノ酸からなる。ヒトCXCL877の代表的なアミノ酸配列を、配列番号1に示す。CXCL8の別のアイソタイプとして、72アミノ酸からなるCXCL872が存在する。ヒトCXCL872の代表的なアミノ酸配列を、配列番号2に示す。CXCL877は、CXCL872には存在しない5アミノ酸（AVLPR、配列番号3）からなる付加配列をN末端に有している点で、CXCL872とは異なる。
　カセプシンLは、公知のシステインプロテアーゼである。ヒトカセプシンLの代表的なアミノ酸配列を配列番号5に、ヒトカセプシンLの代表的なcDNA配列を配列番号4に、それぞれ示す。配列番号5で表されるアミノ酸配列は、ヒトカセプシンLのプレプロタンパク質であり、第1～17アミノ酸からなるシグナル配列の切断によりプレプロカセプシンLからプロカセプシンL（配列番号5における第18～333アミノ酸）へ変換され、更に自己触媒的プロセシング（プロ領域の切断を含む分子内切断）により、プロカセプシンLから、重鎖（配列番号5における第114～288アミノ酸）及び軽鎖（配列番号5における第292～333アミノ酸）からなる成熟カセプシンLに変換される。本発明においては、成熟カセプシンL単独；又はプレプロカセプシンL、プロカセプシンL、及び成熟カセプシンLの総量が測定される。
　CXCL877及びカセプシンLの各タンパク質発現量の測定方法は、特に限定されないが、例えば、各マーカータンパク質に特異的に結合する抗体（CXCL877に特異的に結合する抗体、カセプシンLに特異的に結合する抗体）を用いた免疫学的測定法、トリプシン等のエンドペプチダーゼによる限定分解と質量分析とを組み合わせた方法（例、MALDI-TOF MS等）等を挙げることが出来るが、これらに限定されない。
　免疫学的手法においては、被検試料中の抗原量に対応した抗体－抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線と比較することにより、被検試料中の抗原量を算出する。免疫学的手法としては、サンドイッチ法、競合法、イムノメトリック法、ネフメトリー法、ウェスタンブロッティング、凝集法等を挙げることができる。
　サンドイッチ法は測定対象の抗原と特異的に結合する2種類の抗体を使用する方法であり、例えば、片方の抗体をプレートやビーズ等の固相に固定化したものに試料溶液を反応させ、試料中の抗原を固相上の抗体と結合させた後、酵素、ビオチン、放射性同位元素、蛍光物質等で標識したもう一方の抗体を反応させて、固相上の抗体と結合した抗原にさらに該標識抗体を結合させ、該標識抗体の結合量を標識物質を利用して測定し、その結合量から本抗原を定量する方法があげられる。例えば、5～10点の濃度を決めた抗原の溶液を調製し、この溶液を試料溶液とした場合の、標識抗体への結合量を測定して、抗原の濃度と標識の結合量をプロットした検量線を作成し、抗原を定量する試料溶液についての、標識抗体の結合量を検量線にあてはめることにより、試料溶液の抗原を定量することができる。
　競合法では、被検試料中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させた後、未反応の標識抗原（F）と、抗体と結合した標識抗原（B）とを分離し（B/F分離）、B，Fいずれかの標識量を測定し、被検試料中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、B/F分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第2抗体などを用いる液相法、および、第1抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第1抗体は可溶性のものを用い第2抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
　イムノメトリック法では、被検試料の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検試料中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させた後、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検試料中の抗原量を定量する。
　ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検試料中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合には、レーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
　ウェスタンブロットは、試料に含まれるタンパク質およびペプチドをSDS－ポリアクリルアミドゲルで分離した後、ゲルからポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜、ニトロセルロース膜等にタンパク質およびペプチドをブロットし、酵素、ビオチン、放射性同位元素等で標識した抗体を反応させた後、標識物質を利用して抗体を検出し、膜上の抗原を検出する方法である。
　凝集法は、抗体を固定化したラテックス等の粒子と、試料溶液とを反応させて、試料中の抗原に粒子上の抗体が結合することにより生ずる粒子の凝集を、吸光度の測定により検出または定量する方法である。
　本明細書において、抗体の抗原Agへの「特異的な結合」とは、抗原抗体反応における、抗体の抗原Agに対する結合親和性についてのKD値が1×10-7M以下（好ましくは、1×10-8M以下、1×10-9M以下、1×10-10M以下、1×10-11M以下）であることを意味する。
　本明細書において、「抗体が抗原Agに対して特異的に結合しない」とは、抗原抗体反応における、抗体の抗原Agに対する結合親和性についてのKD値が1×10-5M以上（好ましくは、1×10-4M以上、1×10-3M以上、1×10-2M以上、1×10-1M以上）であることを意味する。
　上記各マーカータンパク質に特異的に結合する抗体（CXCL877に特異的に結合する抗体、カセプシンLに特異的に結合する抗体）は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよく、周知の方法により作成することができる。また、該抗体には完全抗体分子だけでなくその結合性断片も包含される。結合性断片とは、特異的結合活性を有する前述の抗体の一部分の領域を意味する。結合性断片としては例えばF（ab’）2、Fab’、Fab、Fv、sFv、dsFv、sdAb等が挙げられる。例えば、ポリクローナル抗体は、上記タンパク質又はその部分ペプチド（必要に応じて、ウシ血清アルブミン、KLH（Keyhole Limpet Hemocyanin）等のキャリアータンパク質に架橋した複合体とすることもできる）を抗原として、市販のアジュバント（例えば、完全または不完全フロイントアジュバント）とともに、動物の皮下あるいは腹腔内に2～3週間おきに2～4回程度投与し（部分採血した血清の抗体価を公知の抗原抗体反応により測定し、その上昇を確認しておく）、最終免疫から約3～約10日後に全血を採取して抗血清を精製することにより取得できる。抗原を投与する動物としては、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ハムスターなどの哺乳動物が挙げられる。
　また、モノクローナル抗体は、細胞融合法等により作成することができる。例えば、上記各マーカータンパク質もしくはその部分ペプチドを市販のアジュバントと共にマウスに2～4回皮下あるいは腹腔内に投与し、最終投与の約3日後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、白血球を採取する。この白血球と骨髄腫細胞（例えば、NS-1，P3X63Ag8など）を細胞融合して該ペプチドに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。細胞融合はPEG法、電圧パルス法等により実施することができる。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、周知のEIAまたはRIA法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、培養上清中から検出することにより選択できる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養は、インビトロ、またはマウスもしくはラット、このましくはマウス腹水中等のインビボで行うことができ、抗体はそれぞれハイブリドーマの培養上清および動物の腹水から取得することができる。測定系の安定性の観点からは、モノクローナル抗体が好適に用いられる。
　上記各マーカータンパク質へ特異的に結合する抗体（CXCL877に特異的に結合する抗体、カセプシンLに特異的に結合する抗体）が認識するエピトープは、当該マーカータンパク質を免疫学的方法により定量可能な限り特に限定されない。
　ここで、CXCL877のタンパク質発現量の測定にあたっては、CXCL877とCXCL872とを区別し、CXCL877とCXCL872のタンパク質発現量の合計値ではなく、（CXCL872のタンパク質発現量を含まない）CXCL877単独のタンパク質発現量を測定することが肝要である。CXCL877とCXCL872とは、肝細胞に対する生理活性が異なり、CXCL877は肝細胞のアポトーシスを誘導するが、CXCL872は細胞増殖を誘導し、この肝細胞アポトーシス誘導因子であるCXCL877と劇症肝不全の発症可能性及び重症度が相関するからである。
　免疫学的測定法により、CXCL877のタンパク質発現量を測定する場合、その測定に用いるCXCL877に特異的に結合する抗体としては、CXCL872とCXCL877の両方に特異的に結合する抗体を用いても、CXCL877にのみ特異的に結合し、CXCL872へは特異的に結合しない抗体を用いてもよい。CXCL872とCXCL877の両方に特異的に結合する抗体としては、CXCL872とCXCL877の双方に共通する領域（即ち、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなる領域）内にエピトープを有する抗体を挙げることが出来る。CXCL877にのみ特異的に結合し、CXCL872へは特異的に結合しない抗体としては、CXCL877のN末端の5アミノ酸（即ち、配列番号3で表されるアミノ酸配列からなる領域）の一部又は全部をエピトープ内に含む抗体を挙げることができる。そのような特定のエピトープを有する抗体は、所望のエピトープを含む抗原を免疫原として用いて、上述の抗体作成プロセスを実施することにより得ることが出来る。CXCL872とCXCL877の両方に特異的に結合する抗体を用いる場合、CXCL872とCXCL877とを物性（分子量、等電点等）に基づき分離する工程を含む、免疫学的測定法を採用することにより、CXCL877単独のタンパク質発現量を測定することが可能である。例えば、ウェスタンブロッティングにより、電気泳動でCXCL872とCXCL877とを分離し、CXCL872とCXCL877の両方に特異的に結合する抗体で、CXCL872及びCXCL877の双方のバンドを検出し、分子量の差に基づきCXCL877のバンドのみを定量することにより、CXCL877単独のタンパク質発現量を測定することができる。但し、CXCL872とCXCL877とを物性に基づき分離する操作は、煩雑であるので、このような分離操作を要することなく、CXCL877単独のタンパク質発現量を測定できれば、操作が簡便であり、望ましい。このような、観点から、CXCL877にのみ特異的に結合し、CXCL872へは特異的に結合しない抗体（例えば、CXCL877のN末端の5アミノ酸の一部又は全部をエピトープ内に含む、CXCL87に特異的に結合する7抗体）が、免疫学的測定法において好適に用いられる。
　CXCL877にのみ特異的に結合し、CXCL872へは特異的に結合しない抗体を用いる場合、CXCL872とCXCL877の両方に特異的に結合する抗体を併用してもよい。抗原の捕捉と、捕捉した抗原の検出に、それぞれ異なるエピトープを認識する抗体を組み合わせて用いて免疫学的測定法を実施することにより、高い特異性で抗原の量を測定することが可能だからである。例えば、CXCL877の捕捉に、CXCL877にのみ特異的に結合し、CXCL872へは特異的に結合しない抗体、及びCXCL872とCXCL877の両方に特異的に結合する抗体のいずれか一方の抗体を使用し、捕捉した抗原の検出に他方の抗体を使用することにより、高い特異性でCXCL877のタンパク質発現量を測定することが可能である。
　プレプロカセプシンL及びプロカセプシンLは、その内部に成熟カセプシンLを含むので、成熟カセプシンL内にエピトープを有する抗体は、通常、プレプロカセプシンL、プロカセプシンL、及び成熟カセプシンLに特異的に結合する。したがって、免疫学的測定法により、カセプシンLのタンパク質発現量を測定する場合、その測定に用いる抗体として、成熟カセプシンL内にエピトープを有する、プレプロカセプシンL、プロカセプシンL、及び成熟カセプシンLに特異的に結合する抗体を用いることにより、プレプロカセプシンL、プロカセプシンL、及び成熟カセプシンLの総量を測定することができる。但し、成熟カセプシンL内のエピトープであって、プロ領域により、プレプロカセプシンL及びプロカセプシンLではマスクされており、成熟化により、成熟カセプシンLにおいてのみ現れるエピトープを有する抗体は、成熟カセプシンLのみに特異的に結合し、プレプロカセプシンL及びプロカセプシンLに特異的に結合しない。従って、免疫学的測定法により、カセプシンLのタンパク質発現量を測定する場合、その測定に用いる抗体として、成熟カセプシンLのみに特異的に結合する抗体を用いることにより、成熟カセプシンL単独の発現量を測定することが出来る。
　成熟化により、成熟カセプシンLにおいてのみ現れるエピトープにおいて、成熟カセプシンLに特異的に結合する抗体と、成熟カセプシンL内のエピトープにおいて、プレプロカセプシンL、プロカセプシンL、及び成熟カセプシンLに特異的に結合する抗体とを併用してもよい。例えば、カセプシンLの捕捉に、成熟カセプシンLにおいてのみ現れるエピトープにおいて、成熟カセプシンLに特異的に結合する抗体、及び成熟カセプシンL内のエピトープにおいて、プレプロカセプシンL、プロカセプシンL、及び成熟カセプシンLに特異的に結合する抗体のいずれか一方の抗体を使用し、捕捉した抗原の検出に他方の抗体を使用することにより、高い特異性で成熟カセプシンL単独のタンパク質発現量を測定することが可能である。
　尚、カセプシンLのタンパク質発現量は、カセプシンLの生理活性（即ち、プロテアーゼ活性）を測定することによって定量してもよい。プレプロカセプシンL及びプロカセプシンLは非活性なので、カセプシンLの生理活性（即ち、プロテアーゼ活性）を測定することにより、成熟カセプシンL単独のタンパク質発現量を測定することができる。カセプシンLの生理活性は、カセプシンL含有試料を、カセプシンLの基質（例、カセプシンLのペプチド基質（例、FR、HRYR）に、カセプシンLによる消化により発色、蛍光又は発光を生じ得るように、発色、蛍光又は発光色素を結合させた合成基質（例、Ac-FR-AFC、Ac-HRYR-ACC）、CXCL877）と反応させて、基質の分解産物の量を、発色等を指標に測定することにより、定量することができる。
　次に、工程（1）において測定した含有量と、被験者の劇症肝不全の発症可能性及び／又は重症度とを相関付ける。
　生体試料は、サンプル間の総タンパク質濃度の変動が大きいので、相関付けに際しては、工程（1）において測定したタンパク質発現量を補正することが好ましい。補正の基準としては、(i)総タンパク質濃度、(ii) 生体試料の重量、(iii)生体試料の体積等を挙げることができるが、好ましくは、総タンパク質濃度を基準に補正する。例えば、工程（1）において測定した生体試料中のCXCL877及びカセプシンLの各タンパク質発現量を、当該試料の総タンパク質濃度で除することにより、単位タンパク質量あたりの相対的発現量を算出し、この相対的含有量と被験者の劇症肝不全の発症可能性及び／又は重症度とを相関付ける。従って、総タンパク質濃度を基準に補正する場合、工程（1）においては、各生体試料の総タンパク質濃度を併せて測定することが好ましい。
（劇症肝不全の発症可能性の判定）
　例えば、測定したCXCL877及びカセプシンLの各タンパク質発現量を、健常者及び／又は慢性肝不全患者における当該マーカータンパク質の発現量と比較する。あるいは、測定したCXCL877及びカセプシンLの各タンパク質発現量を、あらかじめ求めておいた、健常者及び／又は慢性肝不全患者における当該マーカータンパク質の発現量の平均値、劇症肝不全の患者における当該マーカータンパク質の発現量の平均値、劇症肝不全患者と、健常者及び／又は慢性肝不全患者における当該マーカータンパク質発現量の相関図（分布図）などと比較してもよい。各マーカータンパク質の発現量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行われる。
　後述の実施例に示すように、劇症肝不全では、健常者と比較して、CXCL877濃度が高く、カセプシンL濃度は低い。従って、このような相関（CXCL877濃度と劇症肝不全の発症可能性との間の正の相関、及びカセプシンL濃度と劇症肝不全の発症可能性との間の負の相関）に基づき、劇症肝不全の発症可能性を判定することが出来る。例えば、工程（1）において測定したCXCL877及びカセプシンLの各タンパク質発現量を、CXCL877発現量が、相対的に高く、且つカセプシンL発現量が、相対的に低い場合には、劇症肝不全を発症している可能性が高いという基準と比較する。被験者におけるCXCL877発現量が、相対的に高く、且つカセプシンL発現量が、相対的に低い場合には、被験者は劇症肝不全を発症している可能性が高いと判定することが出来る。
　また、後述の実施例に示すように、慢性肝不全においても、健常者と比較して、CXCL877濃度が高いが、劇症肝不全では、慢性肝不全よりもCXCL877濃度が更に高い。一方、慢性肝不全においては、健常者と比較して、カセプシンL濃度が高いが、劇症肝不全では、健常者よりもカセプシンL濃度はむしろ低い。従って、このような相関に基づき、劇症肝不全を慢性肝不全から識別することが期待できる。例えば、被験者におけるCXCL877発現量が、慢性肝不全患者よりも相対的に高く、且つカセプシンL発現量が、健常者よりも相対的に低い場合には、慢性肝不全ではなく、劇症肝不全を発症している可能性が高いと判定することが出来る。一方、被験者におけるCXCL877発現量が、健常者と比較して高いものの、カセプシンL発現量も健常者と比較して高い場合には、劇症肝不全ではなく、慢性肝不全を発症している可能性が高いと判定することが出来る。
　また、劇症肝不全のみならず、慢性肝不全の急性増悪や肝移植後の移植片拒絶等の早期診断への応用も期待できる。
　また、CXCL877及びカセプシンLの各タンパク質発現量のカットオフ値をあらかじめ設定しておき、測定した発現量とこのカットオフ値とを比較してもよい。例えば、CXCL877の発現量が前記カットオフ値を上回り、且つ、カセプシンLの発現量がカットオフ値を下回る場合には、被験者は劇症肝不全を発症している可能性が高いと判定することが出来る。更に、CXCL877のカットオフ値として、劇症肝不全と慢性肝不全との識別を可能にする値を設定した場合、CXCL877の発現量が当該カットオフ値を上回り、且つ、カセプシンLの発現量がカットオフ値を下回る場合には、被験者は、慢性肝不全ではなく、劇症肝不全を発症している可能性が高いと判定することが出来る。
　「カットオフ値」は、その値を基準として疾患の診断を行った場合に、高い診断感度及び高い診断特異度の両方を満足できる値である。例えば、劇症肝不全の患者で高い陽性率を示し、かつ、健常者及び／又は慢性肝不全の患者で高い陰性率を示す、CXCL877及びカセプシンLの各タンパク質発現量をカットオフ値として設定することが出来る。
　カットオフ値の算出方法は、この分野において周知である。例えば、劇症肝不全患者、及び健常者及び／又は慢性肝不全患者の、CXCL877及びカセプシンLの各タンパク質発現量を測定し、測定された値における診断感度および診断特異度を求め、これらの値に基づき、市販の解析ソフトを使用してROC（Receiver Operating Characteristic）曲線を作成する。そして、診断感度と診断特異度が可能な限り100％に近いときの値を求めて、その値をカットオフ値とすることができる。また、例えば、検出された値における診断効率（全症例数に対する、劇症肝不全患者を「劇症肝不全」と正しく判定した症例と、健常者（又は慢性肝不全患者）を「健常」（又は慢性肝不全）と正しく判定した症例との合計数の割合）を求め、最も高い診断効率が算出される値をカットオフ値とすることができる。
　一例として、CXCL877のカットオフ値として、健常者におけるCXCL877のタンパク質発現量の平均値＋SD～平均値＋3SD（例、平均値＋2SD）を設定し、カセプシンLのカットオフ値として、健常者におけるカセプシンLのタンパク質発現量の平均値-SD～平均値-3SD（例、平均値-2SD）を設定する。CXCL877の発現量が前記カットオフ値を上回り、且つ、カセプシンLの発現量がカットオフ値を下回る場合には、被験者は劇症肝不全を発症している可能性が高いと判定することが出来る。
　他の一例として、CXCL877のカットオフ値として、慢性肝不全におけるCXCL877のタンパク質発現量の平均値＋SD～平均値＋3SD（例、平均値＋2SD）を設定し、カセプシンLのカットオフ値として、慢性肝不全におけるカセプシンLのタンパク質発現量の平均値-SD～平均値-3SD（例、平均値-2SD）を設定する。CXCL877の発現量が前記カットオフ値を上回り
、且つ、カセプシンLの発現量がカットオフ値を下回る場合には、被験者は慢性肝不全ではなく、劇症肝不全を発症している可能性が高いと判定することが出来る。
　更なる一例として、CXCL877のカットオフ値として、慢性肝不全におけるCXCL877のタンパク質発現量の平均値＋SD～平均値＋3SD（例、平均値＋2SD）を設定し、カセプシンLのカットオフ値として、健常者におけるカセプシンLのタンパク質発現量の平均値-SD～平均値-3SD（例、平均値-2SD）を設定する。CXCL877の発現量が前記カットオフ値を上回り、且つ、カセプシンLの発現量がカットオフ値を下回る場合には、被験者は健常者又は慢性肝不全ではなく、劇症肝不全を発症している可能性が高いと判定することが出来る。
（劇症肝不全の重症度の判定）
　例えば、測定したCXCL877のタンパク質発現量を、あらかじめ求めておいた、劇症肝不全の重症度とCXCL877のタンパク質発現量との相関図（分布図）と比較する。
　後述の実施例に示すように、劇症肝不全では、重症度が高くなるほど、CXCL877濃度が高い。従って、上述の判定において劇症肝不全を発症している可能性が高いと判断された患者、及び劇症肝不全患者について、このような相関（CXCL877濃度と劇症肝不全の重症度との間の正の相関）に基づき、劇症肝不全の重症度を判定することが出来る。例えば、工程（1）において測定したCXCL877及びカセプシンLの各タンパク質発現量を、CXCL877発現量が、相対的に高い場合には、劇症肝不全の重症度が高いという基準と比較する。被験者におけるCXCL877発現量が、相対的に高い場合には、被験者の劇症肝不全の重症度は高く、逆に、CXCL877発現量が、相対的に低い場合には、劇症肝不全の重症度は低いと判定することが出来る。
　慢性肝不全と劇症肝不全とは、従来の血清生化学検査および臨床症状の推移等に基づき区分することができるが、そのような従来の検査が適用困難な緊急を要する場合、例えば、突然に劇症肝不全の症状を発症した患者や、慢性肝不全が劇症転化した患者において、カセプシンLとCXCL877の発現量を検討することで、確度の高い劇症肝不全の発症可能性及び／又は重症度の臨床診断が可能となる。
　被験者が劇症肝不全を発症している可能性が高い、或いは、被験者の劇症肝不全の重症度が高いと判定された場合、該被験者の肝移植施設への救急搬送、肝移植のドナー確保等の肝移植の準備に早急に着手することができる。また、当該被験者に、早急に肝移植を施すことにより、劇症肝不全の予後を大きく改善することができる。従って、本発明により、確度の高い治療方針（肝移植の要否等）の決定を行うことができる。
2．劇症肝不全の診断用キット
　本発明は、以下の物質を含む、劇症肝不全の診断用キットを提供するものである：
（1）CXCL877に特異的に結合する抗体、及び
（2）カセプシンLに特異的に結合する抗体、又はカセプシンLの基質。
　本発明の診断用キットを用いれば、上記本発明の検査方法により、劇症肝不全の発症可能性及び／又は重症度を診断することが可能である。
　各マーカータンパク質、抗体を含む各用語の定義は、特に言及しない限り、上記1に記載したものと同一である。
　各抗体が認識するエピトープは、上記マーカータンパク質を免疫学的方法により定量可能な限り特に限定されない。
　（1）のCXCL877に特異的に結合する抗体としては、CXCL872とCXCL877の両方に特異的に結合する抗体（例、CXCL872とCXCL877の双方に共通する領域（即ち、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなる領域）内にエピトープを有する抗体）を用いても、CXCL877にのみ特異的に結合し、CXCL872へは特異的に結合しない抗体（例、CXCL877のN末端の5アミノ酸（即ち、配列番号3で表されるアミノ酸配列からなる領域）の一部又は全部をエピトープ内に含む抗体）を用いてもよい。物性に基づくCXCL872とCXCL877の分離操作を要することなく、CXCL877単独のタンパク質発現量を測定する観点から、（1）の抗体は、好ましくは、CXCL877にのみ特異的に結合し、CXCL872へは特異的に結合しない抗体（例、CXCL877のN末端の5アミノ酸の一部又は全部をエピトープ内に含む抗体）である。
　上述のように、高い特異性で免疫学的測定法を行う観点から、抗原の捕捉と、捕捉した抗原の検出のために、（1）CXCL877に特異的に結合する抗体及び（2）のカセプシンLに特異的に結合する抗体のそれぞれについて、異なるエピトープを認識する複数の抗体を組み合わせて用いることが好ましい。
　例えば、（1）の抗体として、CXCL877にのみ特異的に結合し、CXCL872へは特異的に結合しない抗体（例、CXCL877のN末端の5アミノ酸の一部又は全部をエピトープ内に含む抗体）と、CXCL872とCXCL877の両方に特異的に結合する抗体（例、CXCL872とCXCL877の双方に共通する領域（即ち、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなる領域）内にエピトープを有する抗体）との組み合わせを用いる。このような組み合わせを用いることにより、CXCL877のタンパク質発現量を高い特異性で測定することが可能である。
　本発明の診断用キットに含まれる抗体は、標識剤により標識されていてもよい。標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質、ビオチンなどが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、125I、131I、3H、14Cなどが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β－ガラクトシダーゼ、β－グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。
　上記抗体は、適切な支持体の上に固相化して提供してもよい。支持体としては、当該分野で通常用いられている支持体であれば特に限定されず、例えば、マイクロプレート（例、96穴プレート）、ビーズ、メンブレン（例えば、ナイロン膜）、アレイチップなどが挙げられる。
　本発明の診断用キットは、肝組織のバイオプシーに用いる針を更に含んでいてもよい。
　本発明の診断用キットは、免疫学的測定方法の種類に応じて、標識二次抗体、発色基質、ブロッキング液、洗浄緩衝液、ELISAプレート、ブロッティング膜等をさらに含むことができる。
　本発明の診断用キットに含まれる各構成要素は、適宜、各々別個に（あるいは可能であれば混合した状態で）水もしくは適当な緩衝液（例：TEバッファー、PBSなど）中に適当な濃度となるように溶解されるか、あるいは凍結乾燥された状態で、適切な容器中に収容される。
3．劇症肝不全の予防又は治療剤
　後述する実施例において示すように、カセプシンLはCXCL877を切断し、CXCL872に変換する。CXCL877は肝細胞に対してアポトーシスを誘導するが、CXCL872は肝細胞に対してむしろ細胞増殖因子として作用する。更に、劇症肝不全においては、肝組織中のカセプシンLの発現レベルが極低値であり、このことが、CXCL877のクリアランス（CXCL872への変換）の低下を招き、肝障害を増悪させる要因となっている。従って、カセプシンL又はその発現ベクターを投与して、肝組織において、カセプシンLを補充することにより、CXCL877の肝再生因子(CXCL872)への変換を促進することにより、劇症肝不全を予防又は治療することが期待できる。そこで、本発明は、カセプシンL又はその発現ベクターの有効量を含む、劇症肝不全の予防又は治療剤を提供する。
　プロカセプシンLは、自己触媒的プロセシングにより、成熟カセプシンLに変換されるので、カセプシンL（タンパク質）を投与する場合、投与するカセプシンLとして、プロカセプシンL及び成熟カセプシンLから選択されるいずれの型を用いてもよいが、好ましくは、成熟カセプシンLを用いる。一方、成熟カセプシンLは、ヘテロ二量体なので、両方の鎖を別々の又は同一のベクターで発現させて、生体内でヘテロ二量体を形成させることも、技術的には可能であるが、発現系が複雑になるので、プレプロカセプシンL又はプロカセプシンLをコードするポリヌクレオチドを含む、プレプロカセプシンL又はプロカセプシンLの発現ベクターを投与するのが好ましい。発現したプレプロカセプシンL又はプロカセプシンLは、シグナル配列の切断及び／又は自己触媒的プロセシングにより、成熟カセプシンLに変換される。
　当該発現ベクターにおいては、カセプシンL（好ましくは、プレプロカセプシンL又はプロカセプシンL）をコードするヌクレオチド配列（例えば、配列番号4で表されるヌクレオチド配列）を含むポリヌクレオチド（好ましくはDNA）が、投与対象であるヒトの細胞（好ましくは、肝細胞）内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターに機能的に連結されている。
　当該発現ベクターにおいて使用されるプロモーターとしては、通常、polII系プロモーターが使用される。具体的には、SV40由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスLTR等のウイルスプロモーター、β－アクチン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子プロモーター等を挙げることが出来る。また、肝細胞特異的プロモーターを用いることにより、肝細胞に特異的にカセプシンLを発現させ、これを肝組織特異的に補充することが出来る。肝細胞特異的プロモーターとしては、アルブミンプロモーター等を挙げることが出来る。
　当該発現ベクターは、好ましくはカセプシンLをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有する。さらに、形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含有することもできる。
　当該発現ベクターに使用されるベクターの種類は特に制限されないが、ヒトへの投与に好適なベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等のウイルスベクター、及びプラスミドベクターが挙げられる。このうち、アデノウイルスは、遺伝子導入効率が極めて高く、非分裂細胞にも導入可能である等の利点を有する。但し、導入遺伝子の宿主染色体への組込みは極めて稀であるので、遺伝子発現は一過性で通常約4週間程度しか持続しない。治療効果の持続性を考慮すれば、比較的遺伝子導入効率が高く、非分裂細胞にも導入可能で、且つ逆位末端繰り返し配列（ITR）を介して染色体に組み込まれ得るアデノ随伴ウイルスの使用もまた好ましい。
　本発明の予防又は治療剤は、有効量のカセプシンL又はこれを発現し得る発現ベクターが肝組織（好ましくは、劇症肝不全の疾患部位）に到達し得るように、経口的又は非経口的に、その必要がある投与対象ヒトへ投与される。投与対象としては、劇症肝不全の患者、劇症肝不全を発症していることが疑われる患者（例えば、上述の本発明の検査方法において、劇症肝不全を発症している可能性が高いと判断された患者）、劇症肝不全を発症する可能性があるヒト（例えば、劇症肝不全ではない肝不全の患者、肝炎ウイルス感染者）等を挙げることが出来る。非経口的投与は、通常は、注射剤等の形態で静脈内、動脈内、皮下、皮内、筋肉内、腹腔内への投与により行われる。肝組織（好ましくは、劇症肝不全の疾患部位）内に、直接、局所的に、カセプシンL又はこれを発現し得る発現ベクターを投与してもよい。
　本発明の予防又は治療剤は、カセプシンL又はこれを発現し得る発現ベクターに加え、任意の担体、例えば医薬上許容される担体を含むことができる。
　医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル等の滑剤、クエン酸、メントール等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水等の希釈剤、ベースワックス等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
　発現ベクターの細胞内への導入を促進するために、本発明の予防又は治療剤は更に核酸導入用試薬を含むことができる。発現ベクターがウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターである場合には、遺伝子導入試薬としてはレトロネクチン、フィブロネクチン、ポリブレン等を用いることができる。また、発現ベクターがプラスミドベクターである場合は、リポフェクチン、リポフェクタミン（lipofectamine）、DOGS（トランスフェクタム）、DOPE、DOTAP、DDAB、DHDEAB、HDEAB、ポリブレン、あるいはポリ（エチレンイミン）(PEI)等の陽イオン性脂質を用いることが出来る。
　経口投与に好適な製剤としては、液剤、カプセル剤、サッシェ剤、錠剤、懸濁液剤、乳剤等を挙げることができる。
　非経口的な投与（例えば、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分および医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。
　医薬組成物中の上述のポリヌクレオチドの含有量は、例えば、医薬組成物全体の約0．001ないし100重量％である。
　本発明の予防又は治療剤の投与量は、有効成分の活性や種類、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なり一概に云えないが、通常、成人1日あたり有効成分量として約0．001～約500 mg/kg程度である。
　カセプシンLは、肝細胞に対するアポトーシス誘導因子であるCXCL877を、細胞増殖因子であるCXCL872に変換することにより、劇症肝不全における肝細胞の障害を抑制するので、本発明の予防又は治療剤を、劇症肝不全の患者、劇症肝不全を発症していることが疑われる患者（例えば、上述の本発明の検査方法において、劇症肝不全を発症している可能性が高いと判断された患者）、劇症肝不全を発症する可能性があるヒト（例えば、劇症肝不全ではない肝不全の患者、肝炎ウイルス感染者）等に投与することにより、劇症肝不全を予防又は治療することが出来る。
4．劇症肝不全の予防又は治療剤の候補物質のスクリーニング方法
　上述のように、肝組織におけるカセプシンLの補充が、劇症肝不全を予防又は治療することが期待できるので、カセプシンLの発現を促進する物質をスクリーニングすることにより、劇症肝不全の予防又は治療剤の候補物質を得ることが出来る。そこで、本発明は、以下の工程を含む、劇症肝不全の予防又は治療剤の候補物質のスクリーニング方法を提供する：
（1）被検物質が、カセプシンLの発現を促進するか否か評価すること、及び
（2）カセプシンLの発現を促進した被検物質を、劇症肝不全の予防又は治療剤の候補物質として選択すること。
　一実施形態では、本発明のスクリーニング方法は、下記の工程（a）～（c）を含む：
（a）被検物質とカセプシンLの発現を測定可能な細胞とを接触させる工程；
（b）被検物質を接触させた細胞におけるカセプシンLの発現量を測定し、該発現量を被検物質を接触させない対照細胞におけるカセプシンLの発現量と比較する工程；及び
（c）上記（b）の比較結果に基づいて、カセプシンLの発現を促進した被検物質を劇症肝不全の予防又は治療剤の候補物質として選択する工程。
　スクリーニング方法に供される被検物質は、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。
　上記方法の工程（a）では、被検物質がカセプシンLの発現を測定可能な細胞とインビトロ又はインビボにおいて接触条件下におかれる。インビトロの系においては、カセプシンLの発現を測定可能な細胞に対する被検物質の接触は、カセプシンLの発現を測定可能な細胞を被検物質の存在下で培養することにより行われ得る。インビボの系においては、カセプシンLの発現を測定可能な細胞に対する被検物質の接触は、カセプシンLの発現を測定可能な細胞を含む非ヒト動物（好ましくは、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、サル等の非ヒト哺乳動物）に、被検物質を投与することにより行われる。
　カセプシンLの発現を測定可能な細胞とは、カセプシンL遺伝子の産物、例えば、転写産物、翻訳産物の発現レベルを直接的又は間接的に評価可能な細胞をいう。カセプシンL遺伝子の産物の発現レベルを直接的に評価可能な細胞は、カセプシンLを天然で発現可能な細胞（例、カセプシンLを天然で発現している細胞）であり得、一方、カセプシンL遺伝子の産物の発現レベルを間接的に評価可能な細胞は、カセプシンL遺伝子転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞であり得る。カセプシンLの発現を測定可能な細胞は、動物細胞、例えばマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、サル、ヒト等の哺乳動物細胞、ニワトリ等の鳥類細胞であり得る。
　カセプシンLを天然で発現可能な細胞（例、カセプシンLを天然で発現している細胞）は、カセプシンLを潜在的に発現するものである限り特に限定されない。かかる細胞は、当業者であれば容易に同定でき、初代培養細胞、当該初代培養細胞から誘導された細胞株、市販の細胞株、セルバンクより入手可能な細胞株などを使用できる。カセプシンL遺伝子を天然で発現している細胞としては、例えば、肝細胞、血球細胞等や、これらの細胞の細胞株（HepG2、Huh7、K562等）が挙げられる。劇症肝不全の予防又は治療剤の候補物質をスクリーニングする目的に鑑み、肝臓におけるカセプシンLの発現に寄与する細胞、例えば、肝細胞や、これらの細胞の細胞株（HepG2、Huh7等）が好適に用いられる。
　カセプシンL遺伝子転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞は、カセプシンL遺伝子転写調節領域、当該領域に機能可能に連結されたレポーター遺伝子を含む細胞である。カセプシンL遺伝子転写調節領域、レポーター遺伝子は、発現ベクター中に挿入され得る。カセプシンL遺伝子転写調節領域は、カセプシンL遺伝子の発現を制御し得る領域である限り特に限定されないが、例えば、転写開始点から上流約2kbpまでの領域、あるいは該領域の塩基配列において1以上の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、且つカセプシンL遺伝子の転写を制御する能力を有する領域などが挙げられる。レポーター遺伝子は、検出可能な蛋白質又は検出可能な物質を生成する酵素をコードする遺伝子であればよく、例えばGFP（緑色蛍光蛋白質）遺伝子、GUS（β－グルクロニダーゼ）遺伝子、LUC（ルシフェラーゼ）遺伝子、CAT（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子等が挙げられる。
　カセプシンL遺伝子転写調節領域、当該領域に機能可能に連結されたレポーター遺伝子が導入される細胞は、カセプシンL遺伝子転写調節機能を評価できる限り、即ち、該レポーター遺伝子の発現量が定量的に解析可能である限り特に限定されない。しかしながら、カセプシンL遺伝子に対する生理的な転写調節因子を発現し、カセプシンL遺伝子の発現調節の評価により適切であると考えられることから、該導入される細胞としては、上述のカセプシンLを天然で発現可能な細胞（例、カセプシンLを天然で発現している細胞）が好ましい。
　被検物質とカセプシンLの発現を測定可能な細胞とが接触される培養培地は、用いられる細胞の種類などに応じて適宜選択されるが、例えば、約5～20％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（MEM）、ダルベッコ改変最少必須培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地などである。培養条件もまた、用いられる細胞の種類などに応じて適宜決定されるが、例えば、培地のpHは約6～約8であり、培養温度は通常約30～約40℃であり、培養時間は約12～約72時間である。
　上記方法の工程（b）では、先ず、被検物質を接触させた細胞におけるカセプシンLの発現量が測定される。発現量の測定は、用いた細胞の種類などを考慮し、自体公知の方法により行われ得る。例えば、カセプシンLの発現を測定可能な細胞として、カセプシンLを天然で発現可能な細胞を用いた場合、発現量は、カセプシンL遺伝子の産物、例えば、転写産物又は翻訳産物を対象として自体公知の方法により測定できる。例えば、転写産物の発現量は、細胞からtotal RNAを調製し、RT－PCR、ノザンブロッティング等により測定され得る。また、翻訳産物の発現量は、細胞から抽出液を調製し、免疫学的手法により測定され得る。免疫学的手法としては、上述のものが挙げられる。一方、カセプシンLの発現を測定可能な細胞として、カセプシンL遺伝子転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞を用いた場合、発現量は、レポーターのシグナル強度に基づき測定され得る。
　次いで、被検物質を接触させた細胞におけるカセプシンLの発現量が、被検物質を接触させない対照細胞におけるカセプシンLの発現量と比較される。発現量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被検物質を接触させない対照細胞におけるカセプシンLの発現量は、被検物質を接触させた細胞におけるカセプシンLの発現量の測定に対し、事前に測定した発現量であっても、同時に測定した発現量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した発現量であることが好ましい。
　上記方法の工程（c）では、カセプシンLの発現を促進した被検物質が、劇症肝不全の予防又は治療剤の候補物質として選択される。
　更に、得られた候補物質の効果を生体内において確認してもよい。例えば、該候補物質を劇症肝不全モデル非ヒト哺乳動物（例えば、インビトロ方法で増殖阻害活性が確認された接着性癌細胞を移植した非ヒト哺乳動物）へ投与し、該非ヒト哺乳動物における劇症肝不全の症状をコントロール非ヒト哺乳動物（候補物質を投与しないこと以外の飼育条件が候補物質を投与した劇症肝不全モデル非ヒト哺乳動物と同一）と比較する。劇症肝不全モデルとしては、例えば、BMC Genomics 2010, 11:240等に記載されたConA誘導肝炎モデル等が知られている。そして、比較結果に基づき該非ヒト哺乳動物における劇症肝不全の症状を抑制した候補物質を、生体内における有効性が確認された劇症肝不全の予防又は治療剤として選択することができる。
　本明細書中で挙げられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
　以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
1．劇症肝不全で高値を示すケモカインの同定
　RayBiotech社のプロテインアレイシステム(Human Cytokine Antibody Array 3)を用いて、正常肝臓(生体肝移植ドナー)、小児慢性肝不全、小児劇症肝不全の3群の肝組織で炎症性サイトカインの網羅的解析を行った。その結果、劇症肝不全で高値を示す3つのケモカイン(CXCL8、GRO、MCP-1)を同定し、CXCL8の発現濃度と臨床急性度（進行の速度）とに相関性を認めた（図1）。
2．CXCL877特異的な検出アッセイシステムの確立
（1）ウェスタンブロッティング
　CXCL877のN末端に対するモノクローナル抗体として、N11（eBioscience社）（Journal of immunological methods. 2002;270(1):37-51）を使用した。CXCL8のC末端に対するモノクローナル抗体として、M801（Thermo社）を使用した。
　CXCL877及びCXCL872の二種類のリコンビナント蛋白をSDS電気泳動で分離して、PVDF膜にブロットし、CXCL877のN末端に対するモノクローナル抗体及びCXCL8のC末端に対するモノクローナル抗体でインキュベートし、二次抗体で検出した。結果を図2（1）に示す。CXCL877のN末端に対するモノクローナル抗体を用いた場合、CXCL877が特異的に検出できた。CXCL8のC末端に対するモノクローナル抗体は、CXCL877及びCXCL872の両方に反応したが、分子量の差で、CXCL877とCXCL872とを識別することができた。
（2）酵素免疫測定法(ELISA)
　96ウエルプレートを、上述のCXCL877のN末端に対するモノクローナル抗体、CXCL8のC末端に対するモノクローナル抗体で固相化し、サンドイッチ法による酵素免疫測定法(ELISA)で解析した。即ち、NUNC Maxisorp 96-well プレートに対して、CXCL8のN末端およびC末端に対するマウスモノクローナル抗体をそれぞれ1ウェルあたり2.5 μg/ml(100 μl; 50 mM carbonate buffer pH9.5) 添加し一晩固相化した。洗浄後にタンパク質ライセートおよび標準リコンビナントタンパク質を常温で2時間反応させた。洗浄の後、R&D Human CXCL8/IL-8 Quantikine HS ELISA Kit（HS800）の検出試薬（IL-8 conjugate、substrate、amplifier等）を用いて検出シグナルを求めた。その結果、肝組織中のCXCL877濃度を検出限界10 pg/ml (10～500 pg/ml)で定量解析することに成功した（図2（2））。
（3）免疫組織化学
　健常者及び劇症型肝不全症患者の肝臓組織のパラフィン包埋切片を、上述のCXCL877のN末端に対するモノクローナル抗体でインキュベートし、アルカリフォスファターゼ標識した二次抗体により処理し、ニューフクシン染色により赤色に発色させた。結果を図2（3）に示す。CXCL877は、正常肝及び胆道閉鎖症でも門脈域で弱く発現した。しかしながら、中心静脈の血管壁の肥厚と、周囲の結合組織のCXCL877は、劇症型肝不全症に特異的な所見であった。
3．小児劇症肝不全患者の肝組織中のCXCL877及びカセプシンL濃度の解析
　肝組織を細切断してRayBiotechのCell Lysis Bufferに懸濁してタンパク質を抽出した。上清中のタンパク質濃度をBCA法で定量し、タンパク質濃度を0.1 mg/mlに希釈調整した。同サンプルを用いて、1g liver proteinに含まれるCXCL877タンパク質量をELISA法で導出した。肝組織中のCXCL877 は、健常肝(生体肝移植のドナー)では測定感度以下または低値を示したが、慢性肝不全では軽度上昇しており、その平均値は236 ng (23～670 ng)であった（図3-1左）。そのmean+2SDである630 ngを肝組織CXCL877濃度のカットオフ値として、劇症肝不全症例を解析した。本試験にエントリーした小児劇症肝不全患者、及び慢性肝不全（胆道閉鎖症）患者の年齢（月齢）を下の表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　その結果、小児劇症肝不全8症例中、カットオフ値以上を示す症例は7例(陽性率 88％)であった。そのうち発症から10日以内に肝性昏睡に陥った最重症型の超急性型の4症例は全例3,000 ngを超える高値を示した（図3-1左及び右）。同時にCXCL877濃度を制御しているカセプシンLもELISA法で測定し、健常肝の-2SDの値である875μgをカットオフとした。慢性肝不全では肝組織カセプシンLは高値であったが、劇症肝不全は全例低値であった（図3-1中）。劇症肝不全の進行の速度が速い程、肝組織CXCL877濃度は高かった（図3-1右）。
　以上の結果から、肝生検が施行された症例では、通常の血清生化学および病理学的検索に加え、肝組織中のCXCL877およびカセプシンLの2つのバイオマーカーを測定することで、確度の高い慢性肝不全と劇症肝不全との判別、及び劇症肝不全の重症度診断が可能であることが示された（図3-1右、図3-2）。例えば、肝組織中のCXCL877濃度が3,000 ng以上かつカセプシンLが875μg以下の場合は、最重症型の劇症肝不全症と判断することにより、遅滞なく生体肝移植のバックアップ体制をとり、血液浄化療法を含めた集学的治療の適応判断をすることが出来る。
4．カセプシンLによるCXCL877のCXCL872への変換
　1レーンあたり2μgのCXCL8リコンビナントタンパク質(CXCL877及びCXCL872のコントロール、並びにカセプシンLと30分インキュベートしたCXCL877)を、SDSポリアクリルアミドゲル（15％）を用いた電気泳動で分離し、PVDF膜に転写し、クマシーブリリアントブルーで染色した。CXCL877、CXCL872、及びカセプシンLで処理したCXCL877は分子量の違いで区別できた（図4上）。その後、各バンドを切り出し、エドマン分解によりN末端アミノ酸配列を決定した。その結果、カセプシンLがCXCL877の5番目のアルギニンを切断し、CXCL877をCXCL872に変換したことを確認した(CXCL877が、最初のN末端がSerから始まるCXCL872に変換された)（図4下）。
5．CXCL877とCXCL872の生理活性の比較
　HepG2細胞を用いてCXCL877、CXCL872、及びCXCL877をカセプシンLで処理した産物の細胞増殖に与える影響についてバイオアッセイを行った。具体的には、細胞培養上清に各アイソタイプのCXCL8を添加して3日後の細胞増殖率を、CXCL8非添加コントロールに対する相対的な増殖率として求めた。更に、Promega社のCaspase-Glo3/7を用いて、最終濃度1 ng/mlのCXCL8で処理された細胞のカスパーゼ3/7活性をCXCL8非添加コントロールに対する相対的な活性として求めた。
　その結果、CXCL872はCaspase-活性(細胞アポトーシス)を抑制して濃度依存性に細胞増殖を誘導するが、CXCL877はむしろ細胞アポトーシスを誘導して細胞増殖を抑制した（図5）。カセプシンL処理を受けたCXCL877は、カスパーゼ3活性を抑制し、細胞増殖を誘導した。従って、カセプシンL処理は、CXCL877（アポトーシス誘導因子）をCXCL872（肝細胞増殖因子）に転換することにより、CXCL877による肝細胞のアポトーシスを抑制することが示唆された。
6．成人劇症肝不全における肝組織中のCXCL877及びカセプシンL濃度の解析
　成人劇症肝不全患者10例でもCXCL877とカセプシンLの発現解析を行った。その結果、小児と同様に、血管周囲の結合組織に強いCXCL877の発現局在とカセプシンLの発現低下を認めた。従って、成人劇症肝不全でもCXCL877及びカセプシンLの発現解析が病勢把握に有用であることが示唆された。
7．考察
　劇症肝不全は、急激な肝細胞死により重篤な肝機能障害と多臓器不全を呈する症候群である。本発明者らは、本試験において、線維芽細胞が産生するCXCL877が肝細胞障害因子であることを見出した。慢性肝不全ではCXCL877は門脈域の結合組織に弱く発現するが、肝組織中の平均CXCL877濃度は236.3 ng/g/liver proteinであった。その一方で、劇症肝不全では肝中心静脈の血管壁と周囲の結合組織に強発現し、その発現度は血管障害の重症度と相関していた。また、肝組織中のCXCL877濃度は3537.5 ng/g/liver protein(分布 350-8,250)と著増していた。CXCL877の分解酵素であるカセプシンLは、慢性肝不全では健常者と比較して高値であるが、劇症肝不全では著減していた。このことも、劇症肝不全ではCXCL877が分解されず異常高値を示す原因の一つと考えられた。
　劇症肝不全は臨床的多様性があるが、発症に至る時間経過(急性経過)とその重症度には一定の相関があると考えられる。英国の診断基準では黄疸発症から肝性脳症までの時間経過に基づき病型分類がなされている。小児劇症肝不全で、発症から肝移植が施行される期間(0～7日間、8～28日間、29～72日間)に基づき病型分類を行い重症度と肝組織中のCXCL877濃度との相関解析をした。その結果、重症度とCXCL877濃度とに強い相関を認めた。以上のことから、CXCL877とカセプシンLの生物学的特性と、これまでの臨床データに基づくことで、劇症肝不全の患者を、健常者や慢性肝不全から識別し、かつ確度の高い治療方針の決定が可能となる。
　本症は生命予後も不良であり、客観的指標に基づく重症度の評価を行うことは、患者家族への病状説明、肝移植施設への救急搬送、肝移植のドナー確保等の救命の連鎖(chain of survival)を円滑にできる可能性があり、本症の予後を大きく改善できる可能性がある。
　本発明により、客観的な指標に基づく、劇症肝不全の診断や重症度の判別が可能となる。また、本発明により、劇症肝不全の患者にカセプシンLを補充し、CXCL877のCXCL872への変換を促進する、という新たな機序に基づく劇症肝不全の予防又は治療技術が提供される。
　本出願は、日本で出願された特願2015-101759（出願日：2015年5月19日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (15)

  1. 　以下の工程を含む、劇症肝不全の検査方法：
    （1）被験者から単離された生体試料における、CXCL877及びカセプシンLの各タンパク質発現量を測定すること；並びに
    （2）（1）において測定した発現量と、劇症肝不全の発症可能性及び／又は重症度とを相関付けること。
  2. 　（2）における相関付けが、（1）において測定した各発現量を、CXCL877発現量が、
    相対的に高く、且つカセプシンL発現量が、相対的に低い場合には、劇症肝不全を発症している可能性が高いという基準と比較することを含む、請求項1記載の方法。
  3. 　（2）における相関付けが、（1）において測定したCXCL877発現量を、CXCL877発現量が高い程、劇症肝不全の重症度が高いという基準と比較することを含む、請求項1又は2記載の方法。
  4. 　CXCL877発現量の測定を、免疫学的測定法により行う、請求項1～3のいずれか1項に記載の方法。
  5. 　免疫学的測定法が、CXCL877のN末端の5アミノ酸の一部又は全部をエピトープ内に含む、CXCL877に特異的に結合する抗体を用いて行われる、請求項4記載の方法。
  6. 　生体試料が肝組織である、請求項1～5のいずれか1項に記載の方法。
  7. 　以下の物質を含む、劇症肝不全の診断用キット：
    （1）CXCL877に特異的に結合する抗体、及び
    （2）カセプシンLに特異的に結合する抗体、又はカセプシンLの基質。
  8. 　CXCL877に特異的に結合する抗体が、CXCL877のN末端の5アミノ酸の一部又は全部をエピトープ内に含む、請求項7記載の診断用キット。
  9. 　カセプシンL又はその発現ベクターを含む、劇症肝不全の予防又は治療剤。
  10. 　以下の工程を含む、劇症肝不全の予防又は治療剤の候補物質のスクリーニング方法：
    （1）被検物質が、カセプシンLの発現を促進するか否か評価すること、及び
    （2）カセプシンLの発現を促進した被検物質を、劇症肝不全の予防又は治療剤の候補物
    質として選択すること。
  11. 　劇症肝不全の診断において使用するための、以下の（1）及び（2）を含む組み合わせ：
    （1）CXCL877に特異的に結合する抗体、及び
    （2）カセプシンLに特異的に結合する抗体、又はカセプシンLの基質。
  12. 　劇症肝不全の診断薬を製造するための、以下の（1）及び（2）を含む組み合わせの使用：
    （1）CXCL877に特異的に結合する抗体、及び
    （2）カセプシンLに特異的に結合する抗体、又はカセプシンLの基質。
  13. 　対象ヒトに対して、カセプシンL又はその発現ベクターの有効量を投与することを含む、該対象ヒトにおける劇症肝不全の予防又は治療方法。
  14. 　劇症肝不全の予防又は治療において使用するための、カセプシンL又はその発現ベクター。
  15. 　劇症肝不全の予防又は治療用医薬を製造するための、カセプシンL又はその発現ベクターの使用。
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