BR112012014060B1

BR112012014060B1 - método para o diagnóstico da doença de alzheimer em um sujeito, para detecção da disfunção cognitiva branda ou para diferenciar a doença de alzheimer da disfunção cognitiva branda

Info

Publication number: BR112012014060B1
Application number: BR112012014060-4A
Authority: BR
Inventors: José Manuel Sarasa Barrio
Original assignee: Araclon Biotech, S.L.
Priority date: 2009-12-11
Filing date: 2010-12-13
Publication date: 2021-01-19
Also published as: CA2782250A1; CN102713633B; HUE028105T2; HK1175242A1; US20120264642A1; JP5745531B2; CN102713633A; TWI509246B; US20210011032A1; RU2554774C2; EP2510359B1; PT2510359E; BR112012014060A2; PL2510359T3; EP2510359A1; AU2010329844A1; AR079443A1; JP2013513791A; CA2782250C; MX2012006512A

Abstract

MÉTODOS E REAGENTES PARA DETECÇÃO APRIMORADA DE PEPTÍDEOS BETA-AMILOIDES. A presente invenção refere-se a métodos para o diagnóstico de uma doença neurodegenerativa, para a detecção de um estágio anterior a uma doença neurodegenerativa ou para diferenciar doença neurodegenerativa de um estágio anterior a um doença neurodegenerativa com base no nível de determinados conjuntos de peptídeos beta-amiloides os quais são quer ligados a componentes plasméticos ou ligados a células sanguíneas bem como em determinados parâmetros calculados os quais são obtidos por uma combinação aritmética dos níveis de um ou mais dos peptídeos amiloides. A invenção se refere também a kits para realização do método acima.

Description

CAMPO TÉCNICO

[0001] A invenção se refere ao campo dos imunoensaios e, mais especificamente, aos métodos para aumentar a sensibilidade dos imunoensaios para a determinação de peptídeos beta-amiloides em fluidos biológicos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] A doença de Alzheimer (em inglês, AD) é uma doença degenerativa progressiva do sistema nervoso central caracterizada por perda progressiva e crescente da memória, seguida por perda do controle dos membros e das funções corporais e eventual morte. É de longe a causa mais comum de demência afetando 1 a 6% das pessoas acima da idade de 65 anos e entre 10 a 20% das pessoas acima de 80.

[0003] A doença de Alzheimer é diferenciada de outros tipos de demência por várias características patológicas, incluindo o aparecimento progressivo no cérebro dos pacientes de placas senis no espaço extracelular entre os neurônios. As placas têm núcleos centrais de depósitos amiloides formados essencialmente por fibrilas de um peptídeo de 40 a 42 aminoácidos referido como peptídeo amiloide β (Aβ) circundado por neurite degenerada e células gliais. Este peptídeo resulta do processamento proteolítico de uma proteína precursora denominada proteína precursora do peptídeo β amiloide (βAPP).

[0004] A doença de Alzheimer pode ser classificada de acordo com a idade de aparecimento como de início precoce (idade abaixo de 60 anos) e de início tardio (idade acima de 60 anos), de acordo com a existência de uma herança autossômica dominante, como doença de Alzheimer familiar ou doença de Alzheimer esporádica. As formas de doença de Alzheimer familiar de início precoce podem ser associadas a mutação conhecida nos genes codificando para βAPP, presenilina 1 e presenilina 2 (localizados, respectivamente, nos cromossomas 21, 14 e 1). Estas classificações não são mutuamente exclusivas. As formas mais frequentes são formas de início tardio esporádico.

[0005] Na prática clínica, o diagnóstico da doença de Alzheimer é realizado usando critérios clínicos baseados na presença de características clínicas típicas e na exclusão de outros tipos de demência usando técnicas de estudo de neuroimagem e análise de sangue. Usando estes critérios, a confiabilidade do diagnóstico é aceitável embora, de acordo com estudos feitos usando autópsia cerebral, entre 10 a 20% dos pacientes diagnosticados com doença de Alzheimer sofreram de uma doença diferente. Além disso, os métodos de diagnóstico atuais somente podem ser realizados quando o processo neurodegenerativo está tão avançado que o paciente sofre de demência severa e as lesões cerebrais são tão extensivas que o número de medidas terapêuticas é limitado. O diagnóstico definitivo requer examine patológico de tecido cerebral post-mortem.

[0006] Em vista do fato de que Aβ acumula no cérebro de pacientes com doença de Alzheimer e é um elemento central na patogênese da doença de Alzheimer, esta proteína tem sido considerada como o candidato mais adequado como biomarcador da doença de Alzheimer. No entanto, o uso de Aβ como biomarcador plasmático para doença de Alzheimer se depara com o problema de que as concentrações dos peptídeos Aβ (Aβ(1-40) e Aβ(1-42)) no soro são extremamente baixas, de modo que não há testes os quais sejam suficientemente sensíveis de modo a possibilitar a detecção confiável das referidas espécies de peptídeos.

[0007] Muitos testes diferentes têm sido usados para determinar os níveis de peptídeos beta-amiloides em amostras biológicas (vide, por exemplo, os métodos descritos por Scheuner et al (Nature Med., 1996, 2:864-870); Tamaoka A et al. (J Neurol Sci., 1996, 141, 65-68); Suzuki,N. et al. (Science, 1994, 264:1336-1340); WO200722015, Vanderstichele H et al. (Amyloid, 2000, 7, 245-258); Fukomoto y col. (Arch. Neurol. 2003, 60, 958-964); Mehta et al. (Arch. Neurol. 57, 2000, 100-105); Mayeux, R. et al. (Ann Neurol. 1999, 46, 412-416); Lanz, T.A e Schacthter, J.B. (J. Neuroscience Methods, 2006, 157:7181), pelo Pedido de Patente internacional No. WO200750359, pelo Pedido de Patente internacional No. WO0162801, pelo Pedido de Patente internacional No. WO0315617, pelo Pedido de Patente internacional No. WO0246237 e pelo Pedido de Patente internacional No. WO0413172. No entanto, todos os ensaios à base de ELISA conhecidos até o momento têm um menor limite de detecção o qual não está na faixa de único dígito pg/mL no máximo, o qual é suficiente para detectar Aβ40 e Aβ42 no fluido cerebroespinhal bem como para detectar as referidas espécies no plasma em pacientes sofrendo de doença de Alzheimer familiar, mas são inadequados para detectar Aβ42 no plasma de pacientes sofrendo de doença de Alzheimer esporádica, em que as concentrações plasmáticas de Aβ42 são muito menores.

[0008] Até o momento, os únicos testes de peptídeos Aβ apresentando um limite de detecção menor do que o único dígito pg/mL correspondem aos testes descritos no Pedido de Patente internacional No. WO200646644 e no Pedido de Patente internacional No. WO2009015696.

[0009] O Pedido de Patente internacional No. WO200646644 descreve um ensaio de sanduíche eletroquimiluminiscente (ECL) em que o mAb 21F12 (o qual reconhece os aminoácidos 33 a 42 de Aβ42) é acoplado a contas magnéticas, as quais são então usadas para capturar o peptídeo Aβ42 na amostra contendo Aβ42 e adicionalmente contactadas com 3D6 mAb acoplado a um complexo de rutênio. A quantidade de anticorpo 3D6 ligado é em seguida detectada pela luminescência emitida pelo complexo de rutênio quando é aplicada energia elétrica. Usando este teste, os inventores são capazes de detectar tão pouco quanto 0,5 pg/mL de um padrão de Aβ42. No entanto, quando o mesmo teste é usado para comparar Aβ42 em amostras plasmáticas de pacientes com doença de Alzheimer e controles saudáveis, não puderam ser observadas diferenças significativas entre os dois grupos de pacientes, o que levou os inventores a concluírem que a quantidade de Aβ42 intacto no soro é muito baixa devido a degradação e recorrerem a um ensaio ELISA competitivo usando mAb 21F12 o qual proporciona menores níveis de sensibilidade na faixa de ng/mL.

[00010] O Pedido de Patente internacional No. WO2009015696 descreve um ensaio ELISA de sanduíche de alta sensibilidade em que o anticorpo de detecção é contatado com um reagente ligado a biotina apresentando especificidade para o referido anticorpo. O reagente é contatado com estreptavidina a qual é acoplada a peroxidase. A atividade da peroxidase é em seguida detectada por colorimetria usando TMB ou fluorescentemente usando QuantaBlue.

[00011] O Pedido de Patente internacional No. WO2006053251 descreve um método para a determinação de espécies de peptídeos beta-amiloides em uma amostra compreendendo contactar uma amostra com um agente desnaturante, extrair o conjunto de peptídeo da mistura de agente desnaturante e amostra, separar as espécies de peptídeos beta-amiloides do conjunto e determinação da quantidade das espécies de peptídeos beta-amiloides. Este método requer uma etapa de separação dos peptídeos antes da determinação, a qual resulta em maior tempo de processamento e aumento dos custos.

[00012] Portanto, existe a necessidade na técnica de ensaios imunológicos aprimorados e kits para detectar peptídeos Aβ-derivados os quais superem os problemas dos métodos e kits conhecidos na técnica, em particular, os quais sejam suficientemente sensíveis para detectar peptídeos Aβ em uma maneira confiável no plasma de pacientes sofrendo de doença de Alzheimer esporádica.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[00013] Em um primeiro aspecto, a invenção se refere a um método para o diagnóstico em um sujeito de uma doença neurodegenerativa, para detecção de um estágio anterior a uma doença neurodegenerativa ou para diferenciar uma doença neurodegenerativa de um estágio anterior à referida doença neurodegenerativa compreendendo as etapas de (i) determinação de um ou mais parâmetros selecionados entre o grupo de (a) o nível de um ou mais peptídeos beta-amiloides livres em uma amostra biológica do referido sujeito, (b) os níveis de agregados de um único ou mais peptídeos amiloides livres em uma amostra biológica do referido sujeito e do referido um ou mais peptídeos beta-amiloides associados a componentes macromoleculares presentes na referida amostra biológica, em que os referidos níveis de agregados são determinados quantificando a quantidade do referido um ou mais peptídeos beta- amiloides na fração livre de células da referida amostra depois de contactar a referida amostra com um agente de solubilização de proteína sob condições adequadas para promover dissociação do peptídeo beta amiloide ou peptídeos a partir dos componentes presentes na amostra biológica, (c) o nível de um ou mais peptídeos beta-amiloides asso- ciados a células em uma amostra biológica do referido sujeito, em que o nível referido é determinado isolando a fração de células da referida amostra biológica, contatando a referida fração celular da referida amostra com um agente de solubilização de proteína sob condições adequadas para promover dissociação do peptídeo beta amiloide ou peptídeos a partir das células presentes na amostra (ii) comparação do valor de no mínimo um dos parâmetros (b) ou (c) ou o valor de um parâmetro calculado resultante de combinar aritmeticamente no mínimo dois dos parâmetros (a) a (c) com um valor de referência correspondente ao valor dos referidos parâmetros (b) ou (c) ou do referido parâmetro calculado em uma amostra de referência e (iii) diagnóstico da doença neurodegenerativa, detecção de um estágio anterior a uma doença neurodegenerativa ou diferenciação de uma doença neurodegenerativa de um estágio anterior à referida doença neurodegenerativa onde há uma alteração no valor do parâmetro ou no valor do parâmetro calculado com respeito ao valor de referência. Em um segundo aspecto, a invenção se refere a um kit para determinação de peptídeos beta-amiloides em uma amostra biológica compreendendo (i) um agente de solubilização de proteína e (ii) no mínimo um anticorpo contra um peptídeo beta amiloide.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[00014] Figura 1: A-F. Gráficos de pontos das medições para (A) UP Aβ1-40, (B) DP Aβ1-40, (C) CBAβ1-40, (D) UP Aβ1-42, (E) DP Aβ1-42 e (F) CB Aβ1-42 obtidas nos dois laboratórios externos (Lab1 e Lab2). A maioria dos pontos estão próximos à linha de concordância indicando um grau de concordância nas medições substancial a quase perfeito. A inserção direita inferior em cada gráfico indica o coeficiente de correlação de concordância (CCC) e os intervalos de confiança de 95 %.

[00015] Figura 2: Marcadores diretos de Aβ1-40 (A), of Aβ1-42 (B) e marcadores calculados de Aβ1-40 e Aβ1-42 (C). A. Concentrações em pg/ml de Aβ1-40 livre no soro (FP), níveis de Aβ1-40 total no plasma (inclusive Aβ1-40 livre e Aβ1-40 ligado a componentes plasmáticos) (TP) e Aβ1-40 ligado a células (CB) em controles saudáveis (HC), pacientes sofrendo de disfunção cognitiva branda (MCI) e pacientes sofrendo de doença de Alzheimer (AD). B. Concentrações em pg/ml de Aβ1-42 livre no soro (FP), níveis de Aβ1-42 total no plasma (inclusive Aβ1-42 livre e Aβ1-42 ligado a componentes plasmáticos) (TP) e Aβ1-42 ligado a células (CB) em controles saudáveis (HC), pacientes sofrendo de disfunção cognitiva branda (MCI) e pacientes sofrendo de doença de Alzheimer (AD). C. Valores agregados em pg/ml de Aβ1-40 plasmático total (obtido contatando uma amostra de plasma com um agente de solubilização de proteína) mais Aβ1-40 ligado a células (TP+CB Aβ1-40), de Aβ1-42 plasmático total (obtido contatando uma amostra de plasma com um agente de solubilização de proteína) mais Aβ1-42 ligado a células (TP+CB Aβ1-42), ou os valores agregados de TP+CB Aβ1-40 e Aβ1-42 (TP+CB Aβ1-42). H, M, e A significam significativo (p < 0,05) com respeito a HC, MCI e AD, respectivamente. * significa p < 0,01.

[00016] Figura 3: A-F. Gráfico de pontos para valores de (A) DP Aβ1-40, (B) CB Aβ1-40, (C) UP Aβ1-42, (D) DP Aβ1-42, (E) T40 e (F) T-βAPB em participantes HC, MCI e AD. Números ao lado de * indicam o valor para valores atípicos nos grupos MCI e AD os quais, para a clareza da representação, não são representados na mesma escala do eixo das ordenadas. A linha horizontal representa o valor de corte entre MCI e HC.

[00017] Figura 4: Curva ROC para o marcador 1ab40 em pacientes com MCI/HC. A área sob a curva ROC = 0,510.

[00018] Figura 5: Curva ROC para o marcador 2ab40 em pacientes com MCI/HC. A área sob a curva ROC = 0,778.

[00019] Figura 6: Curva ROC para o marcador 3ab40 para pacientes com MCI/HC

[00020] Figura 7: . A área sob a curva ROC = 0,458. Curva ROC para o marcador 1ab42 para pacientes com MCI/HC

[00021] Figura 8: . A área sob a curva ROC = 0,576 Curva ROC para o marcador 2ab42 para pacientes com MCI/HC

[00022] Figura 9: . A área sob a curva ROC = 0,667 Curva ROC para o marcador 3ab42 para pacientes com AD/HC. A área sob a curva ROC = 0,744

[00023] Figura 10: Curva ROC para o marcador 3ab42 para pacientes com MCI/HC. A área sob a curva ROC = 0,508

[00024] Figura 11: Curva ROC para o marcador 2ab40 + 3ab40 para pacientes com MCI/HC. A área sob a curva é 0,830.

[00025] Figura 12: Curva ROC para o marcador 2ab42 + 3ab42 para pacientes com AD/HC. A área sob a curva é 0,713.

[00026] Figura 13: Curva ROC para o marcador 2ab42 + 3ab42 para pacientes com MCI/HC. A área sob a curva é 0,777.

[00027] Figura 14: Curva ROC para o marcador 2ab40 + 3ab40 + 2ab42 + 3ab42 com MCI/HC. A área sob a curva é 0,848. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00028] Os autores da presente invenção, surpreendentemente, descobriram que a diluição do plasma com tampão de amostra resulta em um aumento nos níveis detectáveis de Aβ1-40 e Aβ1-42. Sem desejar ser limitado por qualquer teoria, acredita-se que a diluição do plasma resulta em uma alteração na força iônica e nas interações moleculares dentro da amostra levando à liberação de Aβ1-40 e Aβ1- 42 ligado a proteínas plasmáticas e outros componentes.

[00029] Deste modo, o incremento nas medições depois da diluição do plasma pode ser devido à detecção de peptídeos Aβ liberados por proteínas e outros componentes do plasma e pode ser interpretado como uma estimativa do nível total de Aβ no plasma.

[00030] Em qualquer caso, estes resultados mostram que os níveis de peptídeo Aβ no sangue são muito maiores do que poderia ser estimado simplesmente testando seus níveis em plasma não diluído. Uma determinação completa dos níveis sanguíneos de βAPB total deve incluir a quantificação dos peptídeos livres no plasma, ligados a proteínas plasmáticas e ligados a células sanguíneas. Esta quantificação extensiva dos diferentes componentes do βAPB proporcionaria uma mais medida precisa dos níveis sanguíneos de Aβ e pode ajudar a determinar a regulação complexa de peptídeos Aβ na saúde e na doença. Além disso, os níveis dos referidos conjuntos de peptídeos beta-amiloides bem como o valor de determinados parâmetros calculados resultantes de combinar aritmeticamente as concentrações dos diferentes conjuntos com as concentrações de peptídeos beta-amiloides livres podem ser usados para determinar se um paciente sofre uma doença neurodegenerativa, se um paciente sofre de um estado anterior a uma doença neurodegenerativa e para distinguir uma doença neurodegenerativa de um estado anterior a uma doença neurodegenerativa.

Método de diagnóstico da invenção

[00031] Deste modo, em um primeiro aspecto, a invenção se refere a um método para o diagnóstico em um sujeito de uma doença neurodegenerativa, para detecção de um estágio anterior a uma doença neurodegenerativa ou para diferenciar uma doença neurodegenerativa de um estágio anterior à referida doença neurodegenerativa compreendendo as etapas de (i) determinação de um ou mais parâmetros selecionados entre o grupo de (a) o nível de um ou mais peptídeos beta-amiloides livres em uma amostra biológica do referido sujeito, (b) os níveis de agregados de um único ou mais peptídeos amiloides livres em uma amostra biológica do referido sujeito e do referido um ou mais peptídeos beta-amiloides associados a componentes macromoleculares presentes na referida amostra biológica, em que os referidos níveis de agregados são determinados quantificando a quantidade do referido um ou mais peptídeos beta- amiloides na fração livre de células da referida amostra depois de contactar a referida amostra com um agente de solubilização de proteína sob condições adequadas para promover dissociação do peptídeo beta amiloide ou peptídeos a partir dos componentes presentes na amostra biológica, (c) o nível de um ou mais peptídeos beta-amiloides associados a células em uma amostra biológica do referido sujeito, em que o nível referido é determinado isolando a fração de células da referida amostra biológica, contatando a referida fração celular da referida amostra com um agente de solubilização de proteína sob condições adequadas para promover dissociação do peptídeo beta amiloide ou peptídeos a partir das células presentes na amostra e (ii) comparação do valor de no mínimo um dos parâmetros (b) ou (c) ou o valor de um parâmetro calculado resultante de combinar aritmeticamente no mínimo dios dos parâmetros (a) a (c) com um valor de referência correspondente ao valor dos referidos parâmetros (b) ou (c) ou do referido parâmetro calculado em uma amostra de referência e (iii) diagnóstico da doença neurodegenerativa, detecção de um estágio anterior a uma doença neurodegenerativa ou diferenciação de uma doença neurodegenerativa de um estágio anterior à referida doença neurodegenerativa onde há uma alteração no valor do parâmetro ou no valor do parâmetro calculado com respeito ao valor de referência.

[00032] O termo “diagnóstico” conforme usado aqui, neste Pedido de Patente, inclui a avaliação da suscetibilidade de um sujeito a uma doença, determinação quanto a se um sujeito atualmente tem a doença, e também ao prognóstico de um sujeito afetado pela doença. Conforme será entendido por pessoas versadas na técnica, a avaliação referida normalmente pode não ser correta para 100% dos sujeitos a serem diagnosticados, embora preferencialmente seja correta. No entanto, o termo requer que uma parte estatisticamente significativa dos sujeitos possa ser identificada como sofrendo da doença ou tendo uma predisposição para a mesma. Se uma parte for estatisticamente significativa pode ser determinado simplesmente pela pessoa versada na técnica usando várias ferramentas de avaliação estatística de conhecimento geral, por exemplo, determinação de intervalos de confiança, determinação de valores- p, t- teste de Student, teste de Mann-Whitney, etc. Detalhes são proporcionados em Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983. Os intervalos de confiança preferenciais são de no mínimo 50%, no mínimo 60%, no mínimo 70%, no mínimo 80%, no mínimo 90%, no mínimo 95%. Os valores p são preferencialmente de 0,2, 0,1 ou 0,05.

[00033] Conforme usado aqui, neste Pedido de Patente, o termo “sujeito” se refere a todos os animais classificados como mamíferos e inclui mas não está limitado a animais domésticos e de criação, primatas e humanos, por exemplo, seres humanos, primatas não humanos, vacas, cavalos, porcos, carneiro, cabras, cães, gatos, ou roedores. Preferencialmente, o sujeito é um ser humano do sexo masculino ou feminino de qualquer idade ou raça.

[00034] O termo “doença neurodegenerativa”, conforme usado aqui, neste Pedido de Patente, se refere a uma condição ou distúrbio no qual células neuronais são perdidas devido a morte celular dando origem a uma deterioração das funções cognitivas ou resultam em dano, disfunção, ou complicações que podem ser caracterizados por aberrações neurológicas, neurodegenerativas, fisiológicas, psicológicas, ou comportamentais. Doenças neurodegenerativas adequadas que podem ser diagnosticadas com os métodos da invenção incluem, sem limitação, degeneração macular relacionada com a idade, doença de Creutzfeldt-Jakob, doença de Alzheimer, demência induzida por radioterapia, lesão de axônios, depressão de disseminação cortical aguda, alfa-sinucleinopatias, isquemia cerebral, doença de Huntington, isquemia cerebral focal permanente, regeneração dos nervos periféricos, modelo pós-status epiléptico, lesão da medula espinhal, esclerose lateral amiotrófica esporádica e encefalopatia espongiforme transmissível.

[00035] Em uma modalidade preferencial, a doença neurodegenerativa é doença de Alzheimer. O termo "doença de Alzheimer" (ou "demência senil") se refere a uma deterioração mental associada com doença cerebral degenerativa específica que é caracterizada por placas senis, emaranhados neuríticos, e perda neuronal progressiva a qual se manifesta clinicamente em déficits progressivos de memória, confusão, problemas comportamentais, incapacidade para cuidar de si mesmo, deterioração física gradual e, finalmente, morte. Pacientes sofrendo de doença de Alzheimer são identificados usando os critérios NINCDS-ADRDA (CDR = 1, MMSE entre 16 e 24 pontos e atrofia temporal medial (determinada por MRI) >3 pontos na escala de Scheltens.

[00036] O termo “estágio anterior à referida doença neurodegenerativa”, conforme usado aqui, neste Pedido de Patente, se refere a uma situação transicional a qual ocorre entre indivíduos normais e sujeitos sofrendo de alguns distúrbios neurodegenerativos e a qual é caracterizada pelo aparecimento de alguns dos sinais e sintomas dos distúrbios neurodegenerativos ou pelo aparecimento de um subgrupo dos sinais e sintomas observados em pacientes sofrendo do distúrbio neurodegenerativo. Em uma modalidade preferencial, o estágio anterior à referida doença neurodegenerativa é disfunção cognitiva branda (nas partes que se seguem MCI) a qual se refere a um estágio transicional de disfunção cognitiva entre envelhecimento normal e doença de Alzheimer precoce. Os pacientes são geralmente identificados como tendo MCI se eles satisfizerem os critérios da Mayo Clinic (CDR = 0,5, apresentam uma atrofia temporal medial (determinada por MRI) a qual é maior do que 3 pontos na escala de Scheltens, apresentam um padrão de hipometabolismo parietal e/ou temporal em Tomografia de Emissão de Pósitrons com 18- fluorodesoxiglicose (PET-FDG) (sugestivo de doença de Alzheimer).

[00037] O termo “diferenciação de uma doença neurodegenerativa de um estágio anterior à referida doença neurodegenerativa” se refere à capacidade de discriminar entre um paciente encontrado no estágio anterior ou prodrômico de uma doença neurodegenerativa de pacientes os quais já estejam sofrendo da doença. No caso particular em que a doença neurodegenerativa é doença de Alzheimer, o método da invenção possibilita a diferenciação de entre doença de Alzheimer e o estágio prodrômico da referida doença conhecido como disfunção cognitiva branda (MCI):

[00038] Em uma primeira etapa, o método da invenção compreende a determinação de no mínimo um parâmetro selecionado entre o grupo de (a) o nível de um ou mais peptídeos beta-amiloides livres em uma amostra biológica do referido sujeito, (b) os níveis de agregados de um único ou mais peptídeos amiloides livres em uma amostra biológica do referido sujeito e do referido um ou mais peptídeos beta-amiloides associados a componentes macromoleculares presentes na referida amostra biológica, em que os referidos níveis de agregados são determinados quantificando a quantidade do referido um ou mais peptídeos beta- amiloides na fração livre de células da referida amostra depois de contactar a referida amostra com um agente de solubilização de proteína sob condições adequadas para promover dissociação do peptídeo beta amiloide ou peptídeos a partir dos componentes presentes na amostra biológica, (c) o nível de um ou mais peptídeos beta-amiloides associados a células em uma amostra biológica do referido sujeito, em que o nível referido é determinado isolando a fração de células da referida amostra biológica, contatando a referida fração celular da referida amostra com um agente de solubilização de proteína sob condições adequadas para promover dissociação do peptídeo beta amiloide ou peptídeos a partir das células presentes na amostra e

[00039] O termo “peptídeo beta amiloide” é usado aqui, neste Pedido de Patente, de modo intercambiável com “Abeta”, "Abeta," "beta AP," " peptídeo A beta," ou " peptídeo Aβ” e se refere a uma família de peptídeos que são o principal constituinte químico das placas senis e de depósitos amiloides vasculares (angiopatia amiloide) encontrados no cérebro em pacientes com doença de Alzheimer (AD), Síndrome de Down, e Hemorragia Cerebral Hereditária com Amiloidose do Tipo Holandesa (HCHWA-D). Peptídeos beta-amiloides são fragmentos da proteína precursora beta-amiloide (APP) a qual compreende um número variável de aminoácidos, tipicamente 38 a 43 aminoácidos.

[00040] Peptídeos beta-amiloides são comumente expressados como "Aβ (x-y)" em que x representa o número de aminoácidos no término amino do peptídeo beta amiloide e y representa o número de aminoácidos no término carbóxi. Por exemplo, Aβ(1-40) é um peptídeo beta amiloide cujo término amino se inicia no aminoácido número 1 e o término carbóxi termina no aminoácido número 40, do qual é proporcionada uma sequência pela SEQ ID NO: 1. Exemplos de peptídeos beta-amiloides incluem que podem ser determinados com o método da presente invenção incluem, sem limitação, Aβ (1-38) (SEQ ID NO: 2), Aβ (1-39) (SEQ ID NO: 3), Aβ (1-40) (SEQ ID NO: 1), Aβ(1- 41) (SEQ ID NO: 4), e Aβ (1-42) (SEQ ID NO;5), Aβ (1-43) (SEQ ID NO: 6), Aβ (11-42) (SEQ ID NO: 7), Aβ (3-40) (SEQ ID NO: 8), Aβ (342) (SEQ ID NO: 9), Aβ (4-42) (SEQ ID NO: 10), Aβ (6-42) (SEQ ID NO: 11), Aβ (7-42) (SEQ ID NO: 12), A13(8-42) (SEQ ID NO: 13), Aβ (9-42) (SEQ ID NO: 14), Aβ (x-40), Aβ (x-42) e Aβ (x-38), bem como peptídeo beta amiloide total, o qual se refere a uma pluralidade de espécies de peptídeos beta-amiloides em que não são discriminadas espécies individuais. Em modalidades preferenciais, os peptídeos beta-amiloides os quais são detectados de acordo com o método da invenção são Aβ(1-40) e Aβ(1-42).

[00041] O termo “Aβ(1-42)”, conforme usado aqui, neste Pedido de Patente, se refere a um peptídeo de 42 aminoácidos correspondente aos aminoácidos 672 a 713 (SEQ ID NO: 5) da APP e o qual é produzido pela clivagem proteolítica sequencial da proteína precursora amiloide (SEQ ID NO: 15) pelas β- e Y—secretases.

[00042] O termo “Aβ(1-40)”, conforme usado aqui, neste Pedido de Patente, se refere a um peptídeo de 40 aminoácidos correspondente aos aminoácidos 672 to 711 (SEQ ID NO: 1) e o qual é produzido pela clivagem proteolítica sequencial da proteína precursora amiloide (SEQ ID NO: 15) pelas β- e Y-secretases.

[00043] O termo “amostra biológica”, conforme entendido na presente invenção, inclui (1) fluidos biológicos tais como sangue total, soro, plasma, urina, linfa, saliva, sêmen, escarro, lágrimas, muco, suor, leite, extratos cerebrais e fluido cerebrospinal; (2) componentes do sangue, tais como plasma, soro, céllas sanguíneas, e plaquetas; (3) extratos obtidos de tecidos sólidos ou órgãos tais como cérebro; e (4) extratos de culturas de linhagens celulares ou células primárias de humanos ou animais, tais como neurônios humanos primários, e neurônios primários de camundongos transgênicos carregando genes de APP humana, por exemplo, células de um animal PDAPP transgênico (por exemplo, camundongo), bem como uma linhagem celular de rim humano 293, uma linhagem celular de neuroglioma humano, uma linhagem de células HeLa humanas, uma linhagem de células endoteliais primárias (por exemplo, células HUVEC), uma linhagem de fibroblastos humanos primários ou uma linhagem de linfoblastos primários (incluindo células endógenas derivadas de pacientes com mutações de APP), uma cultura de células cerebrais mistas humanas primárias (incluindo neurônios, astrócitos e neuroglia), ou uma linhagem celular de ovário de hamster chinês (CHO). Os métodos da invenção são particularmente adequados para medir Aβ em uma amostra de sangue de um animal humano ou não humano, tal como sangue total, plasma, ou uma amostra contendo quaisquer componentes do sangue em quaisquer quantidades.

[00044] O termo "sangue total" significa sangue de um humano ou animal contendo tanto componentes celulares quanto componente líquido. O sangue total pode estar em estado coagulado ou em estado não coagulado. "Sangue total" também inclui sangue em que porção ou todos os componentes celulares, tais como leucócitos ou eritrócitos, foram lisados.

[00045] O termo "plasma" se refere ao componente de fluido do sangue total. Dependendo do método de separação usado, o plasma pode ser completamente livre de componentes celulares, ou pode conter várias quantidades de plaquetas e/ou pequena quantidade de outros componentes celulares.

[00046] O termo “soro” se refere a plasma sem a proteína de coagulação fibrinogênio e outros fatores de coagulação.

[00047] O termo “peptídeo beta amiloide livre”, conforme usado aqui, neste Pedido de Patente, se refere aos peptídeos beta-amiloides os quais não estão associados a qualquer componente da amostra biológica e o qual está prontamente disponível para ligar a um anticorpo específico. Este peptídeo pode ser determinado por técnicas imunológicas convencionais contatando a amostra biológica com um anticorpo específico para o peptídeo referido. Em uma modalidade preferencial, o nível de peptídeo amiloide livre é determinado no plasma.

[00048] O termo “peptídeo beta amiloide associado a componentes macromoleculares”, conforme usado aqui, neste Pedido de Patente, se refere ao peptídeo beta amiloide o qual é ligado de modo não covalente ou anexado a moléculas encontradas na amostra biológica em estudo. Este peptídeo geralmente não está prontamente acessível para detecção imunológica e portanto, requer um pré-tratamento da amostra biológica de modo a obter a separação do peptídeo dos componentes. Sob estas condições, o peptídeo beta amiloide anexado a componentes macromoleculares será liberado dos componentes referidos e se tornará disponível para detecção imunológica usando anticorpos específicos. Como a amostra biológica já contém uma certa quantidade de peptídeo beta amiloide livre, a quantidade total de peptídeo amiloide livre depois de contactar a amostra com o agente de solubilização de proteína será o nível agregado de peptídeo beta amiloide livre originalmente presente e o nível de peptídeo beta amiloide o qual tenha sido liberado no tratamento com o agente de solubilização de proteína. No caso do nível de peptídeo beta amiloide associado aos componentes macromoleculares presentes na amostra biológica precisar ser determinado, isto pode ser feito tipicamente por determinação do nível de peptídeo beta amiloide livre antes do tratamento com o agente de solubilização de proteína e do nível de peptídeo beta amiloide livre depois do tratamento com o agente de solubilização de proteína e subextraindo o primeiro valor do segundo valor. Para os fins da presente invenção, geralmente é adequado determinar o nível agregado de peptídeos beta-amiloides livres o qual inclui os peptídeos beta-amiloides livres originalmente bem como o nível de peptídeos beta-amiloides os quais foram liberados dos componentes macromoleculares depois do tratamento com o agente de solubilização de proteína. Portanto, o parâmetro o qual é geralmente determinado quando a amostra é tratada de modo a dissociar o peptídeo amiloide de componentes macromoleculares corresponde à adição do livre peptídeo presente na amostra e do peptídeo associado a componentes macromoleculares.

[00049] Os componentes macromoleculares da amostra os quais podem ligar peptídeos beta-amiloides e os quais contribuem para o conjunto de peptídeo beta amiloide associados a componentes macromoleculares incluem tanto proteínas bem como lipídeos. No caso particular em que o método é realizado em amostras de sangue ou plasma, os componentes macromoleculares incluem, sem limitação, proteínas e lipídeos do sangue. Exemplos de proteínas do sangue incluem albumina, imunoglobulina G, imunoglobulina E, imunoglobulina M, imunoglobulina A, fibrinogênio (fibrina e produtos da degradação da mesma), alfa-1 antitripsina, pré-albumina, alfa 1 antitripsina, alfa 1 glicoproteína ácida, alfa 1 fetoproteína, Haptoglobina alfa 2, macroglobulina, ceruloplasmina, transferrina, C3/C4 Beta 2 microglobulina, beta lipoproteína, alfa, beta e gama globulinas, proteína C-reativa (CRP), protrombina, proteína de ligação a tiroxina, transtiretina e semelhantes. Exemplos de lipídeos do sangue incluem ácidos graxos livres, colesterol, triglicerídeos, fosfolipídeos, esfingolipídeos e semelhantes. A quantidade de peptídeo beta amiloide associado a componentes macromoleculares pode ser determinada contatando uma amostra livre de células da amostra biológica com um agente de solubilização de proteína sob condições adequadas para induzir a liberação dos referidos peptídeos beta- amiloides dos componentes macromoleculares.

[00050] Por contactar, se indica aqui, neste Pedido de Patente, acrescentar à amostra uma quantidade suficiente de uma solução compreendendo o agente de solubilização de proteína de modo a que a concentração do agente de solubilização de proteína na mistura seja suficiente para solubilizar de modo eficaz o peptídeo beta amiloide o qual é ligado às proteínas e células na amostra. Preferencialmente, o agente de solubilização de proteína é encontrado em solução em uma solução tampão de modo que a adição do agente de solubilização de proteína não resulta em uma modificação substancial no pH da amostra.

[00051] O termo “agente de solubilização de proteína”, conforme usado aqui, neste Pedido de Patente, se refere a qualquer composto de composição capaz de alterar a estrutura secundária, terciária e/ou quaternária dos polipeptídeos enquanto deixando a estrutura primária intacta. Em virtude destas propriedades, agentes de solubilização de proteína são capazes de aumentar a solubilidade das proteínas em uma amostra bem como de prevenir agregação inter- e intramolecular das proteínas. Agentes de solubilização de proteína adequados para aplicação na presente invenção incluem, sem limitação, detergentes, agentes caotrópicos, agentes redutores ou misturas dos mesmos.

[00052] O termo “detergente”, conforme usado aqui, neste Pedido de Patente, é um sinônimo usado para tensoativos em geral, e se refere a agentes ativos na superfície anfipáticos que, quando acrescentados a um líquido, reduzem a tensão superficial do líquido em comparação com o mesmo líquido na ausência do detergente. Detergentes também são capazes de prevenir a agregação de proteínas e de prevenir interação inespecífica ou ligação de contaminantes a uma proteína de interesse. Detergentes adequados para aplicação na presente invenção incluem, sem limitação, detergentes não iônicos (neutros), aniônicos, catiônicos, ou zviterônicos.

[00053] Exemplos de detergentes não iônicos ou neutros incluem, sem limitação, detergentes da série Tween, tais como Tween® 20, Tween® 21, Tween® 40, Tween® 60, Tween® 61, Tween® 65, Tween® 80, Tween® 81, Tween® 85, detergentes da série Span®, tais como Span® 20; detergentes da série Tergitol, tais como Tergitol Type 15-S- 12; detergentes da série Brij®, tais como Brij® 35, Brij® 56, Brij® 72, Brij® 76, Brij® 92V, Brij® 97, Brij® 58P; detergentes da série Tween, tais como Tween® 20, Tween® 21, Tween® 40, Tween® 60, Tween® 61, Tween® 65, Tween® 80, Tween® 81, Tween® 85; detergentes da série Triton®, tais como Triton® X-100, Triton® X-114, Triton® CF-21, Triton® CF-32, Triton® DF-12, Triton® DF-16, Triton® GR-5M, Triton® X-102, Triton® X-15, Triton® X-151, Triton® X-207, Triton® X-165, Triton® X305, Triton® X-405, Triton® X-45, Triton® X-705-70, ou uma variante conservadora não iônica de no mínimo um dos detergentes referidos.

[00054] Exemplos de detergentes aniônicos incluem, sem limitação, ácido cólico e derivados do mesmo, ácido taurocólico, Triton X-200, Triton W-30, Triton- 30, Triton-770, dioctil sulfo succinato, N-óxido de N5N-dimetildodecilamina, 1-alquilsulfonatos de sódio, N- lauroilsarcosina ou sais de ácidos graxos.

[00055] Exemplos de detergentes catiônicos incluem, sem limitação, mono e di-metil aminas graxas, sais de alquil trimetil amônio, sais de dialquil dimetil amônio, acetatos de amina de alquila, acetatos de trialquilamônio, sais de alquildimetilbenzil amônio, sais de dialquimetilbenzil amônio, sais de haleto de alquilpiridínio e alquil (alquil substituído) piridínio, sais de alquiltiometilpiridínio, sais de alquilamidometilpiridínio, sais de alquilquinolínio, sais de alquilisoquinolínio, N,N-alquilmetilpirolidônio, sais de 1,1-dialquilpiperí- dinio, sais de 4,4-dialquiltiamorfolínio, sais de 4,4-dialquiltiamorfolínio- 1-óxido, metil sulfato de metil his (alquil etil)-2-alquil imidazolínio (e outros sais), metil sulfato de metil bis(alquilamido etil)-2-hidroxietil amônio (e outros sais), sais de alquilamidopropil-dimetilbenzil amônio sais, sais de carboxialquil-alquildimetil amônio, óxidos de amina de alquila, óxidos de amina de alquildimetila, sais de poli(vinilmetilpiridínio), sais de poli(vinilpiridina), polietileno iminas, bicarbonatos de trialquil fosfônio (e outros sais), sais de trialquilmetil fosfônio, sais de alquiletilmetilsulfônio, e sais de alquildimetilsulfoxônio.

[00056] Exemplos de detergentes zviterônicos incluem, sem limitação, 3-[(3-colamidopropil)dimetilamônio]-l-propanossulfonato (CHAPS); 3-[(3- colamidopropil)dimetilamônio]-2-hidroxi-l-propanossulfonato (CHAPSO); N-(alquil C10-C16)-N,N-dimetilglicina betaína (EMPIGEN BB); Caprilil sulfobetaína (SB3-10); 3-[N,N-dimetil(3-miristoilaminopropil)amô- nio]propanossulfonato (Amidossulfobetaína-14; ASB-14); N-tetradecil- N,N-dimetil-3-amônio-l- propanossulfonato (3-14 Detergent; ZWITTERGENT); N-dodecil-N,N'-dimetil-3-amônio-1-propanossulfonato; N-octadecil-N,N-dimetil-3-amônio-1- propanossulfonato; N-decil-N,N- dimetil-3-amônio-1-propanossulfonato; Mirataine CB; Mirataine BB; Mirataine CBR; Mirataine ACS; Miracare 2MHT e Miracare 2MCA.

[00057] Em uma modalidade preferencial, o reagente de solubilização de proteína é um detergente. Em uma modalidade ainda mais preferencial, o detergente é Tween 20. Em uma modalidade ainda mais preferencial, Tween 20 é usado em uma concentração de 0,5%.

[00058] Um “agente caotrópico”, conforme usado aqui, neste Pedido de Patente, se refere a um composto ou mistura de compostos os quais rompem ligações de hidrogênio e interações hidrofóbicas tanto entre quanto dentro de proteínas. Quando usados em concentrações elevadas, os agentes caotrópicos rompem a estrutura secundária da proteína e trazem em solução proteínas que não são solúveis de modo diverso. Agentes caotrópicos adequados incluem, sem limitação, uréia, isotiocianato de guanidina, tiocianato de sódio (NaSCN), HCl de Guanidina, cloreto de guanidina, tiocianato de guanidina, tetracloroacetato de lítio, perclorato de sódio, tetracloroacetato de rubídio, iodeto de potássio ou trifluoroacetato de césio.

[00059] O termo “agente redutor”, conforme usado aqui, neste Pedido de Patente, se refere a qualquer composto ou material o qual mantém grupamentos sulfidrila no estado reduzido e reduz ligações dissulfeto intra- ou intermoleculares. A título de exemplo, agentes redutores adequados para o método da presente invenção incluem tanto agentes redutores de sulfidrila ou de fosfina. Exemplos de redutores de sulfidrila incluem ditiotreitol (DTT), ditioeritritol (DTE), e β- mercaptoetanol. Exemplos de redutores de fosfina incluem tributilfosfina (TBP) e tris-carboxietilfosfina (TCEP).

[00060] Tipicamente, a amostra biológica é primeiro processada para remover a fração celular. A amostra livre de células é em seguida contactada com o agente de solubilização de proteína. Em uma modalidade preferencial, a amostra é diluída usando um tampão compreendendo o agente de solubilização de proteína. Tipicamente, a amostra é diluída 5 vezes em uma solução tampão compreendendo Tween 20.

[00061] Conforme usado aqui, neste Pedido de Patente, uma "solução tampão" é qualquer substância ou mistura de compostos em solução que é capaz de neutralizar tanto ácidos quanto bases sem alterar consideravelmente a acidez ou alcalinidade original da solução. Soluções tampão adequadas a serem usadas no método da invenção incluem, sem limitação, solução tampão Tris, solução tampão de fosfato, solução tampão de borato, solução tampão de carbonato, solução tampão de glicina e hidróxido de sódio, ou semelhantes. Preferencialmente, a solução tampão é uma solução tampão de fosfato tal como salina tamponada com fosfato ou PBS.

[00062] A quantidade de solução compreendendo o agente de solu- bilização de proteína a qual é acrescentada à amostra biológica não é essencial contanto que seja obtida suficiente dissociação do peptídeo beta amiloide. A título de exemplo, o fluido biológico pode ser diluído na solução compreendendo o agente de solubilização de proteína em uma diluição de no mínimo 1/2 (v/v), 1/3 (v/v), 1/4 (v/v), 1/5 (v/v), 1/6 (v/v), 1/7 (v/v), 1/8 (v/v), 1/9 (v/v), 1/10 (v/v), 1/20 (v/v), 1/50 (v/v), 1/60 (v/v), 1/80 (v/v), 1/90 (v/v), 1/100 (v/v) ou mais. Uma pessoa versada reconhecerá que pode ser usada qualquer combinação das referidas taxas de diluição e da referida concentração de agente de solubilização de proteína contanto que a concentração final de agente de solubilização de proteína seja adequada para atingir o efeito desejado. Por exemplo, a solução contendo o agente de solubilização de proteína pode compreender o um ou mais agentes de solubilização de proteína selecionados referidos em uma concentração variando de 0,001% a 0,5% (em peso/ vol). Depois de ter sido diluído na solução contendo o agente de solubilização de proteína referida, o fluido biológico referido tipicamente contém o um ou mais tensoativos referidos em menos de 0,1% (em peso/ vol), preferencialmente menos de 0,6% (em peso/ vol), mais preferencialmente não mais de 0,5% (em peso/ vol), o mais preferencialmente não mais de 0,45% (em peso/ vol) e ainda mais preferencialmente 0,5%.

[00063] Sistemas tampão adequados para aplicação na presente invenção incluem tampões de Tris-HCl incluindo um sal tal como NaCl ou KCl e, opcionalmente, BSA. Sistemas tampão particulares incluem, sem limitação, 50 mM de Tris-HCl pH 8, 0,5 M de NaCl, 0,05 %; BSA, 0,05 % de Tween-20; 50 mM de Tris-HCl pH 8, 0,5 M de NaCl, 0,05 %; BSA, 0,05 % de Tween-20, 1M GuHCl; 50 mM de Tris-HCl pH 8, 0,5 M de KCl, 0,05 %; BSA, 0,05 % de Tween-20 ; 50 mM de Tris-HCl pH 8, 0,5 M de KCl, 0,05 %; BSA, 0,05 % de Tween-20, 1M GuHCl; 50 mM de Tris-HCl pH 8, 0,5 M de NaCl, 0,05 %; BSA, 0,05 % de Tween-80; 50 mM de Tris-HCl pH 8, 0,5 M de KCl, 0,05 %; BSA, 0,05 % de Tween-80; 50 mM de Tris-HCl pH 8, 0,5 M de NaCl; 0,05 %; BSA, 0,05 % Triton X-100 50 mM de Tris-HCl pH 8, 0,5 M de KCl, 0,05 %; BSA, 0,05 % Triton X-100; 50 mM de Tris-HCl pH 8; 0,05 %; BSA, 0,05 % de Tween- 20; 50 mM de Tris-HCl pH 8, 0,5 M de NaCl, 0.1 %; BSA, 0,05 % de Tween-20; 50 mM de Tris-HCl pH 8, 0,5 M de NaCl, 0,05 %; BSA, 0,1 % de Tween-20; 50 mM de Tris-HCl pH 8, 0,5 M de NaCl, 0.1 %; BSA, 0,1 % de Tween-20; 50 mM de Tris-HCl pH 8, 1 M de NaCl, 0,05 %; BSA, 0,05 % de Tween-20; 50 mM de Tris-HCl pH 8, 1,5 M de NaCl, 0,05 %; BSA, 0,05 % de Tween-20; 50 mM de Tris-HCl pH 8, 2 M de NaCl, 0,05 %; BSA, 0,05 % de Tween-20; 50 mM de Tris-HCl pH 8, 2,5 M de NaCl, 0,05 %; BSA, 0,05 % de Tween-20; 50 mM de Tris-HCl pH 8, 3 M de NaCl, 0,05 %; BSA, 0,05 % de Tween-20; 50 mM de Tris-HCl pH 8, 0,5 M de NaCl, 0,05 %; BSA, 0,05 % de Tween-20, 10% de DMSO; 50 mM de Tris-HCl pH 8, 0,5 M de NaCl, 0,05 %; BSA, 0,05 % de Tween-20, 0,5 M de GuHCl; 50 mM de Tris-HCl pH 6, 0,5 M de NaCl, 0,05 %; BSA, 0,05 % de Tween-20; 50 mM de Tris-HCl pH 7, 0,5 M de NaCl, 0,05 %; BSA, 0,05 % de Tween-20; 50 mM de Tris-HCl pH 9, 0,5 M de NaCl, 0,05 %; BSA, 0,05 % de Tween-20; 50 mM de Tris-HCl pH 8, 0,5 M de NaCl, 0,05 %; BSA

[00064] Por exemplo, quando Tween 20 é usado como um agente de solubilização de proteína, a concentração preferencial é de 0,004 a 0,02%, mais preferencialmente de 0,005 a 0,01 % (em peso/ vol).

[00065] A etapa de contato é realizada preferencialmente em uma temperatura baixa de modo a inibir atividades proteolíticas presentes na amostra. Temperaturas adequadas são de cerca de 0 a 10 graus C, preferencialmente de cerca de 3 a 5 graus C, por exemplo, cerca de 4 graus C.

[00066] Uma vez que o fluido biológico tenha sido contatado com a solução compreendendo o agente de solubilização de proteína, ambos os fluidos podem ser misturados. A mistura pode ser realizada por agitação, preferencialmente por misturação, mais preferencialmente por misturação em alta velocidade, o mais preferencialmente por turbilhonamento) por no mínimo 5 segundos, preferencialmente por no mínimo 10 segundos, mais preferencialmente por no mínimo 15 segundos (por exemplo, por 15 a 50 segundos). Velocidades vantajosas para a referida mistura, agitação, misturação, misturação em alta velocidade ou turbilhonamento compreendem uma velocidade de no mínimo 250 rpm, preferencialmente de no mínimo 500 rpm, mais preferencialmente de no mínimo 1.000 rpm, o mais preferencialmente de cerca de 2.000 a 2.500 rpm.

[00067] A etapa de contato é realizada sob condições adequadas para obter dissociação parcial ou, preferencialmente, total do peptídeo beta amiloide a partir da proteína e dos lipídeos presentes na amostra biológica. As condições podem ser determinadas adequadamente por uma pessoa com conhecimento ordinário da técnica monitorando a quantidade de peptídeo beta amiloide a qual é detectável antes da etapa de contato e progressivamente em diferentes pontos do tempo depois da etapa de contato ter ocorrido. O curso de tempo do experimento pode ser determinado conforme descrito no exemplo da parte experimental.

[00068] A pessoa versada reconhecerá que quando o nível de peptídeo beta amiloide é determinado diluindo uma amostra biológica com um tampão contendo o reagente de solubilização de proteína, o nível de peptídeo beta amiloide livre obtido por determinação imunológica terá de ser corrigido de modo a levar em conta o fator de diluição previamente aplicado à amostra biológica.

[00069] Deste modo, em uma modalidade preferencial, o parâmetro o qual é determinado na etapa (i) do método da invenção é um ou mais do parâmetro selecionado entre o grupo do nível de peptídeo ABETA40 livre em uma amostra biológica do referido sujeito (nas partes que se seguem conhecido como 1ab40 ou UP Aβ(1-40)), os níveis de agregados de peptídeo ABETA40 livre na amostra biológica e de peptídeo ABETA40 associados aos componentes da referida amostra biológica obtida conforme descrito acima (nas partes que se seguem referido como 2ab40 ou DP Aβ(1-40)), o nível de peptídeo ABETA42 livre na amostra biológica (nas partes que se seguem conhecido como 1ab42 ou UP Aβ(1-42)) e os níveis de agregados de peptídeo ABETA42 livre na amostra biológica e de peptídeo ABETA42 associados aos componentes da referida amostra biológica obtida conforme descrito acima (nas partes que se seguem referido como 2ab42 ou DP Aβ(1-42)).

[00070] O termo “peptídeo beta amiloide associado a células”, conforme usado aqui, neste Pedido de Patente, se refere a peptídeo beta amiloide o qual é associado de modo não covalente à superfície das células presentes na amostra biológica e o qual está indisponível para ligação a anticorpos acrescentados à amostra e portanto, imunologicamente indetectável. Tipicamente, se a amostra biológica for sangue, o peptídeo beta amiloide é associado a hemácias, leucócitos, incluindo neutrófilos, eosinófilos, basófilos, linfócitos e monócitos, e plaquetas.

[00071] A quantidade de peptídeo beta amiloide associado a células em uma dada amostra pode ser determinada e este valor pode ser usado isolado ou em combinação com outros parâmetros relacionados com peptídeos beta-amiloides nos métodos da invenção. Para este fim, primeiro é necessário isolar a fração celular da amostra biológica. Isto pode ser realizado usando qualquer técnica de conhecimento de uma pessoa versada tal como centrifugação, sedimentação, filtração e semelhante. Uma vez que a fração de células de uma amostra biológica tenha sido isolada, as células são contactadas com um agente de solubilização de proteína.

[00072] Agentes de solubilização de proteína adequados incluem detergentes, agentes caotrópicos e agentes redutores conforme definido acima e são geralmente proporcionados em uma solução tampão em uma concentração adequada. Agentes adequados, soluções tampão e concentrações de agentes na solução tampão foram descrito s acima. A etapa de contato é realizada essencialmente conforme explicado acima no método para liberação do peptídeo amiloide o qual é anexado aos componentes (proteínas e lipídeos) da amostra biológica. Em uma modalidade preferencial, o agente de solubilização de proteína é um detergente. Em uma modalidade ainda mais preferencial, o detergente é Tween 20. Concentrações adequadas de Tween 20 para aplicação como agente de solubilização de proteína são conforme definido acima, isto é, entre 0,004 a 0,02%, mais preferencialmente de 0,005 a 0,01 % (em peso/ vol).

[00073] A etapa de contato é realizada preferencialmente em uma temperatura baixa de modo a inibir atividades proteolíticas presentes na amostra. Temperaturas adequadas são de cerca de 0 a 10 graus C, preferencialmente de cerca de 3 a 5 graus C, por exemplo, cerca de 4 graus C.

[00074] Tipicamente, a etapa de contato é realizada por ressuspensão da fração celular na amostra biológica com a solução compreendendo o agente de solubilização de proteína. A ressuspensão referida pode ser realizada pipetando delicadamente para cima e para baixo, por agitação, preferencialmente por misturação, mais preferencialmente por misturação em alta velocidade, o mais preferencialmente por turbilhonamento) por no mínimo 5 segundos, preferencialmente por no mínimo 10 segundos, mais preferencialmente por no mínimo 15 segundos (por exemplo, por 15 a 50 segundos). Velocidades vantajosas para a referida mistura, agitação, misturação, misturação em alta velocidade ou turbilhonamento compreendem uma velocidade de no mínimo 250 rpm, preferencialmente de no mínimo 500 rpm, mais preferencialmente de no mínimo 1.000 rpm, o mais preferencialmente de cerca de 2.000 a 2.500 rpm.

[00075] A etapa de contato é realizada sob condições adequadas para obter dissociação parcial ou, preferencialmente, total do peptídeo beta amiloide a partir das células presentes na amostra biológica. As condições podem ser adequadamente determinadas por uma pessoa com conhecimentos ordinários na técnica monitorando a quantidade de peptídeo beta amiloide o qual é detectável antes da etapa de contato e progressivamente em diferentes pontos do tempo depois da etapa de contato ter ocorrido. O curso de tempo do experimento pode ser determinado conforme descrito no exemplo da parte experimental.

[00076] Deste modo, em uma modalidade preferencial, o parâmetro o qual é determinado na etapa (i) do método da invenção é um ou mais do parâmetro selecionado entre o grupo do nível de ABETA40 associado a células presentes na amostra biológica (nas partes que se seguem conhecido como 3ab40 ou CB Aβ(1-40)) e o nível de ABETA42 associado a células presentes na amostra biológica (nas partes que se seguem conhecido como 3ab42 ou CB Aβ(1-42)).

[00077] A etapa seguinte do método da invenção compreende comparação do valor de no mínimo um dos parâmetros (b) ou (c) ou o valor de um parâmetro calculado resultante de combinar aritmeticamente um ou mais dos parâmetros (a) a (c) com um valor de referência correspondente ao valor dos referidos parâmetros (b) ou (c) ou do referido parâmetro calculado em uma amostra de referência em que (a), (b) e (c) foram definidos em detalhes acima e correspondem, respectivamente, ao nível de um peptídeo beta amiloide livre em uma amostra biológica do referido sujeito (a), aos níveis de agregados de um peptídeo amiloide livre em uma amostra biológica do referido sujeito e do referido peptídeo beta amiloide associados aos componentes macromoleculares presentes na referida amostra biológica (b) e ao nível de um peptídeo beta amiloide associado a células em uma amostra biológica do referido sujeito (c).

[00078] Os parâmetros os quais são usados na etapa (ii) do método da invenção são quer parâmetros diretos, isto é, parâmetros os quais podem ser determinados diretamente conforme definido acima e os quais correspondem àqueles previamente definidos como 2ab40, 3ab40, 2ab42 e 3ab42. Alternativamente, também é possível combinar aritmeticamente um ou mais dos parâmetros diretos de modo a obter um parâmetro calculado. Na prática, qualquer combinação aritmética de dois mais parâmetros pode produzir parâmetros calculados com valor diagnóstico incluindo adições, subextrações, multiplicações, divisões e combinações dos mesmos. Marcadores calculados particulares para aplicação no método da presente invenção incluem, sem limitação, 2ab40/2ab42, 3ab40/3ab42, 2ab40/3ab40, 2ab42/3ab42, 1ab40 + 2ab40, 1ab40 + 3ab40, 2ab40 + 3ab40, 1ab40 + 2ab40 + 3ab40, 1ab42 + 2ab42, 1ab42 + 3ab42, 2ab42 + 3ab42, 1ab42 + 2ab42 + 3ab42, 1ab40 + 2ab40 + 1ab42 + 2ab42, 1ab40 + 3ab40 + 1ab42 + 3ab42, 2ab40 + 3ab40 + 2ab42 + 3ab42, 1ab40 + 2ab40 + 3ab40 + 1ab42 + 2ab42 + 3ab42, (1ab40 + 2ab40)/(1ab42 + 2ab42), (1ab40 + 3ab40)/(1ab42 + 3ab42), (2ab40 + 3ab40)/(2ab42 + 3ab42), (1ab40 + 2ab40 3ab40)/(1ab42 + 2ab42 + 3ab42), (1ab42 + 2ab42)/(1ab40 + 2ab40), (1ab42 + 3ab42)/(1ab40 + 3ab40), (2ab42 + 3ab42)/(2ab40 + 3ab40), (1ab42 + 2ab42 3ab42)/(1ab40 + 2ab40 + 3ab40), 2ab40 -1ab40, 2ab42-1ab42 y (2ab40-1ab40)/(2ab42-1ab42). Em uma modalidade preferencial, o parâmetro calculado resulta da adição dos parâmetros 2ab40 e 3ab40 (nas partes que se seguem referidos como T40). Em outra modalidade preferencial, o parâmetro calculado resulta da adição dos parâmetros 2ab42 e 3ab42 (nas partes que se seguem referido como T42). Em ainda outra modalidade preferencial, o parâmetro calculado resulta da adição dos parâmetros 2ab40, 3ab40, 2ab42 e 3ab42 (nas partes que se seguem referido como T-βAPB).

[00079] O termo “valor de referência”, conforme usado aqui, neste Pedido de Patente, se refere a um valor do parâmetro o qual está sendo usado para comparação e o qual tenha sido determinado em um sujeito não sofrendo de uma doença neurodegenerativa ou sem qualquer histórico de doença neurodegenerativa. Preferencialmente, os sujeitos dos quais os valores de referência para os diferentes parâmetros e parâmetros calculados são obtidos são pacientes os quais apresentam uma ausência de queixas de memória, performance normal em testes neuropsicológicos e ausência de alterações estruturais na MRI.

[00080] Em particular, são selecionados valores de referência os quais possibilitam uma sensibilidade maior do que 85% e uma especificidade maior do que 75%. Em outra modalidade preferencial, os valores de referência são selecionados de modo a obter uma sensibilidade maior do que 70% e uma especificidade maior do que 70%. Preferencialmente, os valores de referência possibilitam obter um prognóstico com uma precisão ou exatidão de no mínimo 80%.

[00081] Na etapa (iii) do método da invenção, o diagnóstico da doença neurodegenerativa, a detecção de um estágio anterior a uma doença neurodegenerativa ou a distinção de uma doença neurodegenerativa de um estágio anterior a uma doença neurodegenerativa são realizados usando um grupo de marcadores em particular ou marcadores calculados os quais proporcionam níveis particularmente adequados de especificidade e de sensibilidade. Deste modo, em um exemplo particular, o diagnóstico de uma doença neurodegenerativa é realizado comparando o valor de um parâmetro selecionado entre o grupo de 3ab40 e 2ab42 ou o valor de um parâmetro calculado selecionado entre o grupo de 2ab40 + 3ab40 e 2ab40 + 3ab40 + 2ab42 + 3ab42.

[00082] Em outra modalidade particular, a detecção de um estágio anterior a uma doença neurodegenerativa é realizada comparando o valor de um parâmetro selecionado entre o grupo de 2ab40, 3ab40 e 2ab42 ou o valor de um parâmetro calculado selecionado entre o grupo de 2ab40 + 3ab40, 2ab40 + 3ab40 + 2ab42 + 3ab42, 1ab40 + 2ab40 + 3ab40 + 1ab42 + 2ab42 + 3ab42, 1ab40 + 2ab40 + 3ab40, 1ab42 + 2ab42 + 3ab42, 1ab40 + 1ab42 + 2ab42 + 3ab42, 1ab40 + 2ab40 + 1ab42 + 2ab42 e 1ab40 + 3ab40 + 1ab42 + 3ab42.

[00083] Em ainda outra modalidade, a diferenciação de uma doença neurodegenerativa de um estágio anterior à referida doença neurodegenerativa é realizada comparando o valor de um parâmetro selecionado entre o grupo de 3ab40 e 2ab42 ou comparando o valor de um parâmetro calculado selecionado entre o grupo de 2ab40 + 3ab40, 2ab40 + 3ab40 + 2ab42 + 3ab42 e 1ab40 + 2ab40 + 1ab42 + 2ab42.

[00084] Valores de referência adequados para os diferentes métodos de diagnóstico da invenção são resumidos na Tabela 1.

[00085] Tabela 1: Sumário de métodos preferenciais da invenção de acordo com o parâmetro e o valor de corte.

[00086] Uma vez que o valor do parâmetro ou do parâmetro calculado é determinado, o diagnóstico de uma doença neurodegenerativa, a detecção de um estágio anterior a uma doença neurodegenerativa ou a diferenciação de uma doença neurodegenerativa de um estágio anterior à referida doença neurodegenerativa de acordo com a invenção é realizada onde há uma alteração no valor do parâmetro ou no valor do parâmetro calculado com respeito ao valor de referência.

[00087] O termo "alteração" se refere a um aumento ou redução estatisticamente significativo no valor do parâmetro em questão com respeito ao valor de referência.

[00088] Por “estatisticamente significante”, conforme usado aqui, neste Pedido de Patente, se referem a uma análise estatística da probabilidade de que haja uma associação não aleatória entre dois ou mais resultados, desfechos ou evolução, isto é, que haja um certo grau de certeza matemática de que o valor do parâmetro seja associado com uma população de pacientes em particular com respeito ao valor de referência.

[00089] A importância estatística da alteração nos valores pode ser determinada usando p-valor. Por exemplo, ao usar p-valor, um parâmetro é identificado como apresentando uma alteração significativa quando o p-valor é menor do que 0,1, preferencialmente menor do que 0,05, mais preferencialmente menor do que 0,01, ainda mais preferencialmente menor do que 0,005, o mais preferencialmente menor do que 0,001.

[00090] Tipicamente, o valor do parâmetro em questão pode ser atribuído como sendo “aumentado” quando o valor acima o valor de referência é de no mínimo 1,1 vez, 1,5 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes, 100 vezes ou ainda mais comparado com o valor de referência. Por outro lado, um valor de parâmetro pode ser considerado como sendo “reduzido” quando é no mínimo 0,9 vez, 0,75 vez, 0,2 vez, 0,1 vez, 0,05 vez, 0,025 vez, 0,02 vez, 0,01 vez, 0,005 vez ou ainda menos comparado com valor de referência. Em uma modalidade particular, a alteração no valor do parâmetro ou no valor do parâmetro calculado com respeito ao valor de referência é um aumento.

[00091] Qualquer método adequado para a determinação de peptídeos pode ser usado na presente invenção. A título de exemplo, a concentração de peptídeo beta amiloide pode ser determinada usando uma ou mais técnicas escolhidas entre Western blot, imunoprecipitação, ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA), ressonância de plasmon superficial, reação de precipitina, um ensaio de imunodifusão de difusão de gel, radioimunoensaio (RIA), classificação celular ativada por fluorescente (FACS), eletroforese por gel bidimensional, eletroforese capilar, espectroscopia de massa (MS), espectrometria de massa com analisador de tempo de voo e ionização / dessorção a laser assistida por matriz (MALDI-TOF), ionização por dessorção a laser realçada por superfícieem tempo de vôo (SELDI-TOF), cromatografia líquida de alta performance (HPLC), cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC), cromatografia líquida multidimensional (LC) seguida por espectrometria de massa tandem (MS/MS), cromatografia de camada fina, análise de expressão de chip de proteína e densiometria a laser.

[00092] Em uma modalidade preferencial, a determinação do no mínimo um ou mais de 1ab40, 1ab42, 2ab40, 2ab42, 3ab40 e 3ab42 é realizada por um método imunológico. Conforme usado aqui, neste Pedido de Patente, “método imunológico”, quando aplicado a uma determinação, se refere a qualquer método o qual envolve o uso de um ou mais anticorpos específicos para uma substância alvo de modo a determinar a quantidade / concentração da referida substância alvo excluindo outras substâncias encontradas na amostra. Métodos imunológicos adequados incluem, sem limitação, Western blot, imunoprecipitação, ensaio imunossolvente ligado a enzima (ELISA), ressonância de plasma superficial, radioimunoensaio (RIA).

[00093] A pessoa versada reconhecerá que qualquer tipo de anticorpo é adequado para realizar os métodos de detecção imunológicos de acordo com a invenção contanto que o anticorpo seja suficientemente específico para discriminar de modo eficaz as espécies de peptídeos beta-amiloides na amostra de outras substâncias. Moléculas de anticorpos adequadas para aplicação nos métodos imunológicos da invenção incluem, sem limitação: (i) anticorpos "intactos" os quais compreendem uma região variável de ligação de antígeno bem como um domínio constante de cadeia leve (CL) e domínios constantes de cadeia pesada, CH1, CH2 e CH3, (ii) fragmentos “Fab” resultantes da digestão por papaína de um anticorpo intacto e os quais compreendem um único sítio de ligação antigênica e uma região CL e uma CH1, (iii) fragmentos “F(ab’)2” resultantes da digestão por pepsina de um anticorpo intacto e os quais contêm dois sítios de ligação antigênica, (iv) fragmentos “Fab'” contêm o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada e tem um sítio de ligação antigênica somente. Fragmentos Fab' diferem de fragmentos Fab pela adição de uns poucos resíduos no término carbóxi do domínio CH 1 de cadeia pesada incluindo uma ou mais cisteínas da região de articulação do anticorpo. (v) “Fv” é o fragmento de anticorpo mínimo o qual contém um sítio completo de reconhecimento de antígeno e de ligação antigênica. Esta região consiste de um dímero de um domínio variável de cadeia leve e uma cadeia pesada em firme associação não covalente. É nesta configuração que as três regiões hipervariáveis (CDRs) de cada domínio variável interagem para definir um sítio de ligação antigênica sobre a superfície do dímero VH - VL. Coletivamente, as seis regiões hipervariáveis conferem especificidade de ligação de antígeno ao anticorpo. No entanto, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv compreendendo somente três regiões hipervariáveis específicas para um antígeno) tem a capacidade para reconhecer e ligar antígeno, embora em uma menor afinidade do que o sítio de ligação inteiro. (vi) fragmentos de anticorpos FV de cadeia única ou "scFv" compreendem os domínios de anticorpo, VL e VH, em que estes domínios estão presentes em uma única cadeia de polipeptídeo. Preferencialmente, as regiões VL e VH são conectadas por um encadeador de polipeptídeo o qual possibilita que o scFv forme a estrutura desejada para ligação de antígeno. (vii) “Diabodies” compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) sobre a mesma cadeia de polipeptídeo (VH-VL) conectado por um encadeador de peptídeo que é curto demais para possibliitar pareamento entre os dois domínios sobre a mesma cadeia. Isto força pareamento com os domínios complementares de outra caceia e promove a montagem de uma molécula dimérica com dois sítios de ligação de antígeno funcionais. (viii) "Anticorpos biespecíficos" (BAbs) são anticorpos únicos, divalentes (ou fragmentos imunoterapeuticamente eficazes dos mesmos) os quais têm dois sítios de ligação de antígeno diferentemente específicos. os dois sítios de antígeno podem ser acoplados juntos quimicamente ou por métodos de engenharia genética conhecidos na técnica.

[00094] Todos estes fragmentos de anticorpos podem ser adicionalmente modificados usando técnicas convencional de conhecimento na arte, por exemplo, usando uma ou mais aminoácidos eliminações, uma ou mais inserções, uma ou mais substituições, uma ou mais adições, e/ou recombinação (e/ou qualquer outra uma ou mais modificações (por exemplo, modificações pós translacional e química, tais como glicosilação e fosforilação) conhecidas na arte quer isoladas ou em combinação. Os métodos para introduzir as referidas modificações na sequência de DNA subjacente à sequência de aminoácidos de uma cadeia de imunoglobulina são de conhecimento geral da pessoa versada na técnica; vide, por exemplo, Sambrook et al.; Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd edition 1989 e 3rd edition 2001.

[00095] Anticorpos compreendem tanto anticorpos policlonais quanto monoclonais. Para a produção de anticorpos policlonais, vários hospedeiros incluindo cabras, coelhos, ratos, camundongos, camelos, dromedários, lhamas, humanos, aves e outros podem ser imunizados por injeção com um peptídeo correspondente a um fragmento de Aβ40 ou Aβ42 o qual tenha propriedades imunogênicas. Dependendo da espécie hospedeira, vários adjuvantes podem ser usados para aumentar a resposta imunológica. Os adjuvantes referidos incluem, mas não estão limitados a, adjuvante de Freund, géis minerais tais como hidróxido de alumínio, e substâncias ativas na superfície tais como lisolecitina, poliânions, peptídeos, emulsões de óleo, KLH, e dinitrofenol. Entre os adjuvantes usados em humanos, BCG (bacilos Calmette-Guerin) e Corynebacterium parvum são especialmente preferenciais. Se o antígeno for um peptídeo, pode ser útil conjugá-lo a uma proteína que seja imunogênica na espécie a ser imunizada. Por exemplo, o antígeno pode ser conjugado a hemocianina da lapa californiana Megathura crenulata (KLH), Blue Carrier (hemocianina isolada de Concholepas concholepas), tiroglobulina bovina, ou inibidor da tripsina da soja, usando um agente bifuncional ou de derivação, por exemplo, éster de sulfossuccinimida de maleimidobenzoíla (conjugação através de resíduos cisteína), N-hidroxissuccinimida (através de resíduos lisina), glutaraldeído, anidrido succínico ou SOCl2.

[00096] Para a produção de anticorpos monoclonais, podem ser usadas técnicas convencional. Por exemplo, anticorpos monoclonais podem ser preparados usando o método do hibridoma descrito pela primeira vez por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975) usando o procedimento descrito em detalhes nas unidades 11.4 a 11.11 de Ausubel, F.M. et al. (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc; ring-bound edition, 2003). Alternativamente, anticorpos monoclonais podem ser isolados por procedimentos de DNA recombinante a partir de bibliotecas de fagos de anticorpos produzidas usando as técnicas descritas em McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clacksoii et al., Nature, 352:624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) descrevem o isolamento de anticorpos murinos e humanos, respectivamente, usando bibliotecas de fagos. Publicações subsequentes descrevem a produção de anticorpos humanos de alta afinidade (faixa de nM) por embaralhamento de cadeias (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), bem como infeção combinatorial e recombinação in vivo como uma estratégia para construção de bibliotecas de fagos muito grandes (Waterhouse et al., Nucl. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). Portanto, estas técnicas são alternativas viáveis a técnicas de hibridoma de anticorpos monoclonais tradicionais para isolamento de anticorpos monoclonais.

[00097] Anticorpos policlonais podem ser usados diretamente como um antissoro obtido a partir de hospedeiros imunizados depois de sangramento e remoção do coágulo de fibrina. Anticorpos monoclonais podem ser usados diretamente como o sobrenadante da cultura de hibridoma ou como fluido de ascite depois da implantação do hibridoma na cavitade peritoneal de um hospedeiro adequado. Alternativamente, as moléculas de imunoglobulina, quer policlonais ou monoclonais, podem ser purificadas antes de seu uso por meios convencionais tais como purificação por afinidade usando peptídeos derivados de peptídeos beta-amiloides, purificação por gel não desnaturante, HPLC ou RP-HPLC, exclusão por tamanho, purificação sobre coluna de proteína A, ou qualquer combinação destas técnicas.

[00098] Anticorpos adequados para realização dos métodos imunológicos da invenção incluem, sem limitação: (i) Anticorpos os quais reconhecem uma região da região N-terminal de peptídeos beta-amiloides, tais como anticorpos específicos para os epítopos localizados dentro dos aminoácidos 1 a 16, 1 a 17, 13 a 28, 15 a 24, 1 a 5 e 1 a 11 de Aβ40 ou Aβ42. Anticorpos preparados contra um peptídeo correspondente à região C- terminal do peptídeo Aβ42 a qual liga especificamente a Aβ42 sem proporcionar qualquer reação cruzada substancial com Aβ40 ou Aβ43, (ii) Anticorpos preparados contra um peptídeo correspondente à região C-terminal do peptídeo Aβ40 a qual liga especificamente a Aβ40 sem proporcionar qualquer reação cruzada substancial com Aβ42, Aβ39, Aβ38, Aβ41 ou Aβ43, (iii) Anticorpos que reconhecem simultaneamente a região C-terminal tanto de Aβ40 quanto de Aβ42 e (iv) Anticorpos específicos para a região da junção de peptídeos beta-amiloides, os quais são adequados para distinguir peptídeos beta-amiloides de outros fragmentos de APP e os quais estão localizados dentro dos aminoácidos 16 e 17, tipicamente abrangendo os resíduos aminoácidos 13 a 28. (v) uma combinação de dois ou mais dos anticorpos men-cionados em (i) a (iv).

[00099] Em uma modalidade preferencial, a determinação da quantidade de peptídeo beta amiloide é realizada por ELISA.

[000100] O termo “ELISA”, conforme usado aqui, neste Pedido de Patente, significa ensaio imunossolvente ligado a enzima e se refere a um ensaio pelo qual uma quantidade desconhecida da substância alvo (o peptídeo beta amiloide) é afixada a uma superfície, e em seguida um anticorpo específico é lavado sobre a superfície de modo que ele pode ligar ao antígeno. Este anticorpo é encadeado a uma enzima, e na etapa final é acrescentada uma substância que a enzima pode converter para algum sinal detectável. São conhecidos diferentes tipos de ensaios ELISA e podem ser aplicados ao método da invenção, incluindo ELISA direto, ELISA de sanduíche, ELISA competitivo e método e dispositivo de ELISA reversa (ELISA-R m&d).

[000101] ELISA direto é realizado contatando a amostra de teste compreendendo o peptídeo beta amiloide com um suporte sólido o qual tenha sido previamente revestido com uma solução concentrada de uma proteína não interagente ou reagente (albumina sérica bovina, caseína). Uma vez que o peptídeo beta amiloide presente na amostra de teste é absorvido sobre o suporte, um anticorpo específico para peptídeo beta amiloide é acrescentado sob condições adequadas para ligação para o peptídeo beta amiloide. O anticorpo o qual é ligado é em seguida detectado com um anticorpo secundário o qual é acoplado a uma etiqueta detectável ou a uma enzima modificadora de substrato. O sinal resultante da etiqueta detectável ou do substrato é em seguida proporcional à quantidade de anticorpo ligado ao suporte o qual, por sua vez, se correlaciona diretamente com a quantidade de peptídeo beta amiloide na amostra.

[000102] Ensaio ELISA competitivo inclui uma primeira etapa em que a amostra de teste compreendendo uma quantidade desconhecida de peptídeo beta amiloide é contatada com um primeiro anticorpo conforme definido acima. Os complexos de antígeno-anticorpo são acrescentados a uma cavidade revestida com antígeno. Uma vez que o suporte é lavado para remover quaisquer complexos ligados de modo inespecífico, a quantidade do primeiro anticorpo é detectada com um segundo anticorpo o qual é acoplado a uma porção detectável. Neste tipo de testes, quanto maior a concentração do antí- geno original, mais fraco o eventual sinal. Um ensaio ELISA competitivo alternativo é aquele o qual inclui um antígeno ligado a enzima ao invés de anticorpo ligado a enzima. O antígeno etiquetado compete por sítios de ligação de anticorpo primário com o antígeno da amostra (não etiquetado). Usando este tipo de testes, a concentração de antígeno na amostra se correlaciona inversamente com a quantidade de antígeno etiquetado retido na cavidade e, por conseguinte, em um sinal mais fraco.

[000103] O método e dispositivo de ELISA reversa (ELISA-R m&d) usa uma fase sólida inovadora constituída de uma haste de poliestireno imunossolvente com 4 a 12 ogivas protruberantes; o dispositivo inteiro é adequado para ser introduzido em um tubo de teste contendo a amostra coletada e as etapas seguintes (lavagem, incubação em conjugado e incubação em cromógeno) são facilmente realizadas imergindo as ogivas em microcavidades de microlâminas de rotina enchidas previamente com reagentes, seladas e armazenadas até sua aplicação.

[000104] Em uma modalidade preferencial, o ensaio ELISA é um ensaio ELISA de sanduíche. O ensaio ELISA de sanduíche envolve revestimento de um suporte com um primeiro anticorpo específico para peptídeo beta amiloide, aplicação da amostra contendo o peptídeo beta amiloide o que resultará na ligação do peptídeo beta amiloide ao primeiro anticorpo e aplicação de um segundo anticorpo também específico para peptídeo beta amiloide, em que o segundo anticorpo referido geralmente é acoplado a uma etiqueta detectável ou a uma enzima modificadora de substrato. O sinal gerado pela etiqueta ou pelo substrato convertido é o proporcional à quantidade de antígeno na amostra.

[000105] No contexto da presente invenção, o primeiro anticorpo será referido como “anticorpo de captura”, significando que este anticorpo é usado para recuperar de uma amostra todas as espécies moleculares às quais o anticorpo liga especificamente. Praticamente não há nenhuma limitação com respeito ao tipo de anticorpo que pode ser usado como anticorpo de captura contanto que contenha no mínimo um sítio de ligação antigênica específico para Aβ40 e/ou Aβ42. Deste modo, qualquer um dos anticorpos mencionados acima pode ser usado como anticorpo de captura.

[000106] No contexto da presente invenção, o segundo anticorpo será referido como “anticorpo de detecção”, uma vez que este anticorpo será usado para detectar a quantidade de antígeno a qual foi retida pelo anticorpo de captura. Assim como com o anticorpo de captura, praticamente não há nenhuma limitação com respeito ao tipo de anticorpo que pode ser usado como anticorpo de detecção. No entanto, também será entendido pela pessoa versada na técnica que o anticorpo de detecção (i) deve ligar a uma região do antígeno a qual não é coberta pelo anticorpo de captura e (ii) deve conter não somente o sítio de ligação de antígeno mas também quer uma etiqueta detectável, uma enzima modificadora de substrato ou uma região ou regiões adicional que podem ser especificamente detectadas por um reagente apresentando elevada afinidade de ligação para o referido anticorpo, de modo a possibilitar detecção do anticorpo o qual é ligado ao antígeno capturado pelo anticorpo de captura. Preferencialmente, as referidas regiões adicionais as quais podem ser especificamente ligadas pelo referido reagente correspondem à região constante da molécula de imunoglobulina.

[000107] Em uma modalidade preferencial, o anticorpo de captura é um anticorpo específico contra a região N-terminal dos peptídeos beta- amiloides. Em uma modalidade ainda mais preferencial, o referido anticorpo de captura é um anticorpo específico contra um epítopo localizado dentro dos aminoácidos 1 a 16 de Abeta40 ou Abeta42. Um anticorpo de captura particularmente preferencial é o anticorpo monoclonal 6E10 conforme descrito por Kim, K.S. (Neuroscience Res. Comm. 1988, 2:121-130).

[000108] Em outra modalidade preferencial, o anticorpo de detecção é um anticorpo específico contra um epítopo localizado na região C- terminal do peptídeo beta amiloide. Conforme explicado acima, a maturidade do anticorpo de detecção pode ser adequadamente escolhida por uma pessoa com conhecimento regular da técnica dependendo do número de espécies beta-amiloides que devem ser detectadas.

[000109] De modo a detectar ou determinar especificamente Aβ40, o anticorpo de captura pode ser um anticorpo o qual reconhece a região N-terminal de Aβ40 (e além de Aβ42, uma vez que ambos os peptídeos têm regiões N-terminais idênticas) e o anticorpo de detecção pode ser um anticorpo o qual reconhece especificamente a região C-terminal de Aβ40 sem proporcionar qualquer reação cruzada com Aβ42. Alternativamente, Aβ40 pode ser especificamente detectado usando um anticorpo de captura o qual reconhece a região C-terminal de Aβ40 sem proporcionar qualquer reação cruzada com Aβ42 e um anticorpo de detecção o qual reconhece uma região de Aβ40 a qual é comum tanto a Aβ40 quanto a Aβ42, preferencialmente a região N-terminal de Aβ42/Aβ40.

[000110] De modo a detectar ou determinar especificamente Aβ42, o anticorpo de captura pode ser um anticorpo o qual reconhece a região N-terminal de Aβ42 (e também de Aβ40, uma vez que ambos os peptídeos têm regiões N-terminais idênticas) e o anticorpo de detecção pode ser um anticorpo o qual reconhece especificamente a região C-terminal de Aβ42 sem proporcionar qualquer reação cruzada com Aβ40. Alternativamente, Aβ42 pode ser detectado especificamente usando um anticorpo de captura o qual reconhece a região C-terminal de Aβ42 e um anticorpo de detecção o qual reconhece uma região de Aβ42 a qual é comum tanto a Aβ42 quanto a Aβ40.

[000111] De modo a detectar ou determinar simultaneamente Aβ42 e Aβ40, o anticorpo de captura pode ser um anticorpo o qual reconhece a região N-terminal comum a Aβ42 e Aβ40 e o anticorpo de detecção pode ser uma combinação de no mínimo dois anticorpos, em que o primeiro anticorpo reconhece especificamente a região C-terminal de Aβ42 sem proporcionar qualquer reação cruzada com Aβ40 e o segundo anticorpo reconhece especificamente a região C-terminal de Aβ40 sem proporcionar qualquer reação cruzada com Aβ42. Alternativamente, o anticorpo de captura pode ser um anticorpo o qual reconhece a região N-terminal comum a Aβ42 e Aβ40 e o anticorpo de detecção pode ser um anticorpo que reconhece a região C-terminal de tanto Aβ40 quanto Aβ42. Alternativamente, Aβ42 e Aβ40 podem ser detectados simultaneamente usando como anticorpo de captura uma mistura de no mínimo dois anticorpos compreendendo um primeiro anticorpo o qual reconhece especificamente a região C-terminal de Aβ42 sem proporcionar qualquer reação cruzada com Aβ40 e um segundo anticorpo o qual reconhece especificamente a região C- terminal de Aβ40 sem proporcionar qualquer reação cruzada com Aβ42 e um anticorpo de detecção o qual reconhece a região N- terminal comum a tanto Aβ42 quanto Aβ40. Alternativamente, Aβ42 e Aβ40 podem ser detectados simultaneamente usando como anticorpo de captura um anticorpo o qual reconhece a região C-terminal de tanto Aβ40 quanto Aβ42 e um anticorpo de detecção o qual reconhece a região N-terminal comum a tanto Aβ42 quanto Aβ40.

[000112] Anticorpos específicos para Aβ40 e Aβ42 e métodos para sua preparação foram descritos em detalhes no Pedido de Patente internacional No. WO2004024770 e Pedido de Patente internacional No. WO2004098631, cujos conteúdos são incorporados aqui, a este Pedido de Patente, por meio de referência.

[000113] Os anticorpos de detecção e/ou os anticorpos de captura podem ter sido purificados por afinidade usando um polipeptídeo o qual compreende a sequência do polipeptídeo usado para sua preparação.

[000114] Conforme mencionado acima, o anticorpo de detecção pode ser diretamente acoplado a uma etiqueta detectável ou a uma enzima modificadora de substrato. Preferencialmente, pode ser usado um reagente o qual apresenta afinidade para o anticorpo de detecção, em cujo caso, é o referido reagente o qual é etiquetado com uma etiqueta detectável ou com uma enzima modificadora de substrato ao invés do anticorpo de detecção. Além disso, o reagente de ligação de anticorpo pode ser acoplado a um primeiro membro de um par de ligação, em cujo caso, é o segundo membro de um par de ligação o qual pode ser acoplado a uma etiqueta detectável ou a uma enzima modificadora de substrato.

[000115] O reagente de ligação de anticorpo pode ligar de modo não-covalente a um ou mais tipos em particular, uma ou mais classes particulares e/ou uma ou mais subclasses particulares de um anticorpo ou fragmentos de anticorpo. Alternativamente, o reagente de ligação de anticorpo pode ligar de modo não covalente a um anticorpo específico para um antígeno em particular. Em determinadas modalidades, o reagente de ligação de anticorpo liga de modo não covalente à região Fc ou à região F(ab) do anticorpo de detecção. Reagentes de ligação de anticorpo preferenciais incluem proteína A, proteína G, proteína V, proteína L, um anticorpo anti-Fc ou fragmento de ligação de anticorpo e um receptor de Fc (FcR) ou um fragmento de ligação de anticorpo do mesmo. Exemplos não limitantes de anticorpos os quais podem ser ligados de modo não covalente ao anticorpo de detecção incluem anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecífcos, anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, anticorpos de domínio único, Fvs de cadeia única (scFv) anticorpos de cadeia única, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), Fvs encadeados por dissulfeto (sdFv), intrabodies, e anticorpos anti-idiotípicos (anti- Id), e fragmentos de ligação de epítopo de qualquer um dos acima. Exemplos não limitantes de receptores de Fc incluem FCYRI, FCYRIIA, FCYRIIB, FCYRIIC, FcYRIIIAα, FcyRIIIB, FcεRIα, FcεRI^ e FCYRIIIA^.

[000116] Pares de ligação adequados incluem para aplicação em detecção incluem: ■ hapteno ou antígeno / anticorpo, por exemplo, digoxina e anticorpos anti-digoxina ■ biotina ou análogos de biotina (por exemplo, aminobiotina, iminobiotina ou destiobiotina) / avidina ou estreptavidina, ■ açúcar / lectina, ■ enzima e cofator ■ ácido fólico / folato ■ oligonucleotiídeos de filamento duplo que ligam seletivamente a proteínas /, fatores de transcrição. ■ ácido nucleico ou análogo de ácido nucleico / ácido nucleico complementar, ■ receptor / ligante, por exemplo, receptor de hormônios esteroides / hormônio esteroide.

[000117] Será entendido que o termo “primeiro” e “segundo” membro de um par de ligação é relativo e que cada um dos membros acima pode ser visto como primeiro ou segundo membros do par de ligação. Em uma modalidade preferencial, o primeiro membro de um par de ligação é biotina ou uma variante funcionalmente equivalente da mesma e o segundo membro do par de ligação é avidina, estreptavidina ou uma variante funcionalmente equivalente da mesma.

[000118] Em uma modalidade preferencial, o segundo membro do par de ligação é estreptavidina.

[000119] Etiquetas detectáveis adequadas incluem, sem limitação, porções fluorescentes (por exemplo, fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, Cumarina, oxazina, resorufina, cianina e derivados das mesmas.), porções luminescentes (por exemplo, nanopartículas Qdot® fornecidas pela Quantum Dot Corporation, Palo Alto, CA).

[000120] Enzimas modificadoras de substrato adequadas são aquelas capazes de gerar um sinal detectável, por exemplo, na adição de um ativador, substrato, agente de amplificação e semelhantes. Enzimas as quais são adequadas como etiquetas detectáveis para a presente invenção e os substratos correspondentes incluem: • Fosfatase alcalina: o Substratos cromogênicos: Substratos à base de p- nitrofenil fosfato (p-NPP), 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato/nitroblue tetrazólio (BCIP/NPT), Fast-Red/naftol-AS-TS fosfato o Substratos fluorogênicos: 4-metilumbeliferil fosfato (4-MUP), 2-(5'-cloro-2’-fosforiloxifenil)-6-cloro-4-(3H)-quinazolinona (CPPCQ), difosfato de 3,6-fluoresceína (3,6-FDP), Fast Blue BB, Fast Red TR, ou Fast Red Violet LB sais de diazônio • Peroxidases: o Substratos cromogênicos à base de 2,2-azinobis(3- etilbenzotiazolina-6-sulfônico ácido) (ABTS), o-fenilenodiamina (OPT), 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB), o-dianisidina, ácido 5- aminossalicílico, 3-dimetilaminobenzóico ácido (DMAB) e 3-metil-2- benzotiazolinahidrazona (MBTH), 3-amino-9-etilcarbazol (AEC)- e tetraidrocloreto de 3,3'-diaminobenzidina (DAB). o Substratos fluorogênicos: ácido 4-hidroxi-3- metoxifenilacético, fenoxazinas reduzidas e benzotiazinas reduzidas, incluindo reagente Amplex® Red, Amplex UltraRed e diidroxantenos reduzidos. • Glicosidases: o Substratos cromogênicos: o-nitrofenil-β-D-galactosideo (o-NPG), p-nitrofenil-β-D-galactosideo e 4- metilumbellifenil-β-D- galactosídeo (MUG) for β-D-galactosidase. o Substratos fluorogênicos: resorufina β-D- galactopiranosídeo, digalactosídeo de fluoresceína (FDG), diglicuronídeo de fluoresceína, 4-metilumbeliferil β-D-galactopiranosideo, carboxiumbeliferil β-D-galactopiranosideo e β-D- galactopiranosídeos de cumarina fluorados. • Oxidorredutases (luciferase): o Substratos luminiscentes: luciferina.

KITS DA INVENÇÃO

[000121] A invenção também proporciona kits os quais são adequados para praticar o método da invenção. Deste modo, em outro aspecto, a invenção proporciona um kit para determinação de peptídeos beta-amiloides em uma amostra biológica compreendendo (i) um agente de solubilização de proteína e (ii) no mínimo um anticorpo contra um peptídeo beta ami- loide.

[000122] Os componentes (i) e (ii) do kit são essencialmente conforme descrito em relação ao método da invenção. Em uma modalidade preferencial, o agente de solubilização de proteína reagente é um detergente. Em uma modalidade ainda mais preferencial, o detergente é Tween20.

[000123] Em outra modalidade preferencial, o no mínimo um anticorpo contra o peptídeo beta amiloide é selecionado entre o grupo de (i) um anticorpo contra a região N-terminal do peptídeo beta amiloide, (ii) um anticorpo contra a região C-terminal do peptídeo beta amiloide e (iii) uma combinação de um anticorpo contra a região N-ter- minal do peptídeo beta amiloide e um anticorpo contra a região C- terminal do peptídeo beta amiloide.

[000124] Em uma modalidade ainda mais preferencial, o kit da invenção compreende um anticorpo contra a região N-terminal do peptídeo beta amiloide o qual é direcionado contra um epítopo localizado dentro dos aminoácidos 1 a 16 de ABETA40 e ABETA42. Em outra modalidade preferencial, o kit da invenção compreende um anticorpo contra a região C-terminal do peptídeo beta amiloide o qual é direcionado contra um peptídeo é selecionado do grupo de : (i) um anticorpo policlonal preparado contra um peptídeo correspondente à região C- terminal do peptídeo ABETA42 a qual liga especificamente a ABETA42 sem proporcionar qualquer reação cruzada substancial com ABETA40 (ii) um anticorpo policlonal preparado contra um peptídeo correspondente à região C-terminal do peptídeo ABETA40 a qual liga especificamente a ABETA40 sem proporcionar qualquer reação cruzada substancial com ABETA42 e (iii) um anticorpo que reconhece simultaneamente a região C-terminal de tanto ABETA40 quanto ABETA42 e (iv) uma combinação dos anticorpos sob (i) e (ii).

[000125] Em uma modalidade preferencial, o kit da invenção compreende adicionalmente um suporte sólido. Conforme usado aqui, neste Pedido de Patente, o termo "suporte" ou "superfície" se refere a uma fase sólida a qual é um material insolúvel em água poroso ou não poroso que pode ter qualquer um de uma série de formatos, tais como fita, haste, partículas, incluindo partículas de látex, partículas magnéticas, micropartículas, contas, membranas, cavidades de microtítulo e tubos plásticos. Em princípio, qualquer material é adequado como suporte sólido contanto que seja capaz de ligar quan- tidades suficientes do anticorpo de captura. Deste modo, a escolha do material de fase sólida é determinada com base nas características de performance do formato do teste desejado. Materiais adequados para o suporte sólido incluem materiais poliméricos, particularmente materiais celulósicos e materiais derivados de celulose, tais como papéis contendo fibra, por exemplo, papel filtro, papel cromatográfico, papel de fibra de vidro, etc.; polímeros sintéticos ou que ocorrem naturalmente modificados, tais como nitrocelulose, acetato de celulose, poli (vinil cloreto), poliacrilamida, dextrano reticulado, agarose, poliacrilato, polietileno, polipropileno, poli(4-metilbuteno), poliestireno, polimetacrilato, poli(etileno tereftalato), nylon, polivinil butirato), etc.; quer usados isolados ou em combinação com outros materiais; vidro tal como, por exemplo, vidro disponível como biovidro, cerâmicas, metais, e semelhantes. Polímeros não reticulados de estireno e estireno carboxilado ou estireno funcionalizado com outros grupamentos ativos tais como amino, hidroxila, halo e semelhantes são preferenciais. Em alguns casos, serão usados copolímeros de estirenos substituídos com dienos tais como butadieno.

[000126] O suporte sólido e o anticorpo podem ser proporcionados separadamente no kit ou, alternativamente, o suporte pode ser liberado já pré-revestido com o anticorpo de captura. Neste caso, o suporte pode ter sido tratado com uma solução de bloqueio depois da ligação do anticorpo de captura.

[000127] Componentes adicionais do kit podem incluir: • Meios para remover do paciente a amostra a ser analisada. • Tampões e soluções necessários para preparar curvas padrões dos peptídeos beta-amiloides. • Tampões e soluções para lavagem e bloqueio do suporte sólido durante o teste • Tampões e soluções para revestir o suporte sólido com o anticorpo de revestimento • Reagentes para desenvolver o sinal colorido ou fluorogênico da etiqueta detectável. • Reagentes para interromper a formação do produto colorido ou fluorogênico a partir da etiqueta detectável (por exemplo, 1N H2SO4) • Uma amostra contendo uma solução de matéria-prima dos peptídeos Aβ40 ou Aβ42 ou uma combinação dos mesmos.

[000128] Em uma modalidade preferencial, o kit da invenção compreende dois anticorpos os quais podem ser usados em um ensaio ELISA de sanduíche. Neste caso, um dos anticorpos, o anticorpo de captura, é imobilizado sobre um suporte sólido. A imobilização pode ser realizada antes da ligação do polipeptídeo alvo a ser detectado ou uma vez que o peptídeo / a proteína é ligado ao anticorpo de captura. Em qualquer caso, se for usado um suporte sólido, é conveniente bloquear o excesso de sítios de ligação de proteína sobre o suporte antes da adição da amostra contendo o polipeptídeo alvo a ser determinado. Preferencialmente, o bloqueio ou a extinção dos sítios de ligação de sobre o suporte é realizado usando o mesmo tampão o qual é usado para lavar os complexos depois de cada reação de ligação (por exemplo, 50 mM de Tris-HCl, pH 8, PBS ou TBS opcionalmente, compreendendo Tween 20) suplementado com um composto macromolecular (por exemplo, albumina sérica bovina, leite em pó sem gordura, reagente de western blocking, caseína, lactoalbumina, ovalbumina) em concentrações a partir de cerca de 0,05% a 10%, preferencialmente 1 a 5%, mais preferencialmente cerca de 3%.

[000129] A invenção é descrita nas partes que se seguem por meio dos exemplos que se seguem os quais devem ser considerados como meramente ilustrativos e não limitantes do âmbito da invenção. EXEMPLOS EXEMPLO 1 População do estudo

[000130] O estudo incluiu 40 participantes: 16 controles saudáveis (HC), 8 pacientes com disfunção cognitiva branda amnésica (MCI) e 16 pacientes com doença de Alzheimer (AD). Todos com idade superior a 65 anos e 50 % de cada sexo em cada grupo. As características demográficas dos participantes estão resumidas na tabela 2.

[000131] Tabela 2. Características demográficas

*O grau de instrução é expressado como 0: sem estudo. 1: Educação Primária. 2: Educação Secundária. 3: Educação Universitária. 1 U-Teste de Kruskal-Wallis, contrasta com U-Teste de Mann-Whitney. H, M, e A significam significativo com respeito a HC, MCI e AD respectivamente.

[000132] Controles saudáveis foram cuidadosamente selecionados entre voluntários socialmente ativos residentes na comunidade, com ausência de queixas de memória, performance normal em testes neuropsicológicos e ausência de alterações estruturais em estudo por imagens de ressonância magnética (MRI) quantitativo.

[000133] Participantes com disfunção cognitiva branda preenchiam os critérios da Clínica Mayo. Adicionalmente, para a seleção de participantes com disfunção cognitiva branda, foi necessário um CDR de 0,5 pontos, mais de 3 pontos na escala de Scheltens (J. Neurol. Neurosurg Psychiatry. 1992; 55:967-972) para atrofia temporal medial e um padrão de hipometabolismo parietal e/ou temporal em tomografia de emissão de pósitrons com 18-fluordesoxiglicose (PET-FDG), sugestivo de conversão para doença de Alzheimer. Foram excluídos pacientes com qualquer patologia psiquipatrica ou sistêmica, diferente de possível doença neurodegenerativa, que pudesse causar a disfunção cognitiva branda.

[000134] Os critérios de inclusão específicos para o grupo com doença de Alzheimer foram um diagnóstico de doença de Alzheimer provável (critérios do NINCDS-ADRDA), um CDR de 1 ponto, um MMSE entre 16 e 24 pontos e mais de 3 pontos na escala de Scheltens para atrofia temporal medial.

[000135] Foi realizado teste cognitivo para diagnóstico de disfunção cognitiva branda e de doença de Alzheimer de acordo com as rotinas da ACE Memory Clinic conforme descrito alhures.

[000136] Foi obtido consentimento informado por escrito de cada participante (ou no caso de vários pacientes com doença de Alzheimer por seu parente mais próximo. Os protocolos do estudo foram revisados e aprovados pelo Comitê de Ética do Hospital Clínic i Provincial (Barcelona, Espanha). EXEMPLO 2 Preparação das amostras

[000137] É colhido sangue de um sujeito e um pélete de Roche CompleteMini é acrescentado (inibidores de protease) para cada 10 ml. O sangue ou é diretamente centrifugado ou é preservado a 4°C e é centrifugado no mesmo dia do teste.

[000138] O plasma é separado da fração de células e o plasma é coletado e centrifugado em alíquotas de 0,5 ml em tubos Eppendorf. As alíquotas podem ser mantidas a -80°C.

[000139] Amiloide livre no plasma (1ab40 e 1ab42) é determinado diretamente em plasma clarificado não diluído obtido conforme explicado abaixo. Estes parâmetros são referidos nas partes que se seguem como 1ab40 ou UP (plasma não diluído) Aβ(1-40) para Aβ(1- 40) e como 1ab42 ou UP Aβ(1-42) para Aβ(1-42).

[000140] Amiloide plasmático total, correspondente ao amiloide livre no plasma mais o amiloide associado a componentes plasmáticos, é determinado em amostras obtidas diluindo 150 μl de plasma em 300 μl de tampão de diluição (PBS contendo 0,5% de Tween-20). Estes parâmetros são referidos nas partes que se seguem como 2ab40 ou DP (plasma diluído) Aβ(1-40) para Aβ(1-40) e como 2ab42 ou DP Aβ(1-42) para Aβ(1-42).

[000141] Beta amiloide ligado a células é determinado diluindo a fração celular plasmática a 1/5 em v/v em amostra de diluição (PBS contendo 0,5% de Tween-20). Estes parâmetros são referidos nas partes que se seguem como 3ab40 ou CB (ligado a células) Aβ(1-40) para Aβ(1-40) e como 3ab42 ou CB Aβ(1-42) para Aβ(1-42). EXEMPLO 3 Condições para tratamento das amostras Diluição das amostras

[000142] De modo a identificar a diluição da amostra proporcionando a maior absorvência no ensaio ELISA, foram testadas diferentes diluições e soluções tampão.

[000143] As amostras foram diluídas a 1/2, 1/3, 1/4, 1/5 e 1/10. Observou-se que a absorvência das simples diminuiu quando diluídas a 1/4 e acima. As melhores diluições são 1/2 e 1/3. Centrifugação de amostra

[000144] As amostras podem ser clarificadas por centrifugação por 1’ a 13.000 rpm de modo a remover componentes particulados os quais podem interferir com a detecção imunológica. O sobrenadante pode ser coletado e testado diretamente ou diluído conforme descrito acima. Sonicação de amostra

[000145] As amostras podem ser sonicadas por 5’ a 10’. As amostras sonicadas podem ser usadas diretamente no ensaios ELISA ou podem ser centrifugadas por 1’ a 13000 rpm e o sobrenadante pode ser usado diretamente em ensaios ELISA. As amostras sonicadas também podem ser diluídas usando os tampões adequados conforme definido nos exemplos anteriores. Pré-clareamento de amostra

[000146] As amostras foram passadas através de uma coluna Sepharosa 4B-IgGK de modo a remover possíveis contaminantes essencialmente conforme descrito por Fukumoto et al, (Arch. Neurol., 2003, 60: 958-964). A coluna Sepharosa 4B-IgGK foi preparada reagindo sepharose ativado com CNBr com IgG1k usando o procedimento que se segue: - IgG1k (peso molecular = 150.000) foi dissolvido em tampão de acoplamento (0,1M de NaHCO3 pH 8,3 e NaCl a 0,5 M (1,5 ml por 300 mg de agarose) usando 500 μl de IgG1k (0,6 mg) e 1,5 ml tampão de acoplamento (Coupling buffer). - A resina foi lavada com 1 mM de HCl (60 ml para cada 300 mg de resina) - O ligante foi misturado com a resina lavada com ácido e incubado de um dia para o outro a 4aC com misturação constante (alternativamente, a incubação pode ser realizada por 2 h em temperatura ambiente). - O excesso de ligante é em seguida lavado usando 5 volumes de tampão de acoplamento. - Os grupamentos ativos não reagidos na resina são em seguida bloqueados com 0,1 M de Tris-HCl pH 8 por 2 h em temperatura ambiente sob misturação. - A resina foi lavada com três ciclos usando alternativamente 0,1 M de Tris-HCl pH 8 + 0,5 M de NaCl / 0,1 M de acetato de sódio pH 4 + 0,5 M de NaCl.

[000147] Uma vez que a Sepharose 4B-IgGK tenha sido obtida, o tratamento da amostra compreende as etapas de: - Contactar 300 μl de plasma com 525 μl de tampão de amostra e 75 μl de agarose-IgG1k e incubar por 2h a 4°C com agitação constante. - O agarose é removido por centrifugação (5’ a 1000 rpm) - 100 μl da amostra tratada é acrescentado a cavidades em algumas lâminas de microtítulo sobre as quais um anticorpo de captura específico para o N-término dos peptídeos beta-amiloides tenha sido adsorvido e incubado de um dia para o outro a 4°C. - A quantidade de peptídeo beta amiloide presente na amostra clarificada é determinada por ensaio ELISA acrescentado às cavidades antissoro específico anti-Aβ40 ou anti-Aβ42 (1/4000) por 1h em temperatura ambiente e misturação constante. - As amostras são em seguida incubadas com uma diluição a 1/5000 de um anticoelho biotinilado por 1h em temperatura ambiente e misturação constante. - As amostras são em seguida incubadas com 1/4000 de estreptavidina acoplada a peroxidase por 1 h em temperatura ambiente e misturação. - A reação foi em seguida desenvolvida com TMB por 30’ no escuro. - A reação em desenvolvimento foi interrompida com solução de interrupção (stop solution ) e a absorvência foi lida a 450 nm. Remoção de albumina e de IgG

[000148] As amostras foram passadas através de colunas as quais ligam albumina e as quais ligam IgG. Os fluxos através foram testados de modo a identificar a fração em que os peptídeos amiloides são encontrados. Albumina é removida usando o kit de remoção de albumina “ProteoExtract Albumin Removal, Kit” (CALBIOCHEM) de acordo com as instruções do fabricante.

[000149] IgG é removida usando uma coluna de proteína A (Protein A Sepharose 4 Fast Flow, Amersham Biosciences) seguindo as instruções do fabricante. Concentração das amostras

[000150] As amostras foram concentradas com microcon tendo um corte de 10000. Os peptídeos amiloides são recuperados no fluxo direto ao passo que proteínas de alto peso molecular são recuperadas no retentado.

[000151] Os efeitos dos diferentes protocolos de tratamento podem ser resumidos como se segue: - Detergentes: Tween-20 é o detergente proporcionando alguns maiores aumentos nos valores de absorvência. Não foi observado nenhum efeito quando a concentração de Tween-20 foi aumentada de 0,05% para 0,1%. - pH: Os valores de pH proporcionando melhores resultados foram 7 e 8. Quando Aβ40 foi determinado, valores de absorvência adequados também foram observados em pH = 9. Quando Aβ42 foi determinado, valores de absorvência adequados foram obtidos em pHs 9 e 5. - Condições de desnaturação: A adição de 0,5 M ou 1 M de GuHCl ou 10% de DMSO não resultou em um aprimoramento dos valores de absorvência. - Sais: Maiores valores de absorvência foram obtidos quando NaCl foi usado em comparação com KCl. - BSA: Não foram observadas diferenças nos níveis de absorvência quando a concentração de BSA foi aumentada de 0,05 % para 0,5%. - Sonicação: Não foram observadas diferenças quando as amostras foram sonicadas antes da determinação da absorvência. - Pré-clareamento: Não foi observado nenhum efeito quando as amostra foram pré-tratadas com uma Sepharosa 4B-IgGk. - Remoção de albumina e IgG: Peptídeos amiloides parecem associar a IgG mas não a albumina. - Concentração: Peptídeos amiloides aparecem essencialmente no retentado. EXEMPLO 4 ELISA sanduíche colorimétrico com amplificação de biotina- estreptavidina

[000152] De modo a aumentar a sensibilidade, o sinal pode ser amplificado usando biotina-estreptavidina. A lâmina foi revestida usando o anticorpo de captura 6E10 mAb o qual reconhece os aminoácidos 1-17 tanto no peptídeo amiloide Aβ40 quanto no amiloide Aβ42. O revestimento foi realizado em uma concentração de 5 μg/ml em 100 mM de tampão de carbonato / bicarbonato, pH=9,6, de um dia para o outro a 4°C. A lâmina foi em seguida bloqueada com 300 μl de uma solução de bloqueio (50 mM de Tris-HCl, pH 8, 0,2% de Tween- 20, 0,5% de BSA) por 3 h em temperatura ambiente com misturação ou por 2 h a 37°C. Quando necessário, as lâminas podem ser tratadas, depois de bloqueio, com 100 μl de uma solução a 50 mM de Tris-HCl, pH 8 contendo 20 mg/ml de trealose. As lâminas foram deixadas para evaporar até aparecer um halo branco característico de trealose. As lâminas tratadas deste modo podem ser mantidas a 4°C cobertas com folha de alumínio e são estáveis por dois anos.

[000153] As amostras da curva padrão foram preparadas a partir de uma solução de matéria-prima a 200 pg/ml dos peptídeos Aβ40 y Aβ42 sobre lâminas revestidas com o 6E10 mAb e tratadas com trealose. A partir destas soluções, foram feitas diluições seriais a 1:2 em SDB de modo a proporcionar concentrações de 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25 e 3,125 pg/ml. 100 μl de cada amostra diluída ou não diluída é acrescentado diluído ou não diluído em SDB (1/1.000.000) e incubado de um dia para o outro a 4°C (ou por 2h a 37°C). As amostras para determinação de amiloide plasmático livre, amiloide plasmático total e amiloide ligado a células nas amostras de teste são preparadas conforme descrito no exemplo 1 e acrescentadas às cavidades das lâminas ELISA usando as mesmas condições que para as amostras da amostra padrão. Anticorpo de detecção (um anticorpo policlonal preparado contra um peptídeo correspondente à região C- terminal do peptídeo Aβ42 ou um anticorpo policlonal preparado contra um peptídeo correspondente à região C-terminal do peptídeo Aβ40, dependendo de se Aβ42 ou Aβ40 deve ser detectado) foi acrescentado diluído em SDB. 100 μl são acrescentados a cada cavidade e foram em seguida incubados por 1 h em temperatura ambiente. Em seguida, 100 μl de uma diluição a 1/5000 em SDB de um anticorpo de IgG anticoelho etiquetado com biotina (SIGMA) foram em seguida acrescentados e incubados por 1h em temperatura ambiente com misturação. Em seguida 100 μl de uma diluição a 1/4000 em SDB de Estreptavidina acoplada a HRP (da SIGMA) foram acrescentados a cada cavidade e incubados por 1 h em temperatura ambiente.

[000154] A lâmina foi desenvolvida usando 100 μl do substrato cromogênico TMB (ZEU Inmunotec). TMB foi acrescentado e incubado no escuro durante 15 a 30 minutos. Como solução de interrupção, 50 μl de H2SO4 a 1 N foram acrescentados por cavidade. A absorvência a 450 nm foi lida em uma leitora de lâminas Synergy HT (BioTek Instruments).

[000155] Os valores de concentração (pg/ml) obtidos a partir das amostras usadas para a determinação do amiloide plasmático total (amiloide plasmático livre junto com amiloide ligado aos componentes do plasma) foram corrigidos de modo a compensar a diluição realizada durante a etapa de preparação. Como a diluição foi tipicamente uma diluição a 1:3 (vide o Exemplo 1), o pg/ml obtido a partir das leituras da absorvência teve de ser multiplicado por três de modo a determinar a concentração de agregado real de amiloide livre no plasma e amiloide ligado aos componentes do plasma. Do mesmo modo, o pg/ml obtido a partir dos valores da absorvência obtidos a partir das amostras usadas para a determinação de amiloide ligado a células também foram corrigidos de modo a compensar a diluição realizada durante a etapa de preparação. Como a diluição foi tipicamente de 1:5 (vide o Exemplo 1), o pg/ml obtido a partir das leituras da absorvência teve de ser multiplicado por cinco de modo a determinar a concentração real de amiloide liga às células.

[000156] Entre cada uma das etapas, a lâmina foi lavada usando uma lavadora de lâminas automática (Elx50 Bio Tek Instruments) programada para realizar 5 enxagues a cada vez. A solução de lavagem continha 50 mM de Tris-HCl pH 8, 0,05% de Tween-20 e 150 mM de NaCl (filtrado antes do uso). EXEMPLO 5 Ensaio ELISA de Sanduíche Fluorescente

[000157] A lâmina foi revestida com 6E10 em tampão de bicarbonato (5 μg/ml) de um dia para o outro a 4°C. A lâmina foi em seguida bloqueada 3h em temperatura ambiente com misturação (300 μl/cavidade). As amostras de teste e da curva padrão foram em seguida acrescentadas às lâminas e incubadas de um dia para o outro a 4°C. Uma diluição a 1/4000 do anticorpo de detecção (soro anti- Aβ40 o anti-Aβ42) foi acrescentado a cada cavidade e incubado por 1h em temperatura ambiente com misturação. Diluições seriais do anticorpo acoplado a FITC (diluições a 1/1000, 1/5000, 1/10000) foram acrescentadas e incubadas por 1h em temperatura ambiente no escuro. A fluorescência foi usando uma comprimento de onda de excitação de 485 nm e uma comprimento de onda de emissão de 528.

[000158] Alternativamente, o teste é realizado usando o substrato fluorescente Quanta-Blu (PIERCE), o qual aumenta a sensibilidade do ensaio ELISA. Máxima excitação é 325 nm e máxima emissão é 420 nm. Pode ser detectada na faixa de excitação de 315 a 340 nm e faixa de emissão de 370 a 470 nm. A solução de elaboração QuantaBlu (QuantaBlu Working Solution) é preparada misturando 9 partes de solução de substrato QuantaBlu (QuantaBlu Substrate Solution) com 1 parte de solução estável de peroxidase QuantaBlu (QuantaBlu Stable Peroxidase Solution) (solução estável por 24 h em temperatura ambiente). Pode ser incubada a partir de 1,5 minutos até 90 minutos em temperatura ambiente e pode ser lida interrompendo a reação ou sem interrupção (é produzida uma cor azul).

[000159] A lâmina é revestida com 6E10 mAb em tampão de bicarbonato (5 μg/ml) de um dia para o outro a 4°C e em seguida bloqueada por 3h em temperatura ambiente com misturação (300 μl/cavidade). Diferentes curvas padrão são então preparadas com as seguintes concentrações de peptídeos Aβ42 e Aβ40: • 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,25 e 15,65 pg/mL • 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25 e 3,125 pg/mL • 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,56, 0,78 e 0,39 pg/mL • 10, 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,3125 e 0,156 pg/mL • 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,3125, 0,156 e 0,078 pg/mL • 1, 0,5, 0,25, 0,125, 0,0625, 0,03125 e 0,0156 pg/mL

[000160] O anticorpo de detecção (soro anti-Aβ40 o anti-Aβ42) é acrescentado (diluído a 1/4000) por 1h em temperatura ambiente com misturação. A IgG anti-coelho acoplada a HRP a 1/1000 é em seguida acrescentada e incubada por 1h em temperatura ambiente com misturação. Para desenvolver a reação, 100 μl de solução de elaboração Quanta-Blue (Quanta-Blue Working Solution) é acrescentado e em seguida incubado por 30’, 60’ e 90’ em temperatura ambiente no escuro. A fluorescência é lida em seguida (Excitação: 360/40 nm; Emissão: 460/40 nm) a 30’, 60’ e 90’ sem interrupção da reação ou interrompendo a reação com solução STOP. EXEMPLO 6 Preparação de curvas padrão de Aβ40 e Aβ42

[000161] Para a preparação da curva padrão de Aβ40, uma amostra liofilizada de Aβ40 humano foi reconstituída até 10 μg/mL. A partir da solução de matéria-prima, foram preparadas as amostras contendo as seguintes concentrações (em pg/mL): 25.000 pg/ml, 2.500 pg/ml, 25 pg/ml, 12,5pg/ml, 6,25 pg/ml, 3,125 pg/ml, 1,56 pg/ml, 0,78 pg/ml. As amostras foram preparadas na presença de 1 mM do inibidor de protease AEBSF. Em seguida as amostras foram processadas de acordo com o método definido nos exemplos anteriores.

[000162] Para a preparação da curva padrão de Aβ42, uma amostra liofilizada de Aβ42 humano foi reconstituída até 10 μg/mL. A partir da solução de matéria-prima, foram preparadas as amostras contendo as seguintes concentrações (em pg/mL): 25.000 pg/ml, 2.500 pg/ml, 25 pg/ml, 12,5pg/ml, 6,25 pg/ml, 3,125 pg/ml, 1,56 pg/ml, 0,78 pg/ml. As amostras foram preparadas na presença de 1 mM do inibidor de protease AEBSF. Em seguida as amostras foram processadas de acordo com o método definido nos exemplos anteriores. EXEMPLO 7

Análise estatística

[000163] A reprodutibilidade interlaboratorial das medições das 16 amostras escolhidas aleatoriamente foi avaliada pelo coeficiente de correlação de concordância (CCC) o qual avalia a conformidade entre as três leituras, a nossa e as reportadas pelos dois laboratórios externos, da mesma amostra medindo a variação da linha de 45 graus através da origem (a linha de concordância) 27. O grau no qual amostras do mesmo indivíduo obtidas em diferentes dias se assemelham umas às outras (reproduyibilidade intrassujeito) foi avaliado pelo coeficiente de correlação intraclasse (ICC). O grau de concordância estimado por estes coeficientes de correlação foi descrito como pobre (0,21 a 0,40), moderado (0,41 a 0,60), substancial (0,61 a 0,80) e quase perfeito (0,81 a 1,00). Os níveis de Aβ nos diferentes grupos de diagnóstico foram comparados usando U- teste de Mann-Whitney. Análise de Spearman foi usada para avaliar correlações entre variáveis contínuas. Para rejeição da hipótese nula foi necessário um p < 0,05. Toda a análise estatística, incluindo medidas de precisão do diagnóstico, foi realizada com o software SAS 9.1. Os gráficos nas figuras 1 a 3 foram gerados com o software estatístico PASW.

[000164] Os seguintes indicadores da validade e da confiabilidade dos marcadores de peptídeos beta-amiloides como um teste de triagem entre pacientes com doença de Alzheimer, disfunção cognitiva branda e controles saudáveis foram estimados.

[000165] Para cada um dos marcadores indicados e determinados, a análise especificada abaixo foi conduzida, classificando os participantes entre HC-AD, HC-MCI e MCI-AD:

[000166] Tabela 3: Classificação dos pacientes com doença de Alzheimer versus controles saudáveis (TP: Verdadeiro positivo; FP: Falso positivo; TN: Verdadeiro negativo; FN: Falso negativo).

[000167] Tabela 4: Classificação dos pacientes com disfunção cognitiva branda versus controles saudáveis (TP: Verdadeiro positivo; FP: Falso positivo; TN: Verdadeiro negativo; FN: Falso negativo).

[000168] Tabela 5: Classificação dos pacientes com doença de Alzheimer versus pacientes com disfunção cognitiva branda (TP: Verdadeiro positivo; FP: Falso positivo; TN: Verdadeiro negativo; FN: Falso negativo). Propriedades de Validade:

[000169] Sensibilidade: É a probabilidade de classificar corretamente um indivíduo doente, isto é, a probabilidade de obter um resultado positivo para um sujeito doente no teste. A sensibilidade é, portanto, a capacidade do teste para detectar a doença.

[000170] Especificidade: É a probabilidade de classificar corretamente um indivíduo saudável, isto é, a probabilidade de obter um resultado negativo para um sujeito saudável. Em outras palavras, especificidade pode ser designada como a capacidade para detectar pessoas saudáveis.

Propriedades de Confiabilidade:

[000171] Valor Preditivo Positivo: É a probabilidade de ter a doença se um resultado positivo for obtido no teste. O valor preditivo positivo pode ser portanto estimado a partir da proporção de pacientes com um resultado positivo no teste que finalmente estavam doentes: PPV = TN.

[000172] Valor Preditivo Negativo: É a probabilidade de um sujeito com um resultado negativo no teste realmente estar saudável. É estimada dividindo o número de verdadeiros negativos pelo total de pacientes com um resultado negativo no teste:

[000173] Além dos conceitos de sensibilidade, especificidade e valores preditivos, o conceito de proporção de possibilidade, proporção de probabilidade, ou proporção de chances também é considerado. Os últimos medem quanto mais provável um resultado específico (positivo ou negativo) está de acordo com a presença ou ausência de doença.

[000174] Proporção de probabilidade positiva ou proporção de chances positivas: é calculada dividindo a probabilidade de um resultado positivo em pacientes doentes pela probabilidade de um resultado positivo entre os pacientes saudáveis. Em resumo, é a proporção entre a fração de verdadeiros positivos (sensibilidade) e a fração de falsos positivos (1 - especificidade):

[000175] Proporção de probabilidade negativa ou proporção de chances negativas: é calculada dividindo a probabilidade de um resultado negativo na presença de doença pela probabilidade de um resultado negativo na ausência da mesma. Portanto é calculada como a proporção entre a fração de falsos negativos (1 - sensibilidade) e a fração de verdadeiros negativos (especificidade):

[000176] A curva ROC é apresentada por meio de um gráfico, e a área sob a curva ROC com 95% de CI, a real classificação de acordo com o parâmetro dos pacientes (doentes/ saudáveis), e o valor de sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e valor preditivo negativo com 95% de CI são apresentados por meio de tabelas.

[000177] Todos os testes estatísticos foram realizados com um nível de significância de 0,05. EXEMPLO 8 Reprodutibilidade interlaboratorial de medições de Aβ.

[000178] Dezesseis amostras escolhidas aleatoriamente de qualquer participante e extração foram enviadas a dois laboratórios externos para a avaliação da reprodutibilidade interlaboratorial das medições. Todos os marcadores se comportaram em um modo similar a CCC que variou de 0,84 a 0,99 (95% de IC total de 0,73 a 0,99,) os quais correspondem a um grau de concordância entre substancial a quase perfeito em todos os casos (figura 1).

[000179] A reprodutibilidade intrateste média, expressada como o coeficiente de variação das cavidades em triplicata, para os seis marcadores em cada laboratório foi de 4,31, 5,83 e 8,34 (tabela 6). O limite de detecções dos testes nos três laboratórios, foram 5,31, 3,63 e 1,91 pg/ml para Aβ1-40 e 2,37, 2,04 e 2,45 pg/ml para Aβ1-42.

[000180] Tabela 6. Reprodutibilidade intrateste.

[000181] CV: Coeficientes de variação das cavidades em triplicata para cada marcador. EXEMPLO 9 Reprodutibilidade intraindividual de medições de Aβ.

[000182] A reprodutibilidade de medições de Aβ ao longo da coleta de sangue de quatro semanas (BS1-BS4) conforme medido pela ICC variou entre substancial a quase perfeito para todos os marcadores diretos nos três grupos (tabela 7). Em média para os três grupos de diagnóstico as maiores ICC correspondem às medições de Aβ1-40 e Aβ1-42 em DP (0,93, 95% de CI = 0,98 a 0,80 e 0,93, 95% de CI = 0,98 a 0,78; respectivamente).

[000183] Tabela 7. Reprodutibilidade Intra-individual.

[000184] Valores médios de ICC depois de comparar as quatro extrações umas com as outras. Todas as correlações foram estatisticamente significantes. Max e Min se refere aos intervalos de confiança de 95 %. EXEMPLO 10 Comparação entre grupos de diagnóstico.

[000185] Em conformidade com a elevada reprodutibilidade intrassujeito das medições, a comparação entre grupos de participantes seguiu o mesmo padrão nas quatro amostras de sangue coletadas em dias diferentes (BS1 a BS4) embora alguns valores-p variem ligeiramente de um BS para outro. A descrição que se segue se baseia nas medições de BS4.

[000186] O primeiro resultado impressionante foi que a concentração de Aβ1-40 e Aβ1-42 medida em UP representou somente em torno de 1/3 e 1/4, respectivamente, dos níveis de DP para qualquer um dos grupos de diagnóstico (tabela 8). Tabela 8. Níveis de marcadores diretos e calculados em cada grupo de participantes.

[000187] Todos os valores são expressados em pg/ml. H, M, e A significam significativo (p<0,05) com respeito a controles saudáveis (HC), disfunção cognitiva branda (MCI) e doença de Alzheimer (AD) respectivamente. * significa p <0,01.

[000188] Em segundo lugar, os níveis de peptídeos CB, medidos diretamente a partir da fração celular da amostra de sangue, foram similares aos níveis medidos em DP. Além disso, os níveis de Aβ1-40 e Aβ1-42 se correlacionaram fortemente quando medidos quer em UP, DP ou CB (r = 0,58, 0,71 e 0,71, respectivamente; p < 0,001). Correlações significativas também foram encontradas entre qualquer par dos seis marcadores testados diretamente nas amostras (Aβ1-40 e Aβ1-42 em UP, PD, CB; tabela 9).

[000189] Tabela 9. Correlação entre variáveis.

[000190] Coeficiente de Spearman para cada par de variáveis. ***, ** e * significam p < 0,001, 0,01 e 0,05, respectivamente.

[000191] Além disso, nós vimos que os níveis de cada marcador aumentou em pacientes com disfunção cognitiva branda e com doença de Alzheimer com respeito ao grupo de controles saudáveis (figura 2, tabela 8). Estes incrementos atingiram importância estatística entre os grupos com disfunção cognitiva branda e de controles saudáveis para os três marcadores de Aβ1-40 (UP, DP e CB os quais aumentaram 2,9, 2,2 e 1,8 vezes, respectivamente) e para os dois marcadores plasmáticos de Aβ1-42 (UP e DP os quais aumentaram 3,1 e 1,8 vezes, respectivamente). O nível médio de cada marcador no grupo com doença de Alzheimer foi muito similar a seu nível médio no grupo com disfunção cognitiva branda e não ocorreram diferenças significativas entre estes dois grupos de pacientes. De modo similar, não foram encontradas diferenças estatísticas entre os grupos com doença de Alzheimer e de controles saudáveis com a exceção dos níveis de CB de Aβ1-42 (Fig. 2). Esta falta de significância foi mais provavelmente devida ao grande alcance de medições individuais dentro do grupo com doença de Alzheimer (n = 16) o qual apresentou CV 1,5 a 2,7 vezes maior do que o grupo com disfunção cognitiva branda (n = 8) e 2,5 a 5,7 vezes maior do que o grupo de controles saudáveis (n= 16) para cada marcador (tabela 8).

[000192] Ambos os marcadores plasmáticos Aβ1-40 e Aβ1-42 (UP e DP) mas não CB, se correlacionaram significativamente com MMSE (tabela 9) embora possa ser em parte superestimado devido à aglomeração de controles saudáveis em direção às maiores pontuações. De fato, excluindo participantes com MMSE > 26, os níveis de Aβ1-40 e Aβ1-42 foram menores em pacientes gravemente afetados (MMSE < 21, n = 5) do que em moderadamente afetados (MMSE 22-25, n = 12) embora as diferenças não atinjam importância estatística (dados não mostrados). Adicionalmente, foi visto que os três marcadores de Aβ1-42, mas não Aβ1-40, se correlacionam significativamente com o grau de atrofia temporal medial tanto no hemisfério direito quanto no esquerdo (tabela 9).

[000193] Foram considerados também vários marcadores calculados a partir daqueles diretamente testados nas amostras. À parte das proporções usuais de Aβ1-42/Aβ1-40, o mais interessante foram a soma de DP mais CB Aβ1-40 e a soma de DP mais CB Aβ1-42, as quais nós denominamos Aβ1-40 total (T40) e Aβ1-42 total (T42), respectivamente e a somas destas duas, a qual nós denominamos βAPB total (T-βAPB). As proporções Aβ1-42/Aβ1-40 quer medidas em UP, DP ou CB não apresentaram diferenças significativas entre os grupos. No entanto, a T40, T42 e T-βAPB aumentaram 2,0, 1,5 e 1,8 vezes, respectivamente no grupo com disfunção cognitiva branda com relação ao grupo de controles saudáveis (p < 0,03) (tabela 4). I ncre- mentos médios similares foram encontrados entre pacientes controles saudáveis e com doença de Alzheimer mas neste caso somente T42 atingiram importância estatística (figura 2). EXEMPLO 11 Características de diagnóstico dos marcadores diretos e calculados

[000194] Os parâmetros diretos e calculados mencionado na Tabela 10 foram determinados usando os métodos definidos nos exemplos anteriores.

[000195] Tabela 10: Lista de parâmetros diretos e calculados os quais foram analisados durante o estudo.

[000196] O valor preditivo dos parâmetros acima foi testado para (i) o diagnóstico de doença de Alzheimer (comparando amostras de pacientes saudáveis com amostras de pacientes com doença de Alzheimer, AD/HC), (ii) o diagnóstico de disfunção cognitiva branda e o estágio anterior a doença de Alzheimer (comparando amostras de pacientes saudáveis com amostras de pacientes sofrendo de disfunção cognitiva branda, MCI/HC) e (iii) diferenciação de disfunção cognitiva branda de doença de Alzheimer (comparando amostras de pacientes sofrendo de disfunção cognitiva branda com amostras de pacientes com doença de Alzheimer,, MCI/AD).

[000197] Características de diagnóstico dos ensaios foram avaliadas por análise logística de medições de Aβ e o diagnóstico clínico foi considerado como o padrão-ouro. Os resultados relativos à sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo (PPV), valor preditivo negativo (NPV), precisão e área sob a curva de Características Operacionais do Receptor (ROC) estão resumidas na tabela 11.

[000198] Tabela 11. Características de diagnóstico de marcadores de βAPB diretos e calculados.

[000199] São salientados em cinza os resultados que satisfazem os critérios considerados adequados conforme figuram no título. PPV: valor de prognóstico positivo. NPV: valor de prognóstico negativo. ROC: área sob a curva de características operacionais do receptor.

[000200] A maioria dos marcadores diretos e dois marcadores calculados (T40 e T-βAPB) satisfazem os critérios considerados adequados para distinguir entre pacientes com disfunção cognitiva branda e controles saudáveis os quais são de extremo interesse porque de qualquer ponto de vista prático é onde o diagnóstico seria aprimorado. Deste modo, todos os marcadores diretos, exceto CB Aβ1-42, apresentaram uma ROC > 0,8 e entre estes quatro (DP Aβ1- 40, CB Aβ1-40, UP Aβ1-42 e DP Aβ1-42) obtiveram exatidões > 80% o que significa que 80% o teste foi correto quando comparado com o padrão-ouro clínico (Fig. 3). Os T40 e T-βAPB calculados foram igualmente precisos para distinguir entre disfunção cognitiva branda e controles saudáveis para os marcadores diretos ao passo que T42 parece ser menos confiável (Fig. 3). Devido à grande variabilidade de medições de Aβ de um indivíduo para outro dentro do grupo com doença de Alzheimer, não pôde ser encontrado qualquer ponto de corte no qual estes marcadores discriminaram os pacientes com doença de Alzheimer dos outros dois grupos de participantes com uma sensibilidade e especificidade aceitáveis (figura 3). EXEMPLO 12

[000201] Outros parâmetros apresentando as maiores sensibilidade e suscetibilidade e convenientes para aplicação na presente invenção incluem aqueles mostrados na Tabela 12.

[000202] Tabela 12: Sumário de métodos apresentando melhores níveis de sensibilidade, especificidade e precisão. Os métodos mais preferenciais são proporcionados em caracteres em branco sobre um fundo preto. Os segundos melhores métodos são mostrados usando fundo cinza claro.

[000203] Os métodos proporcionados particularmente úteis para detecção de disfunção cognitiva branda entre pacientes saudáveis usando o marcador 1ab40 (figura 4), o marcador 2ab40 (figura 5), o marcador 3ab40 (figura 6), o marcador 1ab42 (figura 7), o marcador 2ab42 (figura 8), o marcador 3ab42 (figuras 9 e 10), o marcador 2ab40 + 3ab40 (figura 11), o marcador 2ab42 + 3ab42 (figura 12), o marcador 2ab42 + 3ab42 (figura 13) e o marcador 2ab40 + 3ab40 + 2ab42 + 3ab42 (figura 14).

Claims

1. Método para o diagnóstico de uma doença neurodegenerativa em um sujeito, para detecção de um estágio anterior a uma doença neurodegenerativa ou para diferenciar uma doença neurodegenerativa de um estágio anterior à referida doença neurodegenerativa, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de (i) determinação de um ou mais parâmetros selecionados dentre o grupo de (a) o nível de um ou mais peptídeos beta amiloides livres em uma amostra biológica do referido sujeito, (b) os níveis de agregados de um único ou mais peptídeos amiloides livres em uma amostra biológica do referido sujeito e do referido um ou mais peptídeos beta amiloides associados a componentes macromoleculares presentes na referida amostra biológica, em que os referidos níveis de agregados são determinados quantificando a quantidade do referido um ou mais peptídeos beta amiloides na fração livre de células da referida amostra depois de contatar a referida amostra com um agente de solubilização de proteína sob condições adequadas para promover dissociação do peptídeo beta amiloide ou peptídeos a partir dos componentes presentes na amostra biológica, (c) o nível de um ou mais peptídeos beta amiloides asso-ciados a células em uma amostra biológica do referido sujeito, em que o nível referido é determinado isolando a fração de células da referida amostra biológica, contatando a referida fração celular da referida amostra com um agente de solubilização de proteína sob condições adequadas para promover dissociação do peptídeo beta amiloide ou peptídeos a partir das células presentes na amostra e (ii) comparação do valor de no mínimo um dos parâmetros (b) ou (c) ou o valor de um parâmetro calculado resultante de combinar aritimeticamente no mínimo dois dos parâmetros (a) a (c) com um valor de referência correspondente ao valor dos referidos parâmetros (b) ou (c) ou do referido parâmetro calculado em uma amostra de referência e (iii) diagnóstico da doença neurodegenerativa, detecção de um estágio anterior a uma doença neurodegenerativa ou diferenciação de uma doença neurodegenerativa de um estágio anterior à referida doença neurodegenerativa onde há uma alteração no valor do parâmetro ou no valor do parâmetro calculado com respeito ao valor de referência; em que a amostra biológica é plasma ou sangue, e em que a doença neurodegenerativa é doença de Alzheimer e/ou a fase anterior a uma doença neurodegenerativa é uma disfunção cognitiva branda.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os parâmetros determinados na etapa (i) como definida na reivindicação 1 são um ou mais dos parâmetros selecionados dentre o grupo de (a) 1ab40, correspondente ao nível de peptídeo ABETA40 livre em uma amostra biológica do referido sujeito, (b) 1ab42, correspondente ao nível de peptídeo ABETA42 livre em uma amostra biológica do referido sujeito, (c) 2ab40, correspondente aos níveis de agregados de peptídeo ABETA40 livre em uma amostra biológica do referido sujeito e de peptídeo ABETA40 associados aos componentes da referida amostra biológica, em que 2ab40 é determinado quantificando a quantidade de peptídeo ABETA40 na referida amostra depois de contatar a referida amostra com um agente de solubilização de proteína sob condições adequadas para promover dissociação do peptídeo ABETA40 a partir dos componentes presentes na amostra biológica, (d) 2ab42, correspondente ao nível de agregados de peptí- deo ABETA42 livre em uma amostra biológica do referido sujeito e de peptídeo ABETA42 associados aos componentes da referida amostra biológica, em que 2ab42 é determinado quantificando a quantidade de peptídeo ABETA42 na referida amostra depois de contatar a referida amostra com um agente de solubilização de proteína sob condições adequadas para promover dissociação do peptídeo ABETA42 a partir dos componentes presentes na amostra biológica, (e) 3ab40, correspondente ao nível do peptídeo ABETA40 associado a células em uma amostra biológica do referido sujeito, em que 3ab40 é determinado quantificando a quantidade de peptídeo ABETA40 depois de contatar a fração celular da referida amostra biológica com um agente de solubilização de proteína sob condições adequadas para promover dissociação dos peptídeos beta amiloides a partir das células presentes na amostra, e (f) 3ab42, correspondente ao nível do peptídeo ABETA42 associado a células em uma amostra biológica do referido sujeito, em que 3ab42 é determinado quantificando a quantidade de peptídeo ABETA42 depois de contatar a fração celular da referida amostra biológica com um agente de solubilização de proteína sob condições adequadas para promover dissociação dos peptídeos beta amiloides a partir das células presentes na amostra.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o parâmetro calculado obtido na etapa (ii) como definida na reivinidcação 1 é selecionado dentre o grupo de 2ab40/2ab42, 3ab40/3ab42, 2ab40/3ab40, 2ab42/3ab42, 1ab40 + 2ab40, 1ab40 + 3ab40, 2ab40 + 3ab40, 1ab40 + 2ab40 + 3ab40, 1ab42 + 2ab42, 1ab42 + 3ab42, 2ab42 + 3ab42, 1ab42 + 2ab42 + 3ab42, 1ab40 + 2ab40 + 1ab42 + 2ab42, 1ab40 + 3ab40 + 1ab42 + 3ab42, 2ab40 + 3ab40 + 2ab42 + 3ab42, 1ab40 + 2ab40 + 3ab40 + 1ab42 + 2ab42 + 3ab42, (1ab40 + 2ab40)/(1ab42 + 2ab42), (1ab40 + 3ab40)/(1ab42 + 3ab42), (2ab40 + 3ab40)/(2ab42 + 3ab42), (1ab40 + 2ab40 3ab40)/(1ab42 + 2ab42 + 3ab42), (1ab42 + 2ab42)/(1ab40 + 2ab40), (1ab42 + 3ab42)/(1ab40 + 3ab40), (2ab42 + 3ab42)/(2ab40 + 3ab40), (1ab42 + 2ab42 + 3ab42)/(1ab40 + 2ab40 + 3ab40), 2ab40- 1ab40, 2ab42-1ab42 e (2ab40-1ab40)/(2ab42-1ab42).

4. Método, de acordo com as reivindicações 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que (i) o diagnóstico da doença de Alzheimer é realizado comparando o valor de um parâmetro selecionado entre o grupo de 3ab40, 2ab42 e 3ab42 ou o valor de um parâmetro calculado selecionado entre o grupo de 2ab40 + 3ab40, 2ab42+3ab42, 1ab40+2ab40+1ab42+2ab42 e 2ab40 + 3ab40 + 2ab42 + 3ab42, (ii) a detecção da disfunção cognitiva branda é realizada comparando o valor de um parâmetro selecionado entre o grupo de 2ab40, 3ab40, 2ab42 e 3ab42 ou o valor de um parâmetro calculado selecionado entre o grupo de 2ab40 + 3ab40, 2ab42 + 3ab42, 2ab40 + 3ab40 + 2ab42 + 3ab42, 1ab40 + 2ab40 + 3ab40 + 1ab42 + 2ab42 + 3ab42, 1ab40 + 2ab40 + 3ab40, 1ab42 + 2ab42 + 3ab42, 1ab40 + 2ab40 + 1ab42 + 2ab42 e 1ab40 + 3ab40 + 1ab42 + 3ab42 ou (iii) a diferenciação da doença de Alzheimer da disfunção cognitiva branda é realizada comparando o valor de um parâmetro selecionado entre o grupo de 3ab40 e 2ab42 ou comparando o valor de um parâmetro calculado selecionado entre o grupo de 2ab40 + 3ab40, 2ab40 + 3ab40 + 2ab42 + 3ab42 e 1ab40 + 2ab40 + 1ab42 + 2ab42.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o valor de referência usado na etapa (ii) como definida na reivindicação 1 para comparar o valor do parâmetro ou o valor do parâmetro calculado é selecionado dentre o grupo de (i) 63,8 pg/ml quando o parâmetro 2ab40 é usado para a detecção da disfunção cognitiva branda, (ii) 71,9 pg/ml quando o parâmetro 3ab40 é usado para o diagnóstico da doença de Alzheimer, (iii) 71,1 pg/ml quando o parâmetro 3ab40 é usado para a detecção da disfunção cognitiva branda, (iv) 211,3 pg/ml quando o parâmetro 3ab40 é usado para diferenciar a doença de Alzheimer da disfunção cognitiva branda, (v) 47,4 pg/ml quando o parâmetro 2ab42 é usado para o diagnóstico da doença de Alzheimer, (vi) 50,3 pg/ml quando o parâmetro 2ab42 é usado para a detecção da disfunção cognitiva branda, (vii) 151,7 pg/ml quando o parâmetro 2ab42 é usado para diferenciar a doença de Alzheimer da disfunção cognitiva branda, (viii) 76,9 pg/ml quando o parâmetro é 3ab42 e é usado para o diagnóstico da doença de Alzheimer, (ix) 58,8 pg/ml quando o parâmetro é 3ab42 e usado para a detecção da disfunção cognitiva branda, (x) 132,7 pg/ml quando o parâmetro 2ab40 + 3ab40 é usado para o diagnóstico da doença de Alzheimer, (xi) 132,7 pg/ml quando o parâmetro 2ab40 + 3ab40 é usado para a detecção da disfunção cognitiva branda, (xii) 550,8 pg/ml quando o parâmetro 2ab40 + 3ab40 é usado para diferenciar a doença de Alzheimer da disfunção cognitiva branda, (xiii) 115,8 pg/ml quando o parâmetro é 2ab42 + 3ab42 e é usado para o diagnóstico da doença de Alzheimer, (xiv) 103,3 pg/ml quando o parâmetro é 2ab42+3ab42 e é usado para a detecção da disfunção cognitiva branda, (xv) 235,5 pg/ml quando o parâmetro 2ab40 + 3ab40 + 2ab42 + 3ab42 é usado para o diagnóstico da doença de Alzheimer, (xvi) 235,5 pg/ml quando o parâmetro 2ab40 + 3ab40 + 2ab42 + 3ab42 é usado para a detecção da disfunção cognitiva branda, (xvii) 778,1 pg/ml quando o parâmetro 2ab40 + 3ab40 + 2ab42 + 3ab42 é usado para diferenciar a doença de Alzheimer da disfunção cognitiva branda, (xviii) 272,1 pg/ml quando o parâmetro 1ab40 + 2ab40 + 3ab40 + 1ab42 + 2ab42 + 3ab42 é usado para a detecção da disfunção cognitiva branda, (xix) 155,8 pg/ml quando o parâmetro 1ab40 + 2ab40 + 3ab40 é usado para a detecção da disfunção cognitiva branda, (xx) 124,3 pg/ml quando o parâmetro 1ab42 + 2ab42 + 3ab42 é usado para a detecção da disfunção cognitiva branda, (xxi) 158,3 pg/ml quando o parâmetro 1ab40 + 2ab40 + 1ab42 + 2ab42 é usado para o diagnóstico da doença de Alzheimer, (xxii) 142,4 pg/ml quando o parâmetro 1ab40 + 2ab40 + 1ab42 + 2ab42 é usado para a detecção da disfunção cognitiva branda, (xxiii) 161,2 pg/ml quando o parâmetro 1ab40 + 2ab40 + 1ab42 + 2ab42 é usado para diferenciar a doença de Alzheimer da disfunção cognitiva branda; e (xxiv) 154,7 pg/ml quando o parâmetro 1ab40 + 3ab40 + 1ab42 + 3ab42 é usado para a detecção da disfunção cognitiva branda.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o agente de solubilização de proteína é um detergente, preferencialmente polissorbato 80.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a etapa de determinação do no mínimo um ou mais de 1ab40, 1ab42, 2ab40, 2ab42, 3ab40 e 3ab42 é realizada por um método imunológico.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o referido método imunológico é um ensaio ELISA.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o ensaio ELISA é um ensaio ELISA de sanduíche.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de captura no ensaio ELISA de sanduíche é um anticorpo contra a região N-terminal do peptídeo beta amiloide.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o anticorpo contra a região N-terminal do peptídeo beta amiloide é direcionado contra um epítopo localizado dentro dos aminoácidos 1 a 7 de ABETA40 e ABETA42.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de detecção no ensaio ELISA de sanduíche é um anticorpo específico contra um epítopo localizado na região C-terminal do peptídeo beta amiloide.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o anticorpo específico contra a região C-terminal do peptídeo beta amiloide é selecionado dentre o grupo de (i) um anticorpo policlonal preparado contra um peptídeo correspondente à região C- terminal do peptídeo ABETA42 a qual liga especificamente a ABETA42 sem proporcionar qualquer reação cruzada substancial com ABETA40, (ii) um anticorpo policlonal preparado contra um peptídeo correspondente à região C-terminal do peptídeo ABETA40 a qual liga especificamente a ABETA40 sem proporcionar qualquer reação cruzada substancial com ABETA42, (iii) um anticorpo que reconhece simultaneamente a região C-terminal de tanto ABETA40 quanto ABETA42 e (iv) uma combinação dos anticorpos sob (i) e (ii).

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 13, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de detecção é adicionalmente detectado usando um reagente apresentando afinidade para o referido anticorpo o qual é acoplado a um primeiro membro de um par de ligação.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a detecção é realizada usando um segundo membro de um par de ligação acoplado a uma etiqueta detectável.