RU2708465C1

RU2708465C1 - Способ детекции модификаций амилоидного пептида с помощью высокоспецифичных антител

Info

Publication number: RU2708465C1
Application number: RU2019104466A
Authority: RU
Inventors: Ольга Игоревна Кечко; Владимир Александрович Митькевич; Александр Александрович Макаров
Priority date: 2019-02-18
Filing date: 2019-02-18
Publication date: 2019-12-09

Abstract

Изобретение относится к медицине и касается применения комбинации высокоспецифичных антител для детекции патогенных форм бета-амилоида в сложных белковых растворах, включающего иммуноферментный анализ с помощью комбинации высокоспецифичных антител - анти бета-амилоид (1-17) и анти бета-амилоид (36-42). Изобретение обеспечивает достоверное детектирование патогенных форм бета-амилоидного пептида в растворах. 2 ил., 2 пр.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области биохимии, иммуноферментного анализа и лабораторной диагностики, а именно, к новому способу детекции наличия модификаций амилоидного пептида с помощью высокоспецифичных антител.

Уровень техники

Согласно данным международной организации Alzheimer's Disease International в 2018 году в мире насчитывалось 50 миллионов человек, имеющих деменцию, а к 2050 году ожидается рост числа таких пациентов до 152 миллионов человек. При этом 60-70% случаев составляют пациенты с болезнью Альцгеймера (БА) [World Alzheimer Report 2018. Alzheimer's Disease International (ADI), сентябрь 2018]. БА - это мультифакторное нейродегенеративное заболевание, симптомы которого в большинстве случаев появляются у лиц старше 65 лет [Lane, С.A et al., Alzheimer's disease. Eur. J. Neurol. 2018, 25, 59-70]. К основным факторам риска возникновения БА относятся возраст, наличие АРОЕ-е4 гена и наследственность. С увеличением возраста значительно возрастает количество людей, имеющих БА: 3% людей в возрасте 65-74 года, 17% людей в возрасте 75-84 года и 32% людей старше 85 лет. При этом более 65% пациентов имеют как минимум одну копию гена АРОЕ-е4 [Alzheimer's Association. 2018 Alzheimer's Disease Facts and Figures. Alzheimer's Dement 2018; 14(3): 367-429].

Для большинства пациентов самым ранним проявлением БА является нарушение памяти, в частности, трудности с запоминанием новой информации и воспоминанием недавних событий. Такие симптомы связаны с тем, что на начальных стадиях заболевания наиболее сильно повреждается гиппокамп, играющий центральную роль в формировании кратковременной памяти. Нарушения памяти уже на ранней стадии мешают пациентам вести привычный образ жизни. Так, человек может забыть имя знакомого человека, испытывать трудности в подборе слов во время разговора, забыть дату важного для него события или заблудиться в знакомом месте. Проблемы с памятью также сопровождаются проблемами с мышлением, рассуждениями, восприятием информации или общением. По мере развития заболевания симптомы прогрессируют. Появляются резкие перепады настроения, апатия, приступы агрессии, раздражения, галлюцинации и депрессия. На поздних стадиях заболевания пациенты все меньше осознают, что происходит вокруг них, испытывают трудности с едой, ходьбой и нуждаются в круглосуточной опеке [Van Dam, D. et al., Neuropsychiatric Disturbances in Alzheimer's Disease: What Have We Learned from Neuropathological Studies? Curr. Alzheimer Res. 2016, 13, 1145-64; Weiner, M. W. et al., Update of the Alzheimer's Disease Neuroimaging Initiative: A review of papers published since its inception. Alzheimers. Dement. 2014,11, el-120].

Скорость развития БА и симптоматика сильно варьируют. В среднем после появления первых симптомов продолжительность жизни пациентов составляет восемь-десять лет. Однако, патологические изменения в мозге начинаются за десять и более лет до появления проблем с памятью и постановки диагноза [Nelson, Р. Т. et al., Correlation of Alzheimer disease neuropathologic changes with cognitive status: a review of the literature. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 2012, 71, 362-81]. Они связаны с агрегацией и накоплением двух белков в патологическом состоянии - бета-амилоида и тау, которые по мере развития заболевания вызывают нарушения синапсов, воспаление, смерть нейронов и формируют амилоидные (сенильные) бляшки и нейрофибриллярные клубки, являющиеся главными нейроморфологическими признаками БА [Molinuevo, J. L. et al., Current state of Alzheimer's fluid biomarkers. Acta Neuropathol. 2018, 136, 821-853]. Основным компонентом амилоидных бляшек в мозге пациентов с болезнью Альцгеймера является пептид, состоящий из 42 аминокислот - Абета(1-42). Для данной формы пептида идентифицирован ряд патогенных модификаций, обнаруженных только в мозге, спинномозговой жидкости или крови пациентов с болезнью Альцгеймера [Gerth, J. et al., Modified amyloid variants in pathological subgroups of β-amyloidosis. Ann. Clin. Transl. Neurol. 2018, 5, 815-831]. Многочисленные исследования показали, что интрацеребральные и внутривенные инъекции экстракта амилоидных бляшек и модифицированных синтетических пептидов Абета вызывают у экспериментальных животных развитие амилоидогенеза и сопутствующую БА симптоматику [Kozin, S. A. et al., Peripherally Applied Synthetic Peptide isoAsp7-Aβ(1-42) Triggers Cerebral β-Amyloidosis. Neurotox. Res. 2013, 24, 370-376; Kumar, S. et al., Extracellular phosphorylation of the amyloid β-peptide promotes formation of toxic aggregates during the pathogenesis of Alzheimer's disease. EMBO J. 2011, 30, 2255-65]. Таким образом, появление модифицированных форм Абета в биологических жидкостях может служить маркером развития БА.

В настоящее время нет ни эффективных лекарственных средств, ни методов диагностики ранних стадий заболевания. Лекарства, применяемые в качестве медикаментозной терапии БА: ривастигмин, галантамин, мемантин, донепезил и такрин, способны только временно облегчить симптомы протекания болезни путем увеличения содержания нейротрансмиттеров в мозге. Эффективность этих лекарств различается для каждого пациента, ограничена по времени, и ни один из этих препаратов не может остановить или замедлить течение болезни [Cummings, J. et al., Drug development in Alzheimer's disease: the path to 2025. Alzheimers. Res. Ther. 2016, 8, 39]. Диагноз БА ставится на основе предоставленной родственниками информации о психиатрических и когнитивных нарушениях в семье пациента, изменениях в его поведении и мышлении, данных когнитивных тестов, неврологических обследований, визуализации мозга (ПЭТ), анализа крови и в некоторых случаях спинномозговой жидкости, а также генетических тестов [Mirra, S. S. et al., Making the diagnosis of Alzheimer's disease: A primer for practicing pathologists. Arch. Pathol. Lab. Med. 1993, 117, 132-144; Ow, S.-Y. & Dunstan, D. E. A brief overview of amyloids and Alzheimer's disease. Protein Sci. 2014, 23, 1315-31]. Перечисленные подходы требуют наличия дорогостоящего оборудования и высококвалифицированного персонала, что затрудняет их повсеместное распространение и использование. Организация Alzheimer's Association утверждает, что создание простого и недорогого диагностического теста, такого как анализ крови, было бы идеальным для пациентов, врачей и ученых. В настоящее время активно ведется поиск новых биомаркеров БА, среди которых анализ уровня Абета в мозге пациентов с помощью ПЭТ и измерение содержания определенных белков, в том числе Абета и тау, в спинномозговой жидкости и крови пациентов [Alzheimer's Association. 2018 Alzheimer's Disease Facts and Figures. Alzheimer's Dement 2018; 14(3): 367-429].

Раскрытие сущности изобретения

Задачей предполагаемого изобретения является разработка нового, более дешевого и универсального метода диагностики болезни Альцгеймера.

Сущность изобретения заключается в новом способе детекции модификаций амилоидного пептида.

Результатом является новый способ использования антител анти-Абета(1-17) и анти-Абета(36-42) для определения наличия модификаций Абета(1-42). Найдено, что при помощи данной пары антител можно достоверно различать интактный, фосфорилированный и изомеризованный пептиды.

Краткое описание таблиц и чертежей

Фигура 1. Взаимодействие пары антител анти-Абета(36-42) (5 мкг/мл) и анти-Абета(1-17) (0.7 мкг/мл) с амилоидными пептидами.

Фигура 2. Взаимодействие пары антител анти-Абета(36-42) и анти-Абета(1-17) со смесью амилоидных пептидов. Цифрами обозначены: 1 - Абета(1-42); 2 - Абета(1-42):Абета(1-40):изоD7-Абета(1-42):р88-Абета(1-42) 1:1:1:1; 3 - Абета(1-42):Абета(1-40):изоD7-Абета(1-42):pS8-Абета(1-42) 1:1:0.5:0.5; 4 - Абета(1-42):изоD7-Абета(1-42) 1:0.5. р<0.001 для образцов 2, 3,4 относительно контроля (1).

Осуществление изобретения

Далее изобретение будет проиллюстрировано примерами, предназначенными для обеспечения лучшего понимания сущности заявленного изобретения, но которые при этом не должны рассматриваться как ограничивающие данное изобретение.

Пример 1. Оценка способности антител дифференцировать чистые растворы амилоидных пептидов

Синтетические пептиды Абета(1-42), изоD7-Абета(1-42) и pS8-Абета(1-42) были получены от фирмы Biopeptide Co., LLC (USA). Мономеризацию пептида проводили с использованием гексофлуоризопропанола (HFIP). Пептиды растворяли в охлажденном HFIP (финальная концентрация 1 мМ) и инкубировали в течение 60 мин при 25°С. Охлажденные на льду растворы переносили в микроцентрифужные пробирки из расчета 0.23 мг пептида на пробирку. Для удаления HFIP открытые пробирки помещали под тягу на ночь, а затем откручивали на вакуумной центрифуге Eppendorf Concentrator 5301 в течение 15 мин. Высушенные пептиды хранили при -80°С. Непосредственно перед экспериментом пептиды растворяли в 20 мкл 100% DMSO до финальной концентрации 2.5 мМ с последующей инкубацией в течение 1 часа при 25°С. Сравнение взаимодействия пептидов с антителами проводили методом иммуноферментного анализа. В качестве антител захвата были использованы антитела анти-Абета(36-42) в концентрации 5 мкг/мл, а в качестве первичных антител - анти-Абета(1-17) в концентрации 0.7 мкг/мл. Детекцию изменения оптической плотности раствора проводили с помощью антител к иммуноглобулинам мыши, конъюгированных с пероксидазой хрена (HRP) в разведении 1:10000. Для оценки количества антител, связавшихся с Абета, был взят субстрат пероксидазы хрена OPD (o-phenylenediamine dihydrochloride). Оценка величины поглощения раствора проводили спектрофотометрически (Multiskan™ GO Microplate Spectrophotometer) на длине волны 450 нм через 30 минут после добавления OPD.

Из рис. 1 видно, что модифицированные Абета хуже взаимодействуют с данными антителами, что позволяет достоверно различать фосфорилированный, изомеризованный и немодифицированный пептиды.

Пример 2. Оценка способности антител дифференцировать смеси амилоидных пептидов

Пару антител анти-Абета(1-17) и анти-Абета(36-42) тестировали на смеси Абета(1-42), Абета(1-40) и двух патогенных изоформах изоD7-Абета(1-42) и pS8-Абета(1-42) в различных соотношениях. Использовали следующие смеси амилоидных пептидов: (1) Абета(1-42); (2) Абета(1-42):Абета(1-40):изоD7-Абета(1-42):pS8-Абета(1-42) 1:1:1:1; (3) Абета(1-42):Абета(1-40):изоD7-Абета(1-42):pS8-Абета(1-42) 1:1:0.5:0.5; (4) Абета(1-42):изоD7-Абета(1-42) 1:0.5. Использовались те же концентрации антител и условия эксперимента, как описано в примере 1.

Из рис. 2 видно, что пара антител анти-Абета(1-17) и анти-Абета(36-42) позволяет анализировать только фракцию пептидов Абета(1-42), достоверно определяя наличие модификаций этого пептида в растворе.

Claims

Применение комбинации высокоспецифичных антител для детекции патогенных форм бета-амилоида в сложных белковых растворах, включающее иммуноферментный анализ с помощью комбинации высокоспецифичных антител - анти бета-амилоид (1-17) и анти бета-амилоид (36-42).