KR20230148764A - 알츠하이머병 또는 경도 인지장애 진단을 위한 비응집성 용해조성물 및 이를 이용한 진단 방법 - Google Patents
알츠하이머병 또는 경도 인지장애 진단을 위한 비응집성 용해조성물 및 이를 이용한 진단 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 알츠하이머병 또는 경도 인지장애 진단을 위한 비응집성 용해조성물 및 이를 이용한 진단 방법에 관한 것으로, 알츠하이머 환자의 혈장에서 total-타우, 인산화된 타우, 베타-아밀로이드 측정을 통하여 병리학적 변화를 추적하는데 유용하다. 특히, 추가적으로 고가의 특수 장비가 요구되지 않고, 아밀로이드 항체에 추가적인 공정화 없이 일반적으로 사용되는 항체와 장비만으로도 혈액 내 total-타우, 인산화된 타우, 베타-아밀로이드 측정이 가능하다. 또한, 본 발명은 이러한 아밀로이드 특이적인 항체에 특수적으로 공정화된 처리단계 없이, 혈액 플라즈마 자체를 이용하여, 본 발명에서 제시한 버퍼 처리- 농축- 리파아제 처리를 통하여 알츠하이머 대표적인 단백질의 변화 분석이 가능하게 된다. 웨스턴 블랏과 일방적으로 상용화된 ELISA에 적용하여 쉽게 분석이 가능하며, 또한 현재 혈액 플라즈마 내 베타-아밀로이드 측정법으로 기술 개발된 기기에 특수 처리된 항체로 농축 과정 없이, 본 발명에서 제시된 방법에서 준비된 시료가 동일하게 적용 가능할 것으로 예상된다. 따라서, 본 발명의 조성물 및 진단 방법은 진단의 정확도 및 재현성이 높을 뿐만 아니라, 매우 간편하여 알츠하이머 병의 조기 진단에 매우 유용하게 활용할 수 있다.
Description
본 발명은 알츠하이머 치매의 임상 증상이 발현되거나 발현되기 이전에 혈액과 같은 환자 체액 내에 존재하는 베타-아밀로이드(β-amyloid: Aβ), 인산화 타우의 변화를 정량 분석하여 알츠하이머성 치매 또는 경도 인지장애를 진단할 수 있는 진단용 조성물과 이를 이용한 진단 방법에 관한 것이다.
알츠하이머는 기억력의 점진적인 퇴행을 가져오는 뇌의 기능적 이상에서 오는 병으로써 일상생활에 곤란을 겪을 정도의 심각한 지적기능(사고, 기억, 추론)의 상실을 가져오는 치매(Dementia)에 이르게 된다. 중앙 치매 센터에 따르면 국내 65세 이상 노인 치매 추정 환자는 75만488명(2018년 기준)이다. 노인 인구의 10.2 %가 치매를 앓고 있다. 2024년 100만명, 2039년 200만명, 2050년 300만명으로 늘어날 것으로 추정되고 있다. 치료비로 2조5000억원, 노인 장기요양보험에서 케어 비용으로 4조원이 들어가는 등 연간 15조 3000억원(국내총생산의 0.8%)이 투입된다. 중앙 치매센터는 세계 치매 인구를 약 5000만명으로 추정한다(알츠하이머병 인터녀셔널 자료).
알츠하이머의 주요 병리학적 특성으로써 베타-아밀로이드(Aβ) 펩타이드 플라크의 대뇌 축적 및 타우의 신경원섬유 엉킴(Neurofibrilary tangles, NFT)이며, 알츠하이머 발병 중에 뉴런 및 시냅스에 독성으로 영향을 주어 신경사멸을 유도하는 신경퇴행 메커니즘이 일어나게 된다.
알츠하이머의 병리학적으로 진단하는 비침습적인 방법으로 베타-아밀로이드(Aβ) 또는 타우 및 인산화된 타우 단백질에 대한 양전자 방출 단층촬영(PET: Positron emission tomography) 이미징 영상분석법이 있다. 베타-아밀로이드 또는 타우 및 인산화된 타우 단백질에 대한 방사선을 방출할 수 있는 항체를 체내 주입한 후 양전자 방출 단층촬영 이미징으로 뇌 베타-아밀로이드 응집지역을 모니터링 한다. 침습적인 방법으로, 뇌 척수액을 추출하여 뇌 조직으로부터 뇌 척수액으로 이동된 베타-아밀로이드(Aβ) 또는 타우 및 인산화된 타우 단백질을 검출해 진단하는 방법이 있다. 하지만, 양전자 방출 단층촬영 이미징 방법의 경우, 고가의 PET-CT가 설치된 곳에서만 가능하다. 알츠하이머 진단 및 병리학적 진행 정도를 모니터링하기 위해서는 주기적인 진단이 필요하기 때문에, 양전자 방출 단층 촬영 이미징 방법은 비용에 대한 문제 뿐만 아니라, 주기적인 방사선 노출로 인한 위험성을 갖고 있다. 비침습적 방법으로 뇌척수액을 추출하여 알츠하이머 특이적 단백질을 검출하는 방법 또한, 추출과정에서 전신 마취의 위험성과 추출 이후 환자에게 고통을 준다는 단점을 갖고 있다.
그래서, 최근에 혈액, 침, 콧물 등의 인체 유래물을 이용하여 알츠하이머 특이적인 단백질을 검출하여 알츠하이머병을 병리학적으로 진단하고 병의 경과를 측정하는 방법이 개발되고 있다. 이 중 혈액 내 베타-아밀로이드, 타우 및 인산화된 타우를 검출하고자 하는 방법이 주로 개발되고 있다. 혈액 내 베타-아밀로이드 등의 알츠하이머 특이적인 단백질의 함량을 측정하면, 알츠하이머 진행 경과를 알 수 있기 때문이다. 구체적으로, 최근 연구 결과에 따르면, 베타-아밀로이드가 뇌 조직에서 제한적으로 확인되지 않고, 그 외 혈액 및 다른 조직에서도 베타-아밀로이드 생성이 있으며, 생성된 단백질에 다시 뇌 조직에 유입되어 알츠하이머의 병리학적 정도를 심화시킬 수 있음이 밝혀졌다. 하지만, 뇌 척수액에 비해 혈액 내 베타-아밀로이드는 50 ~ 100배 이상 농도가 낮으며 또한, 혈액 내 여러 다른 물질들이 베타-아밀로이드나 타우, 인산화된 타우 등 알츠하이머 특이적 단백질에 비해 많이 존재하기 때문에, 혈액 내 알츠하이머 특이적 단백질이 얼마나 함량이 되어 있는 측정하기가 어렵다.
이러한 문제를 해결하기 위한 방법 중의 하나로, 베타-아밀로이드나 타우, 인산화된 타우에 대한 특이적인 항체를 이용하여 항원-항체 결합을 통해 검출하는 방법이 개발되었다. 개발된 방법 등의 대부분은 혈장 내 미량으로 존재하고 있는 알츠하이머 특이적인 단백질을 분석 가능할 수 있도록 특수 처리된 항체를 이용하여 농축하는 단계를 가지고 있다. 대표적으로 자성입자에 항체를 부착하여 혈장을 반응시켰을 때, magnetic current에서 일어나는 반응 변화를 감지하여 측정하는 Immunomagnetic reduction (IMR), 미세비드에 항체를 공유결합방식으로 연결한 후, 혈액과 반응하여 disital ELISA방식으로 분석하는 Simgle-molecule array (SIMOA), 베타-아밀로이드의 특이적인 분자구조를 분석하는 Immu-infrared sensor 그리고 혈장에서 합성된 Aβ 펩타이드를 넣어주어 혈장 내 Aβ와 함께 oligomerization되는 양을 측정하는 Multimer detection system 등이 있다. 하지만, 항원-항체 결합을 이용한 방법 또한, 혈장 내 알츠하이머 특이적 단백질과 결합할 수 있는 항체 공정화과정이 필요하다. 그리고 항원-항체 결합을 측정할 수 있는 별도의 고가의 분석기기 및 분석 기술이 필요하다는 단점이 있다.
본 발명의 목적은 알츠하이머 환자 혈액 플라즈마 내에 미량으로 존재하는 베타-아밀로이드, 타우, 인산화된 타우를 효과적으로 분리하여 알츠하이머병을 병리학적으로 진단하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 리파아제를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머병 또는 경도 인지장애 진단을 위한 생체 시료 전처리 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 생체 시료 전처리 조성물 및 진단시약을 포함하는 알츠하이머병 또는 경도 인지장애 진단용 조성물 및 진단 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 생체 시료에 리파아제를 처리하여 지질을 제거하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병 또는 경도 인지장애 진단을 위한 생체 시료 전처리 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 생체 시료에 계면활성제 및 우레아 혼합 용액을 첨가하여 용해하는 단계; 2) 상기 용해액에 메탄올 및 클로로포름을 첨가하여, 분석에 필요한 단백질을 침전시키는 단계; 및 3) 상기 침전액에 리파아제를 처리하여 지질을 제거하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병 또는 경도 인지장애 진단을 위한 생체 시료 전처리 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 생체 시료에 리파아제를 처리하여 지질을 제거하는 단계; 2) 상기 지질이 제거된 생체 시료에 메탄올 및 클로로포름을 첨가하여, 분석에 필요한 단백질을 침전시키는 단계; 및 3) 상기 침전액에 계면활성제 및 우레아 혼합 용액을 첨가하여 용해하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병 또는 경도 인지장애 진단을 위한 생체 시료 전처리 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 상기에 따른 방법으로 전처리된 생체 시료 및 전처리하지 않은 대조군 생체 시료로부터 베타-아밀로이드(beta-amyloid; Aβ), 타우(Tau) 또는 인산화된 타우(pTauS396)의 농도를 측정하는 단계; 2) 상기 전처리하지 않은 대조군 생체 시료에 대한, 전처리된 생체 시료 내 베타-아밀로이드(beta-amyloid; Aβ), 타우(Tau) 또는 인산화된 타우(pTauS396)의 농도 비율을 계산하는 단계; 및 3) 상기 2) 단계에서 계산된 농도 비율이 정상 대조군에서 계산된 농도 비율과 비교하여 높을 경우, 알츠하이머병 또는 경도인지 장애라고 판단하는 단계를 포함하는 알츠하이머병 또는 경도인지 장애 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명은 알츠하이머병 또는 경도 인지장애 진단을 위한 비응집성 용해조성물 및 이를 이용한 진단 방법에 관한 것으로, 알츠하이머 환자의 혈장에서 total-타우, 인산화된 타우, 베타-아밀로이드 측정을 통하여 병리학적 변화를 추적하는데 유용하다. 특히, 추가적으로 고가의 특수 장비가 요구되지 않고, 아밀로이드 항체에 추가적인 공정화 없이 일반적으로 사용되는 항체와 장비만으로도 혈액 내 total-타우, 인산화된 타우, 베타-아밀로이드 측정이 가능하다. 또한, 본 발명은 이러한 아밀로이드 특이적인 항체에 특수적으로 공정화된 처리단계 없이, 혈액 플라즈마 자체를 이용하여, 본 발명에서 제시한 버퍼 처리- 농축- 리파아제 처리를 통하여 알츠하이머 대표적인 단백질의 변화 분석이 가능하게 된다. 웨스턴 블랏과 일방적으로 상용화된 ELISA에 적용하여 쉽게 분석이 가능하며, 또한 현재 혈액 플라즈마 내 베타-아밀로이드 측정법으로 기술 개발된 기기에 특수 처리된 항체로 농축 과정 없이, 본 발명에서 제시된 방법에서 준비된 시료가 동일하게 적용 가능할 것으로 예상된다. 따라서, 본 발명의 조성물 및 진단 방법은 진단의 정확도 및 재현성이 높을 뿐만 아니라, 매우 간편하여 알츠하이머병의 조기 진단에 매우 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 본 발명에서 알츠하이머병 진단을 위해 제시한 혈액으로부터 추출한 혈장에 우레아/도데실 황산 나트륨을 처리하고, 리파아제를 처리하는 방법에 대한 개념도이다.
도 2는 본 발명에서 제시한 방법을 통해 알츠하이머 환자의 혈액에서 추출한 혈장에서 베타-아밀로이드를 검출한 결과이다. 정상인의 혈액에서 추출한 혈장과 같이 분석하였을 때, 도데실 황산 나트륨(SDS)만 처리한 시료에서 리파아제 처리여부에 상관없이 모두 베타-아밀로이드를 검출할 수 없었다. 하지만, 본 발명에서 제시한 방법-우레아/도데실황산나트륨을 처리하고 리파아제를 처리하는 방법을 사용했을 경우, 정상인의 시료에서 검출되지 않았던 베타-아밀로이드가 알츠하이머병으로 진단된 환자의 혈장에서 검출되었다.
도 3은 알츠하이머 환자 (n = 2)의 혈장을 이용하여 사용 가능한 리파아제의 농도를 실험한 결과이다. 혈액에 존재하는 베타-아밀로이드를 분리하고 검출하기에 적절한 리파아제 unit을 정하기 위해, 동일한 시료 단백질에 여러 Unit별로 리파아제를 처리하였다.
도 4는 정상인과 알츠하이머 환자의 혈장에서 단백질을 분리 한 후 동일한 양으로 정량한 후, 본 발명에서 제시한 리파아제 처리에 따른 베타-아밀로이드의 양의 변화를 측정한 결과이다. 리파아제 처리로 인해 혈장으로부터 해리된 베타-아밀로이드를 확인하였다. 정상인에 비해 알츠하이머 환자 혈장 유래 단백질에서 베타-아밀로이드가 더 많이 검출되어 본 발명을 통해 알츠하이머병을 진단할 수 있음을 보여준다.
도 5는 본 발명의 방법을 이용하여 정상인과 알츠하이머 환자의 혈장에 있는 베타-아밀로이드-42 (Aβ-42) 및 베타-아밀로이드-40 (Aβ-40)의 함량을 측정한 결과이다.
도 6은 본 발명에서 제시한 방법으로 정상인과 알츠하이머 환자의 혈장에 있는 total-타우 및 인산화된 타우 (S396)의 함량을 측정한 결과이다.
도 7은 본 발명을 이용해 amyloid-PET 영상을 통하여 amyloid beta는 확인되나, 인지에 문제가 없는 초기 알츠하이머(무증상 치매_asymptomatic AD, aAD) 환자와 인지장애가 있는 알츠하이머 (AD dementia, ADD) 환자의 plasma를 본 발명의 방법과 ELISA를 통해 Amyloid 1-42, Amyloid 1-40, 인산화된 타우 단백질 (pTauS396)의 함량을 측정한 결과이다.
도 8은 본 발명을 통한, 정상인과 인지장애 치매 환자의 차이를 Receiver operating characteristic (ROC) curve, AUC(Area under the ROC curve) value 및 p-value로 나타낸 결과이다.
도 9는 본 발명에서 제시한 방법에 따른 정확도(Accuracy), 민감도(Sensitivity) 및 특이도(Specificity)를 나타낸 결과이다.
도 2는 본 발명에서 제시한 방법을 통해 알츠하이머 환자의 혈액에서 추출한 혈장에서 베타-아밀로이드를 검출한 결과이다. 정상인의 혈액에서 추출한 혈장과 같이 분석하였을 때, 도데실 황산 나트륨(SDS)만 처리한 시료에서 리파아제 처리여부에 상관없이 모두 베타-아밀로이드를 검출할 수 없었다. 하지만, 본 발명에서 제시한 방법-우레아/도데실황산나트륨을 처리하고 리파아제를 처리하는 방법을 사용했을 경우, 정상인의 시료에서 검출되지 않았던 베타-아밀로이드가 알츠하이머병으로 진단된 환자의 혈장에서 검출되었다.
도 3은 알츠하이머 환자 (n = 2)의 혈장을 이용하여 사용 가능한 리파아제의 농도를 실험한 결과이다. 혈액에 존재하는 베타-아밀로이드를 분리하고 검출하기에 적절한 리파아제 unit을 정하기 위해, 동일한 시료 단백질에 여러 Unit별로 리파아제를 처리하였다.
도 4는 정상인과 알츠하이머 환자의 혈장에서 단백질을 분리 한 후 동일한 양으로 정량한 후, 본 발명에서 제시한 리파아제 처리에 따른 베타-아밀로이드의 양의 변화를 측정한 결과이다. 리파아제 처리로 인해 혈장으로부터 해리된 베타-아밀로이드를 확인하였다. 정상인에 비해 알츠하이머 환자 혈장 유래 단백질에서 베타-아밀로이드가 더 많이 검출되어 본 발명을 통해 알츠하이머병을 진단할 수 있음을 보여준다.
도 5는 본 발명의 방법을 이용하여 정상인과 알츠하이머 환자의 혈장에 있는 베타-아밀로이드-42 (Aβ-42) 및 베타-아밀로이드-40 (Aβ-40)의 함량을 측정한 결과이다.
도 6은 본 발명에서 제시한 방법으로 정상인과 알츠하이머 환자의 혈장에 있는 total-타우 및 인산화된 타우 (S396)의 함량을 측정한 결과이다.
도 7은 본 발명을 이용해 amyloid-PET 영상을 통하여 amyloid beta는 확인되나, 인지에 문제가 없는 초기 알츠하이머(무증상 치매_asymptomatic AD, aAD) 환자와 인지장애가 있는 알츠하이머 (AD dementia, ADD) 환자의 plasma를 본 발명의 방법과 ELISA를 통해 Amyloid 1-42, Amyloid 1-40, 인산화된 타우 단백질 (pTauS396)의 함량을 측정한 결과이다.
도 8은 본 발명을 통한, 정상인과 인지장애 치매 환자의 차이를 Receiver operating characteristic (ROC) curve, AUC(Area under the ROC curve) value 및 p-value로 나타낸 결과이다.
도 9는 본 발명에서 제시한 방법에 따른 정확도(Accuracy), 민감도(Sensitivity) 및 특이도(Specificity)를 나타낸 결과이다.
본 발명에서는 알츠하이머 환자의 혈장에서 베타-아밀로이드, 타우, 인산화된 타우를 신속하고, 정확하게 분리 분석, 동정할 수 있도록 시료를 처리하는 방법을 개발하고자 한다.
이에, 본 발명에서는 종래의 절차 이전에 혈장 내의 알츠하이머 특이적인 마커인 베타-아밀로이드, 타우, 인산화된 타우가 가진 소수성을 분석 가능한 성질로 바꾸고, 검출의 민감도를 떨어뜨리는 관련 지질을 제거할 수 있는 특수 용해 버퍼의 조성과 이를 중심으로 하는 분리, 정제 및 농축 방법을 개발하였다. 또한, 본 발명을 통해 특정 장비 또는, 고가의 면역화학결합법 공정된 항체(예, magnetic particle 또는 micro-bead 에 항체연결) 없이 시간, 장소, 비용에 구애받지 않고, 알츠하이머 환자를 진단할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 리파아제를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머병 또는 경도 인지장애 진단을 위한 생체 시료 전처리 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 조성물은 계면활성제 및 우레아 혼합 용액을 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 생체 시료 전처리 조성물 및 진단시약을 포함하는 알츠하이머병 또는 경도 인지장애 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 생체 시료 전처리 조성물 및 진단시약을 포함하는 알츠하이머병 또는 경도 인지장애 진단 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 생체 시료에 리파아제를 처리하여 지질을 제거하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병 또는 경도 인지장애 진단을 위한 생체 시료 전처리 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 생체 시료에 계면활성제 및 우레아 혼합 용액을 첨가하여 용해하는 단계; 2) 상기 용해액에 메탄올 및 클로로포름을 첨가하여, 분석에 필요한 단백질을 침전시키는 단계; 및 3) 상기 침전액에 리파아제를 처리하여 지질을 제거하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병 또는 경도 인지장애 진단을 위한 생체 시료 전처리 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 생체 시료에 리파아제를 처리하여 지질을 제거하는 단계; 2) 상기 지질이 제거된 생체 시료에 메탄올 및 클로로포름을 첨가하여, 분석에 필요한 단백질을 침전시키는 단계; 및 3) 상기 침전액에 계면활성제 및 우레아 혼합 용액을 첨가하여 용해하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병 또는 경도 인지장애 진단을 위한 생체 시료 전처리 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어‘알츠하이머병’은 신경퇴행성 장애를 나타내며 가족력 및 산발성 알츠하이머를 포함한다. 알츠하이머의 대표적인 증상으로써, 경도 내지 중증의 인지장애 치매, 기억의 진행성 손상 (경도 건망증으로부터 방향감각 상실 및 중증의 기억상실), 시공간 기술 부족, 성격 변화, 충동 제어 부족, 판단력 부족, 타인에 대한 불신, 고집 증가, 안절부절한 행동, 계획능력 부족, 의사 결정 부족 및 사회성 결여를 들 수 있다. 뇌 조직의 대표적인 증상으로써 세포외 베타-아밀로이드 플라크 형성, 신경원섬유 엉킴 현상, 신경원섬유 퇴행, 시냅스 손실 및 광범위한 신경세포 사멸을 들 수 있다.
본 발명에서 사용되는 알츠하이머 환자는 베타-아밀로이드에 대한 항체를 방사선으로 연결하여 소량을 체내에 주입하여 진단하는 amyloid-PET (Position Emission Tomography)를 통하여 임상학적으로 알츠하이머로 진단된 환자를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 ‘베타-아밀로이드(β-amyloid: Aβ)’는 알츠하이머 질환에 있어서 아밀로이드 플라크 형성에 중요 요인인 펩타이드로써 아밀로이드 전구체 단백질 (Amyloid precursor protein)에서 단백질 가수분해로 인해 생성된다. 알츠하이머는 취약한 노 영역에서 불용성단백질들의 병리학적 축적으로 인하여 신경세포 사멸을 유도하여 기능장애를 일으키는 특징을 가지고 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 ‘타우(Tau)’는 뇌 신경 세포 내 Microtubule 이라는 세포내 구조물에 결합하는 단백질로써, microtubule의 기능을 조절하여 신경세포의 axon 성장 및 신경전달 물질 수송, 신경 세포 내 미토콘드리아 기능 조절하는 역할을 한다. 타우 단백질의 기능은 단백질 내 인산화와 같은 단백질 내 구조변화를 통해 일어난다. 정상 신경세포에는 유동적으로 인산화가 조절되나, 알츠하이머 질환이 시작되면 타우 단백질 내 인산화가 일어나며, 이러한 단백질은 신경세포에서 soma 또는 Axon 특이적 부위 내에서 396번째 세린에서 인산화가 일어난다. 이러한 인산화는 타우 단백질이 절단작용이 일어나 주변으로 퍼지게 되며, 또한 소수성 특징이 증가하여 신경원섬유 엉킴(NFT)이라는 현상이 일어나 주변 신경세포에 독성으로써 영향을 미친다. 베타-아밀로이드 플라크와 함께 주변 신경세포 사멸을 유도하며, 뇌신경세포의 기능을 저해하게 된다.
본 발명에서 ‘생체 시료’는 단백질이 함유된 모든 시료를 말하는 것으로 바이러스, 미생물, 세포, 동물 또는 식물의 조직, 동물 또는 식물의 기관, 이들의 체액 등이 포함되며, 이러한 시료의 일례로, 뇌와 같은 기관과 그 외 뇌의 체액성분, 조직 등과 같이 다양한 샘플이 될 수 있으며, 특정 질병 뇌조직, 바이오마커를 지닌 뇌조직, 뇌조직과 연관된 혈액, 척수액, 눈물 또는 소변 등의 시료와 그 시료로부터 나오는 소포체, 세포 라지에트, 세포배양을 통해 증식된 시료 또는 자연계의 시료를 모두 포함하는 것일 수 있다. 상기 시료는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 수득할 수 있다. 본 발명에서는 생체 시료로 혈액 또는 혈장을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 ‘혈장’은 혈액으로부터 유래한 플라즈마로 단백질이 포함된 시료이다. 상기 시료는 당업계에서 공지된 방법을 이용해 채취할 수 있다. 채취한 시료는 균질화와 희석 과정을 거치는 것이 바람직하다. 이렇게 채취한 시료는 분석하고자 하는 베타-아밀로이드, 타우, 인산화된 타우 외에 알부민, IgG 와 같은 혈장 단백질이 존재한다. 이런 혈장 단백질을 제거하기 위해서 특별히 제한되는 것은 아니지만, 레진, 비드, 항체 등을 이용한 면역 분리법을 이용해 제거하는 것이 바람직하다. 시료를 그대로 사용할 수도 있고 또는 상기 면역 분리법을 처리하거나, 소니케이터, 열처리 등을 할 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 혈장으로부터 단백질을 용해시키기 위해서 계면활성제를 사용해야 한다. 본 발명에서 활용되는 계면활성제의 종류는 특별히 한정되는 것은 아니나, 일례로 도데실 황산 나트륨 (Sodium Dodecyl Sulfate, SDS)를 포함하는 완충용액을 사용할 수 있다. 적정량의 SDS는 지질분자를 제거하고, 단백질을 변성시켜, 용해를 촉진시키지만, 적정 농도 이상의 사용이거나 단독으로 사용할 경우, 혈장에 존재하는 베타-아밀로이드, 타우, 인산화된 타우를 변형시켜 검출시키지 못하게 한다. SDS의 사용은 2% 이내로 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 우레아(UREA)와 함께 사용한다. SDS/UREA의 혼합 용액에는 SDS/UREA가 주요성분으로, Triethyl ammonium (TEAB), NaCl, EDTA, PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride가 들어가며, 각각 50 mM, 150mM, 1mM, 1mM이 적정하나, 이에 한정하지 않는다. 반응 온도와 시간은 25 ~ 90 ℃, 5시간 이내로 하나, 70℃, 2시간이 바람직하다. 우레아 농도는 4 ~ 8M이 바람직하여, 샘플과 SDS/UREA 혼합 용액의 비율을 부피 비율로 1:1 이 적정하나 이에 한정된 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 혈장에서 추출한 베타-아밀로이드, 타우, 인산화된 타우와 결합되어 있는 지질을 제거하기 위해 리파아제를 처리한다. 리아파제는 췌장 유래 고순도 리파아제를 사용하나, 이에 한정되지 않는다. 효소가 최적으로 반응할 수 있도록 반응 온도는 25 ~ 50 ℃, 반응 농도는 0.5 ~ 5 unit / μg (단백질의 정량 결과), 반응 시간은 2시간인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 이후, 70 ℃에서 30분간 반응을 통해 리파아제를 불활성화시킨다. 단백질을 BCA (Bicinchoninic acid assay)등의 방법으로 정량하여 분석할 시료로써 Western blot 및 ELISA 방법을 통하여 베타-아밀로이드, 타우 및 인산화된 타우 측정에 사용한다.
본 발명에 있어서, 분석에 필요한 단백질을 침전시키는 방법으로 당업계에서 일반적으로 사용하는 메탄올/클로로포름 단백질 침전법을 사용하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 용액의 총 부피를 기준으로 하여 4배의 부피로 100 % Methanol, 1배의 부피로 Chloroform, 3배의 부피로 증류수를 순차적으로 넣어준다. 14,000 g force로 원심분리를 진행 후 상층액을 제거한다. 8M Urea/SDS 버퍼와 혼합된 샘플의 총 부피를 기준으로 하여 4배의 부피로 100% Methanol을 넣어서 잘 섞어준 후, 20,000 g force로 원심분리를 진행하여 상층액을 제거한다. 남아있는 침전물을 50 mM Triethyl ammonium (TEAB)로 녹인 후, 단백질 양을 BCA (Bicinchoninic acid assay)등의 방법으로 정량하여, 정확한 단백질 농도를 확인한다.
또한, 본 발명은 1) 상기 방법으로 전처리된 생체 시료 및 전처리하지 않은 대조군 생체 시료로부터 베타-아밀로이드(beta-amyloid; Aβ), 타우(Tau) 또는 인산화된 타우(pTauS396)의 농도를 측정하는 단계; 2) 상기 전처리하지 않은 대조군 생체 시료에 대한, 전처리된 생체 시료 내 베타-아밀로이드(beta-amyloid; Aβ), 타우(Tau) 또는 인산화된 타우(pTauS396)의 농도 비율을 계산하는 단계; 및 3) 상기 2) 단계에서 계산된 농도 비율이 정상 대조군에서 계산된 농도 비율과 비교하여 높을 경우, 알츠하이머병 또는 경도인지 장애라고 판단하는 단계를 포함하는 알츠하이머병 또는 경도인지 장애 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 베타-아밀로이드는 베타-아밀로이드-42 (Aβ-42) 또는 베타-아밀로이드-40 (Aβ-40)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어 ‘진단’은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링하는 것)을 포함한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시에는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
본 명세서 내에서 모든 동물 실험 과정은 한국뇌연구원 동물실험윤리위원회 규정과 인간 대상 시료의 경우 조선대학교 생명윤리 위원회 및 한국뇌연구원 생명윤리 위원회의 지침서에 따라 수행하였다.
<
실시예
1>
조선대학교에서 피험자를 모집하였다. 일반적인 알츠하이머 환자 판단 기준인 임상 치매 평가 (clinical dementia rating; CDR), 전반적 퇴화 척도도(global deterioration scale, GDS)를 수행하였고, amyloid-PET 영상을 통해 알츠하이머 환자를 진단하였다. 알츠하이머를 진단하기 위한 기준은 미국정신의학회의 DSM-IV를 따랐다. mini-mental state examination(MMSE)를 통해 인지 결함 여부를 구별하여 amyloid-PET 영상결과에는 amyloid가 확인이 되나 인지기능에 문제가 없는 초기 알츠하이머 단계인 무증상 알츠하이머 (asymptomatic AD, aAD)와 amyloid-PET 영상결과에는 amyloid가 확인되며 또한 인지기능이 현저히 감소되어 있는 알츠하이머 환자 (AD dementia, ADD)로 선별하였다. 시험은 조선대학교의 생명윤리 위원회(Institutional Review Board, 의학연구윤리심의위원회)의 승인을 받았고, 모든 참가자들은 본인 또는 가족들의 동의하에 실험에 참여하였다.
<
실시예
2>
1. 시료의 추출
환자로부터 채취한 혈액으로부터 혈장을 분리하고자 혈액을 원심분리기(5430R, Eppendorf)에서 400 g, 10분간 원심분리한 후, 상층액을 2,000 g, 10분간 원심분리를 순차적으로 진행하여 혈액세포가 없는 혈장을 분리하였다.
2. 우레아/계면활성제 처리
상기 용액에 0.5mL e-tube에 넣은 다음, 8M 우레아 (Urea; U5128, Sigma Aldrich), 2% 도데실 황산 나트륨 (Sodum dodecyl sulfate, SDS; L3771, Sigma Aldrich), 40mM 트라에틸암모늄 (Triethyl ammonium , TEAB; 90114, Thermo), 150 mM 염화나트륨(NaCl, S3014, Sigma-Aldrich), 1mM EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid, 15575-038, Invitrogen), 1mM PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride, 93482, Sigma-Aldrich), EDTA-free protease(Halt™ Protease Inhibitor Cocktail (100X), 87786, Thermo)로 이루어진 혼합용액을 상기용액의 부피 동일한 양만큼 넣었다. 히팅 블럭 (ThermoMixer® C, Eppendorf)에서 72도에서 1시간 반응을 시켰다.
3. 메탄올/클로로포름 단백질 침전법
상기 처리된 시료용액 100 ㎕에 400 ㎕ 메탄올(Methanol, S452-4, Fisher)을 넣고 vortex을 이용해 잘 섞어주었다. 다시 100 ㎕의 클로로포름(Chloroform, 319988, Sigma Aldrich)을 넣고 vortex를 이용해 섞어주었다. 다음으로 300 ㎕의 초순수 용액을 넣고 앞서 동일한 방법으로 섞어주었다. 원심 분리기(5430R, Eppendorf)를 이용해 14,000g에서 2분 동안 원심분리를 하여 상층액을 제거하였다. 남은 용액에 400 ㎕ 메탄올을 넣고 votex를 이용해 섞어주었다. 14,000g에서 3분 동안 원심분리를 하여 상층액에 있는 메탄올을 최대한 제거하였다. 고속진공농축기 (SpeedVac; SPD1010, Thermo, USA)을 사용하여 증발시킨 후 50mM 트리에틸 암모늄 (Triethylammonium bicarbonate buffer, TEAB; 90114, Thermo)을 넣어 용해하였다.
4. 단백질 정량
상기 추출한 시료가 담긴 용액은 Pierce BCA Protein Assay Kit(23225, Thermo Scientific™)를 이용해 용액 안의 단백질의 양을 측정하였다. BSA를 계단 희석법을 통해 25μg/mL 단위의 농도로 0.1 mL 씩 만들었다. 측정하고자 하는 용액 또한 적절히 희석 또는 그대로 사용하여 0.1 mL를 준비하였다. 준비된 0.1mL 의 표준 또는 측정대상이 담긴 용액에 2.0 mL의 시약을 넣고 잘 섞어 주었다. 섞어준 용액들은 37℃에서 30분간 반응을 시키고, 상온에서 냉각시켰다. 562nm 로 세팅된 Fast Kinetic Multi-Detection Microplate ReaderFlexStation 3 (Molecular Device) 에서 모든 샘플들을 측정하였다. 측정된 값에서 Blank 표준 용액의 측정값을 빼준 다음에 농도 예상 곡선을 그렸다. 곡선과 시료의 측정값을 비교해서 시료의 단백질의 양을 추정하였다.
5. 지질 분해 및 제거
0.5mL의 e-tube로 시료를 옮기고, 계산된 단백질의 양에 맞추어 단백질 μg 대비 리파아제(Sigma Aldrich) 3 unit을 넣은 후, 37℃로 맞추어진 heat block (Lab Companion)에서 1시간 반응시켰다. heat block에서 70도 30분간 놓아두어, 리파아제 효소의 활동을 중지시켰다.
6. 웨스턴 블로팅
전기 영동 장치에 이미 만들어놓은 겔을 장치하고 Tris/Tricine/SDS Running Buffer (1610744, Bio-Rad)를 부었다. 겔의 홈에 시료를 넣고, 사용하지 않는 홈에도 시료와 같은 용양의 겔 loading 완충 용액을 넣었다. 겔의 전기장을 70 V/m 되도록 30분간 가하고, bromophenol blue가 resolving gel에 도달하면 120 V/m로 전압을 올리고 bromophenol blue가 resolving 겔의 끝까지 갈 때까지 (대략 1시간) 전기 영동을 실시하였다.
전기영동이 끝난 겔을 약 250 mL의 tris/glycine transfer buffer (1016734, Bio-Rad)로 30분간 평형 시켰다. polyvinylidene difluoride (Immun-Blot PVDF Membrane, 1620177, Bio-Rad) 막을 적당한 크기로 자른 후 겔과 함께 tris/glycine transfer buffer (1016734, Bio-Rad)에 담가 30분간 담가 두었다. 웨스턴 블롯용 카세트를 tris/glycine transfer buffer (1016734, Bio-Rad)이 담긴 용액에 넣고 겔 위에 polyvinylidene difluoride (Immun-Blot PVDF Membrane, 1620177, Bio-Rad) 막, 여과지와 스폰지를 함께 올려놓았다. 카세트에 고정 장치를 한 후, blotting chamber로 옮긴 후 tris/glycine transfer buffer (1016734, Bio-Rad)을 넣고 막 쪽이 음극, 겔 쪽이 양극이 되도록 전극을 장치한 다음 400 mA에서 50분 동안 단백질을 막으로 이동시켰다.
항원(단백질)이 전사된 막은 5% skim milk가 포함된 트윈20이 포함된 인산화된 세척 완충 용액 (PBST, Phosphated-buffered saline with Tween-20) 용액에 담가 흔들어주면서, 1시간 동안 실온에서 놓아두어 단백질이 결합하지 않은 막의 부분을 차단시켰다. 블러킹 처리를 한 후, 세척 완충용액 (PBST)으로 세 번 세척하였다.
세척 완충용액을 제거하고, 적당한 농도로 5% BSA가 첨가한 세척 완충용액 (PBST)에 각각 1:1,000으로 희석된 항원 특이적인 일차 항체를 전사막이 충분히 잠길 만큼 가하여 37℃에서 8시간 이상 처리하였다. 일차 항체 희석한 세척 완충용액 (PBST)을 제거한 후 세척 완충용액으로 전사막을 3회에 걸쳐 10분씩 세척하였다. 세척 완충용액 (PBST)에 1:5,000으로 희석시킨 효소가 표지된 이차항체를 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 이차항체 희석 완충요액을 제거한 후, 전사막을 3회에 걸쳐 세척완충용액(PBST) 용액으로 세척하였다. 전사막이 잠길 만큼의 적당한 양의 luminescent 기질 용액(SuperSignal™ West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate, 34580, Thermo)을 첨가한 후 서서히 흔들면서 반응시켰다. 원하는 단백질 밴드가 나오면, 10mM EDTA 용액으로 세척하여 반응을 중지시켰다. Enhanced chemiluminescence (ECL, ImageQuantTM LAS 4000, GE Healthcare) 측정기를 이용해 원하는 단백질을 검출하였다.
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실시예
3>
모든 과정은 실시예 2의 과정과 동일하다. 하지만, 실시예 2의 5단계에서 리파아제를 0.8, 1.6, 3.0 unit /μg으로 나눠서 처리하였다.
<
실시예
4>
모든 과정은 실시예 2의 과정과 동일하다. 실시예 2의 과정에 단백질을 정량한 후, 모든 시료의 단백질 양을 20 μg으로 조절하였다.
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실시예
5>
모든 과정은 실시예 2의 1~5단계까지 동일하다.
6. β Amyloid 1-42 농도 측정
상기 과정을 통해 준비된 시료에 있는 β Amyloid 1-42 (Amyloid beta 42 or Abeta 42) 의 농도를 측정하기 위하여 Human Amyloid beta 42 Assay Kit (KHB3441, invitrogen)를 사용하였다.
Aβ 42에 대한 표준 용액을 만들기 위하여 먼저, 합성된 Aβ 42 펩타이드를 초순수액에 녹여 2,000 pg/mL 농도가 되도록 만들었다. 녹여진 Amyloid beta 42 펩타이드를 계단 희석 방법을 통하여 1000 pg/ml, 500 pg/ml, 250 pg/ml, 125 pg/ml, 62.5 pg/ml, 31.25 pg/ml, 15.63 pg/ml, 0 pg/ml으로 표준용액을 만들었다.
준비된 Amyloid 42 펩타이드 표준용액 50 ㎕ 과 분석할 시료 50㎕를 96well plate의 각 well에 넣어주었다. 그리고 50 ㎕의 Aβ detection 항체를 각각의 well에 넣고 조심히 섞어주었다. 시약이 마르지 않도록 커버를 씌워주고, 실온에서 3시간 동안 흔들어 주면서 반응시켰다. 상기 용액의 반응이 끝나면, 용액을 제거하고, 제공된 세척 용액으로 4번 세척하였다.
제공된 Anti-Rabbit IgG HRP를 1/100으로 희석하여, Amyloid beta 42 표준 용액이 있는 well과 시료가 있는 well에 100 ㎕씩 Anti-Rabbit IgG HRP 용액을 넣고, 상기 방법과 동일하게 30분간 반응시킨 후, 용액을 제거하고 세척하였다. 각각의 well에 Stabilized Chromogen을 넣고 30분간 빛이 없는 실온에서 반응시켰다. 반응 후에 100 ㎕의 Stop solution을 넣어주었다.
반응이 완료된 용액은 2시간 뒤에 450nm 로 세팅된 spectrometer (Fast Kinetic Multi-Detection Microplate ReaderFlexStation 3, Molecular Device)에서 표준용액 및 시료에 대한 흡광도를 측정하였다. 측정된 값에서 chromogen blanks empty의 측정값을 빼준 다음에 농도 예상 곡선을 그렸다. 곡선과 시료의 측정값을 비교해서 시료에 존재하는 Amyloid beta42의 값을 계산하였다.
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실시예
6>
모든 과정은 실시예 2의 1~5단계까지 동일하다.
6. β Amyloid 1-40 농도 측정
상기 과정을 통해 준비된 시료에 있는 β Amyloid 1-40 (Amyloid beta 40 or Abeta 40) 의 농도를 측정하기 위하여 Human Amyloid beta 40 Assay Kit (KHB3481, invitrogen)를 사용하였다.
계단 희석 방법을 통해서, 표준 용액을 만들었다. 표준 Amyloid beta 40가 100 ng/mL의 농도의 용액이 되도록 55 mM Sodium bicarbonate buffer (pH9.0)를 넣었다. 이렇게 제작한 표준 용액 100 ㎕에 900 μL Standard Diluent 완충용액 넣어, 10,000 pg/mL의 표준용액을 만들었다. 이 용액의 100 ㎕를 1,900 μL Standard Diluent 완충용액 넣어, 500 pg/mL의 표준용액을 만들었다. 다시, 150 ㎕ 표준 용액과 150 μL Standard Diluent 완충용액 넣는 방법으로 7 종류의 농도 - 250, 125, 62.5, 31.25, 15.63, 7.81, and 0 pg/mL를 가지는 표준 용액을 만들었다. 이후의 방법은 실시예 4와 동일하다.
<
실시예
7>
모든 과정은 실시예 2의 1~5단계까지 동일하다.
6. Tau의 농도 측정
상기 과정을 통해 준비된 시료에 있는 Tau의 농도를 측정하기 위하여, Tau (Total) Human ELISA Kit (KHB0441, invitrogen)를 사용하였다.
Hu Tau (Total) Standard의 농도가 2,000 pg/mL가 되도록 Standard Dilution 완충용액을 섞었다. 이렇게 준비한 표준 용액에 300 ㎕ 용액과 300 μL Standard Diluent 완충용액 넣는 방법으로 7 종류의 농도 - 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15.63, 7.81, 0 pg/mL를 가지는 표준 용액을 만들었다. 이후의 방법은 실시예 4와 동일하다.
<
실시예
8>
모든 과정은 실시예 2의 1~5단계까지 동일하다.
6. Tau(S396 인산화)의 농도 측정
상기 과정을 통해 준비된 시료에 있는 pTau의 농도를 측정하기 위하여 Human Tau [pS396] ELISA Kit (KHB7031, invitrogen)를 사용하였다.
Hu Tau [pS396] Standard의 농도가 5,000 pg/mL가 되도록 Standard Dilution 완충용액을 섞었다. 이 용액 120 ㎕와 480 ㎕의 Standard Diluent 완충용액 넣어 1,000 pg/mL의 표준 용액을 만들었다. 이렇게 만들어진 표준용액을 실시예 6의 방법과 동일하게 300 ㎕ 용액과 300 μL Standard Diluent 완충용액 넣는 방법으로 7 종류의 농도 - 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15.63, 7.81, 0 pg/mL를 가지는 표준 용액을 만들었다. 이후의 방법은 실시예 5와 동일하다.
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비교예
1>
수득한 환자의 혈액의 처리 과정은 실시예 2와 동일하다. 단, 5단계에서 리아파제를 넣지 않고, 리파아제를 녹일 때 사용한 용액의 동일한 부피를 넣고 37℃로 맞추어진 heat block (Lab Companion)에서 1시간 반응시켰다. 그리고 동일하게 heat block에서 70도 30분간 놓아두었다.
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비교예
2>
수득한 환자의 혈액 처리과정을 실시예 2와 비교예 1과 동일하다. 하지만, 본 비교예에서는 우레아와 계면활성제의 혼합용액을 처리하지 않고, 실시예 2의 2단계에서 도데실 황산 나트륨 (Sodum dodecyl sulfate, SDS; L3771, Sigma Aldrich), 40mM 트라에틸암모늄 (Triethyl ammonium , TEAB; 90114, Thermo), 150 mM 염화나트륨(NaCl, S3014, Sigma-Aldrich), 1mM EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid, 15575-038, Invitrogen), 1mM PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride, 93482, Sigma-Aldrich), EDTA-free protease(Halt™ Protease Inhibitor Cocktail (100X), 87786, Thermo)로 이루어진 혼합용액을 시료가 담긴 용액의 부피 동일한 양만큼 넣었다. 히팅 블럭에서 72도에서 1시간 반응을 시켰다.
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비교예
3>
수득한 환자의 혈액의 처리 과정은 실시예 3과 동일하다. 단, 리아파제를 넣지 않고, 리파아제를 녹일 때 사용한 용액의 동일한 부피를 넣고 37℃로 맞추어진 heat block (Lab Companion)에서 1시간 반응시켰다. 그리고 동일하게 heat block에서 70도 30분간 놓아두었다.
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비교예
4>
수득한 환자의 혈액의 처리 과정은 실시예 4와 동일하다. 단, 5단계에서 리아파제를 넣지 않고, 리파아제를 녹일 때 사용하던 용액의 동일한 부피를 넣고 37℃로 맞추어진 heat block (Lab Companion)에서 1시간 반응시켰다. 그리고 동일하게 heat block에서 70도 30분간 놓아두었다.
<
비교예
5>
수득한 환자의 혈액의 처리 과정은 실시예 5, 비교예 5와 동일하다. 단, 5단계에서 리아파제를 넣지 않고, 리파아제를 녹일 때 사용하던 용액의 동일한 부피를 넣고 37℃로 맞추어진 heat block (Lab Companion)에서 1시간 반응시켰다. 그리고 동일하게 heat block에서 70도 30분간 놓아두었다.
<
비교예
6>
수득한 환자의 혈액의 처리 과정은 실시예 6과 동일하다. 단, 5단계에서 리아파제를 넣지 않고, 리파아제를 녹일 때 사용하던 용액의 동일한 부피를 넣고 37℃로 맞추어진 heat block (Lab Companion)에서 1시간 반응시켰다. 그리고 동일하게 heat block에서 70도 30분간 놓아두었다.
<
비교예
7>
수득한 환자의 혈액의 처리 과정은 실시예 7과 동일하다. 단, 5단계에서 리아파제를 넣지 않고, 리파아제를 녹일 때 사용하던 용액의 동일한 부피를 넣고 37℃로 맞추어진 heat block (Lab Companion)에서 1시간 반응시켰다. 그리고 동일하게 heat block에서 70도 30분간 놓아두었다.
<
비교예
8>
수득한 환자의 혈액의 처리 과정은 실시예 8과 동일하다. 단, 5단계에서 리아파제를 넣지 않고, 리파아제를 녹일 때 사용하던 용액의 동일한 부피를 넣고 37℃로 맞추어진 heat block (Lab Companion)에서 1시간 반응시켰다. 그리고 동일하게 heat block에서 70도 30분간 놓아두었다.
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대조예
1>
실시예 1에서 정상인의 혈액을 수득하였다. 수득한 혈액의 처리 과정은 실시예 2, 비교예 1, 비교예 2와 동일하다.
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대조예
2>
실시예 1에서 정상인의 혈액을 수득하였다. 이후 모든 과정은 실시예 4, 비교예 4의 과정과 동일하다. 모든 시료의 단백질 양을 20 μg으로 조절한 후, 웨스턴 블로팅을 하였다.
<
대조예
3>
실시예 1에서 정상인의 혈액을 수득하였다. 수득한 혈액의 처리 과정은 실시예 5, 비교예 5와 동일하다.
<
대조예
4>
실시예 1에서 정상인의 혈액을 수득하였다. 수득한 혈액의 처리 과정은 실시예 6, 비교예 6과 동일하다.
<
대조예
5>
실시예 1에서 정상인의 혈액을 수득하였다. 수득한 혈액의 처리 과정은 실시예 7, 비교예 7과 동일하다.
<
대조예
6>
실시예 1에서 정상인의 혈액을 수득하였다. 수득한 혈액의 처리 과정은 실시예 8, 비교예 8과 동일하다.
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실험예
1>
실시예 2와 비교예 1, 비교예 2, 대조예 1의 결과를 분석하기 위해서 웨스턴 블로팅에 사용된 일차 항체는 다음과 같다.
- Aβ (D54D2) (β-Amyloid (D54D2) XPⓡ Rabbit mAb, 8243s, Cell Signaling)
- β-Actin Anti-beta-actin, Clone OTI1 (Origene,TA811000S)
2차 항체는 Aβ (D54D2)에 대해서는 Rabbit IgG-HRP (NA-934, GE Healthcare)를 β-Actin에 대해서는 mouse IgG-HRP (NA-931, GE Healthcare) 사용하였다.
β-Amyloid (D54D2) XP® Rabbit mAb는 주로 인간에서 유래한 Aβ-42, Aβ-40, Aβ-39, Aβ-38, and Aβ-37 peptides와 결합하는 항체이다. 이런 Aβ peptides는 응집되어 β sheet의 구조를 갖고 있다. 또한 모든 혈액이 β-Actin을 갖고 있기 때문에, 웨스턴 블로팅 실험에 β-Actin과 알츠하이머 특이 표지자인 Aβ에 대한 항체를 사용하였다.
상기 단백질의 발현 수준을 측정하기 위해, 실험에 모집한 알츠하이머 환자의 혈장을 분석하였다. 구체적으로 상기 실시예 1에서 모집한 환자로부터 수득한 혈액을 실시예 2, 비교예 2, 대조예 2와 같이 실시하여 웨스턴 블로팅 실험을 수행하였다. 그 결과, 도 2에서 나타난 바와 같이, 본 발명이 제시하는 방법인 2% 도데실황산나트륨과 8M 우레아를 처리한 후, 리파아제를 처리했을 경우, 알츠하이머 환자의 혈장에서 뚜렷하게 베타-아밀로이드 펩타이드가 추출됨을 확인하였다. 비교예로, 리아파제를 처리하지 않았을 경우, 알츠하이머 환자의 혈장에서 베타-아밀로이드 펩타이드는 거의 발견되지 않았다. 또한, 대조예로 5% 도데실황산나트늄만을 사용했을 경우, 리파아제를 처리 여부와 상관없이 모든 시료에서 추출한 베타-아밀로이드 펩타이드의 발현 수준은 거의 미미하였다.
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실험예
2>
실시예 3, 비교예 3에서 사용한 일차 항체는 다음과 같다.
- Aβ (D54D2) (β-Amyloid (D54D2) XP® Rabbit mAb, 8243s, Cell Signaling)
- CD63 polyclonal antibody (AB0047-200, Sicgen)
2차 항체는 Aβ (D54D2)에 대해서는 Rabbit IgG-HRP (NA-934, GE Healthcare)를 CD63에 대해서는 mouse anti Goat-HRP (ab157532, Abcam) 사용하였다. 혈액에는 일반적으로 엑소좀을 포함하고 있다. 따라서, 엑소좀 마커인 CD63과 알츠하이머 특이 표지자인 Aβ에 대한 항체를 사용한 웨스턴 블로팅을 실험하였다.
본 발명을 통해 베타-아밀로이드를 검출할 수 있는 리파아제의 적절한 농도를 찾기 위해 실시예 3과 같이 실험을 하였다. 비교를 위해서 리파아제를 넣지 않고 비교예 3과 같이 실험하였다. 도 3의 결과에서 알 수 있듯이, 환자 2명의 혈장에 대해서 리파아제를 처리할수록 분리 추출된 베타-아밀로이드의 양이 많아짐을 확인하였다. 리파아제의 농도가 강해질수록, 동일한 시료 내에서 CD63과 같은 단백질이 리파아제에 의해 사라지고, 베타-아밀로이드 확인 효율이 증가하였다. 따라서 실험예 3을 통해 0.1 ~ 3 units / μg 의 리파아제 처리가 적절함을 확인하였다.
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실험예
3>
실시예 4, 비교예 4와 대조예 2에서 사용한 일차항체는 다음과 같다.
- Aβ (D54D2) (β-Amyloid (D54D2) XP® Rabbit mAb, 8243s, Cell Signaling)
- APOE (ApoE (pan) (D7I9N) Rabbit mAb, 13366, Cell signaling)
2차 항체는 동일하게 Rabbit IgG-HRP (NA-934, GE Healthcare)를 사용하였다.
일반적으로 정상인의 혈액에서도 베타-아밀로이드가 검출된다. 알츠하이머 환자에서 수득한 혈액에서 추출한 혈장에서 추출한 단백질을 정량하여 20 μg 양을 준비한 후, 리파아제를 처리하거나 (실시예 4), 대신에 동일한 볼륨의 용액을 넣는다 (비교예 4). 마찬가지로, 정상인의 혈액으로부터 추출한 혈장에 추출한 단백질을 정량하여 20 μg 양을 준비한 후, 리파아제를 처리하거나, 대신에 동일한 볼륨의 용액을 넣는다 (대조예 2). 도 4에 나타낸 바와 같이, APOE 단백질은 리아파제에 의해 사라지지만, 베타-아밀로이드 펩타이드는 정상인과 알츠하이머 환자의 혈장 추출 단백질에서 모두 확인된다. 뿐만 아니라, 알츠하이머 환자의 베타-아밀로이드 펩타이드의 발현 수준이 정상인의 발현 수준에 비해 높고, 뚜렷이 구분된다. 이를 통해서 리파아제를 이용한 본 발명의 방법이 알츠하이머 환자에 혈액에 존재하는 베타-아밀로이드를 검출해내어 진단방법으로 유의미함을 알 수 있다.
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실험예
4>
Aβ40과 Aβ42 모두 preseniln 유전자의 변이로 기인한, 가족성 알츠하이머병 환자에게서 정상인이나 산발성 알츠하이머병 환자에서 보다, 2-3배 가량 증가한다고 알려져 있다. 또한, Aβ40이 ApoE ε4 대립형질유전자를 가지는 알츠하이머 병 환자에게서 증가한다고 보고 되었다. 하지만, 알츠하이머병이 진행되면, Aβ42 가 뇌에 침착되어 혈액내 Aβ42 의 양은 줄어들지만, Aβ40의 증가되는 양은 변하지 않은 것으로 알려져 있다.
실험에 이용한 항체는 상기 실시예 5/6, 비교예 5/6, 대조예 3/4에 사용한 ELISA kit에서 제공하는 항체를 사용하였다.
본 실험에 혈액을 제공한 알츠하이머 환자의 혈장에 있는 β Amyolid 1-42의 함량을 ELISA를 통해 측정하였다 (실시예 5, n = 7). 비교를 위해서 동일한 혈장에 리파아제를 처리하지 않고 β Amyolid 1-42의 함량을 ELISA를 통해 측정하였다 (비교예 5). 이와 함께, 정상인의 혈장에 있는 β Amyolid 1-42도 측정하였다 (대조예 5, n = 8). 도 5에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법을 사용하여 알츠하이머 환자의 혈장에서 추출된 Aβ42의 함량을 측정했을 경우, 사용하지 않는 방법보다 유의미하게 (p = 0.058) 증가함을 확인하였다. 하지만, 정상인의 혈장에서는 추출된 Aβ42의 양은 본 발명의 방법 사용 여부에 따라 차이가 없었다. 본 발명이 제안하는 리파아제를 처리했을 때, 정상인의 혈장보다 알츠하이머 환자의 혈장에서 분리된 Aβ-42의 양을 비교했을 때, 유의미하게 증가하였다.
본 발명을 이용해 알츠하이머병 환자로부터 나온 혈장을 구분할 수 있는지 확인하기 위해 정상인의 혈장에 본 발명의 방법을 사용한 경우 추출한 Aβ42의 양과 사용하지 않은 경우의 Aβ42의 양의 비율을 측정하였다. 알츠하이머병 환자의 혈장과 마찬가지로 본 방법을 사용해 추출한 Aβ42의 양과 사용하지 않은 경우 Aβ42의 양의 비율을 측정하였다. 그 결과, 도 5에서 나타낸 바와 같이, 알츠하이머병 환자의 혈장의 비율이 정상인의 혈장의 비율보다 높을 뿐만 아니라, 유의미한 차이(p = 0.05)를 보여주었다. 하지만, 리파아제를 처리하지 않았을 경우, 정상인과 알츠하이머 환자의 혈장에 존재하는 Aβ-42 추출 함량에는 유의미한 차이가 없었다.
알츠하이머 환자의 혈장을 본 발명의 방법을 이용해 처리하여 Amyloid 1-40의 함량을 ELISA를 통해 측정하였다 (실시예 6, n=9). 비교를 위해서 동일한 혈장에 리파아제를 처리하지 않고, Amyloid 1-40의 함량을 ELISA를 통해 측정하였다 (비교예 6). 동일한 방법으로 정상인의 혈장에 있는 Amyloid 1-40의 함량을 ELISA를 통해 측정하였다 (대조예 4, n = 8). 측정 결과, Aβ-40의 경우, 도 5에 나타내는 바와 같이, 본 발명이 제안하는 리파아제를 처리하는 방법을 사용할 경우, 리파아제를 처리하지 않는 방법보다 알츠하이머 환자 혈장에서 추출된 양이 유의미(p<0.01)하게 증가하였다. 특히, 본 발명이 제시하는 방법을 통해 정상인과 알츠하이머 환자의 혈장에 존재하는 Aβ-40 추출 함량을 비교했을 경우 유의미(p=0.086)한 차이가 남을 확인하였다. 하지만, 리파아제를 처리하지 않았을 경우, 정상인과 알츠하이머 환자의 혈장에 존재하는 Aβ-40 추출 함량에는 유의미한 차이가 없었다.
상기 실시예 5, 비교예 5, 대조예 3과 마찬가지로, 본 발명을 이용해 알츠하이머병 환자로부터 나온 혈장을 구분할 수 있는지 확인하기 위해 본 발명의 사용해 혈장에서 추출한 Aβ-40의 함량과 사용하지 않는 경우 Aβ-40의 함량을 비율을 측정하였다. 그 결과, 도 5에서 나타낸 바와 같이, 알츠하이머 환자의 혈장에서 추출한 Aβ-40 함량의 비율이 정상인의 혈장에서 추출한 Aβ-40의 비율보다 높을 뿐만아니라, 유의미한 차이 (p = 0.03)를 보여주었다.
상기 실시예 5, 비교예 5, 대조예 3과 마찬가지로, 본 발명을 이용해 amyloid-PET 영상을 통하여 amyloid beta는 확인되나, 인지에 문제가 없는 초기 알츠하이머(무증상 치매_asymptomatic AD, aAD) 환자와 인지장애가 있는 알츠하이머 (AD dementia, ADD) 환자의 plasma를 본 발명의 방법과 ELISA를 통해 Amyloid 1-42, Amyloid 1-40의 함량을 측정하였다 (실시예 6, 무증상 치매 total n = 44_ Female n =22, Male n = 22)(실시예 6, 인지장애 치매 total n= 44_ Female n =26, Male n = 18). 비교를 위해서 동일한 혈장에 리파아제를 처리하지 않고, Amyloid 1-42, Amyloid 1-40의 함량을 ELISA를 통해 측정하였다 (비교예 6). 동일한 방법으로 정상인의 혈장에 있는 Amyloid 1-40의 함량을 ELISA를 통해 측정하였다 (대조예 4, total n = 88_ Female n =44, Male n = 44). 측정 결과, 도 7에서 명시된 것과 같이 본 발명이 제안하는 리파아제를 처리하는 방법을 사용할 경우가 처리하지 않은 방법보다 정상인과 초기 치매환자 및 인지장애 치매환자가 남성그룹에서 유의적으로 차이가 남을 확인하였다. 여성인 경우도 인지장애 치매환자에 있어서는 리파아제를 처리하는 방법으로 분석 시 정상인과 유의미하게 차이가 있음을 확인하였다. 여성 무증상 치매 환자그룹에서는 Amyloid 1-40 에서만 리파아제 처리여부와 상관없이 정상인과 차이가 없었으나, Amyloid 1-42에서는 정상인과 유의적 차이가 있음을 확인하였다. Abeta1-42/Abeta1-40 비율로 살펴볼 때는, 무증상 치매환자 및 인지장애 치매환자그룹 모두 정상인에 비해 유의적 차이가 있음을 확인하였다. 이러한 결과는 도 8에서 본 발명기법을 통하여 정상인과 무증상 치매환자 또는 인지장애 환자의 차이를 Receiver operating characteristic (ROC) curve 및 AUC(Area under the ROC curve) value 및 p-value를 통해서도 알 수 있으며 이러한 정확도는 도 9를 통하여 명시하였다.
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실험예
5>
알츠하이머 진단의 또 다른 표지자로 알려진 타우 단백질의 함량을 측정하기 위해 실시예 7, 비교예 7, 대조예 5와 같이 ELISA 실험을 하였다 (정상인 혈액 n =8, 알츠하이머 환자 혈액 n = 8). 도 6에서 나타낸 바와 같이, 본 발명이 제시한 방법으로 리파아제를 처리했을 경우, 처리하지 않았을 경우보다 유의미하게 (p<0.01) 타우 단백질이 추출됨을 확인하였다(실시예 7, 비교예 7). 하지만, 정상인의 혈액에 대해 타우 단백질을 추출했을 때, 본 발명의 사용에 따른 차이가 유의미하지 않았다. 상기 실험예 4와 같이 본 발명을 이용해 알츠하이머병 환자로부터 나온 혈장을 구분할 수 있는지 확인하기 위해 본 발명의 사용해 혈장에서 추출한 타우 단백질의 함량과 사용하지 않는 경우 타우단백질의 함량을 비율을 측정하였다. 그 결과, 도 6에서 나타낸바와 같이, 본 발명이 제시한 방법에 따라 알츠하이머 환자의 혈장에서 추출한 타우 단백질의 비율이 정상인의 혈장에서 추출한 단백질의 비율에 비해 유의미(p=0.04)하게 차이를 보여주었다.
그래서, 동일한 시료를 실시예 8과 비교예 8, 대조예 6과 같이 처리하여 인산화된 타우 단백질 (pTauS396)의 함량을 ELISA로 측정하였다 (정상인 혈액 n =8, 알츠하이머 환자 혈액 n = 8). 알츠하이머 환자 혈장으로부터 추출한 인산화된 타우 단백질은 본 발명이 제시한 방법을 사용해 추출했을 경우, 사용하지 않았을 경우보다 유의미(p<0.001)하게 증가되어 추출됨을 확인하였다(실시예 8과 비교예 8). 또한, 리파아제를 처리했을 때, 알츠하이머 환자에서 인산화된 타우 단백질이 정상인 환자에서 추출된 인산화된 타우 단백질에 비해 유의미(p < 0.01)하게 증가되어 있음을 확인하였다 (대조예 6). 상기 실험예 4와 같이 본 발명을 이용해 알츠하이머병 환자로부터 나온 혈장을 구분할 수 있는지 확인하기 위해 본 발명의 사용해 혈장에서 추출한 인산화된 타우 단백질의 함량과 사용하지 않는 경우 인산화된 타우 단백질의 함량을 비율을 측정하였다. 그 결과, 도 6에서 나타낸 바와 같이, 본 발명이 제시한 방법에 따라 알츠하이머 환자의 혈장에서 추출한 타우 단백질의 비율이 정상인의 혈장에서 추출한 단백질의 비율에 비해 유의미(p=0.01)하게 차이를 보여주었다.
상기 실험예 4와 실험예 5를 통해 리파아제를 주요성분으로 처리하는 본 방법이 알츠하이머 환자의 혈액에 베타-아밀로이드 펩타이드 특히-Aβ-42, Aβ-40와 타우, 인산화된 타우 단백질 (pTauS396)을 보다 효과적으로 분리 및 측정할 수 있음을 확인하였다, 본 발명이 제시하는 방법으로 Aβ-42, Aβ-40와 인산화된 타우 단백질(pTauS396) 단백질을 보다 효과적으로 추출하여 알츠하이머병을 진단할 수 있음을 확인하였다.
상기 실시예 8, 비교예 8, 대조예 6와 마찬가지로, 본 발명을 이용해 amyloid-PET 영상을 통하여 amyloid beta가 확인되나 인지장애가 없는 초기 알츠하이머 (무증상 치매_asymptomatic AD, aAD) 환자와 인지장애가 있는 알츠하이머 (AD dementia, ADD) 환자의 plasma를 본 발명의 방법과 ELISA를 통해 인산화된 타우 단백질 (pTauS396)의 함량을 측정하였다 (실시예 8, 무증상 치매 total n = 33_ Female n = 16, Male n = 17), (실시예 8, 인지장애 치매 total n= 41_ Female n =23, Male n = 18). 비교를 위해서 동일한 혈장에 리파아제를 처리하지 않고, 인산화된 타우 단백질 (pTauS396)의 함량을 ELISA를 통해 측정하였다 (비교예 8). 동일한 방법으로 정상인의 혈장에 있는 인산화된 타우 단백질 (pTauS396)의 함량을 ELISA를 통해 측정하였다 (대조예 4, total n = 74_ Female n =42, Male n = 32). 측정 결과, 도 7에서 명시된 것과 같이 본 발명이 제안하는 리파아제를 처리하는 방법을 사용할 경우가 처리하지 않은 방법보다 정상인과 인지장애 치매환자가 여성 그룹과 남성 그룹에서 유의적으로 차이가 남을 확인하였다. 이러한 결과는 도 8에서 본 발명기법을 통하여 정상인과 인지장애 치매 환자의 차이를 Receiver operating characteristic (ROC) curve 및 AUC(Area under the ROC curve) value 및 p-value를 통해서도 알 수 있으나, 무증상 치매환자에 있어서는 여성 그룹 및 남성 그룹에서는 인산화된 타우 단백질 (pTauS396)에 있어서는 정상인과 차이 없음을 확인되었다.
따라서, 도 9를 통하여 각 항목에 대한 분석 정확도를 보여주듯이, 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 무증상 치매와 인지장애 치매를 본 발명의 알츠하이머병을 병리학적으로 진단하기 위해 알츠하이머병 표지자, 특히, 베타-아밀로이드 펩타이드와 인산화된 단백질을 분리 분출하고 동정하기 위하여, 환자의 플라즈마를 본 발명의 방법을 통한 처리 및 리파아제를 유효성분으로 하는 용액의 처리가 효과적 방법이라고 할 수 있다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (13)
- 리파아제를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머병 또는 경도 인지장애 진단을 위한 생체 시료 전처리 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 계면활성제 및 우레아 혼합 용액을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생체 시료 전처리 조성물.
- 제1항 또는 제2항의 생체 시료 전처리 조성물 및 진단시약을 포함하는 알츠하이머병 또는 경도 인지장애 진단용 조성물.
- 제1항 또는 제2항의 생체 시료 전처리 조성물 및 진단시약을 포함하는 알츠하이머병 또는 경도 인지장애 진단 키트.
- 생체 시료에 리파아제를 처리하여 지질을 제거하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병 또는 경도 인지장애 진단을 위한 생체 시료 전처리 방법.
- 1) 생체 시료에 계면활성제 및 우레아 혼합 용액을 첨가하여 용해하는 단계;
2) 상기 용해액에 메탄올 및 클로로포름을 첨가하여, 분석에 필요한 단백질을 침전시키는 단계; 및
3) 상기 침전액에 리파아제를 처리하여 지질을 제거하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병 또는 경도 인지장애 진단을 위한 생체 시료 전처리 방법. - 1) 생체 시료에 리파아제를 처리하여 지질을 제거하는 단계;
2) 상기 지질이 제거된 생체 시료에 메탄올 및 클로로포름을 첨가하여, 분석에 필요한 단백질을 침전시키는 단계; 및
3) 상기 침전액에 계면활성제 및 우레아 혼합 용액을 첨가하여 용해하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병 또는 경도 인지장애 진단을 위한 생체 시료 전처리 방법. - 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 계면활성제 및 우레아 혼합 용액은 1 ~ 4% 도데실 황산 나트륨(Sodium Dodecyl Sulfate, SDS) 및 4 ~ 8M 우레아가 혼합된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리파아제 처리는 0.5 ~ 5 unit/μg 리파아제를 25 ~ 50℃에서 0.1 ~ 2시간 동안 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 분석에 필요한 단백질은 베타-아밀로이드(β-amyloid; Aβ), 타우(Tau) 또는 인산화된 타우(pTauS396)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체 시료는 혈액, 혈장, 조직, 세포, 뇌척수액, 눈물 또는 소변인 것을 특징으로 하는 방법.
- 1) 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 전처리된 생체 시료 및 전처리하지 않은 대조군 생체 시료로부터 베타-아밀로이드(β-amyloid; Aβ), 타우(Tau) 또는 인산화된 타우(pTauS396)의 농도를 측정하는 단계;
2) 상기 전처리하지 않은 대조군 생체 시료에 대한, 전처리된 생체 시료 내 베타-아밀로이드(β-amyloid; Aβ), 타우(Tau) 또는 인산화된 타우(pTauS396)의 농도 비율을 계산하는 단계; 및
3) 상기 2) 단계에서 계산된 농도 비율이 정상 대조군에서 계산된 농도 비율과 비교하여 높을 경우, 알츠하이머병 또는 경도인지 장애라고 판단하는 단계를 포함하는 알츠하이머병 또는 경도인지 장애 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법. - 제12항에 있어서, 상기 베타-아밀로이드는 베타-아밀로이드-42 (Aβ-42) 또는 베타-아밀로이드-40 (Aβ-40)인 것을 특징으로 하는 방법.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| PCT/KR2023/005049 WO2023200281A1 (ko) | 2022-04-15 | 2023-04-14 | 알츠하이머병 또는 경도 인지장애 진단을 위한 비응집성 용해조성물 및 이를 이용한 진단 방법 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220046944 | 2022-04-15 | ||
| KR20220046944 | 2022-04-15 |
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|---|---|---|---|
| KR1020230048861A KR20230148764A (ko) | 2022-04-15 | 2023-04-13 | 알츠하이머병 또는 경도 인지장애 진단을 위한 비응집성 용해조성물 및 이를 이용한 진단 방법 |
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|---|---|
| KR (1) | KR20230148764A (ko) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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2023
- 2023-04-13 KR KR1020230048861A patent/KR20230148764A/ko unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6114132A (en) | 1996-11-04 | 2000-09-05 | Merck Frosst Canada & Co. | Prosphatase binding assay |
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