JP3259963B2 - アルツハイマー病を診断およびモニターするためのｐ９７の定量 - Google Patents
アルツハイマー病を診断およびモニターするためのｐ９７の定量Info
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、アルツハイマー病の診断およびモニターに
使用するp97の定量方法に関する。
使用するp97の定量方法に関する。
発明の背景 アルツハイマー病（AD）は、知覚、行動および機能に
影響を及ぼす神経退行性の疾患である。最近の研究にお
いて、ADは年齢75でほぼ７％の個体を冒し、年齢85では
４人に１人を越えるまで増加することが示されている
［カナダの健康および老化の研究グループの研究;J.Ca
n.Med.Assoc.150,899−913（1994）］。他の研究は、老
人を冒すADの発生率をもっと高いものと主張している
［エバンス（Evans,D.A.）:J.Am.Med.Assoc.262,1551−
2559（1989）］。現在のところ、ADに対して非常に限定
された治療選択肢が存在するにすぎず、診断のための唯
一確実な方法は脳剖検によるものである。
影響を及ぼす神経退行性の疾患である。最近の研究にお
いて、ADは年齢75でほぼ７％の個体を冒し、年齢85では
４人に１人を越えるまで増加することが示されている
［カナダの健康および老化の研究グループの研究;J.Ca
n.Med.Assoc.150,899−913（1994）］。他の研究は、老
人を冒すADの発生率をもっと高いものと主張している
［エバンス（Evans,D.A.）:J.Am.Med.Assoc.262,1551−
2559（1989）］。現在のところ、ADに対して非常に限定
された治療選択肢が存在するにすぎず、診断のための唯
一確実な方法は脳剖検によるものである。
ADは、主にβ−アミロイドタンパク質（Ａβ）からな
る老人斑、高ホスホリル化ミクロチューブリン関連タン
パク質Tauを伴なう神経細線維のもつれ［ゲダート（Goe
dert,M）、スピランチニ（Spillantini）ら:Neuron 8,1
56−160（1992）；およびセルケ（Selkoe,D.J.）:Neuro
n 6,487−498（1991）］、ニューロン細胞死およびシナ
プス接合の損失［テリー（Terry,R.D.）ら:Ann.Neurolo
gy 30,572−580（1991）］を含む脳における種々の病理
学的マーカーによって特徴付けられる。タンパク質Ａβ
の異常な蓄積は、知覚および記憶に関与している脳領域
においてニューロン細胞死の結果を与えると言われてい
る［ブラス（Blass,J.P.）:Neurology 43,S25−38（199
3）；およびプライス（Price,D.L.）:Ann.Rev.Neurosc
i.9,489−512（1986）］。
る老人斑、高ホスホリル化ミクロチューブリン関連タン
パク質Tauを伴なう神経細線維のもつれ［ゲダート（Goe
dert,M）、スピランチニ（Spillantini）ら:Neuron 8,1
56−160（1992）；およびセルケ（Selkoe,D.J.）:Neuro
n 6,487−498（1991）］、ニューロン細胞死およびシナ
プス接合の損失［テリー（Terry,R.D.）ら:Ann.Neurolo
gy 30,572−580（1991）］を含む脳における種々の病理
学的マーカーによって特徴付けられる。タンパク質Ａβ
の異常な蓄積は、知覚および記憶に関与している脳領域
においてニューロン細胞死の結果を与えると言われてい
る［ブラス（Blass,J.P.）:Neurology 43,S25−38（199
3）；およびプライス（Price,D.L.）:Ann.Rev.Neurosc
i.9,489−512（1986）］。
臨床的には、ADの診断は神経学的および神経病理学的
な評価によって行われているが、残念ながらこの疾患を
その初期段階において検出することはできない。NINCDS
−ADRDAのような一定の臨床診断基準を使用することに
より、臨床での病理学的診断の精度は80％を越えるまで
改善されている［マッカーン（McKhann,G.）ら:Neurolo
gy 34,939−944（1984）］。
な評価によって行われているが、残念ながらこの疾患を
その初期段階において検出することはできない。NINCDS
−ADRDAのような一定の臨床診断基準を使用することに
より、臨床での病理学的診断の精度は80％を越えるまで
改善されている［マッカーン（McKhann,G.）ら:Neurolo
gy 34,939−944（1984）］。
脳脊髄液（CSF）タンパク質の量とADとを関係付ける
試みは、限定された成功を収めている。例えば、CSF中
のＡβを検出するために開発された試験は、早期開始の
AD患者は年配の対照よりもわずかに高いＡβ量を有する
が［ナカムラ（Nakamura,T.）ら:Ann.Neurol.36,903−9
11（1994）］、AD患者における全Ａβ量は対照とは有意
に相違しないことを示した［ショウジ（Shoji,M.）ら:S
cience 258,126−129（1992）］。しかし、42位まで伸
びるＡβ、即ちＡβ1-42がAD脳組織における拡散性およ
び老人性の両アミロイド斑において多いこと［ローハー
（Roher,A.）ら:J.Biol.Chem.268,3072−3083（199
3）］、およびＡβ1-42が対照に比べてAD患者のCSFにお
いて有意に少ないことが発見されたこと［モター（Mott
er,R.）ら:Ann.Neurol.38,643−648（1995）］が注目さ
れる。分泌型のアミロイド前駆体タンパク質（APP）
（これからＡβが誘導される）の研究において、可溶性
APPが対照に比べてAD患者のCSFにおいて大きく減少して
いることがわかった［バン・ノストランド（Van Nostra
nd,W.E.）ら:Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,2551−2555
（1992）］。しかし、他の研究は、APPのわずかな減少
［パルメート（Palmert,M.R.）ら:Neurol.40,1028−103
4（1990）］、さらには増加［キタグチ（Kitaguchi,
N.）ら:Biochem.BiopHys.Res.Comm.166,1453−1459（19
90）］に言及しているにすぎない。CSF中のタンパク質T
auをモニターするために開発された試験により、平均し
てTau量は対照よりもAD患者において高くなるが、正常
な対照［モター（Motter,R.）ら:Ann.Neurol.38,643−6
48（1995）；ビゴ−ペルフリー（Vigo−Pelfrey,C.）
ら:Neurology 45,788−793（1995）］、および他の神経
学的疾患に罹患している対照［バンダーミーレン（Vand
ermeeren,M.）ら:J.Neurochem.61,1828−1834（199
3）］と大きく重なり合うことがわかった。
試みは、限定された成功を収めている。例えば、CSF中
のＡβを検出するために開発された試験は、早期開始の
AD患者は年配の対照よりもわずかに高いＡβ量を有する
が［ナカムラ（Nakamura,T.）ら:Ann.Neurol.36,903−9
11（1994）］、AD患者における全Ａβ量は対照とは有意
に相違しないことを示した［ショウジ（Shoji,M.）ら:S
cience 258,126−129（1992）］。しかし、42位まで伸
びるＡβ、即ちＡβ1-42がAD脳組織における拡散性およ
び老人性の両アミロイド斑において多いこと［ローハー
（Roher,A.）ら:J.Biol.Chem.268,3072−3083（199
3）］、およびＡβ1-42が対照に比べてAD患者のCSFにお
いて有意に少ないことが発見されたこと［モター（Mott
er,R.）ら:Ann.Neurol.38,643−648（1995）］が注目さ
れる。分泌型のアミロイド前駆体タンパク質（APP）
（これからＡβが誘導される）の研究において、可溶性
APPが対照に比べてAD患者のCSFにおいて大きく減少して
いることがわかった［バン・ノストランド（Van Nostra
nd,W.E.）ら:Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,2551−2555
（1992）］。しかし、他の研究は、APPのわずかな減少
［パルメート（Palmert,M.R.）ら:Neurol.40,1028−103
4（1990）］、さらには増加［キタグチ（Kitaguchi,
N.）ら:Biochem.BiopHys.Res.Comm.166,1453−1459（19
90）］に言及しているにすぎない。CSF中のタンパク質T
auをモニターするために開発された試験により、平均し
てTau量は対照よりもAD患者において高くなるが、正常
な対照［モター（Motter,R.）ら:Ann.Neurol.38,643−6
48（1995）；ビゴ−ペルフリー（Vigo−Pelfrey,C.）
ら:Neurology 45,788−793（1995）］、および他の神経
学的疾患に罹患している対照［バンダーミーレン（Vand
ermeeren,M.）ら:J.Neurochem.61,1828−1834（199
3）］と大きく重なり合うことがわかった。
他のCSF診断マーカー、例えば、老人斑に関係するα
１−抗キモトリプシン［アブラハム（Abraham,C.R.）、
セルケ（Selkoe,D.J.）およびポター（Potter,H.）:Cel
l.52,487−501（1988）］およびユビキチン［ワン（Wan
g,G.P.）ら:Acta Neuropathol.（Berl.）82,6−12（199
1）］は、相反する結果およびADと対照の間の重なりの
ゆえに、不適当であると考えられ、また不適当であるこ
とがわかっている。これらの結果は期待にそむくだけで
なく、患者診断のためのCSFの常法によるサンプリング
は十分に容認されていないようである。しかし、市販の
診断試験がアテナ・ニューロサイエンス社（Athena Neu
roscience Inc.）により開発されており、これは、ヒト
染色体19上に多く位置しているアポリポタンパク質Ｅ
（ApoE）E4アレルと、CSF TauおよびＡβ1-42量を測定
することを組合せている。ApoEが老人斑に関係している
こと、およびApoE E4に対してホモ接合性である人はAD
を発症する可能性が高いことが確かめられている［サン
ダース（Sanders,A.M.）ら:Neurol.43,1467−1472（199
3）］。この組合せ分析は、医師がADを有する患者の可
能性を決定するのを助けることができると主張されてい
る［モター（Motter,R.）ら:Ann.Neurol.38,643−648
（1995）］。しかし、この試験は時間がかかり、可能性
の答えを与えるにすぎない。
１−抗キモトリプシン［アブラハム（Abraham,C.R.）、
セルケ（Selkoe,D.J.）およびポター（Potter,H.）:Cel
l.52,487−501（1988）］およびユビキチン［ワン（Wan
g,G.P.）ら:Acta Neuropathol.（Berl.）82,6−12（199
1）］は、相反する結果およびADと対照の間の重なりの
ゆえに、不適当であると考えられ、また不適当であるこ
とがわかっている。これらの結果は期待にそむくだけで
なく、患者診断のためのCSFの常法によるサンプリング
は十分に容認されていないようである。しかし、市販の
診断試験がアテナ・ニューロサイエンス社（Athena Neu
roscience Inc.）により開発されており、これは、ヒト
染色体19上に多く位置しているアポリポタンパク質Ｅ
（ApoE）E4アレルと、CSF TauおよびＡβ1-42量を測定
することを組合せている。ApoEが老人斑に関係している
こと、およびApoE E4に対してホモ接合性である人はAD
を発症する可能性が高いことが確かめられている［サン
ダース（Sanders,A.M.）ら:Neurol.43,1467−1472（199
3）］。この組合せ分析は、医師がADを有する患者の可
能性を決定するのを助けることができると主張されてい
る［モター（Motter,R.）ら:Ann.Neurol.38,643−648
（1995）］。しかし、この試験は時間がかかり、可能性
の答えを与えるにすぎない。
瞳孔反応を研究する最近の報告は、AD患者がアセチル
コリン遮断薬であるトロピカミドの希釈溶液に対して過
敏症を示すことを示唆している［シント（Scinto,L.
F.）ら:Science 266,1051−1054（1994）］。この過敏
症は、中年の人によりADに非常に類似した神経病理を例
外なく発症するダウン症候群の対象において初めて注目
された［オルソン（Olson,M.I.）およびシャウ（Shaw,
C.M.）:Brain 92,147−156（1969）］。この研究は見込
みがあるように見えるが、これらの結果は、反復するの
が容易ではなく、重なりおよび解釈の困難性（例えば、
目の疾患または色が試験において持つことがある作用）
に悩まされる［ルーぺ（Loupe,D.N.）ら:Opthalmology
103,495−503（1996）］。最も最近になって、１つの戦
略が開示されているが［パーシャド（Parshad,R.）ら:P
roc.Natl.Acad.Sci.USA 93,5246−5150（1996）］、こ
こでは、AD細胞を、そのDNA損傷の修復能力における欠
損の検出によって同定している。この試験は、ADの診断
を支持するのに、またはその可能性がないとするのに有
用でありうると結論された。しかし、この試験は労力を
要し、培養細胞とともに多工程を必要とするので、臨床
での実施にはなお遠い。最後に、陽電子放射断層写真法
を用いてAD患者の脳中のグルコース代謝の変動を検出で
きることが注目された［レイマン（Reiman,E.M.）:N.En
gl.J.Med.334,752−758（1996）］。この試験は、定型
で使用するのには実際的ではない。
コリン遮断薬であるトロピカミドの希釈溶液に対して過
敏症を示すことを示唆している［シント（Scinto,L.
F.）ら:Science 266,1051−1054（1994）］。この過敏
症は、中年の人によりADに非常に類似した神経病理を例
外なく発症するダウン症候群の対象において初めて注目
された［オルソン（Olson,M.I.）およびシャウ（Shaw,
C.M.）:Brain 92,147−156（1969）］。この研究は見込
みがあるように見えるが、これらの結果は、反復するの
が容易ではなく、重なりおよび解釈の困難性（例えば、
目の疾患または色が試験において持つことがある作用）
に悩まされる［ルーぺ（Loupe,D.N.）ら:Opthalmology
103,495−503（1996）］。最も最近になって、１つの戦
略が開示されているが［パーシャド（Parshad,R.）ら:P
roc.Natl.Acad.Sci.USA 93,5246−5150（1996）］、こ
こでは、AD細胞を、そのDNA損傷の修復能力における欠
損の検出によって同定している。この試験は、ADの診断
を支持するのに、またはその可能性がないとするのに有
用でありうると結論された。しかし、この試験は労力を
要し、培養細胞とともに多工程を必要とするので、臨床
での実施にはなお遠い。最後に、陽電子放射断層写真法
を用いてAD患者の脳中のグルコース代謝の変動を検出で
きることが注目された［レイマン（Reiman,E.M.）:N.En
gl.J.Med.334,752−758（1996）］。この試験は、定型
で使用するのには実際的ではない。
大きな興味がADの遺伝的原因に向けられ、いくつかの
遺伝子における突然変異が少数の家族性ADに感受性を与
えることが示された。染色体21上のAPP遺伝子［ミュレ
ル（Murrell,J.）ら:Science 254,97−99（1991）；お
よびカーリンスキー（Karlinsky,H.）:Neurology 42,14
45−1449（1992）］における突然変異は、常染色体支配
的な早期発症（＜65歳）ADと関係しており、プレセニリ
ン（presenilin）、染色体14に結合したS182［シェーレ
ンベルグ（Schellenberg,G.D.）ら:Science 258,668−6
71（1992）；ファン・ブレックホーベン（Van Broeckho
ven,C.）ら:Nature Genet 2,335−339（1992）；および
シェリングトン（Sherrington,R.）ら:Nature 375,754
−760（1995）］および染色体１に結合したSTM2［レビ
ー−ラハッド（Levy−Lahad,E.）ら:Science 269,973−
977（1995）；およびロガエフ（Rogaev,E.I.）ら:Natur
e 376,775−778（1995）］における突然変異は、少数の
家族性ADの症例に関係している。さらに、染色体19上に
見出されるApoE遺伝子のE4アレルは、晩期発症型ADが現
れる危険を変化させる［サンダース（Sanders,A.M.）
ら:Neurl.43,1467−1472（1993）；およびロガエフ（Ro
gaev,E.I.）ら:Nature 376,775−778（1995）］。これ
ら遺伝子の発見は、ADを発症する少数の個体の傾向を決
定するのに大きな価値を有するが、遺伝的評価はADの検
出またはモニターに有用ではないであろう。
遺伝子における突然変異が少数の家族性ADに感受性を与
えることが示された。染色体21上のAPP遺伝子［ミュレ
ル（Murrell,J.）ら:Science 254,97−99（1991）；お
よびカーリンスキー（Karlinsky,H.）:Neurology 42,14
45−1449（1992）］における突然変異は、常染色体支配
的な早期発症（＜65歳）ADと関係しており、プレセニリ
ン（presenilin）、染色体14に結合したS182［シェーレ
ンベルグ（Schellenberg,G.D.）ら:Science 258,668−6
71（1992）；ファン・ブレックホーベン（Van Broeckho
ven,C.）ら:Nature Genet 2,335−339（1992）；および
シェリングトン（Sherrington,R.）ら:Nature 375,754
−760（1995）］および染色体１に結合したSTM2［レビ
ー−ラハッド（Levy−Lahad,E.）ら:Science 269,973−
977（1995）；およびロガエフ（Rogaev,E.I.）ら:Natur
e 376,775−778（1995）］における突然変異は、少数の
家族性ADの症例に関係している。さらに、染色体19上に
見出されるApoE遺伝子のE4アレルは、晩期発症型ADが現
れる危険を変化させる［サンダース（Sanders,A.M.）
ら:Neurl.43,1467−1472（1993）；およびロガエフ（Ro
gaev,E.I.）ら:Nature 376,775−778（1995）］。これ
ら遺伝子の発見は、ADを発症する少数の個体の傾向を決
定するのに大きな価値を有するが、遺伝的評価はADの検
出またはモニターに有用ではないであろう。
メラノトランスフェリンとしても知られているp97抗
原がADに関係している［1994年１月20日にWO94/01463と
して公開されたPCT/CA93/00272］。p97は、トリ卵白由
来のオボトランスフェリン、ラクトフェリンおよび血清
トランスフェリン（Tf）を含む鉄結合タンパク質の重要
な群に属する［ベーカー（Baker,E.N.）、ランボール
（Rumball）ら:Trends Biochem.Sci.12,350−353（198
7）］。p97は鉄を結合することができ、細胞の鉄取込み
に関係している［ケナード（Kennard,M.L.）ら:EMBO J.
14,4178−4186（1995）］。p97には２つの形態が存在
し、その一方はグリコシル−ホスファチジルイノシトー
ルアンカーによって細胞表面に結合し、他方は活性に分
泌される［フッド（Food,M.R.）ら:J.Biol.Chem.269,30
34−3040（1994）］。最近の研究において、p97および
トランスフェリン受容体（TR）は、ヒト脳の毛細管内皮
に高度に局在化されていることがわかった。一方、トラ
ンスフェリン（Tf）それ自体は主にグリア細胞に局在化
されていることがわかった［ローテンベーガー（Rothen
berger,S.）ら:Brain Res.712,117−121（1996）］。ま
た、p97は、AD患者からの死後脳組織においてアミロイ
ド斑に関係した反応性小グリア細胞において特異的に発
現されることが示された［ジェフリーズ（Jefferies,W.
A.）ら:Brain Res.712,122−126（1996）］。老人性AD
斑に関係しない他の全ての小グリア細胞および他の神経
病（パーキンソン病、進行性核上性麻痺、ハンチントン
病および筋萎縮性側索硬化症）からの脳組織において見
出される小グリア細胞は、検出しうる量のp97を発現し
なかった。
原がADに関係している［1994年１月20日にWO94/01463と
して公開されたPCT/CA93/00272］。p97は、トリ卵白由
来のオボトランスフェリン、ラクトフェリンおよび血清
トランスフェリン（Tf）を含む鉄結合タンパク質の重要
な群に属する［ベーカー（Baker,E.N.）、ランボール
（Rumball）ら:Trends Biochem.Sci.12,350−353（198
7）］。p97は鉄を結合することができ、細胞の鉄取込み
に関係している［ケナード（Kennard,M.L.）ら:EMBO J.
14,4178−4186（1995）］。p97には２つの形態が存在
し、その一方はグリコシル−ホスファチジルイノシトー
ルアンカーによって細胞表面に結合し、他方は活性に分
泌される［フッド（Food,M.R.）ら:J.Biol.Chem.269,30
34−3040（1994）］。最近の研究において、p97および
トランスフェリン受容体（TR）は、ヒト脳の毛細管内皮
に高度に局在化されていることがわかった。一方、トラ
ンスフェリン（Tf）それ自体は主にグリア細胞に局在化
されていることがわかった［ローテンベーガー（Rothen
berger,S.）ら:Brain Res.712,117−121（1996）］。ま
た、p97は、AD患者からの死後脳組織においてアミロイ
ド斑に関係した反応性小グリア細胞において特異的に発
現されることが示された［ジェフリーズ（Jefferies,W.
A.）ら:Brain Res.712,122−126（1996）］。老人性AD
斑に関係しない他の全ての小グリア細胞および他の神経
病（パーキンソン病、進行性核上性麻痺、ハンチントン
病および筋萎縮性側索硬化症）からの脳組織において見
出される小グリア細胞は、検出しうる量のp97を発現し
なかった。
発明の要約 本発明者らは、健康な個体に比べてアルツハイマー患
者の血清および脳脊髄液（CSF）において、可溶性形態
の鉄結合タンパク質p97が有意に増加することを具体的
に示した。アルツハイマー患者からの試料中のp97量
は、健康な個体からの試料中のp97量と比較すると、首
尾一貫して高いと測定された。また本発明者らは、病気
期間が長くなるにつれて血清中のp97量が増加すること
を有意に示した。さらに、p97量は、ADの症状が観察さ
れるほぼ２年前に増加し始めるようであった。p97の特
異的な定量はこの病気に罹患している対象の同定を可能
にし、これを用いてこの病気の開始および長期の進行を
モニターすることができる。
者の血清および脳脊髄液（CSF）において、可溶性形態
の鉄結合タンパク質p97が有意に増加することを具体的
に示した。アルツハイマー患者からの試料中のp97量
は、健康な個体からの試料中のp97量と比較すると、首
尾一貫して高いと測定された。また本発明者らは、病気
期間が長くなるにつれて血清中のp97量が増加すること
を有意に示した。さらに、p97量は、ADの症状が観察さ
れるほぼ２年前に増加し始めるようであった。p97の特
異的な定量はこの病気に罹患している対象の同定を可能
にし、これを用いてこの病気の開始および長期の進行を
モニターすることができる。
これらの発見の結果として、本発明者らは、この病気
の評価および管理の両方において価値のある手段となる
体液中のADを検出するための簡単かつ信頼性ある試験を
設計した。本発明を用いるADの早期診断は、アルツハイ
マー患者の適切な看護のための計画を立てるより多くの
時間を家族に与え、アルツハイマーの症状に類似した症
状（例えば、うつ病または発作）の可能性を排除する。
本発明の方法を用いて、ADの新しい治療方法の効果をモ
ニターすることができる。ADの治療用に開発された多く
の薬物が存在するが、これら薬物の効果を調べる安価か
つ迅速な方法は存在しない。現在の臨床試験は、複雑か
つ労力のいる集中的な神経行動的評価によって効果を測
定しようとするものである。
の評価および管理の両方において価値のある手段となる
体液中のADを検出するための簡単かつ信頼性ある試験を
設計した。本発明を用いるADの早期診断は、アルツハイ
マー患者の適切な看護のための計画を立てるより多くの
時間を家族に与え、アルツハイマーの症状に類似した症
状（例えば、うつ病または発作）の可能性を排除する。
本発明の方法を用いて、ADの新しい治療方法の効果をモ
ニターすることができる。ADの治療用に開発された多く
の薬物が存在するが、これら薬物の効果を調べる安価か
つ迅速な方法は存在しない。現在の臨床試験は、複雑か
つ労力のいる集中的な神経行動的評価によって効果を測
定しようとするものである。
広く言うと、本発明は、患者からの体液試料中のp97
を定量することによってアルツハイマー病を診断する方
法であって、以下の工程： （ａ）アルツハイマー病に罹患していることが疑われる
患者から体液試料を採取することにより試験試料を得； （ｂ）試験試料中のp97の量を測定し；そして （ｃ）試験試料中のp97の量を、対照試料中のp97の量と
比較する； からなり、 対照試料中のp97の量と比較して増加している試験試料
中のp97の量の存在をアルツハイマー病の可能性の指標
とする方法に関する。
を定量することによってアルツハイマー病を診断する方
法であって、以下の工程： （ａ）アルツハイマー病に罹患していることが疑われる
患者から体液試料を採取することにより試験試料を得； （ｂ）試験試料中のp97の量を測定し；そして （ｃ）試験試料中のp97の量を、対照試料中のp97の量と
比較する； からなり、 対照試料中のp97の量と比較して増加している試験試料
中のp97の量の存在をアルツハイマー病の可能性の指標
とする方法に関する。
また本発明は、アルツハイマー病に罹患している患者
からの体液試料中のp97を定量することによってアルツ
ハイマー病の進行をモニターする方法であって、以下の
工程： （ａ）アルツハイマー病に罹患している患者から体液試
料を採取することにより試験試料を得； （ｂ）試験試料中のp97の量を測定し；そして （ｃ）試験試料中のp97の量を、先に患者から採取した
第１の試験試料中のp97の量と比較する； からなり、 第１の試験試料中のp97の量と比較して増加している試
験試料中のp97の量の存在を、患者のアルツハイマー病
の進行の指標とする方法に関する。
からの体液試料中のp97を定量することによってアルツ
ハイマー病の進行をモニターする方法であって、以下の
工程： （ａ）アルツハイマー病に罹患している患者から体液試
料を採取することにより試験試料を得； （ｂ）試験試料中のp97の量を測定し；そして （ｃ）試験試料中のp97の量を、先に患者から採取した
第１の試験試料中のp97の量と比較する； からなり、 第１の試験試料中のp97の量と比較して増加している試
験試料中のp97の量の存在を、患者のアルツハイマー病
の進行の指標とする方法に関する。
さらに本発明は、アルツハイマー病に罹患している患
者からの体液試料中のp97を定量することによってアル
ツハイマー病の治療をモニターする方法であって、以下
の工程： （ａ）アルツハイマー病の治療を受けている患者から体
液試料を採取することにより試験試料を得； （ｂ）試験試料中のp97の量を測定し；そして （ｃ）試験試料中のp97の量を、治療前に患者から採取
した治療前試料中のp97の量と比較する； からなり、 治療前試料中のp97の量と比較したときの試験試料中のp
97の量の差異を、治療効果の指標とする方法に関する。
者からの体液試料中のp97を定量することによってアル
ツハイマー病の治療をモニターする方法であって、以下
の工程： （ａ）アルツハイマー病の治療を受けている患者から体
液試料を採取することにより試験試料を得； （ｂ）試験試料中のp97の量を測定し；そして （ｃ）試験試料中のp97の量を、治療前に患者から採取
した治療前試料中のp97の量と比較する； からなり、 治療前試料中のp97の量と比較したときの試験試料中のp
97の量の差異を、治療効果の指標とする方法に関する。
また本発明は、試験試料中のp97の存在を検出する反
応物質およびp97の存在を検出するのに必要な全ての試
薬、および本発明の方法の実施に有用な適当な支持材を
含む、本発明の方法の実施に有用なキットをさらに意図
するものである。
応物質およびp97の存在を検出するのに必要な全ての試
薬、および本発明の方法の実施に有用な適当な支持材を
含む、本発明の方法の実施に有用なキットをさらに意図
するものである。
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の詳細な説明
および添付の図面を参照することによって明確になるで
あろう。さらに本明細書において、種々の特許文献およ
び出版物に言及が為されているが、これらの全てが本明
細書の一部を構成するものとする。
および添付の図面を参照することによって明確になるで
あろう。さらに本明細書において、種々の特許文献およ
び出版物に言及が為されているが、これらの全てが本明
細書の一部を構成するものとする。
図面の簡単な説明 図１は、p97標準の検量線である。
図２は、年齢に基づくアルツハイマー病患者と対照の
血清p97量の比較を示すグラフである。
血清p97量の比較を示すグラフである。
図３は、病気期間に基づくアルツハイマー病患者と対
照の血清p97量の比較を示すグラフである。
照の血清p97量の比較を示すグラフである。
図４は、年齢に基づくアルツハイマー病患者と対照の
血清トランスフェリン量の比較を示すグラフである。
血清トランスフェリン量の比較を示すグラフである。
図５は、AD対象および対照の血清p97濃度を、対象の
年齢で比較するグラフである。
年齢で比較するグラフである。
図６は、AD患者の血清p97濃度を、患者に初めてADの
症状が観察されてからの期間で比較するグラフである。
症状が観察されてからの期間で比較するグラフである。
図７は、AD対象および対照の血清トランスフェリン濃
度を、対象の年齢で比較するグラフである。
度を、対象の年齢で比較するグラフである。
図８は、ADおよび配偶者対照のペアーの血清p97濃度
の比を示す棒グラフである。
の比を示す棒グラフである。
発明の詳細な説明 本発明は、患者からの体液試料中のp97を定量するこ
とによって、患者のアルツハイマー病を診断およびモニ
ターするための方法を提供するものである。本方法は、
患者から体液試験試料を採取することを包含する。「患
者」なる用語は、アルツハイマー病に罹患しているか、
またはアルツハイマー病に罹患していることが疑われる
哺乳動物などの温血動物、好ましくはヒト個体を意味す
る。この患者は知覚損傷を示していても示していなくて
もよく、また、この患者はADの治療を受けていてもよ
い。広くは、本発明の診断方法を用いて、どのようなAD
症状をも示していない個体がADを発症する傾向または可
能性を有するか否かを測定する。
とによって、患者のアルツハイマー病を診断およびモニ
ターするための方法を提供するものである。本方法は、
患者から体液試験試料を採取することを包含する。「患
者」なる用語は、アルツハイマー病に罹患しているか、
またはアルツハイマー病に罹患していることが疑われる
哺乳動物などの温血動物、好ましくはヒト個体を意味す
る。この患者は知覚損傷を示していても示していなくて
もよく、また、この患者はADの治療を受けていてもよ
い。広くは、本発明の診断方法を用いて、どのようなAD
症状をも示していない個体がADを発症する傾向または可
能性を有するか否かを測定する。
試験試料は、例えば血清、リンパ、胆汁、痰または脳
脊髄液を含む種々の体液から採取することができる。ま
た、血球、好ましくは単球などの細胞試料を試験試料と
して用いることもできる。特に、p97を発現する活性化
されたマクロファージを検定することができる。好まし
くは、試験試料は血清またはCSFから、最も好ましくは
血清から得る。試験試料は既知の方法を用いて採取す
る。
脊髄液を含む種々の体液から採取することができる。ま
た、血球、好ましくは単球などの細胞試料を試験試料と
して用いることもできる。特に、p97を発現する活性化
されたマクロファージを検定することができる。好まし
くは、試験試料は血清またはCSFから、最も好ましくは
血清から得る。試験試料は既知の方法を用いて採取す
る。
特に好ましい態様においては、血清試料を患者から採
取する。試料は使用前に保存および凍結（例えば、−80
℃で）することができ、そのままおよび／または希釈し
て、例えばパンデックス（Pandex）緩衝液（0.1％NaH3
および1.0％w/v BSAを含むDNEM）中の50％v/vウシ胎児
血清（FCA）で希釈して用いることができる。
取する。試料は使用前に保存および凍結（例えば、−80
℃で）することができ、そのままおよび／または希釈し
て、例えばパンデックス（Pandex）緩衝液（0.1％NaH3
および1.0％w/v BSAを含むDNEM）中の50％v/vウシ胎児
血清（FCA）で希釈して用いることができる。
試験試料におけるp97の定量を可能にする反応物質を
用いて試験試料においてp97を定量する。この反応物質
は、試験試料中のp97を認識および結合するものである
のが好ましい。本発明の態様においては、この反応物質
は抗体である。
用いて試験試料においてp97を定量する。この反応物質
は、試験試料中のp97を認識および結合するものである
のが好ましい。本発明の態様においては、この反応物質
は抗体である。
本明細書において用いる「抗体」なる用語には、ポリ
クローナルおよびモノクローナル抗体;p97と反応する１
を越える抗体の混合物（例えば、p97と反応する別種モ
ノクローナル抗体のカクテル）；全抗体；その生物学的
に機能的なフラグメント（この抗体フラグメントはp97
に十分に結合する）；および１を越える種からの部分を
含むキメラ抗体；二官能性の抗体；および４量体化抗体
が含まれる。
クローナルおよびモノクローナル抗体;p97と反応する１
を越える抗体の混合物（例えば、p97と反応する別種モ
ノクローナル抗体のカクテル）；全抗体；その生物学的
に機能的なフラグメント（この抗体フラグメントはp97
に十分に結合する）；および１を越える種からの部分を
含むキメラ抗体；二官能性の抗体；および４量体化抗体
が含まれる。
通常の方法を用いて抗体を調製することができる。例
えば、p97のペプチドを用い、常法を用いて、ポリクロ
ーナル抗血清またはモノクローナル抗体を作成すること
ができる。哺乳動物において抗体反応を誘導する免疫原
形態のペプチドを用いて、哺乳動物（例えば、マウス、
ハムスターまたはウサギ）を免疫することができる。ペ
プチドに免疫原性を付与するための方法には、キャリア
ーへのコンジュゲート化または当分野で周知の他の方法
が含まれる。例えば、アジュバントの存在下にペプチド
を投与することができる。血漿または血清中の抗体力価
の検出によって、免疫化の進行をモニターすることがで
きる。通常のELISAまたは他の免疫検定法を抗原として
の免疫原とともに用いて、抗体量を評価することができ
る。免疫化の後に、抗血清を得ることができ、所望によ
り、血清からポリクローナル抗体を単離することができ
る。
えば、p97のペプチドを用い、常法を用いて、ポリクロ
ーナル抗血清またはモノクローナル抗体を作成すること
ができる。哺乳動物において抗体反応を誘導する免疫原
形態のペプチドを用いて、哺乳動物（例えば、マウス、
ハムスターまたはウサギ）を免疫することができる。ペ
プチドに免疫原性を付与するための方法には、キャリア
ーへのコンジュゲート化または当分野で周知の他の方法
が含まれる。例えば、アジュバントの存在下にペプチド
を投与することができる。血漿または血清中の抗体力価
の検出によって、免疫化の進行をモニターすることがで
きる。通常のELISAまたは他の免疫検定法を抗原として
の免疫原とともに用いて、抗体量を評価することができ
る。免疫化の後に、抗血清を得ることができ、所望によ
り、血清からポリクローナル抗体を単離することができ
る。
モノクローナル抗体を調製するためには、抗体産生細
胞（リンパ球）を免疫化動物から集め、通常の体細胞融
合法によってミエローマ細胞と融合させ、このようにし
てこれら細胞を永続性にし、ハイブリドーマ細胞を得る
ことができる。このような方法は当分野で周知である
［例えば、コーラー（Kohler）およびミルスタイン（Mi
lstein）:Nature 256,495−497（1975）によって最初に
開発されたハイブリドーマ法］。また、他の方法、例え
ばヒトＢ細胞ハイブリドーマ法［コズボー（Kozbor）
ら:Immunol.Today 4,72（1983）］、ヒトモノクローナ
ル抗体を調製するためのEBV−ハイブリドーマ法［コー
ル（Cole）ら：癌治療におけるモノクローナル抗体（19
85）、アレン・アール・ブリス社（Allen R.Bliss,In
c.）、77−96頁］、および組合せ抗体ライブラリーのス
クリーニング［ヒューズ（Huse）ら:Science 246,1275
（1989）］も周知である。p97と特異的に反応する抗体
を調製するためにハイブリドーマ細胞を免疫化学的にス
クリーニングすることができ、モノクローナル抗体を単
離することができる。
胞（リンパ球）を免疫化動物から集め、通常の体細胞融
合法によってミエローマ細胞と融合させ、このようにし
てこれら細胞を永続性にし、ハイブリドーマ細胞を得る
ことができる。このような方法は当分野で周知である
［例えば、コーラー（Kohler）およびミルスタイン（Mi
lstein）:Nature 256,495−497（1975）によって最初に
開発されたハイブリドーマ法］。また、他の方法、例え
ばヒトＢ細胞ハイブリドーマ法［コズボー（Kozbor）
ら:Immunol.Today 4,72（1983）］、ヒトモノクローナ
ル抗体を調製するためのEBV−ハイブリドーマ法［コー
ル（Cole）ら：癌治療におけるモノクローナル抗体（19
85）、アレン・アール・ブリス社（Allen R.Bliss,In
c.）、77−96頁］、および組合せ抗体ライブラリーのス
クリーニング［ヒューズ（Huse）ら:Science 246,1275
（1989）］も周知である。p97と特異的に反応する抗体
を調製するためにハイブリドーマ細胞を免疫化学的にス
クリーニングすることができ、モノクローナル抗体を単
離することができる。
別法によれば、SCID−huマウス、例えばジェンファー
ム（Genpharm）によって開発されたモデルを用いて、p9
7と反応する抗体またはそのフラグメントを調製するこ
とができる。
ム（Genpharm）によって開発されたモデルを用いて、p9
7と反応する抗体またはそのフラグメントを調製するこ
とができる。
また、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション（American Type Culture Collection）などの
寄託機関または実験室を含む種々の供給元から抗体を入
手することもできる。例えば、抗p97マウスモノクロー
ナル抗体HybC（33B6E4）は、シュエン−クエイ・リアオ
（Shuen−Kuei Liao）博士［マクマスター大学（McMast
er University,Hamilton,ON］から入手することがで
き、抗p97モノクローナル抗体9B6は、バイオテクノロジ
ー・ラボラトリー（Biotechnology Laboratory）［UBC,
BC,カナダ］から入手することができ、抗p97マウスモノ
クローナル抗体L235は、アメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクションから入手することができる［ATCC−HB
8446 L235（Ｈ−19）］。
クション（American Type Culture Collection）などの
寄託機関または実験室を含む種々の供給元から抗体を入
手することもできる。例えば、抗p97マウスモノクロー
ナル抗体HybC（33B6E4）は、シュエン−クエイ・リアオ
（Shuen−Kuei Liao）博士［マクマスター大学（McMast
er University,Hamilton,ON］から入手することがで
き、抗p97モノクローナル抗体9B6は、バイオテクノロジ
ー・ラボラトリー（Biotechnology Laboratory）［UBC,
BC,カナダ］から入手することができ、抗p97マウスモノ
クローナル抗体L235は、アメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクションから入手することができる［ATCC−HB
8446 L235（Ｈ−19）］。
試験試料中のp97を認識および結合し、試料中のその
存在の定量を可能にする種々の他の反応物質を、本発明
の方法において使用することができる。例えば、トラン
スフェリン受容体がp97に結合し、これを用いて試験試
料中のp97を定量することができる。さらに、p97は鉄お
よび他の金属に結合し、これを用いて通常の方法で試験
試料中のp97を定量することができる［鉄結合検定を記
載する1994年１月20日にWO94/01463として公開されたPC
T/CA93/00272を参照］。
存在の定量を可能にする種々の他の反応物質を、本発明
の方法において使用することができる。例えば、トラン
スフェリン受容体がp97に結合し、これを用いて試験試
料中のp97を定量することができる。さらに、p97は鉄お
よび他の金属に結合し、これを用いて通常の方法で試験
試料中のp97を定量することができる［鉄結合検定を記
載する1994年１月20日にWO94/01463として公開されたPC
T/CA93/00272を参照］。
本発明の方法において用いる反応物質を、検出可能な
物質を用いて検出可能にラベルすることができるか、ま
たはこれらを後に検出可能にラベルすることができる。
検出可能な物質の例には、種々の酵素、蛍光物質、発光
物質および放射活性物質が含まれる。適当な酵素の例に
は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ビオチン、アルカリ
ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチル
コリンエステラーゼが含まれ、適当な蛍光物質の例に
は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセイ
ンイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジ
ニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフ
ィコエリスリンが含まれ、発光物質の例には、ルミノー
ルが含まれ、適当な放射活性物質の例には、放射活性ヨ
ウ素I125、I131、または三重水素が含まれる。
物質を用いて検出可能にラベルすることができるか、ま
たはこれらを後に検出可能にラベルすることができる。
検出可能な物質の例には、種々の酵素、蛍光物質、発光
物質および放射活性物質が含まれる。適当な酵素の例に
は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ビオチン、アルカリ
ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチル
コリンエステラーゼが含まれ、適当な蛍光物質の例に
は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセイ
ンイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジ
ニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフ
ィコエリスリンが含まれ、発光物質の例には、ルミノー
ルが含まれ、適当な放射活性物質の例には、放射活性ヨ
ウ素I125、I131、または三重水素が含まれる。
本発明の方法において用いる反応物質を、例えば、こ
の反応物質を認識および結合する物質を用いて、後に検
出可能にラベルすることができる。例示すると、反応物
質が抗体（例えば、マウスIgG抗体）であるときには、
この反応物質に反応性である第２の抗体（例えば、ウサ
ギ抗マウスγ−グロブリン；これを本明細書中に記載し
たような検出可能な物質でラベルする）を用いて該反応
物質を検出することができ、これによりp97の定量が可
能になる。
の反応物質を認識および結合する物質を用いて、後に検
出可能にラベルすることができる。例示すると、反応物
質が抗体（例えば、マウスIgG抗体）であるときには、
この反応物質に反応性である第２の抗体（例えば、ウサ
ギ抗マウスγ−グロブリン；これを本明細書中に記載し
たような検出可能な物質でラベルする）を用いて該反応
物質を検出することができ、これによりp97の定量が可
能になる。
抗体である反応物質を用いて、p97の抗原決定基と抗
体の間の結合相互作用に依存する既知の免疫検定におい
て、p97を検出および定量することができる。このよう
な検定の例は、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッ
セイ（例えば、ELISA）、免疫蛍光法、免疫沈降法、ラ
テックス凝集法、血球凝集法、対向流免疫電気泳動法
（CIEP）、放射免疫沈降法、ドット・ブロット検定法、
阻害または競合検定法およびサンドイッチ検定法であ
る。
体の間の結合相互作用に依存する既知の免疫検定におい
て、p97を検出および定量することができる。このよう
な検定の例は、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッ
セイ（例えば、ELISA）、免疫蛍光法、免疫沈降法、ラ
テックス凝集法、血球凝集法、対向流免疫電気泳動法
（CIEP）、放射免疫沈降法、ドット・ブロット検定法、
阻害または競合検定法およびサンドイッチ検定法であ
る。
好ましい態様においては、迅速な免疫蛍光法［例え
ば、ジョリー（Jolley）ら［J.Immunol.Meth.67,21−3
5］に記載されている「粒子濃縮蛍光免疫検定法」（PCF
IA）］に基づく検定を用いて試料中のp97量を測定また
は定量する。この方法は、ミクロン以下のポリスチレン
ビーズに結合させた捕捉抗体（Ab）を用いる。この「活
性化された」固相は、所望のタンパク質の特異的な吸収
性物質として作用する。次いで、蛍光ラベルされた第２
のAb（これもタンパク質に対して特異的である）を固体
の捕捉相とともにインキュベートして、蛍光シグナルが
元のタンパク質濃度に比例する複合体を形成させる。こ
の反応は、特別に設計された96ウエルのプレート［カタ
ログ22−400−1;インデックス・ラボラトリーズ社（Ind
exx Laboratories Inc.,Wesbrook,ME）］において行う
ことができる。それぞれのウエルは0.22μｍの酢酸セル
ロース膜を持ち、これが真空下でのウエルの排出を可能
にし、各ウエルの基部における蛍光複合体の濃縮を可能
にする。このプレートを洗浄し、パンデックス（Pande
x）蛍光濃度分析器（FCA;Indexx）を用いて種々の波長
で各ウエルの蛍光を読み取ることができる。
ば、ジョリー（Jolley）ら［J.Immunol.Meth.67,21−3
5］に記載されている「粒子濃縮蛍光免疫検定法」（PCF
IA）］に基づく検定を用いて試料中のp97量を測定また
は定量する。この方法は、ミクロン以下のポリスチレン
ビーズに結合させた捕捉抗体（Ab）を用いる。この「活
性化された」固相は、所望のタンパク質の特異的な吸収
性物質として作用する。次いで、蛍光ラベルされた第２
のAb（これもタンパク質に対して特異的である）を固体
の捕捉相とともにインキュベートして、蛍光シグナルが
元のタンパク質濃度に比例する複合体を形成させる。こ
の反応は、特別に設計された96ウエルのプレート［カタ
ログ22−400−1;インデックス・ラボラトリーズ社（Ind
exx Laboratories Inc.,Wesbrook,ME）］において行う
ことができる。それぞれのウエルは0.22μｍの酢酸セル
ロース膜を持ち、これが真空下でのウエルの排出を可能
にし、各ウエルの基部における蛍光複合体の濃縮を可能
にする。このプレートを洗浄し、パンデックス（Pande
x）蛍光濃度分析器（FCA;Indexx）を用いて種々の波長
で各ウエルの蛍光を読み取ることができる。
この検定に用いる活性化されたビーズは、抗p97抗体
を用いてカルボキシポリスチレン粒子（0.77μｍ、0.25
％v/v;Indexx）を被覆することによって調製することが
できる。適当な抗p97抗体には、抗p97マウスモノクロー
ナル抗体HybC［33B6E4;シュエン−クエイ・リアオ博
士、マクマスター大学（McMaster University,Hamilto
n,ON）］、9B6［ウィルフ・ジェフリーズ（Wilf Jeffer
ies）博士、バイオテクノロジー・ラボラトリー（Biote
chnology Laboratory,UBC,BC）］、または抗p97ウサギ
抗血清［ウィルフ・ジェフリーズ博士、バイオテクノロ
ジー・ラボラトリー］が含まれる。
を用いてカルボキシポリスチレン粒子（0.77μｍ、0.25
％v/v;Indexx）を被覆することによって調製することが
できる。適当な抗p97抗体には、抗p97マウスモノクロー
ナル抗体HybC［33B6E4;シュエン−クエイ・リアオ博
士、マクマスター大学（McMaster University,Hamilto
n,ON）］、9B6［ウィルフ・ジェフリーズ（Wilf Jeffer
ies）博士、バイオテクノロジー・ラボラトリー（Biote
chnology Laboratory,UBC,BC）］、または抗p97ウサギ
抗血清［ウィルフ・ジェフリーズ博士、バイオテクノロ
ジー・ラボラトリー］が含まれる。
蛍光ラベルされた第２の抗体は、フルオレセインイソ
チオシアネート（FITC）でフルオレセイン処理した抗p9
7マウスモノクローナル抗体L235［ATCC−HB8446 L235
（Ｈ−19）］または抗p97ウサギ抗血清［ウィルフ・ジ
ェフリーズ博士、バイオテクノロジー・ラボラトリー］
を用いて調製することができる。
チオシアネート（FITC）でフルオレセイン処理した抗p9
7マウスモノクローナル抗体L235［ATCC−HB8446 L235
（Ｈ−19）］または抗p97ウサギ抗血清［ウィルフ・ジ
ェフリーズ博士、バイオテクノロジー・ラボラトリー］
を用いて調製することができる。
p97標準はp97から、例えば、免疫アフィニティークロ
マトグラフィーによって、ホスファチジルイノシトール
ホスホリパーゼＣ（PI−PLC）処理したチャイニーズ・
ハムスター卵巣（CHO）細胞（ヒトp97によってトランス
フェクションした）の上清から精製したp97から調製す
ることができる。
マトグラフィーによって、ホスファチジルイノシトール
ホスホリパーゼＣ（PI−PLC）処理したチャイニーズ・
ハムスター卵巣（CHO）細胞（ヒトp97によってトランス
フェクションした）の上清から精製したp97から調製す
ることができる。
特に好ましい態様においては、血清p97検定を特別の9
6ウエルプレート（22−401−1;Indexx）において行い、
蛍光をFCA（Indexx）において読み取る。50％FCA溶液で
適切に希釈した血清試料（60μｌ）を、96ウエルプレー
トのウエルに添加してよい。p97標準を、検量線作成の
ために使用することができる。実例の検量線作成を表１
に示し、検量線を図１に示す。
6ウエルプレート（22−401−1;Indexx）において行い、
蛍光をFCA（Indexx）において読み取る。50％FCA溶液で
適切に希釈した血清試料（60μｌ）を、96ウエルプレー
トのウエルに添加してよい。p97標準を、検量線作成の
ために使用することができる。実例の検量線作成を表１
に示し、検量線を図１に示す。
本発明者らは、アルツハイマー病の症状が観察される
約２年前にp97量が増加し始めることを見出した。従っ
て、本発明の方法を用いて、アルツハイマー病の臨床的
に明確な症状を持たない患者において、アルツハイマー
病またはアルツハイマー病を発症する可能性を診断する
ことができ、これによって、この病気を早期に予想する
ことができる。アルツハイマー病を診断するために、患
者の試料中のp97の濃度を、健康な対象からの対照試料
中のp97の濃度範囲（予期および／または回顧の統計学
的研究により確かめることができる）と比較することが
できる。健康な対象は、NINCDS−ADRDA基準および／ま
たはMMS試験の結果に基づいて選択することができる。
健康な対象は、臨床的に明らかな知覚損傷または他の臨
床的もしくは病理学的な問題を持たないのが好ましい。
また、同一の患者について以前に定量された量と比較し
てp97量の増加を見出すことによって、診断を行うこと
もできる。
約２年前にp97量が増加し始めることを見出した。従っ
て、本発明の方法を用いて、アルツハイマー病の臨床的
に明確な症状を持たない患者において、アルツハイマー
病またはアルツハイマー病を発症する可能性を診断する
ことができ、これによって、この病気を早期に予想する
ことができる。アルツハイマー病を診断するために、患
者の試料中のp97の濃度を、健康な対象からの対照試料
中のp97の濃度範囲（予期および／または回顧の統計学
的研究により確かめることができる）と比較することが
できる。健康な対象は、NINCDS−ADRDA基準および／ま
たはMMS試験の結果に基づいて選択することができる。
健康な対象は、臨床的に明らかな知覚損傷または他の臨
床的もしくは病理学的な問題を持たないのが好ましい。
また、同一の患者について以前に定量された量と比較し
てp97量の増加を見出すことによって、診断を行うこと
もできる。
対照と比較したときの試験試料中のp97量の増加は、
患者がアルツハイマー病に罹患しているかまたはアルツ
ハイマー病を発症する可能性を有することを示すもので
ある。例示すると、代表数の対照の血清中のp97量を測
定し、平均p97量を求めるか、またはp97量を図５に示す
ように対象の年齢に対してプロットし、回帰線またはベ
ースライン（図５において）を対照に対して設定する。
この平均またはベースラインを越えるp97量を含む試験
試料は、アルツハイマー病またはアルツハイマー病の可
能性の指標である。一般に、対照の血清中のp97量の1.5
倍またはそれ以上、特に２倍またはそれ以上、好ましく
は２〜９倍に増加しているアルツハイマー病患者からの
試料中のp97量が、アルツハイマー病の可能性の指標で
ある。
患者がアルツハイマー病に罹患しているかまたはアルツ
ハイマー病を発症する可能性を有することを示すもので
ある。例示すると、代表数の対照の血清中のp97量を測
定し、平均p97量を求めるか、またはp97量を図５に示す
ように対象の年齢に対してプロットし、回帰線またはベ
ースライン（図５において）を対照に対して設定する。
この平均またはベースラインを越えるp97量を含む試験
試料は、アルツハイマー病またはアルツハイマー病の可
能性の指標である。一般に、対照の血清中のp97量の1.5
倍またはそれ以上、特に２倍またはそれ以上、好ましく
は２〜９倍に増加しているアルツハイマー病患者からの
試料中のp97量が、アルツハイマー病の可能性の指標で
ある。
血清中のp97量は、病気の進行とともに増加すること
がわかった（図３および図６を参照）。従って、患者に
おけるアルツハイマー病の進行をモニターするために、
患者からの試料中のp97の濃度を、本明細書中に記載し
たように、同一患者からの以前の試料のp97量と比較す
ることができる。また、試験試料におけるp97量を、本
明細書中に記載したように、対照から得た量または他の
アルツハイマー病患者から得た量と比較することによっ
て、この病気の段階の進行および評価を調べることがで
きる。この後者の比較は、体液試料中のp97量とこの病
気の進行の間の直線的な関係に基づいている。例示する
と、患者からの試料中のp97量を定量し、標準曲線（例
えば、図６に示すグラフ）から推定することによって、
患者における病気の段階を測定することができる。
がわかった（図３および図６を参照）。従って、患者に
おけるアルツハイマー病の進行をモニターするために、
患者からの試料中のp97の濃度を、本明細書中に記載し
たように、同一患者からの以前の試料のp97量と比較す
ることができる。また、試験試料におけるp97量を、本
明細書中に記載したように、対照から得た量または他の
アルツハイマー病患者から得た量と比較することによっ
て、この病気の段階の進行および評価を調べることがで
きる。この後者の比較は、体液試料中のp97量とこの病
気の進行の間の直線的な関係に基づいている。例示する
と、患者からの試料中のp97量を定量し、標準曲線（例
えば、図６に示すグラフ）から推定することによって、
患者における病気の段階を測定することができる。
また、本発明の方法を用いて、アルツハイマー病の治
療の効果を患者においてモニターまたは評価することが
できる。試料を治療前、治療中および／または治療後に
採取し、試料中のp97の濃度に及ぼす治療の影響によっ
て治療効果を測定することができる。有効な治療は、対
照に比べて試料中のp97の量を低下させる結果を与える
治療であると予想される。
療の効果を患者においてモニターまたは評価することが
できる。試料を治療前、治療中および／または治療後に
採取し、試料中のp97の濃度に及ぼす治療の影響によっ
て治療効果を測定することができる。有効な治療は、対
照に比べて試料中のp97の量を低下させる結果を与える
治療であると予想される。
アルツハイマー病のあらゆる種類の治療の効果、特に
アルツハイマー病の治療において効果を有すると推定さ
れる医薬組成物の使用の効果をモニターするために本方
法を用いることが意図されている。アルツハイマー病の
治療にある種の効果を有する医薬組成物の例には、コリ
ン作動性の機能を回復または置換する物質、例えば、タ
クリン、コリン、レシチン、フペルジン（huperzine）
ＡおよびＢ、ガランタミン（galanthamine）、メタンス
ルホニルフルオリド、フィゾスチグミンおよびデプレニ
ル（deprenyl）が含まれる。
アルツハイマー病の治療において効果を有すると推定さ
れる医薬組成物の使用の効果をモニターするために本方
法を用いることが意図されている。アルツハイマー病の
治療にある種の効果を有する医薬組成物の例には、コリ
ン作動性の機能を回復または置換する物質、例えば、タ
クリン、コリン、レシチン、フペルジン（huperzine）
ＡおよびＢ、ガランタミン（galanthamine）、メタンス
ルホニルフルオリド、フィゾスチグミンおよびデプレニ
ル（deprenyl）が含まれる。
本発明の方法を適用してp97を定量するのに適する試
薬を、通常のキットにパックして必要な原材料を適当な
容器中にパックすることができる。例えば、このような
キットは、p97と反応する抗体、および本明細書中に記
載した方法により試料中に存在するp97と結合した抗体
を定量するための必要な試薬を含むことができる。ま
た、このキットは、本発明の方法を実施するのに有用な
適当な支持体を含んでいてもよい。
薬を、通常のキットにパックして必要な原材料を適当な
容器中にパックすることができる。例えば、このような
キットは、p97と反応する抗体、および本明細書中に記
載した方法により試料中に存在するp97と結合した抗体
を定量するための必要な試薬を含むことができる。ま
た、このキットは、本発明の方法を実施するのに有用な
適当な支持体を含んでいてもよい。
実施例 以下に挙げる実施例は、本発明者らが行ったアルツハ
イマー病患者および対照の試料中のp97の定量ならびに
このような定量の意味を説明するものである。これら実
施例は例示の目的で挙げたものであり、限定のためのも
のではない。
イマー病患者および対照の試料中のp97の定量ならびに
このような定量の意味を説明するものである。これら実
施例は例示の目的で挙げたものであり、限定のためのも
のではない。
実施例１ アルツハイマー患者の血清中のp97量に関す
る研究 ヒト血清中のp97量を測定するための検定を、1984年
に紹介された迅速免疫蛍光法「粒子濃縮蛍光イムノアッ
セイ（PCFIA）」［ジョリー（Jolley）ら:J.Immunol.Me
th.67,21−35（1984）］に基づいて開発した。この方法
は、ミクロン以下のポリスチレンビーズに結合させた捕
捉抗体（Ab）を用いる。この「活性化された」固相は、
所望のタンパク質の特異的な吸収物質として作用する。
次いで、蛍光ラベルした第２のAb（これもタンパク質に
対して特異的である）を固体の捕捉相とともにインキュ
ベートして、蛍光シグナルが元のタンパク質濃度に比例
する複合体を形成させた。反応は、特別に設計された96
ウエルプレート［カタログ22−400−1;インデックス・
ラボラトリーズ社］において行った。それぞれのウエル
は0.22μｍの酢酸セルロース膜を持ち、これが真空下で
のウエルの排出を可能にし、各ウエルの基部に蛍光複合
体を濃縮させた。次いで、これらプレートを洗浄し、各
ウエルの蛍光をパンデックス（Pandex）蛍光濃度分析器
（FCA;インデックス社）を用いて種々の波長で読み取っ
た。
る研究 ヒト血清中のp97量を測定するための検定を、1984年
に紹介された迅速免疫蛍光法「粒子濃縮蛍光イムノアッ
セイ（PCFIA）」［ジョリー（Jolley）ら:J.Immunol.Me
th.67,21−35（1984）］に基づいて開発した。この方法
は、ミクロン以下のポリスチレンビーズに結合させた捕
捉抗体（Ab）を用いる。この「活性化された」固相は、
所望のタンパク質の特異的な吸収物質として作用する。
次いで、蛍光ラベルした第２のAb（これもタンパク質に
対して特異的である）を固体の捕捉相とともにインキュ
ベートして、蛍光シグナルが元のタンパク質濃度に比例
する複合体を形成させた。反応は、特別に設計された96
ウエルプレート［カタログ22−400−1;インデックス・
ラボラトリーズ社］において行った。それぞれのウエル
は0.22μｍの酢酸セルロース膜を持ち、これが真空下で
のウエルの排出を可能にし、各ウエルの基部に蛍光複合
体を濃縮させた。次いで、これらプレートを洗浄し、各
ウエルの蛍光をパンデックス（Pandex）蛍光濃度分析器
（FCA;インデックス社）を用いて種々の波長で読み取っ
た。
この検定に用いる活性化されたビーズは、以下の抗
体、即ち、抗p97マウスモノクローナル抗体HybC［33B6E
4;シュエン−クエイ・リアオ博士、マクマスター大
学］、9B6［ウィルフ・ジェフリーズ博士、バイオテク
ノロジー・ラボラトリー］、または抗p97ウサギ抗血清
［ウィルフ・ジェフリーズ博士、バイオテクノロジー・
ラボラトリー］を用いてカルボキシポリスチレン粒子
（0.77μｍ、0.25％v/v;インデックス社）を被覆するこ
とによって調製した。粒子（1ml）を１分間撹拌および
音波処理し、これを遠心し、0.1M MES［２−（４−モル
ホリノ）エタンスルホン酸］緩衝液（pH4.5）（8ml）に
再懸濁した。これに、EDC［１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミド］（5.0mg）を
加え、次いで1mg/mlの抗体（1ml）を加えた。混合物を
定期的に撹拌し、室温で一晩インキュベートし、6000rp
mで10分間遠心し［ソーバル（Sorval）HB4］、ビーズ
を、0.2％アジ化ナトリウム（NaN3）および２％w/vウシ
血清アルブミン（BSA）を含むリン酸緩衝食塩水（PBS）
（20ml）に再懸濁した。次いで、ビーズを6000rpmで10
分間遠心し、被覆されたビーズを、0.2％NaN3および２
％BSAを含むPBS（32ml）中、４℃で保存した。
体、即ち、抗p97マウスモノクローナル抗体HybC［33B6E
4;シュエン−クエイ・リアオ博士、マクマスター大
学］、9B6［ウィルフ・ジェフリーズ博士、バイオテク
ノロジー・ラボラトリー］、または抗p97ウサギ抗血清
［ウィルフ・ジェフリーズ博士、バイオテクノロジー・
ラボラトリー］を用いてカルボキシポリスチレン粒子
（0.77μｍ、0.25％v/v;インデックス社）を被覆するこ
とによって調製した。粒子（1ml）を１分間撹拌および
音波処理し、これを遠心し、0.1M MES［２−（４−モル
ホリノ）エタンスルホン酸］緩衝液（pH4.5）（8ml）に
再懸濁した。これに、EDC［１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミド］（5.0mg）を
加え、次いで1mg/mlの抗体（1ml）を加えた。混合物を
定期的に撹拌し、室温で一晩インキュベートし、6000rp
mで10分間遠心し［ソーバル（Sorval）HB4］、ビーズ
を、0.2％アジ化ナトリウム（NaN3）および２％w/vウシ
血清アルブミン（BSA）を含むリン酸緩衝食塩水（PBS）
（20ml）に再懸濁した。次いで、ビーズを6000rpmで10
分間遠心し、被覆されたビーズを、0.2％NaN3および２
％BSAを含むPBS（32ml）中、４℃で保存した。
蛍光ラベルされた第２の抗体は、フルオレセインイソ
チオシアネート（FITC）でフルオレセイン処理した抗p9
7マウスモノクローナル抗体L235［ATCC−HB8446 L235
（Ｈ−19）］または抗p97ウサギ抗血清［ウィルフ・ジ
ェフリーズ博士、バイオテクノロジー・ラボラトリー］
を用いて、以下のように調製した。FITCを、1mg/mlでリ
ン酸緩衝液（pH9.5）（0.15M Na2HPO4）に加えた。アジ
ドの非存在下に、4mg/mlの抗体（0.5ml）をFITC溶液（1
mg/mlのFITC溶液0.15ml）に加え、室温で一晩、暗所で
インキュベートした。フルオレセイン処理したAbをすぐ
使えるように調製し、４℃で保存した。
チオシアネート（FITC）でフルオレセイン処理した抗p9
7マウスモノクローナル抗体L235［ATCC−HB8446 L235
（Ｈ−19）］または抗p97ウサギ抗血清［ウィルフ・ジ
ェフリーズ博士、バイオテクノロジー・ラボラトリー］
を用いて、以下のように調製した。FITCを、1mg/mlでリ
ン酸緩衝液（pH9.5）（0.15M Na2HPO4）に加えた。アジ
ドの非存在下に、4mg/mlの抗体（0.5ml）をFITC溶液（1
mg/mlのFITC溶液0.15ml）に加え、室温で一晩、暗所で
インキュベートした。フルオレセイン処理したAbをすぐ
使えるように調製し、４℃で保存した。
p97標準は、ホスファチジルイノシトールホスホリパ
ーゼＣ（PI−PLC）処理したチャイニーズ・ハムスター
卵巣（CHO）細胞（ヒトp97によってトランスフェクショ
ンした）の上清から免疫アフィニティークロマトグラフ
ィーによって精製したp97から調製した。約109個のトラ
ンスフェクションしたCHO細胞を、37℃で１時間、PBS中
の300mU/mu PI−PLC（1ml）で処理した。遠心によって
細胞から上清を回収し、0.2μｍの膜で濾過した。次い
で、この上清を、アフィゲル（Affi−Gel）10［バイオ
−ラッド（Bio−Rad,Mississauga,ONT）］上に固定した
Ab（HybC）のカラム（１×10）にかけた。このカラム
は、予めpH7.2のPBSで洗浄し、再生しておいた。結合し
たp97を、0.1Mクエン酸（pH3.0）で溶離し、次いで1Mト
リス−HCl（pH9.0）を用いて中和した。精製したp97
を、30,000Mwの限外濾過膜を用いて濃縮した。PBSに対
して透析し、滅菌濾過した。標準p97の濃度を、280nmで
１％＝12.0cm-1のp97の吸光係数を用いて測定した［ベ
ーカー（Baker）ら、1992］。
ーゼＣ（PI−PLC）処理したチャイニーズ・ハムスター
卵巣（CHO）細胞（ヒトp97によってトランスフェクショ
ンした）の上清から免疫アフィニティークロマトグラフ
ィーによって精製したp97から調製した。約109個のトラ
ンスフェクションしたCHO細胞を、37℃で１時間、PBS中
の300mU/mu PI−PLC（1ml）で処理した。遠心によって
細胞から上清を回収し、0.2μｍの膜で濾過した。次い
で、この上清を、アフィゲル（Affi−Gel）10［バイオ
−ラッド（Bio−Rad,Mississauga,ONT）］上に固定した
Ab（HybC）のカラム（１×10）にかけた。このカラム
は、予めpH7.2のPBSで洗浄し、再生しておいた。結合し
たp97を、0.1Mクエン酸（pH3.0）で溶離し、次いで1Mト
リス−HCl（pH9.0）を用いて中和した。精製したp97
を、30,000Mwの限外濾過膜を用いて濃縮した。PBSに対
して透析し、滅菌濾過した。標準p97の濃度を、280nmで
１％＝12.0cm-1のp97の吸光係数を用いて測定した［ベ
ーカー（Baker）ら、1992］。
血清試料は次のようにして調製した。それぞれの患者
について、以下の試料を採取した：（ａ）−20℃で保存
した血清試料、および（ｂ）４℃で保存した新鮮血液。
試料を試験する前に、新鮮血液を遠心し、血清を回収し
た。両方の試料を、そのままで、および／またはパンデ
ックス緩衝液（0.1％NaH3および1.0％w/v BSAを含むDNE
M）中の50％v/vウシ胎児血清（FCA）で希釈して試験し
た。
について、以下の試料を採取した：（ａ）−20℃で保存
した血清試料、および（ｂ）４℃で保存した新鮮血液。
試料を試験する前に、新鮮血液を遠心し、血清を回収し
た。両方の試料を、そのままで、および／またはパンデ
ックス緩衝液（0.1％NaH3および1.0％w/v BSAを含むDNE
M）中の50％v/vウシ胎児血清（FCA）で希釈して試験し
た。
以下のように、血清p97検定を特別の96ウエルプレー
ト（22−401−1;インデックス社）において行い、蛍光
をFCA（インデックス社）において読み取った。50％FCA
溶液で適切に希釈した血清試料（60μｌ）を、96ウエル
プレートのウエルに添加した。それぞれの試料を２重ま
たは３重に試験した。また、各プレートに、p97標準を
２重に添加した（300、150、120、90、60、30、15、
９、6ng/ml）。これら標準を50％FCA溶液で希釈し、検
量線作成用に用いた。実例の検量線作成を表１に示し、
検量線を図１に示す。抗p97被覆ビーズ（〜25μgAb/m
l）（20μｌ）を各試料に加え、室温で40分間インキュ
ベートした。96ウエルプレートの側面を軽くたたくこと
によって、ウエルの内容物を穏やかに混合した。インキ
ュベート後に、フルオレセンイン処理した第２の抗p97A
b［パンデックス緩衝液で1/75希釈（約25〜40μg/m
l）］（20μｌ）を試料およびビーズに加え、室温で５
〜10分間インキュベートした。次いで、プレートをFCA
中に置き、排出し、0.1％NaH3および１％w/v BSAを含む
PBSで３〜５回洗浄した。次いで、排出したプレート
を、25×増加の485/535nmフィルター対を用いて読み取
った。
ト（22−401−1;インデックス社）において行い、蛍光
をFCA（インデックス社）において読み取った。50％FCA
溶液で適切に希釈した血清試料（60μｌ）を、96ウエル
プレートのウエルに添加した。それぞれの試料を２重ま
たは３重に試験した。また、各プレートに、p97標準を
２重に添加した（300、150、120、90、60、30、15、
９、6ng/ml）。これら標準を50％FCA溶液で希釈し、検
量線作成用に用いた。実例の検量線作成を表１に示し、
検量線を図１に示す。抗p97被覆ビーズ（〜25μgAb/m
l）（20μｌ）を各試料に加え、室温で40分間インキュ
ベートした。96ウエルプレートの側面を軽くたたくこと
によって、ウエルの内容物を穏やかに混合した。インキ
ュベート後に、フルオレセンイン処理した第２の抗p97A
b［パンデックス緩衝液で1/75希釈（約25〜40μg/m
l）］（20μｌ）を試料およびビーズに加え、室温で５
〜10分間インキュベートした。次いで、プレートをFCA
中に置き、排出し、0.1％NaH3および１％w/v BSAを含む
PBSで３〜５回洗浄した。次いで、排出したプレート
を、25×増加の485/535nmフィルター対を用いて読み取
った。
血清試料を、アルツハイマー（AD）患者、配偶者対照
および無関係対照から得た。表２は、AD患者におけるp9
7血清濃度の結果を示すものである。病気の期間は、症
状の診断からの年数を示す。しかし、個々の患者が診断
のしばらく前からこの病気に罹患していた可能性もあ
る。表３は、AD患者および対照の試料におけるp97血清
濃度を示すものである。無関係対照の血清中のp97量は
2.4〜12ng/mlの範囲であり、この量は対象の年齢に従っ
て増加しないことが見出された（図２）。図２に示すよ
うに、AD患者の血清中のp97量は対照に比べて有意に増
加し、この量は患者の年齢に従って増加するようであっ
た。AD患者は、少なくとも20ng/mlの血清中のp97量を有
していた。見出された最大量は300ng/mlであった。重要
なことは、図３に示すように、血清p97量がAD患者の病
気期間に関係していることが見出されたことである。よ
り長い病気期間を有する患者の血清において、p97量の
一層の増加が見出された。
および無関係対照から得た。表２は、AD患者におけるp9
7血清濃度の結果を示すものである。病気の期間は、症
状の診断からの年数を示す。しかし、個々の患者が診断
のしばらく前からこの病気に罹患していた可能性もあ
る。表３は、AD患者および対照の試料におけるp97血清
濃度を示すものである。無関係対照の血清中のp97量は
2.4〜12ng/mlの範囲であり、この量は対象の年齢に従っ
て増加しないことが見出された（図２）。図２に示すよ
うに、AD患者の血清中のp97量は対照に比べて有意に増
加し、この量は患者の年齢に従って増加するようであっ
た。AD患者は、少なくとも20ng/mlの血清中のp97量を有
していた。見出された最大量は300ng/mlであった。重要
なことは、図３に示すように、血清p97量がAD患者の病
気期間に関係していることが見出されたことである。よ
り長い病気期間を有する患者の血清において、p97量の
一層の増加が見出された。
また、血清トランスフェリン量もAD患者および対照か
らの試料において測定した。AD患者と対照の血清トラン
スフェリン量の間に明瞭な差異は見出されず、対象の年
齢と血清トランスフェリン量の間に関係は見出されなか
った（図４）。
らの試料において測定した。AD患者と対照の血清トラン
スフェリン量の間に明瞭な差異は見出されず、対象の年
齢と血清トランスフェリン量の間に関係は見出されなか
った（図４）。
さらに、予め日本のAD患者および対照の群から得てい
たCSFおよび血清試料において、トランスフェリンおよ
びp97量を測定した。これらの試料は２年間凍結させ、
解凍したものであり、従って、現在のタンパク質量は試
料に最初に存在していた絶対量を示さないかもしれな
い。しかし、表４に示す結果は、p97量が対照の量に比
べてAD患者の血清において増加するという上記知見を確
認するものであった。また、結果は、CSF中のp97量が対
照に比べてAD患者において増加することを示した。AD患
者の血清およびCSF中のトランスフェリン量は、対照の
量を越えて増加することはなかった。
たCSFおよび血清試料において、トランスフェリンおよ
びp97量を測定した。これらの試料は２年間凍結させ、
解凍したものであり、従って、現在のタンパク質量は試
料に最初に存在していた絶対量を示さないかもしれな
い。しかし、表４に示す結果は、p97量が対照の量に比
べてAD患者の血清において増加するという上記知見を確
認するものであった。また、結果は、CSF中のp97量が対
照に比べてAD患者において増加することを示した。AD患
者の血清およびCSF中のトランスフェリン量は、対照の
量を越えて増加することはなかった。
実施例２ 実施例１において示した研究のさらに完全な説明およ
び議論をこの実施例２に挙げる。以下の原材料および方
法を実施例２で説明する研究に用いた。
び議論をこの実施例２に挙げる。以下の原材料および方
法を実施例２で説明する研究に用いた。
カナダ人対象 AD（Ｎ＝27）対象を、バンクーバー病院のアルツハイ
マー病および関連の疾患のためのUBCクリニックの臨床
試験プログラムに参加している者から選択した。全ての
AD対象が、NINCDS−ADRDA基準に従って「臨床的に可能
性が高い」と診断されていた。知覚症候の概算期間を全
てのAD対象について調べた。対象は、この研究のときに
実験的治療を受けていなかった。健康なボランティア
（Ｎ＝15）または配偶者介護者（Ｎ＝10）からランダム
に選択した対照は、臨床的に明らかな有意の知覚損傷を
示さなかった。
マー病および関連の疾患のためのUBCクリニックの臨床
試験プログラムに参加している者から選択した。全ての
AD対象が、NINCDS−ADRDA基準に従って「臨床的に可能
性が高い」と診断されていた。知覚症候の概算期間を全
てのAD対象について調べた。対象は、この研究のときに
実験的治療を受けていなかった。健康なボランティア
（Ｎ＝15）または配偶者介護者（Ｎ＝10）からランダム
に選択した対照は、臨床的に明らかな有意の知覚損傷を
示さなかった。
２種類の研究を行った。即ち、（ａ）血清試料を静脈
穿刺の直後に４℃で保存し、24時間以内にTfおよびp97
を測定した。51〜82.5歳（66.4±17.52歳）の範囲の年
齢の17人のAD対象（女性10人、男性７人）を、28〜76歳
（52.33±16.5歳）の範囲の年齢の15人の対照（女性６
人、男性９人）と比較した。（ｂ）配偶者のペアー（Ｎ
＝10ペアー）から採取した血清試料を静脈穿刺の直後に
−20℃で凍結させて保存した。同時に配偶者ペアーから
試料を採取し、凍結し、次いで同時に分析した。54〜86
歳（70.6±10.47歳）の範囲の年齢のAD患者（女性７
人、男性３人）を、53〜84歳（69.9±10.21歳）の範囲
の年齢のこれらAD患者の非AD配偶者（女性３人、男性７
人）と比較した。
穿刺の直後に４℃で保存し、24時間以内にTfおよびp97
を測定した。51〜82.5歳（66.4±17.52歳）の範囲の年
齢の17人のAD対象（女性10人、男性７人）を、28〜76歳
（52.33±16.5歳）の範囲の年齢の15人の対照（女性６
人、男性９人）と比較した。（ｂ）配偶者のペアー（Ｎ
＝10ペアー）から採取した血清試料を静脈穿刺の直後に
−20℃で凍結させて保存した。同時に配偶者ペアーから
試料を採取し、凍結し、次いで同時に分析した。54〜86
歳（70.6±10.47歳）の範囲の年齢のAD患者（女性７
人、男性３人）を、53〜84歳（69.9±10.21歳）の範囲
の年齢のこれらAD患者の非AD配偶者（女性３人、男性７
人）と比較した。
日本人対象 61〜80歳（71.5±6.52歳）の範囲の年齢の８人のAD対
象（女性６人、男性２人）を試験し、57〜72歳（66.57
±6.4歳）の範囲の年齢の７人の対照（女性４人、男性
３人）と比較した。AD対象および対照からの血清および
CSF試料は、千葉大学医学部神経学科から入手した。全
てのAD対象が、NINCDSADRDA基準に従って「臨床的に可
能性が高い」と診断された。対照は、以下の神経病に罹
患している年配の対象から採用した：パーキンソン病１
人、旧小脳退行症２人、筋萎縮性側索硬化症１人、頚部
脊椎症２人および末梢神経障害１人。血清およびCSF試
料を採取直後に−20℃で凍結させ、分析前にまとめて同
じように解凍した。
象（女性６人、男性２人）を試験し、57〜72歳（66.57
±6.4歳）の範囲の年齢の７人の対照（女性４人、男性
３人）と比較した。AD対象および対照からの血清および
CSF試料は、千葉大学医学部神経学科から入手した。全
てのAD対象が、NINCDSADRDA基準に従って「臨床的に可
能性が高い」と診断された。対照は、以下の神経病に罹
患している年配の対象から採用した：パーキンソン病１
人、旧小脳退行症２人、筋萎縮性側索硬化症１人、頚部
脊椎症２人および末梢神経障害１人。血清およびCSF試
料を採取直後に−20℃で凍結させ、分析前にまとめて同
じように解凍した。
p97検定 試料をそのままで、および0.1％アジ化ナトリウムお
よび1.0％w/vウシ血清アルブミンを含むDMEM中の50％v/
vウシ胎児血清で希釈して試験した。抗p97マウス抗体Hy
bCを用いてカルボキシポリスチレン（0.77μｍ）捕捉粒
子を被覆し、抗p97マウスモノクローナル抗体L235［ATC
C−HB8446L235（Ｈ−19）］をフルオレセイン処理した
［ケナード（Kennard,M.L.）:EMBO J.14,4178−4186（1
995）］。p97標準は、300〜1ng/mlの範囲でウシ胎児血
清を含むDMEM緩衝液中で新たに調製した。検定は、試料
および標準（60μｌ）を捕捉粒子（〜25μｇ抗体/ml）
（20μｌ）と特殊な96ウエルプレート中で混合し、室温
で40分間インキュベートすることからなっていた。次
に、フルオレセイン処理した第２の抗体（約25〜40μg/
ml）（20μｌ）を加え、混合物を室温でさらに５〜10分
間インキュベートした。次いで、プレートを「パンデッ
クス蛍光濃度分析器」［ジョリー（Jolley,M.J.）:Immu
nol.Methods 67,21−35（1984）］中に置き、排水し、
0.1％アジ化ナトリウムおよび1.0％ウシ血清アルブミン
を含むPBSで４回洗浄した。次いで、排水したプレート
を、25×増加の485/535フィルター対で読み取った。蛍
光をp97濃度と関係付けるp97標準から作成した検量線か
らp97濃度を決定した。全ての試料を種々の希釈におい
て３重に試験し、濃度を全ての結果から平均した。
よび1.0％w/vウシ血清アルブミンを含むDMEM中の50％v/
vウシ胎児血清で希釈して試験した。抗p97マウス抗体Hy
bCを用いてカルボキシポリスチレン（0.77μｍ）捕捉粒
子を被覆し、抗p97マウスモノクローナル抗体L235［ATC
C−HB8446L235（Ｈ−19）］をフルオレセイン処理した
［ケナード（Kennard,M.L.）:EMBO J.14,4178−4186（1
995）］。p97標準は、300〜1ng/mlの範囲でウシ胎児血
清を含むDMEM緩衝液中で新たに調製した。検定は、試料
および標準（60μｌ）を捕捉粒子（〜25μｇ抗体/ml）
（20μｌ）と特殊な96ウエルプレート中で混合し、室温
で40分間インキュベートすることからなっていた。次
に、フルオレセイン処理した第２の抗体（約25〜40μg/
ml）（20μｌ）を加え、混合物を室温でさらに５〜10分
間インキュベートした。次いで、プレートを「パンデッ
クス蛍光濃度分析器」［ジョリー（Jolley,M.J.）:Immu
nol.Methods 67,21−35（1984）］中に置き、排水し、
0.1％アジ化ナトリウムおよび1.0％ウシ血清アルブミン
を含むPBSで４回洗浄した。次いで、排水したプレート
を、25×増加の485/535フィルター対で読み取った。蛍
光をp97濃度と関係付けるp97標準から作成した検量線か
らp97濃度を決定した。全ての試料を種々の希釈におい
て３重に試験し、濃度を全ての結果から平均した。
トランスフェリン検定 この検定は、上記の「粒子濃縮蛍光イムノアッセイ」
に基づいた。抗ヒトトランスフェリンヤギ抗血清を捕捉
粒子に被覆し、抗ヒトトランスフェリンヒツジ抗血清を
フルオレセイン処理した。トランスフェリン標準を、３
〜0.5μg/mlの範囲で新たに調製した。全ての試料を種
々の希釈において３重に試験し、濃度を全ての結果から
平均した。
に基づいた。抗ヒトトランスフェリンヤギ抗血清を捕捉
粒子に被覆し、抗ヒトトランスフェリンヒツジ抗血清を
フルオレセイン処理した。トランスフェリン標準を、３
〜0.5μg/mlの範囲で新たに調製した。全ての試料を種
々の希釈において３重に試験し、濃度を全ての結果から
平均した。
ヒト体液中のp97濃度をモニターすることができる定
量検定法を開発した。この検定は、ミクロン以下のポリ
スチレンビーズに結合させた捕捉抗体と蛍光ラベルした
２次抗体を用いる迅速な免疫蛍光法である「粒子濃縮蛍
光イムノアッセイ」に基づいていた［ケナード（Kennar
d,M.L.）ら:Biotech.Bioeng.42,480−486（1993）］。
改良型のサンドイッチ検定を、0.22μｍの酢酸セルロー
ス膜を含む特別に設計された96ウエルプレートにおいて
行った。このウエルを真空下に排出することができ、各
ウエルの基部に蛍光複合体を濃縮することができる。こ
のプレートを洗浄し、各ウエルの蛍光を読み取ることが
できる（ここで、蛍光はp97濃度に比例する）。p97がヒ
ト血清中で部分的に不安定であり、保存によって抗原性
を失うことがわかった。表５は、最初は100ng/mlで血清
中に加えたp97の検出可能な濃度に対する、保存温度お
よび時間の効果を示すものである。p97は、60℃で30分
間熱ショックを加えた試料において検出不能になり（驚
くべきことに、血清Tfはこの処理によって影響されない
ようであった）、室温で保存した試料は、48時間で20％
までの抗原性を失った。しかし、４℃および−20℃で保
存したときには48時間にわたり試料は比較的安定であっ
た（しかし、凍結と解凍はp97の検出をさらに低下させ
た）。これらの理由から、AD患者からの血清p97濃度を
知覚が正常な対照と比較する研究においては、血清試料
を採取直後に４℃で保存し、24時間以内に試験した。図
５は、全てのAD患者が対照と比較して血清中のp97量が
増加しており、重なりがなかったことを示す。AD群の平
均p97濃度（Ｎ＝17;43.8±11.6ng/ml）は、対のｔ−検
定に基づいて、対照群の平均（Ｎ＝15;7.04±3.28ng/m
l）とは有意に異なっていた（ｔ0.05＝12.96、ｐ＝6.6
×10-10）。現在までにヒト血液中のp97について他の研
究が１つだけ存在するが［ブラウン（Brown,J.P.）ら:P
roc.Natl.Acad.Sci.USA 78,539−543（1981）］、この
ときにはp97は1.3〜2.7ng/mlの範囲で検出された。対照
群の平均年齢（52.3±16.5歳）はAD群の平均年齢（66.4
±17.52歳）よりも若いが、直線回帰は、p97血清濃度と
対象年齢の間に有意の相関関係は存在しないことを示し
た（AD患者:N＝17、回帰線の傾き＝0.359、Ｒ＝0.30、
ｐ＝0.249;対照:N＝15、回帰線の傾き＝−0.07、Ｒ＝−
0.35、ｐ＝0.197）。さらに、AD患者のデータを、ADの
症状が患者に初めて観察されてからの期間に対してプロ
ットしたときに（図６）、直線回帰は、p97血清濃度の
増加と病気の進行の間に有意の関係が存在することを示
した（Ｎ＝17、回帰線の傾き＝3.3、Ｒ＝0.82、ｐ＝0.0
003）。最後に、対照の最大p97濃度への直線回帰の外挿
は、p97濃度が、ADの症状が観察される約２年前から増
加し始めることを示唆した。
量検定法を開発した。この検定は、ミクロン以下のポリ
スチレンビーズに結合させた捕捉抗体と蛍光ラベルした
２次抗体を用いる迅速な免疫蛍光法である「粒子濃縮蛍
光イムノアッセイ」に基づいていた［ケナード（Kennar
d,M.L.）ら:Biotech.Bioeng.42,480−486（1993）］。
改良型のサンドイッチ検定を、0.22μｍの酢酸セルロー
ス膜を含む特別に設計された96ウエルプレートにおいて
行った。このウエルを真空下に排出することができ、各
ウエルの基部に蛍光複合体を濃縮することができる。こ
のプレートを洗浄し、各ウエルの蛍光を読み取ることが
できる（ここで、蛍光はp97濃度に比例する）。p97がヒ
ト血清中で部分的に不安定であり、保存によって抗原性
を失うことがわかった。表５は、最初は100ng/mlで血清
中に加えたp97の検出可能な濃度に対する、保存温度お
よび時間の効果を示すものである。p97は、60℃で30分
間熱ショックを加えた試料において検出不能になり（驚
くべきことに、血清Tfはこの処理によって影響されない
ようであった）、室温で保存した試料は、48時間で20％
までの抗原性を失った。しかし、４℃および−20℃で保
存したときには48時間にわたり試料は比較的安定であっ
た（しかし、凍結と解凍はp97の検出をさらに低下させ
た）。これらの理由から、AD患者からの血清p97濃度を
知覚が正常な対照と比較する研究においては、血清試料
を採取直後に４℃で保存し、24時間以内に試験した。図
５は、全てのAD患者が対照と比較して血清中のp97量が
増加しており、重なりがなかったことを示す。AD群の平
均p97濃度（Ｎ＝17;43.8±11.6ng/ml）は、対のｔ−検
定に基づいて、対照群の平均（Ｎ＝15;7.04±3.28ng/m
l）とは有意に異なっていた（ｔ0.05＝12.96、ｐ＝6.6
×10-10）。現在までにヒト血液中のp97について他の研
究が１つだけ存在するが［ブラウン（Brown,J.P.）ら:P
roc.Natl.Acad.Sci.USA 78,539−543（1981）］、この
ときにはp97は1.3〜2.7ng/mlの範囲で検出された。対照
群の平均年齢（52.3±16.5歳）はAD群の平均年齢（66.4
±17.52歳）よりも若いが、直線回帰は、p97血清濃度と
対象年齢の間に有意の相関関係は存在しないことを示し
た（AD患者:N＝17、回帰線の傾き＝0.359、Ｒ＝0.30、
ｐ＝0.249;対照:N＝15、回帰線の傾き＝−0.07、Ｒ＝−
0.35、ｐ＝0.197）。さらに、AD患者のデータを、ADの
症状が患者に初めて観察されてからの期間に対してプロ
ットしたときに（図６）、直線回帰は、p97血清濃度の
増加と病気の進行の間に有意の関係が存在することを示
した（Ｎ＝17、回帰線の傾き＝3.3、Ｒ＝0.82、ｐ＝0.0
003）。最後に、対照の最大p97濃度への直線回帰の外挿
は、p97濃度が、ADの症状が観察される約２年前から増
加し始めることを示唆した。
p97がADにおいて非特異的に増加する可能性を排除す
るために、別の血液鉄結合タンパク質であるトランスフ
ェリン（Tf）をAD患者および対照の血清において分析し
た。図７は、両集団のTf濃度の間にほとんど差がなかっ
たことを示す。AD群の平均Tf濃度（Ｎ＝17;1.81±0.71m
g/ml）は、対のｔ−検定に基づいて、対照群の平均（Ｎ
＝15;1.93±0.78mg/ml）とは有意に異なっていなかった
（ｔ0.05＝0.41、ｐ＝0.69）。
るために、別の血液鉄結合タンパク質であるトランスフ
ェリン（Tf）をAD患者および対照の血清において分析し
た。図７は、両集団のTf濃度の間にほとんど差がなかっ
たことを示す。AD群の平均Tf濃度（Ｎ＝17;1.81±0.71m
g/ml）は、対のｔ−検定に基づいて、対照群の平均（Ｎ
＝15;1.93±0.78mg/ml）とは有意に異なっていなかった
（ｔ0.05＝0.41、ｐ＝0.69）。
別の研究において、AD患者からのp97の血清量を該AD
患者の知覚的に正常な配偶者と比較することにより、血
清中のp97濃度に対して、食事、ライフスタイルまたは
ある種の他の共通因子の作用が存在するか否かを調べ
た。この場合、血清試料は採取直後に−20℃で凍結させ
た。図８は、10組のAD患者（70.6±10.47歳）とその配
偶者対照（69.9±10.21歳）からの血清p97量の比を比較
するものである。全ての場合において、AD患者のp97血
清量はその配偶者対照に比べて増加しており、1.6〜32.
5（平均10.17±9.08）の範囲の比を有していた。この知
見は、環境因子は恐らくAD患者のp97血清量の増加の原
因とはならないことの証拠を与えるものである。
患者の知覚的に正常な配偶者と比較することにより、血
清中のp97濃度に対して、食事、ライフスタイルまたは
ある種の他の共通因子の作用が存在するか否かを調べ
た。この場合、血清試料は採取直後に−20℃で凍結させ
た。図８は、10組のAD患者（70.6±10.47歳）とその配
偶者対照（69.9±10.21歳）からの血清p97量の比を比較
するものである。全ての場合において、AD患者のp97血
清量はその配偶者対照に比べて増加しており、1.6〜32.
5（平均10.17±9.08）の範囲の比を有していた。この知
見は、環境因子は恐らくAD患者のp97血清量の増加の原
因とはならないことの証拠を与えるものである。
血清およびCSF中のp97およびトランスフェリン量 第３の研究において、日本人のAD患者および対照から
の血清およびCSFの両方の凍結試料について、Tfおよびp
97を分析した。この研究に用いた対照は、種々の他の神
経病に罹患している対象であり、p97の血清量が他の神
経退行性疾患において増加しているか否かを調べるため
に試験した。しかし、これらの血清試料は凍結され、分
析前にまとめて同じように解凍されたものであり、あい
にくp97検出が低下していた。それにもかかわらず、表
６において見ることができるように、いくつかの観察は
注目するに値した。p97の平均濃度は、対照（Ｎ＝5;8.4
8±4.02ng/ml;平均年齢67.2±6.82歳）と比較してAD患
者（Ｎ＝5;22.4±9.21ng/ml;平均年齢72.4±5.99歳）の
CSFにおいて増加していた。これらの濃度は、対のｔ−
検定に基づいて有意に相違していた（ｔ0.05＝2.90、ｐ
＝0.044）。また、これは血清中のp97についても言え、
ここでは対のｔ−検定に基づいて、AD群の平均p97濃度
（Ｎ＝4;11.3±2.76ng/ml;平均年齢74.3±5.63歳）は対
照群の平均（Ｎ＝6;2.01±1.75ng/ml;平均年齢65.6±6.
52歳）とは有意に相違していた（ｔ0.05＝4.52、ｐ＝0.
02）。全体の濃度は大きく低下していたが、この結果は
図５のデータと一致していた。他の観察を補強すると、
p97濃度は対象の年齢または性別とは関係していないよ
うであった。また、これらのデータは、血清p97量より
も２〜４倍高いCSFをモニターすることによって、ADの
開始および進行に関する有用な情報を得ることができる
ことを示唆する。p97よりも血清中でさらに安定であるT
fの平均濃度は、CSFおよび血清においてADおよび対照の
両対象について実質的に同一であった。CSFについて
は、対のｔ−検定に基づいて、AD群の平均Tf濃度（Ｎ＝
8;20.35±4.78μg/ml;平均年齢71.5±6.52歳）は、対照
群の平均（Ｎ＝7;16.0±4.5μg/ml;平均年齢67.7±6.32
歳）とは有意に異なることはなかった（ｔ0.05＝2.05、
ｐ＝0.18）。また血清についても、対のｔ−検定に基づ
いて、AD群の平均Tf濃度（Ｎ＝4;2.24±3.6mg/ml;平均
年齢74.3±5.63歳）は、対照群の平均（Ｎ＝5;2.26±7.
0mg/ml;平均年齢63.4±4.5歳）と有意に異なることがな
かった（ｔ0.05＝0.38、ｐ＝0.72）。さらに、血清Tf量
がCSF中よりも相当に高く（〜100倍）、これがp97（こ
れの量は、CSF中よりも血清中の方が低い）とは対照的
であることに注意することが重要である。これらのデー
タは、Tfは脳から活発に排除されるがp97は排除されな
いようであるので、p97が脳内で独特の機能を有してい
ることを示唆する。
の血清およびCSFの両方の凍結試料について、Tfおよびp
97を分析した。この研究に用いた対照は、種々の他の神
経病に罹患している対象であり、p97の血清量が他の神
経退行性疾患において増加しているか否かを調べるため
に試験した。しかし、これらの血清試料は凍結され、分
析前にまとめて同じように解凍されたものであり、あい
にくp97検出が低下していた。それにもかかわらず、表
６において見ることができるように、いくつかの観察は
注目するに値した。p97の平均濃度は、対照（Ｎ＝5;8.4
8±4.02ng/ml;平均年齢67.2±6.82歳）と比較してAD患
者（Ｎ＝5;22.4±9.21ng/ml;平均年齢72.4±5.99歳）の
CSFにおいて増加していた。これらの濃度は、対のｔ−
検定に基づいて有意に相違していた（ｔ0.05＝2.90、ｐ
＝0.044）。また、これは血清中のp97についても言え、
ここでは対のｔ−検定に基づいて、AD群の平均p97濃度
（Ｎ＝4;11.3±2.76ng/ml;平均年齢74.3±5.63歳）は対
照群の平均（Ｎ＝6;2.01±1.75ng/ml;平均年齢65.6±6.
52歳）とは有意に相違していた（ｔ0.05＝4.52、ｐ＝0.
02）。全体の濃度は大きく低下していたが、この結果は
図５のデータと一致していた。他の観察を補強すると、
p97濃度は対象の年齢または性別とは関係していないよ
うであった。また、これらのデータは、血清p97量より
も２〜４倍高いCSFをモニターすることによって、ADの
開始および進行に関する有用な情報を得ることができる
ことを示唆する。p97よりも血清中でさらに安定であるT
fの平均濃度は、CSFおよび血清においてADおよび対照の
両対象について実質的に同一であった。CSFについて
は、対のｔ−検定に基づいて、AD群の平均Tf濃度（Ｎ＝
8;20.35±4.78μg/ml;平均年齢71.5±6.52歳）は、対照
群の平均（Ｎ＝7;16.0±4.5μg/ml;平均年齢67.7±6.32
歳）とは有意に異なることはなかった（ｔ0.05＝2.05、
ｐ＝0.18）。また血清についても、対のｔ−検定に基づ
いて、AD群の平均Tf濃度（Ｎ＝4;2.24±3.6mg/ml;平均
年齢74.3±5.63歳）は、対照群の平均（Ｎ＝5;2.26±7.
0mg/ml;平均年齢63.4±4.5歳）と有意に異なることがな
かった（ｔ0.05＝0.38、ｐ＝0.72）。さらに、血清Tf量
がCSF中よりも相当に高く（〜100倍）、これがp97（こ
れの量は、CSF中よりも血清中の方が低い）とは対照的
であることに注意することが重要である。これらのデー
タは、Tfは脳から活発に排除されるがp97は排除されな
いようであるので、p97が脳内で独特の機能を有してい
ることを示唆する。
本研究において、関連および無関連の対照に対してAD
患者の血清において首尾一貫して増加する生化学的なマ
ーカー分子を同定した。本発明者らは、AD患者と対照の
間に重なりがないことを見出した。
患者の血清において首尾一貫して増加する生化学的なマ
ーカー分子を同定した。本発明者らは、AD患者と対照の
間に重なりがないことを見出した。
上記から、本発明の特定の態様を説明の目的で本明細
書中に記載したが、本発明の思想および範囲から逸脱す
ることなく種々の修飾を行いうることが理解されよう。
従って、本発明は添付の請求の範囲によることを除き限
定されるものではない。
書中に記載したが、本発明の思想および範囲から逸脱す
ることなく種々の修飾を行いうることが理解されよう。
従って、本発明は添付の請求の範囲によることを除き限
定されるものではない。
フロントページの続き (72)発明者 ジェフリーズ，ウィルフレッド・エイ カナダ、ブイ４エイ・２ブイ５、ブリテ ィッシュ・コロンビア、サウス・サリ ー、クレセント・ロード12682番 (72)発明者 ケナード，マルコム カナダ、ブイ６アール・２ジェイ６、ブ リティッシュ・コロンビア、バンクーバ ー、ウエスト・テンス・アベニュー4660 番、アパートメント103 (56)参考文献 国際公開94／1463（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/48 - 33/98
Claims (15)
- 【請求項１】患者からの血清試料においてアルツハイマ
ー病を検出する方法であって、以下の工程： （ａ）アルツハイマー病に罹患していることが疑われる
患者から血清試料を採取することにより試験試料を得； （ｂ）試験試料中のp97の量を測定し；そして （ｃ）試験試料中のp97の量を、対照試料中のp97の量と
比較する； からなり、 対照試料中のp97の量と比較して1.5倍またはそれ以上に
増加している試験試料中のp97の量の存在をアルツハイ
マー病の可能性の指標とする方法。 - 【請求項２】対照試料中のp97の量と比較して２〜９倍
に増加している試験試料中のp97の量の存在をアルツハ
イマー病の可能性の指標とする請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】少なくとも20ng/mlの試験試料中のp97の量
の存在をアルツハイマー病の可能性の指標とする請求項
１に記載の方法。 - 【請求項４】工程（ｃ）において、試験試料中のp97の
量を、対照試料において測定したp97の平均またはベー
スライン量と比較する請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】（ｃ）における対照試料が、同一の患者ま
たは別の個体からの正常試料である請求項１に記載の方
法。 - 【請求項６】工程（ｂ）におけるp97の量がp97に対する
抗体を用いて測定される請求項１〜５のいずれかに記載
の方法。 - 【請求項７】p97の量を免疫検定を用いて測定する請求
項６に記載の方法。 - 【請求項８】免疫検定が免疫蛍光法である請求項７に記
載の方法。 - 【請求項９】免疫検定がラジオイムノアッセイである請
求項７に記載の方法。 - 【請求項１０】免疫検定が酵素結合免疫検定である請求
項７に記載の方法。 - 【請求項１１】免疫検定が、免疫沈降法、ラテックス凝
集法、血球凝集法、対向流免疫電気泳動法（CIEP）、放
射免疫沈降法、ドット・ブロット検定法、阻害もしくは
競合検定法またはサンドイッチ検定法である請求項７に
記載の方法。 - 【請求項１２】試験試料中のp97の存在を検出する反応
物質およびp97の存在を検出するための試薬を含む、請
求項１〜５のいずれかに記載の方法を実施するためのキ
ット。 - 【請求項１３】p97の存在を検出する反応物質が抗体で
ある請求項12に記載のキット。 - 【請求項１４】抗体がビーズに結合している請求項12に
記載のキット。 - 【請求項１５】蛍光マーカーでラベルされたp97に対す
る第２の抗体をさらに含む請求項12に記載のキット。
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