JPH11511257A

JPH11511257A - アルツハイマー病を診断およびモニターするためのｐ９７の定量

Info

Publication number: JPH11511257A
Application number: JP9509656A
Authority: JP
Inventors: ジェフリーズ，ウィルフレッド・エイ; ケナード，マルコム
Original assignee: University of British Columbia
Current assignee: University of British Columbia
Priority date: 1995-08-31
Filing date: 1996-08-30
Publication date: 1999-09-28
Anticipated expiration: 2016-08-30
Also published as: US20030077693A1; EP0847530A1; CA2230372A1; WO1997008560A1; IL123441A; IL123441A0; CN1198214A; EP0847530B1; ATE269545T1; AU717198B2; US6455494B1; DE69632734D1; AU6783496A; DE69632734T2; CA2230372C; US5981194A; NZ315997A; JP3259963B2

Abstract

(57)【要約】ヒト個体からの体液試料中のｐ９７を定量することによってアルツハイマー病を診断する方法であって、(a)アルツハイマー病に罹患していることが疑われる個体から体液試料を採取することにより試験試料を得；(b)試験試料中のｐ９７の量を測定し；そして(c)試験試料中のｐ９７の量を対照試料中のｐ９７の量と比較することからなり、対照試料中のｐ９７の量と比較して増加している試験試料中のｐ９７の量の存在をアルツハイマー病の可能性の指標とする方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】アルツハイマー病を診断およびモニターするためのｐ９７の定量発明の分野本発明は、アルツハイマー病の診断およびモニターに使用するｐ９７の定量方法に関する。発明の背景アルツハイマー病(AD)は、知覚、行動および機能に影響を及ぼす神経退行性の疾患である。最近の研究において、ＡＤは年齢７５でほぼ７％の個体を冒し、年齢８５では４人に１人を越えるまで増加することが示されている[カナダの健康および老化の研究グループの研究；J．Can．Med．Assoc．150，899-913(1994)] 。他の研究は、老人を冒すＡＤの発生率をもっと高いものと主張している[エバンス(Evans，D.A.)：J．Am．Med．Assoc．262，1551-2559(1989)]。現在のところ、ＡＤに対して非常に限定された治療選択肢が存在するにすぎず、診断のための唯一確実な方法は脳剖検によるものである。ＡＤは、主にβ-アミロイドタンパク質(Ａβ)からなる老人斑、高ホスホリル化ミクロチューブリン関連タンパク質Tauを伴なう神経細線維のもつれ[ゲダート (Goedert，M)、スピランチニ(Spillantini)ら：Neuron ８，156-160(1992)；およびセルケ(Selkoe，D.J.)：Neuron ６，487-498(1991]、ニューロン細胞死およびシナプス接合の損失[テリー(Terry，R.D.)ら：Ann．Neurology 30，572-580(1 991)]を含む脳における種々の病理学的マーカーによって特徴付けられる。タンパク質Ａβの異常な蓄積は、知覚および記憶に関与している脳領域においてニューロン細胞死の結果を与えると言われている[ブラス(Blass，J.P.)：Neurology 43，S25-38(1993)；およびプライス(Price，D.L.)：Ann．Rev．Neurosci．9，48 9-512(1986)]。臨床的には、ＡＤの診断は神経学的および神経病理学的な評価によって行われているが、残念ながらこの疾患をその初期段階において検出することはできない。ＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡのような一定の臨床診断基準を使用することにより、臨床での病理学的診断の精度は８０％を越えるまで改善されている[マッカーン( McKhann,G.)ら:Neurology 34,939-944(1984)]。脳脊髄液(CSF)タンパク質の量とＡＤとを関係付ける試みは、限定された成功を収めている。例えば、CSF中のＡβを検出するために開発された試験は、早期開始のＡＤ患者は年配の対照よりもわずかに高いＡβ量を有するが[ナカムラ(Na kamura，T.)ら：Ann．Neurol．36，903ー911(1994)]、ＡＤ患者における全Ａβ量は対照とは有意に相違しないことを示した[ショウジ(Shoji，M.)ら：Science 25 8，126-129(1992)]。しかし、42位まで伸びるＡβ、即ちＡβ_1-42がＡＤ脳組織における拡散性および老人性の両アミロイド斑において多いこと[ローハー(Rohe r，A.)ら：J．Biol．Chem．268，3072-3083(1993)]、およびＡβ_1-42が対照に比べてＡＤ患者のCSFにおいて有意に少ないことが発見されたこと[モター(Motter ，R.)ら：Ann．Neurol．38，643-648(1995)]が注目される。分泌型のアミロイド前駆体タンパク質(APP)(これからＡβが誘導される)の研究において、可溶性APP が対照に比べてＡＤ患者のCSFにおいて大きく減少していることがわかった[バン・ノストランド(Van Nostrand，W.E.)ら：Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89，255 1-2555(1992)]。しかし、他の研究は、APPのわずかな減少[パルメート(Palmert ，M.R.)ら：Neurol．40，1028-1034(1990)]、さらには増加[キタグチ(Kitaguchi ，N.)ら：Biochem．BiopHys．Res．Comm．166，1453-1459(1990)]に言及しているにすぎない。CSF中のタンパク質Tauをモニターするために開発された試験により、平均してTau量は対照よりもＡＤ患者において高くなるが、正常な対照[モター(Motter，R.)ら：Ann．Neurol．38，643-648(1995)；ビゴ-ペルフリー(Vigo-P elfrey，C.)ら：Neurology 45，788-793(1995)]、および他の神経学的疾患に罹患している対照[バンダーミーレン(Vandermeeren，M.)ら：J．Neurocheｍ．61， 1828-1834(1993)]と大きく重なり合うことがわかった。他のCSF診断マーカー、例えば、老人斑に関係するα１-抗キモトリプシン[アブラハム(Abraham，C.R.)、セルケ(Selkoe，D.J.)およびポター(Potter， H.)：Cell．52，487-501(1988)]およびユビキチン[ワン(Wang，G.P.)ら：Acta N europathol.(Berl.)82，6-12(1991)]は、相反する結果およびＡＤと対照の間の重なりのゆえに、不適当であると考えられ、また不適当であることがわかっている。これらの結果は期待にそむくだけでなく、患者診断のためのCSFの常法によるサンプリングは十分に容認されていないようである。しかし、市販の診断試験がアテナ・ニューロサイエンス社(Athena Neuroscience Inc.)により開発されており、これは、ヒト染色体１９上に多く位置しているアポリポタンパク質Ｅ(Apo E)Ｅ４アレルと、CSF TauおよびＡβ_1-42量を測定することを組合せている。Apo Eが老人斑に関係していること、およびApoE Ｅ４に対してホモ接合性である人はＡＤを発症する可能性が高いことが確かめられている[サンダース(Sanders，A.M .)ら：Neurol．43，1467-1472(1993)]。この組合せ分析は、医師がＡＤを有する患者の可能性を決定するのを助けることができると主張されている[モター(Mott er，R.)ら：Ann．Neurol．38，643-648(1995)]。しかし、この試験は時間がかかり、可能性の答えを与えるにすぎない。瞳孔反応を研究する最近の報告は、ＡＤ患者がアセチルコリン遮断薬であるトロピカミドの希釈溶液に対して過敏症を示すことを示唆している[シント(Scinto ,L.F.)ら：Science 266，1051-1054(1994)]．この過敏症は、中年の人によりＡＤに非常に類似した神経病理を例外なく発症するダウン症候群の対象において初めて注目された[オルソン(Olson，M.I.)およびシャウ(Shaw，C.M.)：Brain 92， 147-156(1969)]。この研究は見込みがあるように見えるが、これらの結果は、反復するのが容易ではなく、重なりおよび解釈の困難性(例えば、目の疾患または色が試験において持つことがある作用)に悩まされる[ルーペ(Loupe，D.N.)ら：O pthalmology 103，495-503(1996)]。最も最近になって、１つの戦略が開示されているが[パーシャド(Parshad，R.)ら：Proc．Natl．Acad．Sci．USA 93，5246- 5150(1996)],．ここでは、ＡＤ細胞を、そのDNA損傷の修復能力における欠損の検出によって同定している。この試験は、ＡＤの診断を支持するのに、またはその可能性がないとするのに有用でありうると結論された。しかし、この試験は労力を要し、培養細胞とともに多工程を必要とするので、臨床での実施にはなお遠い。最後に、陽電子放射断層写真法を用いてＡＤ患者の脳中のグルコース代謝の変動を検出できることが注目された[レイマン(Reiman，E.M.)：N．Engl．J．M ed．334，752-758(1996)]。この試験は、定型で使用するのには実際的ではない。大きな興味がＡＤの遺伝的原因に向けられ、いくつかの遺伝子における突然変異が少数の家族性ＡＤに感受性を与えることが示された。染色体２１上のＡＰＰ遺伝子[ミュレル(Murrell，J.)ら：Science 254，97-99(1991);およびカーリンスキー(Karlinsky，H.)：Neurology 42，1445-1449(1992)]における突然変異は、常染色体支配的な早期発症(<65歳)ＡＤと関係しており、プレセニリン(presen ilin)、染色体１４に結合したＳ１８２[シェーレンベルグ(Schellenberg，G.D.) ら：Science 258，668-671(1992)；ファン・ブレックホーべン(Van Broeckhoven ，C.)ら：Nature Genet 2，335-339(1992)；およびシェリングトン(Sherrington ，R.)ら：Nature 375，754-760(1995)]および染色体１に結合したＳＴＭ２[レビー-ラハッド(Levy-Lahad，E.)ら：Science 269，973-977(1995)；およびロガエフ(Rogaev，E.I.)ら：Nature 376，775-778(1995)]における突然変異は、少数の家族性ＡＤの症例に関係している。さらに、染色体１９上に見出されるApoE遺伝子のＥ４アレルは、晩期発症型ＡＤが現れる危険を変化させる[サンダース(Sand ers，A.M.)ら：Neurol．43，1467-1472(1993)；およびロガエフ(Rogaev，E.I.) ら：Nature 376，775-778(1995)]。これら遺伝子の発見は、ＡＤを発症する少数の個体の傾向を決定するのに大きな価値を有するが、遺伝的評価はＡＤの検出またはモニターに有用ではないであろう。メラノトランスフェリンとしても知られているｐ９７抗原がＡＤに関係している[1994年１月20日にWO94/01463として公開されたPCT/CA93/00272]。ｐ９７は、トリ卵白由来のオボトランスフェリン、ラクトフェリンおよび血清トランスフェリン(Tf)を含む鉄結合タンパク質の重要な群に属する[ベーカー(Baker，E.N.)、ランボール(Rumball)ら：Trends Biochem．Sci．12，350-353(1987)]。ｐ９７は鉄を結合することができ、細胞の鉄取込みに関係している[ケナード(Kennard，M .L.)ら：EMBO J．14，4178-4186(1995)]。ｐ９７には２つの形態が存在し、その一方はグリコシル-ホスファチジルイノシトールアンカーによって細胞表面に結合し、他方は活性に分泌される[フッド(Food，M.R.)ら：J．Biol ．Chem．269，3034-3040(1994)]。最近の研究において、ｐ９７およびトランスフェリン受容体(ＴＲ)は、ヒト脳の毛細管内皮に高度に局在化されていることがわかった。一方、トランスフェリン(Tf)それ自体は主にグリア細胞に局在化されていることがわかった[ローテンベーガー(Rothenberger，S.)ら：Brain Res．71 2，117-121(1996)]。また、ｐ９７は、ＡＤ患者からの死後脳組織においてアミロイド斑に関係した反応性小グリア細胞において特異的に発現されることが示された[ジェフリーズ(Jefferies，W.A.)ら：Brain Res．712，122-126(1996)]。老人性ＡＤ斑に関係しない他の全ての小グリア細胞および他の神経病(パーキンソン病、進行性核上性麻痺、ハンチントン病および筋萎縮性側索硬化症)からの脳組織において見出される小グリア細胞は、検出しうる量のｐ９７を発現しなかった。発明の要約本発明者らは、健康な個体に比べてアルツハイマー患者の血清および脳脊髄液 (CSF)において、可溶性形態の鉄結合タンパク質ｐ９７が有意に増加することを具体的に示した。アルツハイマー患者からの試料中のｐ９７量は、健康な個体からの試料中のｐ９７量と比較すると、首尾一貫して高いと測定された。また本発明者らは、病気期間が長くなるにつれて血清中のｐ９７量が増加することを有意に示した。さらに、ｐ９７量は、ＡＤの症状が観察されるほぼ２年前に増加し始めるようであった。ｐ９７の特異的な定量はこの病気に罹患している対象の同定を可能にし、これを用いてこの病気の開始および長期の進行をモニターすることができる。これらの発見の結果として、本発明者らは、この病気の評価および管理の両方において価値のある手段となる体液中のＡＤを検出するための簡単かつ信頼性ある試験を設計した。本発明を用いるＡＤの早期診断は、アルツハイマー患者の適切な看護のための計画を立てるより多くの時間を家族に与え、アルツハイマーの症状に類似した症状(例えば、うつ病または発作)の可能性を排除する。本発明の方法を用いて、ADの新しい治療方法の効果をモニターすることができる。ＡＤの治療用に開発された多くの薬物が存在するが、これら薬物の効果を調べる安価かつ迅速な方法は存在しない。現在の臨床試験は、複雑かつ労力のいる集中的な神経行動的評価によって効果を測定しようとするものである。広く言うと、本発明は、患者からの体液試料中のｐ９７を定量することによってアルツハイマー病を診断する方法であって、以下の工程： (a)アルツハイマー病に罹患していることが疑われる患者から体液試料を採取することにより試験試料を得； (b)試験試料中のｐ９７の量を測定し；そして (c)試験試料中のｐ９７の量を、対照試料中のｐ９７の量と比較する；からなり、対照試料中のｐ９７の量と比較して増加している試験試料中のｐ９７の量の存在をアルツハイマー病の可能性の指標とする方法に関する。また本発明は、アルツハイマー病に罹患している患者からの体液試料中のｐ９７を定量することによってアルツハイマー病の進行をモニターする方法であって、以下の工程： (a)アルツハイマー病に罹患している患者から体液試料を採取することにより試験試料を得； (b)試験試料中のｐ９７の量を測定し；そして (c)試験試料中のｐ９７の量を、先に患者から採取した第１の試験試料中のｐ９７の量と比較する；からなり、第１の試験試料中のｐ９７の量と比較して増加している試験試料中のｐ９７の量の存在を、患者のアルツハイマー病の進行の指標とする方法に関する。さらに本発明は、アルツハイマー病に罹患している患者からの体液試料中のｐ９７を定量することによってアルツハイマー病の治療をモニターする方法であって、以下の工程： (a)アルツハイマー病の治療を受けている患者から体液試料を採取することにより試験試料を得； (b)試験試料中のｐ９７の量を測定し；そして (c)試験試料中のｐ９７の量を、治療前に患者から採取した治療前試料中のｐ９７の量と比較する；からなり、治療前試料中のｐ９７の量と比較したときの試験試料中のｐ９７の量の差異を、治療効果の指標とする方法に関する。また本発明は、試験試料中のｐ９７の存在を検出する反応物質およびｐ９７の存在を検出するのに必要な全ての試薬、および本発明の方法の実施に有用な適当な支持材を含む、本発明の方法の実施に有用なキットをさらに意図するものである。本発明のこれらおよび他の態様は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照することによって明確になるであろう。さらに本明細書において、種々の特許文献および出版物に言及が為されているが、これらの全てが本明細書の一部を構成するものとする。図面の簡単な説明図１は、ｐ９７標準の検量線である。図２は、年齢に基づくアルツハイマー病患者と対照の血清ｐ９７量の比較を示すグラフである。図３は、病気期間に基づくアルツハイマー病患者と対照の血清ｐ９７量の比較を示すグラフである。図４は、年齢に基づくアルツハイマー病患者と対照の血清トランスフェリン量の比較を示すグラフである。図５は、ＡＤ対象および対照の血清ｐ９７濃度を、対象の年齢で比較するグラフである。図６は、ＡＤ患者の血清ｐ９７濃度を、患者に初めてＡＤの症状が観察されてからの期間で比較するグラフである。図７は、ＡＤ対象および対照の血清トランスフェリン濃度を、対象の年齢で比較するグラフである。図８は、ＡＤおよび配偶者対照のペアーの血清ｐ９７濃度の比を示す棒グラフである。発明の詳細な説明本発明は、患者からの体液試料中のｐ９７を定量することによって、患者のアルツハイマー病を診断およびモニターするための方法を提供するものである。本方法は、患者から体液試験試料を採取することを包含する。「患者」なる用語は、アルツハイマー病に罹患しているか、またはアルツハイマー病に罹患していることが疑われる哺乳動物などの温血動物、好ましくはヒト個体を意味する。この患者は知覚損傷を示していても示していなくてもよく、また、この患者はADの治療を受けていてもよい。広くは、本発明の診断方法を用いて、どのようなAD症状をも示していない個体がADを発症する傾向または可能性を有するか否かを測定する。試験試料は、例えば血清、リンパ、胆汁、痰または脳脊髄液を含む種々の体液から採取することができる。また、血球、好ましくは単球などの細胞試料を試験試料として用いることもできる。特に、ｐ９７を発現する活性化されたマクロファージを検定することができる。好ましくは、試験試料は血清またはCSFから、最も好ましくは血清から得る。試験試料は既知の方法を用いて採取する。特に好ましい態様においては、血清試料を患者から採取する。試料は使用前に保存および凍結(例えば、−８０℃で)することができ、そのままおよび／または希釈して、例えばパンデックス(Pandex)緩衝液(０.１％NaH₃および１.０％w/v B SAを含むDNEM)中の５０％ v/vウシ胎児血清(FCA)で希釈して用いることができる。試験試料におけるｐ９７の定量を可能にする反応物質を用いて試験試料においてｐ９７を定量する。この反応物質は、試験試料中のｐ９７を認識および結合するものであるのが好ましい。本発明の態様においては、この反応物質は抗体である。本明細書において用いる「抗体」なる用語には、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体；ｐ９７と反応する１を越える抗体の混合物(例えば、ｐ９７と反応する別種モノクローナル抗体のカクテル)；全抗体；その生物学的に機能的なフラグメント(この抗体フラグメントはｐ９７に十分に結合する)；および１を越える種からの部分を含むキメラ抗体；二官能性の抗体；および４量体化抗体が含まれる。通常の方法を用いて抗体を調製することができる。例えば、ｐ９７のペプチドを用い、常法を用いて、ポリクローナル抗血清またはモノクローナル抗体を作成することができる。哺乳動物において抗体反応を誘導する免疫原形態のペプチドを用いて、哺乳動物(例えば、マウス、ハムスターまたはウサギ)を免疫することができる。ペプチドに免疫原性を付与するための方法には、キャリアーへのコンジュゲート化または当分野で周知の他の方法が含まれる。例えば、アジュバントの存在下にペプチドを投与することができる。血漿または血清中の抗体力価の検出によって、免疫化の進行をモニターすることができる。通常のELISAまたは他の免疫検定法を抗原としての免疫原とともに用いて、抗体量を評価することができる。免疫化の後に、抗血清を得ることができ、所望により、血清からポリクローナル抗体を単離することができる。モノクローナル抗体を調製するためには、抗体産生細胞(リンパ球)を免疫化動物から集め、通常の体細胞融合法によってミエローマ細胞と融合させ、このようにしてこれら細胞を永続性にし、ハイブリドーマ細胞を得ることができる。このような方法は当分野で周知である[例えば、コーラー(Kohler)およびミルスタイン(Milstein)：Nature 256，495-497(1975)によって最初に開発されたハイブリドーマ法]。また、他の方法、例えばヒトＢ細胞ハイブリドーマ法[コズボー(Koz bor)ら：Immunol．Today 4，72(1983)],．ヒトモノクローナル抗体を調製するためのEBV-ハイブリドーマ法[コール(Cole)ら：癌治療におけるモノクローナル抗体(1985)、アレン・アール・ブリス社(Allen R．Bliss，Inc.)、77-96頁]、および組合せ抗体ライブラリーのスクリーニング[ヒューズ(Huse)ら：Science 246， 1275(1989)]も周知である。ｐ９７と特異的に反応する抗体を調製するためにハイブリドーマ細胞を免疫化学的にスクリーニングすることができ、モノクローナル抗体を単離することができる。別法によれば、SCID-huマウス、例えばジェンファーム(Genpharm)によって開発されたモデルを用いて、ｐ９７と反応する抗体またはそのフラグメントを調製することができる。また、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)などの寄託機関または実験室を含む種々の供給元から抗体を入手することもできる。例えば、抗ｐ９７マウスモノクローナル抗体HybC(33B 6E4)は、シュエン−クエイ・リアオ(Shuen-Kuei Liao)博士[マクマスター大学(M cMaster University，Hamilton，ON]から入手することができ、抗ｐ９７モノクローナル抗体９B6は、バイオテクノロジー・ラボラトリー(Biotechnology Labor atory)[UBC，BC，カナダ]から入手することができ、抗ｐ９７マウスモノクローナル抗体L235は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手することができる[ATCC-HB8446 L235(H-19)]。試験試料中のｐ９７を認識および結合し、試料中のその存在の定量を可能にする種々の他の反応物質を、本発明の方法において使用することができる。例えば、トランスフェリン受容体がｐ９７に結合し、これを用いて試験試料中のｐ９７を定量することができる。さらに、ｐ９７は鉄および他の金属に結合し、これを用いて通常の方法で試験試料中のｐ９７を定量することができる[鉄結合検定を記載する1994年１月20日にＷＯ94／01463として公開されたPCT／CA93／00272を参照]。本発明の方法において用いる反応物質を、検出可能な物質を用いて検出可能にラベルすることができるか、またはこれらを後に検出可能にラベルすることができる。検出可能な物質の例には、種々の酵素、蛍光物質、発光物質および放射活性物質が含まれる。適当な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ビオチン、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが含まれ、適当な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリスリンが含まれ、発光物質の例には、ルミノールが含まれ、適当な放射活性物質の例には、放射活性ヨウ素Ｉ¹²⁵、Ｉ¹³¹、または三重水素が含まれる。本発明の方法において用いる反応物質を、例えば、この反応物質を認識および結合する物質を用いて、後に検出可能にラベルすることができる。例示すると、反応物質が抗体(例えば、マウスIgG抗体)であるときには、この反応物質に反応性である第２の抗体(例えば、ウサギ抗マウスγ-グロブリン；これを本明細書中に記載したような検出可能な物質でラベルする)を用いて該反応物質を検出することができ、これによりｐ９７の定量が可能になる。抗体である反応物質を用いて、ｐ９７の抗原決定基と抗体の間の結合相互作用に依存する既知の免疫検定において、ｐ９７を検出および定量することができる。このような検定の例は、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ(例えば、ELISA)、免疫蛍光法、免疫沈降法、ラテックス凝集法、血球凝集法、対向流免疫電気泳動法(CIEP)、放射免疫沈降法、ドット・ブロット検定法、阻害または競合検定法およびサンドイッチ検定法である。好ましい態様においては、迅速な免疫蛍光法[例えば、ジョリー(Jolley)ら[J ．Immunol．Meth．67，21-35]に記載されている「粒子濃縮蛍光免疫検定法」(PC FIA)]に基づく検定を用いて試料中のｐ９７量を測定または定量する。この方法は、ミクロン以下のポリスチレンビーズに結合させた捕捉抗体(Ab)を用いる。この「活性化された」固相は、所望のタンパク質の特異的な吸収性物質として作用する。次いで、蛍光ラベルされた第２のAb(これもタンパク質に対して特異的である)を固体の捕捉相とともにインキュベートして、蛍光シグナルが元のタンパク質濃度に比例する複合体を形成させる。この反応は、特別に設計された９６ウエルのプレート[カタログ22-400-1；インデックス・ラボラトリーズ社(Indexx L aboratories Inc.，Wesbrook，ME)]において行うことができる。それぞれのウエルは０.２２μｍの酢酸セルロース膜を持ち、これが真空下でのウエルの排出を可能にし、各ウエルの基部における蛍光複合体の濃縮を可能にする。このプレートを洗浄し、パンデックス(Pandex)蛍光濃度分析器(FCA；Indexx)を用いて種々の波長で各ウエルの蛍光を読み取ることができる。この検定に用いる活性化されたビーズは、抗ｐ９７抗体を用いてカルボキシポリスチレン粒子(０.７７μｍ、０.２５％ v/v；Indexx)を被覆することによって調製することができる。適当な抗ｐ９７抗体には、抗ｐ９７マウスモノクローナル抗体HybC[33B6E4；シュエン-クエイ・リアオ博士、マクマスター大学(McMaste r University，Hamilton，ON)]、9B6[ウィルフ・ジェフリーズ(Wilf Jefferies) 博士、バイオテクノロジー・ラボラトリー(Biotechnology Laboratory，UBC，BC )]、または抗ｐ９７ウサギ抗血清[ウィルフ・ジェフリーズ博士、バイオテクノロジー・ラボラトリー]が含まれる。蛍光ラベルされた第２の抗体は、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)でフルオレセイン処理した抗ｐ９７マウスモノクローナル抗体Ｌ２３５[ＡＴＣＣ- ＨＢ８４４６Ｌ２３５(Ｈ-１９)]または抗ｐ９７ウサギ抗血清[ウィルフ・ジェフリーズ博士、バイオテクノロジー・ラボラトリー]を用いて調製することができる。ｐ９７標準はｐ９７から、例えば、免疫アフィニティークロマトグラフィーによって、ホスファチジルイノシトールホスホリパーゼＣ(ＰＩ−ＰＬＣ)処理したチャイニーズ・ハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞(ヒトｐ９７によってトランスフェクションした)の上清から精製したｐ９７から調製することができる。特に好ましい態様においては、血清ｐ９７検定を特別の９６ウエルプレート(2 2-401-1；Indexx)において行い、蛍光をFCA(Indexx)において読み取る。５０％F CA溶液で適切に希釈した血清試料(６０μl)を、９６ウエルプレートのウエルに添加してよい。ｐ９７標準を、検量線作成のために使用することができる。実例の検量線作成を表１に示し、検量線を図１に示す。本発明者らは、アルツハイマー病の症状が観察される約２年前にｐ９７量が増加し始めることを見出した。従って、本発明の方法を用いて、アルツハイマー病の臨床的に明確な症状を持たない患者において、アルツハイマー病またはアルツハイマー病を発症する可能性を診断することができ、これによって、この病気を早期に予想することができる。アルツハイマー病を診断するために、患者の試料中のｐ９７の濃度を、健康な対象からの対照試料中のｐ９７の濃度範囲（予期および／または回顧の統計学的研究により確かめることができる)と比較することができる。健康な対象は、ＮＩＮＣＤＳ-ＡＤＲＤＡ基準および／またはＭＭＳ試験の結果に基づいて選択することができる。健康な対象は、臨床的に明らかな知覚損傷または他の臨床的もしくは病理学的な問題を持たないのが好ましい。また、同一の患者について以前に定量された量と比較してｐ９７量の増加を見出すことによって、診断を行うこともできる。対照と比較したときの試験試料中のｐ９７量の増加は、患者がアルツハイマー病に罹患しているかまたはアルツハイマー病を発症する可能性を有することを示すものである。例示すると、代表数の対照の血清中のｐ９７量を測定し、平均ｐ９７量を求めるか、またはｐ９７量を図５に示すように対象の年齢に対してプロットし、回帰線またはベースライン(図５において)を対照に対して設定する。この平均またはベースラインを越えるｐ９７量を含む試験試料は、アルツハイマー病またはアルツハイマー病の可能性の指標である。一般に、対照の血清中のｐ９７量の１.５倍またはそれ以上、特に２倍またはそれ以上、好ましくは２〜９倍に増加しているアルツハイマー病患者からの試料中のｐ９７量が、アルツハイマー病の可能性の指標である。血清中のｐ９７量は、病気の進行とともに増加することがわかった(図３および図６を参照)。従って、患者におけるアルツハイマー病の進行をモニターするために、患者からの試料中のｐ９７の濃度を、本明細書中に記載したように、同一患者からの以前の試料のｐ９７量と比較することができる。また、試験試料におけるｐ９７量を、本明細書中に記載したように、対照から得た量または他のアルツハイマー病患者から得た量と比較することによって、この病気の段階の進行および評価を調べることができる。この後者の比較は、体液試料中のｐ９７量とこの病気の進行の間の直線的な関係に基づいている。例示すると、患者からの試料中のｐ９７量を定量し、標準曲線(例えば、図６に示すグラフ)から推定することによって、患者における病気の段階を測定することができる。また、本発明の方法を用いて、アルツハイマー病の治療の効果を患者においてモニターまたは評価することができる。試料を治療前、治療中および／または治療後に採取し、試料中のｐ９７の濃度に及ぼす治療の影響によって治療効果を測定することができる。有効な治療は、対照に比べて試料中のｐ９７の量を低下させる結果を与える治療であると予想される。アルツハイマー病のあらゆる種類の治療の効果、特にアルツハイマー病の治療において効果を有すると推定される医薬組成物の使用の効果をモニターするために本方法を用いることが意図されている。アルツハイマー病の治療にある種の効果を有する医薬組成物の例には、コリン作動性の機能を回復または置換する物質、例えば、タクリン、コリン、レシチン、フペルジン(huperzine)ＡおよびＢ、ガランタミン(galanthamine)、メタンスルホニルフルオリド、フィゾスチグミンおよびデプレニル(deprenyl)が含まれる。本発明の方法を適用してｐ９７を定量するのに適する試薬を、通常のキットにパックして必要な原材料を適当な容器中にパックすることができる。例えば、このようなキットは、ｐ９７と反応する抗体、および本明細書中に記載した方法により試料中に存在するｐ９７と結合した抗体を定量するための必要な試薬を含むことができる。また、このキットは、本発明の方法を実施するのに有用な適当な支持体を含んでいてもよい。実施例以下に挙げる実施例は、本発明者らが行ったアルツハイマー病患者および対照の試料中のｐ９７の定量ならびにこのような定量の意味を説明するものである。これら実施例は例示の目的で挙げたものであり、限定のためのものではない。実施例１アルツハイマー患者の血清中のｐ９７量に関する研究ヒト血清中のｐ９７量を測定するための検定を、1984年に紹介された迅速免疫蛍光法「粒子濃縮蛍光イムノアッセイ(PCFIA)」[ジョリー(Jolley)ら：J．Immuno l．Meth．67，21-35(1984)]に基づいて開発した。この方法は、ミクロン以下のポリスチレンビーズに結合させた捕捉抗体(Ab)を用いる。この「活性化された」固相は、所望のタンパク質の特異的な吸収物質として作用する。次いで、蛍光ラベルした第２のAb(これもタンパク質に対して特異的である)を固体の捕捉相とともにインキュベートして、蛍光シグナルが元のタンパク質濃度に比例する複合体を形成させた。反応は、特別に設計された９６ウエルプレート[カタログ22-400- 1；インデックス・ラボラトリーズ社]において行った。それぞれのウエルは０.２２μｍの酢酸セルロース膜を持ち、これが真空下でのウエルの排出を可能にし、各ウエルの基部に蛍光複合体を濃縮させた。次いで、これらプレートを洗浄し、各ウエルの蛍光をパンデックス(Pandex)蛍光濃度分析器(FCA；インデックス社)を用いて種々の波長で読み取った。この検定に用いる活性化されたビーズは、以下の抗体、即ち、抗ｐ９７マウスモノクローナル抗体HybC[33B6E4；シュエン-クエイ・リアオ博士、マクマスター大学]、９B6[ウィルフ・ジェフリーズ博士、バイオテクノロジー・ラボラトリー ]、または抗ｐ９７ウサギ抗血清[ウィルフ・ジェフリーズ博士、バイオテクノロジー・ラボラトリー]を用いてカルボキシボリスチレン粒子(０.７７μｍ、０.２５％ v/v；インデックス社)を被覆することによって調製した。粒子(１ml)を１分間撹拌および音波処理し、これを遠心し、０.１Ｍ MES[２−(４−モルホリノ) エタンスルホン酸]緩衝液(pH4.5)(８ml)に再懸濁した。これに、EDC[１−エチル −３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド](５.０mg)を加え、次いで１mg／mlの抗体(１ml)を加えた。混合物を定期的に撹拌し、室温で一晩インキュベートし、６０００rpmで10分間遠心し[ソーバル(Sorval)HB4]ビーズを、０.２％アジ化ナトリウム(NaN₃)および２％ w/vウシ血清アルブミン(BSA)を含むリン酸緩衝食塩水(PBS)(２０ml)に再懸濁した。次いで、ビーズを６０００rpmで10分間遠心し、被覆されたビーズを、0.2％ NaN₃および２％ BSAを含むPBS(３２ml) 中、4℃で保存した。蛍光ラベルされた第２の抗体は、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)でフルオレセイン処理した抗ｐ９７マウスモノクローナル抗体Ｌ２３５[ＡＴＣＣ- ＨＢ８４４６Ｌ２３５(Ｈ-１９)]または抗ｐ９７ウサギ抗血清[ウィルフ・ジェフリーズ博士、バイオテクノロジー・ラボラトリー]を用いて、以下のように調製した。FITCを、１mg／mlでリン酸緩衝液(pH９.５)(０.１５Ｍ Na₂HPO₄)に加えた。アジドの非存在下に、４mg／mlの抗体(０.５ml)をFITC溶液(１mg／mlのFITC 溶液０.１５ml)に加え、室温で一晩、暗所でインキュベートした。フルオレセイン処理したAbをすぐ使えるように調製し、4℃で保存した。ｐ９７標準は、ホスファチジルイノシトールホスホリパーゼＣ(ＰＩ-ＰＬＣ) 処理したチャイニーズ・ハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞(ヒトｐ９７によってトランスフェクションした)の上清から免疫アフィニティークロマトグラフィーによって精製したｐ９７から調製した。約１０⁹個のトランスフェクションしたCHO細胞を、３７℃で１時間、PBS中の３００ｍＵ／ml PI-PLC(１ml)で処理した。遠心によって細胞から上清を回収し、０.２μｍの膜で濾過した。次いで、この上清を、アフィゲル(Affi-Gel)１０[バイオ-ラッド(Bio-Rad，Mississauga，ONT)]上に固定したＡｂ(HybC)のカラム(１×１０)にかけた。このカラムは、予めpH７. ２のPBSで洗浄し、再生しておいた。結合したｐ９７を、０.１Ｍクエン酸(pH３. ０)で溶離し、次いで１Ｍトリス-HCI(pH９.０)を用いて中和した。精製したｐ９７を、３０,０００Mｗの限外濾過膜を用いて濃縮した。PBSに対して透析し、滅菌濾過した。標準ｐ９７の濃度を、２８０nmで１％＝１２.０cm^-1のｐ９７の吸光係数を用いて測定した[ベーカー(Baker)ら、1992]。血清試料は次のようにして調製した。それぞれの患者について、以下の試料を採取した：(a)−２０℃で保存した血清試料、および(b)４℃で保存した新鮮血液。試料を試験する前に、新鮮血液を遠心し、血清を回収した。両方の試料を、そのままで、および／またはパンデックス緩衝液(０.１％ NaH₃および１.０％ w/v BSAを含むDNEM)中の５０％ v/vウシ胎児血清(FCA)で希釈して試験した。以下のように、血清ｐ９７検定を特別の９６ウエルプレート(22-401-1；インデックス社)において行い、蛍光をFCA（インデックス社）において読み取った。５０％ FCA溶液で適切に希釈した血清試料(６０μl)を、９６ウエルプレートのウエルに添加した。それぞれの試料を２重または３重に試験した。また、各プレートに、ｐ９７標準を２重に添加した(３００、１５０、１２０、９０、６０、３０、１５、９、６ng／ml)。これら標準を５０％ FCA溶液で希釈し、検量線作成用に用いた。実例の検量線作成を表１に示し、検量線を図１に示す。抗ｐ９７被覆ビーズ(〜２５μg Ab／ml)(２０μl)を各試料に加え、室温で４０分間インキュベートした。９６ウエルプレートの側面を軽くたたくことによって、ウエルの内容物を穏やかに混合した。インキュベート後に、フルオレセイン処理した第２の抗ｐ９７Ab[パンデックス緩衝液で１／７５希釈(約２５〜４０μg／ ml)](２０μl)を試料およびビーズに加え、室温で５〜１０分間インキュベートした。次いで、プレートをFCA中に置き、排出し、０.１％ NaH₃および１％w/v B SAを含むPBSで３〜５回洗浄した。次いで、排出したプレートを、２５×増加の４８５／５３５nmフィルター対を用いて読み取った。血清試料を、アルツハイマー(AD)患者、配偶者対照および無関係対照から得た。表２は、ＡＤ患者におけるｐ９７血清濃度の結果を示すものである。病気の期間は、症状の診断からの年数を示す。しかし、個々の患者が診断のしばらく前からこの病気に罹患していた可能性もある。表３は、ＡＤ患者および対照の試料におけるｐ９７血清濃度を示すものである。無関係対照の血清中のｐ９７量は２．４〜１２ng／mlの範囲であり、この量は対象の年齢に従って増加しないことが見出された(図２)。図２に示すように、ＡＤ患者の血清中のｐ９７量は対照に比べて有意に増加し、この量は患者の年齢に従って増加するようであった。AD患者は、少なくとも２０ng／mlの血清中のｐ９７量を有していた。見出された最大量は３００ng／mlであった。重要なことは、図３に示すように、血清ｐ９７量がAD患者の病気期間に関係していることが見出されたことである。より長い病気期間を有する患者の血清において、ｐ９７量の一層の増加が見出された。また、血清トランスフェリン量もAD患者および対照からの試料において測定した。AD患者と対照の血清トランスフェリン量の間に明瞭な差異は見出されず、対象の年齢と血清トランスフェリン量の間に関係は見出されなかった(図４)。さらに、予め日本のAD患者および対照の群から得ていたCSFおよび血清試料において、トランスフェリンおよびｐ９７量を測定した。これらの試料は２年間凍結させ、解凍したものであり、従って、現在のタンパク質量は試料に最初に存在していた絶対量を示さないかもしれない。しかし、表４に示す結果は、ｐ９７量が対照の量に比べてAD患者の血清において増加するという上記知見を確認するものであった。また、結果は、CSF中のｐ９７量が対照に比べてAD患者において増加することを示した。AD患者の血清およびCSF中のトランスフェリン量は、対照の量を越えて増加することはなかった。実施例２実施例１において示した研究のさらに完全な説明および議論をこの実施例２に挙げる。以下の原材料および方法を実施例２で説明する研究に用いた。カナダ人対象 AD(Ｎ＝２７)対象を、バンクーバー病院のアルツハイマー病および関連の疾患のためのUBCクリニックの臨床試験プログラムに参加している者から選択した。全てのAD対象が、NINCDS-ADRDA基準に従って「臨床的に可能性が高い」と診断されていた。知覚症候の概算期間を全てのAD対象について調べた。対象は、この研究のときに実験的治療を受けていなかった。健康なボランティア(Ｎ＝１５)または配偶者介護者(Ｎ＝１０)からランダムに選択した対照は、臨床的に明らかな有意の知覚損傷を示さなかった。２種類の研究を行った。即ち、(a)血清試料を静脈穿刺の直後に４℃で保存し、２４時間以内にTfおよびｐ９７を測定した。５１〜８２.５歳(６６.４±１７. ５２歳)の範囲の年齢の１７人のAD対象(女性１０人、男性７人)を、２８〜７６歳(５２.３３±１６.５歳)の範囲の年齢の１５人の対照(女性６人、男性９人)と比較した。(b)配偶者のペアー(Ｎ＝１０ペアー)から採取した血清試料を静脈穿刺の直後に−２０℃で凍結させて保存した。同時に配偶者ペアーから試料を採取し、凍結し、次いで同時に分析した。５４〜８６歳(７０.６±１０.４７歳)の範囲の年齢のAD患者(女性７人、男性３人)を、５３〜８４歳(６９.９±１０.２１歳)の範囲の年齢のこれらＡＤ患者の非AD配偶者(女性３人、男性７人)と比較した。日本人対象６１〜８０歳(７１.５±６.５２歳)の範囲の年齢の８人のAD対象(女性６人、男性２人)を試験し、５７〜７２歳(６６.５７±６.４歳)の範囲の年齢の７人の対照(女性４人、男性３人)と比較した。AD対象および対照からの血清およびCSF 試料は、千葉大学医学部神経学科から入手した。全てのAD対象が、NINCDS-ADRDA 基準に従って「臨床的に可能性が高い」と診断された。対照は、以下の神経病に罹患している年配の対象から採用した：パーキンソン病１人、旧小脳退行症２人、筋萎縮性側索硬化症１人、頚部脊椎症２人および末梢神経障害１人。血清およびCSF試料を採取直後に−２０℃で凍結させ、分析前にまとめて同じように解凍した。ｐ９７検定試料をそのままで、および０.１％アジ化ナトリウムおよび１.０％ w/vウシ血清アルブミンを含むDMEM中の５０％ v/vウシ胎児血清で希釈して試験した。抗ｐ９７マウス抗体HybCを用いてカルボキシポリスチレン(０.７７μm)捕捉粒子を被覆し、抗ｐ９７マウスモノクローナル抗体Ｌ２３５[ATCC-HB8446L235(H-19)]をフルオレセイン処理した[ケナード(Kennard，M.L.)：EMBO J．14，4178-4186(19 95)]。ｐ９７標準は、３００〜１ng／mlの範囲でウシ胎児血清を含むDMEM緩衝液中で新たに調製した。検定は、試料および標準(６０μl)を捕捉粒子(〜２５μg 抗体／ml)(２０μl)と特殊な９６ウエルプレート中で混合し、室温で４０分間インキュベートすることからなっていた。次に、フルオレセイン処理した第２の抗体(約２５〜４０μg／ml)(２０μl)を加え、混合物を室温でさらに５〜１０分間インキュベートした。次いで、プレートを「パンデックス蛍光濃度分析器」［ジョリー(Jolley，M.J.)：Immunol．Methods 67，21-35(1984)]中に置き、排水し、０.１％アジ化ナトリウムおよび１.０％ウシ血清アルブミンを含むPBSで４回洗浄した。次いで、排水したプレートを、２５×増加の４８５／５３５フィルター対で読み取った。蛍光をｐ９７濃度と関係付けるｐ９７標準から作成した検量線からｐ９７濃度を決定した。全ての試料を種々の希釈において３重に試験し、濃度を全ての結果から平均した。トランスフェリン検定この検定は、上記の「粒子濃縮蛍光イムノアッセイ」に基づいた。抗ヒトトランスフェリンヤギ抗血清を捕捉粒子に被覆し、抗ヒトトランスフェリンヒツジ抗血清をフルオレセイン処理した。トランスフェリン標準を、３〜０.５μg／mlの範囲で新たに調製した。全ての試料を種々の希釈において３重に試験し、濃度を全ての結果から平均した。ヒト体液中のｐ９７濃度をモニターすることができる定量検定法を開発した。この検定は、ミクロン以下のポリスチレンビーズに結合させた捕捉抗体と蛍光ラベルした２次抗体を用いる迅速な免疫蛍光法である「粒子濃縮蛍光イムノアッセイ」に基づいていた[ケナード(Kennard，M.L.)ら：Biotech．Bioeng．42，480-4 86(1993)]。改良型のサンドイッチ検定を、０.２２μｍの酢酸セルロース膜を含む特別に設計された９６ウエルプレートにおいて行った。このウエルを真空下に排出することができ、各ウエルの基部に蛍光複合体を濃縮することができる。このプレートを洗浄し、各ウエルの蛍光を読み取ることができる(ここで、蛍光はｐ９７濃度に比例する)。ｐ９７がヒト血清中で部分的に不安定であり、保存によって抗原性を失うことがわかった。表５は、最初は１００ng／mlで血清中に加えたｐ９７の検出可能な濃度に対する、保存温度および時間の効果を示すものである。ｐ９７は、６０℃で３０分間熱ショックを加えた試料において検出不能になり(驚くべきことに、血清Tfはこの処理によって影響されないようであった)、室温で保存した試料は、４８時間で２０％までの抗原性を失った。しかし、４℃ および−２０℃で保存したときには４８時間にわたり試料は比較的安定であった (しかし、凍結と解凍はｐ９７の検出をさらに低下させた)。これらの理由から、 AD患者からの血清ｐ９７濃度を知覚が正常な対照と比較する研究においては、血清試料を採取直後に４℃で保存し、２４時間以内に試験した。図５は、全てのAD 患者が対照と比較して血清中のｐ９７量が増加しており、重なりがなかったことを示す。AD群の平均ｐ９７濃度(Ｎ＝１７；４３.８±１１.６ng／ml)は、対のｔ -検定に基づいて、対照群の平均(Ｎ＝１５；７.０４±３.２８ng／ml)とは有意に異なっていた(ｔ_0.05＝１２.９６、ｐ＝６.６×１０^-10)。現在までにヒト血液中のｐ９７について他の研究が１つだけ存在するが[ブラウン(Brown，J.P.)ら：Proc．Natl．Acad．Sci．USA 78，539-543(1981)]、このときにはｐ９７は１. ３〜２.７ng／mlの範囲で検出された。対照群の平均年齢(５２.３±１６.５歳) はAD群の平均年齢(６６.４±１７.５２歳)よりも若いが、直線回帰は、ｐ９７血清濃度と対象年齢の間に有意の相関関係は存在しないことを示した(AD患者：Ｎ＝１７、回帰線の傾き＝０.３５９、Ｒ=０.３０、ｐ＝０.２４９；対照：Ｎ＝15 、回帰線の傾き＝−０.０７、Ｒ＝−０.３５、ｐ＝０.１９７)。さらに、AD患者のデータを、ADの症状が患者に初めて観察されてからの期間に対してプロットしたときに(図６)、直線回帰は、ｐ９７血清濃度の増加と病気の進行の間に有意の関係が存在することを示した(Ｎ＝１７、回帰線の傾き＝３.３、Ｒ＝０.８２、ｐ＝０.０００３)。最後に、対照の最大ｐ９７濃度への直線回帰の外挿は、ｐ９７濃度が、ADの症状が観察される約２年前から増加し始めることを示唆した。ｐ９７がADにおいて非特異的に増加する可能性を排除するために、別の血液鉄結合タンパク質であるトランスフェリン(Tf)をAD患者および対照の血清において分析した。図７は、両集団のTf濃度の間にほとんど差がなかったことを示す。AD 群の平均Tf濃度(Ｎ＝１７；１.８１±０.７１mg／ml)は、対のｔ-検定に基づいて、対照群の平均(Ｎ＝１５；１.９３±０.７８mg／ml)とは有意に異なっていなかった(ｔ_0.05＝０.４１、ｐ＝０.６９)。別の研究において、AD患者からのｐ９７の血清量を該AD患者の知覚的に正常な配偶者と比較することにより、血清中のｐ９７濃度に対して、食事、ライフスタイルまたはある種の他の共通因子の作用が存在するか否かを調べた。この場合、血清試料は採取直後に−２０℃で凍結させた。図８は、１０組のAD患者(７０.６ ±１０.４７歳)とその配偶者対照(６９.９±１０.２１歳)からの血清ｐ９７量の比を比較するものである。全ての場合において、AD患者のｐ９７血清量はその配偶者対照に比べて増加しており、１.６〜３２.５(平均１０.１７±９.０８)の範囲の比を有していた。この知見は、環境因子は恐らくAD患者のｐ９７血清量の増加の原因とはならないことの証拠を与えるものである。血清およびCSF中のｐ９７およびトランスフェリン量第３の研究において、日本人のAD患者および対照からの血清およびCSFの両方の凍結試料について、Tfおよびｐ９７を分析した。この研究に用いた対照は、種々の他の神経病に罹患している対象であり、ｐ９７の血清量が他の神経退行性疾患において増加しているか否かを調べるために試験した。しかし、これらの血清試料は凍結され、分析前にまとめて同じように解凍されたものであり、あいにくｐ９７検出が低下していた。それにもかかわらず、表６において見ることができるように、いくつかの観察は注目するに値した。ｐ９７の平均濃度は、対照(Ｎ＝５；８.４８±４.０２ng／ml；平均年齢６７.２±６.８２歳)と比較して AD患者(Ｎ＝５；２２.４±９.２１ng／ml;平均年齢７２.４±５.９９歳)のCSFにおいて増加していた。これらの濃度は、対のｔ-検定に基づいて有意に相違していた(ｔ_0.05＝２.９０、ｐ＝０.０４４)。また、これは血清中のｐ９７についても言え、ここでは対のt-検定に基づいて、AD群の平均ｐ９７濃度(Ｎ＝４；１１. ３±２.７６ng／ml；平均年齢７４.３±５.６３歳)は対照群の平均(Ｎ＝６；２. ０１±１.７５ng／ml;平均年齢６５.６±６.５２歳)とは有意に相違していた(ｔ_0.05 ＝４.５２、ｐ＝０.０２)。全体の濃度は大きく低下していたが、この結果は図５のデータと一致していた。他の観察を補強すると、ｐ９７濃度は対象の年齢または性別とは関係していないようであった。また、これらのデータは、血清ｐ９７量よりも２〜４倍高いCSFをモニターすることによって、ADの開始および進行に関する有用な情報を得ることができることを示唆する。ｐ９７よりも血清中でさらに安定であるTfの平均濃度は、CSFおよび血清においてADおよび対照の両対象について実質的に同一であった。CSFについては、対のt-検定に基づいて、AD群の平均Tf濃度(Ｎ=８；２０.３５±４.７８μg／ml；平均年齢７１.５±６ .５２歳)は、対照群の平均(Ｎ＝７；１６.０±４.５μg／ml；平均年齢６７.７ ±６.３２歳)とは有意に異なることはなかった(ｔ_0.05＝２．０５、ｐ＝０.１８ )。また血清についても、対のt-検定に基づいて、AD群の平均Tf濃度(Ｎ=４；２. ２４±３.６mg／ml;平均年齢７４.３±５.６３歳)は、対照群の平均(Ｎ＝５；２ .２６±７.０mg／ml；平均年齢６３.４±４.５歳)と有意に異なることがなかった(ｔ_0.05＝０.３８、ｐ＝０.７２)。さらに、血清Tf量がCSF中よりも相当に高く(〜１００倍)、これがｐ９７(これの量は、CSF中よりも血清中の方が低い)とは対照的であることに注意することが重要である。これらのデータは、Tfは脳から活発に排除されるがｐ９７は排除されないようであるので、ｐ９７が脳内で独特の機能を有していることを示唆する。本研究において、関連および無関連の対照に対してAD患者の血清において首尾一貫して増加する生化学的なマーカー分子を同定した。本発明者らは、AD患者と対照の間に重なりがないことを見出した。上記から、本発明の特定の態様を説明の目的で本明細書中に記載したが、本発明の思想および範囲から逸脱することなく種々の修飾を行いうることが理解されよう。従って、本発明は添付の請求の範囲によることを除き限定されるものではない。 *安定性は、時間に対する検出可能なｐ９７の割合(％)変化として示す。 nd＝測定せず。 *NINCDS-ADRADに基づいて臨床的に可能性の高いAD。 nd＝測定せず。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ケナード，マルコムカナダ、ブイ６アール・２ジェイ６、ブリティッシュ・コロンビア、バンクーバー、ウエスト・テンス・アベニュー4660番、アパートメント103

Claims

【特許請求の範囲】１．患者からの体液試料中のｐ９７を定量することによってアルツハイマー病を診断する方法であって、以下の工程： (a)アルツハイマー病に罹患していることが疑われる患者から体液試料を採取することにより試験試料を得； (b)試験試料中のｐ９７の量を測定し；そして (c)試験試料中のｐ９７の量を、対照試料中のｐ９７の量と比較する；からなり、対照試料中のｐ９７の量と比較して増加している試験試料中のｐ９７の量の存在をアルツハイマー病の可能性の指標とする方法。２．試験試料中のｐ９７の量が対照試料中のｐ９７の量と比較して１.５倍またはそれ以上に増加していることを、アルツハイマー病の可能性の指標とする請求項１に記載の方法。３．試験試料中のｐ９７の量が対照試料中のｐ９７の量と比較して２〜９倍に増加していることを、アルツハイマー病の可能性の指標とする請求項１に記載の方法。４．工程(c)において、試験試料中のｐ９７の量を、対照試料において測定したｐ９７の平均またはベースライン量と比較する請求項１に記載の方法。５．(c)における対照試料が、同一の患者または別の個体からの正常試料である請求項１に記載の方法。６．アルツハイマー病に罹患している患者からの体液試料中のｐ９７を定量することによってアルツハイマー病の進行をモニターする方法であって、以下の工程： (a)患者から体液試料を採取することにより試験試料を得； (b)試験試料中のｐ９７の量を測定し；そして (c)試験試料中のｐ９７の量を、先に個体から採取した第１の試験試料中のｐ９７の量と比較する；からなり、第１の試験試料中のｐ９７の量と比較して増加している試験試料中のｐ９７の量の存在を、個体のアルツハイマー病の進行の指標とする方法。７．アルツハイマー病に罹患している患者からの体液試料中のｐ９７を定量することによってアルツハイマー病の治療をモニターする方法であって、以下の工程： (a)治療を受けている患者から体液試料を採取することにより試験試料を得； (b)試験試料中のｐ９７の量を測定し；そして (c)試験試料中のｐ９７の量を、治療前に患者から採取した治療前試料中のｐ９７の量と比較する；からなり、治療前試料中のｐ９７の量と比較したときの試験試料中のｐ９７の量の差異を、治療効果の指標とする方法。８．体液が血清またはCSFである請求項１〜７のいずれかに記載の方法。９．工程(b)におけるｐ９７の量がｐ９７に対する抗体を用いて測定される請求項１〜７のいずれかに記載の方法。１０．試験試料中のｐ９７の存在を検出する反応物質およびｐ９７の存在を検出するための試薬を含む、請求項１、６または７のいずれかに記載の方法を実施するためのキット。