KR101250464B1 - 혈장 내 ｐｇｃｐ 농도 측정을 통한 치매 진단 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 혈장 내 존재하는 PGCP의 농도 측정을 통한 치매 진단 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 치매 환자의 혈장 내 PGCP가 정상인군 및 경도인지장애군에 비해 현저히 높은 농도로 존재함을 확인함으로써, 상기 PGCP 단백질을 진단 마커로 이용하여 치매 진단 키트를 구성하고, 이를 이용하여 치매 진단 방법에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

혈장 내 ＰＧＣＰ 농도 측정을 통한 치매 진단 방법{A method for the diagnosis of Alzheimer＇s disease from determination of PGCP concentration in human plasma}

혈장 내 PGCP 농도 측정을 통한 치매 진단 키트, 및 이를 이용한 치매 진단 방법에 관한 것이다.

알츠하이머 질환(Alzheimer's Disease: 이하 "AD"라 칭함)은 진행성 뇌 질환으로, 기억력과 언어력, 그리고 시간과 공간을 인식하는 능력이 점차적으로 감소하여 결국은 혼자서 자신을 돌볼 수 없는 상태가 되는 심각한 질환이다. 1906년에 독일인 의사인 알로이스 알츠하이머에 의해서 처음 기술된 이 병은 처음에는 젊은 사람들에게서만 발생하는 매우 희귀한 질환으로 생각되었으나, 요즘은 65세 이상의 사람들에게서 지적 능력의 소실을 일으키는 가장 흔한 질환이라는 것이 밝혀졌다. 알츠하이머병은 30대, 40대, 50대에서도 발병 가능하나, 전체 알츠하이머병 환자의 10% 정도 이하이고 대부분의 환자들은 60대 이상이 되어서 발생한다. 65세 이전에 발생하는 알츠하이머병은 조발성 알츠하이머병이라고 부르는데, 65세 이후에 발생하는 경우에 비해 유전적 경향이 강하다. 하지만 나이가 들어감에 따라 이 병에 걸릴 가능성은 점차 증가한다. 나이가 들어감에 따라 알츠하이머병의 발생률이 높아지기 때문에, 나이가 들면 당연히 발병하는 그런 병으로 인식되었던 적도 있었지만 알츠하이머 질환은 정상적인 노화와 달리 병적인 퇴행성 뇌신경 변화로 인해 발생하는 것으로 알려져 있다.

AD로 사망한 환자의 두뇌에서 관찰되는 노인성 플라크(senile plaque)와 신경원 섬유의 엉킴(neurofibrillary tangles)이 AD의 병리학적 특성으로 나타난다. 이중 노인성 플라크는 세포 외부에 단백질과 죽은 세포 등이 축적되어 형성되는 것으로, 주 구성 성분은 아밀로이드-베타(Amyloid-β: 이하 "Aβ"라 칭함)라는 펩티드이다(Hardy, J. etal, Nat Neurosci. 1:355-358, 1998). AD 환자의 주요 특징인 인지 작용의 점진적 상실은 비정상적으로 축적된 Aβ에 의해 유발되는 것으로 보이며, Aβ는 아밀로이드 전구 단백질(amyloidprecursor protein: 이하 "APP"라 칭함)로부터 단백질분해(proteolysis) 과정을 통해 생성된다. 전구 물질인 APP가 β-세크레타제(BSCE) 및 γ-세크라타제에 의해분해되어 Aβ가 생성되게 된다(Craven, R.,Nat Rev. Neurosci. 2: 533, 2001; David, H. S. et al., Nat Rev. Neurosci. 2: 595-598, 2001; Yankner, B. A., Neuron 16: 921-932, 1996; Selkoe, D. J., Nature 399: A23-A31, 1999).

알츠하이머성 치매는 치매 중 50 내지 70%를 차지하는 가장 흔한 형태로, 4백만 명의 미국인과 전 세계적으로 거의 15백만 명이 겪고 있는 심각한 질환이다. 알츠하이머 치매는 개인적으로 엄청난 피해와 고통을 주지만, 사회적으로도 많은 문제를 야기하게 되는데, 특히 이 질병의 후기 환자는 그 보호자에게 엄청난 부담을 주게 된다. 상당한 경제적 비용이 보존적 치료(supportive care) 및 수용시설 입원을 통해 사용되게 된다. 사회에서 노인 인구의 비율이 급속하게 증가한다는 것은 AD에 걸리는 환자수가 급격하게 증가한다는 것을 의미하고, 이런 이유로 AD의 조기 진단과 치료법의 발견은 전 세계적으로 중요한 이슈가 되고 있다. 하지만, 다양한 병인으로 일어나는 알츠하이머 질환의 정확한 원인을 결정하는 진단 과정은 매우 난해할 뿐 아니라, 현재 실시되고 있는 검사들로 AD와 다른 유형의 치매를 구별하는 것 또한 어려운 실정이다.

현재 치매의 진단검사에는 MMSE(Mini Mental State Examination)와 같은 정신상태학적 검사 및 CDR(clinical dementia rating)과 같은 신경심리학적 검사 등이 이용되고 있다.

간이정신상태검사인 MMSE는 치매 또는 알콜 중독 등의 병으로 인한 인지능력의 저하 여부를 확인하는 테스트로, 방향감, 회상, 단기기억, 집중력, 구성행동 및 언어능력 등을 측정하는 도구로써, 30점이 만점이고, 보통 18점 이하이면 확정적 치매(분명한 인지기능 장애)로 판단하고, 19 ~ 23 점이면 치매를 의심(경도의 인지기능 장애)하며, 24점 이상이면 정상(인지기능 장애의 인지적 손상 없음)으로 판정한다. 아주 간단하고 시간도 많이 걸리지 않아 편한 반면, 어느 기능이 저하되었는지 정확한 정보를 얻기 위해서는 다른 테스트를 병행해야 하므로, MMSE 검사만으로 치매를 확진하거나 치매 유형을 구별할 수는 없다.

치매 임상 평가 척도인 CDR은 6 가지 지표(기억, 지남력, 판단력 및 문제해결능력, 사회활동, 집안 생활과 취미 및 위생 및 몸치장)로 치매의 단계를 나누는 방법으로, 각 점수에서 0은 치매가 아니고, 0.5는 약간의 인지장애, 1은 경증의 치매, 2는 중증도의 치매, 3은 중증 치매, 4는 심화된 치매 및 5는 말기 치매로 판정한다.

상기 진단 기준을 통해 알츠하이머성 치매 환자는 경도인지장애(Mild Cognitive Impairment), 경증 치매(MILD AD), 중간 치매 및 중증 치매(severe AD)로 나눌 수 있다. 정상인들도 나이가 들면 어느 정도의 기억장애를 겪게 되지만, 알츠하이머 환자들에게 특이적으로 나타나는 성격변화 등의 증상은 나타나지 않게 되는데, 이를 경도인지장애(MCI)라 한다. 경도인지장애는 알츠하이머 질환의 전구증상으로 여겨지고, 단기기억상실, 공간기억상실 및 감정적 불균형으로 특징지어지는데, 이는 다시 몇 단계로분류가 이루어지게 된다. 이중 기억손실과 관련된 MCI를 망각성 MCI(amnestic MCI)라 하는데, 65세 정상인이 특정 기간 안에 알츠하이머성 환자로 변환된 확률이 1 내지 3% 인데 반해, 망각성 MCI를 가진 그룹은 10명 중 8명이 알츠하이머성 환자로 전환되는 것으로 나타나, 망각성 경도인지장애를 가진 경우, 알츠하이머성 치매로 발전할 가능성이 높은 것으로 여겨지고 있다.

다른 질병분야와 비교하여 치매분야에서 조기 진단은 더 중요하다. 그 이유는 현재 가용한 효과적인 치료법이 없기 때문이다. 알츠하이머 질환 치료의 궁극적인 목표는 병 자체를 되돌려서 완치시키고 치매에 의하여 나타나는 인지장애, 정신장애 및 이상 행동증 등을 줄이고 없애는 것이다. 현재 많은 약들이 알츠하이머병의 치료에 사용되는 것처럼 얘기되고 있지만 대부분의 약재들은 아직 약효에 대한 심사과정에 있고, 더욱이 여태까지 나온 모든 약재들은 알츠하이머병의 진행을 약간 늦출 수 있거나 알츠하이머병에 의해 나타나는 증상에 대한 치료를 위하여 만들어진 것이지, 그 어느 것도 알츠하이머병의 근본적인 병 자체를 치료할 수 있도록 고안되고 만들어진 약은 없는 실정이다. 따라서, 알츠하이머 환자를 조기에 구별할 수 있는 간단한 진단 기술이 제공된다면, 질병의 초기 단계에 약물의 투여 등을 통한 빠르고 적절한 치료를 통해, 증상을 완화시키고 발병의 정도를 약화시킬 수 있어, 치매 조기 진단에 대한 연구는 치매의 치료에 있어서 매우 중요하다.

현재까지, 알츠하이머 질환을 초기에 진단하기 위해 많은 연구가 이루어지고 있지만, 아직까지 진단에 유효한 마커는 존재하지 않는다. 최근 혈장내 Aβ-40/-42의 레벨과 다양한 신호조절 단백질이 대조군으로부터 알츠하이머성 치매를 구별하기 위해 사용될 수 있다는 연구결과가 있었고, 몇 가지 프로테옴(proteome)에 기초한 연구에서 대조군과 비교하여 AD 혈장 내에서 α2-매크로글로불린(α2M), 컴플리멘트 팩터 H(CFH) 및 α1-안티트립신(AIAT) 등이 높은 레벨로 존재함이 밝혀져, 이를 이용하여 AD의 진단에 응용 가능한 마커로의 활용이 기대되었다. 하지만, 개별 단백질이나 그들의 조합을 이용한 단백질의 민감도 및 특이도가 MCI 및 AD의 초기 진단에는 매우 불충분하여, MCI 및 AD의 초기 진단을 위한 임상학적으로 유용한 새로운 바이오 마커의 개발이 필요한 상황이다.

인간 혈액의 PGCP(plasma glutamate carboxypeptidase)는 GCP II(glutamate carboxypeptidase II)의 활성부위와 높은 배열 상동성(sequence homology)을 보이는 메탈로프로테이즈(metalloprotease)이다. GCP II는 N-아세틸화 α-결합된 산성 디펩티다아제(NAALADase) 또는 프로스테이트-특이적 막 항원(prostate-specific membrane antigen; PSMA)으로 알려져 있다. 하지만, PGCP는 인간 조직에서 흔히 발현되고, 혈청 내에서 주로 발견되는 당단백질임에도 불구하고, PGCP의 생물학적 기능 및 PGCP의 정확한 생리학적 기질에 대해서는 알려진 바가 전혀 없다.

이에, 본 발명인들은 PGCP를 인지하는 새로운 항체를 개발하고, 이를 이용하여 효소면역측정법(Enzyme-link immunosorbent assay, ELISA)을 수행하여 정상군, 경도인지장애군 및 치매 환자군의 혈장 내 PGCP의 농도를 측정하여, 혈장내 PGCP의 농도가 MMSE와 CDR의 측정에 의한 인지적 기능이 떨어진 치매 환자군에서 현저히 높게 나타남을 확인함으로써, PGCP 단백질을 마커로 이용하여, 특별한 징후 및 증상이 없어 초기 진단이 어려운 알츠하이머성 치매의 진단에 유용하게 이용할 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 혈장 내 PGCP를 마커로 이용한 치매 진단 키트 또는 면역크로마토그래피 스트립을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 키트 또는 면역크로마토그래피 스트립을 이용하여 혈액으로부터 치매를 진단하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항-PGCP(plasma glutamate carboxypepridase) 항체를 함유하는 치매 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은

1) 접착성 지지체;

2) 상기 접착성 플라스틱 지지체의 상부 표면에 부착되어 있는, 분석하고자 하는 피검 시료를 부착하는 검체 패드;

3) 상기 검체 패드와 연동되어 있고, 피검 시료에 함유된 PGCP 단백질과 특이적으로 결합하는 컨쥬게이트를 함유하는 컨쥬게이트 패드;

4) 상기 컨쥬게이트 패드와 연동되어 있고, 상기 컨쥬게이트에 결합하는 단백질이 선형으로 고정된 검출 라인(test line) 및 인간 항체 면역글로불린이 고정된 대조 라인(control line)을 포함하는, 신호검출 패드; 및

5) 신호검출반응이 종료된 피검 시료를 흡수하는, 상기 신호검출 패드의 다운스트림에 위치하는 흡수 패드로 구성된, 치매 진단용 면역크로마토그래피 스트립을 제공한다.

또한, 본 발명은

1) 피검체 유래 혈액을 고체기판에 처리한 후 세척하는 단계;

2) 상기 기판에 항-PGCP 항체를 처리한 후 세척하는 단계; 및

3) 상기 기판 위에 항-PGCP 항체의 부착 정도가 정상인에 비해 증가한 피검체를 치매에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 개체로 판정하는 단계를 포함하는, 치매 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은

1) 피검체 유래 혈액을 항-PGCP 항체가 부착된 고체기판에 처리한 후 세척하는 단계;

2) 상기 기판에 항-PGCP 항체를 처리한 후 세척하는 단계; 및

3) 상기 기판 위에 항-PGCP 항체의 부착 정도가 정상인에 비해 증가한 피검체를 치매에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 개체로 판정하는 단계를 포함하는, 치매 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법을 제공한다.

본 발명은 혈장 내 PGCP(plasma glutamate carboxypeptidase)의 농도가 치매 환자에서 정상인 및 경도인지장애 환자에 비해 현저히 증가되는 것을 확인함으로써, 상기 PGCP를 마커로 이용하여 치매를 진단하는 방법을 제공한다. 따라서 피검체 유래 혈액 내에 존재하는 PGCP를 특이적으로 검출함으로써, 쉽고 간단하게 치매를 진단할 수 있다.

도 1은 정상인, 경도인지장애 및 치매환자의 혈장 내 PGCP 농도분포를 진단그룹별, 성별에 따라 나타낸 그림이다:
A - ELISA로 측정한 결과 그림;
B - 웨스턴 블랏과 이를 정량화한 결과 그림;
C - 닷 블랏 결과 그림;
D - 닷 블랏 결과를 정량화한 결과 그림;
Control - 정상인군;
MCI - 경도인지장애군; 및
AD - 알츠하이머성 치매 환자군.
도 2는 정상인, 경도인지장애 환자 및 치매환자의 혈장 내 PGCP의 농도를 나이 및 MMSE 결과에 따라 나타낸 그림이다:
Control - 정상인군;
MCI - 경도인지장애군; 및
AD - 알츠하이머성 치매 환자군.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 항-PGCP(plasma glutamate carboxypeptidase) 항체를 함유하는 치매 진단용 키트를 제공한다.

상기 항-PGCP 항체는 PGCP 단백질의 주입을 통해 제조된 것 또는 시판되어 구입한 것이 모두 사용 가능하고, 상기 PGCP(plasma glutamate carboxypeptidase)는 인간의 PGCP인 것이 바람직하고, 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 더욱 바람직하다. 또한, 상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 에피토프와 결합할 수 있는 단편 등을 포함한다.

다클론 항체는 상기 PGCP 단백질을 동물에 주사하고 해당 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 종래의 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 당업계에 알려진 어떠한 방법에 의해서든 정제될 수 있고, 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 만들어질 수 있고, 토끼를 숙주로 함이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

단클론 항체는 연속 세포주의 배양을 통한 항체분자의 생성을 제공하는 어떠한 기술을 사용하여도 제조할 수 있다. 이러한 기술로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 하이브리도마 기술, 사람 B-세포 하이브리도마 기술 및 EBV-하이브리도마 기술이 포함된다(Kohler G et al., Nature 256:495-497, 1975; Kozbor D et al ., J Immunol Methods 81:31-42, 1985; Cote RJ et al ., Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030, 1983; 및 Cole SP et al., Mol Cell Biol 62:109-120, 1984).

또한, 상기 PGCP 단백질에 대한 특정 결합 부위를 함유한 항체 단편이 제조될 수 있다. 예를 들면 이들로 한정되는 것은 아니지만 F(ab')2 단편은 항체분자를 펩신으로 분해시켜 제조할 수 있으며, Fab 단편은 F(ab')2 단편의 디설파이드 브릿지를 환원시킴으로써 제조할 수 있다. 다른 방도로서, Fab 발현 라이브러리를 작게하여 원하는 특이성을 갖는 단클론 Fab 단편을 신속하고 간편하게 동정할 수 있다(Huse WD et al ., Science 254: 1275-1281, 1989).

상기 항체는 세척이나 복합체의 분리 등 그 이후의 단계를 용이하게 하기 위해 고형 기질(solid substrate)에 결합될 수 있다. 고형 기질은 예를 들어 합성수지, 니트로셀룰로오스, 유리기판, 금속기판, 유리섬유, 미세구체 및 미세비드 등이 있다. 또한, 상기 합성수지에는 폴리에스터, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, PVDF 및 나일론 등이 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, HEK293 세포에서 분리된 mRNA를 주형으로 RT-PCR을 수행하여 PGCP cDNA를 증폭하고, 이를 재조합 PGCP 배큘로바이러스 전달 벡터인 pENTR3C-PGCP에 삽입하고, 배큘로바이러스 DNA와 전달 벡터를 곤충세포에공동형질도입한 후, 대량 발현을 유도하여 다량의 재조합 PGCP단백질을 생산하였다. 이후, 재조합 PGCP 단백질을 디이에이이-세파로즈(DEAE-Sepharose) 레진을 이용하여 정제하고, 이를 에스디에스-폴리아크릴아마이드(SDS-polyacrylamide) 겔에서 전기영동한 후, PGCP 단백질 밴드(band)를 잘라내어, 토끼에 주입한 후, 토끼의 항-혈청 면역글로불린 단백질을 프로데틴 A-아가로즈(protein-A agarose)를 이용하여 정제하여 항-PGCP 다클론 항체를 제조하였다.

또한, 상기 제조된 항-PGCP 항체를 이용하여 혈장 내 PGCP 단백질의 농도를 측정하기 위하여, 효소면역측정법(ELISA), 닷 블랏(dot blot) 및 웨스턴 블랏(Western blot)분석을 수행하였고, 그 결과, 대조군과 비교하여, 알츠하이머성 치매환자의 MMSE-K 값은 낮고, CDR 점수는 높았으며, 혈장 알부민 및 총 단백질 농도는 치매군에서 정상군 및 경도인지장애군보다 낮게 나타났다. 그에 반해, ELISA 방법으로 측정한 혈장내 PGCP의 농도는 정상군 126.0 ±25.2 ug/ml, 경도인지장애군 123.5 ±26.0 ug/ml 및 치매군 135.2 ±35.9 ug/ml으로 나타나, 치매군의 PGCP 농도가 정상 및 경도인지장애군의 PGCP 농도에 비해 유의하게 높게 나타남을 확인하였다(도 1의 A). 웨스턴 블랏(도 1의 B 참조)과 닷 블랏 분석 (도 1의 C 및 D 참조)에서는 PGCP의 농도가 정상 < 경도인지장애 < 치매순으로 정상과 치매환자간에는 통계적으로 유의한 차이가 있었다. 닷 블랏 결과를 여자와 남자로 나누었을때도 전체 시료와 유사한 차이를 보였다. 이를 통해, 혈장 내 PGCP의 농도가 정상 대조군에 비해 경도인지장애군에서 높고 특히 알츠하이머성 치매 환자에서 유의하게 높게 나타남을 확인하였다.

또한, 나이가 증가함에 따라 PGCP의 농도도 증가하였으며 (p<0.01, 도 2의 A), MMSE 점수와는 역의 관계를 보였는데 이는 남자일 경우 통계적으로 유의한 음의 상관관계가 있음을 확인하였다(r=0.31, p<0.001, 도 2의 B 참조).

현재 임상에서 치매의 진단검사로 사용되고 있는 인지기능 검사인 MMSE 및 CDR 점수와 혈장 내 PGCP의 농도, 나이 및 성별에 따른 상관관계에 대해 분석을 수행하였고, 그 결과, PGCP 농도는 MMSE 점수가 증가할수록 감소하였다(r=0.147, p=<0.003). 또한, MMSE 점수와 혈장 내 PGCP의 농도는 전체 대상자와 남성그룹에서 통계적으로 유의한 상관관계가 나타났으며, 이는 나이, 성별 및 교육정도의 변수를 보정한 후에도 유의성이 유지되었으며, 치매척도를 나타내는 CDR 점수에서도 유의한 상관관계가 나타났다(표 2 참조).

따라서, 혈장 내 PGCP의 농도는 MMSE 점수와 반비례의 상관관계가 있고, CDR 점수와는 비례적인 상관관계가 있으므로, 이를 통해, 인지력이 떨어진 경우, 즉 치매의 발병도가 높을수록, 혈장 내 PGCP의 농도 또한 현저히 증가함을 확인하였다.

또한, 치매 환자에서 혈장 내 PGCP의 농도가 증가하는 것이 치매 특이적 현상인지 확인하기 위하여 노인 우울증과 PGCP 와의 상관관계를 확인하였다. 정상군 및 경도인지장애군에서 우울증 증상 유무에 따른 혈장 내 PGCP의 농도를 비교하였고, 그 결과, 혈장 내 PGCP 농도는 인지기능이 정상인 군 및 경도인지장애군 모두에서 우울증 증상이 있는 환자에서 모두 현저히 감소되었고(p<0.001), 이를 통해 우울증 증상이 있는 환자의 경우, 인지력과는 관계없이 우울증 증상이 없는 환자에 비해 혈장 내 PGCP의 농도가 현저히 낮게 나타남을 확인하였다(표 3 참조).

따라서, 상기 결과들을 종합해 볼 때, PGCP가 치매 환자의 혈장 내에서 현저하게 높은 것은 인지 기능 감소에 따라 민감하게 변동하는 현상임을 알 수 있고, 이를 통하여 치매를 용이하게 진단할 수 있음을 알 수 있다.

본 발명의 치매 진단 키트에 있어서, 항-PGCP 항체는 바이오틴, 또는 아비딘 또는 스트렙트아비딘에 대해 바이오틴과 본질적으로 동일한 결합 작용을 갖는 바이오틴 유도체인 리간드에 결합된 것을 사용하는 것이 바람직하고, 상기 리간드 특이적 결합분자에 결합된 발색효소, 발색물질 또는 형광분자가 결합된 시각화 컨쥬게이트가 상기 리간드에 결합된 것을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 발색 효소는 HRP(horseradish peroxidase) 또는 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase)인 것이 바람직하며, 상기 발색물질은 콜로이드 골드(coloid gold)인 것이 바람직하며, 형광분자는 FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate) 및 RITC(rhodamine-B-isothiocyanate)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 치매 진단 키트는 항원-항체 결합반응, 또는 단백질-리간드 결합반응을 통하여 결합 반응을 정량 또는 정성적으로 분석함으로써 치매를 진단할 수 있으며, 상기 결합 반응은 통상의 효소면역분석법(ELISA), 방사능면역분석법(radioimmunoassay, RIA), 샌드위치 측정법(sandwich assay), 웨스턴 블랏팅, 면역침강법, 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 형광면역법, 효소기질발색법, 항원-항체 응집법 등의 방법을 이용하여 측정할 수 있다.

본 발명의 치매 진단 키트는 지지체로 나이트로셀룰로오즈 막, PVDF 막, 폴리비닐(polyvinyl) 수지 또는 폴리스티렌(polystyrene) 수지로 합성된 웰 플레이트(well plate), 유리로 된 슬라이드 글래스 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 치매 진단 키트는 표지체로 발색효소, 발색물징 또는 형광분자는 발색반응을 하는 통상의 발색제가 바람직하며, HRP(horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(coloid gold), FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 등의 형광물질(fluorescein) 및 색소(dye) 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 치매 진단 키트는 세척액으로 인산염 완충용액, NaCl 및 트윈 20(Tween 20)을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은 PGCP 단백질과 특이적으로 결합하는 컨쥬게이트 및 컨쥬게이트에 결합하는 단백질을 포함하는 치매 진단용 면역크로마토그래피 스트립을 제공한다.

본 발명에 따른 면역크로마토그래피 스트립은 접착성 플라스틱 지지체와, 상기 접착성 플라스틱 지지체에 부착되어 있는 검체 패드, 컨쥬게이트 패드, 신호검출 패드 및 흡수 패드로 이루어지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

구체적으로, 상기 면역크로마토그래피 스트립은 하기와 같은 구성을 하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:

1) 접착성 지지체;

2) 상기 접착성 플라스틱 지지체의 상부 표면에 부착되어 있는, 분석하고자 하는 피검 시료를 부착하는 검체 패드;

3) 상기 검체 패드와 연동되어 있고, 피검 시료에 함유된 PGCP 단백질과 특이적으로 결합하는 컨쥬게이트를 함유하는 컨쥬게이트 패드;

4) 상기 컨쥬게이트 패드와 연동되어 있고, 상기 컨쥬게이트에 결합하는 단백질이 선형으로 고정된 검출 라인(test line) 및 인간 항체 면역글로불린이 고정된 대조 라인(control line)을 포함하는, 신호검출 패드; 및

5) 신호검출반응이 종료된 피검 시료를 흡수하는, 상기 신호검출 패드의 다운스트림에 위치하는 흡수 패드로 구성.

상기 구성에 있어서, 단계 3)의 발색제는 콜로이드성 골드 파티클(gold particle)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 구성에 있어서, 단계 4)의 신호검출 패드는 니트로셀룰로오즈 막으로 이루어진 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 구성에 있어서, 단계 5)의 흡수 패드는 다공성 지지체, 및 상기 다공성 지지체의 공극(pore)에 분산되거나 다공성 지지체의 섬유사에 흡착 또는 코팅되어 있는 흡수제를 포함하는 것이 바람직하며, 상기 다공성 지지체의 상부면에 부착된 다공성 필름층을 추가로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 흡수제는 염화칼슘, 염화마그네슘, 규조토, 벤토나이트, 백운석, 석고, 실리카겔 및 이들의 혼합물로 구성되는 군에서 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 면역크로마토그래피 스트립은, 면역크로마토그래피 스트립 상의 대조라인 및 검출라인에 착색선이 나타나면, 피검 시료를 치매의 양성 시료로 판정하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 면역크로마토그래피 스트립은, 우선 피검 시료인 혈장을 상기 검체 패드를 통해 면역크로마토그래피 스트립으로 공급된다. 상기 검체 패드는, 분석물질에 대한 선택성을 보다 향상시키기 위해 또는 상기 피검 시료에 포함될 수 있는 간섭물질에 의한 영향을 최소화하기 위해, 필터링의 기능을 추가로 가질 수 있다. 필요한 경우, 상기 검체 패드의 상류에 분석물질과 컨쥬게이트 사이의 반응을 증가시키거나 또는 간섭물질에 의해 영향을 배제할 수 있는 물질을 함유하는 보조 패드를 추가로 구비할 수 있다. 상기 검체 패드를 통해 도입된 혈액은 크로마토그래피적 이동을 통해 상기 검체 패드의 상류에 위치하는 컨쥬게이트 패드로 이동한다. 상기 컨쥬게이트 패드는 혈액에 함유되어 있는 PGCP 단백질과 특이적으로 결합하는 컨쥬게이트가 함유되어 있다. 상기 컨쥬게이트는 금입자, 라텍스 입자, 형광물질, 및 효소 등에 의해 레이블링된다. 상기 컨쥬게이트 패드를 통과한 피검 시료는 신호검출 패드로 이동한다. 상기 신호검출 패드는 상기 피검 시료에 분석물질이 존재하는 지의 여부를 검출하는 검출라인과, 분석물질의 존재 유무와 관계없이 분석 키트가 정상적으로 작동하였는지 여부를 확인하는 대조라인을 포함한다. 이를 위해, 상기 검출라인에는 분석물질과 상기 컨쥬게이트 패드에 함유된 컨쥬게이트 사이의 결합 산물에 선택적이고 특이적으로 결합하는 물질(또는 신호검출물질)이 코팅되고, 상기 대조라인에는 상기 컨쥬게이트 패드에 함유된 컨쥬게이트에 특이적으로 결합하는 물질이 코팅되는 것이 좋다. 상기 신호검출 패드는 다공성 멤브레인 패드로 구성되며, 니트로셀룰로오스, 셀룰로오즈, 폴리에틸렌, 폴리에테르설폰, 나일론 등으로 이루어질 수 있다.

또한, 본 발명은 항-PGCP 항체를 포함하는 치매 진단용 조성물 또는 치매 진단 키트를 이용하여 치매를 진단하는 방법을 제공한다.

상기 치매 진단 방법은 구체적으로 하기와 같은 단계로 수행되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:

1) 피검체 유래 혈액을 고체기판에 처리한 후 세척하는 단계;

2) 상기 기판에 항-PGCP 항체를 처리한 후 세척하는 단계; 및

3) 상기 기판 위에 항-PGCP 항체의 부착 정도가 정상인에 비해 증가한 피검체를 치매에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 개체로 판정하는 단계.

상기 치매 진단 방법은 구체적으로 하기와 같은 단계로 수행되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:

1) 피검체 유래 혈액을 항-PGCP 항체가 부착된 고체기판에 처리한 후 세척하는 단계;

2) 상기 기판에 항-PGCP 항체를 처리한 후 세척하는 단계; 및

3) 상기 기판 위에 항-PGCP 항체의 부착 정도가 정상인에 비해 증가한 피검체를 치매에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 개체로 판정하는 단계.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 피검체는 인간을 포함한 척추동물이고, 바람직하게는 포유동물이며, 보다 바람직하게는 인간, 유인원류, 소, 돼지, 쥐, 토끼, 기니아피크, 햄스터, 개 또는 고양이를 사용할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 고체기판은 NC(nitrocellulose) 막, PVDF(polyvinylidene fluoride) 막, 마이크로플레이트, 유리기판, 폴리스티렌, 실리콘기판 및 금속판으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나를 사용할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 2)의 항-PGCP 항체는 리간드에 결합되고, 상기 리간드는 특이적 결합분자가 결합되고, 상기 결합분자에 발색효소 또는 형광분자가 결합된 것을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 3)의 결합 정도는 웨스턴블랏팅(Western blotting)법, 효소-면역화학 검출법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역침강(immunoprecipitation) 및 면역형광법(immunofluorescence)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

이하, 본 발명의 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 항- PGCP 다클론 항체의 제조

항-PGCP 다클론 항체를 제조하기 위하여, HEK293 세포에서분리된 mRNA를 주형으로 하여, RT-PCR을 수행하여 전장 PGCP cDNA를 증폭하였고, 이를 pQE30 벡터 내에 클로닝하였다. 곤충 세포에서 PGCP를 발현하기 위하여, 재조합 PGCP 배큘로바이러스 전달 벡터인 pENTR3C-PGCP를 제조하였고, 이를 위하여 각각 Kpn I과 Xho I 제한효소 부위를 가진 프라이머[정방향 5'-CGGGGTACCATGAAATTCCTTATC-3'(서열번로 2) 및 역방향 5'-CCCTC GAGATGGACCTAGGCAG-3(서열번호 3)]를 이용하였으며, 시퀀싱을 통하여 pENTR3C 벡터 내로 PGCP의 삽입 여부를 확인하였다. 이후, 배큘로바이러스 DNA와 전달 벡터를 배큘로다이렉트 트랜스팩션 키트(BaculoDirect transfecftion kit, Invitrogen에서 구입)를 이용하여 Sf 9 곤충 세포에 공동형질도입하였다. 재조합 PGCP 바이러스 스탁(stock)은 곤충 세포에 두 번의 감염을 통해 제조하였고, 이를 곤충 세포에 감염하여, 재조합 PGCP(rPGCP)를 대량발현하였다. Sf 9 세포는 단층배양 및 10% 태아 소 혈청(FBS)과 1% 항-생제 용액(GIBCO에서 구입)이 첨가된 Sf900II-Sf 배지(Invitrogen에서 구입)에서 스피너 플라스크(spinner flask)를 이용한 부유배양을 통해 27℃에서 배양되었다. 이후, rPGCP의 발현을 최적화하기 위하여, Sf 9 세포를 대량으로 배양한 후, rPGCP 바이러스를 감염시켰다. 바이러스 감염된 곤충 세포를 배양 후, 배지를 수집하고 센트리콘 농축기(Centricon concenctrator, 분자량 10 KDa 컷오프 멤브레인 이용, Amicon으로부터 구입)를 이용하여 농축한 후, 13,000 rpm에서 20분 동안 원심분리하였다. 이후, rPGCP의 정제를 위하여, 농축된 PGCP를 디이에이이-세파로즈 레진(DEAE-Sepharose resin)과 하룻밤 동안 반응시킨 후, 상기 레진용 부피의 10배 부피의 결합 완충 용액(pH 8.0)을 이용하여, 원 레진을 씻고, 각각 0.1, 0.25, 0.5 및 1 몰 염화나트륨을 포함하는 결합 완충 용액을 이용하여 순차적으로 용출하였다. 용출된 분획물에서 용출된 분획물만을 모두 모은 후, 아세톤으로 침전시키고, 에스디에스-폴리아크릴아마이드(SDS-polyacrylamide) 겔에서 전기영동하고, PGCP 단백질 밴드(band)만을 잘라내어, PGCP 항체 생산을 위한 토끼 면역화에 사용하였다(LabFrontier에서 제조). 이후, 토끼의 항-혈청 면역글로불린 단백질을 프로테인 A-아가로즈(protein A-agarose)를 이용하여 정제하였고, 이를 통하여, 항-PGCP 다클론 항체를 얻었다.

< 실시예 2> 정상군, 경도인지장애군 및 치매군의 혈장분리

알츠하이머성 치매(AD) 환자는 한국의 서울에 위치한 서울삼성병원 정신과에서 수집되었고, 건강한 대조군 및 MCI(경도인지장애) 환자는 한국의 안산에 위치한 고려대학교 노인건강연구소에서 지역사회안산노인코호트(cohort)를 통하여 수집되었다. 모든 AD 환자는 NINCDS-ADRDA 진단 기준을 통하여 진단하였고, 경도인지장애(MCI)는 메이요 클리닉 진단 기준(Mayo clinic criteria)을 기본으로 하여 진단하였다. 인지적 기능 및 기억 장애는 한국형 간이 정신상태 검사(MMSE-K) 및 신경심리검사[CERAD-K(N)]를 통하여 평가하였으며, 우울증 증상은 30 문항-의 한국판 노인 우울증 척도(Geriatric Depression Scale; GDS-K)를 통하여 판정하였고, GDS-K 스코어가 18 이상일 경우에 우울증으로 판정하였다.

혈액 샘플은 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)이 포함된 표준 정맥 천자를 이용해 획득하였고, 이후 1,300 Ｘg에서 10분간 원심분리하여 혈장을분리하였고,분리된 혈장은분석을 위해 -80℃에서 보관하였다.

< 실험예 1> 정상군, 경도인지장애군 및 치매군의 혈장 내 PGCP( plasma glutamate carboxypeptidase)의 농도 비교

정상인군, 경도인지장애군 및 치매군의 혈장 내 PGCP의 농도를 비교하기 위하여, 효소면역측정법(ELISA), 닷 블랏(Dot blot)분석법 및 웨스턴 블랏(Western blot)분석법을 수행하였다.

<1.1> 효소면역측정법( ELISA )을 통한 농도 비교

효소면역측정법(ELISA)은 디메틸술폭시드(DMSO) 완충 용액(1% DMSO 및 0.02% NaN3를 포함한 PBS)을 이용하여 1: 30,000으로 희석된 100 ul의 혈장 샘플을 96 웰 플레이트(Nunc에서 구입한 Maxisorp)에 처리하여, 4℃에서 하룻밤 동안 배양을 통하여 혈장 내 단백질을 96 웰에 코팅하여 수행하였다. HEK293T 세포 배지에서 정제된 PGCP를 표준물질(calibration standard, DMSO 완충 용액으로 0 ~ 8 pg/ml 농도로 희석)로 사용하였다. 상기 플레이트는 200 ul의 PBST(0.05% Tween 20이 포함된 PBS) 완충용액으로 3 번 세척하고, 100 ul의 3% 소 알부민 혈청(BSA, GIBCO에서 구입)이 포함된 PBS 완충용액으로 상온에서 1시간 동안 정치하여 블라킹하였다. 이후, 상기 <실시예 1>에서 제조한 토끼 항-PGCP 다클론 항체를 1% BSA가 포함된 PBS 완충용액으로 1:5000으로 희석하여 100 ul/웰로 각각의 웰에 첨가하고, 이후 PBST 완충용액으로 3 번 세척한 후, 상온에서 2 시간 정치한 다음, PBST로 3 번 세척하였다. 이후, 플레이트에 이차 항체로 1% BSA가 포함된 PBS 완충용액으로 1: 5000으로 희석된 Fc 절편에 특이적인 항-토끼 IgG 퍼록시다제 접합체를 100 ul 처리하여 상온에서 1시간 동안 정치한 후, PBST 완충용액으로 세척하였다. 이후, 플레이트에 50 ul/웰로 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB, amresco에서 구입) 용액을 처리한 후, 빛이 차단된 조건에서 상온에서 15분간 반응시키고, 50 ul/웰의 정지 용액(1 mol/l 염산 용액)을 처리하여 반응을 끝내고, 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

인지기능이 정상이고 우울증 증상이 없는 정상 대조군 186명(평균나이 69.2±4.3세), 경도인지장애가 있는 대상자 89명(평균나이 73.7±5.5세) 및 알츠하이머성 치매환자 137명(평균나이 74.6±6.7세)으로 한 총 412명의 혈장 내 PGCP 농도를 상기 ELISA 방법으로 측정하였고, 다양한 값들 사이의 통계학적 분석을 위해서 일원분산분석법(one way ANOVA test)을 이용하였다. 나이 또는 MMSE 값과 PGCP 농도간 개인별 상관관계는 전체 샘플 및 세 가지 연구 그룹(대조군, MCI 및 AD)에서 계산되었고, 샘플은 성별 및 테스트 값과 분석된 PGCP 농도 간 상관관계로 분석되었다. 공분산의 분석은 공변량변수(covariates)로써, 나이, 성별 및 교육 정도를 포함한 세 종류의 진단 그룹 전체에 걸친 PGCP 농도를 ANOVA를 사용하여 수행하였고, 카이자승 검정(chi-square test), 스튜던트 티-검정(student's t-test) 및 다중 로지스틱 회귀분석(multiple logistic regression analysis)은 SAS 9.1 프로그램을 사용하여 수행하였으며, p 값(p value)은 0.05 보다 아래일 때, 통계학적으로 유의하다고 판정하였으며, 그 결과를 하기 [표 1]에서 나타내었다.

실험 대상자 그룹의 일반적 특징 및 PGCP 농도

	정상 대조군	경도인지장애(MCI)	알츠하이머성 치매(AD)
검체 수(명)	186	89	137
연령(년)	69.2±4.3	73.7±5.5	74.6±6.7
성별(남성/여성)	116/70	36/53	48/89
교육 연령	11.4±4.1	7.3±4.1	7.9±5.3
MMSE 점수	27.8±1.6	26.0±2.5	15.9±6.9
CDR 전체 점수	0.00±0.04	0.06±0.20	1.28±8.7*
혈청 내 알부민(g/dl)	4.4±0.2	4.4±0.2	4.0±0.6
전체 혈청 단백질(g/dl)	7.2±0.4	7.2±0.4	6.8±1.0**
ApoE-ε4 대립유전자(%)	17.2	14.6	34.6
PGCP 농도(ug/ml)	126.0±25.2	123.5±26.0	135.2±35.9

스튜던트 티-검정(student's T-Test)을 이용하여 계산한 값을 ± 표준편차로 나타내었다.

* 125명의 검체로분석한 결과

** 114명의 검체로분석한 결과

상기 [표 1]에서 나타낸 바와 같이, 알츠하이머 환자는 대조군에 비하여 현저하게 나이가 많았고, 교육 정도가 낮았으며, 남자가 더 적었고(AD 환자 26% 및 대조군 62%), 전체 137명의 알츠하이머성 치매환자 중 MMSE 점수 및 CDR 점수 값을 가진 125명의 환자(91%)의 점수를 기준으로 분석하였다.

그 결과, 대조군과 비교하여, 알츠하이머성 치매환자의 MMSE 값은 낮고, CDR 전체 점수는 높았으며, 혈장 알부민 및 총 단백질농도는 치매군에서 정상군 및 경도인지장애군보다 낮게 나타났다. ELISA 방법으로 측정한 혈장내 PGCP의 농도는 정상군 126.0±25.2 μg/ml, 경도인지장애군 123.5±26.0 μg/ml 및 치매군 135.2±35.9 μg/ml으로 나타나, 치매군의 PGCP 농도가 정상 및 경도인지장애군의 PGCP 농도에 비해 유의하게 높게 나타남을 확인하였다(도 1의 A).

<1.2> 닷 블랏 ( Dot blot ) 및 웨스턴 블랏 ( Western blot ) 분석을 통한 농도 비교

닷 블랏 분석은 DMSO 완충 용액으로 1: 10으로 희석한 혈장 샘플 3 ul를 니트로셀룰로즈(NC) 막에 떨어뜨리고, 상온에서 30분 동안 건조시켜 수행하였다. 상기 막을 5% 탈지분유가 포함된 PBST 완충용액으로 블라킹하고, PGCP 다클론 항체와 반응시킨 후, PBST 완충용액으로 3번 세척하였다. 이후 막을 3% 탈지분유가 포함된 PBST 완충용액으로 1: 5000으로 희석된 Fc 절편에 특이적인 이차 항-토끼 IgG 퍼록시다제 접합체를 100 ul 처리하여 상온에서 1시간 동안 정치한 후, PBST 완충용액으로 세척하였고, 제조자의 설명 방법에 따라, ECL 용액(PIECE에서 구입)을 처리하여 단백질 스팟(spot)을 시각화하였다.

또한, 웨스턴 블랏 분석은, 1: 10으로 희석한 혈장 샘플 3 ul를 10% 겔에서 소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 젤 전기영동법(SDS-PAGE)을 통하여 분리 후, NC 막에 이동시켜 수행하였다. 상기 막은 PGCP 항체와 반응시킨 후, 호스라디시 퍼록시다제(horseradish peroxidase)가 접합된 염소-토끼 또는 마우스 IgG 항체(PIERCE에서 구입)를 반응시켜 확인하였고, 제조자의 설명 방법에 따라, ECL 용액(PIECE에서 구입)을 처리하여 단백질 밴드(band)를 시각화하였고, 이후, 시각화된 PGCP 스팟과 밴드의 이미지를 스캔하여 정량화하였다.

그 결과, 웨스턴 블랏(도 1의 B)과 닷블랏 분석 (도 1의 C와 D)에서는 PGCP의 농도가 정상 < 경도인지장애 < 치매순으로 정상과 치매 환자간에는 통계적으로 유의한 차이가 있었다. 닷 블랏 결과를 여자와 남자로 나누었을 때도 전체 시료와 유사한 차이를 보였다.

따라서, 혈장 내 PGCP의 농도가 정상 대조군에 비해 경도인지장애군에서 높고, 특히 알츠하이머성 치매 환자에서 유의하게 높게 나타남을 확인하였다.

< 실험예 2> 혈장 내 PGCP ( plasma glutamate carboxypeptidase )의 농도와 인지기능검사 점수의 상관관계 비교

현재 임상에서 치매의 진단검사로 사용되고 있는 인지기능검사인 MMSE 및 CDR의 점수와 혈장 내 PGCP의 농도, 나이 및 성별에 따른 상관관계를 분석을 통하여 확인하였다.

MMSE 점수는 30점이 만점이고, 보통 18점 이하이면 확정적 치매(분명한 인지기능 장애)로 판단하고, 19 ~ 23 점이면 치매를 의심(경도의 인지기능 장애)하며, 24점 이상이면 정상(인지기능 장애의 인지적 손상 없음)으로 판정하므로, 점수가 낮을수록 인지기능이 떨어진 것으로 판단하였다. 또한, CDR 점수는 0은 치매가 아니고, 0.5는 약간의 인지장애, 1은 경증의 치매, 2는 중증도의 치매, 3은 중증 치매, 4는 심화된 치매 및 5는 말기 치매로 판정하므로, 점수가 높을수록 중증 치매로 판단하였다.

그 결과, PGCP의 농도는 나이가 증가함에 따라 증가하였으며 (p<0.01, 도 2의 A), MMSE 점수와는 역의 관계를 보였는데 이는 남자일 경우, 통계적으로 유의한 음의 상관관계가 있음을 확인하였다(r=0.31, p<0.001, 도 2의 B).

또한, 하기 [표 2]에서 나타낸 바와 같이, PGCP 농도는 MMSE 점수가 증가할수록 감소하였다(r=0.147, p=<0.003). 더불어, MMSE 점수와 혈장 내 PGCP의 농도는 전체 대상자와 남성그룹에서 통계적으로 유의한 상관관계가 나타났으며, 이는 나이, 성별 및 교육정도의 변수를 보정한 후에도 유의성이 유지되었으며, 치매척도를 나타내는 CDR 점수에서도 유의한 상관관계가 나타났다.

	전체 환자(530 명)		남성 (245 명)		여성(285 명)
	r	p	r	p	r	p
MMSE 점수
보정전	-0.159	0.0002	-0.237	0.0002	-0.101	0.090
보정후*	-0.148	0.0007	-0.246	0.0001	-0.086	0.149
CDR 점수
보정전	0.186	<0.0001	0.217	0.0006	0.162	0.006
보정후*	0.162	0.0002	0.217	0.0006	0.109	0.070

r: 피어슨 상관계수(Pearson correlation coefficient)

* 나이, 성별 및 교육기간에 따른 보정

따라서, 혈장 내 PGCP의 농도는 MMSE 점수와 반비례의 상관관계가 있고, CDR 점수와는 비례적인 상관관계가 있으므로, 이를 통해, 인지력이 떨어진 경우, 즉 치매의 발병도가 높을수록, 혈장 내 PGCP의 농도 또한 현저히 증가함을 확인하였다.

< 실험예 3> 정상군 및 경도인지장애군에서 우울증 증상 유무에 따른 혈장 내 PGCP(plasma glutamate carboxypeptiddase )의 농도 비교

치매 환자에서 혈장 내 PGCP의 농도가 증가하는 것이 치매 특이적 현상인지 확인하고, 경도인지장애 환자의 경우, 우울증을 동반하는 경우가 많으므로 노인 우울증과 PGCP와의 상관관계를 조사하였다. 혈장 내 PGCP와 우울증과의 상관관계를 확인하기 위하여, 정상군 및 경도인지장애군에서 우울증 증상 유무에 따른 혈장 내 PGCP의 농도를 비교하였다.

구체적으로, 인지적으로 정상이고, 우울증이 없는 186개의 정상군과 우울증이 있는 인지적 정상인 50 명 및, 우울증이 있는 66 명의 MCI 환자의 혈장 내 PGCP 농도를 확인하여 비교분석하였다.

그 결과, 하기 [표 3]에서 나타낸 바와 같이, 혈장 내 PGCP 농도는 인지기능이 정상인 군 및 경도인지장애군 모두에서 우울증 증상이 있는 환자에서 모두 현저히 감소되었다(p<0.001).

	인지적으로 정상인 대조군			경도인지장애군(MCI)
	우울증 무 (186 명)	우울증 유 (50 명)	p	우울증 무 (89 명)	우울증 유 (66 명)	p
연령(년)	69.3±4.5	69.0±5.6	0.716	73.6±5.4	70.9±5.6	0.04
교육 연령(년)	11.4±4.1	10.3±4.1	0.091	7.3±4.1	4.5±4.3	<.0001
혈청 내 알부민(g/dl)	4.4±0.2*	4.4±0.3**	0.921	4.4±0.2	4.3±0.2	0.999
전체 혈청 단백질(g/dl)	7.2±0.4*	7.2±0.5**	0.645	7.2±0.4	7.2±0.4	0.424
MMSE 점수	27.8±1.6	27.3±2.2	0.143	26.0±2.5	24.6±3.1	0.002
PGCP 농도(ug/ml)	126.0±25.2	88.1±39.3***	<.0001	123.5±26.0	85.1±39.9	0.0002

스튜던트 티-검정(student's T-Test)을 이용하여 계산한 값을 ± 표준편차로 나타내었다.

* 185명의 검체로 분석한 결과

** 38명의 검체로 분석한 결과

*** 48명의 검체로 분석한 결과

따라서, 우울증 증상이 있는 환자의 경우, 인지력과는 관계없이 우울증 증상이 없는 환자에 비해 혈장 내 PGCP의 농도가 현저히 낮게 나타남을 확인하였다. 이는 혈장 내 PGCP의 농도가 치매 스크린 검사시 노인 우울증과의 감별진단에서 사용될 수 있음을 보여준다.

상기에서 보는 바와 같이, 본 발명은 치매 진단용 조성물 및 진단 키트 개발, 및 치매 진단 방법 및 치매 치료제 개발에도 유용하게 사용될 수 있다.

<110> Korea Center for Disease Control and Prevention <120> A method for the diagnosis of Alzheimer's disease from determination of PGCP concentration in humnan plasma <130> 10p-02-14 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 472 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Lys Phe Leu Ile Phe Ala Phe Phe Gly Gly Val His Leu Leu Ser 1 5 10 15 Leu Cys Ser Gly Lys Ala Ile Cys Lys Asn Gly Ile Ser Lys Arg Thr 20 25 30 Phe Glu Glu Ile Lys Glu Glu Ile Ala Ser Cys Gly Asp Val Ala Lys 35 40 45 Ala Ile Ile Asn Leu Ala Val Tyr Gly Lys Ala Gln Asn Arg Ser Tyr 50 55 60 Glu Arg Leu Ala Leu Leu Val Asp Thr Val Gly Pro Arg Leu Ser Gly 65 70 75 80 Ser Lys Asn Leu Glu Lys Ala Ile Gln Ile Met Tyr Gln Asn Leu Gln 85 90 95 Gln Asp Gly Leu Glu Lys Val His Leu Glu Pro Val Arg Ile Pro His 100 105 110 Trp Glu Arg Gly Glu Glu Ser Ala Val Met Leu Glu Pro Arg Ile His 115 120 125 Lys Ile Ala Ile Leu Gly Leu Gly Ser Ser Ile Gly Thr Pro Pro Glu 130 135 140 Gly Ile Thr Ala Glu Val Leu Val Val Thr Ser Phe Asp Glu Leu Gln 145 150 155 160 Arg Arg Ala Ser Glu Ala Arg Gly Lys Ile Val Val Tyr Asn Gln Pro 165 170 175 Tyr Ile Asn Tyr Ser Arg Thr Val Gln Tyr Arg Thr Gln Gly Ala Val 180 185 190 Glu Ala Ala Lys Val Gly Ala Leu Ala Ser Leu Ile Arg Ser Val Ala 195 200 205 Ser Phe Ser Ile Tyr Ser Pro His Thr Gly Ile Gln Glu Tyr Gln Asp 210 215 220 Gly Val Pro Lys Ile Pro Thr Ala Cys Ile Thr Val Glu Asp Ala Glu 225 230 235 240 Met Met Ser Arg Met Ala Ser His Gly Ile Lys Ile Val Ile Gln Leu 245 250 255 Lys Met Gly Ala Lys Thr Tyr Pro Asp Thr Asp Ser Phe Asn Thr Val 260 265 270 Ala Glu Ile Thr Gly Ser Lys Tyr Pro Glu Gln Val Val Leu Val Ser 275 280 285 Gly His Leu Asp Ser Trp Asp Val Gly Gln Gly Ala Met Asp Asp Gly 290 295 300 Gly Gly Ala Phe Ile Ser Trp Glu Ala Leu Ser Leu Ile Lys Asp Leu 305 310 315 320 Gly Leu Arg Pro Lys Arg Thr Leu Arg Leu Val Leu Trp Thr Ala Glu 325 330 335 Glu Gln Gly Gly Val Gly Ala Phe Gln Tyr Tyr Gln Leu His Lys Val 340 345 350 Asn Ile Ser Asn Tyr Ser Leu Val Met Glu Ser Asp Ala Gly Thr Phe 355 360 365 Leu Pro Thr Gly Leu Gln Phe Thr Gly Ser Glu Lys Ala Arg Ala Ile 370 375 380 Met Glu Glu Val Met Ser Leu Leu Gln Pro Leu Asn Ile Thr Gln Val 385 390 395 400 Leu Ser His Gly Glu Gly Thr Asp Ile Asn Phe Trp Ile Gln Ala Gly 405 410 415 Val Pro Gly Ala Ser Leu Leu Asp Asp Leu Tyr Lys Tyr Phe Phe Phe 420 425 430 His His Ser His Gly Asp Thr Met Thr Val Met Asp Pro Lys Gln Met 435 440 445 Asn Val Ala Ala Ala Val Trp Ala Val Val Ser Tyr Val Val Ala Asp 450 455 460 Met Glu Glu Met Leu Pro Arg Ser 465 470 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PGCP forward primer <400> 2 cggggtacca tgaaattcct tatc 24 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PGCP Reverse primer <400> 3 ccctcgagat ggacctaggc ag 22

Claims (14)

1. 혈장 시료 내 PGCP 농도 측정을 위한, 항-PGCP(plasma glutamate carboxypeptidase) 항체를 함유하는 치매 진단용 키트.
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 항-PGCP 항체는 리간드에 결합된 것을 특징으로 하는 키트.
   
3. 제 2항에 있어서, 상기 리간드는 바이오틴인 것을 특징으로 하는 키트.
   
4. 제 3항에 있어서, 리간드 특이적 결합분자에 결합된 발색효소, 발색물질 또는 형광분자가 결합된 시각화 컨쥬게이트를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
   
5. 제 4항에 있어서, 발색효소는 HRP(horseradish peroxidase) 또는 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase)인 것을 특징으로 하는 키트.
   
6. 제 4항에 있어서, 발색물질은 콜로이드 골드(coloid gold)인 것을 특징으로 하는 키트.
   
7. 제 4항에 있어서, 형광분자는 FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate) 및 RITC(rhodamine-B-isothiocyanate)인 것을 특징으로 하는 키트.
   
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 1) 피검체 유래 혈액을 고체기판에 처리한 후 세척하는 단계;
    2) 상기 기판에 항-PGCP 항체를 처리한 후 세척하는 단계; 및
    3) 상기 기판 위에 항-PGCP 항체의 부착 정도가 정상인에 비해 증가한 피검체를 치매에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 개체로 판정하는 단계를 포함하는, 치매 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법.
    
14. 1) 피검체 유래 혈액을 항-PGCP 항체가 부착된 고체기판에 처리한 후 세척하는 단계;
    2) 상기 기판에 항-PGCP 항체를 처리한 후 세척하는 단계; 및
    3) 상기 기판 위에 항-PGCP 항체의 부착 정도가 정상인에 비해 증가한 피검체를 치매에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 개체로 판정하는 단계를 포함하는, 치매 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법.

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