KR20090009579A

KR20090009579A - 알츠하이머병 진단용 마커 및 이를 이용한 진단키트

Info

Publication number: KR20090009579A
Application number: KR1020070072989A
Authority: KR
Inventors: 강상원; 최철희; 권종범; 정용; 이종서; 장중식; 신정우
Original assignee: 영인프런티어(주)
Priority date: 2007-07-20
Filing date: 2007-07-20
Publication date: 2009-01-23
Also published as: WO2009014342A3; WO2009014342A2

Abstract

본 발명은 알츠하이머병 진단용 마커, 상기 마커의 존재를 측정하는 제제를 포함하는 조성물, 키트 및 이를 사용하여 알츠하이머병을 진단하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 진단용 마커는 혈액 내 존재하므로, 시료를 채취함에 있어서 고통, 부작용이 없으며, 채취가 용이하여 유용하다.

Description

알츠하이머병 진단용 마커 및 이를 이용한 진단키트{Markers and kit for the diagnosis of Alzheimer's disease}

본 발명은 알츠하이머병에 특이적인 진단 마커에 관한 것이다. 또한, 상기 마커의 존재를 측정하는 제재를 포함하는 조성물, 키트 및 이를 사용하여 알츠하이머병을 진단하는 방법에 관한 것이다.

알츠하이머병(AD)은 기억력 감소와 그 외의 인식 부족 등의 특징이 나타나는 신경쇠퇴성 병으로(Mckhann et al., Neurology 34;939(1984)), 치매의 가장 중요한 원인이다. 기억력, 사고력이 급격히 저하하는 퇴행성 뇌질환인 치매는 대표적인 노인성 질환으로, 우리나라의 경우, 65세 이상 노인 인구 중 약 9.5%인 29 만명 정도가 노인성 치매로 고생하고 있으며, 이중 73%인 18 만명은 습관적으로 거리를 배회하는 등 중증 환자이다. 이는 앞으로 인구의 노령화가 가속화됨에 따라 지속적으로 증가하여, 2020년에는 치매 환자가 현재보다 2.4배까지 증가한 70 만명에 달할 것으로 예상된다. 이러한 치매는, 유형별로는 알츠하이머병이 51%, 혈관성 치매가 34%로 85%를 차지하며, 이 밖에 감염성 질환, 대사성 질환 등에 의한 치매가 15%를 차지한다.

알츠하이머병과 혈관성 치매는 전체 치매 원인 질환의 대다수를 차지하는 가 장 흔한 원인이다. 그러나 사망전 정확한 감별 진단이 마련되어 있지 않아 그 진단의 신뢰도에 많은 논란이 계속되고 있다. 특히 우리나라의 경우에는 사망 후에도 죽음에 대한 동양적인 사고 방식으로 인해 뇌조직을 얻는 것이 힘들어 병리학적 최종 진단을 구하는 것이 거의 불가능한 실정이다. 알츠하이머병의 임상적 진단은 병력(history taking)과 신경심리학적 검사에 주로 의존하고 있으며, 부차적인 검사로 자기공명영상(MRI)나 PET과 같은 영상 검사를 시행한다. 그러나 최종적인 치매의 진단은 병리 소견에 의해 결정되는데 외국의 병리 연구에 의하면 알츠하이머병의 임상적 진단의 정확성은 50~82%이며, 혈관성 치매의 정확도는 40~80%로 연구자에 따라 편차가 심하다

이러한 맥락에서 최근에는 치매환자의 뇌척수액에서 특이하게 증가 혹은 감소하는 표적 물질을 측정함으로써 치매의 조기 진단 및 감별 진단에 이용하려는 시도가 이루어지고 있다.

뇌척수액은 시료 채취에 많은 고통을 수반하는 단점이 있으며, 전문의료기관에서만 채취가 가능한 불편함이 있고, 또한 채취과정에서 의학적인 부작용이 우려되는 등의 문제점이 있다.

이에, 본 발명자는 뇌척수액 이외의 시료를 이용한 알츠하이머병의 진단을 위해 노력한 결과, 혈액 내의 알츠하이머병 진단용 단백질 마커를 다수 찾을 수 있었다. 또한, 이 단백질의 단독 또는 조합을 알츠하이머병 진단에 적용하였을 때, 알츠하이머병을 조기에 정확하게 진단할 수 있다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 Ubiquitin, CSPS(Catecholamine Sulfating Phenol Sulfotransferase), GS2(Glutamine synthetase 2), S100β, Ubiquitin+1, DBI(Diazepam binding inhibitor), Neurosine, Enolase2, Aβ40(amyloid beta 40) 및 TG2(Transglutaminase 2)로 구성된 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 단백질을 유효성분으로 포함하는 혈액 내 알츠하이머병 진단용 단백질 마커를 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명에서 용어, "알츠하이머병(Alxheimer's disease)"은 대뇌피질의 신경세포가 죽어서 대뇌의 전두엽과 측두엽의 뇌회(腦回)가 위축되거나 줄어드는 퇴 행성 뇌질환을 의미한다.

본 발명에서 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 알츠하이머병의 발병 여부를 확인하는 것이다.

본 발명에서 용어, "진단용 마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)"란 알츠하이머병을 가진 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 세포에 비하여 알츠하이머병을 가진 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 당단백질 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 이 마커 또는 마커들은 단일의 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 조합으로 이루어질 수 있다.

조직, 또는 뇌척수액에 과발현되어 있는 단백질은 생검(Biopsy) 또는 뇌척수액 채취를 통해서만 진단이 가능한 어려움이 있다. 그러나, 혈액 등의 체액에서 질환 마커의 검출이 가능하다면 매우 유용하게 활용될 수 있는바, 본 발명자들은 알츠하이머 발명환자의 혈액 내에 존재할 것으로 예측되는 단백질 마커가 실제로 알츠하이머 진단용 마커로 사용될 수 있는지 검증하기 위하여 환자의 혈청시료와 정상인의 혈청시료를 검체로 수집하여, 항체부착 color-coded bead를 이용한 Luminex multi-analyte assay system으로 분석하였다. 그 결과, 예상 단백질 중 Ubiquitin, CSPS(Catecholamine Sulfating Phenol Sulfotransferase), GS2(Glutamine synthetase 2), S100β 단백질이 환자군의 혈액에서 높은 발현양상을, Ubiquitin+1, DBI(Diazepam binding inhibitor), Neurosine, Enolase2, Aβ 40(amyloid beta 40), TG2(Transglutaminase 2) 단백질이 환자군의 혈액에서 낮은 발현양상을 보였다. 이로써, 상기 단백질이 알츠하이머병 진단에 유의성을 갖는 마커로 사용될 수 있음을 알 수 있었다(도 1 및 도 2참조).

또한, 본 발명은 Ubiquitin, CSPS(Catecholamine Sulfating Phenol Sulfotransferase), GS2(Glutamine synthetase 2), S100β, Ubiquitin+1, DBI(Diazepam binding inhibitor), Neurosine, Enolase2, Aβ40(amyloid beta 40) 및 TG2(Transglutaminase 2)로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 단백질의 수준을 측정하는 제재를 포함하는 혈액 내 알츠하이머병 진단 마커 검출용 조성물을 제공한다.

상기 단백질 수준을 측정하는 제재의 대표적인 예로는 단백질에 특이적인 항체가 있다.

본 발명에서, "항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.

상기한 바와 같이 혈액 내 알츠하이머병 마커 단백질이 규명되었으므로 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.

다클론 항체는 상기한 알츠하이머병 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 숙주로부터 제조 가능하다. 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein(1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; marks et al, J. Mol, Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 하이브리도마 방법은 알츠하이머병 진단 마커 단백질 항원을 주사한 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주 동물로부터 추출한 세포를 이용하고, 나머지 하나의 집단으로는 암 또는 골수종 세포주를 이용한다. 이러한 두 집단의 세포들을 폴리에틸렌글리콜과 같은 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 융합시키고 나서 항체-생산 세포를 표준적인 조직 배양 방법에 의해 증식시킨다. 한계 희석법(limited dilution technique)에 의한 서브클로닝에 의해 균일한 세포 집단을 수득한 후, 알츠하이머병 진단 마커 단백질에 대해 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 표준 기술에 따라 시험관 내에서 또는 생체 내에서 대량으로 배양한다. 상기한 하이브리도마가 생산하는 단클론 항체는 정제하지 않고 사용할 수도 있으나, 최선의 결과를 얻기 위해서는 당업계에 널리 공지된 방법에 따라 고순도로 정제하여 사용하는 것이 바람직하다. 파지 항체 라이브러리 방법은 세포 내에 존재하는, 다양한 알츠하이머병 마커에 대한 항체 유전자(Single chain fragment variable, scFv 형태)를 획득하여 이를 파아지의 표면에 융합 단백질 형태로 발현함으로서 항체 라이브러리를 시험관 내에서 제작하고, 이 라이브러리부터 알츠하이머병 단백질과 결합하는 모노클로날 항체를 분리, 제작하는 방법이 다.

상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리한다.

또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab')2 및 Fv 등이 있다.

또한, 본 발명은 Ubiquitin, CSPS(Catecholamine Sulfating Phenol Sulfotransferase), GS2(Glutamine synthetase 2), S100β, Ubiquitin+1, DBI(Diazepam binding inhibitor), Neurosine, Enolase2, Aβ40(amyloid beta 40) 및 TG2(Transglutaminase 2)로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 혈액 내 알츠하이머병 진단 마커 검출용 키트를 제공한다.

본 발명의 진단 마커 검출용 키트는, 상기 단백질에 특이적인 항체; 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체(Conjugate); 상기 표지체와 발색 반응할 발색 기질 용액; 세척액; 및 효소반응 정지용액을 포함할 수 있다.

본 발명의 진단 마커 검출용 키트는 항원-항체 결합반응을 통하여 항체 단백질에 대한 항원을 정량분석 또는 정성분석함으로써 알츠하이머병을 진단할 수 있으 며, 상기 항원-항체 결합반응은 통상의 ELISA, RIA(Radioimmnoassay), 샌드위치 측정법(Sandwich assay), 폴리아크릴아미드 겔 상의 웨스턴 블롯, 면역 블롯 분석 또는 면역조직화학염색 방법(Immnohistochemical staining)으로 측정할 수 있다. 예를 들어, 검체 및 대조군을 표면에 코팅시킨 96 웰 마이크로타이터 플레이트 등을 이용하여 재조합 모노클로날 항체 단백질과 반응하는 ELISA를 수행하도록 상기 진단 마커 검출용 키트를 제공할 수 있다.

항원-항체 결합 반응을 위한 고정체로는 니트로셀룰로오즈 막, PVDF 막, 폴리비닐(Polyvinyl) 수지 또는 폴리스티렌(Polystyrene) 수지로 합성된 웰 플레이트(Well plate) 및 유리로 된 슬라이드 글래서 등이 사용될 수 있다.

2차 항체의 표지체는 발색반응을 하는 통상의 발색제가 바람직하며, HRP(Horseadish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(Alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(Coloid gold), FITC(Poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC (Rhodamine-B-isothiocyanate) 등의 형광물질 (Fluorescein) 및 색소 (Dye) 등의 표지체가 사용될 수 있다. 발색을 유도하는 기질은 발색반응을 하는 표지체에 따라 사용하는 것이 바람직하며, TMB (3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS[2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)], OPD (o-phenylenediamine) 등을 사용할 수 있다. 이 때, 발색제 기질은 완충용액 (0.1 M NaAc, pH 5.5)에 용해된 상태로 제공되는 것이 더욱 바람직하다. TMB와 같은 발색기질은 2차 항체 접합체의 표지체로 사용된 HRP에 의해 분해되어 발색 침적체를 생성하고 그 발색 침적체의 침적 정도를 육안으로 확인함으로써 퍼옥시레독신-I 단백질 항원의 존재 유 무를 검출한다.

세척액은 인산염 완충용액, NaCl 및 트윈 20을 포함하는 것이 바람직하며, 0.02 M 인산염 완충용액, 0.13 M NaCl, 및 0.05% 트윈 20 (Tween 20)으로 구성된 완충용액 (PBST)이 더욱 바람직하다. 세척액은 항원-항체 결합반응 후 항원-항체 결합체에 2차 항체를 반응시킨 다음 적당량을 고정체에 첨가하여 3 내지 6회 세척한다. 반응 정지용액은 황산용액(H2SO4)이 바람직하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 검체 혈액으로부터 항원-항체 반응을 이용하여 알츠하이머 진단용 단백질 마커를 검출하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 Ubiquitin, CSPS(Catecholamine Sulfating Phenol Sulfotransferase), GS2(Glutamine synthetase 2), S100β, Ubiquitin+1, DBI(Diazepam binding inhibitor), Neurosine, Enolase2, Aβ40(amyloid beta 40) 및 TG2(Transglutaminase 2)로 구성된 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 단백질에 특이적인 항체를 알츠하이머병 의심 환자의 검체와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성으로 단백질 수준을 확인하는 단계, 및 상기 항원-항체 복합체 형성량의 증가 또는 감소를 정상 대조구 시료의 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 알츠하이머병을 진단하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 검체로서는 혈청, 혈장 또는 혈액을 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 혈청을 검체로 사용하였다. 본 발명에서와 같이 혈청, 혈장 또는 혈액을 생물학적 시료로 사용하는 경우, 뇌척수액 등을 시료로 사용하는 경우보다 검체의 채취가 훨씬 용이하며, 환자의 시료 채취 과정에 고통이 수반되지 않을 뿐 아니라, 의학적 기구 사용에 의한 부작용의 염려가 없어 매우 유용하다.

검체에서 단백질을 분리하는 과정은 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있다.

단백질 수준을 확인하는 것은, 상기 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인하는 것으로서, 확인 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA:Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip), 항체부착 color-coded bead를 이용한 Luminex multi-analyte assay system 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 알츠하이머병 의심 환자에서의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 마커 단백질의 유의한 발현량의 증가 또는 감소 여부를 판단하여, 알츠하이머병 의심 환자의 실제 알츠하이머병 환자 여부를 진단할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 항체 부착 color-coded bead를 이용한 Luminex muti-analyte assay system을 이용하여 단백질 발현수준을 측정하였다.

본 발명에서 용어 "항원-항체 복합체"란 알츠하이머병 마커 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기, 발현량을 통해서 정량적으로 측정 가능하다.

이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(micropatricle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 D-글루코시다제, D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 3H, 14C, 35S, 36CL, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다.

본 발명의 퇴행성뇌질환 마커의 혈액내 단백질의 발현 수준을 검출하여 퇴행성뇌질환을 정확하고 간편하게 진단할 수 있다.

본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정이 되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

퇴행성뇌질환 환자의 혈액과 정상인 혈액의 단백질 정량 분석.

<1> 검체의 수집(혈청 수득)

이화여자대학교 신경과 (정지향/최경주 교수팀)과 삼성의료원 (정용/나덕렬 교수팀)에서 기관IRB의 허가에 따른 프로토콜에 따라 환자 및 보호자의 동의를 받은 후에 86명의 퇴행성 뇌질환 환자와 17명의 정상대조군의 혈청을 검체로 수집하였다.

<2> 항체의 제조

수집된 알츠하이머 발병환자의 검체 내에 존재할 것으로 예측되는 단백질 중, 유의성 있는 단백질 마커를 찾아내기 위하여, 예상되는 단백질 마커 Ubiquitin, CSPS(Catecholamine Sulfating Phenol Sulfotransferase), GS2(Glutamine synthetase 2), S100β, Uboquitin+1, DBI(Diazepam binding inhibitor), Neurosine, Enolase2, Aβ40(amyloid beta 40), TG2(Transglutamninase 2)에 대한 항체를 제조하였다.

다클론 항체는 상기한 Ubiquitin, CSPS(Catecholamine Sulfating Phenol Sulfotransferase), GS2(Glutamine synthetase 2), S100β, Uboquitin+1, DBI(Diazepam binding inhibitor), Neurosine, Enolase2, Aβ40(amyloid beta 40), TG2(Transglutamninase 2) 각각에 대한 재조합 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 제조하였다.

단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조)을 이용하여 제조하였다. 생후 6주된 암컷 BALB/c 마우스의 복강에 Ubiquitin, CSPS(Catecholamine Sulfating Phenol Sulfotransferase), GS2(Glutamine synthetase 2), S100β, Uboquitin+1, DBI(Diazepam binding inhibitor), Neurosine, Enolase2, Aβ40(amyloid beta 40), TG2(Transglutamninase 2) 재조합 단백질 항원을 완전 프로인트 보조제와 혼합하여 50∼100ug/ 0.2㎖씩 복강내 주사하였다. 4주 후 같은 방법으로 불완전 프로인트 보조제와 상기 각 항원을 혼합하여 50∼100 μg/0.2㎖ 씩 복강내 주사하였다. 다음으로, 2주 후에 마우스의 꼬리로부터 채혈하여 ELISA 시험 후 항체의 역가가 1/1000에서 1.0 이상이면 융합에 사용하였다. 세포융합을 위한 2차 면역처리로부터 4주째에 동량의 항원을 PBS에 희석하여 50-100 ㎍/ 0.2㎖씩 복강내 주사하였다. 3일 후에 마우스를 희생시켜 세포 융합 과정을 수행하였다. 먼저, ATCC로부터 구매한 미엘로마 세포(Sp2/0-Ag14)를 10% FBS 배지에 1X105 cell/㎖로 희석하여 37℃, CO2 배양기에서 밤새 배양하고, 이를 매일 반복하여 계대배양하였다. 융합 하루 전날은 150T 플라스크 3개에 50㎖씩 계대배양하여 융합에 사용하였다. 다음으로, 위에서 준비된 면역된 마우스를 희생시키고, 지라(spleen)를 적출하여 준비된 100mm 디쉬(DMEM 10ml)의 배지에서 세척하였다. 그 후, 100mm 디쉬(DMEM 5㎖)에 메쉬(mesh)를 넣고 메쉬 위에 지라를 넣고 가위로 몇 토막으로 잘랐다. 잘려진 지라를 5㎖ 주사기의 플런저 부분으로 곱게 으깨 지라의 세포들이 분리되어 나오도록 하였다. 1회용 피펫으로 여러 번 현탁화하여 미리 준비한 FBS가 들어있는 튜브에 지라 세포를 레이어링(layering)하고 약 10분간 정치시켜 커다란 찌꺼기를 가라앉게 하였다. FBS 상층부의 세포는 잘 풀고, 미리 데운 RBC 파쇄 버퍼 10㎖을 넣고 현탁화한 후 10분 동안 37℃에 배양한 후 FBS 3㎖을 넣고 1,000rpm에 10분간 원심분리하였다. 원심분리 후, 상층액은 버리고 펠렛만 기본배지로 희석하여 1,000rpm에서 10분간 원심분리하였다. 원심분리된 세포를 기본배지 10㎖에 희석하여 세포를 계수하였다. 상기 미에로마(Sp2/o-Ag14, ATCC) 세포는 150T 플라스크 3개에 키워 50㎖ 원뿔형 튜브에 옮겨 담아 원심분리하였다. 각 튜브의 펠렛을 모아 20㎖ 기본배지에 희석하여 세포를 계수하였다. 위와 같이 준비된 지라 세포와 미엘로마 세포를 5:1의 비율이 되도록 섞어 1,000rpm에서 10분간 원심분리하였다. 펠렛을 튜브 끝에 골고루 펴 뭉치지 않도록 하고, 미리 데워진 PEG(1,500) 1㎖ (1X108cell 기준)를 1분간 천천히 튜브를 돌리면서 세포에 골고루 스미도록 떨어뜨렸다. 다시 1분 동안 튜브를 돌리면서 PEG가 세포에 골고루 묻도록 하였다. 이때 총 2분이 경과하지 않도록 조심하고 37℃를 유지하였다. 기본배지 4 ㎖을 4분간 천천히 튜브를 탭핑하면서 첨가하였다. 다시 기본배지 10㎖을 4분간 천천히 튜브를 탭핑하면서 첨가하였다. FBS 3㎖을 넣고 1,000rpm에 10분간 원심분리하였다. 펠렛을 1X HAT 배지로 조심스럽게 현탁하여 96 웰-플레이트에 200㎕씩 분주하였다. 상기 단백질 항원에만 양성반응을 보이는 세포주(양성 웰의 세포주)를 24웰로 옮긴 후 세포를 계수(counting)하였다. 100∼200 세포/20㎖이 되게 20㎖ HT 배지에 희석하고, 96 웰 플레이트에 200㎕씩 분주하였다. 다음으로, CO2 항온 배양기에서 37℃에서 약 7∼10일간 배양시키고, 약 5일∼7일째 1회 피딩(feeding)하였다. ELISA로 탐색하고 클로닝 과정을 반복하여, 최종 클론을 얻고, 이들을 액체 질소 탱크에 보관하였다. 그 결과, 상기 단백질 항원에 대하여 특이적인 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 얻었다.

<3> 검체의 분석

상기 예상 단백질이 유의성 있는 마커가 될 수 있는지 알아보기 위해, 항체부착 color-coded bead를 이용한 Luminex multi-analyte assay system으로 분석하였다

미국 Upstate사로부터 구입한 carboxylated luminex bead (P-33997-10101 ~19901)에 예상 단백질 마커에 대한 항체를 포획항체(capture antibody)로 부착하여, 각각의 bead가 그 고유 color에 의해 인식되게 하였고, 동시에 각 단백질에 대한 포획항체가 프로브(probe)로 작용하도록 하였다(도 1참조). 상기 bead와 검체를 반응시킴으로써 단백질이 포획항체에 결합하게 되며, 여기에 다른 에피톱(epitope)를 인식하며 bead와 다른 종류의 녹색형광 chromophore가 부 착된 검출항체(detection antibody)를 마커 단백질에 반응하여 결합시켰다 그리고 Luminex multi-analyte assay system을 이용하여 두 개의 laser 즉, 적색형광과 녹색형광을 하나하나의 bead에 주사하여 적색형광으로는 bead의 종류, 즉 마커 단백질의 종류를 결정하고, 녹색형광으로는 결합된 단백질의 양을 측정하였다(도 1 참조). 그리고 그 결과를 Bio-Plex Manager software를 이용하여, bead의 종류를 확인하고, 분석물질을 정량하였다. 포획항체 및 검출항체는 상기<2> 단계에서 제조된 단클론 항체를 사용하였다.

<4> 퇴행성뇌질환 마커의 검증 및 퇴행성뇌질환의 진단

항체부착 color-coded bead를 이용한 단백질의 정량분석 결과 환자군의 혈액에서 대조군의 혈액과 대비하여 퇴행성뇌질환의 진단에 유의성을 갖는 마커 단백질이 발견되었다. Ubiquitin, CSPS(Catecholamine Sulfating Phenol Sulfotransferase), GS2(Glutamine synthetase 2), S100β 단백질은 환자군의 혈액에서 높은 발현양상을 보였으며, Ubiquitin+1, DBI(Diazepam binding inhibitor), Neurosine, Enolase2, Aβ40(amyloid beta 40), TG2(Transglutaminase 2) 단백질은 환자군의 혈액에서 낮은 발현양상을 보였다(도 2 참조). 정상 대조군에 비해 환자군의 혈액에서 높은 발현양상을 보이는 마커단백질의 경우는, 정상대조군 농도의 평균치에 1/2*표준편차를 더한 값 이상의 값을 가질 때 양성으로 판정하였으며, 환자군 농도의 평균치에 1/2*표준편차를 뺀 값 이하의 값을 가질 때 음성으로 판정하였다. 또한, 정상대조군에 비해 환자군의 혈액에서 낮은 발현양상을 보이는 마커단백질의 경우는, 정상대조군 농도의 평균치에 1/2*표준편차를 뺀 값 이하의 값을 가 질 때 양성으로 판정하였으며, 환자군 농도의 평균치에 1/2*표준편차를 더한 값 이상의 값을 가질 때 음성으로 판정하였다(표 1 참조).

마커단백질	정상대조군농도 (ng/ml)	환자군농도 (ng/ml)	민감도 (%)	특이도 (%)
Aβ40	2373.2±906.2	2811.1±1699.9	50.8	66.7
CSPS	86.0±39.2	102.3±58.6	55.9	75.0
DBI	96.8±34.8	87.9±43.5	66.1	50.0
Enolase2	14.8±5.3	14.7±6.0	63.6	33.3
GS	1050.0±342.7	1417.5±666.8	67.1	50.0
Neurosin	3226.9±771.9	2337.9±1168.3	73.8	72.7
S100β	9.42±2.27	14.48±8.41	62.1	63.6
TG2	2.35±0.78	1.78±1.50	77.1	71.4
Ub	1.98±0.73	3.43±1.54	72.4	87.5
Ub+1	49.3±23.5	29.7±20.2	80.1	63.6

도 1은 항체 부착 color-coded bead를 이용한 Luminex multi-analyte assay system을 나타낸 것이다.

도 2는 알츠하이머병 환자와 대조군의 시료에서 나타나는 Ubiqitin, CSPS(Catecholamine Sulfating Phenol Sulfotransferase), GS2(Glutamine synthetase 2), S100β, Ubiquitn+1, DBI(Diazepam binding inhibitor), Neurosine, Enolase2, Aβ40(amyloid beta 40), TG2(Transglutaminase 2) 단백질 발현량의 차이를 나타낸 것이다.

Claims

Ubiquitin, CSPS(Catecholamine Sulfating Phenol Sulfotransferase), GS2(Glutamine synthetase 2), S100β, Ubiquitin+1, DBI(Diazepam binding inhibitor), Neurosine, Enolase2, Aβ40(amyloid beta 40) 및 TG2(Transglutaminase 2)로 구성된 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 단백질을 유효성분으로 포함하는 혈액 내 알츠하이머병 진단용 단백질 마커.
제1항에 있어서, 상기 혈액은 혈청 또는 혈장인 것을 특징으로 하는 알츠하이머병 진단용 단백질 마커.
Ubiquitin, CSPS(Catecholamine Sulfating Phenol Sulfotransferase), GS2(Glutamine synthetase 2), S100β, Ubiquitin+1, DBI(Diazepam binding inhibitor), Neurosine, Enolase2, Aβ40(amyloid beta 40) 및 TG2(Transglutaminase 2)로 구성된 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 단백질의 수준을 측정하는 제재를 포함하는 혈액 내 알츠하이머병 진단 마커 검출용 조성물.
제3항에 있어서, 상기 제재는 Ubiquitin, CSPS(Catecholamine Sulfating Phenol Sulfotransferase), GS2(Glutamine synthetase 2), S100β, Ubiquitin+1, DBI(Diazepam binding inhibitor), Neurosine, Enolase2, Aβ40(amyloid beta 40) 및 TG2(Transglutaminase 2)로 구성된 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 단백질에 특이적인 항체인 것을 특징으로 하는 알츠하이머병 진단 마커 검출용 조성물.
제3항에 있어서, 상기 혈액은 혈청 또는 혈장인 것을 특징으로 하는 알츠하이머병 진단 마커 검출용 조성물.
Ubiquitin, CSPS(Catecholamine Sulfating Phenol Sulfotransferase), GS2(Glutamine synthetase 2), S100β, Ubiquitin+1, DBI(Diazepam binding inhibitor), Neurosine, Enolase2, Aβ40(amyloid beta 40) 및 TG2(Transglutaminase 2)로 구성된 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 혈액 내 알츠하이머병 진단 마커 검출용 키트.
제6항에 있어서, 상기 혈액은 혈청 또는 혈장인 것을 특징으로 하는 알츠하이머병 진단 마커 검출용 키트.
검체 혈액으로부터 항원-항체 반응을 이용하여 알츠하이머병 진단용 단백질 마커를 검출하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 혈액은 혈청 또는 혈장인 것을 특징으로 하는 방법.
Ubiquitin, CSPS(Catecholamine Sulfating Phenol Sulfotransferase), GS2(Glutamine synthetase 2), S100, Ubiquitin+1, DBI(Diazepam binding inhibitor), Neurosine, Enolase2, Aβ40(amyloid beta 40) 및 TG2(Transglutaminase 2)로 구성된 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 단백질에 특이적인 항체를 알츠하이머병 의심 환자의 검체 혈액과 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성으로 단백질 수준을 확인하는 단계, 및 상기 항원-항체 복합체 형성량의 증가 또는 감소를 정상 대조구 시료의 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하여 알츠하이머병을 진단하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 혈액은 혈청 또는 혈장인 것을 특징으로 하는 방법.